RS65415B1 - Anti-garp antitelo - Google Patents

Anti-garp antitelo

Info

Publication number
RS65415B1
RS65415B1 RS20240428A RSP20240428A RS65415B1 RS 65415 B1 RS65415 B1 RS 65415B1 RS 20240428 A RS20240428 A RS 20240428A RS P20240428 A RSP20240428 A RS P20240428A RS 65415 B1 RS65415 B1 RS 65415B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
antibody
seq
sequence
positions
Prior art date
Application number
RS20240428A
Other languages
English (en)
Inventor
Kazuki Satoh
Kazuki Hirahara
Ichiro Watanabe
Masato Amano
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of RS65415B1 publication Critical patent/RS65415B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Napomene:
Potpun dokument koji uključuje referentnu tabelu (tabele) i listu (liste) sekvenci može se preuzeti sa veb-stranice EPO-a
Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na antitelo koje se vezuje za GARP i korisno je kao terapijsko sredstvo protiv tumora, i na postupak za lečenje tumora u kojem se koristi gore pomenuto antitelo.
Stanje tehnike
[0002] Regulatorne T ćelije (Treg) su glavne uzročne ćelije koje indukuju imunsku toleranciju koja se zapaža u području tumora, kod pacijenata obolelih od kancera. Drugim rečima, kod pacijenata obolelih od kancera, grupe imunskih ćelija kojima je prirođeno da rade na ubijanju tumora, prelaze u stanje imunske supresije aktiviranim Treg u tumoru, a to dovodi do maligne progresije tumora [Nepatentna literatura 1].
[0003] GARP (Glycoprotein-A Repetitions Predominant, glikoprotein A sa preovlađujućim ponovcima) je protein sa jednim transmembranskim domenom [Nepatentna literatura 2], i ovaj protein se eksprimira na površini aktiviranih Treg i formira kompleks sa latentnim TGF-β (prekursor TGF-β koji je molekul važan za indukovanje imunske tolerancije) [Nepatentna literatura 3].
[0004] Kao rezultat međućelijske interakcije između Treg i ciljnih ćelija čiju imunosupresiju Treg indukuju, pomoću GARP na površini Treg, latentni TGF-β sazreva i izlučuje se iz Treg, i imunosupresivni signali TGF-β prenose se direktno do ciljnih ćelija [Nepatentna literatura 4, 5]. Pokazano je da je za takvo sazrevanje TGF-β potrebno da se na površini ćelije eksprimira membranski GARP [Nepatentna literatura 5]. Sa druge strane, pokazano je takođe da solubilni GARP, kojem nedostaje transmembranski region, suprimira proliferaciju CD4 pozitivnih T ćelija kada se direktno doda ćelijskoj kulturi [Nepatentna literatura 6]. Prema tome, ne može se odbaciti mogućnost postojanja imunosupresivnog mehanizma GARP koji ne zahteva sazrevanje TGF-β na ćelijskoj membrani.
[0005] GARP ne eksprimiraju samo Treg iz periferne krvi kada se aktiviraju nego i u kliničkoj postavci, tumor-infiltrirajuće T ćelije na mestima tumora kod pacijenata obolelih od kancera [Nepatentna literatura 7], Treg koje postoje u ascitu [Nepatentna literatura 8], i takođe Treg koje cirkulišu u perifernoj krvi pacijenata obolelih od kancera [Nepatentna literatura 9].
[0006] U izveštaju u kojem se istražuje efekat inhibiranja ekspresije GARP na funkciju Treg, siRNK koja cilja GARP inhibira imunosupresivnu funkciju Treg na proliferativne odgovore pomagačkih T ćelija, ali takav inhibitorni efekat je delimičan [Nepatentna literatura 10].
[0007] U drugom izveštaju, anti-GARP antitela (MHG-8 i LHG-10) dobijena zbog svoje sposobnosti da inhibiraju sazrevanje TGF-β, inhibirala su supresivnu funkciju A1 ćelija koje predstavljaju ćelijsku liniju Treg [Nepatentna literatura 11] uspostavljenu od ćelija pacijenata sa hemohromatozom, na proliferativne odgovore pomagačkih T ćelija [Patentna literatura 1 i Nepatentna literatura 12]. Međutim, nije poznato da li gore pomenuta antitela efikasno ispoljavaju takve inhibitorne efekte na Treg u tumorskoj mikrosredini, i do sada još uvek nije saopšteno da ijedno anti-GARP antitelo ima takve efekte. Antitelo koje prepoznaje i GARP i TGF-β takođe je poznato [Patentna literatura 2].
[0008] Pokazano je da su prekomerno prisustvo i aktivacija Treg kod pacijenata koji imaju malariju i HIV infekciju, u korelaciji sa bolesnim stanjem [Nepatentna literatura 13 i 14], i da uklanjanje Treg za rezultat ima remisiju bolesnog stanja u modelima ovih bolesti na miševima [Nepatentna literatura 15 i 16].
Spisak citirane literature
Patentna literatura
[0009]
Patentna literatura 1: WO2015/015003
Patentna literatura 2: WO2016/125017
Nepatentna literatura
[0010]
Nepatentna literatura: 1: Int J Cancer. 2010 Aug 15; 127(4): 759-67.
Nepatentna literatura: 2: PLoS One. 2008; 3(7): e2705.
Nepatentna literatura: 3: Proc Natl Acad Sci SAD.2009; 106(32): 13445-50.
Nepatentna literatura: 4: Eur J Immunol. 2009; 39(12): 3315-22.
Nepatentna literatura: 5: Mol Biol Cell. 2012; 23(6): 1129-39.
Nepatentna literatura: 6: Blood.2013; 122(7): 1182-91.
Nepatentna literatura: 7: Eur J Immunol. 2012 Jul; 42(7): 1876-85.
Nepatentna literatura: 8: Clin Immunol.2013 Oct; 149(1): 97-110.
Nepatentna literatura: 9: Cancer Res.2013; 73: 2435.
Nepatentna literatura: 10: Proc Natl Acad Sci SAD 2009 Aug 11; 106(32): 13445-50.
Nepatentna literatura: 11: Eur J Immunol. 2009; 39(12): 869-82.
Nepatentna literatura: 12: Sci Transl Med.2015 Apr 22; 7(284)
Nepatentna literatura: 13: PLoS One. 2008 Apr 30; 3(4): e2027.
Nepatentna literatura: 14: Clin Exp Immunol.2014 Jun; 176(3): 401-9.
Nepatentna literatura: 15: J Immunol. 2012 Jun 1; 188(11): 5467-77.
Nepatentna literatura: 16: PLoS Pathog. 2013; 9(12): e1003798.
Kratak opis pronalaska
Tehnički problem
[0011] Cilj predmetnog pronalaska je obezbeđivanje antitela koje inhibira funkciju Treg u tumoru i koje se, prema tome, koristi kao farmaceutski proizvod sa terapijskim efektom, postupka za lečenje tumora korišćenjem gore pomenutog antitela, i slično.
Rešenje problema
[0012] Ovi izumitelji izveli su intenzivne studije usmerene ka postizanju gore pomenutog cilja. Kao rezultat, izumitelji su pronašli antitelo koje se specifično vezuje za GARP i ispoljava aktivnost inhibiranja funkcije Treg putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela, čime je ovaj pronalazak dovršen. Specifično, predmetni pronalazak uključuje sledeće aspekte pronalaska.
(1) Antitelo koje ima sledeća svojstva:
(a) specifično se vezuje za glikoprotein-A sa preovlađujućim ponovcima (GARP);
(b) poseduje aktivnost inhibiranja imunosupresivne funkcije regulatornih T ćelija;
(c) poseduje aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (antibodydependent cellular cytotoxic (ADCC) activity); i
(d) poseduje in vivo antitumorsku aktivnost,
i koje ima:
(a) varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO (SEK ID BR): 33, i varijabilni region lakog lanca, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 37;
(b) varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 35, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 39; ili (c) varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 139 prikazane u SEQ ID NO: 41, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 43.
(2) Antitelo prema gornjem (1), pri čemu antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 33, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 37.
(3) Antitelo prema gornjem (1), pri čemu antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 35, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 39.
(4) Antitelo prema gornjem (1), pri čemu antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 139 prikazane u SEQ ID NO: 41, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 43.
(5) Antitelo prema bilo kojem od gornjih (1) do (4), pri čemu je tumor kancer.
(6) Antitelo prema gornjem (5), pri čemu je kancer – kancer pluća, kancer bubrega, kancer urotela, kancer kolona, kancer prostate, multiformni glioblastom, kancer ovarijuma, kancer pankreasa, kancer dojke, melanom, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer želuca, kancer jednjaka, ili kancer krvi.
(7) Antitelo prema bilo kojem od gornjih (1) do (6), koje ima:
(a) teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 33, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 37,
(b) teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 35, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 39, ili
(c) teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 469 prikazanu u SEQ ID NO: 41, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 43.
(8) Antitelo prema gornjem (7), koje ima: teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 33, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 37.
(9) Antitelo prema gornjem (7), koje ima: teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 35, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 39.
(10) Antitelo prema gornjem (7), koje ima: teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 469 prikazanu u SEQ ID NO: 41, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 43.
(11) Polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kojem od gornjih (1) do (10).
(12) Polinukleotid prema gornjem (11), koji ima:
(a) polinukleotid varijabilnog regiona teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 408 prikazane u SEQ ID NO: 32, i polinukleotid varijabilnog regiona lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 prikazane u SEQ ID NO: 36, (b) polinukleotid varijabilnog regiona teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 408 prikazane u SEQ ID NO: 34, i polinukleotid varijabilnog regiona lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 prikazane u SEQ ID NO: 38, ili (c) polinukleotid varijabilnog regiona teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 417 prikazane u SEQ ID NO: 40, i polinukleotid varijabilnog regiona lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 prikazane u SEQ ID NO: 42.
(13) Polinukleotid prema bilo kojem od gornjih (11) ili (12), koji ima:
(a) polinukleotid teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398 prikazane u SEQ ID NO: 32, i polinukleotid lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 prikazane u SEQ ID NO: 36,
(b) polinukleotid teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398 prikazane u SEQ ID NO: 34, i polinukleotid lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 prikazane u SEQ ID NO: 38, ili
(c) polinukleotid teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 1407 prikazane u SEQ ID NO: 40, i polinukleotid lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 prikazane u SEQ ID NO: 42.
(14) Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema bilo kojem od gornjih (11) do (13).
(15) Ćelije-domaćini transformisane ekspresionim vektorom prema gornjem (14). (16) Postupak za proizvodnju antitela od interesa ili njegovog fragmenta, koji uključuje korak kultivisanja ćelija-domaćina prema gornjem (15), i korak sakupljanja antitela od interesa iz kulture dobijene gore pomenutim korakom.
(17) Antitelo prema bilo kojem od gornjih (1) do (10), koje sadrži jednu ili dve ili više modifikacija odabranih iz grupe koja se sastoji od N-glikozilacije, O-glikozilacije, obrade N-terminusa, obrade C-terminusa, deamidacije, izomerizacije asparaginske kiseline, oksidacije metionina, adicije metioninske rezidue na N-terminus, amidacije prolinske rezidue, i teškog lanca koji sadrži deleciju jedne ili dve amino-kiseline na karboksil terminusu.
(18) Antitelo prema gornjem (17), pri čemu su jedna ili dve amino-kiseline deletirane na karboksil terminusu teškog lanca istog.
(19) Antitelo prema gornjem (18), pri čemu je jedna amino-kiselina deletirana na svakom od karboksil terminusa oba teška lanca istog.
(20) Antitelo prema bilo kojem od gornjih (17) do (19), pri čemu je prolinska rezidua na karboksil terminusu teškog lanca istog dodatno amidovana.
(21) Antitelo prema bilo kojem od gornjih (1) do (10) i (17) do (20), pri čemu je modifikacija šećernog lanca regulisana u cilju pojačanja ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela.
(22) Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno od antitela prema gornjim (1) do (10) i (17) do (21).
(23) Farmaceutska kompozicija prema gornjem (22), koja je za upotrebu u lečenju tumora.
(24) Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema gornjem (23), pri čemu je tumor kancer.
(25) Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema gornjem (24), pri čemu je kancer – kancer pluća, kancer bubrega, kancer urotela, kancer kolona, kancer prostate, multiformni glioblastom, kancer ovarijuma, kancer pankreasa, kancer dojke, melanom, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer želuca, kancer jednjaka, ili kancer krvi.
Povoljni efekti pronalaska
[0013] U skladu sa predmetnim pronalaskom, može se dobiti terapijsko sredstvo za kancer, koje sadrži antitelo koje se vezuje za GARP i koje ima antitumorsku aktivnost uzrokovanu ADCC-posredovanom inhibicijom Treg. Pored toga, prekomerno prisustvo i aktivacija Treg kod pacijenata koji imaju malariju i HIV infekciju u korelaciji su sa tim bolesnim stanjem, i uklanjanje Treg indukuje remisiju bolesnog stanja u mišjem modelu bolesti. Prema tome, može se očekivati da će efikasna inhibicija funkcije Treg imati terapijske efekte i na refraktorne infektivne bolesti kao što su one izazvane malarijom i HIV-om.
Kratak opis crteža
[0014]
[Slika 1] Slika 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 1) GARP-a.
[Slika 2] Slika 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2) teškog lanca 105F antitela.
[Slika 3] Slika 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3) lakog lanca 105F antitela.
[Slika 4] Slika 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4) teškog lanca 110F antitela.
[Slika 5] Slika 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5) lakog lanca 110F antitela.
[Slika 6] Slika 6 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 6) teškog lanca 105F antitela.
[Slika 7] Slika 7 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 7) lakog lanca 105F. antitela
[Slika 8] Slika 8 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 8) teškog lanca 110F antitela.
[Slika 9] Slika 9 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 9) lakog lanca 110F antitela.
[Slika 10] Slika 10 prikazuje vezivanje antitela za GARP.105F antitelo i 110F antitelo pokazuju svoje vezivanje za GARP, prema ELISA postupku.
[Slika 11] Slika 11 prikazuje specifično vezivanje antitela za GARP. 105F antitelo ne vezuje se za HEK293T ćelije u koje je uveden prazan vektor, i ispoljava vezivanje za HEK293T ćelije, u kojima se GARP eksprimira prolazno.
[Slika 12] Slika 12 prikazuje specifično vezivanje antitela za GARP. 105F antitelo ispoljava aktivnost vezivanja za L428 ćelije koje endogeno eksprimiraju GARP.
[Slika 13] Slika 13 prikazuje specifično vezivanje antitela za GARP. 105F antitelo pokazuje aktivnost vezivanja za aktivirane Treg.
[Slika 14] Slika 14 prikazuje ADCC aktivnost antitela. Kada se ciljaju L428 ćelije koje endogeno eksprimiraju GARP, nađen je porast ADCC aktivnosti na način zavisan od koncentracije 105F antitela.
[Slika 15] Slika 15 prikazuje inhibitornu aktivnost antitela na funkciju Treg. 105F antitelo (50 µg/mL) inhibira supresivnu funkciju Treg na proliferaciju pomagačkih T ćelija.
[Slika 16] Slika 16 prikazuje inhibitornu aktivnost antitela na funkciju Treg. 105F antitelo (10 µg/mL) inhibira supresivnu funkciju Treg na proliferaciju pomagačkih T ćelija, Sa druge strane, MHG-8 i LHG-10 antitela ne pokazuju efekat na supresivnu funkciju Treg na proliferaciju pomoćnih T ćelija.
[Slika 17] Slika 17 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 25) teškog lanca c151D antitela.
[Slika 18] Slika 18 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 27) lakog lanca c151D antitela.
[Slika 19] Slika 19 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 29) teškog lanca c198D antitela.
[Slika 20] Slika 20 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 31) lakog lanca c198D antitela.
[Slika 21] Slika 21 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 33) h151D-H1 teškog lanca.
[Slika 22] Slika 22 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 37) h151D-L1 lakog lanca.
[Slika 23] Slika 23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 35) h151D-H4 teškog lanca.
[Slika 24] Slika 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 39) h151D-L4 lakog lanca.
[Slika 25] Slika 25 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 41) h198D-H3 teškog lanca.
[Slika 26] Slika 26 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 43) h198D-L4 lakog lanca.
[Slika 27] Slika 27 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 24) teškog lanca c151D antitela.
[Slika 28] Slika 28 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 26) lakog lanca c151D antitela.
1
[Slika 29] Slika 29 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 28) teškog lanca c198D antitela.
[Slika 30] Slika 30 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 30) lakog lanca c198D antitela.
[Slika 31] Slika 31 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 32) h151D-H1 teškog lanca antitela.
[Slika 32] Slika 32 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 36) h151D-L1 teškog lanca antitela.
[Slika 33] Slika 33 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 34) h151D-H4 teškog lanca.
[Slika 34] Slika 34 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 38) h151D-L4 lakog lanca.
[Slika 35] Slika 35 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 40) h198D-H3 teškog lanca.
[Slika 36] Slika 36 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 42) h198D-L4 lakog lanca.
[Slika 37] Slika 37 prikazuje vezujuću aktivnost svakog od antitela za GARP-eksprimirajuće ćelije. h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pokazuju specifičnu aktivnost vezivanja za GARP.
[Slika 38] Slika 38 prikazuje vezujuću aktivnost svakog od antitela za GARP-TGF β1-koeksprimirajuće ćelije. Pojedinačna antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 vezuju se za GARP i za GARP mutant, koji se koeksprimiraju sa TGFβ1, i ova antitela pokazuju aktivnost vezivanja za regione u GARP koji su različiti od onih u slučaju vezivanja sa poznatim antitelima MHG8 i LHG10.
[Slika 39] Slika 39 prikazuje vezujuću aktivnost svakog od antitela za L428 ćelije. Pojedinačna antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pokazuju aktivnost vezivanja za endogeno eksprimirani GARP.
[Slika 40] Slika 40 prikazuje vezujuću aktivnost svakog od antitela za Treg. Pojedinačna antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pokazuju aktivnost vezivanja za FoxP3-pozitivne Treg.
[Slika 41] Slika 41 prikazuje ADCC aktivnost svakog od antitela. Pojedinačna antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pokazuju ADCC aktivnost.
[Slika 42] Slika 42 prikazuje inhibitornu aktivnost svakog od antitela na funkciju Treg. Pojedinačna antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pokazuju inhibitornu aktivnost na funkciju Treg.
[Slika 43] Slika 43 prikazuje supresivnu aktivnost Treg na aktivnost CTL u lizi ciljnih ćelija.
[Slika 44] Slika 44 prikazuje povišenje antitumorske aktivnosti svakog od antitela. Pojedinačna antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, i h198D-H3L4 inhibiraju supresivnu funkciju Treg na aktivnost CTL u lizi ciljnih ćelija.
[Slika 45] Slika 45 prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost svakog od antitela. Pojedinačna antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, i h198D-H3L4 pokazuju antitumorsku aktivnost u modelima in vivo.
Detaljan opis
[0015] U ovom opisu, pojam "kancer" koristi se tako da ima isto značenje kao pojam "tumor".
[0016] U ovom opisu, pojam "gen" koristi se tako da uključuje ne samo DNK nego i njenu iRNK(eng. mRNA) i cDNK, i njenu cRNK.
[0017] U ovom opisu, izraz "polinukleotid" koristi se tako da ima isto značenje kao nukleinska kiselina, i uključuje DNK, RNK, probu, oligonukleotid, i prajmer.
[0018] U ovom opisu, pojam "polipeptid" koristi se tako da se ne razlikuje od pojma "protein".
[0019] U ovom opisu, pojam "ćelija" uključuje ćelije u pojedinačnoj životinji, i kultivisane ćelije.
[0020] U ovom opisu, pojam "GARP" koristi se tako da ima isto značenje kao GARP protein.
[0021] U ovom opisu, pojam "citotoksičnost" koristi se da označi da je patološka promena izazvana kod ćelija na bilo koji dati način. Ne označava samo direktnu traumu, nego označava i sve tipove strukturnih i funkcionalnih oštećenja nanetih ćelijama, kao što su sečenje DNK, formiranje dimera baza, sečenje hromozoma, oštećenje mitotičkog aparata ćelije, i smanjenje aktivnosti različitih tipova enzima.
[0022] U ovom opisu, izraz "citotoksična avktivnost" koristi se da označi aktivnost koja izaziva gore opisanu citotoksičnost.
[0023] U ovom opisu, izraz "ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela" koristi se da označi "aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC)" i ova aktivnost označava efekat ili aktivnost oštećivanja ciljnih ćelija kao što su tumorske ćelije putem NK ćelija, posredovanu antitelom.
[0024] U ovom opisu, pojam "epitop" koristi se da označi parcijalni peptid ili parcijalnu trodimenzionalnu strukturu GARP za koju se vezuje specifično anti-GARP antitelo. Takav epitop koji je parcijalni peptid gore opisanog GARP-a, može se odrediti postupkom koji je dobro poznat stručnjaku u oblasti, kao što je imunotest, na primer, sledećim postupkom. Prvo, proizvedu se različite parcijalne strukture antigena. Što se tiče proizvodnje takvih parcijalnih struktura, može se primeniti poznata tehnika sinteze oligopeptida. Na primer, tehnikom rekombinacije gena koja je dobro poznata stručnjaku u oblasti, proizvede se niz peptida u kojima se antigen uzastopno skraćuje do odgovarajuće dužine, počevši od C-terminusa ili N-terminusa, a posle toga se proučava reaktivnost antitela na takve polipeptide, i mesta prepoznavanja se grubo određuju. Posle toga, sintetišu se još kraći peptidi, i zatim se proučava reaktivnost istog prema gore navedenim peptidima, kako bi se odredio epitop. Pored toga, epitop, koji je parcijalna trodimenzionalna struktura antigena, koja se vezuje sa specifičnim antitelom, može se odrediti specifikovanjem aminokiselinskih rezidua antigena koje se nalaze uz gore opisano antitelo, atrukturnom analizom X-zracima.
[0025] U ovom opisu, izraz "antitela koja se vezuju za isti epitop" koristi se da označi različita antitela koja se vezuju za zajednički epitop. Ako se drugo antitelo vezuje za parcijalni peptid ili parcijalnu trodimenzionalnu strukturu, za koju se vezuje prvo antitelo, može se odrediti da se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za isti epitop. Pored toga, potvrđivanjem da drugo antitelo kompetira sa prvim antitelom u vezivanju prvog antitela za antigen (tj., drugo antitelo interferira sa vezivanjem prvog antitela za antigen), može se odrediti da se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za isti epitop, čak i ako specifična sekvenca ili struktura epitopa nisu određene. Pored toga, kada se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za isti epitop i dodatno, prvo antitelo ima specifične efekte kao što je antitumorska aktivnost, može se očekivati da drugo antitelo ima istu aktivnost kao što je ona prvog antitela. Prema tome, ako se drugo anti-GARP antitelo vezuje za parcijalni peptid za koji se vezuje prvo anti-GARP antitelo, može se odrediti da se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za isti epitop GARP. Pored toga, potvrđivanjem da drugo anti-GARP antitelo kompetira sa prvim anti-GARP antitelom u vezivanju prvog anti-GARP antitela za GARP, može se odrediti da su prvo antitelo i drugo antitelo antitela koja se vezuju za isti epitop na GARP-u.
[0026] U ovom opisu, pojam "CDR" koristi se da označi region koji određuje komplementarnost. Poznato je da svaki teški lanac i svaki laki lanac molekula antitela ima tri CDR-a. Takav CDR se označava i kao hipervarijabilni domen, i lociran je u varijabilnom regionu teškog lanca i varijabilnom regionu lakog lanca antitela. Ovi regioni imaju posebno visoko variijabilnu primarnu strukturu i razdvojeni su u tri oblasti u primarnoj strukturi
1
polipeptidnog lanca, unutar svakog teškog lanca i svakog lakog lanca. U ovom opisu, u vezi sa CDR antitela, CDR-ovi teškog lanca označavaju se kao CDRH1, CDRH2, odnosno CDRH3, počevši od amino-terminalne strane aminokiselinske sekvence teškog lanca, dok se CDR-ovi lakog lanca označavaju kao CDRL1, CDRL2, odnosno CDRL3, od amino-terminalne strane aminokiselinske sekvence lakog lanca. Na trodimenzionalnoj strukturi, tri mesta su locirana jedno u blizini drugog, i određuju specifičnost antitela prema antigenu za koji se antitelo vezuje.
[0027] U ovom opisu, izraz "hibridizovati pod stringentnim uslovima" koristi se da označi da se hibridizacija odvija u komercijalno dostupnom rastvoru za hibridizaciju ExpressHyb Hybridization Solution (proizvođač Clontech) na 68°C, ili da se hibridizacija odvija pod uslovima u kojima se hibridizacija odigrava korišćenjem DNK-imobilišućeg filtera u prisustvu 0.7-1.0 M NaCl na 68°C, i dobijeni proizvod se zatim ispira na 68°C, 0.1- do 2-strukom koncentracijom SSC rastvora (gde se 1 x SSC sastoji od 150 mM NaCl i 15 mM natrijum citrata) radi identifikacije, ili pod uslovima ekvivalentnim tome.
1. GARP
[0028] GARP upotrebljen u ovom opisu može se prečistiti direktno iz GARP-eksprimirajućih ćelija humanog ili nehumanog sisara (npr., pacov, miš, itd.) i može se posle toga upotrebiti, ili se može pripremiti frakcija ćelijske membrane gore pomenutih ćelija i koristiti kao GARP. Alternativno, GARP se može dobiti i sintetisanjem in vitro, ili omogućavanjem genetičkom manipulacijom da ćelije-domaćini proizvedu GARP. Prema takvoj genetičkoj manipulaciji, GARP protein može da se dobije, specifično, inkorporisanjem GARP cDNK u ekspresioni vektor sposoban da eksprimira GARP cDNK, i zatim sintetisanjem GARP u rastvoru koji sadrži enzime, supstrat i energetske materijale potrebne za transkripciju i translaciju, ili transformisanjem ćelije-domaćina drugih prokariota ili eukariota, tako da im se omogući da eksprimiraju GARP.
[0029] Aminokiselinska sekvenca humanog GARP-a prikazana je u SEQ ID NO: 1 u listi sekvenci. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 1 prikazana je na Slici 1.
[0030] Pored toga, GARP uključuje i protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja sadrži supstituciju, deleciju i/ili adiciju jedne ili nekoliko amino-kiselina u gore opisanoj aminokiselinskoj sekvenci GARP-a i ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj koju ima GARP protein.
[0031] Zreli humani GARP, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca, odgovara sekvenci aminokiselina koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 662 u sekvenci aminokiselina prikazanoj u SEQ ID NO: 1.
[0032] Pored toga, protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja sadrži supstituciju, deleciju i/ili adiciju jedne ili nekoliko amino-kiselina u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 1, ili u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 1 iz koje je uklonjena signalna sekvenca, i koja ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj koju ima GARP, takođe je uključena u GARP. Pored toga, protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kodirane splajsujućom varijantom transkribovanom sa humanog GARP genskog lokusa ili aminokiselinske sekvence koja uključuje supstituciju, deleciju i/ili adiciju jedne ili nekoliko amino-kiselina u gore pomenutoj aminokiselinskoj sekvenci, i koji ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj koju ima GARP, takođe je uključen u GARP.
2. Proizvodnja anti-GARP antitela
[0033] Primer antitela na GARP ovog opisa, ali koje nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, može biti anti-GARP humano antitelo. Anti-GARP humano antitelo označava humano antitelo koje ima samo gensku sekvencu antitela poreklom iz humanih hromozoma.
[0034] Anti-GARP humano antitelo može se dobiti postupkom u kojem se koristi miš koji proizvodi humano antitelo, koji ima fragment humanog hromozoma, koji sadrži gene teškog lanca i lakog lanca humanog antitela (vidi Tomizuka, K. i sarad., Nature Genetics (1997) 16, str. 133-143,; Kuroiwa, Y. i sarad., Nucl. Acids Res. (1998) 26, str.3447-3448; Yoshida, H. i sarad., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol.10, str.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. ed.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (2000) 97, str.722-727; itd.).
[0035] Takav miš koji proizvodi humano antitelo može se specifično proizvesti korišćenjem genetički modifikovane životinje čiji su genski lokusi teškog lanca i lakog lanca endogenog imunoglobulina narušeni i umesto njih su uvedeni genski lokusi teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina, uz korišćenje veštačkog hromozoma kvasca (yeast artificial chromosome, YAC) kao vektora, ili slično, i zatim proizvodnjom knock-out životinje i transgene životinje od takve genetički modifikovane životinje, i zatim međusobnim ukrštanjem takvih životinja.
[0036] U drugom slučaju, anti-GARP humano antielo može se dobiti i transformisanjem eukariotskih ćelija pomoću cDNK koja kodira svaki od teškog lanca i lakog lanca takvog humanog antitela, ili poželjno vektorom koji sadrži cDNK, u skladu sa tehnikama genetičke
1
rekombinacije, i zatim kultivisanjem transformiranih ćelija koje proizvode genetički modifikovano humano monoklonsko antitelo, tako da se antitelo može dobiti iz supernatanta kulture. Kao ćelije-domaćini mogu se koristiti, na primer, eukariotske ćelije, i poželjno ćelije sisara kao što su CHO ćelije, limfociti ili ćelije mijeloma.
[0037] Alternativno, antitelo se može dobiti i postupkom dobijanja humanog antitela odabranog iz biblioteke humanih antitela, prikazivanjem na fagima (vidi Wormstone, I. M. i sarad., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), str. 2301-2308; Carmen, S. i sarad., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), str. 189-203; Siriwardena, D. i sarad., Ophthalmology (2002) 109 (3), str. 427-431; itd.). Na primer, može se primeniti postupak prikazivanja na fagima, koji uključuje omogućavanje eksprimiranja varijabilnog regiona humanog antitela kao jednolančanog antitela (single chain antibody, scFv) na površini faga, i zatim odabiranje faga koji se vezuje za antigen (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), str.1105-1116).
[0038] Analiziranjem gena faga koji su odabrani zbog svoje soposbnosti vezivanja sa antigenom, može se odrediti DNK sekvenca koja kodira varijabilni region humanog antitela koje se vezuje za antigen. Kada se odredi DNK sekvenca scFv koji se vezuje za antigen, DNK sekvenca konstantnog regiona antitela može da se veže za nju da bi se proizveo IgG-ekspresioni vektor koji ima gore pomenute sekvence, i proizvedeni ekspresioni vektor se zatim uvede u pogodnu ćeliju-domaćina i omogući mu se da se eksprimira u njoj, čime se dobija humano antitelo (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, str. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), str.1105-1116).
[0039] Pored toga, antitelo na GARP, ovog opisa, može se dobiti imunizovanjem životinje korišćenjem GARP-a ili bilo kojeg datog polipeptida odabranog iz aminokiselinske sekvence GARP-a, i zatim prikupljanjem i prečišćavanjem antitela proizvedenog u njenom živom telu. Vrsta organizma iz kojeg je GARP koji se koristi kao antigen nije ograničena na čoveka, i prema tome, životinja se može imunizovati i korišćenjem GARP-a dobijenog iz životinje koja nije čovek, na primer iz miša ili pacova. U tom slučaju, antitelo koje se primenjuje u oboljenjima kod ljudi može se odabrati ispitivanjem unakrsne reaktivnosti dobijenog antitela koje se vezuje za heterologni GARP, sa humanim GARP-om.
[0040] Pored toga, ćelije koje proizvode antitelo na GARP fuzionišu se sa mijeloma ćelijama u skladu sa poznatim postupkom (npr., Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, str. 495-497, Kennet, R. izd., Monoclonal Antibodies, str.365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) da bi se uspostavili hibridomi, tako da se dobije monoklonsko antitelo.
1
[0041] Tteba napomenuti da GARP koji se koristi kao antigen može da se dobije tako što će se ćelijama-domaćinima omogućiti da proizvode GARP gene, u skladu sa genetičkom manipulacijom.
[0042] Specifično, proizvodi se vektor sposoban da eksprimira GARP gen, i vektor se zatim uvodi u ćelije-domaćine, tako da se gen eksprimira u njima, i posle toga, eksprimirani GARP može da se prečisti. U nastavku ovog teksta specifično će biti opisan postupak dobijanja antitela na GARP.
(1) Pripremanje antigena
[0043] Primeri antigena upotrebljenog za proizvodnju anti-GARP antitela mogu uključivati GARP, polipeptid koji se sastoji od parcijalnih sekvenci najmanje 6 uzastopnih amino-kiselina istog, i derivat pripremljen dodavanjem bilo koje date aminokiselinske sekvence ili nosača na takav GARP ili njegov polipeptid.
[0044] GARP se direktno može prečistiti iz tumorskih tkiva ili tumorskih ćelija čoveka i zatim se može koristiti. Alternativno, GARP se može dobiti i sintetisanjem in vitro ili omogućavanjem genetičkom manipulacijom da ga proizvode ćelije-domaćini.
[0045] U skladu sa takvom genetičkom manipulacijom, antigen se može dobiti, specifično, ugradnjom GARP cDNK u ekspresioni vektor koji može eksprimirati GARP cDNK, i zatim sintetisanjem GARP-a u rastvoru koji sadrži enzime, supstrat i energetske materijale potrebne za transkripciju i translaciju, ili transformisanjem ćelija-domaćina drugih prokariota ili eukariota, kako bi im se omogućilo da eksprimiraju GARP.
[0046] Isto tako, moguće je antigen dobiti u vidu sekretnog proteina tako što će se omogućiti da se u pogodnom domaćinu i/ili vektorskom sistemu eksprimira fuzioni protein formiran povezivanjem DNK koja kodira vanćelijski region GARP-a kao membranskog proteina sa DNK koja kodira konstantni region antitela.
[0047] GARP cDNK može se dobiti takozvanim PCR postupkom koji obuhvata izvođenje lančane reakcije polimeraze (u nastavku ovog teksta "PCR", polymerase chain reaction), na primer, korišćenjem cDNK biblioteke koja eksprimira cDNK GARP kao templat, i takođe korišćenjem prajmera za specifičnu amplifikaciju GARP cDNK (vidi Saiki, R. K., i sarad. Science (1988) 239, str.487-489).
[0048] Primer in vitro sinteze polipeptida može biti sistem brze translacije (Rapid Translation System, RTS) koji proizvodi Roche Diagnostics, ali bez ograničavanja na njega.
1
[0049] Primeri prokariotskih ćelija koje se upotrebljavaju kao ćelije-domaćini mogu uključiti Escherichia coli i Bacillus subtilis. U cilju transformisanja ćelija-domaćina pomoću gena od interesa, ćelije-domaćini se transformišu plazmidnim vektorom koji sadrži replikon izveden iz vrste kompatibilne sa domaćinom, tačnije, mesto početka replikacije, i regulatornu sekvencu. Kao vektor, poželjan je vektor sa sekvencom koja ćelijama koje će se transformisati može pružiti selektivnost fenotipa.
[0050] Primeri eukariotskih ćelija koje se upotrebljavaju kao ćelije-domaćini mogu uključiti ćelije vertebrata, insekata i kvasaca. Primeri ćelija vertebrata koje mogu često da se koriste uključuju COS ćelije koje su ćelije majmuna (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL-1650), mišje fibroblaste NIH3T3 (ATCC br. CRL-1658), i dihidrofolat reduktaza-deficijentne ćelijske linije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (1980) 77, str.4126-4220), ali bez ograničavanja na njih.
[0051] Tako dobijeni transformant može se kultivisati prema uobičajenim postupcima, a polipeptid od interesa može se proizvesti unutar ili izvan ćelija kulture.
[0052] Kao medijumi koji se koriste u kulturi mogu se odabrati različiti tipovi medijuma koji se uobičajeno koriste, zavisno od vrste upotrebljenih ćelija-domaćina. Ako su ćelije-domaćini Escherichia coli, na primer, u LB medijum se mogu dodati po potrebi antibiotici kao što su ampicilin ili IPMG i dobijeni medijum se zatim može koristiti.
[0053] Rekombinantni protein proizveden unutar ili izvan ćelija transformanta kao rezultat gore opisane kulture, može se izdvojiti i/ili prečistiti različitim tipovima poznatih postupaka izdvajanja, uz korišćenje fizičkih osobina ili hemijskih osobina proteina.
[0054] Specifični primeri postupka mogu uključivati tretman korišćenjem uobičajenog sredstva za precipitaciju proteina, ultrafiltraciju, različite vrste tečne hromatografije kao što je hromatografija molekularnog sita (gel filtracija), apsorpciona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija ili afinitetna hromatografija, postupak dijalize i njihove kombinacije.
[0055] Pored toga, pričvršćivanjem histidinske oznake koja se sastoji od 6 rezidua, na rekombinantni protein koji treba da se eksprimira, protein se može efikasno prečistiti pomoću nikl-afinitetne kolone. Inače, povezivanjem Fc regiona IgG-a sa rekombinantnim proteinom koji treba da se eksprimira, protein se može efikasno prečistiti korišćenjem protein A kolone.
[0056] Međusobnim kombinovanjem gore opisanih postupaka, polipeptid od interesa može da se proizvede u velikom obimu, sa visokim prinosom i visokom čistoćom.
1
(2) Proizvodnja anti-GARP monoklonskog antitela
[0057] Primer antitela koje se specifično vezuje za GARP može biti monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za GARP. Postupak dobijanja takvog monoklonskog antitela je kako sledi.
[0058] Za proizvodnju monoklonskog antitela, obično su potrebni sledeći radni koraci.
[0059] Specifično, potrebni radni koraci uključuju:
(a) prečišćavanje biopolimera koji je upotrebljen kao antigen,
(b) korak imunizovanja životinje injektiranjem antigena, sakupljanje krvi iz životinje, ispitivanje titra antitela da bi se odredio period izolovanja slezine iz životinje, i zatim pripremanje ćelija koje proizvode antitelo,
(c) pripremanje mijeloma ćelija (u ovom testu kasnije označene kao "mijelomi"), (d) ćelijska fuzija između ćelija koje proizvode antitelo i mijeloma,
(e) odabir grupe hibridoma koji proizvode antitelo od interesa,
(f) razdvajanje pojedinačnih ćelija u klonove (kloniranje),
(g) opciono, kultivisanje hibridoma za masovnu proizvodnju monoklonskih antitela, ili ukrštanje životinja u koje su transplantirani hibridomi, i
(h) analiza fiziološke aktivnosti i specifičnosti vezivanja tako proizvedenog monoklonskog antitela, ili ispitivanje osobina antitela kao reagensa za obeležavanje.
[0060] Kasnije u ovom tekstu, detaljno će se opisati postupak za proizvodnju monoklonskog antitela, zajedno sa gore opisanim koracima. Međutim, postupak proizvodnje gore pomenutog antitila nije ograničena na to, i, na primer, mogu se koristiti i ćelije koje proizvode antitela, a koje su različite od ćelija slezine i mijeloma.
(a) Prečišćavanje antigena
[0061] Kao antigen, može se koristiti GARP pripremljen gore opisanim postupkom, ili njegov deo.
[0062] Alternativno, kao antigeni mogu se koristiti i membranska frakcija pripremljena od GARP-eksprimirajućih rekombinantnih somatskih ćelija, ili same GARP-eksprimirajuće rekombinantne somatske ćelije, ili dodatno, parcijalni peptid proteina ovog pronalaska, koji je hemijski sintetisan prema postupku dobro poznatom stručnjaku u oblasti.
(b) Pripremanje ćelija koje proizvode antitelo
1
[0063] Antigen dobijen u koraku (a) pomeša se sa pomoćnim sredstvom, kao što je Freund-ov kompletni ili nekompletni adjuvans, ili kalijum alum, kako bi se pripremio imunogen, i posle toga se eksperimentalna životinja imunizuje imunogenom. Kao takva eksperimentalna životinja, može se bez problema koristiti životinja koja se koristi u poznatim postupcima proizvodnje hibridoma. Specifični primeri takve životinje koja se ovde može koristiti uključuju miša, pacova, kozu, ovcu, govedo i konja. Sa stanovišta dostupnosti ćelija mijeloma koje se spajaju sa izolovanim ćelijama koje proizvode antitela, itd. kao životinja koja će se imunizovati poželjno se koristi miš ili pacov.
[0064] Sojevi miševa i pacova koji se praktično koriste nisu posebno ograničeni. U slučaju miševa, primeri sojeva koji se ovde mogu koristiti uključuju A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, i 129. Sa druge strane, u slučaju pacova, primeri sojeva koji se ovde mogu koristiti uključuju Wistar, Low, Lewis, Sprague Dawley, ACI, BN, i Fischer.
[0065] Ovi miševi i pacovi se mogu nabaviti od uzgajivača i distributera eksperimentalnih životinja, kao što su CLEA Japan, Inc. i CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.
[0066] Između ostalog, uzimajući u obzir fuzionu kompatibilnost sa ćelijama mijeloma o kojima se govori u nastavku, soj BALB/c u slučaju miševa, i sojevi Wistar i Low u slučaju pacova, posebno su poželjni kao životinje koje će se imunizovati.
[0067] Pored toga, uzimajući u obzir homologiju između antigena ljudi i miševa, poželjno je takođe koristiti miševe čiji je biološki mehanizam za uklanjanje autoantitela snižen, tačnije miševe sa autoimunskim bolestima.
[0068] Starost ovih miševa ili pacova posle imunizacije je poželjno 5 do 12 nedelja, i poželjnije 6 do 8 nedelja.
[0069] U cilju imunizovanja životinja pomoću GARP ili njegovog rekombinanta, mogu se primeniti poznati postupci koji su detaljno opisani u, na primer, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964), itd.
[0070] Među ovim postupcima imunizacije, postupak koji se poželjno primenjuje u ovom pronalasku je specifično, na primer, postupak koji sledi.
[0071] Drugim rečima, najpre se kod životinje primene, intradermalno ili intraperitonealno, ćelije u kojima se eksprimira membranska proteinska frakcija koja se koristi kao antigen, ili sam antigen.
2
[0072] U cilju poboljšanja efikasnosti imunizacije, poželjna je njena kombinovana upotreba. Ako se intradermalna primena izvodi u prvoj polovini režima primene, a intraperitonealna primena se izvodi u njegovoj drugoj polovini, ili samo u krajnoj instanci primene, efikasnost imunizacije može se posebno poboljšati.
[0073] Raspored primene antigena se razlikuje u zavisnosti od vrste životinje koja se imunizuje, individualnih razlika, itd. Uopšteno, poželjna je primeniti 3 do 6 doza antigena i interval doziranja od 2 do 6 nedelja, i poželjnije 3 ili 4 doze antigena i interval doziranja od 2 do 4 nedelje.
[0074] Primenjena doza antigena razlikuje se u zavisnosti od tipa životinje koja će biti imunizovana, individualnih razlika, itd. Obično iznosi 0.05 do 5 mg, i poželjno približno 0.1 do 0.5 mg.
[0075] Pojačavanje odgovora izvodi se 1 do 6 nedelja, poželjno 2 do 4 nedelje, i poželjnije 2 do 3 nedelje posle gore opisane primene antigena.
[0076] Primenjena doza antigena, kada se izvodi pojačavanje odgovora, različita je u zavisnosti od tipa životinje, njene veličine, itd. U slučaju miša na primer, primenjena doza antigena je obično 0.05 do 5 mg, poželjno 0.1 do 0.5 mg, i poželjnije približno 0.1 do 0.2 mg.
[0077] 1 do 10 dana, poželjno 2 do 5 dana, i poželjnije 2 ili 3 dana posle završetka gore opisanog pojačavanja odgovora, ćelije slezine ili limfociti koji uključuju ćelije koje proizvode antitelo, aseptički se izoluju iz imunizovane životinje. Tada se meri titar antitela. Životinja u kojoj je titar antitela zadovoljavajuće povišen, koristi se kao izvor za snabdevanje ćelijama koje proizvode antitelo, tako da se efikasnost kasnijih operacija može povećati.
[0078] Primeri postupaka merenja titra antitela, koji su ovde upotrebljeni, mogu uključiti RIA postupak i ELISA postupak, ali nisu ograničeni na njih.
[0079] U vezi sa merenjem titra antitela u ovom pronalasku, ELISA postupak može se, na primer, izvesti prema sledećim procedurama.
[0080] Prvo, prečišćeni ili delimično prečišćeni antigen se adsorbuje na površinu čvrste faze, kao što je ploča sa 96 bunarčića za ELISA, i druga čvrsta površina na koju se taj antigen nije adsorbovao, prekriva se proteinom koji nije relevantan za antigen, kao što je goveđi serumski albumin (bovine serum albumin, kasnije u ovom tekstu "BSA"). Površine se isperu i zatim se dopusti da dođu u kontakt sa serijskim razblaženjima uzorka koji se koristi kao primarno antitelo (npr. serum miša), tako da se antitelu u uzorku omogući da se veže za gore opisani antigen.
[0081] Posle toga, dodaje se enzimom obeleženo antitelo na mišje antitelo, kao sekundarno antitelo, tako da mu se omogući da se veže za mišje antitelo, posle čega sledi ispiranje. Posle toga, tome se dodaje supstrat enzima, a zatim se meri promena apsorbance usled razvijanja boje na osnovu razgradnje supstrata itd., tako da se izračuna titar antitela.
[0082] Ćelije koje proizvode antitelo mogu se izvojiti iz slezinskih ćelija ili limfocita imunizovane životinje u skladu sa poznatim postupcima (npr., Kohler i sarad., Nature (1975) 256, str. 495,; Kohler i sarad., Eur. J. Immunol. (1977) 6, str. 511,; Milstein i sarad., Nature (1977), 266, str.550,; Walsh, Nature, (1977) 266, str.495). Na primer, u slučaju ćelija slezine, može se primeniti uobičajeni postupak koji uključuje usitnjavanje slezine, zatim filtriranje ćelija kroz mrežicu od nerđajućeg čelika, zatim suspendovanje filtrata u Eagle-ovom minimalnom esencijalnom medijumu (minimal essential medium, MEM) da bi se izdvojile ćelije koje proizvode antitelo.
(c) Pripremanje mijeloma ćelija (ovde kasnije označene kao "mijelomi")
[0083] Ćelije mijeloma koje se koriste u fuziji ćelija nisu posebno ograničene, i ćelije se mogu odabrati od poznatih ćelijskih linija, po potrebi, i zatim se mogu koristiti. Imajući u vidu pitanja pogodnosti u selekciji hibridoma iz fuzionisanih ćelija, poželjno se koriste HGPRT (hipoksantin-GUANIN fosforibozil transferaza, hypoxanthine-GUANINE phosphoribosyl transferase)-deficijentne ćelijske linije, za koje su ustanovljene procedure selekcije.
[0084] Tačnije, primeri takvih HGPRT-deficijentnih ćelijskih linija uključuju: X63-Ag8 (X63), NS1-ANS11 (NS1), P3X63-Ag8. U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, i BU.1 poreklom iz miša; 210. RSY3. Ag. 1. 2.3 (Y3) poreklom iz pacova; i U266AR (SKO-007), GM1500·GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), i 8226AR/NIP4-1 (NP41) poreklom iz čoveka. Ove HGPRT-deficijentne ćelijske linije mogu se nabaviti, na primer, od American Type Culture Collection (ATCC).
[0085] Ove ćelijske linije se supkultivišu u pogodnom medijumu kao što je 8-azaguaninski medijum [medijum pripremljen dodavanjem 8-azaguanina RPMI-1640 medijumu koji uključuje glutamin, 2-merkaptoetanol, gentamicin, i fetalni teleći serum (fetal calf serum, kasnije u ovom tekstu označen kao "FCS")], Iscove-ov modifikovan Dulbecco-ov medijum (Iscove’s modified Dulbecco’s medium, kasnije u ovom tekstu označen kao "IMDM"), ili Dulbecco-ov modifikovan Eagle-ov medijum (Dulbecco’s modified Eagle medium, kasnije u ovom tekstu označen kao "DMEM"). Tri ili četiri dana pre fuzije ćelija, ćelije se supkultivišu u normalnom medijumu [npr., ASF104 medijum koji sadrži 10% FCS (proizvođač Ajinomoto Co., Inc.)] da bi se na dan fuzije ćelija obezbedilo ne manje od 2×10<7>ćelija.[0075]
(d) Fuzija ćelija
[0086] Ćelije koje proizvode antitelo mogu se fuzionisati sa ćelijama mijeloma, kako je pogodno, prema poznatim postupcima (Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964), itd.), pod uslovima u kojima ne dolazi do prekomernog snižavanja stope preživljavanja ćelija.
[0087] Primer takvog postupka koji se ovde može koristiti obuhvata hemijski postupak koji uključuje mešanje ćelija koje proizvode antitela sa ćelijama mijeloma, u rastvoru polimera visoke koncentracije, kao što je polietilen glikol, i fizički postupak u kojem se koristi električna stimulacija. Od ovih postupaka, specifičan primer gore opisanog hemijskog postupka je kako sledi.
[0088] Preciznije, kada se kao rastvor polimera visoke koncentracije koristi polietilen glikol, ćelije koje proizvode antitelo pomešaju se sa ćelijama mijeloma u rastvoru polietilen glikola sa molekulskom masom od 1500 do 6000, poželjno 2000 do 4000, na temperaturi od 30°C do 40°C, poželjno 35°C do 38°C, i u trajanju od 1 do 10 minuta, poželjno u trajanju od 5 do 8 minuta.
(e) Odabir grupe hibridoma
[0089] Postupak odabira hibridoma dobijenih gore opisanom fuzijom ćelija nije posebno ograničen. Uopšteno, koristi se HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine, hipoksantin, aminopterin, timidin) postupak odabira (Kohler i sarad., Nature (1975) 256, str.495; Milstein i sarad., Nature (1977) 266, str.550).
[0090] Ovaj postupak je efikasan kada se hibridomi dobiju korišćenjem ćelija mijeloma HGPRT-deficijentne ćelijske linije, koje ne mogu preživeti u aminopterinu.
[0091] Specifično, nespojene ćelije i hibridomi kultivišu se u HAT medijumu, tako da se samo hibridomi koji su otporni na aminopterin mogu održati i selektivno rasti
(f) Razdvajanje pojedinačnih ćelija u klonove (kloniranje)
[0092] Kao postupci kloniranja hibridoma mogu se primeniti poznati postupci, kao što su postupak sa metil celulozom, postupak sa mekim agarom, ili postupak kloniranja razblaživanjem (vidi na primer, Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Od ovih
2
postupaka, posebno su poželjni postupci trodimenzionalne kulture, kao što je postupak sa metil celulozom. Na primer, grupa hibridoma formiranih fuzijom ćelija suspenduje se u metilceluloznom medijumu kao što je ClonaCell-HY selekcioni medijum D (proizvođač StemCell Technologies, #03804), i zatim kultiviše. Posle toga, formirane kolonije hibridoma se sakupe, tako da se mogu dobiti monoklonski hibridomi. Svaka od sakupljenih kolonija hibridoma se kultiviše, i dobijeni supernatant kulture hibridoma, u kojem se zapaža stabilan titar antitela, odabere se kao soj hibridoma koji proizvodi GARP monoklonsko antitelo.
[0093] Primeri uspostavljenih sojeva hibridoma mogu uključiti GARP hibridome 151D i 198D. U ovom opisu, antitela koja su proizveli GARP hibridomi 151D i 198D označena su kao "151D antitelo" ili "198D antitelo" ili jednostavno kao "151D" ili "198D." Antitela 151D i 198D, proizvedena odgovarajućim hibridomima, kako je gore navedeno, su antitela pacova koja nisu unutar doslovnog obima patentnih zahteva.
[0094] Varijabilni region teškog lanca 151D antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 15 u listi sekvenci. Pored toga, varijabilni region lakog lanca 151D antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17 u listi sekvenci. Treba takođe napomenuti da je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca prikazana u SEQ ID NO: 15 u listi sekvenci kodirana nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 14 u listi sekvenci. Treba takođe napomenuti da je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca prikazana u SEQ ID NO: 17 u listi sekvenci kodirana nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 16 u listi sekvenci.
[0095] Varijabilni region teškog lanca 198D antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 19 u listi sekvenci. Pored toga, varijabilni region lakog lanca 198D antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 21 u listi sekvenci. Treba takođe napomenuti da je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca prikazana u SEQ ID NO: 19 u listi sekvenci kodirana nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 18 u listi sekvenci. Treba takođe napomenuti da je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca prikazana u SEQ ID NO: 21 u listi sekvenci kodirana nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 20 u listi sekvenci.
(g) Pripremanje monoklonskog antitela kultivisanjem hibridoma
[0096] Ovako odabrani hibridomi se kultivišu, tako da se efikasno mogu dobiti monoklonska antitela. Pre kultivisanja, poželjno je izvršiti pretraživanje u pogledu hibridoma koji proizvode monoklonsko antitelo od interesa.
[0097] U ovom pretraživanju mogu se koristiti poznati postupci.
[0098] Titar antitela može se meriti u ovom pronalasku na primer ELISA postupkom koji je opisan u gornjem odeljku (b).
[0099] Hibridomi dobijeni gore pomenutim postupcima mogu se čuvati u zamrznutom stanju, u tečnom azotu ili u zamrzivaču na temperaturi od -80°C ili nižoj.
[0100] Posle završenog kloniranja, hibridomi se kultivišu, dok se HT medijum zamenjuje normalnim medijumom.
[0101] Omasovljenje kulture izvodi se rotirajućim kultivisanjem ili kultivisanjem na spineru, uz korišćenje velike boce za kulturu. Supernatant dobijen iz ove kulture u masi, prečišćava se u skladu sa postupcima koji su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti, kao što je gel filtracija, kako bi se dobilo monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za protein iz ovog opisa.
[0102] Pored toga, hibridomi se injektiraju u trbušnu duplju miša istog soja (npr., gore opisani BALB/c), ili Nu/Nu miša, i hibridomi se ostave da tamo rastu, tako da se dobije ascit koji sadrži veliku količinu monoklonskog antiela ovog pronalaska.
[0103] Kada se hibridomi unesu u trbušnu duplju takvog miša, veća količina ascita može se dobiti ako se mišu prethodno da mineralno ulje kao što je 2,6,10,14-tetrametilpentadekan (pristan) (3 do 7 dana pre primene hibridoma).
[0104] Na primer, pretpostavimo da je imunosupresivno sredstvo prethodno uneto u trbušnu duplju miša istog soja kao što su hibridomi, tako da su T ćelije inaktivirane. Dvadeset dana posle injekcije, 10<6>do 10<7>hibridoma i/ili klonskih ćelija suspenduje se u medijumu koji ne sadrži serum (0.5 ml), i suspenzija se zatim unosi u trbušnu duplju. Kada normalni abdomen otekne i dođe do nakupljanja ascita, ascit se uzima iz miša. Ovim postupkom može se dobiti monoklonsko antitelo u koncentraciji koja je oko 100 ili više puta veća nego u rastvoru kulture.
[0105] Monoklonsko antitelo dobijeno gore opisanim postupkom može se prečistiti, na primer, postukom opisanim u Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oksford (1978).
[0106] Tako dobijeno monoklonsko antitelo ima visoku antigensku specifičnost prema GARP-u.
(h) Test monoklonskog antitela
[0107] Izotip i podtip dobijenog monoklonskog antitela mogu se odrediti na sledeći način.
[0108] Prvo, primeri testnih postupaka mogu uključiti Ouchterlony-jev postupak, ELISA postupak, i RIA postupak.
2
[0109] Ouchterlony-jev postupak je jednostavan, ali kada je koncentracija monoklonskog antitela niska potrebno je primeniti proceduru koncentrovanja.
[0110] Sa druge strane, kada se koriste ELISA postupa ili RIA postupak, supernatant kulture direktno reaguje sa antigenom koji je adsorbovan za čvrstu fazu, i antitelo koje odgovara različitim izotipovima ili potklasama imunoglobulina koristi se kao sekundarno antitelo, tako da se izotip i podtip monoklonskog antitela mogu identifikovati.
[0111] Kao jednostavniji postupak, može se upotrebiti i komercijalno dostupni identifikacioni kit (npr., Mouse Typer Kit; proizvođač BioRad), itd.
[0112] Pored toga, kvantifikacija proteina može se izvesti Folin Lowry-jevim postupkom i postupkom izračunavanja vrednosti na osnovu apsorbance na 280 nm [1.4 (OD 280) = 1 mg/ml imunoglobulina].
[0113] Pored toga, u slučaju kada se koraci (a) do (h) u gornjem (2) ponovo izvode i monoklonsko antitelo se nezavisno dobija zasebno, može se dobiti antitelo sa osobinama koje su ekvivalentne osobinama 105F antitela (koje nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva), 110F antitela (koje nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva), antitela izvedenog iz 151D (humanizovano 151D antitelo) i antitela izvedenog iz 198D (humanizovano 198D antitelo). Primer takvog antitela može biti antitelo koje se vezuje za isti epitop za koji se vezuje svako od gore opisanih antitela. 105F antitelo prepoznaje delove aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 366 do 377, 407 do 445 i 456 do 470 u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 1) GARP, i vezuje se za njih; 110F antitelo prepoznaje delove aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 54 do 112 i 366 do 392 u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 1) GARP, i vezuje se za njih; antitelo izvedeno iz 151D (humanizovano 151D antitelo) prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 352 do 392 u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 1) GARP, i vezuje se za nju; i antitelo izvedeno iz 198D (humanizovano 198D antitelo) prepoznaje aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 18 do 112 u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 1) GARP, i vezuje se za nju. Prema tome, posebni primeri gore pomenutog epitopa mogu uključivati gore pomenute regione u aminokiselinskoj sekvenci GARP-a.
[0114] Ako se novopripremljeno monoklonsko antitelo vezuje za parcijalni peptid ili parcijalnu trodimenzionalnu strukturu za koju se vezuje gore opisano 105F antitelo itd., može se odrediti da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop za koji se vezuje gore opisano 105F antitelo, itd. Pored toga, potvrđivanjem da monoklonsko antitelo kompetira sa gore opisanim antitelima kao što je 105F antitelo u vezivanju antitela za GARP (tj. monoklonsko antitelo interferira sa vezivanjem gore opisanih antitela kao što je 105F antitelo, za GARP), može se odrediti da se
2
monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop za koji se vezuje gore opisano 105F antitelo itd. čak i ako specifična sekvenca ili struktura epitopa nisu određene. Kada se potvrdi da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop za koji se vezuje 105F antitelo, itd. onda postoje snažna očekivanja da bi monoklonsko antitelo trebalo da ima osobine ekvivalentne osobinama gore opisanih antitela kao što je 105F antitelo.
(3) Druga antitela
[0115] Antitelo ovog pronalaska uključuje i genetički rekombinantna antitela koja su veštački modifikovana u svrhu smanjenja heterogenske antigenosti za ljude, kao što su himerna antitela, humanizovana antitela i gore opisana humana antitela, kao i gore opisano monoklonsko antitelo na GARP. Ova antitela mogu da se proizvedu poznatim postupcima.
[0116] Dobijeno antitelo može se prečistiti do homogenog stanja. Za izdvajanje i prečišćavanje antitela mogu se koristiti postupci izdvajanja i prečišćavanja koji se koriste za obične proteine. Na primer, hromatografija na koloni, filtracija, ultrafiltracija, isoljavanje, dijaliza, preparativna elektroforeza na poliakrilamidnom gelu, izoelektrično fokusiranje, itd. pogodno se odaberu i međusobno kombinuju tako da se antitela mogu izdvojiti i prečistiti (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak i dr. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996.); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), ali primeri postupaka izdvajanja i prečišćavanja nisu ograničene na njih.
[0117] Primeri hromaotgrafije mogu uključiti afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, gel-filtracionu hromatografiju, reverzno-faznu hromatografiju, i apsorpcionu hromatografiju.
[0118] Ove hromatografske tehnike mogu se izvesti korišćenjem tečne hromatografije kao što su HPLC ili FPLC.
[0119] Primeri kolone upotrebljene u afinitetnoj hromatografiji mogu uključiti Protein A kolonu i Protein G kolonu. Primeri kolone koja uključuje upotrebu Proteina A mogu uključiti Hyper D, POROS, i Sepharose F. F. (Pharmacia).
[0120] Isto tako, korišćenjem imobilisanog nosača antigena, antitelo se može prečistiti korišćenjem aktivnosti vezivanja antitela za anatigen.
[0121] Dobijena antitela se evaluiraju u pogledu svoje aktivnosti vezivanja za antigen, prema postupcima opisanim u Primerima, o kojima će biti reči u nastavku ovog teksta, itd., tako da se može izvršiti odabir poželjnog antitela.
2
[0122] Stabilnost antitela može se koristiti kao indikator za upoređivanje osobina antitela. Diferencijalni skenirajući kalorimetar (differential scanning calorimeter, DSC) je uređaj koji može brzo i tačno izmeriti srednju tačku termičke denaturacije (thermal denaturation midpoint, Tm) koja je dobar indikator relativne strukturne stabilnosti proteina. Korišćenjem DSC za merenje Tm vrednosti i upoređivanjem dobijenih vrednosti mogu se uporediti razlike u termičkoj stabilnosti. Poznato je da je prezervaciona stabilnost antitela u određenoj korelaciji sa termičkom stabilnošću antitela (Lori Burton, i sarad., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, str. 265-273), i dakle, poželjna antitela se mogu odabrati korišćenjem termičke stabilnosti kao indikatora. Primeri drugih indikatora za odabir antitela mogu uključivati visok prinos u pogodnim ćelijama-domaćinima i nisku aglutinaciju u vodenom rastvoru. Na primer, pošto antitelo sa najvećim prinosom ne pokazuje uvek najveću termičku stabilnost, potrebno je da se antitelo najpogodnije za primenu kod čoveka odabere na osnovu sveobuhvatnog određivanja gore navedenih indikatora.
[0123] Primer anti-GARP humanog antitela ovog opisa, koje nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva može biti anti-GARP humano antitelo dobijeno gore opisanim postupkom prikazivanja na fagima, i specifični primeri mogu uključivati 105F antitelo i 110F antitelo, od kojih svako ima strukturu kako sledi.
[0124] Teški lanac 105F antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 u listi sekvenci. U aminokiselinskoj sekvenci teškog lanca prikazanoj u SEQ ID NO: 2 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 118 je varijabilni region, dok je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 119 do 448 konstantni region. U SEQ ID NO: 2 listi sekvenci, ovaj varijabilni region ima CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 26 do 35, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 50 do 66, i CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselnskim pozicijama 99 do 107. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 2 prikazana je na Slici 2.
[0125] Laki lanac 105F antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3 u listi sekvenci. U aminokiselinskoj sekvenci lakog lanca prikazanoj u SEQ ID NO: 3 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 112 je varijabilni region, dok je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 113 do 217 konstantni region. U SEQ ID NO: 3 u listi sekvenci, ovaj varijabilni region ima CDRL1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 23 do 36, CDRL2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na
2
aminokiselinskim pozicijama 52 do 58, i CDRL3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 91 do 101. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 3 prikazana je na Slici 3.
[0126] Teški lanac 110F antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4 u listi sekvenci. U aminokiselinskoj sekvenci teškog lanca prikazanoj u SEQ ID NO: 4 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 123 je varijabilni region, dok je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 124 do 453 konstantni region. U SEQ ID NO: 4 u listi sekvenci, ovaj varijabilni region ima CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 26 do 35, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 50 do 66, i CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 99 do 112. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 4 prikazana je na Slici 4.
[0127] Laki lanac 110F antitela ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5 u listi sekvenci. U aminokiselinskoj sekvenci lakog lanca prikazanoj u SEQ ID NO: 5 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 111 je varijabilni region, dok je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 112 do 216 konstantni region. U SEQ ID NO: 5 u listi sekvenci, ovaj varijabilni region ima CDRL1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 23 do 36, CDRL2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 52 do 58, i CDRL3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 91 do 100. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 5 prikazana je na Slici 5.
[0128] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 105F antitela prikazana u SEQ ID NO: 2 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 6 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 354 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 6 u listi sekvenci kodira varijabilni region teškog lanca 105F antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 355 do 1344 kodira konstantni region teškog lanca 105F antitela. Kako je prikazano u SEQ ID NO: 6, nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region ima polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 76 do 105 koji kodira CDRH1, polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 148 do 198 koji kodira CDRH2, i polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim
2
pozicijama 295 do 321 koji kodira CDRH3. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 6 prikazana je na Slici 6.
[0129] Aminokiselinska sekvenca lakog lanca 105F antitela prikazana u SEQ ID NO: 3 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 7 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 336 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 7 u listi sekvenci kodira varijabilni region lakog lanca 105F antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 337 do 651 kodira konstantni region lakog lanca 105F antitela. Kako je prikazano u SEQ ID NO: 7, nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region ima polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 67 do 108 koji kodira CDRL1, polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 154 do 174 koji kodira CDRL2, i polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 271 do 303 koji kodira CDRL3. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 7 prikazana je na Slici 7.
[0130] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 110F antitela prikazana u SEQ ID NO: 4 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 8 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 369 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 8 u listi sekvenci kodira varijabilni region teškog lanca 110F antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 370 do 1359 kodira konstantni region teškog lanca 110F antitela. Kako je prikazano u SEQ ID NO: 8, nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region ima polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 76 do 105 koji kodira CDRH1, polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 148 do 198 koji kodira CDRH2, i polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 295 do 336 koji kodira CDRH3. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 8 prikazana je na Slici 8.
[0131] Aminokiselinska sekvenca lakog lanca 110F antitela prikazanog u SEQ ID NO: 5 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 9 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 333 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 9 u listi sekvenci kodira varijabilni region lakog lanca 110F antitela i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 334 do 648 kodira konstantni region lakog lanca 110F antitela. Kako je prikazano u SEQ ID NO: 9, nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region ima polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 67 do 108 koji kodira CDRL1, polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 154 do 174 koji kodira CDRL2, i polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 271 do 300 koji kodira CDRL3. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 9 prikazana je na Slici 9.
[0132] Kako je opisano u ovom tekstu, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, pored gore opisanog anti-GARP humanog antitela, čak i u slučaju kada se antitelo nezavisno dobije, zasebno, prema postupku različitom od gore opisanog postupka dobijanja antitela, mogu se dobiti antitela koja imaju citotoksičnost ekvivalentnu citotoksičnosti 105F antitela ili 110F antitela. Primer takvog antitela može biti antitelo koje se vezuje za isti epitop za koji se vezuje antitelo 105F ili antitelo 110F.
[0133] Ako se novoproizvedeno humano antitelo vezuje za parcijalni peptid ili parcijalnu trodimenzionalnu strukturu za koju se vezuje 105F antitelo ili 110F antitelo, može se odrediti da se proizvedeno antitelo vezuje za isti epitop za koji se vezuje 105F antitelo ili 110F antitelo. Pored toga, potvrđivanjem da antitelo o kojem je reč kompetira sa 105F antitelom ili 110F antitelom u vezivanju za GARP (tj., antitelo o kojem je reč interferira sa vezivanjem 105F antitela ili 110F antitela za GARP), može se odrediti da se antitelo o kojem je reč vezuje za isti epitop za koji se vezuje 105F antitelo ili 110F antitelo, čak i ako specifična sekvenca ili struktura epitopa nisu određene. Ako se potvrdi da se antitelo o kojem je reč vezuje za isti epitop za koji se vezuje 105F antitelo ili 110F antitelo, onda postoji snažno očekivanje da bi antitelo o kojem je reč trebalo da ima citotoksičnost ekvivalentnu citotoksičnosti 105F antitela ili 110F antitela.
[0134] Pored toga, antitelo ovog pronalaska uključuje veštački modifikovana, genetički rekombinantna antitela. Ova antitela mogu da se proizvedu poznatim postupcima. U ovom tekstu je opisano, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, antitelo koje ima najmanje 6 istih CDR kao teški lanac i laki lanac gore opisanog 105F antitela ili 110F antitela, i takođe ima ADCC aktivnost i aktivnost inhibiranja imunosupresivne funkcije Treg. Antitelo o kojem je reč nije ograničeno na specifično antitelo, sve dok ima gore navedene osobine. Antitelo je poželjnije antitelo koje ima varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca gore opisanog 105F antitela ili 110F antitela.
[0135] Kako je opisano u ovom tekstu, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, međusobnim kombinovanjem sekvenci koje pokazuju visoku homologiju sa aminokiselinskom sekvencom teškog lanca i aminokiselinskom sekvencom lakog lanca 105F antitela ili 110F antitela, moguće je odabrati antitelo koje ima aktivnost ekvivalentnu aktivnosti gore opisanog antitela. Takva homologija je homologija od uopšteno 80% ili više, poželjno 90% ili više,
1
poželjnije 95% ili više, i najpoželjnije 99% ili više (međutim, svaki CDR je identičan onome svakog od gore opisanih antitela). Pored toga, moguće je takođe odabrati antitelo koje ima aktivnost ekvivalentnu aktivnosti svakog od gore opisanih antitela, inkorporisanjem aminokiselinske sekvence koja uključuje supstituciju, deleciju ili adiciju jedne ili više aminokiselinskih rezidua u aminokiselinskoj sekvenci gore opisanog teškog lanca ili lakog lanca (isključujući svako CDR mesto).
[0136] Pored toga, primeri anti-GARP antitela mogu uključiti sledeća himerna antitela koja nisu unutar doslovnog obima patentnih zahteva, i humanizovana antitela.
[0137] Kako je opisano u ovom tekstu, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, primer himernog antitela može uključiti antitela u kojima su varijabilni region i konstantni region međusobno heterologni, kao što je himerno antitelo formirano konjugacijom varijabilnog regiona antitela izvedenog iz miša ili pacova sa konstantnim regionog izvedenim iz čoveka (vidi Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81, 6851-6855, (1984)).
[0138] Kako je opisano u ovom tekstu, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, himerno antitelo izvedeno iz pacovskog antihumanog GARP antitela 151D je antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 117 prikazane u SEQ ID NO: 15, i lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 109 prikazane u SEQ ID NO: 17, i ovo himerno antitelo može imati konstantni region izveden iz bilo kojeg datog humanog.
[0139] Kako je opisano u ovom tekstu, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, himerno antitelo izvedeno iz pacovskog antihumanog GARP antitela 198D je antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 120 prikazane u SEQ ID NO: 19, i lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 109 prikazane u SEQ ID NO: 21, i ovo himerno antitelo može imati konstantni region izveden iz bilo kojeg datog humanog.
[0140] Kako je opisano u ovom tekstu, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, primeri takvog himernog antitela mogu uključiti: antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji u sebi ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 25 u listi sekvenci, i lakog lanca koji u sebi ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 234
2
prikazanu u SEQ ID NO: 27; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji u sebi ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 469 prikazanu u SEQ ID NO: 29 u listi sekvenci, i lakog lanca koji u sebi ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 31.
[0141] Treba napomenuti da je, u sekvenci teškog lanca prikazanoj u SEQ ID NO: 25 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 19 signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 136 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 137 do 466 je konstantni region.
[0142] Isto tako, treba napomenuti da je, u sekvenci lakog lanca prikazanoj u SEQ ID NO: 27 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 20 signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 130 do 234 je konstantni region.
[0143] Treba napomenuti i to da je, u sekvenci teškog lanca prikazanoj u SEQ ID NO: 29 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 19 signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 139 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 140 do 469 je konstantni region.
[0144] Treba napomenuti i to da je, u sekvenci lakog lanca prikazano uj SEQ ID NO: 31 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 20 signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 130 do 234 je konstantni region.
[0145] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca c151D antitela prikazana u SEQ ID NO: 25 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 24 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 57 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 24 u listi sekvenci kodira signalnu sekvencu teškog lanca c151D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 408 u istoj kodira varijabilni region teškog lanca c151D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 409 do 1398 u istoj, kodira konstantni region teškog lanca c151D antitela.
[0146] Pored toga, aminokiselinska sekvenca lakog lanca c151D antitela prikazana u SEQ ID NO: 27 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 26 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 60 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 26 u listi sekvenci kodira signalnu sekvencu lakog lanca c151D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 u istoj kodira varijabilni region lakog lanca c151D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 388 do 702 u istoj, kodira konstantni region lakog lanca c151D antitela.
[0147] Pored toga, aminokiselinska sekvenca teškog lanca c198D antitela prikazana u SEQ ID NO: 29 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 28 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 57 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 28 u listi sekvenci kodira signalnu sekvencu teškog lanca c198D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 417 u istoj kodira varijabilni region teškog lanca c198D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 418 do 1407 u istoj, kodira konstantni region teškog lanca c198D antitela.
[0148] Pored toga, aminokiselinska sekvenca lakog lanca c198D antitela prikazana u SEQ ID NO: 31 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 30 u listi sekvenci. Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 60 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 30 u listi sekvenci kodira signalnu sekvencu lakog lanca c198D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 u istoj kodira varijabilni region lakog lanca c198D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 388 do 702 u istoj, kodira konstantni region lakog lanca c151D antitela.
[0149] Primeri humanizovanog antitela pronalaska uključuju humanizovano antitelo formirano inkorporacijom samo regiona koji određuje komplementarnost (CDR) u antitelo izvedeno iz čoveka (vidi Nature (1986) 321, p. 522-525), i humanizovano antitelo formirano transplantiranjem aminokiselinskih rezidua u neke regione okvira, kao i CDR sekvenci, u humano antitelo, prema postupku kalemljenja CDR (Međunarodna publikacija br. WO90/07861).
[0150] Međutim, humanizovano antitelo pronalaska izvedeno iz 151D antitela nije ograničeno na specifično humanizovano antitelo, sve dok sadrži sekvence varijabilnog regiona date u delovima (a) i (b) patentnog zahteva 1, zadržavajući tako svih 6 CDR sekvenci 151D antitela, i ima zahtevanu aktivnost.
4
[0151] Treba napomenuti da varijabilni region teškog lanca 151D antitela ima CDRH1 (GFTFSNYYMA) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 26 do 35 u SEQ ID NO: 15 u listi sekvenci, CDRH2 (SIGTVGGNTY) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 50 do 59 u SEQ ID NO: 15 u istoj, i CDRH3 (EDYGGFPH) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 99 do 106 u SEQ ID NO: 15 u istoj.
[0152] Dodatno, varijabilni region lakog lanca 151D antitela ima CDRL1 (KASQNVGTNVD) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 24 do 34 u SEQ ID NO: 17 u listi sekvenci, CDRL2 (GASNRYT) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 50 do 56 u SEQ ID NO: 17 u istoj, i CDRL3 (LQYKYNPYT) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 89 do 97 u SEQ ID NO: 17 u istoj.
[0153] Pored toga, varijabilni region teškog lanca 198D antitela ima CDRH1 (GFSLTSFHVS) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 26 do 35 u SEQ ID NO: 19 u listi sekvenci, CDRH2 (TISSGGGTY) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 50 do 58 u SEQ ID NO: 19 u istoj, i CDRH3 (ISGWGHYYVMDV) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 98 do 109 u SEQ ID NO: 19 u istoj.
[0154] Pored toga, varijabilni region lakog lanca 198D antitela ima CDRL1 (QASEDIYSGLA) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 24 do 34 u SEQ ID NO: 21 u listi sekvenci, CDRL2 (GAGSLQD) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 50 do 56 u SEQ ID NO: 21 u istoj, i CDRL3 (QQGLKFPLT) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 89 do 97 u SEQ. ID NO: 21 u istoj.
[0155] Opis obezbeđuje primere humanizovanog antitela pacovskog 151D antitela, koje sadrži bilo koju datu kombinaciju: teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od bilo koje od (1) aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 136, prikazane u SEQ ID NO: 33 (h151D-H1) ili 35 (h151D-H4) u listi sekvenci, (2) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 95% ili više homologna sa sekvencom regiona okvira različitom od svake CDR sekvence u gornjoj sekvenci (1) i (3) aminokiselinske sekvence koja sadrži deleciju, supstituciju ili adiciju jedne ili nekoliko amino-kiselina u sekvenci regiona okvira različitoj od svake CDR sekvence u gornjoj sekvenci (1); i laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od bilo koje od (4) aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 37 (h151D-L1) ili 39 (h151D- L4), (5) aminokiselinske sekvenca koja je najmanje 95% ili više homologna sa sekvencom regiona okvira različitom od svake CDR sekvence u gornjoj sekvenci (4), i (6) aminokiselinske sekvence koja sadrži deleciju, supstituciju ili adiciju jedne ili nekoliko amino-kiselina u sekvenci regiona okvira različitoj od svake CDR sekvence u gornjoj sekvenci (4). Humanizovana 151D antitela pronalaska specifično imaju sledeće kombinacije varijabilnih regiona teškog i lakog lanca: h151D-H1L1 i h151D-H4L4. Sekvence ovih antitela pronalaska date su u nastavku ovog teksta. Druge gore pomenute kombinacije i varijacije sekvenci nisu unutar doslovnog obima patentnih zahteva.
[0156] Opis obezbeđuje i primere humanizovanog antitela pacovskog 198D antitela, koje sadrži bilo koju datu kombinaciju: teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od bilo kojeg od (1) aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 139, prikazane u SEQ ID NO: 41 (h198D-H3) u listi sekvenci, (2) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 95% ili više homologna sa sekvencom regiona okvira različitom od svake CDR sekvence u gornjoj sekvenci (1), i (3) aminokiselinske sekvence koja sadrži deleciju, supstituciju ili adiciju jedne ili nekoliko amino-kiselina u sekvenci regiona okvira različitoj od svake CDR sekvence u gornjoj sekvenci (1); i laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od bilo koje od (4) aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 43 (h198D-L4) u listi sekvenci, (5) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 95% ili više homologna sa sekvencom regiona okvira različitom od svake CDR sekvence u gornjoj (4), i (6) aminokiselinske sekvence koja sadrži deleciju, supstituciju ili adiciju jedne ili nekoliko amino-kiselina u sekvenci regiona okvira različitoj od svake CDR sekvence u gornjoj sekvenci (4). Humanizovano 198D antitelo pronalaska specifično ima sledeću kombinaciju varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca: h198D-H3L4. Sekvenca ovog antitela pronalaska data je u nastavku ovog teksta. Druge gore pomenute kombinacije i varijacije sekvenci nisu unutar doslovnog obima patentnih zahteva.
[0157] Kombinacija teškog lanca i lakog lanca humanizovanih 151D antitela pronalaska je sledeća: antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 33, i lakog lanca koji ima varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 37; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 35, i lakog lanca koji ima varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 39.
[0158] Primeri poželjnije kombinacije istog mogu uključivati: antitelo (h151D-H1L1) koje se sastoji od teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 33 i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 37; i antitelo (h151D-H4L4) koje se sastoji od teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 35 i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 39.
[0159] Kombinacija teškog lanca i lakog lanca humanizovanog 198D antitela pronalaska je antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 139 prikazane u SEQ ID NO: 41, i lakog lanca koji ima varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 43.
[0160] Primer poželjnije kombinacije istog može biti antitelo (h198D-H3L4) koje se sastoji od teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 41 i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 43.
[0161] U ovom tekstu je takođe opisano, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, da je kombinovanjem sekvenci koje pokazuju visoku homologiju sa gore opisanim aminokiselinskim sekvencama teškog lanca i aminokiselinskim sekvencama lakog lanca, moguće odabrati antitelo koje ima citotoksičnost ekvivalentnu sa onom svakog od gore opisanih antitela. Takva homologija je homologija od uopšteno 80% ili više, poželjno 90% ili više, poželjnije 95% ili više, i najpoželjnije 99% ili više. Pored toga, međusobnim kombinovanjem aminokiselinskih sekvenci koje sadrže supstituciju, deleciju ili adiciju jedne ili više aminokiselinskih rezidua u odnosu na aminokiselinsku sekvencu teškog lanca ili lakog lanca, moguće je odabrati i antitelo koje ima citotoksičnost ekvivalentnu onoj svakog od gore opisanih antitela.
[0162] Treba napomenuti da se izraz "nekoliko" u ovom opisu koristi da označi 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, ili 1 ili 2.
[0163] Aminokiselinska supstitucija u ovom opisu je poželjno konzervativna aminokiselinska supstitucija. Konzervativna aminokiselinska supstitucija je supstitucija koja se događa unutar grupe amino-kiselina koje su u vezi sa određenim bočnim lancima amino-kiselina. Poželjne grupe amino-kiselina su sledeće: grupa kiselih amino-kiselina = asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; grupa baznih amino-kiselina = lizin, arginin i histidin; grupa nepolarnih amino-kiselina = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin i triptofan; i grupa nenaelektrisanih polarnih amino-kiselina = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin i tirozin. Druge poželjne aminokiselinske grupe su sledeće: grupa alifatičnih hidroksi aminokiselina = serin i treonin; grupa amino-kiselina koje sadrže amid = asparagin i glutamin; grupa alifatičnih amino-kiselina = alanin, valin, leucin i izoleucin; i grupa aromatičnih amino-kiselina = fenilalanin, triptofan i tirozin. Takva aminokiselinska supstitucija se poželjno izvodi do te mere da se ne naruše osobine supstance koja ima originalnu aminokiselinsku sekvencu.
[0164] Homologija između dva tipa aminokiselinskih sekvenci može se odrediti korišćenjem unapred zadatih parametara Blast algoritma verzija 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Blast algoritam može da se upotrebi i pristupanjem www.ncbi.nlm.nih.gov/blast preko interneta. Treba napomenuti da homologija između nukleotidne sekvence antitela opisanog u ovom tekstu i nukleotidne sekvence drugog antitela takođe može da se odredi korišćenjem Blast algoritma.
[0165] U aminokiselinskoj sekvenci teškog lanca humanizovanog 151D antitela prikazanoj u SEQ ID NO: 33 ili 35 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 19 je signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 136 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 137 do 466 je konstantni region.
[0166] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci lakog lanca humanizovanog 151D antitela prikazanoj u SEQ ID NO: 37 ili 39 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 20 je signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 130 do 234 je konstantni region.
[0167] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci teškog lanca humanizovanog 198D antitela prikazanoj u SEQ ID NO: 41 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 19 je signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 20 do 139 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 140 do 469 je konstantni region.
[0168] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci lakog lanca humanizovanog 198D antitela prikazanoj u SEQ ID NO: 43 u listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 1 do 20 je signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 21 do 129 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih rezidua na pozicijama 130 do 234 je konstantni region.
[0169] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca humanizovanog 151D antitela prikazana u SEQ ID NO: 33 ili 35 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 32, odnosno 34 u listi sekvenci. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 33 prikazana je na Slici 21, sekvenca SEQ ID NO: 35 prikazana je na Slici 23, sekvenca SEQ ID NO: 32 prikazana je na Slici 31, i sekvenca SEQ ID NO: 34 prikazana je na Slici 33, respektivno.
[0170] Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 57 u svakoj od nukleotidnih sekvenci kodira signalnu sekvencu teškog lanca humanizovanog 151D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 408 u istom kodira varijabilni region teškog lanca humanizovanog 151D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 409 do 1398 u istom kodira konstantni region teškog lanca humanizovanog 151D antitela.
[0171] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca humanizovanog 198D antitela prikazana u SEQ ID NO: 41 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 40 u listi sekvenci. Dodatno, sekvenca SEQ ID NO: 41 prikazana je na Slici 25, i sekvenca SEQ ID NO: 40 prikazana je na Slici 35.
[0172] Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 57 u gore navedenoj nukleotidnoj sekvenci kodira signalnu sekvencu teškog lanca humanizovanog 198D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 417 u istom kodira varijabilni region teškog lanca humanizovanog 198D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 418 do 1407 u istom kodira konstantni region teškog lanca humanizovanog 198D antitela.
[0173] Aminokiselinska sekvenca lakog lanca humanizovanog 151D antitela prikazana u SEQ ID NO: 37 ili 39 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 36, odnosno 38 u listi sekvenci. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 37 prikazana je na Slici 22, sekvenca SEQ ID NO: 39 prikazana je na Slici 24, sekvenca SEQ ID NO: 36 prikazana je na Slici 32, i sekvenca SEQ ID NO: 38 prikazana je na Slici 34, respektivno.
[0174] Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 60 u svakoj od nukleotidnih sekvenci kodira signalnu sekvencu lakog lanca humanizovanog 151D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 u istom kodira varijabilni region lakog lanca humanizovanog 151D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 388 do 702 u istom kodira konstantni region lakog lanca humanizovanog 151D antitela.
[0175] Aminokiselinska sekvenca lakog lanca humanizovanog 198D antitela prikazana u SEQ ID NO: 43 u listi sekvenci kodirana je nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 42 u listi sekvenci. Pored toga, sekvenca SEQ ID NO: 43 prikazana je na Slici 26, i sekvenca SEQ ID NO: 42 prikazana je na Slici 36.
[0176] Nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 60 u gore pomenutoj nukleotidnoj sekvenci kodira signalnu sekvencu lakog lanca humanizovanog 198D antitela, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 u istoj kodira varijabilni region lakog lanca humanizovanog 198D antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 388 do 702 u istoj kodira konstantni region lakog lanca humanizovanog 198D antitela.
[0177] Homologija između ovih nukleotidnih sekvenci i nukleotidnih sekvenci drugih antitela takođe se može odrediti korišćenjem Blast algoritma
[0178] Kako je opisano u ovom tekstu, ali nije unutar doslovnog obima patentnih zahteva, još jedan primer antitela može biti humano antitelo koje se vezuje za isti epitop za koji se vezuje i humanizovano 151D antitelo ili humanizovano 198D antitelo. Anti-GARP humano antitelo označava humano antitelo koje ima samo gensku sekvencu humanog antitela izvedenog iz hromozoma. Anti-GARP humano antitelo može se dobiti gore pomenutim postupkom.
[0179] Ako se novoproizvedeno humano antitelo vezuje za parcijalni peptid ili parcijalnu trodimenzionalnu strukturu za koje se vezuje humanizovano 151D antitelo ili humanizovano 198D antitelo, može se odrediti da se humano antitelo vezuje za isti epitop za koji se vezuje i humanizovano antitelo 151D ili humanizovano antitelo 198D. Pored toga, potvrđivanjem da humano antitelo kompetira sa humanizovanim 151D antitelom ili humanizovanim 198D antitelom u vezivanju za GARP (tj. humano antitelo interferira sa vezivanjem humanizovanog 151D antitela ili humanizovanog198D antitela za GARP), može se odrediti da se humano antitelo vezuje za isti epitop za koji se vezuje humanizovano 151D antitelo ili humanizovano 198D antitelo, čak i ako specifična sekvenca ili struktura epitopa nisu određene. Ako se potvrdi da se predmetno humano antitelo vezuje za isti epitop za koji se vezuje humanizovano 151D antitelo ili humanizovano 198D antitelo, onda postoji snažno očekivanje da bi humano antitelo trebalo da ima citotoksičnost jednaku onoj humanizovanog 151D antitela ili humanizovanog 198D antitela.
4
[0180] Himerno antitelo ili humano antitelo koja nisu unutar doslovnog obima patentnih zahteva, ili humanizovano antitelo dobijeno gore navedenim postupcima evaluira se postupcima opisanim kasnije u Primerima, itd., u pogledu aktivnosti vezivanja za antigen, i tako se može odabrati poželjno antitelo.
[0181] Ovaj pronalazak uključuje i modifikaciju antitela. Pojam "modifikacija" se koristi u ovom tekstu da označi antitelo prema ovom pronalasku koje je hemijski ili biološki modifikovano. Primeri takve hemijske modifikacije uključuju vezivanje hemijske komponente za aminokiselinski skelet i hemijsku modifikaciju ugljenohidratnog lanca vezanog za N ili O. Primeri takve biološke modifikacije uključuju antitela koja su prošla posttranslacionu modifikaciju (npr. modifikaciju šećernog lanca vezanog za N ili O, obradu N-terminusa ili C-terminusa, deamidaciju, izomerizaciju asparaginske kiseline i oksidaciju metionina) i antitela na čiji je N-terminus dodata metioninska rezidua kao rezultat toga što je ekspresija omogućena korišćenjem prokariotskih ćelija-domaćina. Dodatno, takva modifikacija uključuje i obeležena antitela za omogućavanje detekcije ili izolacije antitela ovog pronalaska ili antigena kao što je, na primer, enzimom obeleženo antitelo, fluorescentno obeleženo antitelo i afinitetno obeleženo antitelo. Takva modifikacija antitela ovog pronalaska korisna je za poboljšanje stabilnosti i zadržavanja u krvi izvornog antitela ovog pronalaska, smanjenje antigenosti, detekciju ili izolaciju takvog antitela ili antigena, itd.
[0182] Pored toga, regulisanjem modifikacije šećernog lanca (glikozilacija, defukozilacija, itd.) koji se vezuje za antitelo ovog pronalaska, može se pojačati ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela. Kao tehnike regulacije modifikacije šećernog lanca antitela, poznate su one opisane u WO99/54342, WO2000/61739, WO2002/31140, itd., ali tehnike nisu ograničene na njih. Antitelo prema ovom pronalasku uključuje i antitela u kojima je regulisana gore navedena modifikacija šećernog lanca.
[0183] Posle izolovanja gena za antitelo, gen se uvodi u odgovarajućeg domaćina da bi se proizvelo antitelo, uz korišćenje pogodne kombinacije domaćina i ekspresionog vektora. Specifičan primer gena za antitelo može biti kombinacija gena koji kodira sekvencu teškog lanca antitela opisanog u ovom opisu i gena koji kodira sekvencu lakog lanca antitela opisanog u istom. Posle transformacije ćelija-domaćina, gen za sekvencu teškog lanca i gen za sekvencu lakog lanca mogu se insertovati u jedan ekspresioni vektor, ili se umesto toga svaki od ovih gena može insertovati u različite ekspresione vektore.
[0184] Kada se eukariotske ćelije koriste kao domaćini, mogu se korititi ćelije životinja, ćelije biljaka ili eukariotski mikroorganizmi. Primeri ćelija životinja uključuju ćelije sisara kao što su COS ćelije koje su ćelije majmuna (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL1650), mišje fibroblaste NIH3T3 (ATCC br. CRL-1658), i ćelijske linije ovarijuma kineskog hrčka, deficijentne u dihidrofolat reduktazi (CHO ćelije, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (1980) 77, str.4126-4220).
[0185] Kada se prokariotske ćelije koriste kao domaćini, mogu se koristiti na primer Escherichia coli ili Bacillus subtilis .
[0186] Gen antitela od interesa uvodi se u te ćelije radi transformacije, i transformisane ćelije se zatim kultivišu in vitro da bi se dobilo antitelo. U gore pomenutoj kulturi, postoje slučajevi da je prinos različit u zavisnosti od sekvence antitela, i tako se od antitela koja imaju ekvivalentnu aktivnost vezivanja, kao lek može odabrati antitelo koje se lako proizvodi, uz korišćenje prinosa kao indikatora. Prema tome, antitelo prema ovom pronalasku uključuje i antitelo dobijeno gore opisanim postupkom za proizvodnju antitela, koji se karakteriše time što uključuje korak kultivisanja transformiranih ćelija-domaćina i korak prikupljanja iz kulture antitela od interesa, dobijenih u gore pomenutom koraku.
[0187] Poznato je da je rezidua lizina na karboksil terminusu teškog lanca antitela proizvedenog u kultivisanim ćelijama sisara deletirana (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), i takođe je poznato da su dve aminokiselinske rezidue na karboksil terminusu teškog lanca, glicin i lizin, deletirane i da je prolinska rezidua smeštena na karboksil terminusu novoamidovana (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Međutim, ta delecija i modifikacija ovih sekvenci teškog lanca ne utiču na aktivnost vezivanja sa antigenom i efektorsku funkciju (aktivacija komplementa, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela, itd.) antitela. U skladu sa tim, ovaj pronalazak uključuje i antitelo koje je podvrgnuto gore pomenutoj modifikaciji, i specifični primeri takvog antitela uključuju delecioni mutant koji sadrži deleciju 1 ili 2 amino-kiseline na karboksil terminusu teškog lanca, i delecioni mutant formiran amidacijom gore pomenutog delecionog mutanta (npr. teški lanac u kojem je prolinska rezidua na karboksil-terminalnom mestu amidovana). Međutim, delecioni mutanti koji sadrže deleciju na karboksil terminusu teškog lanca antitela prema ovom pronalasku nisu ograničeni na gore opisane delecione mutante, sve dok zadržavaju aktivnost vezivanja sa antigenom i efektorsku funkciju. Dva teška lanca koja čine antitelo prema ovom pronalasku mogu biti bilo koji tip teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od antitela pune dužine i gore opisanih delecionih mutanata, ili kombinacije bilo koja dva tipa odabrana iz gore pomenute grupe. Na odnos pojedinačnih delecionih mutanata mogu uticati tipovi kultivisanih ćelija sisara, koje proizvode antitela prema ovom pronalasku i uslovi kultivisanja. Glavni sastojak antitela prema ovom pronalasku mogu biti antitela kod kojih je jedna aminokiselinska rezidua deletirana na svakom od karboksil terminusa dva teška lanca.
[0188] Primeri izotipa antitela ovog pronalaska mogu uključiti IgG (IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4). Između ostalih, poželjni su IgG1 i IgG2.
[0189] Primeri opšte funkcije antitela mogu uključiti antigen-vezujuću aktivnost, aktivnost neutralisanja aktivnosti antigena, aktivnost pojačavanja aktivnosti antigena, ADCC aktivnost, aktivnost ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (antibody dependent cellular phagocytosis, ADCP), i aktivnost citoksičnosti zavisne od komplementa (complement-dependent cytotoxic (CDC) activity). Funkcija antitela prema ovom pronalasku je aktivnost vezivanja za GARP, poželjno ADCC aktivnost, i poželjnije citotoksičnost (antitumorska aktivnost) izazvana ADCC-posredovanom inhibicijom funkcije Treg. Štaviše, antitelo ovog pronalaska može imati ADCP aktivnost i/ili CDC aktivnost, kao i ADCC aktivnost. Posebno, u pogledu lekova koji sadrže postojeća antitumorska antitela, saopšteno je da lekovi direktno deluju na tumorske ćelije u blokiranju signala rasta, da direktno deluju na tumorske ćelije indukujući signale ćelijsku smrt, da direktno suprimiraju angiogenezu, da izazivaju ADCC aktivnost putem NK ćelija, i da indukuju CDC aktivnost preko komplementa, kako bi suprimirali rast tumorskih ćelija (J Clin Oncol 28: 4390-4399. (2010), Clin Cancer Res; 16 (1); 11-20. (2010)). Međutim, u pogledu ADCP aktivnosti anti-GARP antitela prema pronalasku ove patentne prijave, bar, ovi izumitelji nisu znali da je ADCP aktivnost bila saopštena kao aktivnost leka koji sadrži postojeće anti-GARP antitumorsko antitelo.
[0190] Antitelo ovog pronalaska može biti antitelo koje je multimerizovano da bi se povećao afinitet za antigen. Antitelo koje se multimerizuje može biti ili jedan tip antitela ili mogu biti više antitela koja prepoznaju više epitopa jednog antigena. Primeri postupka multimerizacije antitela mogu uključivati vezivanje IgG CH3 domena na dva scFv (jednolančana antitela), vezivanje antitela za streptavidin i uvođenje motiva zavojnica-okret-zavojnica.
[0191] Antitelo ovog pronalaska može biti i poliklonsko antitelo koje je mešavina više tipova anti-GARP antitela koja imaju različite aminokiselinske sekvence. Primer poliklonskog antitela može biti mešavina više vrsta antitela koja imaju različite CDR. Kao takvo poliklonsko antitelo može se koristiti antitelo dobijeno kultivisanjem mešavine ćelija koje proizvode različita antitela i zatim prečišćavanjem dobijene kulture (vidi WO2004/061104).
[0192] Kao modifikacija antitela može se koristiti antitelo koje se vezuje za različite vrste molekula kao što je polietilen glikol (PEG).
[0193] Antitelo ovog pronalaska može biti i konjugat formiran od takvog antitela i drugog leka (imunokonjugat). Takvo antitelo može biti, na primer, antitelo koje se vezuje za radioaktivnu supstancu ili jedinjenje koje ima farmakološko dejstvo (Nature Biotechnology (2005) 23, str.
1137-1146). Primeri takvog antitela mogu uključiti indijum (<111>In) kapromab pendetid,
4
tehnicijum (<99m>Tc) nofetumomab merpentan, indijum (<111>In) ibritumomab, itrijum (<90>Y) ibritumomab, i jod (<131>I) tositumomab.
3. Lekovi koji sadrže anti-GARP antitelo
[0194] Sva upućivanja na postupke lečenja u narednim paragrafima opisa treba tumačiti kao upućivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja tela čoveka (ili životinje) terapijom.
[0195] S obzirom na to da antitelo dobijeno postupkom opisanim u gornjem odeljku "2. Proizvodnja anti-GARP antitela" pokazuje citotoksičnost prema Treg, može se koristiti kao lek, i posebno kao terapijsko sredstvo za kancer i zarazne bolesti (posebno malariju i HIV infekciju).
[0196] Citotoksičnost izazvana antitelima in vitro može se meriti na osnovu aktivnosti suzbijanja proliferativnih odgovora ćelija.
[0197] Na primer, kultiviše se kancerska ćelijska linija koja prekomerno eksprimira GARP, i u sistem kulture se dodaju antitela u različitim koncentracijama. Posle toga se može meriti inhibitorna aktivnost antitela na formiranje fokusa, formiranje kolonija i rast sferoida.
[0198] In vivo terapijski efekti antitela na kancer ogledne životinje mogu se meriti, na primer, davanjem antitela nude mišu u koji je transplantirana tumorska ćelijska linija koja prekomerno eksprimira GARP, i zatim merenjem promena ćelija kancera.
[0199] Primeri tipova kancera mogu uključivati kancer pluća, kancer bubrega, kancer urotela, kancer debelog creva, kancer prostate, multiformni glioblastom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer dojke, melanom, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer želuca, kancer jednjaka i kancer krvi. Međutim, vrsta kancera nije ograničena na gore navedene primere, sve dok ćelije kancera, kao ciljevi za terapiju, eksprimiraju GARP.
[0200] Kao supstanca koja se koristi u leku prihvatljivom za farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska, poželjna je supstanca koja u primenjenoj dozi ili primenjenoj koncentraciji nije toksična za subjekta kod kojeg će se farmaceutska kompozicija primeniti.
[0201] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može sadržati farmaceutsku supstancu za promenu ili očuvanje pH, osmotskog pritiska, viskoznosti, prozirnosti, boje, izotoničnosti, sterilnosti, stabilnosti, rastvorljivosti, brzine oslobađanja, apsorpcije i propustljivosti. Primeri farmaceutske supstance mogu uključivati sledeće supstance, ali nisu ograničeni na njih: aminokiseline kao što su glicin, alanin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; antibakterijska sredstva; antioksidanti kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfat ili natrijum hidrogen sulfit; puferi kao što su fosfatni, citratni ili boratni pufer, natrijum hidrogen karbonat ili rastvor Tris-HCl; potporne supstance kao što su manitol ili glicin; helirajuća sredstva kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); sredstva za kompleksovanje kao što su kofein, polivinilpirolidin, β-ciklodekstrin ili hidroksipropil-β-ciklodekstrin; sredstva za povećanje zapremine kao što su glukoza, manoza ili dekstrin; drugi ugljeni hidrati kao što su monosaharidi ili disaharidi; sredstvo za bojenje; sredstvo za poboljšanje ukusa; razblaživač; emulgator; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidin; polipeptid niske molekulske mase; kontrajoni koji formiraju soli; antiseptici kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid; rastvarači kao što je glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol; šećerni alkoholi kao što su manitol ili sorbitol; polisorbati kao što su sredstvo za suspendovanje, sorbitan estar, polisorbat 20 ili polisorbat 80; surfaktanti kao što su Triton, trometamin, lecitin ili holesterol; sredstva za povećanje stabilnosti kao što su saharoza ili sorbitol; sredstvo za suspendovanje; sredstva za povećanje elastičnosti kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid, manitol ili sorbitol; transportna sredstva; pomoćne supstance; i/ili farmaceutske pomoćne supstance. Takva farmaceutska supstanca se poželjno dodaje anti-GARP antitelu u količini od 0.001 do 100 puta, posebno 0.1 do 10 puta većoj od težine anti-GARP antitela. Poželjni sastav farmaceutske kompozicije u formulaciji može odrediti, prema potrebi, stručnjak u oblasti, zavisno od ciljne bolesti, korišćenog puta primene, itd.
[0202] Ekscipijens ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti u tečnom ili čvrstom stanju. Pogodan ekscipijens ili nosač mogu biti voda za injekcije, normalni fiziološki rastvor, veštačka cerebrospinalna tečnost ili druge supstance koje se uobičajeno koriste u parenteralnoj primeni. Neutralni normalni fiziološki rastvor ili normalni fiziološki rastvor koji sadrži serumski albumin takođe se može koristiti kao nosač. Farmaceutska kompozicija može sadržati Tris pufer sa pH 7.0-8.5, acetatni pufer sa pH 4.0-5.5 ili citratni pufer sa pH 3.0-6.2. Pored toga, ovi puferi mogu sadržati i sorbitol ili druga jedinjenja.
[0203] Primeri farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu uključivati farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-GARP antitelo i farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-GARP antitelo i najmanje jedno sredstvo za lečenje kancera. Farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku priprema se kao lek koji ima odabrani sastav i potrebnu čistoću u obliku proizvoda osušenog zamrzavanjem ili tečnosti. Takva farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-GARP antitelo i farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-GARP antitelo i najmanje jedno sredstvo za lečenje kancera može se uobličiti u liofilizovani proizvod koji sadrži pogodan ekscipijent kao što je saharoza.
4
[0204] Sredstvo za lečenje kancera sadržano, zajedno sa anti-GARP antitelom, u gore opisanoj farmaceutskoj kompoziciji može se primeniti kod pojedinca, istovremeno, odvojeno ili u kontinuitetu, zajedno sa anti-GARP antitelom. U protivnom, sredstvo za lečenje kancera i anti-GARP antitelo mogu se primeniti kod subjekta u različitim intervalima primene. Primeri takvog sredstva za lečenje kancera mogu uključiti abraksan, karboplatin, cisplatin, gemcitabin, irinotekan (CPT-11), paklitaksel, pemetreksed, sorafenib, vinblastin, lekove opisane u Međunarodnoj publikaciji br. WO2003/038043, LH-RH analoge (leuprorelin, goserelin itd.), estramustin-fosfat, antagoniste estrogena (tamoksifen, raloksifen itd.) i inhibitore aromataze (anastrozol, letrozol, eksemestan itd.). Međutim, primeri sredstava za lečenje kancera nisu ograničeni na gore opisane lekove, sve dok sredstva imaju antitumorsku aktivnost.
[0205] Ciljni subjekt za primenu nije posebno ograničen. To je poželjno sisar, i poželjnije čovek.
[0206] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može se pripremiti za upotrebu u parenteralnoj primeni, ili za upotrebu u gastrointestinalnoj apsorpciji koja uključuje oralnu primenu. Sastav i koncentracija formulacije mogu se odrediti zavisno od načina primene. U pogledu afiniteta anti-GARP antitela sadržanog u farmaceutskoj kompoziciji ovog pronalaska, prema GARP, tačnije, konstante disocijacije (Kd vrednost) anti-GARP antitela prema GARP, sa povišenjem afiniteta (tj., Kd vrednost je niska), farmaceutska kompozicija može pokazivati medicinske efekte, čak i ako se njena doza primenjena kod čoveka smanjuje. Na osnovu ovih rezultata, može se odrediti i doza farmaceutske kompozicije ovog pronalaska koja se primenjuje kod čoveka. Kada se anti-GARP antitelo humanog tipa primenjuje kod čoveka, antitelo se može primeniti u dozi od oko 0.001 do 100 mg/kg, jednom ili nekoliko puta u intervalima od 1 do 180 dana. Primeri oblika farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu uključivati injekciju uključujući infuziju u kapima, supozitoriju, transnazalno sredstvo, sublingvalno sredstvo i sredstvo za transdermalnu apsorpciju.
[0207] U nastavku ovog teksta, primeri koji slede dati su samo kao ilustracija.
Primeri
[0208] U primerima koji slede, ukoliko nije drugačije specifikovano, pojedinačne operacije u vezi sa genetičkim manipulisanjem izvode se u skladu sa postupcima opisanim u "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., objavio Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ili drugim postupcima opisanim u priručnicima za izvođenje eksperimenata, koje
4
koristi osoba obučena u struci ili, kada se koriste komercijalni reagensi ili kitovi, primeri se izvode prema uputstvima koja su priključena komercijalnim proizvodima.
Komparativni primer 1: Dobijanje antitela
1)-1 Izdvajanje anti-GARP Fab afinitetnom selekcijom u prikazivanju na fagima
[0209] n-CoDeR Fab biblioteka faga (BioInvent) koristi se u izdvajanju Fab koji se vezuje za GARP. Korišćenjem reagensa EZ-Link NHS-hromogen-biotin (EZ-Link NHS-Chromogenic-Biotin, Thermo Scientific), GARP (R&D Systems) se biotiniše. Za afinitetnu selekciju u tečnoj fazi, biotinisani GARP se prevede u čvrstu fazu prikačinjanjem na magnetne perlice povezane sa streptavidinom (Dynabeads Streptavidin M-280, Life Technologies), i zatim se dodaju fagi. Nevezani fagi se uklone ispiranjem uz korišćenje magneta (DynaMag-2, Life Technologies). Posle toga, fagi vezani za GARP sakupe se tretiranjem tripsinom (Sigma-Aldrich), i zatim se amplifikuju korišćenjem Escherichia coli. Postupak afinitetne selekcije se izvodi ukupno tri puta i, korišćenjem restrikcionih enzima, DNK fragment koji kodira Fab iseče se iz poliklonskog fagemida, i zatim uvede u ekspresioni vektor za Escherichia coli. Posle toga, Escherichia coli TOP10F' (Life Technologies) se transformiše ekspresionim vektorom, i Fab se ostavi da se eksprimira u prisustvu IPTG (Sigma-Aldrich). Dobijeni Fab se podvrgne pretrazi pomoću ELISA.
1)-2 Pretraživanje Fab koji se vezuju za GARP, korišćenjem ELISA
[0210] 50 µL GARP, koji se razblaži do 2 µg/mL korišćenjem PBS (0.01 M fosfatom puferisani fiziološki rastvor (phosphate buffered saline) (pH 7.4) koji sadrži 0.138 M natrijum hlorid i 0.0027 M kalijum hlorid; Sigma-Aldrich), doda se u svaki bunarčić ploče sa 384 bunarčića, Maxi-sorp (Black, Nunc), i to se zatim inkubira preko noći na 4°C da bi se ploča obložila. Alternativno, 50 µL NeutrAvidin-a (Life Technologies) razblaženog do 1 µg/mL korišćenjem PBS, doda se u takvu Maxi-sorp ploču sa 384 bunarčića da bi se ploča obložila (inkubiranje preko noći na 4°C). Posle toga, ploča se tri puta ispere ELISA puferom (PBS (Sigma-Aldrich) sa dodatkom 0.05% Tween-20 (Bio-RAD)), i tome se zatim doda biotinisani GARP (1 pmol/50 µL PBS/bunarčiću), što je praćeno inkubacijom na sobnoj temperaturi, 1 sat uz mešanje. Ploča se ispere ELISA puferom tri puta, zatim blokira kazeinom kao blokatorom (Blocker Casein, Thermo Scientific), i još jednom ispere u tri promene ELISA pufera. Posle toga, doda se supernatant kulture, koji sadrži Fab proizveden u Escherichia coli, i ploča se zatim inkubira na
4
sobnoj temperaturi, 1 sat uz mešanje. Ploča se ispere ELISA puferom tri puta, i doda se 50 µL 2500-struko razblaženog anti-humanog F(ab')2antitela obeleženog peroksidazom rena (HRP) (Horseradish peroxidase (HRP)-labeled anti-human F(ab’)2antibody, R&D Systems). Ploča se dodatno inkubira na sobnoj temperaturi, 1 sat uz mešanje. Reakciona smeša se ispere u tri promene ELISA pufera, i zatim se u bunarčiće doda SuperSignal Pico ELISA hemiliminiscentni supstrat (Thermo Scientific). Deset minuta kasnije, hemiluminiscencija se meri korišćenjem čitača ploča (Envision 2104 Multilabel Reader, Perkin Elmer), i izoluje se GARP-vezani Fab.
1)-3 Određivanje nukleotidne sekvence ELISA-pozitivnog klona
[0211] Varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca ELISA-pozitivnih klonova (105F i 110F) analiziraju se postupkom Dye Terminator (BigDye (registrovani žig) Terminator v3.1, Life Technologies). Sekvence glavnih prajmera upotrebljenih u sekvenciranju su kako sledi.
[0212]
Prajmer A: 5'-GAA ACA GCT ATG AAA TAC CTA TTG C-3' (SEQ ID NO: 10) Prajmer B: 5'-GCC TGA GCA GTG GAA GTC C-3' (SEQ ID NO: 11)
Prajmer C: 5' -TAG GTA TTT CAT TAT GAC TGT CTC-3' (SEQ ID NO: 12) Prajmer D: 5'-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3' (SEQ ID NO: 13)
[0213] Kao rezultat gore opisane analize, određene su nukleotidne sekvence gena varijabilnih regiona 105F antitela i 110F antitela.
[0214] Nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 105F antitela bila je sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 354 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 6 u listi sekvenci, i nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 105F antitela bila je sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 336 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 7 u listi sekvenci.
[0215] Nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 110F antitela bila je sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 369 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 8 u listi sekvenci, i nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 110F antitela bila je sekvenca koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 1 do 333 u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 9 u listi sekvenci.
1)-4: Pripremanje IgG pune dužine, i ekspresija i prečišćavanje IgG
4
[0216] IgG pune dužine ELISA-pozitivnih klonova koji uključuju 105F i 110F pripremaju se postupkom koji sledi.
[0217] Određuje se nukleotidna sekvenca koja kodira Fab, i posle toga se određuju nukleotidne sekvence koje odgovaraju varijabilnim regionima teškog lanca i lakog lanca svakog od antitela specifikovanih u gornjem 1)-3.
[0218] Prema uobičajenom postupku, nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona gore opisanog teškog lanca veže se za nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region teškog lanca humanog IgG1(CH1 Fc region: aminokiselinska sekvenca na aminokiselinskim pozicijama 119 do 448 u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 2 u listi sekvenci), i nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona gore opisanog lakog lanca veže se za nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca humanog IgG1(CL: aminokiselinska sekvenca na aminokiselinskim pozicijama 113 do 217 u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 3 u listi sekvenci). Posle toga, dobijeni ligat se insertuje u ekspresioni vektor za ćelije životinja, kao što je pcDNA3.3 (Invitrogen), da se konstruiše IgG ekspresioni vektor za ćelije životinja.
[0219] Ponovo se analizira nukleotidna sekvenca konstruisanog IgG ekspresionog vektora, tako da se potvrdi da je nukleotidna sekvenca teškog lanca pune dužine 105F antitela nukleotidna sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 6 u listi sekvenci, i da je nukleotidna sekvenca lakog lanca pune dužine 105F antitela nukleotidna sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 7 u listi sekvenci.
[0220] Potvrđeno je i to da je nukleotidna sekvenca teškog lanca pune dužine 110F antitela nukleotidna sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 8 u listi sekvenci, i da je nukleotidna sekvenca lakog lanca pune dužine 110F antitela nukleotidna sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 9 u listi sekvenci.
[0221] Pored toga, na osnovu gore opisanih nukleotidnih sekvenci, određuju se aminokiselinske sekvence teškog lanca pune dužine i lakog lanca pune dužine 105F antitela kodirane nukleotidnim sekvencama, i aminokiselinske sekvence teškog lanca pune dužine i lakog lanca pune dužine 110F antitela kodirane nukleotidnim sekvencama.
[0222] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 105F antitela bila je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 2 u listi sekvenci, i aminokiselinska sekvenca lakog lanca istog bila je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 3 u listi sekvenci.
[0223] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 110F antitela bila je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 4 u listi sekvenci, i aminokiselinska sekvenca lakog lanca istog bila je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 5 u listi sekvenci.
4
[0224] IgG 105F antitela ili 110F antitela prolazno se eksprimira insertovanjem gore opisanog IgG ekspresionog vektora za ćelije životinja u FreeStyle 293F ćelije (Life Technologies), i zatim se rezultujući IgG prečistе korišćenjem Protein A-afinitetne kolone (HiTrap Mab Select SuRe, GE Healthcare), po potrebi. Posle toga, pufer u kojem je rastvoren IgG zameni se za PBS uz korišćenje Vivaspin 20 (7k MWCO, GE Healthcare) i rezultanta se zatim izloži sledećem koraku "1)-5".
1)-5 Potvrda vezivanja prečišćenog IgG za GARP, prema ELISA
[0225] 100 µL humanog GARP (R&D Systems, kataloški broj: 6055-LR) razblaženog do 1 µg/mL pomoću PBS doda se u svaki bunarčić Maxi-sorp ploče sa 96 bunarčića (Black, Nunc), i ploča se zatim inkubira preko noći na 4°C kako bi se ploča obložila.
[0226] Ploča se tri puta ispere ELISA puferom, i zatim blokira kazeinom kao blokatorom na sobnoj temperaturi, 1 sat. Ploča se tri puta ispere ELISA puferom, i u bunarčiće se doda 100 µL 50 nM 105F antitela, 50 nM 110F antitela, 50 nM humanog IgG (Jackson Immuno Research), 50 nM mišjeg anti-GARP antitela (Plato-1, ENZO Life Science) ili 50 nM mišjeg IgG (Jackson Immuno Research), i ploča se inkubira na sobnoj temperaturi, 1 sat uz mešanje.
[0227] Ploča se tri puta ispere ELISA puferom. Posle toga, 100 µL HRP-obeleženog antihumanog Fc antitela (R&D Systems), koje je 5000 puta razblaženo pomoću PBS, doda se u bunarčiće tretirane 105F antitelom, 110F antitelom ili humanim IgG. Sa druge strane, 100 µL HRP-obeleženog antimišjeg Fc antitela (R&D Systems) koje je 5000 puta razblaženo pomoću PBS, doda se u bunarčiće tretirane mišjim anti-GARP antitelom i mišjim IgG. Ploča se inkubira na sobnoj temperaturi, 1 sat uz mešanje.
[0228] Ploča se pet puta ispere ELISA puferom, i zatim se u bunarčiće doda 0.1 mL SuperSignal Pico ELISA hemiluminiscentnog supstrata. Deset minuta kasnije, hemiluminiscencija se meri korišćenjem čitača ploča (Envision 2104 Multilabel Reader, Perkin Elmer).
[0229] Kao rezultat, pokazano je da se 105F antitelo i 110F antitelo vezuju za GARP (Slika 10) kao što se vezuje i komercijalno dostupno anti-GARP antitelo.
Komparativni primer 2: Vezivanje za ćelije koje eksprimiraju gen antigena
[0230] U vezi sa GARP ekspresionim vektorom, cDNK klon humanog GARP (Origene) kupi se i klonira u pcDNA3.1 (+) vektor (Invitrogen) prema uobičajenom postupku. Posle toga, potvrdi se njegova nukleotidna sekvenca.
[0231] GARP eksperesioni vektor i pcDNA3.1 vektor upotrebljen kao kontrola, transfektuju se u HEK-293T ćelije (ATCC: CRL-11268), uz korišćenje Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dobijene ćelije se kultivišu u DMEM medijumu (Invitrogen) dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (FBS, Hyclone) preko noći, u prisustvu 5% CO2, na 37°C. Posle toga, ćelije se sakupe sa ploče tretmanom pomoću TrypLE Express (Invitrogen), i ćelije se zatim isperu dva puta MACS puferom (PBS koji sadrži 0.5% BSA i 2 mM EDTA; Miltenyi Biotec) i zatim suspenduju u istom rastvoru kao što je opisano gore. 105F antitelo i kontrolni humani IgG (ENZO Life Science) se, svaki, dodaju ćelijskoj suspenziji, i ćelije se inkubiraju 15 minuta na 4°C. Ćelije se isperu dva puta MACS puferom. Doda se i suspenduje anti-IgG antitelo označeno fluorescein izotiocijanatom (fluorescein isothiocyanate, FITC) (Jackson ImmunoResearch Laboratories), i ćelije se dodatno inkubiraju na 4°C, 15 minuta. Ćelije se isperu dva puta MACS puferom, i ćelije se zatim fiksiraju pomoću 1% PFA (pripremljen od paraformaldehida, 32% rastvor (ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES)), i mere korišćenjem protočnog citometra (FACS Canto II; Becton Dickinson). Podaci se analiziraju korišćenjem Flowjo (TreeStar). Mrtve ćelije se uklone iz analize ograđivanjem ćelija obojenih pomoću Horizon FVS450 (Becton Dickinson). Posle toga, generiše se histogram FITC intenziteta fluorescencije živih ćelija.
[0232] U vezi sa HEK-293T ćelijama koje su transfektovane samo kontrolnim vektorom, histogram intenziteta fluorescencije za 105F antitelo bio je sličan onom za kontrolni IgG. Sa druge strane, u vezi sa HEK-293T ćelijama koje eksprimiraju GARP, potvrđeno je da se histogram za 105F antitelo pomerio na stranu jakog intenziteta fluorescencije, u poređenju sa histogramom za kontrolni IgG (Slika 11). Iz gore navedenih rezultata, nađeno je da se 105F antitelo specifično vezuje za GARP eksprimiran u HEK-293T ćelijama.
Komparativni primer 3: Vezivanje za ćelije koje endogeno eksprimiraju GARP
3)-1 Protočno-citometrijska analiza uz korišćenje L428 ćelija
[0233] Fluorescentno obeležena forma 105F antitela pripremljena je pomoću Alexa Fluor 647 kita za obeležavanje monoklonskih antitela (Invitrogen). L428 ćelije (dobijene od DSMZ) isperu se dva puta MACS puferom i suspenduju u istom rastvoru. Obeleženo 105F antitelo doda se ćelijskoj suspenziji, i ćelije se inkubiraju 30 minuta, na 4°C. Ćelije se isperu dva puta MACS puferom, i ćelije se zatim fiksiraju pomoću 1% PFA, i mere korišćenjem protočnog citometra (FACS Canto II, Becton Dickinson). Podaci se analiziraju pomoću FlowJo (TreeStar). Mrtve ćelije se uklone ograđivanjem ćelija obojenih pomoću Horizon FVS450. Posle toga, generiše
1
se histogram intenziteta FITC fluorescencije živih ćelija. U poređenju sa histogramom intenziteta fluorescencije za same L428 ćelije, histogram ćelija L428 kojima je dodato 105F antitelo pomerio se na stranu jakog intenziteta fluorescencije. Tako je potvrđeno da se antitelo 105F vezalo za GARP endogeno eksprimiran u ćelijama (Slika 12).
3)-2 Protočno-citometrijska analiza uz korišćenje humanih Treg
[0234] Mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) zdravog subjekta izdvoje se korišćenjem Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare), i izdvojene ćelije se zatim zaseju u koncentraciji od 2 × 10<6>ćelija/mL, u RPMI1640 medijumu (Invitrogen) sa dodatkom 10% FBS (u nastavku ovog teksta označen kao "medijum RP-F10") u ploči sa 24 bunarčića niske adhezije (Costar). U bunarčiće se dodaju anti-CD3 antitela (BD Pharmingen) i anti-CD28 antitela (BD Pharmingen), i ćelije se kultivišu 20 sati. Posle toga, ćelije se suspenduju u FACS puferu (HBSS (Invitrogen) dopunjenom sa 10 mM HEPES (Invitrogen), 2 mM EDTA (Invitrogen) i 2% FBS), i u suspenziju se dodaju obeleženo 105F antitelo pripremljeno u gornjem 3)-1 i Alexa Fluor 647-obeleženo anti-GARP antitelo (G14D9, eBioscience). Ćelije se inkubiraju na ledu 30 minuta. Ćelije se isperu FACS puferom i doda se radni rastvor za fiksaciju/permeabilizaciju (eBioscience). Ćelije se dodatno inkubiraju na ledu, 30 minuta, i ćelije se isperu puferom za permeabilizaciju (eBioscience). Posle toga se ćelijama doda 2% serum pacova (eBioscience). Ćelije se inkubiraju na sobnoj temperaturi 15 minuta i doda se PE-obeleženo anti-Foxp3 antitelo (eBioscience), posle čega sledi dodatna inkubacija na sobnoj temperaturi, 30 minuta. Ćelije se isperu i fiksiraju rastvorom za fiksiranje tkiva koji je pripremljen dvostrukim razblaživanjem 4% rastvora paraformaldehida u fosfatnom puferu (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) sa D-PBS (Invitrogen) na 4°C, tokom 15 minuta ili više. Posle ispiranja ćelija FACS puferom, ćelije se mere pomoću protočnog citometra (FACS Canto II; Becton Dickinson) i analiziraju pomoću FlowJo (Tree Star). Kao rezultat, 105F antitelo se vezalo za FoxP3-pozitivne Treg kao što je to učinilo i komercijalno dostupno anti-GARP antitelo (Slika 13).
Komparativni primer 4: Osobine anti-GARP antitela
4)-1 ADCC aktivnost
4)-1-1 Pripremanje efektorskih ćelija
2
[0235] PBMC poreklom iz zdravih dobrovoljaca izdvoje se prema gornjem 3)-2. NK ćelije se prečiste iz PBMC korišćenjem kita za izolaciju NK ćelija (Miltenyi Biotec). Dobijene NK ćelije se inkubiraju preko noći u RP-F10 medijumu sa dodatkom 100 IU/mL rhIL-2 (Novartis). Posle toga, žive ćelije se izbroje testom isključivanja tripan plavog, i ćelije se zatim ponovo suspenduju u RP-F10 medijumu pri gustini ćelija od 2 × 10<5>ćelija/mL. Dobijene ćelije koriste se kao efektorske ćelije.
4)-1-2 Pripremanje ciljnih ćelija
[0236] 30 µL (1110 kBq) hroma-51 (<51>Cr) pomeša se sa 0.6 × 10<6>L428 ćelija opisanih u Primeru 3)-1, u RPMI1640 medijumu (Invitrogen) dopunjenom sa 10% FBS, i ćelije se inkubiraju 2 sata u prisustvu 5% CO2, na 37°C, tako da se ćelije radio-obeleže. Obeležene ćelije se isperu tri puta RPMI1640 medijumom (Invitrogen) koji je dopunjen 10% FBS, i ćelije se zatim resuspenduju u istom medijumu pri 4 × 10<4>ćelija/mL. Dobijene ćelije se koriste kao ciljne ćelije.
4)-1-3 Test oslobađanja<51>Cr
[0237] Antitelo 105F, koje je bilo razblaženo RP-F10 medijumom tako da konačna koncentracija iznosi 1, 10, 100 ili 1000 ng/mL, raspodeli se, u količini od 50 µL/bunarčiću, u mikroploču sa 96 bunarčića sa U-dnom (Costar), i ciljne ćelije se dodaju u bunarčiće (50 µL/bunarčiću). Ploča se inkubira na 4°C, 30 minuta. Posle toga, efektorske ćelije se dodaju u bunarčiće (100 µL/bunarčiću), i ploča se inkubira u prisustvu 5% CO2, na 37°C, 4 sata. Posle toga, 50 µL/bunarčiću supernatanta se sakupi i nanese na LumaPlate (PerkinElmer) i doza oslobođenog gama-zračenja meri se korišćenjem gama-brojača. Brzina lize ćelija uzrokovane ADCC aktivnošću izračunava se prema sledećoj formuli.
Stopa lize ćelija (%) = (A-B) / (C-B) x 100x
A: Vrednost izmerena za uzorački bunarčić
B: Srednja vrednost (n = 3) izmerenog spontanog oslobađanja (bunarčić bez antitela i efektorskih ćelija). Posle dodavanja antitela i posle dodavanja efektorskih ćelija, dodaje se 50 µL, odnosno 100 µL RP-F10 medijuma. Izvedene su iste operacije kao za bunarčiće sa uzorcima osim gore navedenih.
[0238] C: Srednja vrednost (n = 3) izmerena za maksimalno oslobađanje (bunarčić u kojem su ciljne ćelije rastvorene surfaktantom). Posle dodavanja antitela, doda se 50 µL RP-F10 medijuma. Posle dodavanja efektorskih ćelija, doda se 100 µL RP-F10 medijuma dopunjenog 2% (v/v) Triton-X100 (Sigma). Izvedene su iste operacije kao za bunarčiće sa uzorcima osim gore navedenih.
[0239] Rezultati su prikazani na Slici 14. Antitelo 105F pokazalo je citolitičku aktivnost prema L428 ćelijama na način zavisan od koncentracije antitela. Sa druge strane, kontrolni humani IgG nije pokazao takvu citolitičku aktivnost. Prema tome, 105F antitelo je imalo ADCC aktivnost prema L428 ćelijama koje eksprimiraju endogeni GARP. Treba napomenuti da humana IgG1 anti-GARP antitela (MHG8 i LHG10) proizvedena na osnovu informacija o sekvenci opisanim u Patentnoj literaturi 1, nisu pokazala ADCC aktivnost.
4)-2 Aktivnost inhibiranja funkcije Treg
4)-2-1 Pripremanje Treg, Teff (efektorske T ćelije: CD4-pozitivne CD25-negativne pomagačke T ćelije), i pomoćnih ćelija
[0240] CD4-pozitivne T ćelije izdvoje se iz PBMC pripremljenih na isti način kao u gornjem 4)-1-1, uz korišćenje kita za izolaciju CD4 T ćelija (CD4 T cell ISOLATION kit, Miltenyi Biotec), i FITC-obeleženo anti-CD4 antitelo (Miltenyi Biotec) i APC-obeleženo anti-CD25 antitelo (Miltenyi Biotec) dodaju se CD4-pozitivnim T ćelijama. Ćelije se inkubiraju na 4°C, 30 minuta. Pošto se ćelije isperu, ćelije se suspenduju u MACS puferu, i CD4-pozitivne CD25-negativne ćelije (Teff) i CD4-pozitivne CD25-snažno pozitivne ćelije (Treg) razdvoje se korišćenjem FACS Aria IIu (Becton Dickinson).
[0241] Sa druge strane, CD3-pozitivne ćelije izdvoje se iz PBMC uz korišćenje CD3 mikroperlica (Miltenyi Biotec) i ćelije se ozrače dozom od 1 C/kg (apsorbovana doza: 38.76 Gy/kg (3876 Rad/kg)) uz korišćenje ozračivanja X-zracima (Hitachi Medical Corporation) da bi se pripremile pomoćne ćelije.
4)-2-2 Postupak kokultivisanja i test inhibitorne aktivnosti na funkciju Treg
[0242] Kao medijum za kulturu, upotrebljen je RPMI1640 medijum (Invitrogen) dopunjen penicilinom i streptomicinom (Invitrogen), 1 × MEM NEAA (Invitrogen), 1 × natrijum piruvatom (Invitrogen), 5 mM Hepes i 5% čovečjim AB serumom muškarca (Sigma). Teff (2000 ćelija/bunarčiću) i pomoćne ćelije (20000 ćelija/bunarčiću) pomešaju se i dodaju u svaki
4
od bunarčića mikroploče sa 96 bunarčića sa U-dnom, i dodaju se i Treg i zaseju u bunarčiće u količini od 500 ćelija/bunarčiću. Pored toga, pripreme se i kontrolni bunarčići bez Treg. Anti-CD3 antitelo, anti-CD28 antitelo, i 105F antitelo dodaju se u bunarčiće u finalnoj koncentraciji od 50 ili 10 µg/mL, i ploče se inkubiraju 5 dana u prisustvu 5% CO2, na 37°C. Posle toga, pripremi se [<3>H]-timidin (PerkinElmer) u količini 18.5 kBq/mL i doda u svaki bunarčić u količini od 20 µL/bunarčiću. Ćelije se inkubiraju još 18 sati. Ćelije se sakupe u Filtermat A (PerkinElmer) korišćenjem uređaja za sakupljanje ćelija (Mach II, Tomtech), i radioaktivnost [<3>H]-timidina inkorporisanog u ćelije meri se korišćenjem scintilacionog brojača (MicroBeta, PerkinElmer). Podaci dobijeni merenjem izražavaju se kao korigovana vrednost po minutu (corrected count per minute, CCPM).
[0243] Humana IgG1 anti-GARP antitela (MHG8 i LHG10) proizvedena na osnovu informacija o sekvenci opisanim u Patentnoj literaturi 1, takođe su bila izložena ovom eksperimentalnom sistemu.
4)-2-3 Izračunavanje inhibitorne aktivnosti
[0244] Izračunava se srednja vrednost za tri bunarčića pod svakim od kokultivacionih uslova. Snižena vrednost proliferacije Teff u kokulturi sa Treg, kada se uporedi sa onom za Teff same, definiše se kao "stopa supresije proliferacije Teff, izazvane pomoću Treg" (= 1 - [CCPM kokulture/CCPM Teff samih]).
[0245] Inhibitorna aktivnost svakog od antitela na funkciju Treg određuje se oduzimanjem stope supresije proliferacije Teff, izazvane pomoću Treg u prisustvu antitela, od one u odsustvu antitela (= [stopa supresije posle nedodavanja antitela] - [stopa supresije posle dodavanja svakog od antitela]). Treba napomenuti da se ova inhibitorna aktivnost uzorka izračunava svaki put u svakom eksperimentu.
[0246] Rezultati inhibitorne aktivnosti 105F antitela na funkciju Treg pri 50 µg/mL (stopa inhibicije: 72,6%) prikazani su na Slici 15, i rezultati 105F antitela i MHG-8 i LHG-10 antitela (10 µg/mL svako) prikazani su na Slici 16. Antitela MHG-8 i LHG-10 nisu imala inhibitornu aktivnost na funkciju Treg (stope inhibicije: 0.8% odnosno 0.0%), dok je 105F antitelo značajno inhibiralo funkciju Treg (stopa inhibicije: 65.8%). Stopa inhibicije prouzrokovana transdukcijom siRNK za GARP u Treg bila je oko 15%, kada se grubo izračuna pomoću vrednosti na Slici 5A (CD4 CD25 - (Teff) : Treg = 4 : 1) iz Nepatentne literature 10.
Primer 5: Proizvodnja antitela pacova
5)-1 Pripremanje GARP ekspresionog vektora
[0247] Ekspresioni vektor opisan u Primeru 2 upotrebljen je kao GARP ekspresioni vektor, i EndoFree Plasmid Giga kit (QIAGEN) upotrebljen je za masovnu proizvodnju.
5)-2 Imunizacija pacova
[0248] Za imunizaciju, korišćene su ženke WKY/Izm pacova (Japan SLC, Inc.). Najpre se izvrši predretman zadnjih udova svakog pacova hijaluronidazom (SIGMA-ALDRICH) i na ista mesta se intramuskularno injektira GARP ekspresioni vektor. Posle toga, korišćenjem ECM830 (BTX), na istim mestima se izvodi in vivo elektroporacija, korišćenjem elektrode sa dve igle. Jednom svake dve nedelje, ponavlja se in vivo elektroporacija na isti način, i limfni čvorovi ili slezina izoluju se iz pacova i koriste za proizvodnju hibridoma.
5)-3 Proizvodnja hibridoma
[0249] Ćelije limfnog čvora ili slezine fuzionišu se sa mišjim mijeloma ćelijama SP2/0-ag14 (ATCC, br. CRL-1581) električnom fuzijom ćelija, uz korišćenje LF301 jedinice za fuziju (BEX), i ćelije se zatim razblaže ClonaCell-HY selekcionim medijumom D (StemCell Technologies) i inkubiraju. Kolonije hibridoma koje se pojavljuju u kulturi izdvoje se i selektuju kao monoklonski hibridomi. Svaka kolonija hibridoma se kultiviše, i supernatant kulture svakog hibridoma koristi se za pretragu hibridoma koji proizvode anti-GARP antitelo.
5)-4 Pretraživanje antitela prema ćelijskom ELISA postupku
5)-4-1 Pripremanje ćelija koje eksprimiraju gen antigena za upotrebu u ćelijskom ELISA
[0250] 293α ćelije (stabilna ekspresiona ćelijska linija izvedena iz HEK-293 ćelija (ATCC: CRL-1573) koje eksprimiraju integrin αv i integrin β3) pripreme se u koncentraciji od 7.5 × 10<5>ćelija/mL u DMEM medijumu (Invitrogen) dopunjenom 10% FBS. Prema procedurama transdukcije za upotrebu Lipofektamina 2000 (Life Technologies), GARP ekspresioni vektor ili pcDNA3.1 (+) vektor upotrebljen kao negativna kontrola, transfektuju se u ćelije, i ćelije se dispenduju u količini od po 50 µl u ploču sa 96 bunarčića sa prepolovljenom površinom (96-half area well plate, Corning). Posle toga, ćelije se kultivišu u DMEM medijumu dopunjenom 10% FBS-om, 24 do 27 sati u prisustvu 5% CO2, na 37°C. Dobijene transfektovane ćelije koriste se za ćelijski ELISA u adhezivnom stanju.
5)-4-2 Ćelijski ELISA
[0251] Supernatant kulture 293α ćelija transfektovanih ekspresionim vektorima, pripremljenih u Primeru 5)-4-1 se ukloni i supernatant kulture svakog hibridoma doda se 293α ćelijama transfektovanim GARP ekspresionim vektorom ili pcDNA3.1 (+) vektorom. Ćelije se inkubiraju na 4°C, 1 sat. Ćelije u bunarčićima se jedanput isperu pomoću PBS (+) koji je dopunjen sa 5% FBS, i zatim se u bunarčiće doda anti-pacovsko IgG-peroksidaza antitelo proizvedeno u zecu (SIGMA) koje je razblaženo 500 puta u PBS-u (+) dopunjenom sa 5% FBS. Ćelije se inkubiraju na 4°C, 1 sat. Ćelije u bunarčićima se isperu tri puta u PBS (+) dopunjenom sa 5% FBS, i u bunarčiće se doda OPD rastvor za bojenje (koji se priprema rastvaranjem ofenilendiamin dihidrohlorida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i H2O2u OPD rastvoru (0.05 M trinatrijum citrat, 0.1 M dinatrijum hidrogen fosfat, 12-molekula vode; pH 4.5), tako da supstance dostignu 0.4 mg/ml i 0.6% (v/v), redom) u količini od 50 µl/bunarčiću. Dok se ploče inkubiraju neko vreme uz mešanje, odvija se reakcija bojenja. Posle toga, u ploču se doda 1M HCl (50 µl/bunarčiću) da se prekine reakcija bojenja, i meri se apsorbanca na 490 nm uz korišćenje čitača ploča (ENVISION: PerkinElmer). Da bi se odabrali hibridomi koji proizvode antitelo koje se specifično vezuje za humani GARP eksprimiran na površini ćelijske membrane, hibridomi koji proizvode supernatant kulture koji ispoljava višu apsorbancu u 293α ćelijama transfektovanim GARP ekspresionim vektorom od one u ćelijama transfektovanim kontrolnim pcDNA3.1 (+) vektorom odaberu se kao pozitivne ćelije koje proizvode antihumano GARP antitelo.
5)-5 Pretraživanje antitela postupkom protočne citometrije
5)-5-1 Pripremanje ćelija koje eksprimiraju gen antigena, za upotrebu u analizi protočnom citometrijom
[0252] HEK-293T ćelije (dobijene od ATCC) zaseju se u bocu od 225 cm<2>(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) u koncentraciji od 5 × 10<4>ćelija/cm<2>, i ćelije se zatim kultivišu u DMEM medijumu dopunjenom sa 10% FBS, preko noći, u prisustvu 5% CO2, na 37°C. Sledećeg dana, HEK-293T ćelije se transfektuju GARP ekspresionim vektorom ili pcDNA3.1 (+) vektorom upotrebljenim kao negativna kontrola, uz korišćenje Lipofektamina 2000, i ćelije se dodatno inkubiraju preko noći, u prisustvu 5% CO2, na 37°C. Sledećeg dana, transfektovane HEK-293T ćelije tretiraju se TrypLE Express (Life Technologies), isperu DMEM medijumom koji je dopunjen sa 10% FBS i ponovo se suspenduju u PBS-u koji je dopunjen sa 5% FBS. Dobijena ćelijska suspenzija koristi se u protočno-citometrijskoj analizi.
5)-5-2 Protočno-citometrijska analiza
[0253] Specifičnost vezivanja za humani GARP, antitela proizvedenog iz hibridoma za koje je pomoću ćelijskog ELISA u Primeru 5)-4-2 utvrđena pozitivnost, dodatno je potvrđena protočno-citometrijskom analizom.
[0254] Suspenzija prolazno eksprimirajućih HEK-293T ćelija pripremljena u Primeru 5)-5-1 se centrifugira, i zatim se ukloni supernatant. Posle toga, supernatant kulture iz svakog hibridoma doda se ćelijama i izvrši se suspendovanje. Ćelije se inkubiraju na 4°C, 1 sat. Ćelije se isperu dva puta korišćenjem PBS dopunjenog sa 5% FBS, i FITC-konjugovani anti-pacovski IgG (SIGMA) koji je bio razblažen 500 puta korišćenjem PBS dopunjenog sa 5% FBS doda se ćelijama i izvrši se suspendovanje. Ćelije se inkubiraju na 4°C, 1 sat. Ćelije se isperu dva puta korišćenjem PBS dopunjenog sa 5% FBS, i zatim se resuspenduju u PBS sa dodatkom 5% FBS i 2 µg/ml 7-aminoaktinomicina D (Molecular Probes). Ćelije se mere korišćenjem protočnog citometra (FC500: proizvođač Beckman Coulter). Podaci se analiziraju pomoću Flowjo (TreeStar). Posle uklanjanja mrtvih ćelija iz analize postavljanjem ograde na 7-aminoaktinomicin D-pozitivnim ćelijama, konstruiše se histogram intenziteta FITC fluorescencije živih ćelija. Hibridomi koji proizvode humana GARP-vezujuća antitela (113 klonova) odaberu se na osnovu rezultata gde se histogram za antitela pomera ka jakom intenzitetu fluorescencije u HEK-293T ćelijama transfektovanim GARP-eksprimirajućim vektorom, u poređenju sa ćelijama transfektovanim kontrolnim pcDNA3.1 vektorom.
5)-6 Pripremanje monoklonskog antitela
5)-6-1 Kultura hibridoma 151D i 198D
[0255] Iz hibridoma pacova, koji proizvode anti-humana GARP antitela, dobijenih u gornjem 5)-5-2, odaberu se hibridomi 151D i 198D, za koje je sugerisano da se snažno vezuju za humani GARP.
[0256] Pacovsko anti-GARP monoklonsko antitelo se prečisti iz supernatanta kulture hibridoma.
[0257] Prvo, zapremina hibridoma koji proizvode pacovsko anti-GARP monoklonsko antitelo dovoljno se poveća korišćenjem ClonaCell-HY selekcionog medijuma E, i posle toga, medijum se zameni Hybridoma SFM (Life Technologies) medijumom kojem se doda 20% Ultra Low IgG FBS (Life Technologies). Posle toga, hibridomi (8 do 9 × 10<7>ćelija) se zaseju u bocu od 1272-cm<2>(Corning), i zatim kultivišu 7 dana. Supernatant ove kulture se sakupi centrifugiranjem, i steriliše propuštanjem kroz 0.8 µm-ski filter, i kroz 0.45-µm-ski filter (Corning).
5)-6-2 Prečišćavanje monoklonskog antitela
[0258] Antitelo se prečisti iz supernatanta kulture hibridoma pripremljene u Primeru 5)-6-1 Protein G afinitetnom hromatografijom. Antitelo se adsorbuje na Protein G-kolonu (GE Healthcare Bioscience), kolona se zatim ispere pomoću PBS, i antitelo se zatim eluira 0.1 M vodenim rastvorom glicin/HCl (pH 2.7).1 M Tris-HCl (pH 9.0) doda se u eluat, tako da se pH podesi na pH 7.0 do 7.5. Posle toga, rastvor se dijalizira (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), tako da se pufer zameni za PBS. Korišćenjem UF filterskog uređaja za centrifugiranje VIVASPIN20 (Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20; granična vrednost molekularne težine: UF30K, Sartorius), antitelo se koncentruje, tako da se koncentracija antitela podesi na 0.7 mg/mL ili više. Na kraju, antitelo se filtrira kroz filter Minisart-Plus (Sartorius) da se dobije prečišćeni uzorak.
Primer 6: Kloniranje antitela pacova i proizvodnja humanog himernog antitela
6)-1 Kloniranje i sekvenciranje cDNK 151D antitela pacova
6)-1-1 Pripremanje ukupne RNK iz hibridoma koji proizvode 151D
[0259] Da bi se amplifikovala cDNK koja sadrži varijabilni region 151D, ukupna RNK se pripremi iz hibridoma koji proizvode 151D, korišćenjem TRIzol reagensa (Ambion). [0194]
6)-1-2 Amplifikacija cDNK koja sadrži varijabilni region teškog lanca 151D, prema 5'-RACE PCR, i njeno sekvenciranje
[0260] cDNK koja sadrži varijabilni region teškog lanca amplifikuje se korišćenjem približno 1 µg od ukupne RNK pripremljene u Primeru 6)-1-1, i SMARTer RACE cDNA kita za amplifikaciju (Clontech).
[0261] Kao prajmeri za amplifikaciju cDNK gena varijabilnog regiona teškog lanca 151D prema PCR postupku, koriste se UPM (univerzalna mešavina prajmera A, Universal Primer A Mix: uključena u SMARTer RACE cDNA kit za amplifikaciju) i prajmeri dizajnirani na osnovu sekvenci konstantnih regiona poznatih teških lanaca pacova.
[0262] cDNK koja sadrži varijabilni region teškog lanca, amplifikovana putem 5'-RACE PCR, klonira se u plаzmid i posle toga se nukleotidna sekvenca cDNK varijabilnog regiona teškog lanca podvrgne sekvencionoj analizi.
[0263] Determinisana nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira verijabilni region teškog lanca 151D prikazana je u SEQ ID NO: 14, i njena aminokiselinska sekvenca prikazana je u SEQ ID NO: 15.
6)-1-3 Amplifikacija cDNK koja sadrži varijabilni region lakog lanca 151D, prema 5'-RACE PCR, i njeno sekvenciranje
[0264] Amplifikacija i sekvenciranje izvode se postupkom koji je isti kao onaj primenjen u Primeru 6)-1-2. Međutim, kao prajmeri za amplifikaciju cDNK gena varijabilnog regiona lakog lanca 151D prema PCR, koriste se UPM (Universal Primer A Mix: uključena u SMARTer RACE cDNA kit za amplifikaciju) i prajmeri dizajnirani na osnovu sekvenci konstantnih regiona poznatih lakih lanaca pacova.
[0265] Determinisana nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira verijabilni region lakog lanca 151D prikazana je u SEQ ID NO: 16, i njena aminokiselinska sekvenca prikazana je u SEQ ID NO: 17.
6)-2 Kloniranje i sekvenciranje cDNK 198D antitela pacova
[0266] Sekvence se određuju istim postupkom kao što je onaj primenjen u Primeru 6)-1.
[0267] Determinisana nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira verijabilni region teškog lanca 198D prikazana je u SEQ ID NO: 18, i njena aminokiselinska sekvenca prikazana je u SEQ ID NO: 19. Determinisana nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira verijabilni region lakog lanca 198D prikazana je u SEQ ID NO: 20, i njena aminokiselinska sekvenca prikazana je u SEQ ID NO: 21.
6)-3 Proizvodnja ekspresionog vektora humanog himernog antitela
6)-3-1 Konstruisanje ekspresionog vektora humanog himernog lakog lanca, pCMA-LK
[0268] Fragment od pribl. 5.4 kb, dobijen digestijom plazmida pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen) restrikcionim enzimima XbaI i PmeI, poveže se sa DNK fragmentom koji sadrži signalnu sekvencu humanog lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 22 i DNK sekvencu koja kodira konstantni region humanog κ lanca, korišćenjem In-Fusion Advantage PCR kita za kloniranje (CLONTECH), da se proizvede pcDNA3.3/LK.
[0269] Jedinica za ekspresiju neomicina ukloni se iz pcDNA3.3/LK da se konstruiše pCMA-LK.
6)-3-2 Konstruisanje ekspresionog vektora humanog himernog teškog lanca IgG1 tipa, pCMA-G1
[0270] DNK fragment dobijen digestijom pCMA-LK pomoću XbaI i PmeI kako bi se iz njega uklonile signalna sekvenca lakog lanca i konstantni region humanog κ lanca, poveže se sa DNK fragmentom koji sadrži signalnu sekvencu humanog teškog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 23 i DNK sekvencu koja kodira amino-kiseline u konstantnom regionu humanog IgG1, uz korišćenje In-Fusion Advantage PCR kita za kloniranje (CLONTECH), da se konstruiše pCMA-G1.
6)-3-3 Konstruisanje ekspresionog vektora teškog lanca humanog himernog 151D
[0271] Korišćenjem kao templata cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca 151D antitela pacova, dobijene u Primeru 6)-1, izvodi se PCR sa prajmerima dizajniranim za Infusion kloniranje, tako da se amplifikuje DNK fragment koji sadrži cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca. Korišćenjem In-Fusion HD PCR kita za kloniranje (Clontech), amplifikovani DNK fragment se insertuje u mesto pCMA-G1 koje je bilo isečeno restrikcionim enzimom BIpI, tako da se konstruiše ekspresioni vektor teškog lanca humanog himernog 151D.
[0272] Nukleotidna sekvenca teškog lanca humanog himernog 151D i aminokiselinska sekvenca ovog teškog lanca prikazane su u SEQ ID NO: 24, odnosno SEQ ID NO: 25.
6)-3-4 Konstruisanje ekspresionog vektora lakog lanca humanog himernog 151D
[0273] Korišćenjem kao templata cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca 151D, dobijene u Primeru 6)-1, izvodi se PCR sa prajmerima dizajniranim za In-fusion kloniranje, tako da se amplifikuje DNK fragment koji sadrži cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca. Korišćenjem In-Fusion HD PCR kita za kloniranje (Clontech), amplifikovani DNK fragment se insertuje u mesto pCMA-LK koje je bilo isečeno restrikcionim enzimom BsiWI, tako da se konstruiše ekspresioni vektor lakog lanca humanog himernog 151D.
1
[0274] Nukleotidna sekvenca lakog lanca humanog himernog 151D i aminokiselinska sekvenca ovog teškog lanca prikazane su u SEQ ID NO: 26, odnosno SEQ ID NO: 27.
6)-3-5 Konstruisanje ekspresionog vektora teškog lanca humanog himernog 198D
[0275] Korišćenjem kao templata cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca 198D antitela pacova, dobijene u Primeru 6)-2, ekspresioni vektor teškog lanca humanog himernog 198D konstruiše se istim postupkom kao što je onaj primenjen u Primeru 6)-3-3.
[0276] Nukleotidna sekvenca teškog lanca humanog himernog 198D i aminokiselinska sekvenca ovog teškog lanca prikazane su u SEQ ID NO: 28, odnosno SEQ ID NO: 29.
6)-3-6 Konstruisanje ekspresionog vektora lakog lanca humanog himernog 198D
[0277] Korišćenjem kao templata cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca 198D, dobijene u Primeru 6)-2, ekspresioni vektor lakog lanca humanog himernog 198D konstruiše se istim postupkom kao što je onaj primenjen u Primeru 6)-3-4.
[0278] Nukleotidna sekvenca lakog lanca humanog himernog198D i aminokiselinska sekvenca ovog lakog lanca prikazane su u SEQ ID NO: 30, odnosno SEQ ID NO: 31.
6)-4 Pripremanje humanog himernog antitela
6)-4-1 Proizvodnja humanog himernog antitela
[0279] Prema uputstvu, FreeStyle 293F ćelije (Invitrogen) se kultivišu i pasažiraju. 1 × 10<8>FreeStyle 293F ćelija (Invitrogen) u logaritamskoj fazi rasta zaseje se u 250 mL-ski Fernbach erlenmajer (CORNING), i zatim razblaži FreeStyle293 ekspresionim medijumom (Invitrogen) do 2.0 × 10<6>ćelija/mL.
[0280] U međuvremenu, 20 µg ekspresionog vektora teškog lanca, 30 µg ekspresionog vektora lakog lanca i 150 µg polietilenimina (Polyscience #24765) dodaju se u 5 mL Opti-Pro SFM medijuma (Invitrogen), i dobijena smeša se blago promeša. Posle inkubacije od 5 minuta, smeša se doda FreeStyle 293F ćelijama.
[0281] Ćelije se inkubiraju u inkubatoru (37°C, 8% CO2) uz šejkiranje na 125 opm, u trajanju od 4 sata, i posle toga se u kulturu dodaju 50 mL EX-CELL VPRO medijuma (SAFC Biosciences), 0.36 mL GlutaMAX I (GIBCO), i 2.5 mL Yeastolate ultrafiltrata (GIBCO). Ćelije se dodatno inkubiraju u inkubatoru (37°C, 8% CO2) uz šejkiranje na 125 opm, 7 dana.
2
Supernatant kulture se sakupi i filtrira pomoću 250 mL-skog sistema za filtriranje (CORNING, #431096).
[0282] Humano himerno 151D antitelo dobijeno kombinovanjem ekspresionog vektora teškog lanca humanog himernog 151D sa ekspresionim vektorom lakog lanca humanog himernog 151D nazvano je "c151D", dok je humano himerno 198D antitelo dobijeno kombinovanjem ekspresionog vektora teškog lanca humanog himernog 198D sa ekspresionim vektorom lakog lanca humanog himernog 198D nazvano "c198D".
6)-4-2 Prečišćavanje himernog antitela
[0283] Supernatant kulture dobijen u Primeru 6)-4-1 prečisti se jednostepenim procesom rProtein A afinitetne hromatografije. Supernatant kulture se nanese na kolonu (proizvođač GE Healthcare Bioscience) koja je bila napakovana smolom MabSelectSuRe ekvilibrisanom pomoću PBS, i kolona je zatim isprana pomoću PBS u količini dva ili više puta većoj od zapremine kolone. Zatim je izvršeno eluiranje korišćenjem 2 M rastvora arginin hidrohlorida (pH 4.0), tako da se sakupi frakcija koja sadrži antitelo. Ova frakcija se izloži UF filterskom uređaju za centrifugiranje VIVASPIN20 (granična vrednost molekularne težine: UF30K, Sartorius), tako da se pufer zameni za PBS i antitelo se koncentruje, čime se koncentracija antitela podesi na 1 mg/mL ili više. Na kraju, antitelo se filtrira kroz Minisart-Plus filter (Sartorius) da se dobije prečišćeni uzorak.
6)-5 Evaluacija vezujuće aktivnosti humanog himernog antitela za humani GARP
[0284] Konstanta disocijacije između c151D ili c198D proizvedenih u Primeru 6)-4 i humanog GARP evaluirana je pomoću Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience), prema postupku zadržavanja, koji uključuje zadržavanje antitela kao liganda na imobilisanom proteinu A i zatim analiziranje konstante disocijacije uz korišćenje antigena (rekombinantni ljudski GARP: R&D Systems) kao analita. HBS-EP+ (proizvođač GE Healthcare Bioscience) koristi se kao radni pufer, i protein A senzorski čip (proizvođač GE Healthcare Bioscience) koristi se kao senzorski čip.
[0285] Humano himerno antitelo (1 µg/mL) dodaje se na čip pri stopi od 10 µL/min, tokom 20 sekundi, i serijsko razblaženje rastvora (8 do 128 nM) antigena se zatim dodaje pri stopi protoka od 30 µl/min, tokom 120 sekundi. Posle toga, disocijacija se prati tokom 480 sekundi. Kao rastvor za regeneraciju, dodaje se glicin 1.5 (proizvođač GE Healthcare Bioscience) pri stopi protoka od 20 µl/min, tokom 30 sekundi.
[0286] U analizi podataka upotrebljavaju se 1 : 1 modeli fitovanja, i izračunavaju se konstanta stope asocijacije ka, konstanta stope disocijacije kd, i konstanta disocijacije (KD; KD = kd/ka).
[0287] Rezultati su prikazani u Tabeli 1.
Tabela 1 Konstanta disocijacije između c151D ili c198D i humanog GARP
[0288]
[Tabela 1]
Primer 7 Proizvodnja humanizovanog antitela
7)-1 Molekularno modelovanje varijabilnog regiona c151D antitela
[0289] Molekularno modelovanje varijabilnog regiona c151D antitela izvedeno je prema postupku koji je uopšteno poznat kao homologno modelovanje (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)).
[0290] Primarna sekvenca varijabilnog regiona humanog imunoglobulina registrovanog u Proteinskoj banci podataka (Protein Data Bank, Nuc. Acid Res.28, 235-242 (2000)) (dostupna je trodimenzionalna struktura izvedena iz kristalne strukture dobijene rendgenografijom) upoređuje se sa varijabilnim regionom c151D antitela.
[0291] Trodimenzionalna struktura varijabilnog regiona proizvodi se tako što se međusobno kombinuju koordinate teškog lanca i lakog lanca c151D antitela i model koji ima visoku sekvencionu homologiju sa njihovim interfejsima, tako da se dobije "model okvira".
[0292] Posle toga, reprezentativna konformacija svakog CDR inkorporiše se u model okvira.
[0293] Na kraju, da bi se eliminisao kontakt atoma koji je energetski nepovoljan, izvodi se izračunavanje energetske minimizacije. Gore opisane procedure izvode se korišćenjem aplikacije Discovery Studio (Dassault Systemes).
7)-2 Dizajn aminokiselinske sekvence humanizovanog 151D antitela
4
[0294] Humanizovano 151D antitelo konstruiše se prema postupku koji je uopšteno poznat kao CDR kalemljenje (Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 86, 10029-10033 (1989)). Akceptorsko antitelo se bira na bazi homologije amino-kiselina u regionu okvira.
[0295] Sekvenca regiona okvira c151D antitela upoređuje se sa regionom okvira konsenzusne sekvence humane podgrupe određene po KABAT i sarad. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Kao rezultat, konsenzusna sekvenca humanog γ lanca podgrupe 3 i humanog κ lanca podgrupe 1 i 4 imaju visoku sekvencionu homologiju, i na osnovu toga one su odabrane za akceptore.
[0296] U vezi sa konsenzusnom sekvencom humanog γ lanca podgrupe 3 i konsenzusnim sekvencama humanog κ lanca podgrupe 1 i humanog κ lanca podgrupe 4, aminokiselinske rezidue u regionima okvira poravnavaju se sa aminokiselinskim reziduama c151D antitela, tako da se identifikuju pozicije na kojima su korišćene različite amino-kiseline. Pozicije ovih rezidua analiziraju se korišćenjem trodimenzionalnog modela c151D antitela konstruisanog u gornjem 7)-1, i donorske rezidue koje će se kalemiti na akceptor biraju se na osnovu kriterijuma koje su dali Queen i sarad. (Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 86, 10029-10033 (1989)).
[0297] Nekoliko tako odabranih donorskih rezidua uvodi se u akceptorsko antitelo tako da se konstruiše sekvenca humanizovanog h151D na način kao što je opisano u Primerima koji slede.
7)-3 Dizajn teškog lanca h151D-H humanizovanog 151D
7)-3-1 h151D-H1 tip teškog lanca
[0298] Teški lanac humanizovanog 151D dizajniran supstitucijom argininske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 35 glicinskom reziduom, lizinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 37 leucinskom reziduom, lizinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 38 argininskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 42 alaninskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 61 glicinskom reziduom, glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 62 lizinskom reziduom, alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 68 serinskom reziduom, argininske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 80 alaninskom reziduom, alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 94 serinskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 96 asparaginskom reziduom, rezidue asparaginske kiseline na aminokiselinskoj poziciji 103 asparaginskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 107 alaninskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 112 valinskom reziduom, valinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 130 treoninskom reziduom i metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 131 leucinskom reziduom u teškom lancu c151D prikazanom u SEQ ID NO: 25 u listi sekvenci, nazvan je "h151D-H1 tip teškog lanca".
[0299] U nukleotidnoj sekvenci (SEQ ID NO: 32) koja kodira h151D-H1 tip teškog lanca, zreli teški lanac iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca, kodiran je nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398, varijabilni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 408, i konstantni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 409 do 1398. Gore pomenuti varijabilni region ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 133 do 162 koja kodira CDRH1, nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 205 do 234 koja kodira CDRH2, i nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleoitdnim pozicijama 352 do 375 koja kodira CDRH3, u SEQ ID NO: 32 u listi sekvenci.
[0300] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 33) h151D-H1 tipa teškog lanca, zreli teški lanac iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466, varijabilni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136, i konstantni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 137 do 466. Gore pomenuti varijabilni region ima CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 45 do 54 u SEQ ID NO: 33 u listi sekvenci, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 69 do 78 u istoj, i CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 118 do 125 u istoj.
[0301] Pored toga, sekvence prikazane u SEQ ID NO: 32 i 33 prikazane su i na Slikama 31, odnosno 21.
7)-3-2 h151D_H4 tip teškog lanca
[0302] Teški lanac humanizovanog 151D dizajniran supstituisanjem argininske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 35 glicinskom reziduom, lizinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 37 leucinskom reziduom, lizinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 38 argininskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 42 alaninskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 61 glicinskom reziduom, glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 62 lizinskom reziduom, alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 94 serinskom reziduom, rezidue asparaginske kiseline na aminokiselinskoj poziciji 103 asparaginskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 107 alaninskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 112 valinskom reziduom, valinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 130 treoninskom reziduom, i metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 131 leucinskom reziduom u teškom lancu c151D prikazanom u SEQ ID NO: 25 u listi sekvenci, nazvan je "h151D_H4 tip teškog lanca".
[0303] U nukleotidnoj sekvenci (SEQ ID NO: 34) koja kodira h151D-H4 tip teškog lanca, zreli teški lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca, kodiran je nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398, varijabilni region kodiran je nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 408, i konstantni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 409 do 1398. Gore pomenuti varijabilni region ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 133 do 162 koja kodira CDRH1, nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 205 do 234 koja kodira CDRH2, i nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 352 do 375 koja kodira CDRH3, u SEQ ID NO: 34 u listi sekvenci.
[0304] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 35) h151D-H4 tipa teškog lanca, zreli teški lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466, varijabilni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136, i konstantni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 137 do 466. Gore pomenuti varijabilni region ima CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 45 do 54 u SEQ ID NO: 35 u listi sekvenci, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 69 do 78 u istoj, i CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 118 do 125 u istoj.
[0305] Pored toga, sekvence prikazana u SEQ ID NO: 34 i 35 prikazane su i na Slikama 33, odnosno 23.
7)-4 Dizajn lakog lanca h151D_L humanizovanog 151D
7)-4-1 h151D-L1 tip lakog lanca
[0306] Laki lanac humanizovanog 151D dizajniran supstitucijom treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 29 reziduom asparaginske kiseline, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 31 leucinskom reziduom, fenilalaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 32 alaninskom reziduom, izoleucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 33 valinskom reziduom, valinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 35 leucinskom reziduom, rezidue asparaginske kiseline na aminokiselinskoj poziciji 37 reziduom glutaminske kiseline, valinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 39 alaninskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 41 izoleucinskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 60 prolinskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 83 serinskom reziduom, asparaginske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 97 serinskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 98 leucinskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 103 valinskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 120 glutaminskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 124 valinskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 126 izoleucinskom reziduom, asparaginske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 127 lizinskom reziduom, i alaninske residue na aminokiselinskoj poziciji 129 treoninskom reziduom u lakom lancu c151D prikazanom u SEQ ID NO: 27 u listi sekvenci, nazvan je "h151D_L1 tip lakog lanca".
[0307] U nukleotidnoj sekvenci (SEQ ID NO: 36) koja kodira h151D-L1 tip lakog lanca, zreli laki lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca, kodiran je nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 702, varijabilni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 387, i konstantni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 388 do 702. Gore pomenuti varijabilni region ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 130 do 162 koja kodira CDRH1, nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 208 do 228 koja kodira CDRH2, i nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 325 do 351 koja kodira CDRH3, u SEQ ID NO: 36 u listi sekvenci.
[0308] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 37) h151D_L1 tipa lakog lanca, zreli laki lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234, varijabilni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129, i konstantni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 130 do 234. Gore pomenuti varijabilni region ima CDRH1 koji se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 44 do 54 u SEQ ID NO: 37 u listi sekvenci, CDRH2 koji se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 70 do 76 u istoj, i CDRH3 koji se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 109 do 117 u istoj.
[0309] Pored toga, sekvence prikazana u SEQ ID NO: 36 i 37 prikazane su i na Slikama 32, odnosno 22.
7)-4-2 h151D-L4 tip lakog lanca:
[0310] Laki lanac humanizovanog 151D dizajniran supstituisanjem treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 29 serinskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 31 leucinskom reziduom, fenilalaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 32 serinskom reziduom, izoleucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 33 alaninskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 41 izoleucinskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 60 prolinskom reziduom, glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 62 lizinskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 83 serinskom reziduom, asparaginske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 97 serinskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 98 leucinskom reziduom, alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 100 prolinskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 103 fenilalaninskom reziduom, valinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 105 treoninskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 120 glutaminskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 124 valinskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 126 izoleucinskom reziduom, asparaginske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 127 lizinskom reziduom, i alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 129 treoninskom reziduom u lakom lancu c151D prikazanom u SEQ ID NO: 27 u listi sekvenci, nazvan je "h151D-L4 tip lakog lanca".
[0311] U nukleotidnoj sekvenci (SEQ ID NO: 38) koja kodira h151D-L4 tip lakog lanca, zreli laki lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca, kodiran je nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 702, varijabilni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 387, i konstantni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 388 do 702. Gore pomenuti varijabilni region ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 130 do 162 koja kodira CDRL1, nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 208 do 228 koja kodira CDRL2, i nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 325 do 351 koja kodira CDRL3, u SEQ ID NO: 38 u listi sekvenci.
[0312] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 39) h151D_L4 tipa lakog lanca, zreli laki lanac iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234, varijabilni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129, i konstantni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 130 do 234. Gore pomenuti varijabilni region ima CDRL1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 44 do 54 u SEQ ID NO: 39 u listi sekvenci, CDRL2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 70 do 76 u istoj, i CDRL3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 109 do 117 u istoj.
[0313] Pored toga, sekvence prikazane u SEQ ID NO: 38 i 39 prikazane su i na Slikama 34, odnosno 24.
7)-5 Molekularno modelovanje regiona varijacije c198D
[0314] Molekularno modelovanje varijabilnog regiona c198D antitela izvedeno je prema postupku koji je uopšteno poznat kao homologno modelovanje (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primarna skevenca varijabilnog regiona humanog imunoglobulina registrovanog u Proteinskoj banci podataka (Protein Data Bank, Nuc. Acid Res.28, 235-242 (2000)) (dostupna je trodimenzionalna struktura izvedena iz kristalne strukture dobijene rendgenografijom) upoređuje se sa varijabilnim regionom c198D antitela.
[0315] Trodimenzionalna struktura varijabilnog regiona proizvodi se tako što se međusobno kombinuju koordinate teškog lanca i lakog lanca c198D antitela i model koji ima visoku sekvencionu homologiju sa njihovim interfejsima, tako da se dobije "model okvira".
[0316] Posle toga, reprezentativna konformacija svakog CDR inkorporiše se u model okvira.
[0317] Na kraju, da bi se eliminisao kontakt atoma koji je energetski nepovoljan, izvodi se izračunavanje energetske minimizacije. Gore opisane procedure izvode se korišćenjem aplikacije Discovery Studio (Dassault Systemes).
7)-6 Dizajn aminokiselinske sekvence humanizovanog 198D
[0318] Humanizovano 198D antitelo konstruiše se prema postupku koji je uopšteno poznat kao CDR kalemljenje (Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 86, 10029-10033 (1989)). Akceptorsko antitelo se bira na bazi homologije amino-kiselina u regionu okvira.
[0319] Sekvenca regiona okvira c198D antitela upoređuje se sa regionom okvira konsenzusne sekvence humane podgrupe, određene po KABAT i sarad. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Kao rezultat, konsenzusna sekvenca humanog γ lanca podgrupe 2 i humanog κ lanca podgrupe 1 imaju visoku sekvencionu homologiju, i na osnovu toga one su odabrane za akceptora. Pored toga, nekoliko rezidua u konsenzusnoj sekvenci humanog γ lanca podgrupe 3 uvedeno je u akceptor teškog lanca.
[0320] U vezi sa konsenzusnom sekvencom humanog γ lanca podgrupe 2 koja sadrži deo konsenzusne sekvence humanog γ lanca podgrupe 3 i konsenzusnu sekvencu humanog κ lanca podgrupe 1, aminokiselinske rezidue u regionima okvira poravnavaju se sa aminokiselinskim reziduama c198D antitela, tako da se identifikuju pozicije na kojima su korišćene različite amino-kiseline. Pozicije ovih rezidua analiziraju se korišćenjem trodimenzionalnog modela c198D antitela konstruisanog u gornjem 7)-5, i donorske rezidue koje će se kalemiti na akceptor biraju se na osnovu kriterijuma koje su dali Queen i sarad. (Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 86, 10029-10033 (1989)).
[0321] Nekoliko tako odabranih donorskih rezidua uvodi se u akceptorsko antitelo tako da se konstruiše sekvenca humanizovanog h198D na način kao što je opisano u Primerima koji slede.
7)-7 Dizajn teškog lanca h198D-H humanizovanog 198D
7)-7-1 h198D-H3 tip teškog lanca
[0322] Teški lanac humanizovanog 198D dizajniran supstituisanjem glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 20 reziduom glutaminske kiseline, argininske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 24 valinskom reziduom, prolinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 28 glicinskom reziduom, glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 32 lizinskom reziduom, rezidue glutaminske kiseline na aminokiselinskoj poziciji 61 glicinskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 80 prolinskom reziduom, alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 81 serinskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 86 valinskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 87 treoninskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 95 asparaginskom reziduom, fenilalaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 98 serinskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 101 leucinskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 103 serinskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 104 valinskom reziduom, glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 105
1
treoninskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 106 alaninskom reziduom, rezidue glutaminske kiseline na aminokiselinskoj poziciji 107 alaninskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 111 valinskom reziduom, fenilalaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 113 tirozinskom reziduom, alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 133 treoninskom reziduom, i serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 134 leucinskom reziduom u teškom lancu c198D prikazanom u SEQ ID NO: 29 u listi sekvenci, nazvan je "h198D_H3 tip teškog lanca".
[0323] U nukleotidnoj sekvenci (SEQ ID NO: 40) koja kodira h198D-H3 tip teškog lanca, zreli teški lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca, kodiran je nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 1407, varijabilni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 417, i konstantni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 418 do 1407. Gore pomenuti varijabilni region ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 130 do 162 koja kodira CDRH1, nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 205 do 231 koja kodira CDRH2, i nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 349 do 384 koja kodira CDRH3, u SEQ ID NO: 40 u listi sekvenci.
[0324] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 41) h198D-H3 tipa teškog lanca, zreli teški lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 20 do 469, varijabilni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 20 do 139, i konstantni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 140 do 469.
[0325] Pored toga, sekvence prikazane u SEQ ID NO: 40 i 41 prikazane su i na Slikama 35, odnosno 25.
7)-8 Dizajn lakog lanca h198D-L humanizovanog 198D
7)-8-1 h198D-L4 tip lakog lanca
[0326] Laki lanac humanizovanog 198D dizajniran supstituisanjem alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 29 serinskom reziduom, glicinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 33 alaninskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 35 valinskom reziduom, rezidue glutaminske kiseline na aminokiselinskoj poziciji 37 reziduom asparaginske kiseline, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 38 argininskom reziduom,
2
glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 42 treoninskom reziduom, glutaminske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 65 lizinskom reziduom, glicinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 85 serinskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 92 treoninskom reziduom, lizinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 94 treoninskom reziduom, metioninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 98 leucinskom reziduom, treoninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 100 prolinskom reziduom, rezidue glutaminske kiseline na aminokiselinskoj poziciji 103 fenilalaninskom reziduom, glicinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 104 alaninskom reziduom, valinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 105 treoninskom reziduom, serinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 120 glutaminskom reziduom, leucinske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 124 valinskom reziduom, i alaninske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 129 treoninskom reziduom u lakom lancu c198D prikazanom u SEQ ID NO: 31 u listi sekvenci, nazvan je "h198D-L4 tip lakog lanca".
[0327] U nukleotidnoj sekvenci (SEQ ID NO: 42) koja kodira h198D-L4 tip lakog lanca, zreli laki lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca, kodiran je nukleoitdnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 702, varijabilni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 387, i konstantni region je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 388 do 702. Gore pomenuti varijabilni region ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 130 do 162 koja kodira CDRL1, nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 208 do 228 koja kodira CDRL2, i nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 325 do 351 koja kodira CDRL3, u SEQ ID NO: 42 u listi sekvenci.
[0328] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 43) h198D_L4 tipa lakog lanca, zreli laki lanac, iz kojeg je uklonjena signalna sekvenca je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234, varijabilni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129, i konstantni region je aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od amino-kiselina na aminokiselinskim pozicijama 130 do 234.
[0329] Pored toga, sekvence prikazane u SEQ ID NO: 42 i 43 prikazane su i na Slikama 36, odnosno 26.
7)-9 Konstruisanje ekspresionog vektora za humanizovano antitelo
7)-9-1 Konstruisanje ekspresionog vektora za humanizovano anti-humano GARP antitelo h151D-H1L1
[0330] Sintetiše se DNK fragment koji sadrži sekvencu koja kodira h151D-H1 tip teškog lanca, koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398 nukleotidne sekvence h151D-H1 tipa teškog lanca prikazane u SEQ ID NO: 32 u listi sekvenci (GENEART, servis za veštačku sintezu gena). Korišćenjem sintetisanog DNK fragmenta, prema protokolima Potelligent(R) CHOK1SV Technology, BioWa and Lonza, konstruiše se ekspresioni vektor za h151D-H1 tip teškog lanca. Konstruisani ekspresioni vektor nazvan je "GSV-h151D-H1".
[0331] Posle toga, sintetiše se DNK fragment koji sadrži sekvencu koja kodira h151D-L1 tip lakog lanca, koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 nukleotidne sekvence h151D-L1 tipa lakog lanca prikazane u SEQ ID NO: 36 u listi sekvenci (GENEART, servis za veštačku sintezu gena).
[0332] Korišćenjem sintetisanog DNK fragmenta, prema protokolima Potelligent(R) CHOK1SV Technology, BioWa and Lonza, konstruiše se ekspresioni vektor za h151D-L1 tip lakog lanca. Konstruisani ekspresioni vektor nazvan je "GSV-h151D-L1".
[0333] Posle toga, konstruiše se MACA-1511a ekspresioni vektor iz tako konstruisanih ekspresionih vektora "GSV-h151D-H1" i "GSV-h151D-L1" prema protokolima Potelligent(R) CHOK1SV Technology, BioWa and Lonza. Dobijeni ekspresioni vektor nazvan je "DGV-h151D-H1L1-GS".
7)-9-2 Konstruisanje ekspresionog vektora za humanizovano anti-humano GARP antitelo h151D-H4L4
[0334] Kao u slučaju Primera 7)-9-1, sintetišu se DNK fragment koji sadrži sekvencu koja kodira h151D-H4 tip teškog lanca, koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398 nukleotidne sekvence h151D-H4 tipa teškog lanca prikazane u SEQ ID NO: 34 u listi sekvenci, i DNK fragment koji sadrži sekvencu koja kodira h151D-L4 tip lakog lanca, koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 nukleotidne sekvence h151D-L4 tipa lakog lanca prikazane u SEQ ID NO: 38 u listi sekvenci (GENEART, servis za veštačku sintezu gena).
[0335] Korišćenjem sintetisanih DNK fragmenata, prema protokolima Potelligent(R) CHOK1SV Technology, BioWa and Lonza, konstruiše se MACA-1514a ekspresioni vektor. Dobijeni ekspresioni vektor nazvan je "DGV-h151D-H4L4-GS".
4
7)-9-3 Konstruisanje ekspresionog vektora za humanizovano anti-humano GARP antitelo h198D-H3L4
[0336] Kao u slučaju Primera 7)-9-1, sintetišu se DNK fragment koji sadrži sekvencu koja kodira h198D-H3 tip teškog lanca, koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 58 do 1407 nukleotidne sekvence h198D-H3 tipa teškog lanca prikazane u SEQ ID NO: 40 u listi sekvenci, i DNK fragment koji sadrži sekvencu koja kodira h198D-L4 tip lakog lanca, koja se sastoji od nukleotida na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 nukleotidne sekvence h198D-L4 tipa lakog lanca prikazane u SEQ ID NO: 42 u listi sekvenci (GENEART, servis za veštačku sintezu gena).
[0337] Korišćenjem sintetisanih DNK fragmenata, prema protokolima Potelligent(R) CHOK1SV Technology, BioWa and Lonza, konstruiše se MACA-1983a ekspresioni vektor. Dobijeni ekspresioni vektor nazvan je "DGV-h198D-H3L4-GS".
7)-10 Pripremanje humanizovanog antihumanog GARP antitela
7)-10-1 Proizvodnja ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo
7)-10-1-1 Proizvodnja ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H1L1
[0338] Potelligent CHOK1SV ćelije (BioWa and Lonza) transfektuju se ekspresionim vektorom za humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H1L1, DGV-h151D-H1L1-GS, koji je konstruisan u Primeru 7)-9-1 prema protokolima Potelligent(R) CHOK1SV Technology, BioWa and Lonza, tako da se konstruiše ćelijska linija koja proizvodi humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H1L1. Dobijena produkujuća ćelijska linija nazvana je "MAC1-1".
7)-10-1-2 Proizvodnja ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H4L4
[0339] Kao u Primeru 7)-10-1-1, Potelligent CHOK1SV ćelije (BioWa and Lonza) transfektuju se ekspresionim vektorom za humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H4L4, DGV-h151D-H4L4-GS, koji je konstruisan u Primeru 7)-9-2, tako da se konstruiše ćelijska linija koja proizvodi humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H4L4. Dobijena produkujuća ćelijska linija nazvana je "MAC2-1".
7)-10-1-3 Proizvodnja ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo h198D-H3L4
[0340] Kao u Primeru 7)-10-1-1, Potelligent CHOK1SV ćelije (BioWa and Lonza) transfektuju se ekspresionim vektorom za humanizovano antihumano GARP antitelo h198D-H3L4, DGV-h198D-H3L4-GS, koji je konstruisan u Primeru 7)-9-3, tako da se konstruiše ćelijska linija koja proizvodi humanizovano antihumano GARP antitelo h198D-H3L4. Dobijena produkujuća ćelijska linija nazvana je "MAC3-1".
7)-10-2 Kultura ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo
7)-10-2-1 Kultura ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H1L1
[0341] Ćelijska linija "MAC1-1" koja proizvodi humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H1L1, proizvedena u Primeru 7)-10-1-1, kultiviše se korišćenjem aparata za kulturu Wave reactor (GE Healthcare Japan). Produkujuća ćelijska linija "MAC1-1" odmrzne se u Dsp04B (JX Energy) medijumu i zatim kultiviše u Dsp04B (JX Energy) medijumu, na 120 opm, u inkubatoru (37°C, 5% CO2). Dobijeni rastvor kulture razblaži se C36 (JX Energy) medijumom, i zatim ekspanzivno kultiviše na 120 opm, u inkubatoru (37°C, 5% CO2).
[0342] Dobijeni rastvor kulture razblaži se C36 medijumom do 30 × 10<4>ćelija/mL, i zatim prenese u WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), posle čega sledi kultivisanje na 37°C, u prisustvu 5% CO2, pri stopi snabdevanja vazduhom od 0.3 L/min, pri stopi rotacije od 18-24 opm, pod uglom od 6-8°, u trajanju od 13 dana.
[0343] Od 3. dana posle inicijacije kulture, u kulturu se svakodnevno dodaje FM4Ae2 medijum (originalno pripremljen) u količini od 6% od inicijalne zapremine kulture. Dobijeni rastvor kulture grubo se filtrira kroz dubinski filter Millistak MC0HC054H1 (Merck Millipore), i zatim se filtrira kroz 0.22 µm-ski filter (Sartorius) pričvršćen za Flexboy Bags. Ovaj filtrat je nazvan "MACA-1511a supernatant kulture".
7)-10-2-2 Kultura ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H4L4
[0344] Na isti način kao što je onaj primenjen u Primeru 7)-10-2-1, ćelijska linija "MAC2-1" koja proizvodi humanizovano antihumano GARP antitelo h151D-H4L4, proizvedena u Primeru 7)-10-1-2, kultiviše se i ekspandira, i posle toga, ćelije se podvrgnu dolivnom postupku kultivisanja (fed-batch) uz korišćenje aparata za kultivisanje Wave reactor (GE Healthcare Japan). Dobijena kultura se razblaži C36 medijumom do 30 × 10<4>ćelija/mL, i zatim prenese u WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), posle čega sledi kultivisanje u trajanju od 13 dana. Dobijeni rastvor kulture se filtrira, i dobijeni filtrat je nazvan "MACA-1514a supernatant kulture".
7)-10-2-3 Kultura ćelija koje proizvode humanizovano antihumano GARP antitelo h198D-H3L4
[0345] Na isti način kao što je onaj primenjen u Primeru 7)-10-2-1, ćelijska linija "MAC3-1" koja proizvodi humanizovano antihumano GARP antitelo h198D-H3L4, proizvedena u Primeru 7)-10-1-3 kultiviše se i ekspandira, i posle toga, ćelije se podvrgnu dolivnom postupku kultivisanja uz korišćenje aparata za kultivisanje Wave reactor (GE Healthcare Japan). Dobijena kultura se razblaži C36 medijumom do 30 × 10<4>ćelija/mL, i zatim prenese u WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), posle čega sledi kultivisanje u trajanju od 13 dana. Dobijeni rastvor kulture se filtrira, i dobijeni filtrat je nazvan "MACA-1983a supernatant kulture".
7)-10-3 Prečišćavanje humanizovanog antihumanog GARP antitela
7)-10-3-1 Prečišćavanje humanizovanog antihumanog GARP antitela h151D-H1L1
[0346] "MACA-1511a supernatant kulture" dobijen u Primeru 7)-10-2-1 prečisti se u trostepenom procesu, konkretno, rProtein A afinitetnom hromatografijom, anjonskoizmenjivačkom hromatografijom, i katjonsko-izmenjivačkom hromatografijom.
[0347] Prvo, supernatant kulture se nanese na rProtein A afinitetnu hromatografsku smolu koja je bila ekvilibrisana pomoću PBS. Pošto ceo rastvor kulture uđe u kolonu, kolona se ispere pomoću PBS, pufera koji sadrži arginin, i PBS. Posle toga, preostala supstanca u koloni se eluira acetatnim puferom, i zatim se sakupi apsorpcioni pik na 280 nm. Sakupljeni rastvor se neutrališe Tris puferom, i zatim grubo filtrira kroz filter od staklenih vlakana AP20 (Merck Millipore). Rastvor se filtrira kroz Stericup-GV (Merck Millipore) koji je 0.22 µm-ski filter, i dobijeni filtrat se definiše kao pul (skup) prečišćen na rProteinu A.
[0348] Posle toga, pul prečišćen na rProteinu A nanese se na smolu za anjonsko-izmenjivačku hromatografiju koja je ekvilibrisana pomoću PBS. Pošto naneti rastvor u potpunosti uđe u kolonu, doda se PBS. Sakupe se propuštena frakcija i apsorpcioni pik na 280 nm u vreme dodavanja PBS. pH sakupljenog rastvora podesi se sirćetnom kiselinom, i rastvor se zatim grubo filtrira kroz filter od staklenih vlakana AP20 (Merck Millipore). Rastvor se filtrira kroz Stericup-GV (Merck Millipore) koji je 0.22 µm-ski filter, i dobijeni filtrat se definiše kao pul prečišćen pomoću AEX.
[0349] Posle toga, pul prečišćen pomoću AEX se nanese na smolu za katjonsko-izmenjivačku hromatografiju koja je ekvilibrisana pomoću acetatnog pufera. Pošto naneti rastvor u potpunosti uđe u kolonu, kolona se ispere acetatnim puferom. Posle toga, izvrši se eluiranje uz korišćenje acetatnog pufera koji sadrži visoku koncentraciju NaCl, i sakupi se apsorpcioni pik na 280 nm. Sakupljeni rastvor se grubo filtrira kroz filter od staklenih vlakana AP20 (Merck Millipore), i zatim se filtrira kroz Stericup-GV (Merck Millipore) koji je 0.22 µm-ski filter. Dobijeni filtrat se definiše kao pul prečišćen pomoću CEX.
[0350] Pul prečišćen pomoću CEX se koncentruje do koncentracije antitela od 25 mg/mL upotrebom Pellicon 3 kasete 30 kDa (Merck Millipore), i pufer se zatim zameni histidinskim puferom (25 mM histidin, 5% sorbitola, pH 6.0). Na kraju, rastvor se grubo filtrira kroz filter od staklenih vlakana AP20 (Merck Millipore), i zatim se filtrira kroz Stericup-GV (Merck Millipore) koji je 0.22 µm-ski filter, tako da se dobije prečišćeni uzorak. Ovaj prečišćeni uzorak nazvan je "h151D-H1L1".
7)-10-3-2 Prečišćavanje humanizovanog antihumanog GARP antitela h151D-H4L4
[0351] Na isti način kao što je onaj primenjen u Primeru 7)-10-3-1, "MACA-1514a supernatant kulture" dobijen u Primeru 7)-10-2-2 prečisti se u trostepenom procesu, tačnije, rProtein A afinitetnom hromatografijom, anjonsko-izmenjivačkom hromatografijom, i katjonskoizmenjivačkom hromatografijom. Prečišćeni uzorak nazvan je "h151D-H4L4".
7)-10-3-3 Prečišćavanje humanizovanog antihumanog GARP antitela h198D-H3L4
[0352] Na isti način kao što je onaj primenjen u Primeru 7)-10-3-1, "MACA-1983a supernatant kulture" dobijen u Primeru 7)-10-2-3 prečisti se u trostepenom procesu, tačnije, rProtein A afinitetnom hromatografijom, anjonsko-izmenjivačkom hromatografijom, i katjonskoizmenjivačkom hromatografijom. Prečišćeni uzorak je nazvan "h198D-H3L4".
7)-11 Evaluacija vezujuće aktivnosti humanizovanih antihumanih GARP antitela za humani GARP
[0353] Konstanta disocijacije između svakog od humanizovanih antihumanih GARP antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 proizvedenih u Primeru 7)-10 i GARP, evaluirana je korišćenjem Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience), po postupku zadržavanja koji uključuje zadržavanje antitela kao liganda na imobilisanom Proteinu A i zatim analiziranje konstante disocijacije korišćenjem antigena kao analita. HBS-EP+ (proizvođač GE Healthcare Bioscience) se koristi kao radni pufer, i Protein A senzorski čip (proizvođač GE Healthcare Bioscience) koristi se kao senzorski čip.
[0354] Humano himerno antitelo (1 µg/mL) dodaje se na čip pri stopi od 10 µL/min tokom 20 sekundi, i serijska razblaženja rastvora (8 do 128 nM) antigena dodaju se pri stopi protoka od 30 µl/min tokom 120 sekundi. Posle toga, disocijacija se prati tokom 480 sekundi. Kao rastvor za regeneraciju, dodaje se glicin 1.5 (proizvođač GE Healthcare Bioscience) pri stopi protoka od 20 µl/min, tokom 30 sekundi.
[0355] 1 : 1 model fitovanja koristi se u analizi podataka, i izračunavaju se konstanta stope asocijacije ka, konstanta stope disocijacije kd, i konstanta disocijacije (KD; KD = kd/ka).
[0356] Rezultati su prikazani u Tabeli 2.
Tabela 2 Konstanta disocijacije humanizovanih antihumanih GARP antitela
[0357]
[Tabela 2]
Primer 8: Vezivanje za ćelije koje eksprimiraju gen antigena
8)-1 Vezivanje za GARP
[0358] Prema postupku opisanom u Primeru 2, pripremi se suspenzija HEK-293T ćelija u koje je transfektovan ekspresioni vektor za humani GARP ili kontrolni vektor. h151D-H1L1, h151D-H4L4, h198D-H3L4, i kontrolni humani IgG (humani IgG: Eureka Therapeutics) dodaju se u suspenziju ćelija, i ćelije se inkubiraju na 4°C, 15 minuta.
[0359] Ćelije se dva puta isperu FACS puferom (PBS (Invitrogen) dopunjen 3% FBS), i posle toga se dodaju i suspenduju R-fikoeritrinom (PE)-obeleženo anti-IgG antitelo (Jackson ImmunoResearch Laboratories) i Horizon FVS450 (Becton Dickinson). Ćelije se inkubiraju na 4°C još 15 minuta. Protočno-citometrijska analiza izvodi se kako je opisano u Primeru 2, i konstruiše se histogram intenziteta PE fluorescencije (Slika 37).
[0360] Histogrami intenziteta fluorescencije za h151D-H1L1, h151D-H4L4, i h198D-H3L4 u HEK-293T ćelijama transfektovanim kontrolnim vektorom bili su slični histogramima za kontrolni IgG (na slici, ćelije su iznačene kao "Lažnim vektorom transfektovane HEK-293T").
[0361] Sa druge strane, potvrđeno je da se histogrami intenziteta fluorescencije za h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D_H3L4 pomeraju na stranu jakog intenziteta fluorescencije u HEK-293T ćelijama koje eksprimiraju GARP (koje su označene kao "hGARP-transfektovane HEK-293T" na slici) u poređenju sa histogramom za kontrolni humani IgG.
[0362] Na osnovu gore pomenutih rezultata utvrđeno je da se h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 specifično vezuju za GARP.
8)-2 Vezivanje za GARP-TGF β1
8)-2-1 Konstruisanje ekspresionog vektora za humani GARP mutant
[0363] Korišćenjem ekspresionog vektora za humani GARP (Origene) kao templata, kao i korišćenjem prajmera F (cacggcaacctgctggagcggctgctgggggagg) (SEQ ID NO: 44), prajmera R (caggctgttcccagacaggtccag) (SEQ ID NO: 45), i KOD-Plus-Mutagenesis kita (Toyobo), YSG na aminokiselinskim pozicijama 137-139 u aminokiselinskoj sekvenci humanog GARP (SEQ ID NO: 1) konvertuje se u HGN, tako da se konstruiše ekspresioni vektor za humani GARP mutant. Zatim se potvrdi nukleotidna sekvenca ovog vektora.
8)-2-2 Koekspresija GARP-TGF β1
[0364] Korišćenjem Lipofektamina 2000 (Invitrogen), HEK-293T ćelije se transfektuju ekspresionim vektorom za humani TGF β1 (Sino Biological), kao i ekspresionim vektorom za humani GARP ili ekspresionim vektorom za humani GARP mutant.
[0365] Ćelije se kultivišu u DMEM medijumu (Invitrogen) koji je dopunjen 10% FBS, preko noći, u prisustvu 5% CO2, na 37°C, i ćelije se zatim sakupe sa ploče tretiranjem pomoću TrypLE Express (Invitrogen). Sakupljene ćelije se isperu dva puta korišćenjem FACS pufera i resuspenduju u istom rastvoru.
[0366] Antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 u ovom pronalasku, poznata antitela (humana IgG1 anti-GARP antitela MHG8 i LHG10 proizvedena na osnovu informacija o sekvenci opisanih u Patentnoj literaturi 1), i kontrolni humani IgG (Eureka Therapeutics) dodaju se u ćelijsku suspenziju, i ćelije se inkubiraju na 4°C, 15 minuta.
[0367] Ćelije se isperu dva puta FACS puferom, i dodaju se i suspenduju PE-obeleženo anti-IgG antitelo (Jackson ImmunoResearch Laboratories) i Horizon FVS450 (Becton Dickinson). Ćelije se inkubiraju na 4°C još 15 minuta. Protočno-citometrijska analiza obavlja se kako je opisano u Primeru 2, i konstruišu se histogrami intenziteta PE fluorescencije (Slika 38).
[0368] Potvrđeno je da se histogrami za sva antitela pomeraju na stranu jakog intenziteta fluorescencije u HEK-293T ćelijama kotransfektovanim TGF β1 i GARP, u poređenju sa histogramima za kontrolni IgG (Slika 38).
[0369] Sa druge strane, histogrami za MHG8 i LHG10 nisu pomereni i slični su histogramima za kontrolni IgG u HEK-293T ćelijama kotransfektovanim TGF β1 i GARP mutantom, dok su histogrami za antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pomereni na stranu jakog intenziteta fluorescencije u ćelijama. Prema tome, pokazano je da se antitela MHG8 i LHG10 nisu vezala za GARP mutant, kako je opisano u [Nepatentnoj literaturi 12].
[0370] Na osnovu gore pomenutih rezultata utvrđeno je da se antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 vezuju i za GARP i za GARP mutant na ćelijama koje koeksprimiraju TGF β1, nađeno je da se ova antitela vezuju za regione različite od onih za koje se vezuju MHG8 i LHG10 antitela.
Primer 9: Vezivanje za ćelije koje endogeno eksprimiraju GARP
9)-1 Protočno-citometrijska analiza uz korišćenje L428 ćelija
[0371] L428 ćelije isperu se dva puta FACS puferom i suspenduju u istom rastvoru. Posle toga, u suspenziju se dodaju h151D-H1L1, h151D-H4L4, h198D_H3L4, i kontrolni humani IgG (humani IgG: Eureka Therapeutics) i ćelije se inkubiraju na 4°C, 15 minuta. Ćelije se operu dva puta FACS puferom, i doda se i suspenduje PE-obeleženo anti-IgG antitelo (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Ćelije se inkubiraju na 4°C, 15 minuta. Protočno-citometrijska analiza izvodi se kako je opisano Primeru 3, i konstruišu se histogrami intenziteta PE fluorescencije.
[0372] Kao rezultat, histogrami za antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D_H3L4 pomereni su ka strani jakog intenziteta fluorescencije u L428 ćelijama, u poređenju sa
1
histogramima za kontrolni IgG. Prema tome, potvrđeno je da se h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 vezuju za endogeno eksprimirani GARP (Slika 39).
9)-2 Protočno-citometrijska analiza uz korišćenje humanih Treg
[0373] Zamrznute humane PBMC (Cellular Technology) odmrznu se prema protokolima, i PBMC se zaseju u koncentraciji od 2 × 10<6>ćelija/mL u ploči sa 24 bunarčića (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) uz korišćenje RPMI1640 medijuma (Invitrogen) dopunjenog 10% FBS.
[0374] Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (magnetne perlice obložene antihumanim CD3/CD28 antitelima, za aktivaciju humanih T ćelija, Life technologies) dodaju se u ploču, i ćelije se kultivišu 48 sati. Posle toga, ćelije se suspenduju u FACS puferu, i dodaju se antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4, i kontrolni humani IgG (humani IgG: Eureka Therapeutics). APC-obeleženo anti-CD4 antitelo (Becton Dickinson) takođe se doda u suspenziju. Ćelije se inkubiraju na 4°C, 10 minuta.
[0375] Ćelije se isperu FACS puferom, i zatim se dodaju i suspenduju FITC-obeleženo anti-IgG antitelo (Jackson ImmunoResearch Laboratories) i Horizon FVS450 (Becton Dickinson). Ćelije se inkubiraju na 4°C, još 15 minuta.
[0376] Ćelije se ponovo isperu FACS puferom i resuspenduju u rastvoru, uz korišćenje puferskog seta za bojenje FoxP3 (FoxP3 Staining Buffer Set, Miltenyi Biotec). Posle toga, ćelijama se doda PE-obeleženo anti-Foxp3 antitelo (Miltenyi Biotec) i ćelije se inkubiraju na 4°C, 30 minuta.
[0377] Pošto se ćelije isperu, ćelije se mere korišćenjem protočnog citometra (FACS Canto II; Becton Dickinson). CD4-pozitivne ćelije analiziraju se korišćenjem FlowJo (Tree Star) posle uklanjanja mrtvih ćelija iz analize ograđivanjem ćelija obojenih sa Horizon FVS450.
[0378] Rezultati pokazuju da se antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 vezuju za FoxP3-pozitivne Treg (Slika 40).
Primer 10: Osobine anti-GARP antitela
10)-1 ADCC aktivnost
[0379] Antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4, poznata antitela (humana IgG1 anti-GARP antitela MHG8 i LHG10 proizvedena na osnovu informacija o sekvenci opisanih u Patentnoj literaturi 1), i kontrolni humani IgG (Eureka Therapeutics) analiziraju se u pogledu svoje ADCC aktivnosti prema postupcima opisanim u Primeru 4.
2
[0380] Antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 ispoljila su citolitičku aktivnost prema L428 ćelijama na način zavisan od koncentracije antitela (Slika 41A).
[0381] Nasuprot tome, kako je opisano u Primeru 4, MHG8 i LHG10 nisu pokazala takvu citolitičku aktivnost, isto kao što nije ni kontrolni humani IgG (Slika 41B).
[0382] Gore pomenutim rezultatima pokazano je da antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 imaju ADCC aktivnost.
10)-2 Inhibitorna aktivnost na funkciju Treg
[0383] Antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4, i h198D-H3L4 analizirana su u pogledu svoje inhibitorne aktivnosti na funkciju Treg prema postupku opisanom u Primeru 4. Inhibitorna aktivnost h151D-H1L1, h151D-H4L4, i h198D-H3L4 na funkciju Treg u finalnoj koncentraciji od 1 µg/mL prikazana je na Slici 42 (stopa inhibicije za h151D-H1L1: 81.5%; stopa inhibicije za h151D-H4L4: 80.4%; i stopa inhibicije za h198D-H3L4: 70.8%).
[0384] Pokazano je da antitela h151D-H1L1, h151D-H4L4, i h198D-H3L4 imaju inhibitornu aktivnost na funkciju Treg.
10)-3 Antitumorska aktivnost (in vitro)
10)-3-1 Pripremanje citotoksičnih T limfocita (CTL)
[0385] Prema protokolu Mie University, CTL ćelije koje imaju NY-ESO-1-specifičan T ćelijski receptor (MU28 CD8B35 klon #7: dobijene od Mie University) inkubiraju se pri 3 × 10<5>ćelija u boci od 25 cm<2>(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) u prisustvu anti-CD3 antitela (OKT3: Imgenex), IL-2 (Novartis), i ćelija-hraniteljica, u RPMI1640 medijumu (Invitrogen) koji je dopunjen 10% čovečjim AB serumom muškarca (Sigma), tokom 7 dana.
[0386] U vezi sa ćelijama-hraniteljicama, zamrznute humane PBMC (Cellular Technology) odmrznu se i CD8-pozitivne ćelije se uklone iz PBMC uz korišćenje CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotech) da se dobiju PBMC bez CD8 (7.5 × 10<6>ćelija/boci od 25 cm<2>) i ćelije se ozrače X-zracima. Pored toga, 103-LCL ćelije (dobijene od Riken BioResource Center) (1.5 × 10<6>ćelija/boci od 25 cm<2>) takođe se ozrače X-zracima korišćenjem ozračivača X-zracima (Hitachi Medical Corporation). Ove ćelije se koriste kao ćelije-hraniteljice.
[0387] Treg dobijene postupkom koji je opisan u Primeru 4)-2-1 dodaju se posle inicijacije kulture (1.5 × 10<5>ćelija/boci od 25 cm<2>) da bi se evaluirao supresivni efekat Treg na ćelijsku aktivnost CTL. Pored toga, Treg (7.5 × 10<4>ćelija/boci od 25 cm<2>) dobijene gore pomenutim postupkom i antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, h198D-H3L4 i humani IgG1 (Enzo) dodaju se posle inicijacije kulture (10 µg/ml) da bi se evaluirala antitumorska aktivnost svakog od antitela.
[0388] Posle završetka kulture, CD8-pozitivne ćelije se prečiste i izdvoje da bi se pripremile CTL ćelije, uz korišćenje kita za izolaciju CD8<+>T ćelija (Miltenyi Biotech). Posle toga, pripremljene CTL ćelije koriste se za evaluaciju aktivnosti.
10)-3-2 Pripremanje ciljnih ćelija
[0389] Ćelijska linija humanog melanoma, tačnije ćelije SK-MEL-52 koje eksprimiraju NY-ESO-1 (dobijene sa Mie University: Proc Natl Acad Sci U S A. 1980. jul; 77(7): 4260-4) kultivišu se uz korišćenje RPMI1640 medijuma (Invitrogen) sa dodatkom 10% FBS. Izvršeno je obeležavanje ćelija kako je opisano u Primeru 4)-1-2, i ćelije su podešene na 2 × 10<4>ćelija/mL. Dobijene ćelije su definisane kao ciljne ćelije.
10)-3-3 Test oslobađanja<51>Cr
[0390] Ciljne ćelije se dispenduju u mikroploči sa 96 bunarčića sa U-dnom (Costar) (50 µL/bunarčiću).
[0391] Posle toga, CTL ćelije se dodaju u ploču (100 µL/bunarčiću), tako da broj ćelija bude 16, 8, 4, ili 2 puta veći nego broj ciljnih ćelija (CTL ćelije : ciljne ćelije = 16 : 1, 8 : 1, 4 : 1, ili 2 : 1), i ćelije se inkubiraju u prisustvu 5% CO2, na 37°C, 4 sata. Posle toga, ćelije se obrade prema postupku opisanom u Primeru 4)-1-3. Treba napomenuti da se inhibitorna aktivnost uzorka izračunava svaki put u svakom eksperimentu. Pored toga, potvrđeno je da CTL ćelije ne ispoljavaju citolitičku aktivnost prema ćelijama koje ne eksprimiraju NY-ESO-1.
[0392] Rezultati merenja prikazani su na Slikama 43 i 44.
[0393] Treg suprimirale su citolitičku aktivnost CTL ćelija prema SK-MEL-52 (Slika 43).
[0394] Sa druge strane, stope ćelijske lize SK-MEL-52 ćelija CTL ćelijama povišavaju se sa povećanjem broja CTL ćelija, za CTL ćelije kojima su dodata antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, ili h198D-H3L4, i takođe, stope ćelijske lize jasno su više nego one kod kontrolnih CTL ćelija kojima je dodat kontrolni IgG (Slika 44), i to pri svakom odnosu cilja prema efektoru.
[0395] Prema tome, pokazano je da antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 inhibiraju supresivnu aktivnost Treg prema CTL ćelijama, i pojačavaju antitumorsku aktivnost.
4
10)-4 Antitumorska aktivnost (in vivo)
[0396] Poznato je da se antitumorski efekti himernog antitela koje ima ADCC aktivnost mogu evaluirati u NOD/Shi-scid, IL-2R<null>(NOG) miševima u koje se transplantiraju L428 ćelije i kod kojih se primene humane PBMC (J Immunol.2009 Oct 1; 183(7): 4782-91).
[0397] L428 ćelije (DSMZ), koje su suspendovane u kombinovanom rastvoru RPMI1640 medijuma (Invitrogen) i Matrigel (Becton Dickinson) (1 : 1) u koncentraciji od 1 × 10<7>ćelija/mL, transplantiraju se u zapremini od 0.1 mL u potkožno tkivo aksilarnog regiona NOG miševa (ženke, In vivo science). Dan kada se L428 ćelije transplantirane definisan je kao Dan 0. Na Dan 6, miševi se raspodele u grupe na osnovu veličine tumora (n = 6 u svakoj grupi), i postave se sledeće grupe tretmana.
[0398]
PBS kontrola 1: primenjuje se na Dane 6, 10, 14, 18, 22 i 26, i takođe primenjuju se humane PBMC (lot: 20140707) na Dane 6, 14 i 22
105F antitelo: primenjuje se u dozi od 5 mg/kg na Dane 6, 10, 14, 18, 22 i 26, i takođe primenjuju se humane PBMC (lot: 20140707) na Dane 6, 14 i 22
PBS kontrola 2: primenjuje se na Dane 6, 10, 14, 18, 22, i takođe primenjuju se humane PBMC (lot: 20150924) na Dane 6, 14 i 22
h151D-H1L1 antitelo: primenjuje se u dozi od 1 mg/kg na Dane 6, 10, 14, 18 i 22, i takođe primenjuju se humane PBMC (lot: 20150924) na Dane 6, 14 i 22
h151D-H4L4 antitelo: primenjuje se u dozi od 1 mg/kg na Dane 0, 6, 10, 14, 18 i 22, i takođe primenjuju se humane PBMC (lot: 20150924) na Dane 6, 14 i 22
h198D-H3L4 antitelo: primenjuje se u dozi od 1 mg/kg na Dane 0, 6, 10, 14, 18 i 22, i takođe primenjuju se humane PBMC (lot: 20150924) na Dane 6, 14 i 22
[0399] Svako antitelo razblaži se pomoću PBS (Invitrogen) i administrira se miševima preko repne vene (10 mL/kg).
[0400] U vezi sa humanim PBMC, zamrznute humane PBMC (Cellular Technology) odmrznu se prema protokolima i pripreme u koncentraciji od 1 × 10<7>ćelija/mL. Pripremljene ćelije (0.2 mL) administriraju se miševima preko repne vene.
[0401] Duži dijametar (mm) i kraći dijametar (mm) tumora mere se tokom vremena, pomoću digitalnog elektronskog pomičnog kljunastog merila (Mitutoyo), i zatim se izračunava zapremina tumora prema sledećem izrazu.
[0402] Promena srednje vrednosti ± standardna greška (SE) zapremina tumora u svakoj grupi prikazana je na Slici 45.
[0403] Antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pokazala su antitumorsku aktivnost prema L428 ćelijama u poređenju sa kontrolnom grupom kod koje su primenjene samo PBMC. Prema tome, zapažena je značajna razlika u odnosu na kontrolnu grupu (105F: ttest; i h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4: Dunnett-ov test višestrukog poređenja). Rezultati testa značajnosti razlika (P vrednosti) poslednjeg dana merenja za pojedinačne grupe (105F: Dan 31; i h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4: Dan 25) takođe su prikazani na slici.
[0404] Prema tome, antitela 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 i h198D-H3L4 pokazala su antitumorsku aktivnost u modelima in vivo.
Primer 11: Analiza epitopa za anti-GARP antitela
[0405] Epitopi za antihumana GARP antitela (105F, 110F, h151D-H1L1, i h198D-H3L4) analizirani su masenom spektrometrijom zasnovanom na razmeni vodonika i deuterijuma.
[0406] 7 mg/mL antihumanog GARP antitela pomeša se sa 3 mg/mL humanog GARP (R&D Systems) ili čistim puferom u jednakim količinama. Dobijenom rastvoru doda se 9 ekvivalenata lake vode ili teške vode. Trideset sekundi, 480 sekundi, ili 6000 sekundi posle dodavanja vode, ili pošto prođe jedna noć, u uzorak se dodaju u jednakim količinama 100 mM fosforna kiselina, 4 M Gdn-HCl i 150 mM TCEP (pH 2.5), tako da se dobijena smeša izloži deuterijumskoj supstituciji. Takav deuterijumom supstituisani uzorak injektira se u HPLC u uslovima hlađenja, i zatim nanese na kolonu sa imobilisanim pepsinom, sa 0.1% rastvorom TFA.
[0407] Peptidni fragment dobijen digestijom humanog GARP u koloni sa pepsinom zadržava se u C18-koncentratorskoj koloni, zatim se eluira linearnim gradijentom vode i acetonitrila uz dodavanje 0.1% mravlje kiseline i 0.025% TFA i zatim se izvrši razdvajanje u C18 analitičkoj koloni. Izdvojeni peptidni fragment podvrgne se masenoj spektrometriji uz korišćenje masenog spektrometra vremena preleta (time-of-flight mass spectrometer).
[0408] Stopa deuterijumske supstitucije izračunava se iz mase svakog peptida. Peptidni fragment u kojem se zapaža značajno smanjenje stope deuterijumske supstitucije kao rezultat dodavanja antihumanog GARP antitela, identifikuje se kao epitopski fragment.
[0409] U slučaju 105F, supresija stope deuterijumske supstitucije utvrđena je na aminokiselinskim reziduama na pozicijama 366-377, 407-445, i 456-470 humanog GARP prikazanog u SEQ ID NO: 1 i, prema tome, one su identifikovane kao epitopi.
[0410] U slučaju 110F, supresija stope deuterijumske supstitucije utvrđena je na aminokiselinskim reziduama na pozicijama 54-112 i 366-392 humanog GARP prikazanog u SEQ ID NO: 1 i, prema tome, one su identifikovane kao epitopi.
[0411] U slučaju h151D-H1L1, supresija stope deuterijumske supstitucije utvrđena je na aminokiselinskim reziduama na pozicijama 352-392 humanog GARP prikazanog u SEQ ID NO: 1, i prema tome, one su identifikovane kao epitop.
[0412] U slučaju h198D-H3L4, supresija stope deuterijumske supstitucije utvrđena je na aminokiselinskim reziduama na pozicijama 18-112 humanog GARP prikazanog u SEQ ID NO: 1 i, prema tome, one su identifikovane kao epitop.
Industrijska primenljivost
[0413] Anti-GARP antitelo ovog pronalaska ima antitumorsku aktivnost koja je rezultat inhibitornog dejstva na funkciju Treg, koja je posredovana ADCC aktivnošću, i prema tome, farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-GARP antitelo može se koristiti kao antikancersko sredstvo.
[0414] Pored toga, prekomerno prisustvo Treg i njihova aktivacija kod pacijenata koji imaju malariju i HIV infekciju, u korelaciji je sa bolesnim stanjem, i uklanjanje Treg indukuje remisiju ovih bolesti u mišjim modelima. Prema tome, može se očekivati da efikasna inhibicija funkcije Treg ima terapijske efekte i na refraktorne infekcije kao što su malarija i HIV.
Slobodan tekst liste sekvenci
[0415]
SEQ ID NO: 1 - Aminokiselinska sekvenca GARP
SEQ ID NO: 2 - Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 105F antitela
SEQ ID NO: 3 - Aminokiselinska sekvenca lakog lanca 105F antitela
SEQ ID NO: 4 - Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 110F antitela
SEQ ID NO: 5 - Aminokiselinska sekvenca lakog lanca 110F antitela
SEQ ID NO: 6 - Nukleotidna sekvenca teškog lanca 105F antitela
SEQ ID NO: 7 - Nukleotidna sekvenca lakog lanca 105F antitela
SEQ ID NO: 8 - Nukleotidna sekvenca teškog lanca 110F antitela
SEQ ID NO: 9 - Nukleotidna sekvenca lakog lanca 110F antibody
SEQ ID NO: 10 - Prajmer A
SEQ ID NO: 11 - Prajmer B
SEQ ID NO: 12 - Prajmer C
SEQ ID NO: 13 - Prajmer D
SEQ ID NO: 14 - Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca 151D
SEQ ID NO: 15 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 151D SEQ ID NO: 16 - Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca 151D
SEQ ID NO: 17 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 151D
SEQ ID NO: 18 - Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca 198D
SEQ ID NO: 19 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 198D SEQ ID NO: 20 - Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca 198D
SEQ ID NO: 21 - Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 198D
SEQ ID NO: 22 - Nukleotidna sekvenca DNK fragmenta koja sadrži signalnu sekvencu humanog lakog lanca i sekvencu koja kodira amino-kiseline u konstantnom regionu humanog κ lanca
SEQ ID NO: 23 - Nukleotidna sekvenca DNK fragmenta koja sadrži signalnu sekvencu humanog teškog lanca i sekvencu koja kodira amino-kiseline u konstantnom regionu humanog IgG1
SEQ ID NO: 24 - Nukleotidna sekvenca teškog lanca humanog himernog antitela c151D SEQ ID NO: 25 - Aminokiselinska sekvenca teškog lanca humanog himernog antitela c151D
SEQ ID NO: 26 - Nukleotidna sekvenca lakog lanca humanog himernog antitela c151D SEQ ID NO: 27 - Aminokiselinska sekvenca lakog lanca humanog himernog antitela c151D
SEQ ID NO: 28 - Nukleotidna sekvenca teškog lanca humanog himernog antitela c198D SEQ ID NO: 29 - Aminokiselinska sekvenca teškog lanca humanog himernog antitela c198D
SEQ ID NO: 30 - Nukleotidna sekvenca lakog lanca humanog himernog antitela c198D SEQ ID NO: 31 - Aminokiselinska sekvenca lakog lanca humanog himernog antitela c198D
SEQ ID NO: 32 - Nukleotidna sekvenca h151D-H1 humanizovanog antitela
SEQ ID NO: 33 - Aminokiselinska sekvenca h151D-H1 humanizovanog antitela SEQ ID NO: 34 - Nukleotidna sekvenca h151D-H4 humanizovanog antitela
SEQ ID NO: 35 - Aminokiselinska sekvenca h151D-H4 humanizovanog antitela SEQ ID NO: 36 - Nukleotidna sekvenca h151D-L1 humanizovanog antitela
SEQ ID NO: 37 - Aminokiselinska sekvenca h151D-L1 humanizovanog antitela SEQ ID NO: 38 - Nukleotidna sekvenca h151D-L4 humanizovanog antitela
SEQ ID NO: 39 - Aminokiselinska sekvenca h151D-L4 humanizovanog antitela SEQ ID NO: 40 - Nukleotidna sekvenca h198D-H3 humanizovanog antitela
SEQ ID NO: 41 - Aminokiselinska sekvenca h198D-H3 humanizovanog antitela SEQ ID NO: 42 - Nukleotidna sekvenca h198D-L4 humanizovanog antitela
SEQ ID NO: 43 - Aminokiselinska sekvenca h198D-L4 humanizovanog antitela SEQ ID NO: 44 - Prajmer F
SEQ ID NO: 45 - Prajmer R

Claims (25)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje ima sledeća svojstva:
(1) specifično se vezuje za glikoprotein-A sa preovlađujućim ponovcima (GARP);
(2) poseduje aktivnost inhibiranja imunosupresivne funkcije regulatornih T ćelija;
(3) poseduje aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC); i (4) poseduje in vivo antitumorsku aktivnost,
koje ima:
(a) varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 33, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 37;
(b) varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 35, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 39; ili (c) varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 139 prikazane u SEQ ID NO: 41, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 43.
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 33, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 37.
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 136 prikazane u SEQ ID NO: 35, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 39.
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 20 do 139 prikazane u SEQ ID NO: 41, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 21 do 129 prikazane u SEQ ID NO: 43.
5. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu je tumor kancer.
6. Antitelo prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je kancer - kancer pluća, kancer bubrega, kancer urotela, kancer kolona, kancer prostate, multiformni glioblastom, kancer ovarijuma, kancer pankreasa, kancer dojke, melanom, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer želuca, kancer jednjaka, ili kancer krvi.
7. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, koje ima:
(1) teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 33, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 37,
(2) teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 35, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 39, ili
(3) teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 469 prikazanu u SEQ ID NO: 41, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 43.
8. Antitelo prema patentnom zahtevu 7, koje ima:
teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 33, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 37.
9. Antitelo prema patentnom zahtevu 7, koje ima:
1
teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 466 prikazanu u SEQ ID NO: 35, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 39.
10. Antitelo prema patentnom zahtevu 7, koje ima:
teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 20 do 469 prikazanu u SEQ ID NO: 41, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu na aminokiselinskim pozicijama 21 do 234 prikazanu u SEQ ID NO: 43.
11. Polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 10.
12. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 11, koji ima:
(1) polinukleotid varijabilnog regiona teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 408 prikazane u SEQ ID NO: 32, i polinukleotid varijabilnog regiona lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 prikazane u SEQ ID NO: 36, (2) polinukleotid varijabilnog regiona teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 408 prikazane u SEQ ID NO: 34, i polinukleotid varijabilnog regiona lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 prikazane u SEQ ID NO: 38, ili (3) polinukleotid varijabilnog regiona teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 417 prikazane u SEQ ID NO: 40, i polinukleotid varijabilnog regiona lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 387 prikazane u SEQ ID NO: 42.
13. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 11 ili patentnom zahtevu 12, koji ima:
(1) polinukleotid teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398 prikazane u SEQ ID NO: 32, i polinukleotid lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 prikazane u SEQ ID NO: 36,
(2) polinukleotid teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 1398 prikazane u SEQ ID NO: 34, i polinukleotid lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 prikazane u SEQ ID NO: 38, ili
2
(3) polinukleotid teškog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 58 do 1407 prikazane u SEQ ID NO: 40, i polinukleotid lakog lanca koji se sastoji od nukleotidne sekvence na nukleotidnim pozicijama 61 do 702 prikazane u SEQ ID NO: 42.
14. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema bilo kojem od patentnih zahteva 11 do 13.
15. Ćelija-domaćin transformisana ekspresionim vektorom prema patentnom zahtevu 14.
16. Postupak za proizvodnju antitela od interesa ili njegovog fragmenta, koji uključuje korak kultivisanja ćelija-domaćina prema patentnom zahtevu 15, i korak sakupljanja antitela od interesa iz kulture dobijene gore pomenutim korakom.
17. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 10, koje sadrži jednu ili dve ili više modifikacija odabranih iz grupe koja se sastoji od N-glikozilacije, O-glikozilacije, obrade N-terminusa, obrade C-terminusa, deamidacije, izomerizacije asparaginske kiseline, oksidacije metionina, adicije metioninske rezidue na N-terminus, amidacije prolinske rezidue, i teškog lanca koji sadrži deleciju jedne ili dve amino-kiseline na karboksil terminusu.
18. Antitelo prema patentnom zahtevu 17, pri čemu su jedna ili dve amino-kiseline deletirane na karboksil terminusu teškog lanca istog.
19. Antitelo prema patentnom zahtevu 18, pri čemu je jedna amino-kiselina deletirana na svakom od karboksil terminusa oba teška lanca istog.
20. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 17 do 19, pri čemu je prolinska rezidua na karboksil terminusu teškog lanca istog dodatno amidovana.
21. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 10, i 17 do 20, pri čemu je modifikacija šećernog lanca regulisana u cilju pojačanja ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela.
22. Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno od antitela prema patentnim zahtevima 1 do 10 i 17 do 21.
23. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 22, koja je za upotrebu u lečenju tumora.
24. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, pri čemu je tumor kancer.
25. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, pri čemu je kancer - kancer pluća, kancer bubrega, kancer urotela, kancer kolona, kancer prostate, multiformni glioblastom, kancer ovarijuma, kancer pankreasa, kancer dojke, melanom, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer želuca, kancer jednjaka, ili kancer krvi.
4
RS20240428A 2015-09-24 2016-09-23 Anti-garp antitelo RS65415B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015187488 2015-09-24
EP16848676.9A EP3354729B1 (en) 2015-09-24 2016-09-23 Anti-garp antibody
PCT/JP2016/078067 WO2017051888A1 (ja) 2015-09-24 2016-09-23 抗ｇａｒｐ抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65415B1 true RS65415B1 (sr) 2024-05-31

Family

ID=58386752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240428A RS65415B1 (sr) 2015-09-24 2016-09-23 Anti-garp antitelo

Country Status (28)

Country Link
US (4) US11046780B2 (sr)
EP (3) EP3660051A1 (sr)
JP (5) JP6878283B2 (sr)
KR (2) KR102776730B1 (sr)
CN (3) CN110922481A (sr)
AU (3) AU2016325858B2 (sr)
BR (1) BR112018005777A2 (sr)
CA (1) CA2999819A1 (sr)
CO (1) CO2018003542A2 (sr)
DK (1) DK3354729T5 (sr)
ES (1) ES2978126T3 (sr)
FI (1) FI3354729T3 (sr)
HR (1) HRP20240495T1 (sr)
HU (1) HUE066594T2 (sr)
IL (3) IL288784B2 (sr)
LT (1) LT3354729T (sr)
MX (2) MX2018003594A (sr)
MY (1) MY194586A (sr)
PH (1) PH12018500642A1 (sr)
PL (1) PL3354729T3 (sr)
PT (1) PT3354729T (sr)
RS (1) RS65415B1 (sr)
RU (2) RU2769379C2 (sr)
SG (2) SG11201802352VA (sr)
SI (1) SI3354729T1 (sr)
SM (1) SMT202400160T1 (sr)
TW (2) TWI836305B (sr)
WO (1) WO2017051888A1 (sr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3786187A1 (en) 2013-08-01 2021-03-03 Université catholique de Louvain Antibody binding a complex of human glycoprotein a repetitions predominant (garp) and latent tgf-beta-1
BR112017024899A2 (pt) 2015-05-21 2018-11-13 Harpoon Therapeutics, Inc. proteínas de ligação trispecíficas e métodos de uso.
TWI836305B (zh) 2015-09-24 2024-03-21 日商第一三共股份有限公司 抗ｇａｒｐ抗體及其製造方法及用途
CN109195990A (zh) * 2016-03-30 2019-01-11 Musc研究发展基金会 通过靶向糖蛋白a重复优势蛋白(garp)治疗和诊断癌症以及单独或联合提供有效免疫疗法的方法
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
JP7101621B2 (ja) 2016-05-20 2022-07-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質
SG11201810509PA (en) 2016-06-20 2018-12-28 Kymab Ltd Anti-pd-l1 antibodies
GB201707561D0 (en) 2017-05-11 2017-06-28 Argenx Bvba GARP-TGF-beta antibodies
CA3063359A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
KR102425983B1 (ko) 2017-10-13 2022-07-29 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이적 단백질 및 사용 방법
WO2019118513A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. Anti-trem2 antibodies and related methods
CN112204143B (zh) * 2018-05-31 2024-03-08 第一三共株式会社 抗人tlr7抗体
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
EP3856771A4 (en) 2018-09-25 2022-06-29 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
KR20220088425A (ko) 2019-10-25 2022-06-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 garp 항체와 면역 조절제의 조합
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
US20250262293A1 (en) 2020-07-07 2025-08-21 BioNTech SE Therapeutic rna for hpv-positive cancer
CN116723861A (zh) * 2020-12-02 2023-09-08 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗GARP/TGFβ抗体及使用方法
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
CA3204628A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 John T. POIRIER Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CN117425500A (zh) 2021-01-13 2024-01-19 纪念斯隆凯特琳癌症中心 抗dll3抗体-药物缀合物
TW202241955A (zh) * 2021-01-18 2022-11-01 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司 Ｇａｒｐ蛋白抗體及其應用
CA3225254A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
EP4558823A1 (en) 2022-07-22 2025-05-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Garp as a biomarker and biotarget in t-cell malignancies
IL321098A (en) 2022-12-14 2025-07-01 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy including bispecific binding agents that bind to CLDN18.2- and CD3- and immune checkpoint inhibitors
AU2024252640A1 (en) 2023-04-07 2025-10-02 Diagonal Therapeutics Inc. Bispecific agonistic antibodies to activin a receptor like type 1 (alk1)
WO2025120866A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
TW202541837A (zh) 2023-12-08 2025-11-01 日商安斯泰來製藥公司 含有結合至cldn18.2和cd3之雙特異性結合劑和穩定或增加cldn18.2表現之藥劑之組合療法
WO2025120867A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and anti-vegfr2 antibodies

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
CA2177367A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Andrew David Griffiths Recombinant binding proteins and peptides
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
CA2326389C (en) 1998-04-21 2007-01-23 Micromet Gesellschaft Fur Biomedizinische Forschung Mbh Novel cd19xcd3 specific polypeptides and uses thereof
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
CN1333274A (zh) * 2000-07-07 2002-01-30 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人garp蛋白12.98和编码这种多肽的多核苷酸
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
MXPA04004184A (es) 2001-11-01 2005-01-25 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos selectivos para un receptor de ligando que induce apoptosis relacionada al factor de necrosis tumoral y otros agentes terapeuticos.
DK1583830T3 (da) 2003-01-07 2007-01-15 Symphogen As Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante polyklonale proteiner
WO2006089678A2 (en) 2005-02-22 2006-08-31 Bioinvent International Ab Antibodies and peptides binding to hiv tat, and uses thereof
WO2006103639A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Case Western Reserve University Methods and reagents for identifying/isolating t regulatory (treg) cells and for treating individuals
EP2001509A1 (en) 2006-04-03 2008-12-17 Medizinische Hochschule Hannover Pharmaceuticals for influencing the reaction of the human immune system
CN101679519A (zh) 2006-12-22 2010-03-24 先灵公司 Cd200r的抗体
CA2711806A1 (en) 2008-01-11 2009-07-16 Morphosys Ag Display vectors and methods and uses thereof
US8114968B2 (en) 2008-03-03 2012-02-14 Dyax Corp. Metalloproteinase-12 specific monoclonal antibody
US20100260668A1 (en) 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
JP5593488B2 (ja) 2008-11-17 2014-09-24 独立行政法人国立がん研究センター 癌間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性化合物との複合体による新規の癌ターゲティング治療
TWI480050B (zh) 2009-02-10 2015-04-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 抗－ｍｓｔ１ｒ抗體及其用途
KR20120035145A (ko) 2009-05-11 2012-04-13 우드라이 파마 게엠베하 인간화 ａｘｌ 항체
AU2011232435B2 (en) 2010-03-23 2016-01-28 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
EP3020812B1 (en) 2010-10-29 2018-05-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel anti-dr5 antibody
US8440797B2 (en) 2010-12-06 2013-05-14 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Human monoclonal antibody
RS57279B1 (sr) * 2011-04-25 2018-08-31 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-b7-h3 antitelo
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
BR112014024267A8 (pt) 2012-03-30 2017-07-25 Daiichi Sankyo Co Ltd anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo, composição farmacêutica, usos de pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno e de uma composição, polinucleotídeo, vetor, e, célula hospedeira transformada
CA2870126C (en) 2012-04-09 2020-10-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-fgfr2 antibody
JP2014141434A (ja) * 2013-01-24 2014-08-07 Daiichi Sankyo Co Ltd 抗ｒｏｂｏ４抗体
DK2841457T3 (da) 2012-04-27 2019-07-22 Daiichi Sankyo Co Ltd Antistof imod ROBO4
CN104619722B (zh) * 2012-06-22 2022-10-04 达特茅斯大学理事会 新型vista-ig构建体和vista-ig用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途
WO2014061277A1 (ja) 2012-10-19 2014-04-24 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体－薬物コンジュゲート
SG11201503271XA (en) * 2012-11-06 2015-05-28 Scholar Rock Inc Compositions and methods for modulating cell signaling
EP2832747A1 (en) * 2013-08-01 2015-02-04 Université Catholique de Louvain Anti-GARP protein and uses thereof
EP3786187A1 (en) * 2013-08-01 2021-03-03 Université catholique de Louvain Antibody binding a complex of human glycoprotein a repetitions predominant (garp) and latent tgf-beta-1
EP3253796A1 (en) 2015-02-03 2017-12-13 Université Catholique de Louvain Anti-garp protein and uses thereof
TWI836305B (zh) * 2015-09-24 2024-03-21 日商第一三共股份有限公司 抗ｇａｒｐ抗體及其製造方法及用途
CN109195990A (zh) * 2016-03-30 2019-01-11 Musc研究发展基金会 通过靶向糖蛋白a重复优势蛋白(garp)治疗和诊断癌症以及单独或联合提供有效免疫疗法的方法

Also Published As

Publication number Publication date
NZ780546A (en) 2025-05-30
JP2025036561A (ja) 2025-03-14
IL258322A (en) 2018-05-31
CN108026521A (zh) 2018-05-11
CN110922481A (zh) 2020-03-27
CN115869398A (zh) 2023-03-31
RU2018114904A (ru) 2019-10-24
EP3354729B1 (en) 2024-02-14
US10550198B2 (en) 2020-02-04
US20180258184A1 (en) 2018-09-13
IL288784A (en) 2022-02-01
WO2017051888A1 (ja) 2017-03-30
JP6868739B2 (ja) 2021-05-12
DK3354729T3 (da) 2024-04-22
US11046780B2 (en) 2021-06-29
IL288784B2 (en) 2023-10-01
EP3660051A1 (en) 2020-06-03
PH12018500642A1 (en) 2018-09-24
JP7137657B2 (ja) 2022-09-14
US20240360245A1 (en) 2024-10-31
US12006372B2 (en) 2024-06-11
PT3354729T (pt) 2024-04-11
AU2022231706A1 (en) 2022-10-06
TW202438526A (zh) 2024-10-01
EP4349997A3 (en) 2024-07-10
CN108026521B (zh) 2022-12-06
HK1254310A1 (en) 2019-07-19
ES2978126T3 (es) 2024-09-05
CO2018003542A2 (es) 2018-07-10
TW201718643A (zh) 2017-06-01
SG10201912570UA (en) 2020-02-27
RU2769379C2 (ru) 2022-03-30
JP2021106617A (ja) 2021-07-29
JP6878283B2 (ja) 2021-05-26
RU2022108079A (ru) 2022-04-08
AU2016325858B2 (en) 2022-05-26
TWI836305B (zh) 2024-03-21
IL258322B2 (en) 2023-10-01
LT3354729T (lt) 2024-04-25
KR102776730B1 (ko) 2025-03-05
PL3354729T3 (pl) 2024-05-20
AU2022231706B2 (en) 2025-05-15
US20220010026A1 (en) 2022-01-13
IL258322B1 (en) 2023-06-01
JP2022169801A (ja) 2022-11-09
MX2018003594A (es) 2018-06-15
EP3354729A1 (en) 2018-08-01
US20180327511A1 (en) 2018-11-15
KR20180053316A (ko) 2018-05-21
NZ741033A (en) 2025-05-30
MX2023003470A (es) 2023-04-19
TWI751979B (zh) 2022-01-11
JP2020202875A (ja) 2020-12-24
RU2018114904A3 (sr) 2020-03-03
TW202227501A (zh) 2022-07-16
SMT202400160T1 (it) 2024-05-14
KR20250037587A (ko) 2025-03-17
DK3354729T5 (da) 2024-09-30
FI3354729T3 (fi) 2024-04-23
JPWO2017051888A1 (ja) 2018-07-12
AU2016325858A1 (en) 2018-04-19
EP3354729A4 (en) 2019-06-12
AU2020200866A1 (en) 2020-02-27
IL288784B1 (en) 2023-06-01
SG11201802352VA (en) 2018-04-27
SI3354729T1 (sl) 2024-05-31
CA2999819A1 (en) 2017-03-30
CN115869398B (zh) 2025-04-22
AU2020200866B2 (en) 2022-06-16
BR112018005777A2 (pt) 2018-10-09
HRP20240495T1 (hr) 2024-07-05
MY194586A (en) 2022-12-05
EP4349997A2 (en) 2024-04-10
HUE066594T2 (hu) 2024-08-28
IL302932B1 (en) 2026-01-01
IL302932A (en) 2023-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022231706B2 (en) Anti-garp antibody
RU2668170C2 (ru) Анти-в7-н3-антитело
RS58173B1 (sr) Konjugat anti-trop2 antitelo-lek
HK40110144A (en) Anti-garp antibody
HK40023165A (en) Anti-garp antibody
TWI909341B (zh) 抗garp抗體及其製造方法及用途
HK1254310B (en) Anti-garp antibody
HK40002989B (en) Method for producing an anti-trop2 antibody-drug conjugate
HK1229817B (en) Anti-trop2 antibody-drug conjugate