RU2548816C1 - Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей - Google Patents

Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей Download PDF

Info

Publication number
RU2548816C1
RU2548816C1 RU2013155716/10A RU2013155716A RU2548816C1 RU 2548816 C1 RU2548816 C1 RU 2548816C1 RU 2013155716/10 A RU2013155716/10 A RU 2013155716/10A RU 2013155716 A RU2013155716 A RU 2013155716A RU 2548816 C1 RU2548816 C1 RU 2548816C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mir
centrifugation
centrifuge
column
exosomes
Prior art date
Application number
RU2013155716/10A
Other languages
English (en)
Inventor
Александр Андреевич Абрамов
Дмитрий Александрович Мурашко
Вадим Игоревич Поспелов
Original Assignee
Мамонтова Марина Васильевна
Вадим Игоревич Поспелов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мамонтова Марина Васильевна, Вадим Игоревич Поспелов filed Critical Мамонтова Марина Васильевна
Priority to RU2013155716/10A priority Critical patent/RU2548816C1/ru
Priority to SG11201604889UA priority patent/SG11201604889UA/en
Priority to PCT/RU2014/000941 priority patent/WO2015094017A1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2548816C1 publication Critical patent/RU2548816C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу выделения микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы. Способ включает последовательное центрифугирование, ультрафильтрацию и ультрацентрифугирование культуральной конденсированной среды. Растворяют полученный осадок в фосфатно-солевом буфере и повторно центрифугируют. Растворяют полученный осадок в воде. Подвергают полученный раствор электрофорезу в свободном потоке на приборе FFE System. Проводят ультрацентрифугирование каждой из полученных фракций. Очищают каждую фракцию от клеточных стенок экзосом посредством фильтрации и центрифугирования. Проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы. Останавливают реакцию нагреванием до 95°С в течение 5 минут. Предложенное изобретение позволяет выделить микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, с высоким выходом. 2 ил., 1 пр.

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам выделения микроРНК из биологических жидкостей, и предназначено для выделения различных типов микроРНК из различных экзосомосодержащих биологических материалов для оценки отдельных фракций экзосом.
Экзосомы - маленькие, 20-100 нм, сферические пузырьки, формируемые клеткой для межклеточных взаимодействий. В экзосомах содержатся комплексы белков и микроРНК, которые представляют ценность как диагностические маркеры, а также могут использоваться для формирования иммунного ответа в онкологии. Однако для эффективного использования экзосом необходимо получение чистой фракции.
Экзосомы стабильны в биологических жидкостях, крови, моче, слюне, асците или культуральной жидкости в случае культивирования. Это делает доступной не инвазивную диагностику экзосом опухолевого происхождения в плазме крови и моче.
Экзосомы активно выделяются клетками иммунной системы - дендритные клетки и В-лимфоциты, клетками нервной ткани, секреторных тканей и особенно опухолевыми клетками [ K.Denzer et al. 2000, Huber et al. 005, P.Wwearsch 2009]. В случае дендритных клеток выделяются экзосомы содержащие маленькие (8-12 аминокислот) презентованные полипептиды в комплексе антигеном МНС I, присоединяющиеся к соответствующим рецепторам на CD8 цитотоксических Т-лимфоцитах, NK-клетках, а также в комплексе с МНС II, содержащие большие (12-16 аминокислот) презентированные полипептиды, к соответствующим рецепторам на CD4 цитотоксических Т-лимфоцитах. Экзосомы, выделяющиеся опухолевыми клетками, могут нарушать формирование противоопухолевогоответа цитотоксических Т-клеток за счет конкуренции с экзосомами дендритных клеток или макрофагов, учитывая, что концентрация экзосом увеличивается в плазме/сыворотке крови примерно в 50 раз при развитом раке [Taylor et al. 2008, Iero 2008].
Экзосомы содержат антигены МНС I и МНС II комплекса гистосовместимости, Rab-белки ряд интегринов, а также антигены и наборы микроРНК, определяемые тканевой принадлежностью и индивидуальными особенностями типа клеток. Так в экзосомах из мочи человека обнаружено присутствие 295 белков [ Pisitkun et al. 2004]. Около 50 белков встречаются регулярно во всех экзосомах [Gonzales et al., 2009]. В случае опухолей тканеспецифический набор белков и опухолевоспецифический набор микроРНК может использоваться для ранней диагностики или обоснования схемы лечения [Baj-Krzyworzeka et а1. 2007].
Для изучения специфических опухолевых экзосом необходимо их дифференцировать. Концентрация конкретных микроРНК является в таком случае критерием отбора экзосом из конкретных клеток.
Известен способ выделения экзосом из биологических жидкостей (см. ссылку http://tsitologiya.cytspb.rssi.ru/54 5/shtam ms.pdf сети Интернет), где собирают культуральную конденсированную среду (КС), проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000g, далее полученную КС объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом из полученных препаратов концентрированной КС применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, разбивают на аликвоты, которые замораживают при -80 °С для дальнейших протеомных исследований.
Известный метод не позволяет разделить экзосомы на различные фракции, относящиеся к различным тканям, а следовательно, и осуществить оценку уровня микроРНК в выделенных образцах.
Техническим эффектом заявленного способа является возможность выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, в частности, возможность выделения отдельных типов, например, тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК в дальнейшем позволит создавать вакцины, основанные на экзосомах из опухолевых клеток.
Вышеприведенный технический результат достигается тем, что в способе выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, включающем последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000g, ультрафильтрацию полученной надосадочной жидкости на цетрифужном концентраторе Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore до конечного объема 10 мл, ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 часов, растворение полученного осадка в фосфатно-солевом буфере, повторное центрифугирование при тех же условиях, и растворение полученного осадка в 100 мкл воды, согласно настоящему изобретению, далее полученный раствор подвергают электрофорезу в свободном потоке в бункерах для анодной и катодной стабилизации на приборе FFE System с последующим сбором отдельных фракций при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 минут, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА, образец и маркер вводят при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно, пробег проводят в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч, для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5 М тиомочевины + 6 M мочевины + 100 мМ H2SО4 +25 мМ 2-пиридин-пропанол +мМ 2-пиридин-этанол. Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, далее отдельные фракции повторно ультрацентрифугируют на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч, затем проводят выделение микроРНК из каждой отдельной фракции, а именно, в каждую из отдельных фракций добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000g, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), а именно, к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин.
Далее, с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems спраймерами на отдельные типы, например, тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК, а именно: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-3р, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-3р, miR-432, miR-438, miR-574-3р, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c.
Затем при помощи программы GenEx qPCR software, вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, после чего полученные данные сводят в таблицу для сравнения профилей экспрессии микроРНК в образцах из разных тканей.
Пример исследования
600 мл мочи, взятой у здорового донора подвергают последовательному центрифугированию в режиме 2000 и 10000g, далее полученную надосадочную жидкость объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, далее исследуемый образец подвергают электрофорезу в свободном потоке в специальных буферах на приборе FFE system (FFE Service GmbH) при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА. Образец и маркер были введены при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно. Пробег проводили в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч. Для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5 М тиомочевины + 6 M мочевины + 100 мМ H2SO4+25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол. Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, с последующим сбором отдельных фракций, концентрированием образцов из отдельных лунок при помощи повторного ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч.. Затем проводят выделение микроРНК по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, затем используют колонки Exiqon, для очистки микроРНК - образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды. Колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а потом центрифугируют при 3000g на центрифуге eppendorf 5104, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems, с праймерами на следующие микроРНК: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-3р, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Зр, miR-432, miR-438, miR-574-3р, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c результаты анализируют при помощи программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы 1 (см. фиг.1 - Распределение микроРНК, выделенной из 500 мл мочи здорового донора по лункам. Концентрация представлена как log с основанием 2 копий микроРНК в микролитре).
Затем 600 мл мочи, взятой у пациента с раком молочной железы, подвергают последовательному центрифугированию в режиме 2000 и 10000g, далее полученную надосадочную жидкость объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, далее исследуемый образец подвергают электрофорезу в свободном потоке в специальных буферах на приборе FFE system (FFE Service GmbH) при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 минут, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА. Образец и маркер были введены при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно. Пробег проводили в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч. Для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5М тиомочевины + 6 M мочевины + 100 мМ H2SO4+25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол. Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины +180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, с последующим сбором отдельных фракций, концентрированием образцов из отдельных лунок при помощи повторного ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. Затем проводят выделение микроРНК по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, затем используют колонки Exiqon, для очистки микроРНК - образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером фирмы Exiqon, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды. Колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а потом центрифугируют при 3000g на центрифуге eppendorf 5104, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems, с праймерами на следующие микроРНК: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-Зр, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Зр, miR-432, miR-438, miR-574-Зр, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c, результаты анализируют при помощи компьютерной программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы 2 (см. фиг.2 - Распределение микроРНК, выделенной из 500 мл мочи пациента с аденокарциномой легких по лункам. Концентрация представлена как log с основанием 2 копий микроРНК в микролитре).
Как видно из таблиц 1 и 2 в лунках 61-66 микроРНК miR-17-Зр, miR-106а, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192 наблюдаются только у пациента с аденокарциномой легких и не выявляется у здорового донора, что указывает на то, что в эти лунки попадают только экзосомы из опухолевых клеток аденокарциномы легких, следовательно, заявленным способом возможно выделять чистые фракции отдельных типов микроРНК, в том числе тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК, из биологических жидкостей, содержащих экзосомы.

Claims (1)

  1. Способ выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, включающий последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000g, ультрафильтрацию полученной надосадочной жидкости на цетрифужном концентраторе Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore до конечного объема 10 мл и ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч, далее полученный осадок растворяют в фосфатно-солевом буфере и повторно центрифугируют при тех же условиях, затем полученный осадок растворяют в 100 мкл воды, отличающийся тем, что далее полученный раствор подвергают электрофорезу в свободном потоке в бункерах для анодной и катодной стабилизации на приборе FFE System с последующим сбором отдельных фракций при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА, образец и маркер вводят при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно, пробег проводят в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч, для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5 М тиомочевины + 6 M мочевины +100 мМ H2SO4 +25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол; среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, далее отдельные фракции повторно ультрацентрифугируют на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч, затем проводят выделение микроРНК из каждой отдельной фракции, а именно в каждую из отдельных фракций добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000g, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), а именно к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°в течение 5 мин.
RU2013155716/10A 2013-12-16 2013-12-16 Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей RU2548816C1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013155716/10A RU2548816C1 (ru) 2013-12-16 2013-12-16 Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей
SG11201604889UA SG11201604889UA (en) 2013-12-16 2014-12-12 Method for isolating separate types of micro-rna from biological fluids containing exosomes
PCT/RU2014/000941 WO2015094017A1 (ru) 2013-12-16 2014-12-12 Способ выделения отдельных типов микрорнк из биологических жидкостей, содержащих экзосомы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013155716/10A RU2548816C1 (ru) 2013-12-16 2013-12-16 Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2548816C1 true RU2548816C1 (ru) 2015-04-20

Family

ID=53289500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013155716/10A RU2548816C1 (ru) 2013-12-16 2013-12-16 Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей

Country Status (3)

Country Link
RU (1) RU2548816C1 (ru)
SG (1) SG11201604889UA (ru)
WO (1) WO2015094017A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2710368C2 (ru) * 2018-05-29 2019-12-26 Станислав Евгеньевич Волчков Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения
RU2729423C2 (ru) * 2018-12-19 2020-08-06 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Способ выделения свободных и экзосомальных микроРНК из слюны
RU2748767C1 (ru) * 2020-08-27 2021-05-31 Гордейчук Владимир Евгеньевич Способ загрузки экзосом малыми некодирующими РНК

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2301260C2 (ru) * 2000-09-22 2007-06-20 Вирэкссис Корпорейшн Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение
WO2011029903A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Flemming Velin Method for the preparation of micro-rna and its therapeutic application
US20120164648A1 (en) * 2010-12-28 2012-06-28 Bexmart Integrated Versatile and Systems Preparation of Specimens

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2301260C2 (ru) * 2000-09-22 2007-06-20 Вирэкссис Корпорейшн Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение
WO2011029903A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Flemming Velin Method for the preparation of micro-rna and its therapeutic application
US20120164648A1 (en) * 2010-12-28 2012-06-28 Bexmart Integrated Versatile and Systems Preparation of Specimens

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAJ-KRZYWORZEKA M. ET AL., Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes, Immunol Lett, 2007, v.113, no.2, p. 76-82. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2710368C2 (ru) * 2018-05-29 2019-12-26 Станислав Евгеньевич Волчков Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения
RU2729423C2 (ru) * 2018-12-19 2020-08-06 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Способ выделения свободных и экзосомальных микроРНК из слюны
RU2748767C1 (ru) * 2020-08-27 2021-05-31 Гордейчук Владимир Евгеньевич Способ загрузки экзосом малыми некодирующими РНК
WO2022045927A1 (ru) * 2020-08-27 2022-03-03 ГОРДЕЙЧУК, Владимир Евгеньевич Способ загрузки экзосом малыми некодирующими рнк

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015094017A1 (ru) 2015-06-25
SG11201604889UA (en) 2016-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Masaoutis et al. Exosomes in lung cancer diagnosis and treatment. From the translating research into future clinical practice
CN105026911B (zh) 用于分离微囊泡的方法
Pant et al. The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities
US9868988B2 (en) Method to assess human allograft status from microrna expression levels
TWI727232B (zh) 個人化癌症疫苗的製備方法
CN101921759B (zh) 一种与宫颈癌及其癌前病变相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
CN102016037A (zh) 血清/血浆miRNA在HBV感染和肝癌早期诊断中的应用
Xu et al. Exosome: an emerging source of biomarkers for human diseases
JP2014522993A5 (ru)
Chen et al. miR-197 expression in peripheral blood mononuclear cells from hepatitis B virus-infected patients
Nachmany et al. Two potential biomarkers identified in mesenchymal stem cells and leukocytes of patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis
RU2548816C1 (ru) Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей
ES2908932T3 (es) Perfilado de ácidos nucleicos de microvesícula y usos del mismo como características distintivas en diagnóstico de rechazo de trasplante renal
JP6531987B2 (ja) 腎疾患診断のためのエクソソーム回収法
Glynn et al. Isolation of secreted microRNAs (miRNAs) from cell-conditioned media
Campos et al. Analytical technologies for liquid biopsy of subcellular materials
WO2020106853A1 (en) Compositions and methods for internal controls of microvesicle isolations
CN109055312A (zh) AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用
US20230183809A1 (en) Extracellular vesicles for treatment and diagnosis
EP3684383A1 (en) Methods and systems for detecting tissue conditions
Miron et al. Novel cellular and molecular approaches to stratification and treatment of colorectal cancer
CN111087442B (zh) 一种多肽提取方法
CN106544416A (zh) 一种用于检测胃癌的引物组及检测方法
Gupta et al. Exosomes as diagnostic tools
RU2571507C1 (ru) Способ диагностики и мониторинга онкологических заболеваний с использованием экзосом крови

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20161217

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20171018

PD4A Correction of name of patent owner
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20180215

PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20181008