RU2018119843A - Способ получения и концентрирования микро-РНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения - Google Patents

Claims (1)

1. Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток, содержащих выработку большой массы мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующее культивирование и сбор культуральной жидкости, обогащенной экзосомами, концентрацию экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсабилизации, заморозку или высушивание полученного концентрата для долгосрочного хранения, в котором, в качестве источника экзосом, используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки -ММСК от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются - пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в специальной среде альфаМЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмы пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляется до 80-100% монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным или проточным: при статичном культивировании клетки помещаются в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри и т.д., при достижении 80-100% монослоя, культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры и т.п., при достижении клетками монослоя культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7-и дней, при получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100-200-500 кДа, в зависимости от выбранного фильтра за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100-500 кДа, в результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируют в ретинюате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит высокое количество экзосом, которое измеряют с помощью проточной цитометрии и измерению уровня РНК. далее полученные экзосомы могут быть использованы в течении 2-х недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, быть заморожены при -20°, -40°, -60° и -80° и хранится на протяжении 6-ти месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2-х лет при отрицательных температурах или +4°С.