RU1831500C - Способ снижени гетерогенности секретированных моноклональных антител - Google Patents

Abstract

Использование: изобретение относитс  к области биологии и касаетс  способа снижени  гетерогенности секретированных мо- ноклональных антител. Предложение  вл етс  пионерским. Сущность изобретени  заключаетс  в обработке культуральной жидкости, продуцирующей моноклональ- ные антитела карбоксипептидазой В при соотношении секретированные гетерогенные моноклональные антитела: фермент 100:1, инкубировании смеси в течение 5 ч. выращивании при температуре 22-23сС и выделении целевого продукта в гомогенной форме. Положительный эффект предложени  заключаетс  в получении гомогенных антител, которые можно выделить в чистом виде гель-фильтрацией.

Description

Изобретение относитс  к биологии и касаетс  способа снижени  гетерогенности секретированных моноклональных антител.

Крупномасштабное производство моноклональных антител из клеток гибридом вызвало революцию в прогнозе, диагностике и лечении различных болезненных состо ний , Моноклональные антитела также полезны в определении стадий различных природных состо ний, таких как беременность . Однако, было установлено, что многие полученные из гибридов антитела про вл ют гетерогенные формы, которые сильно мешают процессам очистки и выделени , необходимом дл  достижени  высоких выходов из промышленных штаммов. Катионнообменна  хроматографи  показывает , что существует, по меньшей мере, три дискретных гетерогенных формы антитела, выделенного из клеток, выращенных ин вит- ро. Эти формы могут по вл тьс  в различных относительных количествах. Эти

гетерогенные формы не обнаружены в таком же количестве в асцит-выделенных антителах , хот  производство высоких уровней антител из асцитов намного более трудоемкий и дорогой процесс дл  коммерческих целей.

Биохимическа  основа дл  этой гетерогенности возникает из наличи  избыточной аминокислоты или кислот, присоединенной к карбокси-окончанию т желых цепей антитела . Терминальна  аминокислота наиболее веро тно удал етс  во врем  внутренней обработки или выделени  антитела из клетки , тогда как предполагаема  последовательность аминокислот, полученна  из ДНК-последовательности гена антитела, действительно содержит дополнительную аминокислоту. Одной из этих трех гетерогенных форм  вл етс  антитело, которое не содержит дополнительной терминальной аминокислоты в любой из своих т желых цепей. Втора  из трех дискретных гетероы

ел о о

w

генных форм содержит дополнительную аминокислоту в одной из своих т желых цепей , в то врем  как треть  форма содержит дополнительные аминокислоты в обеих т желых цеп х.

Насто щее изобретение включает способ специального отщеплени  дополнительной аминокислоты от т желых цепей гетерогенных антител, тем самым превраща  все три формы в одну, по существу, чистую, гомогенную смесь. Разработка и применение технологии моноклональных антител зависит от доступности больших объемов по существу гомогенных антител. Эта разработка в какой-то степени сдерживаетс  невозможностью легкой очистки и характеристики различных гетерогенных форм выделенных антител. Насто щее изобретение полезно и особенно важно в том, что оно позвол ет преобразовать большинство гетерогенных антител в одну по существу гомогенную форму перед очисткой. Это преобразование приводит к высокому выходу антитела с более определенными биохимическими характеристиками, а также к снижению загр знени  гетерогенными формами антитела при очистке. Более того, обладание сверхчистыми одноформными антителами значительно увеличивает ре- продуктивность и логичность последующих модификаций, таких как реализации имму- ноконъюгации или иммуномобилизации.

Способ снижени  гетерогенности выделенных антител включает добавление кар- боксипептидазы в культуральную жидкость, содержащую выделенные антитела при СР1Р соотношении, достаточном дл  снижени  гетерогенности указанных антител, затем выращивании культуральной жидкости в течение определенного времени и при температуре и рН, достаточных дл  редукции гетерогенности антител.

Способ осуществл етс  следующим образом .

П р и м е р 1. Культура гибридомы СЕМ231.6.7.

Гибридому СЕМ231.6.7, котора  выдел ет моноклональное антитело СКМ231, получают из АТСС (Американской коллекции типов-культуры) 12301 Парклоун драйв, Роквил, Мэриленд 20852, Гибридома СЕМ 231.6.7  вл етс  частью коллекций штаммов ТСС и доступна специалистам как источник и вместилище штаммов антитела под номером АТСС НВ9620. Замороженные клетки быстро размораживают, затем сразу промывают 10мл среды HLI, дополненной 4 мМ глутамина. Среда HLI поставл етс  фирмой Вентрекс из Портланда, гр.Мэйн. Клетки помещают в Т-колбу и выращивают до достижени  высокой концентрации клеток.

Вращающиес  250 мл колбы, содержащие среду HLI, дополненные 4 мМ глутами5 на, засе ли 300000 клеток/см СЕМ 231.6.7, которые выдел ли антитело. Эти клетки выращивали при 37°С 48 ч до достижени  концентрации клеток 900000 клеток/мг. Затем в каждую вращающуюс  колбу добавили

Ю другую аликвоту глутамина дл  доведени  конечной концентрации культуры до 4 мМ глутамина. Вращающиес  колбы, содержащие клетки СЕМ 2.31.6.7, затем выращивали при 37°С еще 8-10 суток.

15 После конечного выращивани  клеточную культуру вылили в две 250 мл колбы и центрифуговали при 10000 оборотах/минуту 12 мин в роторе Beckmann IA8 на центрифуге . Выделили около 375 мл супернатанта

20 и предварительна  количественна  оценка показала, что концентраци  антитела составл ла около 80 мкг/мл. Культуральную среду затем концентрировали до 40 мл, использу  400 мл перемешиваемый концент25 ратор клеток, снабженный фильтром УМ10 76 мм (производство Amlcqn Corporation, Sclentific.Syg, что после 24 часов более 80% антител превратились в первичную гомогенную форму, в то врем  как контрольные про30 бы, выращиваемые без асцитической жидкости остались почти эквимол рными во всех трех гетерогенных формах.

Пример 4. Преобразование антитела СЕМ 231, использу  способ СР.

35 Примерно 5 мг аликвоты концентрата антитела СЕМ231 выращивали при 22-23°С 5 ч с 50 мкг карбоксипептидазы В. Карбок- сипептидазу В представл ет Calllochem P.O. Box. 12087, Sor. Diego California 92112

40 и она имеет ферментную активность 295 1/мг. Следовательно, эта реакци  соответствует ОР1Р соотношению 3,0. После 5-часового выращивани , гетерогенность пробы оценили катион-обменной хроматографией

45 на колонке Mono-SHR 5/5, рН 4,5 в 0.17М буфере ацетата натри  с градиентом 0,0-0,2 М NaCl. Экспериментальные данные показали , что более 95% антител в пробе преобразовались в первичную гомогенную форму,

50 в то врем  как необработанные антитела сохранили почти эквимол рное соотношение гетерогенных форм.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ снижени  гетерогенности сек55 ротированных моноклональных антител путем отщеплени  аминокислоты или аминокислот от карбоксиконца одной или обеих цепей моноклональных антител посредством добавлени  карбоксипептидазы В в культуральную жидкость, продуцирую

   щую моноклональные антитела при соотно- инкубировани  смеси в течение 5 ч, пыр щи- шении секретированные гетерогенные мо- вани  при температуре 22 23fJC и выделе- ноклонэльные антитела: фермент 1001:1. нии целевого продукта в гомогенной форме.