RU1836081C - Способ получени иммуногенной композиции дл перорального введени - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к химико-фармацевтической промышленности и касаетс  способа получени  иммуногенной композиции дл  перорального введени . Цель - по- вышение стабильности. Сущность изобретени  заключаетс  в смешении им- муногена, способного иммунизировать человека или животных, и желатина 2 со средним мол.м. 80000-120000 и прочностью гел  более 150 (Блум, г.б. 2/3%), выращивании и нанесении кишечно-растворимой пленки. 6 з.п. ф-лы.

Description

(Л

С

Изобретение относитс  к химико-фармацевтической промышленности и касаетс  способа получени  иммуногенной композици  дл  перорального введени .

Цель изобретени  заключаетс  в созданий препарата дл  перорального введени , по звол ющего перорэльно вводить иммуно- гем с преодолением в результате различных прэблем, присущих препаратам дл  инъекций , но без снижени  активности иммуноге- на

В соответствии с насто щим изобретением получают стабильную композицию им- муногена дл  перорального введени , представл юща  собой высушенную сферическую форму, содержащую иммуноген, способный иммунизировать человека или животных, и желатин среднего молекул рного веса 80000-120000 и прочностью гел 

более 150 (Блуум, .г.6,2/3%). и така  форма  вл етс  тонкокишечной.

В насто щем изобретении термин иммуноген , способный иммунизировать человека или животных), употребл емый выше включает любые иммуногены, которые можно использовать дл  профилактики инфекционных заболеваний. Примерами их  вл ютс  дезактивированные вакцины (гриппа,  понского энцефалита, коклюша, тройна  вакцина, холеры, пневмококка и т.п.), ослабленные живые вакцины (полиомиелита , кори, краснухи, эпидемического паротита, ВСС, тифа, натуральной оспы и т.п.), токсоиды (дифтерии, столбн ка, анток- син тримерезурус, тифа, бутолин и т.п.) и компонентные вакцины (гримма НА, гепатита В, гепатита, отличного от А и В, герпеса и т.п.).

со

СА) О О 00

I

IGJ

Известен метод стабилизации живой вакцины полиомиелита сушкой вымораживанием , но нами найдено, что така  лиофи- лизованна.  сушкой вымораживанием вакцина непригодна в качестве исходного материала в насто щем изобретении.

Необходимо, чтобы желатин, вход щий в состав композиции изобретени , имел средний молекул рный вес 80000-120000 и прочность гел  выше 150 (Блум, г,, 6,2/3). Даже если средний молекул рный вес желатина находитс  в указанном интервале, прочность гел  менее 150 не может обеспечить композиции необходимой стабильно- сти. Максимальна  прочность гел  примен емого желатина примерно 340, а рекомендуема  прочность составл ет примерно 300. Исходные продукты дл  желатина не ограничены при условии удовлетворени  вышеуказанных условий.

Композици  изобретени  может быть получена добавлением желатина к содержащему иммуноген буферному физиологическому солевому раствору, смешиванием при низкой температуре (к примеру 0-10°С, предпочтительно 4-5°С) и нагреванием (например , ниже 50°С, предпочтительно ниже 40°С) с образованием зол . Композицию в виде зол  прикапывают к физиологически не довитой жидкости, котора  не смешиваетс  с водой и удельный вес которой ниже, чем у воды (например: касторовому маслу, камелиевому маслу, соевому маслу, жидкому парафину и т.п.) с превращением в результате в эластичную сферическую форму. В этом случае рекомендуетс , чтобы золь был нагрет, а вышеуказанна  жидкость была нагрета в своей верхней части и охлаждена в нижней части (например, до 0-10°С).

Полученную в результате эластичную сферическую форму постепенно сушат при атмосферном давлении и низкой температуре (например, при 0-10°С) предпочтительно 4-5 С) с образованием твердой сферической формы. Диаметр твердой сферической формы не ограничен конкретными значени ми , но предпочтительно составл ет 0,5-2 мм. Содержание воды в сферической форме предпочтительно менее 30%, более предпочтительно 20-10%.

Полученна  в результате сферическа  форма может быть непосредственно покрыта с поверхности тонкомышечным кроющим средством, соответственно подобранным из примен емых в данной области. Рекомендуемые примеры тонкокишечных кроющих средств включают; сополимер метакриловой кислоты, фталат гидроксип- роп ил метил целлюлозы, карбоксиметилэ- тилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозы.

очищенный шеллак, белый шеллак, этилцел- люлозу или аминоалкил-метакрилатный сополимер .

Покрытие может быть нанесено методом нанесени  пленочного покрыти  с помощью машины дл  нанесени  покрыти  в потоке или центрифужного транул тора. Полученную в результате тонкокишечную сферическую форму примен ют в качестве

препарата дл  перорального введени . Вместо вышеописанной методики к сферической форме (без тонкокишечного покрыти ) могут быть добавлены фармацевтически приемлемые наполнители или разбавители, св зующие средства и т.п. с образованием таблеток, которые затем могут быть покрыты тонкокишечным кроющим средством. Или же вышеописанна  сферическа  форма может быть помещена в тонкркишечную капсулу с получением капсулированного препарата.

При изготовлении сферической формы изобретени  необходимо использовать небольшое количество иммуногена по сравнению с примен емым желатином. Количество иммуногена зависит от типа используемого иммуногена. но, как правило, предпочтительно составл ет 1 50-1/100000000 относительно 1 части по массе желатина. При

использовании описанного метода может быть гарантирована стабильность иммуногена . Предположительно это можно объ снить тем, что иммуноген заключен в желатин в своей фиксированной конфигурации (в особенности конфигурации антигенной детерминанты, существующей в вирусе, микроорганизме или мертвом микроорганизме ) и без химического св зывани . Подтверждено , что иммуноген не образует

юньгатов с желатином.

Композици  изобретени  может содержать вспомогательное вещество. Рекомендуетс  использовать мурамилпептидное производное (описанное, например, в открыто отложенной за вке на Европейский патент №0316934А2) или аналог липида-А. Добавление вспомогательного вещества усиливает эффективность композиции и уменьшает колебани  в ее действии, завис щие от индивидуальных отличий.

При перорзльном введении композиции изобретени  в кишечные происходит растворение тонкокишечного покрыти  и затем желатина с выделением в кишечных иммуногена, который затем абсорбируетс  из пр мокишечного канала. Можно предположить , что иммунизаци  происходит в пей- еровых бл шках, наход щихс  в пр мокишечном канале.

Количество вводимой перорально ком- г озиции в сильной степени зависит от вида: г римен емого иммуногенз. К примеру, в случае гриппа обычно перорально в вод т Е 0-20000 АКЧ (число агглютинации эритро- по Чичу) дл  взрослого человека за один прием и, возможно, введение повтор т тем же путем спуст  2-4 недели после первого приема. В случае гепатита 8 в первый прием взрослому человеку перорально t вод т обычно 0,1-1 мг антигенного белка, i торое введение осуществл ют через 4 не- лели и третье введение провод т спуст  20- i 4 недели после первого введени . Таким образом, введение провод т трижды. В слу- ае понского энцефалита младенцу старше (I мес цев перорально ввод т дважды 10- 00 мкг антигенного белка с интервалом в -2 недели.

Изобретение иллюстрируетс  следую- щими примерами.

П р и м е р 1.

(1) Получение высушенной сферической формы.

Порошок желатина (20 г прочность гел  -300(Блуум, г.,6,2/3%).средний молекул р- шй вес около 100000. N1PP1 Ко., Лтд), добавл ют к вакцине гриппа НА (80 мл, 200 лкг/мл на белок, НА способность - 14000) и ;мешивают при 4°С. Дл  образовани  зол  ;месь нагревают до 40°С с перемешиванием . В то же врем  в калиброванный цилиндр на 1000 мл наливают 1000 мл соевого асла, верхнюю часть цилиндра (10 см от уровн  жидкости) нагревают до 40-50°С, а ;го нижнюю часть (50 см-6тг#на) охлаждают но 4°С. С помощью на 20 мл и диа- иетром 2 мм смесь в виде зол , нагретую до 10°С, прикапывают к заполн ющему градуированный цилиндр соевому маслу, после его оставл ют на 30 мин. Полученные в Ьезультате сферические формы перенос т /13 градуированного цилиндра в химический стакан и отмывают от соевого масла охлажденным ацетом. Далее сферические формы промывают 5000 мл холодной воды, повтор   операцию раз дес ть, и, наконец, прорывают 1000 мл водного спирта (60%). Полученные желатинизированные сферические формы сушат 4-5 дней при 4°С в бане с регулируемой температурой и получают высушенные сферические формы диаметром 0,5-2 мм и содержанием воды 15% относительно желатинизированной сферической формы.

(2). Электрофорез

Проведением электрофореза на НДС- полиакриламидном геле относительно вышеохарактеризованного желатина, антигена гриппа НА и высушенной сферической формы до нанесени  на ее пленочного покрыти  подтверждено, что желатин дает размытое п тно, антиген гриппа НА дает единственное п тно и высушенна  сферическа  форма дает два п тна, расположенные в местах, соответствующих п тнам желатина и антигена гриппа НА.

На основании этого сделан вывод о том, что желатин и антиген гриппа НА не образуют коньюгата.

(3) Тонкокишечное покрытие.

На высушенные сферические формы затем нанос т тонкокишечное пленочное покрытие , состав которого приведен в табл. 1.

По методике примера 1 применением вакцины гепатита В, вакцины  понского энцефалита , вакцины коклюша, вакцины гепатита (отличного от А и В) и дезактивированной вакцины гриппа в концентраци х , указанных в табл.2, получены соответственно высушенные сферические формы и высушенные сферические формы с пленочным покрытием.

Примеры 7-10. По методике примера 1 использованием вакцины гриппа НА и желатина (средний молекул рный вес около 100000) с различной прочностью гел  получены высушенные сферические формы.

Каждую высушенную сферическую форму (0,1 г) раствор ют в 5 мл фосфатного буфера, содержащего коллагеназу, и провод т НА (гемагглутинин) тест в присутствии эритроцитов цыпл т с определением антигенной способности формы.

Результаты испытаний приведены в табл.3, согласно которой люба  сферическа  форма, полученна  использованием желатина с прочностью гел  более 150, обладает достаточной НА способностью.

Пример 11. Вместо высушенной сферической формы с содержанием воды в 15% относительно желатинизированной сферической формы получены сферические формы с содержанием воды соответственно 30%, 40% и 50% относительно желатиниэи- рованной сферической формы.

, После выдерживани  каждой сферической формы в течение 20 дней при 40°С осуществлен НА-тест. Соответственно дл  содержащей 30% воды сферической формы ее НА-способность составл ет 106.7, в то врем  как НА-способность высушенной сферической формы примера составл ет 128.

Напротив, высушенные сферические формы с содержанием воды в 40% и 50% про вл ют НА-способность. соответственно составл ющую 64 и 42,7, что оказываетс  неприемлемым.

Пример 12. По методике примера 1 получена высушенна  сферическа  форма, содержаща  вакцину гриппа НА, нос добавлением в качестве вспомогательного вещества в концентрации 100 мкг/мл мурамил пептида.

Проведенный дл  полученной высушенной сферической формы КА-тест дает значение НА-способноети. в 106,7. Полученный результат не показывает заметного уменьшени  НА-способности (см. пример 10).

Испытани  на стабильность.

Проведено определение сохранени  антигенной способности в ходе выдерживани  при 40°С высушенных сферических форм (перед нанесением на них пленочного покрыти ), полученных в примерах 1-6. Дл  сравнени  определ ют сохранение антигенной способности дл  каждой из вакцин, использованных в качестве исходных продуктов при получении соответствующих высушенных сферических форм. Антиген стабилен в любой из высушенных сферических , форм примеров 1-6.

Испытание иммунности.

На высушенные сферические формы примеров 1, 2, 6 и 12 нанос т пленочное покрытие, после чего выдерживают 20 дней при 40°С. затем соответствующими высушенными сферическими формами и затем у них раз в неделю отбирать кровь. Методом ферментного иммуносорбентного анализа в каждом образце сыворотки собранной крови определ ют антитела к 10 М. В сравнительных цел х примен ют те, же вакцины, что и дл  получени  соответствующих высушенных сферических форм.

Пример 13. Тонкокишечное покрытие .

На сферическую форму изобретени  в количестве 15% относительно сферической формы нанос т тонкокишечную пленку следующего состава:

Ацетат - сукци- . нат гидроксип-

ролилметилцеллюлозы2 ,5 части по массе

Шеллак0,5 части по массе

Тальк0,3 части по массе

Глицериновый

эфир жирной

кислоты0.3 масти по массе

Этанол25 частей по массе

ДихлорэтанДополн ющее кол-во

Итого100 частей, по массе

Пример 14. На высушенную сферическую форму изобретени  в количестве 10% относительно высушенной .сферической формы нанос т тонкокишечное кроющее средство следующего состава:

Фталат гидроксип роп ил метил- целлюлозы5 частей по массе

Глицериновый

эфир жирной

кислоты0.5 части по.массе

ШеллакОтчасти по массе

0 Этанол45 частей по массе

.Дихлорэтан Дополн ющее кол-во

Всего100 частей,ло массе

Затем на высушенную сферическую форму с покрытием в количестве, 10% отно- 5 сительно высушенной сферической формы нанос т пленку следующего состава:

Ацетат-су к цй нат

гидроксипропилмети л целлюлозы 2,5 части по массе 0 Шеллак0,5 части по массе

Тальк0,3 части по массе

Глицериновый

эфир жирной

кислоты0,3 части по массе

5 Этанол25 части по массе

ДихлорэтанДополн ющее кол-во

Всего100 частей по массе,

П р и м е р 15.

Прессуют следующие компоненты: 0 Высушенна 

сферическа  . . -

форма; 20 частей по iacce

Лактоза70 частей по массе

КрахмалДополн ющее кол-во

5 Стеарат магни  0,5 части по массе

Всего100 частей по массе.

Затем на полученные таблетки в количестве 5% относительно таблетки -нанос т тонкокишечную пленку состава, приведен- 0 ного в примере Т.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и  

Claims (7)

1.Способ получени  иммуногенной композиции дл  перорального введени  путем нанесени  иммуногена на носитель, о т5 л и ч а ю щ и и с   тем, что, с целью повышени  стабильности, добавл ют желатин со средней мол.м. 80000-120000 и прочностью гел  более 150 (Блум, г.б. 2/3%) к содержащему иммуноген буферному физио0 логическому солевому раствору, смешивают компоненты при низкой температуре, нагревают смесь с образованием зол , перенос т золь в несовместимую с водой физиологически нетоксичную жидкость, вы5 сушивэют полученную эластичную форму при низкой температуре с образованием твердой сферической формы и затем нанос т кишечно-растворимую пленку.

2.Способ по п.1, Q т л и ч а ю щ с   тем, что низка  температура при смешении

компонентов при высушивании эластичной сферической формы находитс  в интервале

оНо°с.

-

- .

3.Способ по л.1, о т л и ч а ю щ и и с   TJ5M, что нагревание смеси провод т при температуре ниже 50°С.

4.Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и. и с   TJJM, что физиологически нетоксична  жид- кЬсть  вл етс  касторовым маслом, камели- езым маслом, соевым маслом или жидким парафином.

Пример

Вакцина

Гепатит В

Японский энцефалит

Коклюш

Гепатит (отличный от А и В)

Грипп (дезактивированна )

5.Способ по п.1, отличающийс  тем, что количество используемого иммуно- гена составл ет (50-100000000) по отношению к массе желатина.

6.Способ по п.1.отличающий с   тем, что иммуноген направлен против гриппа ,  понского энцефалита, гепатита В, коклюша или гепатитов не А и не В.

7.Способ по п.1, отличаю щи и с   тем, что композици  содержит адьювант, способный усиливать иммуногенные свойства иммуногена.

Таблица 1

Таблица 2

Примен ема  дл  приготовлени  концентраци  (мкг/мл) на белок

30 мкг/мл на белок 50 мкг/мл на белок 80 мкг/мл на белок 10 мкг/мл на белок 600 мкг/мл на белок