RS62003B2 - Vezujući molekuli specifični za cd73 i njihove upotrebe - Google Patents

Vezujući molekuli specifični za cd73 i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS62003B2
RS62003B2 RS20210770A RSP20210770A RS62003B2 RS 62003 B2 RS62003 B2 RS 62003B2 RS 20210770 A RS20210770 A RS 20210770A RS P20210770 A RSP20210770 A RS P20210770A RS 62003 B2 RS62003 B2 RS 62003B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antigen
seq
amino acid
binding fragment
Prior art date
Application number
RS20210770A
Other languages
English (en)
Inventor
Ralph Minter
Steven Rust
Sandrine Guillard
Lutz U Jermutus
Carl Hay
Kris Sachsenmeier
Erin Sult
Qihui Huang
Peter Pavlik
Melissa Damschroder
Li Cheng
Gundo Diedrich
Jonathan Rios-Doria
Scott Hammond
Robert E Hollingsworth
Nicholas Durham
Ching Ching Leow
Mary Antonysamy
James Geoghegan
Xiaojun Lu
Kim Rosenthal
Original Assignee
Medimmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54478033&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62003(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medimmune Ltd filed Critical Medimmune Ltd
Publication of RS62003B1 publication Critical patent/RS62003B1/sr
Publication of RS62003B2 publication Critical patent/RS62003B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis
POZADINA PRONALASKA
[0001] CD73 ili ekto-5'-nukleotidaza (5'-NT) sveprisutno se eksprimira u brojnim tkivima. Ovaj protein je usidren za ćelijsku membranu putem veze glikozil fosfatidilinozitola (GPI), ima ektoenzimsku aktivnost, i igra ulogu u transdukciji signala. Primarna funkcija CD73 je pretvaranje ekstracelularnih nukleotida (npr.5'-AMP), za koje su ćelije uglavnom nepropusne, u njihove odgovarajuće nukleozide (npr. adenozin), koji mogu lako ući u većinu ćelija. Pokazalo se da proizvodnja adenozina posredstvom CD73 putem defosforilacije AMP-a reguliše angažovanje receptora adenozina u mnogim tkivima, što ukazuje na to da adenozin ima funkciju u citoprotekciji, ćelijskom rastu, angiogenezi i imunosupresiji, i takođe ima ulogu u tumorogenezi.
[0002] Ekspresija CD73 na ćelijama tumora je zabeležena kod nekoliko vrsta kancera, uključujući kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer bešike, leukemiju, limfom, gliom, glioblastom, melanom, kancer jajnika, tiroidni kancer, kancer jednjaka, kancer prostate i kancer dojke. Povišena ekspresija CD73 takođe je povezana sa invazivnošću tumora, metastazama i smanjenim vremenom preživljavanja pacijenta. CD73 stvara imunosupresivno okruženje, koje karakteriše povišeni nivo adenozina, koji promoviše razvoj i progresiju kancera. Značajno je da je ekspresija CD73 povezana sa prometastatskim fenotipom kod melanoma i kancera dojke.
[0003] Inhibitori imunološke kontrolne tačke imaju veliki potencijal kao terapija za kancer. Ipak, kliničke koristi od inhibicije imunološke kontrolne tačke bile su umerene. Jedno od potencijalnih objašnjenja je da tumori koriste imunosupresivne mehanizme bez preklapanja kako bi olakšali imunološki beg. Shodno tome, hitno su potrebne unapređene kompozicije i postupci za smanjenje tumorski posredovane imunosupresije.
[0004] Stagg et al. ("Anti-CD73 antibody therapy inhibits breast tumor growth and metastasis", PNAS, sveska 107, br. 4, 2010, strane 1547-1552) opisuju upotrebu anti-CD73 za inhibiciju rasta tumora. Allard et al. ("Targeting CD73 enhances the antitumor activity of anti-PD-1 and anti-CTLA-4 mAbs", Clinical Cancer Research, sveska 19, br.20, 2013, strane 5626-5635) opisuju kombinovanu upotrebu anti-CTLA-4 i anti-CD73.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuju za CD73, koji sadrže VL i VH koji obuhvataju VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VHCDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 46, 51, 56, 36, 39, odnosno 45.
[0006] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrže VL koji obuhvata SEQ ID NO: 68 i VH koji obuhvata SEQ ID NO: 82. Opciono, CD73 je humani CD73. Opciono, anti-CD73 antitelo je MEDI9447 ili Phen0203 hIgG1.
[0007] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov antigenvezujući fragment iz pronalaska za upotrebu u lečenju kancera. Opciono, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera bešike, leukemije, limfoma, glioma, glioblastoma, melanoma, kancera jajnika, tiroidnog kancera, kancera jednjaka, kancera prostate i kancera dojke. Opciono, ispitanik je podvrgnut, bio je podvrgnut, ili će biti podvrgnut anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapiji.
[0008] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov antigenvezujući fragment iz pronalaska, pri čemu anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapija obuhvata primenu anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta. Opciono, anti-PD-1 antitelo je pembrolizumab (KEYTRUDA®, lambrolizumab, MK-3475), nivolumab (OPDIVA®, BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), AMP-224, ili njegov antigen-vezujući fragment. Opciono, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736, BMS-936559 ili MPDL3280A ili njihovi antigen-vezujući fragmenti.
[0009] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu je anti-CTLA-4 antitelo ipilimumab, tremelimumab (ticilimumab, CP-675,206) ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0010] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema pronalasku, anti-PD-L1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili anti-CTLA4 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Opciono, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736, BMS-936559 ili MPDL3280A, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti. Opciono, anti-CTLA4 antitelo je ipilimumab ili tremelimumab (ticilimumab, CP-675,206) ili njegov antigen vezujući fragment.
[0011] Predmetno otkriće obezbeđuje izolovane vezujuće molekule ili njihove antigenvezujuće fragmente koji se specifično vezuju za CD73. U nekim aspektima, takvi CD73-vezujući molekuli su, npr., antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti. U određenim otelotvorenjima, anti-CD73 antitela iz otkrića (npr. MEDI9447) korisna su za smanjenje tumorski posredovane imunosupresije. Shodno tome, predmetno otkriće takođe obezbeđuje terapeutske kombinacije koje obuhvataju anti-CD73 antitela (npr. MEDI9447) i druge agense koji ciljaju dodatne aspekte ciklusa imuniteta kancera (tj. anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela; anti-CTLA4 antitela, A2aR antagonisti, STAT-3 inhibitori) i postupci za upotrebu takvih kombinacija su korisni za smanjenje tumorski posredovane imunosupresije.
[0012] U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73 epitop, kada se vezujući molekul specifično vezuje za isti epitop CD73 kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) antitela izabranog od CD730002, CD730003, CD730004, CD730008, CD730010, CD730011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047 ili CD730058.
[0013] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73 i konkurentski inhibira vezivanje CD73 putem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži VHi VLCD730002, CD730003, CD730004, CD730008, CD730010, CD730011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047 ili CD730058.
[0014] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73 koji sadrži VLantitela, pri čemu VLima aminokiselinsku sekvencu:
[FW1]SGSLSNIGRNX1VN[FW2] LX2NX3RX4X5[FW3] ATWDDSX6X7GWX8[FW4] pri čemu [FW1], [FW2], [FW3] i [FW4] predstavljaju VLregione okvira i pri čemu X1predstavlja aminokiselinske ostatke prolin (P), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D); X2predstavlja aminokiselinske ostatke asparagin (N) ili asparaginsku kiselinu (D);
X3predstavlja aminokiselinske ostatke glutamin (Q) ili leucin (L);
X4predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili prolin (P);
X5predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X6predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili histidin (H);
X7predstavlja aminokiselinske ostatke lizin (K), prolin (P), izoleucin (I) ili asparagin (N); i,
X8predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili treonin (T).
[0015] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 6, pri čemu FW1obuhvata SEQ ID NO: 25 ili 26, FW2obuhvata SEQ ID NO: 27 ili 28, FW3obuhvata SEQ ID NO: 29, i FW4obuhvata SEQ ID NO: 30.
[0016] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73 koji sadrži VH antitela, pri čemu VHima aminokiselinsku sekvencu:
[FW5]SYAX9S [FW6]X10IX11GSX12GX13TYYADSVKG [FW7]LGYX14X15X16DX17[FW8] pri čemu [FW5], [FW6], [FW7] i [FW8] predstavljaju regione okvira VH, i pri čemu X9predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili tirozin (Y);
X10predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili alanin (A);
X11predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili serin (S);
X12predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili glicin (G);
X13predstavlja aminokiselinske ostatke serin (S) ili arginin (R);
X14predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X15predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili treonin (T);
X16predstavlja aminokiselinske ostatke valin (V) ili izoleucin (I); i,
X17predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y), lizin (K), metionin (M), leucin (L) ili glutaminsku kiselinu (E).
[0017] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73 koji sadrži VLantitela i VHantitela, pri čemu VLsadrži aminokiselinsku sekvencu:
[FW1]SGSLSNIGRNX1VN[FW2]LX2NX3RX4X5[FW3]ATWDDSX6X7GWX8[FW4] pri čemu [FW1], [FW2], [FW3] i [FW4] predstavljaju regione okvira VLi pri čemu X1predstavlja aminokiselinske ostatke prolin (P), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);
X2predstavlja aminokiselinske ostatke asparagin (N) ili asparaginsku kiselinu (D); X3predstavlja aminokiselinske ostatke glutamin (Q) ili leucin (L);
X4predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili prolin (P);
X5predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X6predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili histidin (H);
X7predstavlja aminokiselinske ostatke lizin (K), prolin (P), izoleucin (I) ili asparagin (N); i,
X8predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili treonin (T);
i pri čemu VHsadrži aminokiselinsku sekvencu:
[FW5]SYAX9S [FW6]X10IX11GSX12GX13TYYADSVKG [FW7]LGYX14X15X16DX17[FW8] pri čemu [FW5], [FW6], [FW7] i [FW8] predstavljaju regione okvira VH, i pri čemu X9predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili tirozin (Y);
X10predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili alanin (A);
X11predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili serin (S);
X12predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili glicin (G);
X13predstavlja aminokiselinske ostatke serin (S) ili arginin (R);
X14predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X15predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili treonin (T);
X16predstavlja aminokiselinske ostatke valin (V) ili izoleucin (I); i,
X17predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y), lizin (K), metionin (M), leucin (L) ili glutaminsku kiselinu (E).
[0018] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VLantitela, pri čemu VLima aminokiselinsku sekvencu regiona za određivanje komplementarnosti-2 VL(VL-CDR2) koja je identična, ili identična osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 52.
[0019] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VLantitela, pri čemu VLima aminokiselinsku sekvencu regiona za određivanje komplementarnosti-3 (VL-CDR3) koja je identična, ili identična osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, ili SEQ ID NO: 56.
[0020] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VIIantitela, pri čemu VIIima aminokiselinsku sekvencu regiona za određivanje komplementarnosti-1 (VH-CDR1) koja je identična, ili identična osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 36.
[0021] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za CD73 koji ima VIIantitela, pri čemu VIIima aminokiselinsku sekvencu regiona za određivanje komplementarnosti-2 (VH-CDR2) koja je identična, ili identična osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije sa: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 ili SEQ ID NO: 40.
[0022] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VHantitela, pri čemu VHima aminokiselinsku sekvencu regiona za određivanje komplementarnosti-3 (VH-CDR3) koja je identična, ili identična osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, ili SEQ ID NO: 45.
[0023] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VLantitela, pri čemu VLima aminokiselinske sekvence VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 koje su identične, ili su identične osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije u jednom ili više od VL-CDR, sa: SEQ ID NO: 46, 49 i 53; SEQ ID NO: 47, 49 i 53; SEQ ID NO: 47, 49 i 54; SEQ ID NO: 46, 50 i 54; SEQ ID NO: 46, 51 i 55; SEQ ID NO: 48, 52 i 54; SEQ ID NO: 46, 49 i 56; SEQ ID NO: 47, 49 i 56; SEQ ID NO: 46, 50 i 56; SEQ ID NO: 46, 51 i 56; ili SEQ ID NO: 48, 52, odnosno 56.
[0024] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VHantitela, pri čemu VHima aminokiselinske sekvence VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 koje su identične, ili su identične osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije u jednom ili više od VH-CDR, sa: SEQ ID NO: 35, 37 i 41; SEQ ID NO: 36, 37 i 42; SEQ ID NO: 36, 38 i 43; SEQ ID NO: 36, 39 i 44; SEQ ID NO: 36, 40 i 44; SEQ ID NO: 35, 37 i 45; SEQ ID NO: 36, 37 i 45; SEQ ID NO: 36, 38 i 45; SEQ ID NO: 36, 39 i 45; ili SEQ ID NO: 36, 40, odnosno 45.
[0025] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VLi VHsa aminokiselinskim sekvencama VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 koje su identične, ili su identične osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije u jednom ili više CDR, sa: SEQ ID NO: 46, 49, 53, 35, 37, i 41; SEQ ID NO: 47, 49, 53, 35, 37, i 41; SEQ ID NO: 47, 49, 54, 36, 37, i 42; SEQ ID NO: 46, 50, 54, 36, 38, i 43; SEQ ID NO: 46, 51, 55, 36, 39, i 44; SEQ ID NO: 48, 52, 54, 36, 40, i 44; SEQ ID NO: 46, 49, 56, 35, 37, i 41; SEQ ID NO: 46, 49, 53, 35, 37, i 45; SEQ ID NO: 47, 49, 56, 36, 37, i 45; SEQ ID NO: 46, 50, 56, 36, 38, i 45; SEQ ID NO: 46, 51, 56, 36, 39, i 45; SEQ ID NO: 48, 52, 56, 36, 40, i 45; ili SEQ ID NO: 46, 49, 56, 35, 37, i 45.
[0026] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VLantitela i VHantitela, pri čemu VLima aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 90% do oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 i SEQ ID NO: 70.
[0027] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, koji ima VLantitela i VHantitela, pri čemu VHima aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 90% do oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 odnosno SEQ ID NO: 84.
[0028] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, gde antitelo ili antigen-vezujući fragment ima VLsa sekvencom najmanje oko 90% do oko 100% identičnom sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 i SEQ ID NO: 70, i gde antitelo ili antigen-vezujući fragment ima VHsa sekvencom najmanje oko 90% do oko 100% identičnom sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 odnosno SEQ ID NO: 84.
[0029] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima VLkoji se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 57 i VHkoji se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 71.
[0030] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima VLkoji se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 68 i VHkoji se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 82.
[0031] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima VLkoji se sastoji od SEQ ID NO: 57 i VHkoji se sastoji od SEQ ID NO: 71.
[0032] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima VLkoji se sastoji od SEQ ID NO: 68 i VHkoji se sastoji od SEQ ID NO: 82.
[0033] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema otkriću, i nosač.
[0034] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja ima sekvencu koja kodira izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema otkriću.
[0035] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje kompoziciju koja uključuje nukleinsku kiselinu prema otkriću.
[0036] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema otkriću.
[0037] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline, kompoziciju ili vektor prema otkriću.
[0038] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za pravljenje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema otkriću, koji obuhvata uzgajanje ćelije koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline, kompoziciju ili vektor prema otkriću; i izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0039] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje dijagnostički reagens koji sadrži izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema otkriću, koji je obeležen.
[0040] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kompoziciju ili dijagnostički reagens prema otkriću.
[0041] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za inhibiciju rasta ćelije koja eksprimira CD73, koji obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom prema otkriću.
[0042] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje kancera kod ispitanika kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema otkriću.
[0043] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje kancera kod ispitanika, koji obuhvata primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine prvog agensa, koji je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema otkriću, u kombinaciji sa terapeutski delotvornom količinom drugog agensa, koji je antikancerski agens koji nije prvi agens.
1
[0044] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje koji obuhvata primenu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta na ispitaniku kod koga je identifikovano da ima tumor koji ima povećanu ekspresiju CD73 u odnosu na referencu.
[0045] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje koji obuhvata primenu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, na ispitaniku kod koga je identifikovano da ima tumor koji ima povećanu ekspresiju CD73 u odnosu na referencu.
[0046] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje koji obuhvata primenu MEDI9447 ili Phen0203 hIgG1 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i pembrolizumaba (Keytruda®) ili nivolumaba (Opdiva®) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, na ispitaniku kod koga je identifikovano da ima tumor koji ima povećanu ekspresiju CD73 u odnosu na referencu.
[0047] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje koji obuhvata primenu MEDI9447 ili Phen0203 hIgG1 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i MEDI4736 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, na ispitaniku kod koga je identifikovano da ima tumor koji ima povećanu ekspresiju CD73 u odnosu na referencu.
[0048] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje koji obuhvata primenu MEDI9447 ili Phen0203 hIgG1 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i tremelimumaba ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, na ispitaniku kod koga je identifikovano da ima tumor koji ima povećanu ekspresiju CD73 u odnosu na referencu.
[0049] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za identifikovanje ispitanika koji ima kancer responsivan na anti-CD73 terapiju, pri čemu postupak obuhvata detekciju povećanog nivoa ekspresije ili aktivnosti CD73 u ćeliji tumora ili krvnim zrncima ispitanika, u odnosu na referentnu vrednost, čime se navedeni kancer identifikuje kao responsivan na anti-CD73 terapiju.
[0050] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za identifikaciju ispitanika koji ima kancer responsivan na anti-CD73 terapiju u kombinaciji sa jednom ili više od anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapije, pri čemu postupak obuhvata detekciju povećanog nivoa ekspresije ili aktivnosti CD73 u ćeliji tumora ili krvnim zrncima ispitanika, u odnosu na referentnu vrednost, čime se navedeni kancer identifikuje kao responsivan na anti-CD73 terapiju u kombinaciji sa jednom ili više od anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapije.
[0051] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za identifikaciju ispitanika koji ima kancer responsivan na anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapiju, pri čemu postupak obuhvata detekciju smanjenog nivoa ekspresije ili aktivnosti CD73 u ćeliji tumora ili krvnim zrncima ispitanika, u odnosu na referentnu vrednost, čime se navedeni kancer identifikuje kao responsivan na anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapiju.
[0052] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za inhibiciju rasta tumora kod ispitanika, pri čemu postupak obuhvata primenu na ispitaniku kome je to potrebno anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i jednog ili više od anti-PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela, anti-CTLA4 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0053] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za povećanje antitumorskog imunskog odgovora kod ispitanika, pri čemu postupak obuhvata primenu na ispitaniku kome je to potrebno anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i jednog ili više od anti-PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela, anti-CTLA4 antitela, ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta na ispitaniku.
[0054] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje tumora kod ispitanika, pri čemu postupak obuhvata primenu na ispitaniku kome je to potrebno anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i jednog ili više od anti-PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela, anti-CTLA4 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0055] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i anti-PD-1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0056] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu MED19447 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i pembrolizumaba (Keytruda®), ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0057] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu MEDI9447 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i nivolumaba (Opdiva®), ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0058] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu Phen0203 hIgG1, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i pembrolizumaba (Keytruda®), ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0059] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu Phen0203 hIgG1 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i nivolumaba (Opdiva ®), ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0060] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i anti-PD-L1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0061] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu MEDI9447 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i MEDI4736, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0062] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu Phen0203 hIgG1 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i MEDI4736, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0063] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i anti-CTLA4 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0064] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu MEDI9447 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, i tremelimumaba ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
1
[0065] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu MEDI9447 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i ipilimumaba, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0066] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu Phen0203 hIgG1 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i tremelimumaba, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0067] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži delotvornu količinu Phen0203 hIgG1 ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i ipilimumaba, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0068] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje komplet za povećanje anti tumorske aktivnosti, te komplet sadrži anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0069] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje komplet za povećanje antitumorske aktivnosti, pri čemu komplet sadrži anti-CD73 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-PD-L1 antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment.
[0070] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje komplet za povećanje antitumorske aktivnosti, pri čemu komplet sadrži anti-CD73 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-CTLA4 antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment.
[0071] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, VL i VH iz CD730002 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 1, odnosno 2, a VL i VH iz CD730010 su, ili obuhvataju, SEQ ID NO: 3, odnosno 4.
[0072] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment uključuje antitelo ili njegov antigen vezujući fragment.
[0073] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, vezujući molekul je afinitetno sazreo.
[0074] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, FW5 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 31, FW6 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 32, FW7 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 33 i FW8 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 34.
[0075] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, FW1 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 25 ili 26, FW2 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 27 ili 28, FW3 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 29, FW4 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 30, FW5 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 31, FW6 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 32, FW7 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 33 i FW8 je, ili obuhvata, SEQ ID NO: 34.
[0076] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, VL uključuje aminokiselinsku sekvencu regiona za određivanje komplementarnosti-1 VL (VL-CDR1) koja je identična, ili je identična osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije sa: SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, ili SEQ ID NO: 48.
[0077] U različitim otelotvorenjima bilo kog aspekta koji je ovde opisan, izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ima VL koji ima SEQ ID NO: 57 i VH koji ima SEQ ID NO: 71.
[0078] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ima VL sa SEQ ID NO: 68 i VH sa SEQ ID NO: 82.
[0079] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment uključuje konstantni region teškog lanca ili njegov fragment.
[0080] U različitim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca ili njegov fragment je konstantni region IgG, uključujući, na primer, konstantni region IgG1, konstantni region IgG2, konstantni region IgG3 ili konstantni region IgG4.
[0081] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment uključuje konstantni region lakog lanca izabran od humanog kapa konstantnog regiona i humanog lambda konstantnog regiona.
1
[0082] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konstantni region IgG ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na konstantni region divljeg tipa IgG, pri čemu modifikovani IgG ima produženi poluživot u poređenju sa poluživotom IgG koji ima konstantni region divljeg tipa IgG.
[0083] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konstantni region IgG ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija aminokiselinskih ostataka na pozicijama 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 i 428-436, pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata.
[0084] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, najmanje jedna aminokiselinska supstitucija konstantnog regiona IgG je izabrana od:
(a) supstitucije aminokiseline na poziciji 252 tirozinom (Y), fenilalaninom (F), triptofanom (W) ili treoninom (T);
(b) supstitucije aminokiseline na poziciji 254 treoninom (T);
(c) supstitucije aminokiseline na poziciji 256 serinom (S), argininom (R), glutaminom (Q), glutaminskom kiselinom (E), asparaginskom kiselinom (D) ili treoninom (T);
(d) supstitucije aminokiseline na poziciji 257 leucinom (L);
(e) supstitucije aminokiseline na poziciji 309 prolinom (P);
(f) supstitucije aminokiseline na poziciji 311 serinom (S);
(g) supstitucije aminokiseline na poziciji 428 treoninom (T), leucinom (L), fenilalaninom (F) ili serinom (S);
(h) supstitucije aminokiseline na poziciji 433 argininom (R), serinom (S), izoleucinom (I), prolinom (P) ili glutaminom (Q);
(i) supstitucije aminokiseline na poziciji 434 triptofanom (W), metioninom (M), serinom (S), histidinom (H), fenilalaninom (F) ili tirozinom; i,
(j) kombinacije dve ili više navedenih supstitucija,
pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata.
[0085] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konstantni region humanog IgG ima aminokiselinske supstitucije u odnosu na konstantni region divljeg tipa humanog IgG na pozicijama 252, 254 i 256, pri čemu
(a) aminokiselina na poziciji 252 je supstituisana tirozinom (Y),
1
(b) aminokiselina na poziciji 254 je supstituisana treoninom (T), i
(c) aminokiselina na poziciji 256 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata.
[0086] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, aminokiselina na poziciji 434 je supstituisana aminokiselinom izabranom od triptofana (W), metionina (M), tirozina (Y) i serina (S), i pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata.
[0087] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, aminokiselina na poziciji 428 je supstituisana aminokiselinom izabranom od treonina (T), leucina (L), fenilalanina (F) i serina (S), i pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata.
[0088] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, aminokiselina na poziciji 257 je supstituisana leucinom (L), a aminokiselina na Kabatovoj poziciji 434 je supstituisana tirozinom (Y), i pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata.
[0089] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, aminokiselina na Kabatovoj poziciji 428 je supstituisana leucinom (L), a aminokiselina na Kabatovoj poziciji 434 je supstituisana serinom (S).
[0090] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konstantni region humanog IgG ima aminokiselinske supstitucije u odnosu na konstantni region divljeg tipa humanog IgG na pozicijama 252, 254 i 256, pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata, i pri čemu
(a) aminokiselina na poziciji 252 je supstituisana tirozinom (Y),
(b) aminokiselina na poziciji 254 je supstituisana treoninom (T), i (c) aminokiselina na poziciji 256 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E).
[0091] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, antitelo je potpuno humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, multispecifično antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment.
1
[0092] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, antigen vezujući fragment je Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv ili sc(Fv)2.
[0093] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment su konjugovani sa najmanje jednim heterolognim agensom, uključujući, na primer, antikancerski agens.
[0094] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, kompozicija prema otkriću dalje sadrži antikancerski agens.
[0095] U različitim realizacijama bilo kog aspekta koji je ovde opisan, izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ne indukuje citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela (ADCC).
[0096] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je antagonist CD73.
[0097] U različitim otelotvorenjima, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je antagonist CD73 u ćelijama izabranim od MB-MDA-231, 4T1, MK1, ili kombinacije dve ili više navedenih ćelija.
[0098] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, CD73 je humani CD73.
[0099] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, vezivanje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta za CD73 može da smanji ćelijsku proliferaciju.
[0100] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, antitelo ili antigen vezujući fragment za CD73 može da se vezuje za humani CD73, CD73 majmuna cinomolgus i mišji CD73.
[0101] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, kancer je izabran od kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera bešike, leukemije, limfoma, glioma,
1
glioblastoma, melanoma, kancera jajnika, tiroidnog kancera, kancera jednjaka, kancera prostate i kancera dojke.
[0102] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, kancer ima prometastatski fenotip, uključujući melanom ili kancer dojke
[0103] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, ispitanik je čovek.
[0104] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, kombinacija prvog agensa i drugog agensa ima superiornu antitumorsku aktivnost; može biti zbirna ili sinergijska.
[0105] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, drugi agens je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0106] U različitim otelotvorenjima, druga agens se specifično vezuje za PD-1 (protein programirane smrti 1), PD-L1 (protein ligand 1 programirane smrti 1), PD-L2 (protein ligand 2 programirane smrti 1) ili CTLA-4 (protein antigena 4 citotoksičnog T limfocita).
[0107] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, drugi agens je anti-CTLA-4 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, uključujući, na primer, ipilimumab, tremelimumab (ticilimumab, CP-675,206) ili njihove antigen-vezujuće fragmente.
[0108] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, drugi agens je anti-PD-1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, uključujući, na primer, pembrolizumab (Keytruda®, lambrolizumab, MK-3475), nivolumab (Opdiva®, BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), AMP-224 ili njihove antigen-vezujuće fragmente.
[0109] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, drugi agens je anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, uključujući, na primer, MEDI4736, BMS-936559, MPDL3280A, ili njihove antigen-vezujuće fragmente.
[0110] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, anti-CD73 antitelo je MEDI9447, Phen0203 hIgG1, ili njihovi antigen vezujući fragmenti.
1
[0111] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, ispitanik je podvrgnut, bio je podvrgnut, ili će biti podvrgnut anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapiji.
[0112] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapija obuhvata primenu anti-PD-1, anti-PD-L1, odnosno anti-CTLA4 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0113] U različitim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo je pembrolizumab (Keytruda®, lambrolizumab, MK-3475), nivolumab (Opdiva®, BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), AMP-224, ili njihovi antigen vezujući fragmenti.
[0114] U različitim otelotvorenjima, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736, BMS-936559, MPDL3280A, ili njihovi antigen vezujući fragmenti.
[0115] U različitim otelotvorenjima, anti-CTLA-4 antitelo je ipilimumab, tremelimumab (ticilimumab, CP-675,206), ili njihovi antigen vezujući fragmenti.
[0116] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, tumor je kancer debelog creva, melanom, kancer dojke, limfom, nemikrocelularni karcinom pluća, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom i Burkitov limfom, kancer jajnika, kancer dojke, kancer glave i vrata, ili kancer pankreasa.
[0117] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, ekspresija ili aktivnost CD73 je detektovana u uzorku tumora, uzorku krvi ili uzorku limfe.
[0118] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, ekspresija CD73 je detektovana u ćeliji tumora ili ćeliji periferne krvi, uključujući podskupove limfoidnih ili mijeloidnih ćelija (tj. jedno ili više od B limfocita, CD4+, FoxP3+ limfocita ili mijeloidno dobijene supresorske ćelije (MDSC)).
2
[0119] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, ekspresija CD73 se detektuje pomoću protočne citometrije, imunohistohemije (IHC) ili aktivnosti CD73 enzima ili nivoa rastvorljivog CD73 u uzorcima.
[0120] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo, ili njihov antigen vezujući fragment, primenjuju se istovremeno.
[0121] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, postupak indukuje ili povećava imunski odgovor specifičan za tumor.
[0122] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, postupak smanjuje imunosupresivno dejstvo puta AMP/CD73/adenozina.
[0123] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, tumor je tumor koji prekomerno eksprimira CD73.
[0124] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73, ima VL antitela i VH antitela, koji se specifično vezuje za epitop CD73 proteina sa jednom ili više aminokiselina koje odgovaraju Val144, Lys180 i Asn185.
[0125] U različitim realizacijama bilo kog aspekta koji je ovde opisan, izolovani vezujući molekul ili vezujući antigen dalje sadrži jednu ili više amino kiselina koje odgovaraju Tyr135, Lis136 i Asn187.
[0126] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment sadrži aminokiseline koje odgovaraju Tyr135, Lys136 i Asn187.
[0127] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment sadrži aminokiseline koje odgovaraju Tyr135, Lys136, Asn187, Tyr135, Lys136 i Asn187.
[0128] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje epitop unutar jednog ili više od sledećih regiona CD73 proteina: Tir132-Val144 i/ili Lis180-Asn187.
[0129] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment, sadrži ili se nalazi unutar aminokiselinskih sekvenci na Tyr132-Val144 i/ili Lys180-Asn187.
[0130] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje konformacioni epitop na površini CD73 proteina, koji ima jednu ili više aminokiselina koje odgovaraju Val144, Lys180 i Asn185, pri čemu CD73 protein koji sadrži epitop može specifično da se veže monoklonskim antitelom MEDI9447 ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, varijantom, analogom ili derivatom.
[0131] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konformacioni epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina koje odgovaraju Tyr135, Lys136 i Asn18.
[0132] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konformacioni epitop sadrži aminokiseline koje odgovaraju Tyr135, Lys136 i Asn187.
[0133] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konformacioni epitop sadrži aminokiseline koje odgovaraju Tyr135, Lys136, Asn187, Tyr135, Lys136 i Asn187.
[0134] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konformacioni epitop je unutar jednog ili više od sledećih regiona CD73 proteina: Tyr132-Val144 i/ili Lys180-Asn187.
[0135] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, konformacioni epitop sadrži ili je unutar aminokiselinskih sekvenci na Tyr132-Val144 i/ili Lys180-Asn187.
[0136] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, MEDI9447 vezuje CD73 protein u neaktivnom ili katalitički aktivnom stanju ili otvorenom ili zatvorenom stanju.
[0137] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, CD73 protein je humani CD73.
[0138] U različitim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih aspekata, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment, pri čemu, VL i VH su VL i VH iz MED19447.
[0139] Kompozicije i proizvodi definisani pronalaskom su izolovani ili na drugi način proizvedeni u vezi sa primerima datim u nastavku. Ostale karakteristike i prednosti pronalaska biće jasne iz detaljnog opisa i iz zahteva.
2
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
[0140]
Slika 1A prikazuje nukleotidnu sekvencu i translaciju aminokiselina VH domena MEDI9447 pri čemu su prikazani CDR-i zasnovani na Kabatovoj numeraciji.
Slika 1B prikazuje nukleotidnu sekvencu i translaciju aminokiselina VL domena MEDI9447 pri čemu su prikazani CDR-i zasnovani na Kabatovoj numeraciji.
Slika 1C prikazuje poravnanje VH MEDI9447 sa najbližim humanim VH i JH germinativnim sekvencama. CDR zasnovani na Kabatovoj numeraciji su istaknuti, i ostaci različiti od germinativne sekvence su uokvireni.
Slika ID prikazuje poravnanje VL MEDI9447 sa najbližim humanim VL i JL germinativnim sekvencama. CDR zasnovani na Kabatovoj numeraciji su istaknuti, i ostaci različiti od germinativne sekvence su uokvireni.
Slika 2 pruža dva grafikona koji prikazuju internalizaciju posredovanu antitelom citotoksičnog FabZAP reagensa u MDA-MB-231 ćelije i 4T1 ćelije, pri čemu su antitela MEDI9447, a kontrolno antitelo je R347.
Slika 3A je grafikon koji prikazuje inhibiciju 5' ektonukleotidaze pomoću anti-CD73 antitela MEDI9447.
Slika 3B je grafikon koji prikazuje inhibiciju AMP hidrolize pomoću anti-CD73 antitela CD370010.
Slika 4 je grafikon koji pokazuje da je MEDI9447 inhibirao rast tumora u CT26 modelu singenetskog tumora. Mišje CT26 tumorske ćelije su supkutano implantirane na desnom boku ženki Balb/C miševa. Tumori su ostavljeni da rastu tokom 3 dana i tretirani su sa MEDI9447 ili izotipskom kontrolom dva puta nedeljno tokom dve nedelje. Tumori su 16. dana sakupljeni za analizu protočnom citometrijom.
Slika 5 je grafikon koji pokazuje da je MEDI9447 inhibirao tumorske infiltrirajuće mijeloidno dobijene supresorske ćelije (MDSC). CT26 miševi sa tumorom tretirani sa MEDI9447 su žrtvovani i tumori su sakupljeni 16. dana studije. Tumori su disasocirani u pojedinačne ćelije, obojeni za CD45 i MDSC markere i analizirani protočnom citometrijom.
Slika 6 uključuje šest mrežastih dijagrama koji pokazuju dejstvo MEDI9447 mIgG1, anti-PD-1 ili kombinacije na zapreminu tumora. Kontrolna antitela uključuju rIgG2a, koji je kontrolno monoklonsko pacovsko IgG2a antitelo specifično za E. coli βgalaktozidazu (β-Gal) i mišji IgG1 izotipske kontrole. Zapremine tumora iz svake grupe životinja su unete za pojedinačne životinje 40. dana studije. Nijedan miš iz kontrolne grupe nije bio bez tumora na kraju studijskog perioda od 40 dana. Samo lečenje sa anti-CD73 dalo je 10% životinja bez tumora na kraju studije. Samo lečenje sa anti-PD1 takođe je dalo 10% životinja bez tumora na kraju studije. Izuzetno je to što je kombinacija tretiranja sa anti-CD73 i anti-PD dala 60% miševa bez tumora. Nijedan miš iz kontrolne grupe nije bio bez tumora na kraju studije.
Slika 7 je grafikon koji prikazuje dejstvo MEDI9447 mIgG1, anti-PD1 ili kombinacije na preživljavanje.
Slika 8 je grafikon koji pokazuje da je kombinacija MEDI9447 i anti-PD-1 značajno pojačala inhibiciju rasta tumora (p<0,05) u poređenju sa bilo kojim agensom samostalno kod tumora kolorektalnog karcinoma. Miševima su supkutano injektovane singene MC38-OVA ćelije kolorektalnog karcinoma i dva puta nedeljno su tretirani sa 10 mg po kg MEDI9447 ili 10 mg po kg anti-PD-1 antitela, samostalno ili kombinacijom oba antitela. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno.
Slika 9 je grafikon koji pokazuje da je anti-PD-1 indukovao tumorsko mikrookruženje bogato CD73 kako je izmereno ekspresijom CD73 na tumorskim ćelijama izolovanim iz miševa sa tumorom. Miševima (n=4) su supkutano injektovane singene CT26 kolorektalne ćelije i tretirani su dva puta nedeljno sa 10 mg po kg anti-PD-1 ili irelevantnim izotipskim kontrolnim antitelom. Jedan dan nakon prvog tretmana tumori su izolovani, ćelije disocirane i analizirane na površinski fenotip putem protočne citometrije.
Slika 10 je grafikon koji pokazuje da je anti-PD-1 indukovao tumorsko mikrookruženje bogato CD73 kako je izmereno ekspresijom CD73 na mijeloidno dobijenim supresorskim ćelijama (MDSC) izolovanim iz miševa sa tumorom. Miševima (n=4) su supkutano injektovane singene CT26 kolorektalne ćelije i tretirani su dva puta nedeljno sa 10 mg po kg anti-PD-1 ili irelevantnim izotipskim kontrolnim antitelom. Jedan dan nakon prvog tretmana tumori su izolovani, tumorske ćelije su izolovane, periferne ćelije pune krvi su sakupljene i analizirane na površinsku ekspresiju CD73 putem protočne citometrije.
Slika 11 je grafikon koji pokazuje da je anti-PD-1 indukovao tumorsko mikrookruženje bogato CD73 kako je izmereno ekspresijom CD73 na CD4<+>, FoxP3<+>limfocitima izolovanim iz miševa sa tumorom. Miševima (n=4) su supkutano injektovane singene CT26 kolorektalne ćelije i tretirani su dva puta nedeljno sa 10 mg po kg anti-PD-1 ili irelevantnim izotipskim kontrolnim antitelom. Tri dana nakon
2
prvog tretmana tumori su izolovani, periferne ćelije pune krvi su sakupljene i analizirane na površinsku ekspresiju CD73 putem protočne citometrije
Slika 12 je grafikon koji pokazuje da je kombinacija MEDI9447 i anti-PD-L1 značajno pojačala inhibiciju rasta tumora (p<0,05) u poređenju sa bilo kojim agensom samostalno kod tumora melanoma. Miševima su supkutano injektovane singene ćelije B16F10 melanoma i dva puta nedeljno su tretirani sa 10 mg po kg MEDI9447 ili 10 mg po kg anti-PD-L1 antitela, samostalno ili kombinacijom oba antitela. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno.
Slika 13 je grafikon koji pokazuje da je kombinacija MEDI9447 i anti-PD-L1 značajno pojačala inhibiciju rasta tumora (p<0,01) u poređenju sa bilo kojim agensom samostalno kod tumora limfoma. Miševima su supkutano injektovane singene ćelije EG7-OVA limfoma i dva puta nedeljno su tretirani sa 10 mg po kg MEDI9447 ili 10 mg po kg anti-PD-L1 antitela, samostalno ili kombinacijom oba antitela. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno.
Slika 14 je grafikon koji pokazuje da je anti-PD-L1 indukovao tumorsko mikrookruženje bogato sa CD73, kako je izmereno površinskom ekspresijom CD73 na B limfocitima drenažnog limfnog čvora. Miševima (n=4) su supkutano injektovane singenske CT26 kolorektalne ćelije, i tretirani su dva puta nedeljno sa 10 mg po kg anti-PD-L1 ili irelevantnim izotipskim kontrolnim antitelom. Jedan dan nakon prvog tretmana, ćelije su izolovane iz drenažnih limfnih čvorova i analizirane na površinski fenotip putem protočne citometrije.
Slika 15 je grafikon koji pokazuje da je anti-PD-L1 indukovao tumorsko mikrookruženje bogato sa CD73, kako je izmereno površinskom ekspresijom CD73 na CD4+ koji se infiltriraju u tumor, FoxP3+ limfocitima. Miševima (n=4) su supkutano injektovane singenske CT26 kolorektalne ćelije, i tretirani su dva puta nedeljno sa 10 mg po kg anti-PD-L1 ili irelevantnim izotipskim kontrolnim antitelom. Tri dana nakon prvog tretmana tumori su izolovani, ćelije disocirane i analizirane na površinski fenotip putem protočne citometrije.
Slike 16 A i B su grafikoni koji pokazuju da je MEDI9447 samostalno ili u kombinaciji sa anti-PD-L1 smanjio ekspresiju CD73 na limfoidnim ćelijama koje se infiltriraju u tumor. Miševi koji imaju kolorektalne CT26 singene tumore tretirani su dva puta nedeljno (12. dan i D16) sa 30 mg/kg MEDI9447 ili 30 mg/kg anti-PD-Ll, samostalno ili kombinacijom MEDI9447 i anti-PD-L1. Tumori su 17. dana sakupljeni
2
i analizirani na površinsku ekspresiju CD73 pomoću protočne citometrije. Ekspresija CD73 na tumorskim infiltratima (A) CD4+ FoxP3+ Treg i (B) CD8+ T ćelijama.
Slike 17 A i B su grafikoni koji pokazuju da je MEDI9447 samostalno ili u kombinaciji sa anti-PD-L1 smanjio aktivnost CD73 na (A) tumorskim ćelijama i (B) perifernim ćelijama pune krvi. Miševi koji imaju kolorektalne CT26 singene tumore su tretirani dva puta nedeljno (12. dan i D16) sa 30 mg/kg MEDI9447 ili 30 mg/kg anti-PD-L1, samostalno ili kombinacijom MEDI9447 i anti-PD-L1. Periferne ćelije pune krvi su 17. dana sakupljene i analizirane na površinsku ekspresiju CD73 za enzimsku aktivnost koristeći Cell-Titre Glo.
Slika 18 je skup grafikona koji prikazuju profile citokina mononuklearnih ćelija periferne krvi tretirane MEDI9447 i antitelima ili fuzionim proteinima specifičnim za CTLA4, OX40, PD-1 i PD-L1. Primarne mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka su inkubirane 72 sata u mešovitoj leukocitnoj reakciji sa MEDI9447 i/ili antitelima ili fuzionim proteinima specifičnim za naznačene ciljeve. Citokini (IFN-γ, IL-Iβ, TNF-α) u duplikatima supernatanta kvantifikovani su pomoću ELISA. Prikazani podaci predstavljaju optimalne kombinacije doza anti-CD73 antitela sa 4 različita partnerska agensa. Kombinacija anti-PD-1 i anti-CD73 pokazala je značajnu (p<0,05) sinergiju utvrđenu metodom Blisovog površinskog odgovora (Zhao et al.). Profil citokina pokazuje da je bilo uticaja i na mijeloidne i na limfoidne loze. Testirano je više od 50 donorskih parova.
Slike 19A i 19B prikazuju rezultate MS analize izmene vodonika deuterijumom (HDX-MS) kod CD73 u kompleksu sa MEDI9447. Slika 19A prikazuje toplotnu mapu izmene vodonik-deuterijum koja prikazuje one regione CD73 (N- do C-terminusa) koji doživljavaju smanjeni unos deuterijuma kada su vezani za MEDI9447. Relativna izmena između CD73 vezanih za antitela i nevezanih prikazana je kao funkcija vremena izloženosti sa smanjenom izmenom u crvenoj, povećanom izmenom u plavoj, i izostankom promene u beloj boji. N-terminalni regioni na pozicijama 132-143 i 182-187 ispoljili su najveći stepen diferencijalne izmene. Slika 8B prikazuje kristalnu strukturu monomera CD73 koja prikazuje lokaciju HDX-identifikovane vezujuće međupovršine (cijan) unutar N-terminalnog domena (žuta). Linkerski region i C-terminalni domen CD73 predstavljeni su narandžastom, odnosno plavom bojom. Slike 20A-20E prikazuju rezultate MS analize izmene vodonika deuterijumom (HDX-MS) koji ukazuju na regione CD73 i MEDI9447 koji podležu diferencijalnoj izmeni vodonika u slobodnom stanju u odnosu na vezana stanja. Slika 20A prikazuje
2
dijagrame koji predstavljaju relativni unos deuterijuma (promena mase u daltonima) kao funkciju vremena izloženosti deuterijumu unutar peptida koji obuhvataju region 132-143. Slika 20B prikazuje dijagrame koji predstavljaju relativni unos deuterijuma (promena mase u daltonima) kao funkciju vremena izloženosti deuterijumu unutar peptida koji obuhvataju region 182-187. Na slikama 20A i 20B, unos samo za CD73 prikazan je u kvadratima, a unos za CD73 vezan za MEDI9447 Fab prikazan je crvenom bojom. Peptidna sekvenca, pozicija i masa su naznačeni u polju dijagrama. Da bi se suzio region koji sadrži sekvencu koja pokazuje promenu u izmeni vodonika i očekuje se da gradi epitop, upoređena je relativna promena mase u preklapajućim peptidima. Na primer, peptid koji se prostire na pozicijama 173-186 pokazuje diferencijalnu izmenu, dok nije bilo razlike kod peptida koji se prostire na 173-181. Dakle, zaključeno je da ostaci ushodno od 182 nisu različito obeleženi. Slika 20C prikazuje DynamX grafikon razlika za teški lanac MEDI9447 Fab. Slika 20D prikazuje DynamX grafikon razlika za laki lanac MEDI9447 Fab. Na slikama 20C i 20D, svaka tačka podataka ukazuje na razliku u unosu deuterijuma između kompleksa CD73+Fab (pozitivne vrednosti na y osi) i samo Fab (negativne vrednosti na y osi). Vertikalna traka predstavlja zbir razlika unosa u tačkama vremena izlaganja. Označeni su CDR-ovi koji pokazuju niži relativni unos kada je Fab vezan za CD73. Slika 9E prikazuje DynamX grafikon razlika samo CD73 (negativne vrednosti na y osi) naspram CD73 vezanog za Fab (pozitivne vrednosti na y osi). Označeni su regioni E1 (aa 132-143) i E2 (aa 182-187). Horizontalna osa odgovara analiziranim peptidima od N- do C-terminusa (sleva nadesno). Na grafikon je uneta isprekidana linija koja pokazuje presek sa intervalom pouzdanosti od 98% za statistički značajne promene od 1,6 daltona.
Slike 21A-21H prikazuju podatke senzorskih čipova koji pokazuju da se epitop MEDI9447 nalazi unutar N-terminalnog domena CD73. Slika 21A je grafikon koji prikazuje podatke senzorskih čipova za divlji tip CD73 proteina. CD73 protein divljeg tipa imobilisan je na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Slika 21B je grafikon koji prikazuje podatke senzorskih čipova za CD73 protein sa zamenjenim N-terminalnim domenom. CD73 protein sa zamenjenim N-terminalnim domenom je imobilisan na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je putem SPR. MEDI9447 se nije vezivao za CD73 kada je N-terminalni domen zamenjen. Slika 21C je grafikon koji prikazuje podatke
2
senzorskih čipova za CD73 protein sa zamenjenim N-terminalnim i C-terminalnim domenom. CD73 protein sa zamenjenim N-terminalnim i C-terminalnim domenom je imobilisan na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je putem SPR. MEDI9447 se nije vezivao za CD73 kada su i N-terminalni i C-terminalni domeni zamenjeni. Slika 21D je grafikon koji prikazuje podatke senzorskih čipova za CD73 protein sa zamenjenim regionom linkera. CD73 protein sa zamenjenim regionom linkera je imobilisan na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je putem SPR. Zamena samo regiona linkera nije uticala na vezivanje. Slika 21E je grafikon koji prikazuje podatke senzorskih čipova za CD73 protein sa zamenjenim C-terminalnim domenom. CD73 protein sa zamenjenim C-terminalnim domenom je imobilisan na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je putem SPR. Zamena samo C-terminalnog domena nije uticala na vezivanje. Slika 21F je grafikon koji prikazuje podatke senzorskih čipova za CD73 protein sa zamenjenom međupovršinom E1 (aa 132-143). CD73 protein sa zamenjenom međupovršinom E1 (aa 132-143) imobilisan je na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je putem SPR. Slika 21G je grafikon koji prikazuje podatke senzorskih čipova za CD73 protein sa zamenjenom međupovršinom E2 (aa 182-187). CD73 protein sa zamenjenom međupovršinom E2 (aa 182-187) imobilisan je na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je putem SPR. Slika 21H je grafikon koji prikazuje podatke senzorskih čipova za CD73 protein sa zamenjenom međupovršinom E1 (aa 132-143) i međupovršinom E2 (aa 182-187). CD73 protein sa zamenjenom međupovršinom E1 (aa 132-143) i međupovršinom E2 (aa 182-187) imobilisan je na HTG senzorskom čipu, i vezivanje razblaženja MEDI9447 (5 nM do 0,3 nM) izmereno je putem SPR. Na slikama 21F-21H, zamena HDX međupovršine E1 (aa 132-143) (slika 21F) imala je mali uticaj na vezivanje, nasuprot zameni HDX međupovršine E2 (aa 182-187), samostalno (slika 21G) ili u kombinaciji sa E1 (slika 21H). Na slikama 21A-21H, senzorgrami i unete krive prikazani su odgovarajućim bojama. Kinetička merenja za svaku analizu vezivanja data su u tabeli 16.
Slika 22 prikazuje poravnanje sekvenci humanog i kokošjeg proteina CD73. Prikazane su samo zrele proteinske sekvence. Neočuvani ostaci su istaknuti u kokošjoj sekvenci. Označeni su regioni zamenjeni između kokoške i čoveka radi stvaranja nokaut varijanti (npr. DS1a, DS1b, itd.).
2
Slike 23 prikazuju vezivanje MEDI9447 za varijante CD73. Slika 23 je tabela podataka koja pokazuje vezivanje MEDI9447 za varijante CD73. KDza varijante istaknute plavom bojom su >2-struko promenjene od WT ili KO matičnog konstrukta. *Kinetička merenja dobijena iz 2:1 heterogenog uklapanja liganda. *Numeracija odgovara kokošjoj sekvenci (129 = 133, 140 = 144, a 181 = 185 kod čoveka).
Slike 24A-24F prikazuju da je epitop MEDI9447 pozicioniran na vrhu N-terminalnog domena. Slika 13A pokazuje da je procena vezivanja MEDI9447 za panel sa varijantama CD73 (vidite slike 22 i 23) otkrila šest pozicija koje čine mesto interakcije. Dva od tri najuticajnija ostatka (istaknuti blokovi) locirani su izvan regiona međupovršine HDX (istaknuto plavom bojom). Tri manje važna ostatka (ružičasti blokovi) nalaze se unutar HDX međupovršine. Slika 24B je tabela koja pokazuje da je ubacivanje N185 i V144 (K180 je očuvan) u CD73 konstrukt koji sadrži kokošju sekvencu N- i C-terminalnog domena vratilo vezivanje na manje od 20-strukog KDza divlji tip CD73 (razblaženja MEDI9447 od 5 nM do 0,3 nM, uporedite sa slikom 10B). Slika 24C prikazuje uvećane ostatke epitopa locirane u N-terminalnom domenu CD73. Najvažniji ostaci za vezivanje su prikazani istaknuto, a manje uticajne pozicije (Y135, K136 i N187) su ružičaste boje. HDX međupovršina je prekrivena plavom bojom. Slika 24D daje površinski prikaz koji pokazuje da epitop gradi skoro uzastopnu vezujuću površinu. Slika 24E prikazuje kristalnu strukturu otvorene konformacije CD73 koja prikazuje poziciju epitopa na apikalnoj, bočnoj površini N-terminalnog domena. Slika 24F pokazuje da je lokacija epitopa udaljena od mesta vezivanja supstrata (adenozin prikazan u sferama) i mesta koordinacije (bočni lanci plavozelenom bojom) jona cinka (siva sfera). U svim kristalnim strukturama, N-terminalni domen, region linkera i C-terminalni domen CD73 prikazani su žutom, narandžastom, odnosno plavom bojom.
Slike 25A-25C pokazuju da je MEDI9447 nekonkurentski inhibitor CD73 hidrolize AMP. Slika 25A je grafikon koji prikazuje kinetiku CD73 fosfohidrolize AMP izmerene u prisustvu MEDI9447 ili izotipski podudarnog kontrolnog mAb. Slika 25B je grafikon koji pokazuje da MEDI9447 deluje kao nekonkurentski inhibitor po tome što podjednako inhibira hidrolizu bez obzira na koncentraciju supstrata. Nasuprot tome, APCP, poznati konkurentski inhibitor CD73, povećava Kmali ne i Vmaks. Slika 25C je grafikon koji prikazuje dozni odgovor MEDI9447 IgG, Fab ili kontrolnog IgG na inhibiciju CD73 hidrolize AMP. MEDI9447 IgG postigao je maksimalnu inhibiciju pri molskoj stehiometriji 1:1 sa CD73 dimerom (strelica). Pri visokim koncentracijama, kada postoji višak MEDI9447 IgG (>10 nM), uočen je gubitak inhibicije ili „efekat udice“. MEDI9447 Fab i kontrolni IgG nisu inhibirali CD73. Svi eksperimenti su izvedeni pomoću testova CellTiterGlo, kako je ovde opisano (RLU, relativne svetlosne jedinice).
Slike 26A-26C pokazuju da vezivanje anti-CD73 mAb (klon 0069) zavisi od N- i C-terminalnih ostataka CD73. Slika 26A je grafikon koji prikazuje podatke senzorskog čipa za histidinski označeni CD73. Histidinski označeni CD73 imobilisan je na HIS2 biosenzoru, i vezivanje putem mAb A je izmereno interferometrijom biosloja (BLI). Vezivanje mAb A za WT CD7 (plavi senzorgram), nokaut CD73 sa zamenom N-terminalnog domena (KO_1-291, zeleni senzorgram) i nokaut CD7 sa zamenom C-terminalnog domena (KO_311-523 plavozeleni senzorgram) pokazuje da na vezivanje mAb utiču ostaci i u N- i u C-terminalnom domenu. Slika 26B Kristalna struktura otvorenog i zatvorenog CD73 koja istaknuto prikazuje poziciju žarišta vezivanja mAb A (aa 114-134 i 153-170), pozicioniranog u blizini međupovršine N- i C-terminalnog domena (N-terminalni domen prikazan žutom, linker narandžastom, a C-terminalni domen plavom bojom). Mapiranje se zasniva na podacima vezivanja sa slika 26A i 26C. Slika 26C prikazuje senzorgrame vezivanja mAb A za različite nokaut varijante CD73 sa zamenom domena. Zamena podregiona DS2c (aa 114-134) ili DS3a (aa 153-170) izbacila je vezivanje. Sve analize vezivanja obavljene su na instrumentu Octet QK384, kako je ovde opisano.
Slike 27A-27C pokazuju da je MEDI9447 inhibirao prelaz CD73 u konformaciono aktivnu strukturu. Slika 27A je grafikon koji prikazuje biosenzorske podatke za divlji tip CD73. Divlji tip CD73 je imobilisan na HIS2 biosenzoru, i vezivanje MEDI9447 (plavi senzorgram) i anti-CD73 mAb A (smeđi senzorgram) izmereno je putem BLI na instrumentu Octet QK384. Kada je CD73 prethodno inkubiran sa Zn2+ i APCP, MEDI9447 je zadržao vezivanje (crni senzorgram), ali je vezivanje mAb A izgubljeno (narandžasti senzorgram). Slika 27B je grafikon koji pokazuje da, iako je prethodna inkubacija CD73 sa Zn2+ i APCP uzrokovala gubitak u vezivanju mAb A (narandžasti senzorgram), prethodna inkubacija sa MEDI9447 pre dodavanja Zn2+ i APCP vratila je vezivanje (ljubičasti senzorgram). Vezivanje mAb A samo za CD73 i za CD73 prethodno inkubiran sa MEDI9447 (ali ne i Zn2+ i APCP) prikazano je plavim, odnosno smeđim senzorgramom. Slika 27C prikazuje predloženi model koji prikazuje kako MEDI9447 sprečava CD73 da poprimi potpuno zatvorenu, aktivnu konformaciju
1
indukovanu putem Zn2+ i APCP. MEDI9947 može da ograniči prelaz u intermedijerno stanje sa manjim afinitetom prema mAb A.
Slike 28A i 28B prikazuju vezivanje MEDI9447 ili mAb A za CD73 pod različitim uslovima izmereno pomoću BLI, kako je ovde opisano, osim ako u nastavku nije drugačije naznačeno. Slika 28A je grafikon koji prikazuje vezivanje anti-CD73 mAb A za histidinski označeni divlji tip CD73 imobilisan na HIS2 biosenzoru. Nakon 100 sekundi početnog stanja, uhvaćeni CD73 je inkubiran sa Zn<2+>, APCP i/ili EDTA tokom 900 sekundi, a zatim je biosenzor inkubiran u 30 nM mAb A tokom 600 sekundi kako bi se izmerilo vezivanje. mAb A se vezao za CD73 (plavi senzorgram) ali ne i za CD73 prethodno inkubiran sa Zn2+ i APCP (ljubičasti senzorgram). mAb A je održao vezivanje za CD73 prethodno inkubiran sa APCP i EDTA (zeleni senzorgram) ili Zn<2+>, APCP i EDTA (zlatni senzorgram). Helirajuće dejstvo EDTA pokazuje da je dvovalentni katjon bio potreban za gubitak vezivanja mAb A kada je CD73 inkubiran sa Zn2+ i APCP. Slika 28B je grafikon koji pokazuje da MEDI9447 Fab ili kontrolni IgG nisu spasli vezivanje mAb A za CD73 prethodno inkubiran sa Zn2+ i APCP. Test je obavljen kao na slici 27B. MEDI9447 Fab ili izotipski podudarni kontrolni IgG su prethodno inkubirani sa CD73 pre dodatka Zn2+ i APCP. mAb A imobilisan na biosenzoru vezivao se samo za CD73 (plavi senzorgram), CD73 prethodno inkubiran sa MEDI9447 Fab (svetloplavi senzorgram) ili kontrolnim IgG (crni senzorgram), ali ne za CD73 inkubiran sa Zn2+ i APCP (smeđi senzorgram) niti za Fab (zlatni senzorgram) niti kontrolni IgG (ljubičasti senzorgram) prethodno inkubiran sa CD73 pre dodatka Zn2+ i APCP.
Slike 29A i 29B pokazuju da vezivanje anti-CD73 mAb B zavisi od ostataka u podregionima DS2b (aa 92-134) ili DS2c (aa 114-134). Slika 29A je tabela koja pokazuje podatke SEC-MALS koji odgovaraju slikama 30A-30C. Za svaku mešavinu CD73 i MEDI9447 ili mAb B, prikazani su odgovarajuće SEC retenciono vreme, Mm i polidisperznost nastalih kompleksa. Slika 29B prikazuje određivanje žarišta vezivanja mAb B na CD73. Vezivanje mAb B za varijante CD73 imobilisane na HIS2 biosenzorima izmereno je pomoću BLI kako je opisano za mAb A (klon 0069) na slikama 26A-26C u skladu sa ovde datim postupcima. Vezujući senzorgrami su pokazali da zamena podregiona DS2b (aa 92-134) ili DS2c (aa 114-134) izbacuje vezivanje od strane mAb B.
Slike 30A-30C pokazuju da MEDI9447 gradi interdimerne mostove između rastvorljivih molekula CD73. CD73 je inkubiran sa različitim količinama MEDI9447
2
ili anti-CD73 mAb B i analiziran putem SEC-MALS. Prikazani su SEC UV hromatogrami sa retencionim vremenom proteina na x osi i molskom masom utvrđenom putem MALS na y osi. Slika 30A je hromatogram koji pokazuje da je u molskom odnosu 1:1 (zeleni trag) MEDI9447 gradio komplekse sa CD73 od ∼1.7 (^) i ∼6,6 (+) megadaltona. Kompleksi uporedive veličine su nastali pri nižim odnosima MEDI9447:CD73 (0,5:1 plavo, 0,1:1 crvenoljubičasto). Samo MEDI9447 i CD73 predstavljeni su crnim, odnosno crvenim UV tragovima. Slika 30B je pogled odozgo na kristalnu strukturu CD73 dimera koji pokazuje žarište vezivanja mAb B (ljubičasto) i epitop MEDI9447 (crvenoljubičasto i ružičasto). mAb B se vezuje za mesto blizu središnjeg žleba između dimera u otvorenoj konformaciji. Slika 30C je hromatogram koji pokazuje da, kada se CD73 vezuje za mAb B, nastaje jedan preovlađujući kompleks od ~ 270-290 kD (pik na ~7,2 min). Prikazani UV tragovi predstavljaju 1:1 mAb B:CD73 (crvena), 0,5:1 (plava) i 0,1:1 (zelena). Samo mAb A i CD73 su u crvenoljubičastoj, odnosno crnoj boji.
Slike 31A-31D prikazuju da je CD73 vezan za površinu inhibiran putem IgG i Fab formata MEDI9447. Slika 31A je grafikon koji prikazuje inhibiciju AMP hidrolize imobilisanog CD73 pomoću MEDI9447 IgG, Fab ili kontrolnih antitela. CD73 je imobilisan putem C-terminalne histidinske oznake na mikrotitarskoj ploči obloženoj niklom, i inhibicija AMP hidrolize putem MEDI9447 IgG, Fab ili kontrolnih antitela je izmerena koristeći test sa malahitno zelenim, kako je ovde opisan. MEDI9447 IgG, ali ne i kontrolni IgG, inhibirao je CD73 hidrolizu AMP na dozno zavisan način. MEDI9447 Fab je takođe inhibirao aktivnost CD73, ali u mnogo manjoj meri. Slika 31B prikazuje komplekse koji sadrže MEDI9447 Fab (zeleno) vezan za anti-Fd antitelo (xFd, crveno). Kada je MEDI9447 Fab (zeleno) vezan za jedan krak anti-Fd antitela (xFd, crveno), a drugi krak vezan za nespecifični poliklonski Fab (pFab, narandžasto), inhibicija se povećala do inhibicije uporedive sa MEDI9447 IgG (Fab+xFd+pFab u odnosu na MEDI9447 IgG i MEDI9947 IgG+xFd+pFab) (vidite sliku 31A). Slika 31C je grafikon koji prikazuje inhibiciju AMP hidrolize GPI-usidrenog CD73 pomoću MEDI9447 IgG, Fab ili kontrolnih antitela. Enzimska aktivnost endogeno eksprimiranog CD73 u MDA-MB-231 ćelijama je izmerena testom CellTiterGlo. Slično imobilisanom rekombinantnom CD73, MEDI9447 IgG inhibira AMP hidrolizu u većoj meri od Fab, ali povećanje delotvorne veličine MEDI9447 Fab stvaranjem kompleksa sa anti-Fd antitelima pojačava inhibiciju. Slika 31D je grafikon koji prikazuje inhibiciju AMP hidrolize rastvorljivog CD73 (sCD73) pomoću MEDI9447 IgG, Fab ili kontrolnih antitela. Da bi se ispitalo da li xFd+MEDI9447 može da inhibira rastvorljivi CD73, AMP hidroliza je izmerena koristeći test sa malahitno zelenim. MEDI9447 Fab, samostalno ili vezan za jedan krak xFd, nije inhibirao aktivnost rastvorljivog CD73. Nasuprot tome, vezivanje MEDI9947 Fab za oba kraka xFd (MEDI9447 Fab xFd) dalo je dvovalentnost koja dovodi do inhibicije CD73.
Slika 32 je grafikon koji pokazuje da MEDI94447 IgG i Fab inhibiraju CD73 hidrolizu AMP. Aktivnost CD73 je merena u prisustvu rastućih koncentracija antitela korišćenjem testa sa malahitno zelenim, kako je ovde opisano. MEDI9447 IgG je inhibirao hidrolitičku aktivnost CD73 na dozno zavisan način, i efekat udice i gubitak inhibicije nisu uočeni. MEDI9447 Fab je takođe inhibirao funkciju CD73, ali na niži nivo maksimalne inhibicije. Eksperiment je izveden dva puta sa uporedivim rezultatima. Prikazani su podaci iz samo jednog eksperimenta.
Na slici 33 prikazan je model koji pokazuje da se inhibicija hidrolitičke aktivnosti CD73 pomoću MEDI9447 događa putem dvostrukog mehanizma. MEDI9447IgG (zeleno) inhibira rastvorljivi CD73 tako što gradi interdimerne mostove koji sprečavaju konformacioni prelaz u zatvoreno stanje. Jednovalentno vezani IgG ili Fab ne inhibira rastvorljivi CD73. Kada je CD73 vezan za površinu, inhibicija može da se ostvari premošćavanjem susednih dimera CD73 ili sternim blokiranjem jednovalentno vezanih IgG ili Fab/xFd (crveno) kompleksa.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0141] Predmetno otkriće obezbeđuje izolovane vezujuće molekule ili njihove antigenvezujuće fragmente koji se specifično vezuju za CD73. U nekim aspektima, takvi molekuli su antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za CD73. Takođe su obezbeđeni srodni polinukleotidi, vektori, farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-CD73 antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente. Takođe su obezbeđeni postupci za pravljenje, kao i postupci za korišćenje ovde otkrivenih anti-CD73 antitela i antigen-vezujućih fragmenata, na primer, dijagnostički postupci i postupci za lečenje kancera kod ispitanika (kao direktna terapija, adjuvantna terapija ili kombinovana terapija). Otkriće takođe obezbeđuje konjugate antitelo-lek dobijene od CD73 vezujućih molekula koji su ovde otkriveni. Otkriće dalje obezbeđuje terapeutske kombinacije koje obuhvataju anti-CD73 antitela (npr. MEDI9447) i jedan ili više agensa koji ciljaju dodatne aspekte ciklusa imuniteta kancera, kao što su anti-PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela (npr. MEDI4736), anti-CTLA4
4
antitela; i postupke za korišćenje takvih kombinacija za smanjenje tumorski posredovane imunosupresije.
[0142] Kako bi se predmetno otkriće lakše razumelo, prvo će biti definisani neki pojmovi. Dodatne definicije su date tokom detaljnog opisa.
I. Definicije
[0143] Pre detaljnog opisa ovog pronalaska, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na specifične supstance ili procesne korake, jer oni mogu da budu različiti. Kako se koriste u ovoj specifikaciji i dodatnim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju odgovarajuću množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Pojmovi „jedan“, kao i pojmovi „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ ovde se mogu koristiti naizmenično.
[0144] Osim toga, „i/ili“, kada se ovde koristi, treba razumeti kao specifično otkriće svake od dve naznačene karakteristike ili komponente sa onom drugom ili bez nje. Dakle, pojam „i/ili“, kako se koristi u frazi kao što je „A i/ili B“, ovde je predviđen da obuhvati „A i B“, „A ili B“, (samo) „A“ i (samo) „B“. Slično tome, termin „i/ili“, kako se koristi u frazi poput „A, B i/ili C“, treba da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B i C; A, B, ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; (samo) A; (samo) B; i (samo) C.
[0145] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je poznato osobi sa uobičajenim znanjima u oblasti na koju se otkriće odnosi. Na primer, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2. izd., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3. izd., 1999, Academic Press; i the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, pružaju osobi sa veštinama opšti rečnik mnogih termina koji se koriste u ovom otkriću.
[0146] Jedinice, prefiksi i simboli su naznačeni u svom obliku prihvaćenom prema Međunarodnom sistemu jedinica (SI). Numerički rasponi uključuju brojeve koji definišu raspon. Osim ako nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence se pišu sleva nadesno u smeru amino prema karboksi. Ovde dati naslovi ne predstavljaju ograničenja različitih aspekata, koji se mogu dobiti uvidom u specifikaciju kao celinu. Shodno tome, termini koji su neposredno definisani u nastavku su potpunije definisani uvidom u specifikaciju u celini.
[0147] Jasno je da uvek kada su aspekti ovde opisani izrazom „obuhvata“, analogni aspekti opisani terminima „sastoji se od“ i/ili „suštinski se sastoji od“ su takođe obezbeđeni.
[0148] Aminokiseline koje se ovde pominju bilo u vidu opšte poznatih simbola od tri slova ili simbola od jednog slova preporučenih od strane IUPAC-IUB Komisije za biohemijsku nomenklaturu (IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission). Slično tome, nukleotidi se označavaju svojim opšteprihvaćenim jednoslovnim šiframa.
[0149] Termin „CD73 polipeptid“, kako se ovde koristi, odnosi se na protein CD73 (klaster diferencijacije 73), koji se u literaturi naziva i 5'-nukleotidaza (5'-NT) ili ekto-5'-nukleotidaza, koji je kodiran NT5E genom. Vidite, npr. Misumi et al. Eur. J. Biochem. 191(3): 563-9 (1990). Odgovarajuće sekvence humanih i mišjih oblika CD73 su dostupne u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojevima P21589, odnosno Q61503. Pri definisanju bilo kog epitopa CD73 antitela, korišćena numeracija aminokiselina predstavlja aminokiselinski ostatak zrelog CD73 proteina koji ne sadrži ostatke signalne sekvence. Shodno tome, aminokiseline Val144, Lys180 i Asn185 koje vezuju antitelo, na primer, označavaju aminokiselinske pozicije nakon cepanja signalne sekvence, tj. aminokiseline u zrelom proteinu.
[0150] Primer CD73 polipeptida je obezbeđen u nastavku:
[0151] Identifikovani su rastvorljivi i membranski vezani oblici CD73. Vidite Klemens et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 172(3):1371-7 (1990). Pored toga, identifikovano je nekoliko različitih izoenzima. Vidite Rosi et al. Life Sci. 62(25):2257-66 (1998). CD73 protein kompletne dužine sadrži 574 aminokiseline. Zreli protein CD73 nastaje nakon uklanjanja signalne sekvence (pozicije 1 do 26) i C-terminalnog regiona propeptida (pozicije 550-574). Pored toga, aminokiseline 404 do 453 uklanjaju se u izoobliku 2 CD73 nakon alternativnog splajsovanja. Poznate su i prirodne varijante, na primer, varijanta C358Y, varijanta T376A i varijanta M379T. Vidite Misumi et al., Eur. J. Biochem. 191:563-569 (1990); Otsuki et al. DNA Res. 12:117-126 (2005); Mungall et al. Nature 425:805-811 (2003); Hansen et al. Gene 167:307-312 (1995); Klemens et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.
172:1371-1377 (1990); Knapp et al. Structure 20:2161-2173 (2012); ili St. Hilaire et al. N. Engl. J. Med.364:432-442 (2011).
[0152] Uobičajene bolesti koje dovode do promene pacijentovog nivoa CD73 u intersticijalnoj tečnosti, naročito u serumu su: povreda tkiva, reperfuzione povrede usled infarkta miokarda ili moždanog udara, transplantacija organa ili drugi hirurški zahvati; kancer ili metastaze kancera; ili inflamatorna stanja usled gorepomenutih trauma ili reperfuzionih povreda ili hroničnih stanja uključujući alergijska stanja, autoimune bolesti i inflamatorne bolesti. Kao primere takvih hroničnih stanja možemo pomenuti artritis, alergijska stanja kao što je astma, inflamatorna stanja kao što je inflamatorna bolest creva ili inflamatorno stanje kože, psorijazu, Parkinsonovu bolest, Alchajmerovu bolest, autoimune bolesti, dijabetes tip I ili tip II, aterosklerozu, multiplu sklerozu, Kronovu bolest, ili reakciju odbacivanja usled transplantacije organa. Naročito inflamatorne bolesti sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), akutna povreda pluća (ALI), multiorganska disfunkcija (MOF), ishemijska reperfuziona povreda (IRI) i neželjene reakcije na lek (ADRS) dovode do promene CD73 proteina intersticijalne tečnosti. Shodno tome, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli takođe mogu da se koriste, na primer, za lečenje ili dijagnostikovanje kancera (npr. kancera debelog creva, melanoma, kancera dojke, limfoma, nemikrocelularnog karcinoma pluća, Hodžkinovog limfoma, non-Hodžkinovog limfoma i Burkitovog limfoma, kancera jajnika, kancera dojke, kancera glave i vrata, i kancera pankreasa). Pored toga, merenje nivoa CD73 u uzorku dobijenom od pacijenta (npr. intersticijalna tečnost) pomoću ovde otkrivenih CD73-vezujućih molekula može da se koristi za praćenje razvoja prethodno opisanih bolesti, za procenu delotvornosti terapija, za odabir pacijenata za lečenje određenom terapijom, ili za donošenje medicinskih odluka, na primer, započinjanje, završetak, prekid ili modifikovanje određenog lečenja.
[0153] Pojmovi „inhibirati“, „blokirati“, „suzbiti“ i njihove gramatičke varijante ovde se koriste naizmenično, i označavaju bilo koje statistički značajno smanjenje biološke aktivnosti, uključujući potpuno blokiranje aktivnosti. Na primer, „inhibicija“ može da se odnosi na smanjenje biološke aktivnosti od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. Shodno tome, kada se termini „inhibicija“ ili „suzbijanje“ koriste za opisivanje, npr. dejstva na enzimsku aktivnost CD73, termin se odnosi na sposobnost anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta da statistički značajno smanje aktivnost 5'-nukleotidaze CD73 (katabolizacija hidrolize adenozin monofosfata, AMP, u adenozin), u odnosu na CD73-posredovanu aktivnost 5'-nukleotidaze u netretiranoj (kontrolnoj) ćeliji. Ćelija koja eksprimira CD73 može biti ćelija ili ćelijska linija koja se javlja u prirodi (npr. ćelija kancera), ili može rekombinantno da se proizvede uvođenjem nukleinske kiseline koja kodira CD73 u ćeliju domaćina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment mogu statistički značajno da smanje aktivnost 5'-nukleotidaze rastvorljivog oblika CD73 u biološkoj tečnosti. U jednom aspektu, anti-CD73 vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, inhibira CD73-posredovanu aktivnost 5'-nuklotidaze za najmanje 10%, najmanje 15%, ili najmanje 20%, najmanje 25%, ili najmanje 30%, najmanje 35%, ili najmanje 40%, najmanje 45%, ili najmanje 50%, najmanje 55%, ili najmanje 60%, najmanje 65%, ili najmanje 70%, najmanje 75%, ili najmanje 80%, najmanje 85%, ili najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje oko 100%, kako je utvrđeno, na primer, postupcima koji su opisani u Primerima u nastavku i/ili postupcima koji su poznati u struci.
[0154] Termin „suzbijanje aktivnosti CD73“, kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, da značajno smanji CD73-zavisnu aktivnost 5'-nukleotidaze u ćeliji koja eksprimira CD73 ili uzorku koji sadrži CD73. U nekim aspektima, suzbijanje aktivnosti CD73 može biti smanjenje od najmanje 10%, ili najmanje 15%, ili najmanje 20%, ili najmanje 25%, ili najmanje 30%, ili najmanje 35%, ili najmanje 40%, ili najmanje 45%, ili najmanje 50%, ili najmanje 55%, ili najmanje 60%, ili najmanje 65%, ili najmanje 70%, ili najmanje 75%, ili najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 95%, ili oko 100% kada su ćelije ili uzorak dovedeni u kontakt sa anti-CD73 vezujućim molekulom, npr. antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom iz predmetnog otkrića, u odnosu na aktivnost CD73 izmerenu u odsustvu anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta (kontrolni uslovi).
[0155] Termini „antitelo“ ili „imunoglobulin“, kako se ovde naizmenično koriste, uključuju cela antitela i bilo koji njihov antigen-vezujući fragment ili pojedinačne lance.
[0156] Tipično antitelo obuhvata bar dva teška (eng. H) lanca i dva laka lanca (eng. L) međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac obuhvata varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao VH ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2, i CH3. Svaki laki lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao VL ili VL) i konstanti region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni se mogu dalje podeliti na hipervarijabilne regione, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (eng. CDR), isprekidane regionima koji su više konzervisani, nazvanim regioni okvira (eng. FW). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FW, raspoređenih od amino terminalnog do karboksi terminalnog kraja po sledećem rasporedu: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa. Primeri za antitela iz predmetnog otkrića uključuju anti-CD73 antitela (originalna i germinatizovana), afinitetno optimizovane klonove, optimizovana antitela kojima nedostaje ADCC, konjugovana antitela (npr. ADC) i druga optimizovana antitela (npr. antitela sa optimizovanim poluživotom u serumu uključujući, na primer, YTE mutacije, vidite Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-24 (2006) i U.S. patent br.7,083,784).
[0157] Pojam „germinacija“ znači da su aminokiseline na specifičnim pozicijama u antitelu mutirale unazad do onih u germinativnoj liniji.
[0158] Termin „antitelo“ označava molekul imunoglobulina koji prepoznaje cilj i specifično se vezuje za cilj, kao što je protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, ili kombinacija gorepomenutog putem najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena u varijabilnom regionu molekula imunoglobulina. Kako se ovde koristi, termin „antitelo“ obuhvata intaktna poliklonska antitela, intaktna monoklonska antitela, fragmente antitela (kao što su fragmenti Fab, Fab', F(ab')2 i Fv), jednolančane Fv (scFv) mutante, multispecifična antitela, kao što su bispecifična antitela nastala od najmanje dva intaktna antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzione proteine koji obuhvataju antigen determinišući deo antitela i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji obuhvata mesto za prepoznavanje antigena, sve dok antitelo ispoljava željenu biološku aktivnost.
[0159] Antitelo može biti bilo koje od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM ili njihovih potklasa (izotipova) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identičnosti njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama, odnosno mu. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije. Antitela mogu biti gola ili konjugovana sa drugim molekulima kao što su toksini, radioizotopi, itd. radi građenja ADC.
[0160] „Blokirajuće“ antitelo ili „antagonističko“ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena koji vezuje, kao što je CD73. U određenom aspektu, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela u velikoj meri ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena. Poželjno je da je biološka aktivnost smanjena za najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili čak 100%.
[0161] Termini „CD73 antitelo“, „antitelo koje se vezuje za CD73“ ili „anti-CD73“ odnose se na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji je sposoban za vezivanje za CD73 sa dovoljnim afinitetom tako da je molekul koristan kao terapeutski agens ili dijagnostički reagens za ciljanje CD73. Stepen vezivanja anti-CD73 antitela za nepovezani protein koji nije CD73 je manji od oko 10% vezivanja antitela za CD73 kako je izmereno, npr. pomoću radioimunološkog testa (RIA), BIACORE™ (koristeći rekombinantni CD73 kao analit i antitelo kao ligand, ili obrnuto) ili drugih testova vezivanja koji su poznati u struci. U određenim aspektima, antitelo koje vezuje CD73 ima konstantu disocijacije (KD) ≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0,1 nM, ≤10 pM, ≤1 pM ili ≤0,1 pM. Termin „anti-CD73“ takođe uopšteno obuhvata molekule koji sadrže, npr. CDR ovde otkrivenih antitela uključene u konstrukciju. Dakle, fraza „izolovani vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CD73“ odnosila bi se ne samo na antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente, već i na molekul koji sadrži, na primer, jednu ili više konstrukcija (kao što je domen fibronektina III iz fibronektina ili tenascina-3) uključenu u CDR ovde opisanih antitela. Vidite, na primer, U.S. patentnu publikaciju Br.20150098955.
4
[0162] U jednom otelotvorenju, anti-CD73 antitelo se odnosi na antitelo u formatu IgG1-TM tako da Fc domen IgG1 sadrži mutacije L234, L235E i P331, vezuje rastvorljivi CD73 i CD73 prikazan na ćelijskoj površini, i inhibira enzimsku aktivnost CD73. Slike 1A-1D daju nukleotidne i aminokiselinske sekvence VH i VL domena MED19447.
[0163] Pod „CTLA4 polipeptidom“ podrazumeva se polipeptid koji ima najmanje 85% identičnosti aminokiselinske sekvence sa GenBank AccessionAAL07473.1 ili njegovim fragmentom koji ima T ćelijsku inhibitorsku aktivnost. Sekvenca AAL07473.1 je obezbeđena u nastavku:
[0164] Pod „molekulom nukleinske kiseline CTLA4“ podrazumeva se polinukleotid koji kodira CTLA4 polipeptid. Primer sekvence molekula nukleinske kiseline CTLA4 obezbeđen je pod GenBank pristupnim br. AAL07473.
[0165] Pod „anti-CTLA4 antitelom“ podrazumeva se antitelo koje selektivno vezuje CTLA4 polipeptid. Primeri antiCTLA4 antitela su opisani, na primer, u US patentima br. 6,682,736; 7,109,003; 7,123,281; 7,411,057; 7,824,679; 8,143,379; 7,807,797; i 8,491,895 (tremelimumab je 11.2.1, u datom tekstu). Tremelimumab je primer za anti-CTLA4 antitelo. Sekvence tremelimumaba su ovde obezbeđene u spisku sekvenci u nastavku (SEQ ID NO: 130-137).
[0166] Pod „PD-1 polipeptidom“ podrazumeva se polipeptid ili njegov fragment koji ima najmanje oko 85% identičnosti aminokiselina sa NCBI pristupnim br. NP_005009 i ima PD-L1 i/ili PD-L2 vezujuću aktivnost. Sekvenca NP_005009 obezbeđena je u nastavku.
[0167] Pod „molekulom nukleinske kiseline PD-1“ podrazumeva se polinukleotid koji kodira PD-1 polipeptid. Primer za sekvencu molekula nukleinske kiseline PD-1 obezbeđen je pod NCBI pristupnim br. NM_005018.
[0168] Pod „anti-PD-1 antitelom“ podrazumeva se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji selektivno vezuje PD-1 polipeptid. Primeri za anti-PD-1 antitelo uključuju, na primer, pembrolizumab (KEYTRUDA®, lambrolizumab, MK-3475), nivolumab (OPDIVA®, BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538) ili AMP-224.
[0169] Pod „PD-L1 polipeptidom“ podrazumeva se polipeptid ili njegov fragment koji ima najmanje oko 85%, 95% ili 100% identičnosti aminokiselina sa NCBI pristupnim br. NP_001254635 i ima PD-1 i CD80 vezujuću aktivnost. Sekvenca NP_001254635 obezbeđena je u nastavku.
[0170] Pod „molekulom nukleinske kiseline PD-L1“ podrazumeva se polinukleotid koji kodira PD-L1 polipeptid. Primer za sekvencu molekula nukleinske kiseline PD-L1 obezbeđen je pod NCBI pristupnim br. NM_001267706.
[0171] Pod „anti-PD-L1 antitelom“ podrazumeva se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji selektivno vezuje PD-L1 polipeptid. Primeri za anti-PD-L1 antitela su opisani, na primer, u US20130034559 / US8779108 i US20140356353. MEDI4736 je primer za PD-L1 antitelo. Sekvence MEDI4736 su ovde obezbeđene u spisku sekvenci u nastavku (SEQ ID NO: 138-145).
[0172] Termin „antigen-vezujući fragment“ odnosi se na molekul koji sadrži deo netaknutog antitela, a naročito se odnosi na molekul koji sadrži varijabilne regione koji određuju antigenost netaknutog antitela. U struci je poznato da funkciju vezivanja antigena nekog antitela mogu da vrše fragmenti antitela pune dužine. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela i multispecifična antitela izgrađena od fragmenata antitela.
[0173] „Monoklonsko antitelo“ označava homogenu populaciju antitela uključenu u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje pojedinačne antigenske determinante ili epitopa. To je suprotno poliklonskim antitelima koja tipično uključuju različita antitela usmerena na različite antigenske determinante.
[0174] Pojam „monoklonsko antitelo“ uključuje i netaknuta i monoklonska antitela kompletne dužine kao i fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančane varijabilne fragmente (scFv), fuzione proteine koji obuhvataju deo antitela, i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji obuhvata mesto za prepoznavanje antigena. Nadalje, „monoklonsko antitelo“ se odnosi na takva antitela nastala na bilo koji način uključujući, bez ograničenja, hibridom, selekciju faga, rekombinantnu ekspresiju i transgene životinje (npr. ekspresija humanog antitela u transgenom mišu).
[0175] Pojam „humanizovano antitelo“ označava antitelo izvedeno iz nehumanog (npr. mišjeg) imunoglobulina, koje je inženjeringom obrađeno da obuhvata minimalne nehumane (npr. mišje) sekvence. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini kod kojih su ostaci CDR zamenjeni ostacima CDR nehumanih vrsta (npr. miš, pacov, zec ili hrčak) koji imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). U nekim slučajevima, aminokiselinski ostaci regiona okvira (FW) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ostacima u antitelu nehumanih vrsta koji imaju željenu specifičnost i/ili afinitet i/ili sposobnost.
[0176] Humanizovana antitela mogu dalje biti modifikovana supstitucijom dodatnih ostataka bilo u Fv regionu okvira i/ili unutar zamenjenih nehumanih ostataka da bi se poboljšala i optimizovala specifičnost antitela, afinitet i/ili sposobnost. Opšte uzeto, humanizovano antitelo će sadržati u znatnoj meri sve od najmanje jednog, a tipično dva ili tri, varijabilna
4
domena koji sadrže sve ili suštinski sve CDR regione koji odgovaraju nehumanom imunoglobulinu, dok su svi ili suštinski svi FR regioni oni sa sekvencom konsenzusa humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo može takođe da obuhvata najmanje deo konstantnog regiona ili domena (Fc) imunoglobulina, tipično humanog imunoglobulina. Primeri za metode koje se koriste za stvaranje humanizovanih antitela su opisani u U.S. Pat. br. 5,225,539 ili 5,639,641.
[0177] „Varijabilni region“ antitela označava varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo samog ili u kombinaciji. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sastoje se od četiri regiona FW povezana pomoću tri regiona CDR. CDR-i u svakom lancu se drže na okupu u neposrednoj blizini pomoću FW regiona i, sa CDR-ima iz drugih lanaca, doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela. Postoje bar dve tehnike za određivanje CDR: (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvence među vrstama (tj. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5. izd, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); i (2) pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigen-antitelo (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol.273:927-948)). Pored toga, kombinacija ova dva pristupa se nekad koristi u oblasti za određivanje CDR.
[0178] Kabatov sistem za numerisanje se uopšteno koristi kada se govori o ostatku varijabilnog domena (približno ostaci 1–107 lakog lanca i ostaci 1–113 teškog lanca) (npr. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
[0179] Fraze „numerisanje aminokiselinskih pozicija kao kod Kabata“, „Kabatova pozicija“, i njihove gramatičke varijante odnose se na sistem za numerisanje koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u publikaciji Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Koristeći ovaj sistem za numerisanje, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćenju ili umetanju u FW ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može sadržati pojedinačni aminokiselinski umetak (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 H2 i umetnute ostatke (npr. ostaci 82a, 82b i 82c itd. prema Kabatu) nakon ostatka teškog lanca FW 82.
TABELA 1
[0180] Kabatova numeracija ostataka može biti određeno za dato antitelo putem poravnanja homologih regiona sekvence antitela sa standardnom Kabatovom numeričkom sekvencom. Čotijina numeracija se umesto toga odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kraj Čotijine CDR-H1 petlje, kada se numeriše koristeći Kabatovu konvenciju za numeraciju, varira između H32 i H34, u zavisnosti od dužine petlje (ovo je zato što Kabatova šema za numerisanje postavlja umetke na H35A i H35B; ako ni 35A ni 35B nije prisutan, petlja se završava na 32; ako je prisutan samo 35A, petlja se završava na 33; ako su i 35A i 35B prisutni, petlja se završava na 34). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između Kabatovih CDR-a i Čotijinih strukturnih petlji, a koristi ih AbM softver za modelovanje antitela kompanije Oxford Molecular.
[0181] IMGT (ImMunoGeneTics) takođe predstavlja sistem numerisanja za varijabilne regione imunoglobulina, uključujući CDR-e. Vidite, npr. Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003). IMGT sistem za numerisanje je zasnovan na poravnanju više od 5000 sekvenci, strukturnim podacima i karakterizaciji hipervarijabilnih petlji, i omogućava lako poređenje varijabilnih i CDR regiona za sve vrste. Prema IMGT šemi za numerisanje, VH-CDR1 je na pozicijama 26 do 35, VH-CDR2 je na pozicijama 51 do 57, VH-CDR3 je na pozicijama 93 do 102, VL-CDR1 je na pozicijama 27 do 32, VL-CDR2 je na pozicijama 50 do 52 i VL-CDR3 je na pozicijama 89 do 97.
4
[0182] EU indeks ili EU sistem numeracije je zasnovan na rednom numerisanju prvog sekvenciranog humanog IgG (EU antitelo). Budući da je najčešća referenca za ovu konvenciju Kabatov priručnik sekvenci (Kabat et al., 1991), EU indeks se ponekad pogrešno koristi kao sinonim za Kabatov indeks. EU indeks ne obezbeđuje insercije i delecije, te tako u nekim slučajevima poređenje IgG pozicija između IgG potklasa i vrsta može biti nejasno, naročito u regionima šarke. Ipak, konvencija je bila dovoljna da omogući direktno poređenje između Fc regiona u brojnim studijama funkcije Fc strukture. Shodno tome, šema za numerisanje korišćena za supstitucije i insercije u Fc regionima u ovoj specifikaciji je EU indeks kao kod Kabata. Nasuprot tome, šema za numeraciju korišćena za varijabilne regione (VH i VL) u ovoj specifikaciji je uobičajena Kabatova numeracija.
[0183] Kako se koriste kroz specifikaciju, opisane sekvence VH CDR odgovaraju klasičnim lokacijama Kabatovog numerisanja, naime Kabatov VH-CDR1 je na pozicijama 31-35, VH-CDR2 je na pozicijama 50-65 i VH-CDR3 je na pozicijama 95-102. VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 takođe odgovaraju klasičnim lokacijama Kabatovog numerisanja, naime pozicijama 24-34, 50-56, odnosno 89-97.
[0184] Kako se ovde koristi, Fc region uključuje polipeptide koji sadrže konstantni region antitela bez prvog konstantnog regiona domena imunoglobulina. Tako, Fc se odnosi na poslednja dva konstantna regiona domena imunoglobulina IgA, IgD i IgG, i poslednja tri konstantna regiona domena imunoglobulina IgE i IgM, i fleksibilni N-terminal šarke za ove domene. Za IgA i IgM, Fc može da uključuje J lanac. Za IgG, Fc obuhvata imunoglobulinske domene Cgama2 i Cgama3 (Cγ2 i Cγ3) i šarku između Cgama1 (Cγ1) i Cgama2 (Cγ2).
[0185] Iako granice Fc regiona mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG obično je definisan tako da sadrži ostatke C226 ili P230 prema svom karboksi terminusu, pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je prikazan kod Kabata (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Fc može da se odnosi na ovaj region sam po sebi, ili ovaj region u kontekstu antitela, fragmenta antitela ili Fc fuzionog proteina. Polimorfizmi su uočeni kod određenog broja različitih Fc pozicija, uključujući, bez ograničenja, pozicije 270, 272, 312, 315, 356 i 358 numerisane pomoću EU indeksa, i stoga mogu postojati neznatne razlike između predstavljenih sekvenci i sekvenci iz prethodnog stanja tehnike.
4
[0186] Termin „humano antitelo“ označava antitelo koje proizvodi čovek ili antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu koje proizvodi čovek napravljeno koristeći bilo koju tehniku poznatu u struci (npr. rekombinantna ekspresija u uzgajanim ćelijama, ili ekspresija u transgenim životinjama). Prema tome, termin humano antitelo takođe obuhvata antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu koje originalno proizvodi čovek (ili njegovoj konstruisanoj varijanti ili derivatu) ali je eksprimirano u nehumanom sistemu (npr. proizvedeno hemijskom sintezom; rekombinantno eksprimirano u ćelijama mikroba, sisara ili insekata; ili eksprimirano kod životinjskog ispitanika). Shodno tome, antitelo koje je dobijeno od humanog ispitanika ili iz humanih ćelija (npr. hibridom ili ćelijska linija koja eksprimira rekombinantno antitelo ili njegov fragment) i zatim eksprimirano u životinji, npr. mišu, smatra se humanim antitelom. Ova definicija humanog antitela uključuje intaktna ili antitela pune dužine, njihove fragmente i/ili antitela koja obuhvataju bar jedan humani teški i/ili laki lanac polipeptida kao što je, na primer, antitelo koje obuhvata mišji laki lanac i humani teški lanac polipeptida.
[0187] Termin „himerna antitela“ odnosi se na antitela u kojima je aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina dobijena od dve ili više životinjskih vrsta. Tipično, varijabilni region lakog i teškog lanca odgovara varijabilnom regionu antitela izvedenih od jedne vrste sisara (npr. miš, pacov, zec, itd.) sa željenom specifičnošću i/ili afinitetom, i/ili sposobnošću dok su konstantni regioni homologni sekvencama kod antitela izvedenih od druge vrste (obično čovek) kako bi se izbeglo izazivanje imunskog odgovora kod te vrste.
[0188] Termin „epitop“, kako se ovde koristi, odnosi se na antigenu determinantu proteina koja je sposobna da se vezuje za ovde otkriveno CD73 antitelo ili CD73 vezujući molekul. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula, kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci, i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Deo antitela ili vezujućeg molekula koji prepoznaje epitop naziva se paratop. Epitopi proteinskih antigena su podeljeni u dve kategorije, konformacioni epitopi i linearni epitopi, na osnovu svoje strukture i interakcije sa paratopom. Konformacioni epitop je sačinjen od diskontinualnih delova aminokiselinske sekvence antigena. Ovi epitopi interaguju sa paratopom na osnovu 3-D karakteristika površine i oblika, ili tercijarne strukture antigena. Nasuprot tome, linearni
4
epitopi interaguju sa paratopom na osnovu svoje primarne strukture. Linearni epitop gradi kontinualna sekvenca aminokiselina iz antigena.
[0189] Termin „mesto vezivanja antitela“ odnosi se na region u antigenu (npr. CD73) koji sadrži kontinualno ili diskontinualno mesto (tj. epitop) za koje se specifično vezuje komplementarno antitelo. Dakle, mesto vezivanja antitela može da sadrži dodatne oblasti u antigenu koje su izvan epitopa, i koje mogu da odrede svojstva kao što su afinitet vezivanja i/ili stabilnost, ili da utiču na svojstva kao što su enzimska aktivnost antigena ili dimerizacija. Prema tome, čak i ako se dva antitela vezuju za isti epitop u antigenu, ako molekuli antitela uspostavljaju posebne intermolekulske kontakte sa aminokiselinama izvan epitopa, smatra se da se takva antitela vezuju za različita mesta vezivanja antitela.
[0190] „Afinitet vezivanja“ se uopšteno odnosi na snagu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera za vezivanje (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y uopšteno se može predstaviti konstantom disocijacije (KD). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u predmetnoj oblasti, uključujući one koji su ovde opisani. Antitela malog afiniteta obično polako vezuju antigen i lako se otpuštaju, dok antitela velikog afiniteta obično brže vezuju antigen i duže ostaju vezana. Različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja su poznati u struci, i bilo koji od njih može da se koristi u svrhe predmetnog otkrića.
[0191] „Potentnost“ se obično izražava kao vrednost IC50, u nM, ako nije drugačije navedeno. IC50je medijana inhibitorne koncentracije antigen-vezujućeg molekula. U funkcionalnim testovima, IC50je koncentracija koja umanjuje biološki odgovor za 50% u odnosu na njegov maksimum. U studijama vezivanja liganda, IC50je koncentracija koja smanjuje vezivanje receptora za 50% u odnosu na specifični maksimalni nivo vezivanja. IC50može biti izračunat na bilo koji način poznat u struci. Poboljšanje potentnosti može da se utvrdi merenjem, npr. u odnosu na matično antitelo (na primer, matično antitelo pre germinatizacije ili matično antitelo pre afinitetne optimizacije).
4
[0192] Stepen poboljšanja potentnosti za antitela ili polipeptide iz predmetnog otkrića u poređenju sa matičnim antitelom može biti najmanje oko 2 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 15 puta, najmanje oko 20 puta, najmanje oko 25 puta, najmanje oko 30 puta, najmanje oko 40 puta, najmanje oko 50 puta, najmanje oko 60 puta, najmanje oko 70 puta, najmanje oko 80 puta, najmanje oko 90 puta, najmanje oko 100 puta, najmanje oko 110 puta, najmanje oko 120 puta, najmanje oko 130 puta, najmanje oko 140 puta, najmanje oko 150 puta, najmanje oko 160 puta, najmanje oko 170 puta, ili najmanje oko 180 puta, ili više.
[0193] „Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ označava oblik citotoksičnosti u kome izlučeni imunoglobulini vezani za Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelijama prirodnim ubicama (NK), neutrofilima i makrofagima) omogućava tim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vezuju za ciljnu ćeliju koja nosi antigen, i da zatim ubiju ciljnu ćeliju citotoksinima. Specifična IgG antitela sa visokim afinitetom usmerena na površinu ciljnih ćelija „naoružavaju“ citotoksične ćelije, i apsolutno su potrebna za to ubijanje. Liza ciljne ćelije je ekstracelularna, zahteva neposredan kontakt između ćelija, i ne uključuje komplement. Smatra se da će, osim antitela, i drugi proteini koji sadrže Fc regione, posebno Fc fuzioni proteini, koji imaju sposobnost specifičnog vezivanja za ciljnu ćeliju koja nosi antigen, moći da vrše ćelijski posredovanu citotoksičnost. Radi jednostavnosti, ćelijski posredovana citotoksičnost koja je rezultat aktivnosti Fc fuzionog proteina ovde se takođe naziva i ADCC aktivnost.
[0194] Polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koja je „izolovana“ je polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija, ili kompozicija koji je u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili smeše uključuju one koji su prečišćeni do stepena da više nisu u obliku u kome se nalaze u prirodi. U nekim aspektima, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koja je izolovana su u osnovi čisti.
[0195] Termin „ispitanik“ odnosi se na bilo koju životinju (npr. sisara), uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, primate koji nisu ljudi, glodare i slično, koja će primiti određeno lečenje. Termini „ispitanik“ i „pacijent“ ovde se uobičajeno koriste naizmenično da se označi humani ispitanik.
4
[0196] Termin „farmaceutska kompozicija“ odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da dozvoljava da biološka aktivnost aktivnog sastojka (npr. anti-CD73 vezujućeg molekula koji je ovde otkriven) bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će kompozicija biti primenjena. Takva kompozicija može biti sterilna.
[0197] „Delotvorna količina“ anti-CD73 vezujućeg molekula kako je ovde otkriven je količina dovoljna da se postigne naročito navedena svrha. „Efikasna količina“ može biti određena empirijski i na rutinski način, u odnosu na navedenu svrhu.
[0198] Termin „terapeutski delotvorna količina“ odnosi se na količinu ovde otkrivenog anti-CD73 vezujućeg molekula ili drugog leka delotvornu za „lečenje“ bolesti ili poremećaja kod ispitanika ili sisara.
[0199] Reč „oznaka“, kada se ovde koristi, odnosi se na detektabilno jedinjenje ili kompoziciju koja je direktno ili indirektno spojena (npr. genetski spojena) ili konjugovana (npr. hemijski konjugovana) sa ovde otkrivenim anti-CD73 vezujućim molekulom kako bi se stvorio „označeni“ anti-CD73 vezujući molekul. Oznaka može biti detektabilna sama po sebi (npr. radioizotopske oznake ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimske oznake, može da katalizuje hemijsku izmenu supstratskog jedinjenja ili kompozicije koja je detektabilna.
[0200] Termini kao što su „grupa koja može da se derivatizuje“ i „funkcionalna grupa koja može da se derivatizuje“ koriste se naizmenično, i označavaju funkcionalnu grupu koja može da reaguje da omogući nastanak kovalentne veze između ovde otkrivenog anti-CD73 vezujućeg molekula (npr. CD73 antitelo) i druge supstance. U nekim aspektima, takva supstanca je terapeutski agens (npr. citotoksin), detektabilna oznaka, polimer (npr. PEG), itd. Primeri za grupe koje mogu da se derivatizuju uključuju tiol, hidroksil, amino, karboksil i amid, kao i njihove modifikovane oblike, kao što su aktivirani ili zaštićeni oblici.
[0201] Termini kao što su „lečenje“ ili „lečiti“ ili „ublažavanje“ ili „ublažiti“ odnose se istovremeno na (1) terapeutske mere koje leče, usporavaju, oslabljuju simptome i/ili zaustavljaju progresiju dijagnostikovanog patološkog stanja ili poremećaja, i (2) profilaktičke ili preventivne mere koje sprečavaju i/ili usporavaju razvoj ciljnog patološkog stanja ili poremećaja. Dakle, oni kojima je potrebno lečenje obuhvataju pacijente koji već imaju poremećaj; one koji su skloni tome da imaju poremećaj; i one kod kojih taj poremećaj treba sprečiti. U određenim aspektima, ispitanik je uspešno „lečen“ od kancera u skladu sa postupcima iz predmetnog otkrića ako pacijent pokazuje, npr. potpunu, delimičnu ili prolaznu remisiju određene vrste kancera.
[0202] Termini „kancer“, „tumor“, „kancerozni“ i „maligni“ označavaju ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje je uobičajeno okarakterisano neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri za kancer uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinome koji uključuju adenokarcinome, limfome, blastome, melanome, sarkome i leukemije. Konkretniji primeri za takve kancere uključuju kancer skvamoznih ćelija, mikrocelularni karcinom pluća, nemikrocelularni karcinom pluća, gastrointestinalni kancer, Hodžkinov i non-Hodžkinov limfom, kancer pankreasa, glioblastom, gliom, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer jetre kao što je hepatički karcinom i hepatom, kancer bešike, kancer dojke (uključujući hormonski posredovani kancer dojke, vidite, npr. Innes et al. (2006) Br. J. Cancer 94:1057-1065), kancer debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma, mijelom (kao što je multipli mijelom), karcinom pljuvačne žlezde, kancer bubrega kao što je karcinom bubrežnih ćelija i Vilmsov tumor, karcinom bazalnih ćelija, melanom, kancer prostate, kancer vulve, tiroidni kancer, kancer testisa, kancer jednjaka, različite vrste kancera glave i vrata i kancere mucinoznog porekla, kao što su mucinozni kancer jajnika, holangiokarcinom (jetra) i bubrežni papilarni karcinom. U nekim aspektima, termin kancer, kako se ovde koristi, specifično se odnosi na kancer koji eksprimira CD73. U nekim specifičnim aspektima, termin kancer se odnosi na kancere koji eksprimiraju niske nivoe CD73. U nekim aspektima, termin kancer, kako se ovde koristi, specifično se odnosi na kancer koji eksprimira CD73 (npr. kancer debelog creva, kancer dojke, limfom, nemikrocelularni karcinom).
[0203] „Polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“, kako se ovde naizmenično koristi, odnosi se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i uključuje DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi ili bilo koji supstrat koji može biti uključen u polimer uz pomoć DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotid može da obuhvati modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Prethodni opis se odnosi na sve polinukleotide označene ovde, uključujući RNK i DNK.
1
[0204] Termin „vektor“ označava konstrukt koji je sposoban da isporuči, i u nekim aspektima, eksprimira, jedan ili više gena ili sekvenci od interesa u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, ogoljene vektore za ekspresiju DNK ili RNK, plazmide, kozmide ili vektore faga, vektore za ekspresiju DNK ili RNK povezane sa katjonskim kondenzujućim agensima, vektore za ekspresiju DNK ili RNK enkapsuliranih u lizozomima i nekim eukariotskim ćelijama, kao što su produkujuće ćelije.
[0205] Pojmovi „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ se ovde naizmenično koriste da označe polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline i može biti isprekidan neaminokiselinama. Pojmovi takođe obuhvataju aminokiselinski polimer koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidacija, acetilacija, fosforilacija ili bilo koja druga manipulacija ili izmena, kao što je konjugacija sa označenim sastojkom. Uključeni takođe u definiciju su, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline itd.), kao i druge izmene poznate u predmetnoj oblasti. Podrazumeva se da, budući da su polipeptidi iz predmetnog otkrića zasnovani na antitelima, u određenim aspektima, polipeptidi mogu da se jave kao pojedinačni lanci ili povezani lanci.
[0206] „Rekombinantni“ polipeptid ili protein odnosi se na polipeptid ili protein proizveden tehnologijom rekombinantne DNK. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u konstruisanim ćelijama domaćina smatraju se izolovanim, kao i nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani, ili delimično ili značajno prečišćeni putem bilo koje odgovarajuće tehnike. Ovde otkriveni polipeptidi mogu se rekombinantno proizvesti upotrebom postupaka poznatih u struci. Alternativno, ovde otkriveni proteini i peptidi mogu se hemijski sintetisati.
[0207] Termin „aminokiselinska supstitucija“ odnosi se na zamenu aminokiselinskog ostatka prisutnog u matičnoj sekvenci drugim aminokiselinskim ostatkom. Aminokiselina može biti supstituisana u matičnoj sekvenci, na primer, hemijskom sintezom peptida ili rekombinantnim postupcima poznatim u struci. Shodno tome, reference na „supstituciju na poziciji X“ ili „supstitucija na poziciji X“ odnosi se na supstituciju aminokiseline prisutne na poziciji X alternativnim aminokiselinskim ostatkom. U nekim aspektima, obrasci supstitucije mogu da se opišu prema šemi AXY, pri čemu je A jednoslovni kod koji odgovara
2
aminokiselini koja je prirodno prisutna na poziciji X, a Y je supstituišući aminokiselinski ostatak. U drugim aspektima, obrasci supstitucije mogu da se opišu prema šemi XY, pri čemu je Y jednoslovni kod koji odgovara aminokiselinskom ostatku koji supstituiše aminokiselinu koja je prirodno prisutna na poziciji X.
[0208] „Konzervativna aminokiselinska supstitucija“ je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, ako je aminokiselina u polipeptidu zamenjena drugom aminokiselinom iz iste familije bočnih lanaca, supstitucija se smatra konzervativnom. U drugom aspektu, niz aminokiselina može konzervativno da se zameni strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova familije bočnih lanaca.
[0209] Nekonzervativne supstitucije uključuju one u kojima (i) ostatak koji ima elektropozitivni bočni lanac (npr. Arg, His ili Lys) supstituiše elektronegativni ostatak (npr. Glu ili Asp), ili je njime supstituisan, (ii) hidrofilni ostatak (npr. Ser ili Thr) supstituiše hidrofobni ostatak (npr. Ala, Leu, Ile, Phe ili Val), ili je njime supstituisan, (iii) cistein ili prolin supstituiše bilo koji drugi ostatak, ili je njime supstituisan, ili (iv) ostatak koji ima glomazni hidrofobni ili aromatični bočni lanac (npr. Val, His, Ile ili Trp) supstituiše ostatak sa manjim bočnim lancem (npr. Ala, Ser) ili bez bočnog lanca (npr. Gly), ili je njime supstituisan.
[0210] Osobe sa uobičajenim znanjem mogu lako da identifikuju druge supstitucije. Na primer, za aminokiselinu alanin, supstitucija može biti sa bilo kojim od D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteina i D-cisteina. Za lizin, zamena može biti bilo koji od D-lizina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, omitina ili D-ornitina. Uopšteno, supstitucije u funkcionalno važnim regionima za koje može da se očekuje da indukuju promene u svojstvima izolovanih polipeptida su one u kojima (i) polarni ostatak, npr. serin ili treonin, supstituiše hidrofobni ostatak, npr. leucin, izoleucin, fenilalanin ili alanin (ili je njime supstituisan); (ii) cisteinski ostatak supstituiše bilo koji drugi ostatak (ili je njime supstituisan); (iii) ostatak koji ima elektropozitivni bočni lanac, npr. lizin, arginin ili histidin, supstituiše ostatak koji ima elektronegativni bočni lanac, npr. glutaminsku kiselinu ili asparaginsku kiselinu (ili je njime supstituisan); ili (iv) ostatak koji ima glomazni bočni lanac, npr. fenilalanin, supstituiše ostatak koji nema takav bočni lanac, npr. glicin (ili je njime supstituisan). Verovatnoća da jedna od prethodnih nekonzervativnih supstitucija može da izmeni funkcionalna svojstva proteina je takođe povezana sa pozicijom supstitucije u odnosu na funkcionalno značajne regione proteina: neke nekonzervativne supstitucije mogu shodno tome imati malo ili nepostojeće dejstvo na biološka svojstva.
[0211] Termin „insercija aminokiselina“ odnosi se na uvođenje novog aminokiselinskog ostatka između dva aminokiselinska ostatka prisutna u matičnoj sekvenci. Aminokiselina može biti umetnuta u matičnu sekvencu, na primer, hemijskom sintezom peptida ili rekombinantnim postupcima poznatim u struci. U skladu sa tim kako se ovde koriste, fraze „insercija između pozicija X i Y“ ili „insercija između Kabatovih pozicija X i Y“, pri čemu X i Y odgovaraju aminokiselinskim pozicijama (npr. insercija aminokiseline cisteina između pozicija 239 i 240), odnose se na inserciju aminokiseline između pozicija X i Y, i takođe na inserciju u sekvenci nukleinske kiseline kodona koji kodira aminokiselinu između kodona koji kodiraju aminokiseline na pozicijama X i Y. Obrasci insercije mogu da se opišu prema šemi AXins, pri čemu je A jednoslovni kod koji odgovara aminokiselini koja su ubacuje, a X je pozicija koja prethodi inserciji.
[0212] Termin „procenat identičnosti sekvence“ između dve sekvence polipeptida ili polinukleotida odnosi se na broj identičnih uparenih pozicija koje sekvence dele u okviru za poređenje, uzimajući u obzir adicije ili delecije (tj. praznine) koje moraju da se uvedu za optimalno poravnanje dve sekvence. Uparena pozicija je bilo koja pozicija na kojoj je identični nukleotid ili aminokiselina prisutna i u ciljnoj i u referentnoj sekvenci. Praznine predstavljene u ciljnoj sekvenci se ne broje ,pošto praznine nisu nukleotidi ili aminokiseline. Isto tako, praznine predstavljene u referentnoj sekvenci se ne broje, pošto se broje nukleotidi ili aminokiseline ciljne sekvence, ne nukleotidi ili aminokiseline iz referentne sekvence.
[0213] Procenat identičnosti sekvence se izračunava utvrđivanjem broja pozicija na kojima se identični aminokiselinski ostatak ili baza nukleinske kiseline javlja u obe sekvence kako bi se dobio broj uparenih pozicija, uz deljenje broja uparenih pozicija ukupnim brojem pozicija u
4
okviru za poređenje i množenjem rezultata sa 100, kako bi se dobio procenat identičnosti sekvence. Poređenje sekvenci i utvrđivanje procenta identičnosti sekvence između dve sekvence može da se postigne koristeći lako dostupni softver za onlajn upotrebu i za preuzimanje. Odgovarajući softverski programi su dostupni iz različitih izvora, za poravnanje sekvenci proteina i nukleotida. Jedan odgovarajući program za određivanje procenta identičnosti sekvence je bl2seq, deo BLAST paketa programa koji je dostupan na veb stranici BLAST nacionalnog centra za biotehnološke informacije vlade SAD (U.S. government's National Center for Biotechnology Information BLAST) (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq vrši poređenje između dve sekvence koristeći algoritam BLASTN ili BLASTP. BLASTN se koristi za poređenje sekvenci nukleinskih kiselina, dok se BLASTP koristi za poređenje sekvenci aminokiselina. Drugi odgovarajući programi su, npr. Needle, Stretcher, Water ili Matcher, deo EMBOSS paketa bioinformatičkih programa i takođe su dostupni od Evropskog instituta za bioinformatiku (EBI) na www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
[0214] Različiti regioni u jednoj ciljnoj sekvenci polinukleotida ili polipeptida koja se poravnava sa referentnom sekvencom polinukleotida ili polipeptida mogu da imaju sopstvene procente identičnosti sekvence. Treba imati u vidu da se vrednost procenta identičnosti sekvence zaokružuje na najbližu decimalu. Na primer, 80,11, 80,12, 80,13 i 80,14 zaokružuju su na 80,1, dok se 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 i 80,19 zaokružuju na 80,2. Takođe treba imati u vidu da će vrednost dužine uvek biti ceo broj.
[0215] U određenim aspektima, procenat identičnosti „X“ prve aminokiselinske sekvence sa drugom aminokiselinskom sekvencom je izračunat kao 100 x (Y/Z), gde je Y broj aminokiselinskih ostataka koji su ocenjeni kao identični parovi u poravnanju prve i druge sekvence (poravnanje prema vizuelnoj inspekciji ili određenom programu poravnanja sekvenci) i Z je ukupni broj ostataka u drugoj sekvenci. Ako je dužina prve sekvence veća od druge sekvence, procenat identičnosti prve sekvence prema drugoj će biti veći nego procenat identičnosti druge sekvence prema prvoj sekvenci.
[0216] Stručnjaku će biti jasno da stvaranje poravnanja sekvence za izračunavanje procenta identičnosti sekvence nije ograničeno na binarna poređenja između sekvenci koja isključivo pokreću podaci o primarnoj sekvenci. Poravnanja sekvenci mogu da se izvedu iz poravnanja više sekvenci. Jedan prikladan program za generisanje poravnanja više sekvenci je ClustalW2, dostupan na www.clustal.org. Drugi prikladan program je MUSCLE, dostupan na www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 i MUSCLE su alternativno dostupni, npr. od EBI.
[0217] Takođe će biti jasno da poravnanja sekvence mogu da se dobiju integrisanjem podataka sekvence sa podacima iz heterogenih izvora kao što su strukturni podaci (npr. kristalografske proteinske strukture), funkcionalni podaci (npr. lokacija mutacija) ili filogenetski podaci. Prikladan program koji integriše heterogene podatke za dobijanje poravnanja više sekvenci je T-Coffee, dostupan na www.tcoffee.org, i alternativno dostupan, npr. od EBI. Takođe će biti jasno da konačno poravnanje korišćeno za izračunavanje procenta identičnosti sekvence može da se organizuje automatski ili ručno.
[0218] Termin „sekvenca konsenzusa“, kako se ovde koristi u odnosu na varijabilne regione lakog lanca (VL) i teškog lanca (VH), odnosi se na kompozitnu ili uopštenu sekvencu VL ili VH definisanu na osnovu informacija o tome koji su aminokiselinski ostaci u VL ili VH lancu podložni modifikaciji bez štete po vezivanje antigena. Dakle, u „sekvenci konsenzusa“ za VL ili VH lanac, određene pozicije aminokiselina su zauzete sa jednim ili više mogućih aminokiselinskih ostataka na toj poziciji. Na primer, ako se arginin (R) ili serin (S) javljaju na određenoj poziciji, tada ta određena pozicija u sekvenci konsenzusa može biti ili arginin ili serin (R ili S). Sekvence konsenzusa za VH i VL lanac mogu da se definišu, na primer, in vitro afinitetnim sazrevanjem (npr. randomizacija svake aminokiselinske pozicije u određenom CDR koristeći degenerativne kodirajuće prajmere), skenirajućom mutagenezom aminokiselinskih ostataka u CDR-ima antitela (npr. ciljana mutageneza sa alaninom), ili drugim postupcima koji su poznati u struci, nakon čega sledi procena vezivanja mutanata za antigen kako bi se utvrdilo da li mutirana aminokiselinska pozicija utiče na vezivanje antigena. U nekim aspektima, mutacije su uvedene u CDR regione. U drugim aspektima, mutacije su uvedene u regione okvira. U nekim drugim aspektima, mutacije su uvedene u CDR i regione okvira.
II. CD73-vezujući molekuli
[0219] Predmetno otkriće obezbeđuje CD73 vezujuće molekule, npr. antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji specifično vezuju CD73, na primer, humani CD73. Aminokiselinske (aa) i nukleotidne (nt) sekvence kompletne dužine za CD73 poznate su u struci (vidite, npr. UniProt prist. br. P21589 za humani CD73, ili UniProt prist. br. Q61503 za mišji CD73). U nekim aspektima, anti-CD73 vezujući molekuli su humana antitela (na primer, klon 10.3 antitela, klon 2C5 antitela, MEDI9447). U određenim aspektima, CD73 vezujući molekuli su antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti.
[0220] U nekim aspektima, CD73 vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, sadrže Fab, Fab', F(ab')2, Fd, jednolančani Fv ili scFv, disulfidno vezani Fv, V-NAR domen, IgNar, intratelo, CH2 IgG, minitelo, F(ab')3, tetratelo, trijatelo, dijatelo, antitelo sa jednim domenom, DVD-Ig, Fcab, mAb2 , (scFv)2ili scFv-Fc. U nekim aspektima, antitelo je tipa IgG, na primer tipa IgG1.
[0221] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitela ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže konstantni region teškog lanca ili njegov fragment. U nekim specifičnim aspektima, konstantni region teškog lanca je konstantni region IgG. Konstantni region IgG može da sadrži konstantni region lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od kapa konstantnog regiona i lambda konstantnog regiona.
[0222] U određenim aspektima, ovde otkrivena anti-CD73 antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti modifikovani su u odnosu na matično antitelo, npr. CD730010 antitelo ili CD730002 antitelo. U nekim aspektima, matično antitelo je CD730010. U drugim aspektima, matično antitelo je CD730002. U drugim aspektima, matično antitelo je CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069. Modifikacije mogu da uključuju mutacije u CDR regionima i/ili u FW regionima u odnosu na matično antitelo, npr. CD730010 ili CD730002.
[0223] Fraza „CD730002 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2.
[0224] Fraza „CD730004 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:103.
[0225] Fraza „CD730008 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:106 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 107.
[0226] Fraza „CD730010 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4.
[0227] Fraza „CD730011 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
[0228] Fraza „CD730021 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0229] Fraza „CD730042 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10.
[0230] Fraza „CD730046 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12.
[0231] Fraza „CD730047 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14.
[0232] Fraza „CD730068 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:108 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:107.
[0233] Fraza „CD730069 antitelo“ odnosi se na IgG1 koji sadrži dva domena VL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:110 i dva domena VH koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:109.
(i) Anti-CD73 antitela izvedena iz CD730010
[0234] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo iz predmetnog otkrića sadrži modifikacije CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 lakog lanca antitela CD730010, uključujući, bez ograničenja:
1) CDR1 lakog lanca koji sadrži sekvencu konsenzusa SGSLSNIGRNX1VN, pri čemu X1predstavlja aminokiselinske ostatke prolin (P), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D); i/ili,
2) CDR2 lakog lanca koji sadrži sekvencu konsenzusa LX2NX3RX4X5, pri čemu X2predstavlja aminokiselinske ostatke asparagin (N) ili asparaginsku kiselinu (D), X3predstavlja aminokiselinske ostatke glutamin (Q) ili leucin (L), X4predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili prolin (P), i X5predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S); i/ili,
3) CDR3 lakog lanca koji sadrži sekvencu konsenzusa ATWDDSX6X7GWX8, pri čemu X6predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili histidin (H), X7predstavlja aminokiselinske ostatke lizin (K), prolin (P), izoleucin (I) ili asparagin (N), i X8predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili treonin (T).
[0235] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo iz predmetnog otkrića sadrži modifikacije CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 teškog lanca antitela CD730010, uključujući, bez ograničenja:
1) CDR1 teškog lanca koji sadrži sekvencu konsenzusa SYAX9S, pri čemu X9predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili tirozin (Y); i/ili,
2) CDR2 teškog lanca koji sadrži sekvencu konsenzusa X10IX11GSX12GX13TYYADSVKG, pri čemu X10predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili alanin (A), Xnpredstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili serin (S), X12predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili glicin (G), i X13predstavlja aminokiselinske ostatke serin (S) ili Arginin (R); i/ili,
3) CDR3 teškog lanca koji sadrži sekvencu konsenzusa LGYX14X15X16DX17, pri čemu X14predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S), X15predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili treonin (T), X16predstavlja aminokiselinske ostatke valin (V) ili izoleucin (I), i X17predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y), lizin (K), metionin (M), leucin (L) ili glutaminsku kiselinu (E).
[0236] U jednom aspektu, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW1]SGSLSNIGRNX1VN[FW2] LX2NX3RX4X5[FW3] ATWDDSX6X7GWX8[FW4] pri čemu [FW1], [FW2], [FW3] i [FW4] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VL (SEQ ID NO: 25 ili 26), regiona okvira 2 VL (SEQ ID NO: 27 ili 28), regiona okvira 3 VL (SEQ ID NO: 29), odnosno regiona okvira 4 VL (SEQ ID NO: 30), i pri čemu X1predstavlja aminokiselinske ostatke prolin (P), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);
X2predstavlja aminokiselinske ostatke asparagin (N) ili asparaginsku kiselinu (D); X3predstavlja aminokiselinske ostatke glutamin (Q) ili leucin (L);
X4predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili prolin (P);
X5predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X6predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili histidin (H);
X7predstavlja aminokiselinske ostatke lizin (K), prolin (P), izoleucin (I) ili asparagin (N); i,
X8predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili treonin (T).
[0237] U jednom aspektu, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW5]SYAX9S [FW6]X10IX11GSX12GX13TYYADSVKG [FW7]LGYX14X15X16DX17[FW8] pri čemu [FW5], [FW6], [FW7] i [FW8] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VH (SEQ ID NO: 31), regiona okvira 2 VH (SEQ ID NO: 32), regiona okvira 3 VH (SEQ ID NO: 33), odnosno regiona okvira 4 VH (SEQ ID NO: 34), i pri čemu
X9predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili tirozin (Y);
X10predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili alanin (A);
X11predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili serin (S);
X12predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili glicin (G);
X13predstavlja aminokiselinske ostatke serin (S) ili arginin (R);
X14predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X15predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili treonin (T);
X16predstavlja aminokiselinske ostatke valin (V) ili izoleucin (I)
X17predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y), lizin (K), metionin (M), leucin (L) ili glutaminsku kiselinu (E).
[0238] U jednom aspektu, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW1]SGSLSNIGRNX1VN[FW2] LX2NX3RX4X5[W3] ATWDDSX6X7GWX8[FW4] pri čemu [FW1], [FW2], [FW3] i [FW4] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VL (SEQ ID NO: 25 ili 26), regiona okvira 2 VL (SEQ ID NO: 27 ili 28), regiona okvira 3 VL (SEQ ID NO: 29), odnosno regiona okvira 4 VL (SEQ ID NO: 30), i pri čemu X1predstavlja aminokiselinske ostatke prolin (P), glutaminsku kiselinu (E) ili asparaginsku kiselinu (D);
X2predstavlja aminokiselinske ostatke asparagin (N) ili asparaginsku kiselinu (D); X3predstavlja aminokiselinske ostatke glutamin (Q) ili leucin (L);
X4predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili prolin (P);
X5predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X6predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili histidin (H);
X7predstavlja aminokiselinske ostatke lizin (K), prolin (P), izoleucin (I) ili asparagin (N); i,
X8predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili treonin (T);
i pri čemu anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dalje sadrže VH region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW5]SYAX9S [FW6]X10IX11GSX12GX13TYYADSVKG [FW7]LGYX14X15X16DX17[FW8] pri čemu [FW5], [FW6], [FW7] i [FW8] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VH (SEQ ID NO: 31), regiona okvira 2 VH (SEQ ID NO: 32), regiona okvira 3 VH (SEQ ID NO: 33), odnosno regiona okvira 4 VH (SEQ ID NO: 34), i pri čemu
X9predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili tirozin (Y);
X10predstavlja aminokiselinske ostatke leucin (L) ili alanin (A);
X11predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili serin (S);
X12predstavlja aminokiselinske ostatke triptofan (W) ili glicin (G);
X13predstavlja aminokiselinske ostatke serin (S) ili arginin (R);
X14predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili serin (S);
X15predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili treonin (T);
X16predstavlja aminokiselinske ostatke valin (V) ili izoleucin (I)
X17predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y), lizin (K), metionin (M), leucin (L) ili glutaminsku kiselinu (E).
[0239] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47
1
i 48. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47 i 48.
[0240] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52.
[0241] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56.
[0242] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36.
[0243] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40.
[0244] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45.
[0245] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47
2
i 48, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47 i 48, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0246] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0247] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0248] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0249] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0250] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0251] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47 i 48; VL-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52; i VL-CDR3 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47 i 48; VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52; i VL-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56.
[0252] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36; VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40; i VH-CDR3 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36; VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40; VH-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45.
[0253] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47 i 48, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VL-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
4
[0254] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47 i 48, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 49, 50, 51 i 52, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VL-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53, 54, 55 i 56, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0255] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VH-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VH-CDR3 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0256] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i 36, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 38, 39 i 40, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VH-CDR3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 i 45, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0257] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže modifikacije CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 teškog i/ili lakog lanca, i dalje sadrže modifikacije na FW1 i/ili FW2 i/ili FW3 i/ili FW4 teškog i/ili lakog lanca.
[0258] U nekim aspektima, FW1obuhvata SEQ ID NO: 25 ili 26, FW2obuhvata SEQ ID NO: 27 ili 28, FW3obuhvata SEQ ID NO: 29, FW4obuhvata SEQ ID NO: 30, FW5obuhvata SEQ ID NO: 31, FW6obuhvata SEQ ID NO: 32, FW7obuhvata SEQ ID NO: 33 i FWs obuhvata SEQ ID NO: 34.
[0259] U nekim aspektima, FW1obuhvata SEQ ID NO: 25 ili 26, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; FW2obuhvata SEQ ID NO: 27 ili 28, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; FW3obuhvata SEQ ID NO: 29, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; FW4obuhvata SEQ ID NO: 30, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; FW5obuhvata SEQ ID NO: 31, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; FW6obuhvata SEQ ID NO: 32, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; FW7obuhvata SEQ ID NO: 33, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i FW8obuhvata SEQ ID NO: 34.
[0260] U određenim aspektima, anti-CD733 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL i VH koji sadrže aminokiselinske sekvence VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 identične, ili identične osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina u jednom ili više CDR, pri čemu su takvi VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3:
SEQ ID NO: 46, 49, 53, 35, 37 i 41; ili,
SEQ ID NO: 47, 49, 53, 35, 37 i 41; ili,
SEQ ID NO: 47, 49, 54, 36, 37 i 42; ili,
SEQ ID NO: 46, 50, 54, 36, 38 i 43; ili,
SEQ ID NO: 46, 51, 55, 36, 39 i 44; ili,
SEQ ID NO: 48, 52, 54, 36, 40 i 44; ili,
SEQ ID NO: 46, 49, 56, 35, 37 i 41; ili,
SEQ ID NO: 46, 49, 53, 35, 37 i 45; ili,
SEQ ID NO: 47, 49, 56, 36, 37 i 45; ili,
SEQ ID NO: 46, 50, 56, 36, 38 i 45; ili,
SEQ ID NO: 46, 51, 56, 36, 39 i 45; ili,
SEQ ID NO: 48, 52, 56, 36, 40 i 45; ili
SEQ ID NO: 46, 49, 56, 35, 37, odnosno 45.
[0261] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL antitela i VH antitela, pri čemu VL sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 i SEQ ID NO: 70.
[0262] U drugim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL antitela i VH antitela, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 odnosno SEQ ID NO: 84.
[0263] U drugim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL koji sadrži sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 i SEQ ID NO: 70, i dalje sadrži VH koji sadrži sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 odnosno SEQ ID NO: 84.
[0264] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 68 i VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:82. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:68 i VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:82.
[0265] „Klon 10.3 antitelo“ (naziva se i „73combo3“ ili „MEDI9447“) je IgG1 koji sadrži dva laka lanca (VL) dobijena od CD730010 sa SEQ ID NO: 68 (uključujući tri CDR-a, CDR1, CDR2 i CDR3, sa sekvencama SEQ ID NO: 46, 51, odnosno 56) i dva teška lanca (VH) dobijena od CD730010 sa SEQ ID NO: 82 (uključujući tri CDR-a, CDR1, CDR2 i CDR3, sa sekvencama SEQ ID NO: 36, 39, odnosno 45).
[0266] U određenim aspektima, ovde otkriveno anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment vezuju CD73 sa suštinski istim ili boljim afinitetom kao 10.3 antitelo koje sadrži 10.3 teški lanac VH sa SEQ ID NO: 82 i 10.3 laki lanac VL sa SEQ ID NO: 68.
(ii) Anti-CD73 antitela izvedena iz CD730002
[0267] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo iz predmetnog otkrića sadrži modifikacije na CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 lakog lanca CD730002 antitela, uključujući, bez ograničenja:
1) CDR1 lakog lanca koji sadrži sekvencu SGDKVGDKYAS; i/ili,
2) CDR2 lakog lanca koji sadrži sekvencu konsenzusa EDX18KX19X20S, pri čemu X18predstavlja aminokiselinske ostatke serin (S) ili treonin (T), X19predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili tirozin (Y), i X20predstavlja aminokiselinske ostatke histidin (H), prolin (P) ili leucin (L); i/ili,
3) CDR3 lakog lanca koji sadrži sekvencu QAWDTSFWV.
[0268] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo iz predmetnog otkrića sadrži modifikacije na CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 teškog lanca CD730002, uključujući, bez ograničenja:
1) CDR1 teškog lanca koji sadrži sekvencu SX21A X22S, pri čemu X21predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y) ili valin (V), i X22predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili arginin (R); i/ili,
2) CDR2 teškog lanca koji sadrži sekvencu AISGSGGSX23YY X24DSVKX25, pri čemu X23predstavlja aminokiselinske ostatke treonin (T) ili prolin (P); X24predstavlja aminokiselinske ostatke alanin (A) ili G (glicin); i X25predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili arginin (R); i/ili,
3) CDR3 teškog lanca koji sadrži sekvencu DKGYYWYM.
[0269] U jednom aspektu, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW9]SGDKVGDKYAS[FW10]EDX18KX19X20S[FW11]QAWDTSFWV[FW12]
pri čemu [FW9], [FW10], [FW11] i [FW12] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VL (SEQ ID NO: 90 ili 91), regiona okvira 2 VL (SEQ ID NO: 92), regiona okvira 3 VL (SEQ ID NO: 93, 94 ili 122), odnosno regiona okvira 4 VL (SEQ ID NO: 30); i pri čemu X18predstavlja aminokiselinske ostatke prolin (P) ili leucin (L); X19predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili tirozin (Y); i X20predstavlja aminokiselinske ostatke histidin (H), prolin (P) ili leucin (L).
[0270] U jednom aspektu, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW13] SX21A X22S[FW14]AISGSGGSX23YY X24DSVKX25[FW15]DKGYYWYM[FW16] pri čemu [FW13], [FW14], [FW15] i [FW16] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VH (SEQ ID NO: 31), regiona okvira 2 VH (SEQ ID NO: 32), regiona okvira 3 VH (SEQ ID NO: 33), odnosno regiona okvira 4 VH (SEQ ID NO: 89); i pri čemu X21predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y) ili valin (V); X22predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili arginin (R); X23predstavlja aminokiselinske ostatke treonin (T) ili prolin (P); X24predstavlja aminokiselinske ostatke alanin (A) ili G (glicin); i X25predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili arginin (R).
[0271] U jednom aspektu, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW9]SGDKVGDKYAS[FW10]EDX18KX19X20S[FW11]QAWDTSFWV[FW12]
pri čemu [FW9], [FW10], [FW11] i [FW12] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VL (SEQ ID NO: 90 ili 91), regiona okvira 2 VL (SEQ ID NO: 92), regiona okvira 3 VL (SEQ ID NO: 93, 94 ili 122), odnosno regiona okvira 4 VL (SEQ ID NO: 30); i pri čemu X18predstavlja aminokiselinske ostatke prolin (P) ili leucin (L); X19predstavlja aminokiselinske ostatke arginin (R) ili tirozin (Y); i X20predstavlja aminokiselinske ostatke histidin (H), prolin (P) ili leucin (L), i pri čemu anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dalje sadrže VH region koji sadrži sekvencu konsenzusa aminokiseline:
[FW13] SX21A X22S[FW14]AISGSGGSX23YY X24DSVKX25[FW15]DKGYYWYM[FW16] pri čemu [FW13], [FW14], [FW15] i [FW16] predstavljaju aminokiselinske ostatke regiona okvira 1 VH (SEQ ID NO: 31), regiona okvira 2 VH (SEQ ID NO: 32), regiona okvira 3 VH (SEQ ID NO: 33), odnosno regiona okvira 4 VH (SEQ ID NO: 89); i pri čemu X21predstavlja aminokiselinske ostatke tirozin (Y) ili valin (V); X22predstavlja aminokiselinske ostatke metionin (M) ili arginin (R); X23predstavlja aminokiselinske ostatke treonin (T) ili prolin (P); X24predstavlja aminokiselinske ostatke alanin (A) ili G (glicin); i X25predstavlja aminokiselinske ostatke glicin (G) ili arginin (R).
[0272] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97. U nekim aspektima, antiCD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97.
[0273] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129.
[0274] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 100. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 100.
[0275] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124.
[0276] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126.
[0277] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 96. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 96.
[0278] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0279] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0280] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 100, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrže VL-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 100, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0281] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0282] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0283] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 96, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-
1
vezujući fragment sadrže VH-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 96, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0284] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97; VL-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129; i VL-CDR3 koji se sastoji od sekvence koja se sastoji od SEQ ID NO: 100. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97; VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129; i VL-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 100.
[0285] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124; VH-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126; i VH-CDR3 koji se sastoji od sekvence koja se sastoji od SEQ ID NO: 96. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124; VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126; VH-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 96.
[0286] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VL-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VL-CDR3 koji se sastoji od sekvence koja se sastoji od SEQ ID NO: 100, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0287] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 97, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VL-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 98, 99, 127, 128 i 129, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VL-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 100, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
2
[0288] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VH-CDR2 koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VH-CDR3 koji se sastoji od sekvence koja se sastoji od SEQ ID NO: 96, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0289] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 123 i 124, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VH-CDR2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, 95, 125 i 126, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VH-CDR3 koji sadrži sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 96, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0290] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže modifikacije CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 teškog i/ili lakog lanca, i dalje sadrže modifikacije na FW1 i/ili FW2 i/ili FW3 i/ili FW4 teškog i/ili lakog lanca.
[0291] U nekim aspektima, FW9obuhvata SEQ ID NO: 90 ili 91, FW10obuhvata SEQ ID NO: 92, FW11obuhvata SEQ ID NO: 93, 94 ili 122, FW12obuhvata SEQ ID NO: 30, FW13obuhvata SEQ ID NO: 31, FW14obuhvata SEQ ID NO: 32, FW15obuhvata SEQ ID NO: 33, a FW16obuhvata SEQ ID NO: 89.
[0292] U nekim aspektima, FW9obuhvata SEQ ID NO: 90 ili 91, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina, FW10obuhvata SEQ ID NO: 92, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina, FW11obuhvata SEQ ID NO: 93, 94 ili 122, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina, FW12obuhvata SEQ ID NO: 30, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina, FW13obuhvata SEQ ID NO: 31, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina, FW14obuhvata SEQ ID NO: 32, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina, FW15obuhvata SEQ ID NO: 33, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina, i FW16obuhvata SEQ ID NO: 89.
[0293] U određenim aspektima, anti-CD733 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL i VH koji sadrže aminokiselinske sekvence VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 identične, ili identične osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina u jednom ili više CDR, pri čemu su takvi VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3:
SEQ ID NO: 97, 98, 100, 35, 37 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 99, 100, 35, 95 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 98, 100, 35, 37 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 99, 100, 123, 37 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 99, 100, 124, 37 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 99, 100, 35, 125 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 99, 100, 35, 126 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 99, 100, 35, 95 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 127, 100, 35, 95 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 128, 100, 35, 95 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 129, 100, 35, 95 i 96; ili,
SEQ ID NO: 97, 99, 100, 35, 95 i 96.
[0294] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL antitela i VH antitela, pri čemu VL sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86, 88, 112, 118, 119, 120 i 121.
[0295] U drugim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL antitela i VH antitela, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 85, 87, 111, 113, 114, 115, 116 i 117.
[0296] U drugim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL koji sadrži sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86, 88, 112, 118, 119, 120 i
4
121; i dalje sadrže VH koji sadrži sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 85, 87, 111, 113, 114, 115, 116 i 117.
[0297] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 88; i VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:87. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:87, i VH koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:87.
[0298] „Klon 2C5 antitelo“ je IgG1 koji sadrži dva laka lanca (VL) dobijena od CD730002 sa SEQ ID NO: 88 (sadrži tri CDR-a, CDR1, CDR2 i CDR3, sa sekvencama SEQ ID NO: 97, 99, odnosno 100) i teške lance (VH) dobijene od CD7300002 sa SEQ ID NO: 87 (sadrži tri CDR-a, CDR1, CDR2 i CDR3, sa sekvencama SEQ ID NO: 35, 95, odnosno 96).
[0299] U određenim aspektima, ovde otkriveno anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment vezuju CD73 sa suštinski istim ili boljim afinitetom kao antitelo 2C5 koje sadrži 2C5 teški lanac VH sa SEQ ID NO: 87 i 2C5 laki lanac VL sa SEQ ID NO: 88.
(iii) Anti-CD73 antitela sa matičnim antitelima koja nisu CD730002 ili CD730010
[0300] U drugim aspektima, matično antitelo ovde otkrivenog anti-CD73 antitela ili antigenvezujućeg fragmenta je CD730004 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 104 i VH sa SEQ ID NO:103), CD730008 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 106 i VH sa SEQ ID NO:107), CD7300011 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 5 i VH sa SEQ ID NO:6), CD730021 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 7 i VH sa SEQ ID NO:8), CD730042 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 9 i VH sa SEQ ID NO:10), CD730046 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 11 i VH sa SEQ ID NO:12), CD730047 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 13 i VH sa SEQ ID NO:14), CD730068 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 108 i VH sa SEQ ID NO:107) ili CD730069 (tj. anti-CD73 antitelo koje sadrži VL sa SEQ ID NO: 110 i VH sa SEQ ID NO:109). Modifikacije matičnih antitela mogu da uključuju mutacije u CDR regionima i/ili u FW regionima u odnosu na matično antitelo, npr. CD730004.
[0301] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo sadrži modifikacije na CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 lakog lanca CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0302] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo sadrži modifikacije na CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 teškog lanca CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0303] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0304] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0305] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069 osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VLCDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0306] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0307] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069; VL-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069; i VL-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0308] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069; VH-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069; i VH-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0309] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VL-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VL-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0310] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH-CDR1 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; VH-CDR2 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina; i VH-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina.
[0311] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže modifikacije na CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 teškog i/ili lakog lanca iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, i dalje sadrže modifikacije na FW1 i/ili FW2 i/ili FW3 i/ili FW4 teškog i/ili lakog lanca iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0312] U određenim aspektima, anti-CD733 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL i VH koji sadrže aminokiselinske sekvence VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 identične, ili identične osim jedne, dve, tri ili četiri supstitucije aminokiselina u jednom ili više CDR, pri čemu su takvi VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0313] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL antitela i VH antitela, pri čemu VL sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od VL sekvenci iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0314] U drugim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL antitela i VH antitela, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od VH sekvenci iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0315] U drugim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VL koji sadrži sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od VL sekvenci iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069, i dalje sadrže VH koji sadrži sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100% identičnu sa referentnom aminokiselinskom sekvencom izabranom od VH sekvenci iz CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069.
[0316] U određenim aspektima, ovde otkriveno anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment vezuju CD73 sa suštinski istim ili boljim afinitetom kao CD730004, CD730008, CD7300011, CD730021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069 antitelo.
(iv) Pomešana i usklađena anti-CD73 antitela
[0317] VH i VL sekvence anti-CD73 vezujućih molekula koji su ovde otkriveni (npr. CD730002, CD730004, CD730008, CD730010, CD730011, CD73021, CD730042, CD730046, CD730047, CD730068 ili CD730069) ili VH i VL varijanti takvih sekvenci (npr. klon 10 GL9, klon 10 P32E, klon 10 C1, klon 10 C2, klon 10 D3, klon 10 G10, klon 10 HPT, klon 10 GRVE, klon 10 combo1, klon 10 combo2, klon 10 combo3, klon 10 combo5, ili klon combo6) mogu da se „mešaju i usklade“ kako bi nastali drugi anti-CD73 vezujući molekuli.
[0318] U određenim aspektima, sekvence VH antitela 10.3 i antitela 2C5 su mešane i usklađene. U drugom aspektu, sekvence VL antitela 10.03 i antitela 2C5 mogu da se mešaju i usklade. Dodatno ili alternativno, ovde otkrivene varijante sekvenci VL i/ili VH klona 10 (CD730010) mogu da se mešaju i usklade. Dodatno ili alternativno, ovde otkrivene varijante VL i/ili VH sekvenci klona 2 (CD730002) mogu da se mešaju i usklade. Dodatno ili alternativno, ovde otkrivene varijante sekvenci VL i/ili VH klona 10 (CD730010) i klona 2 (CD730002) mogu da se mešaju i usklade.
[0319] U nekim aspektima, mešanje i usklađivanje VL i/ili VH može da se odvija između sekvenci koje su dobijene iz antitela grupisanih u istu epitopsku grupu (vidite primer 2). Kako se ovde koristi, termin „epitopska grupa“ odnosi se na grupisanje antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata koji vezuju isti epitop ili preklapajući epitop, ili se međusobno takmiče u vezivanju za isti epitop ili preklapajući epitop. Npr. sekvence iz CD730003, CD730010, CD730021, CD730042, CD730046 i CD730047, pri čemu su to sve antitela koja pripadaju „epitopskoj grupi B“, mogu da se mešaju i usklađuju. U drugim aspektima, mešanje i uparivanje VL i/ili VH može da se odvija između sekvenci dobijenih iz anti-CD73 antitela grupisanih u različitim grupama epitopa. Shodno tome, sekvence antitela koja pripadaju „epitopskoj grupi B“ mogu da se mešaju i usklađuju sa sekvencama iz anti-CD73 antitela u „epitopskoj grupi A“ (CD730002, CD730004, CD730008 i CD730011) ili „epitopskoj grupi C“ (CD730068 i CD730069).
(v) Mutantna anti-CD73 antitela
[0320] U određenim aspektima, ovde otkriveno anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže mutacije koje poboljšavaju vezivanje za humani FcRn i poboljšavaju poluživot anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U nekim aspektima takve mutacije su mutacija metionina (M) u tirozin (Y) na poziciji 252, mutacija serina (S) u treonin (T) na poziciji 254, i mutacija treonina (T) u glutaminsku kiselinu (E) na poziciji 256, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata (Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), uvedene u konstantni domen IgG1. Videti U.S. Patent br.7,658,921. Pokazalo se da ova vrsta mutiranih IgG, koja se naziva „YTE mutant“, pokazuje približno četvorostruko veći poluživot u odnosu na verzije istog antitela divljeg tipa (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem.
281:23514-24 (2006)). U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrže konstantni domen IgG obuhvataju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija aminokiselinskih ostataka na pozicijama 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 i 428-436, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, pri čemu takve mutacije produžavaju poluživot u serumu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0321] U nekim aspektima, YTE mutant dalje sadrži supstituciju na poziciji 434 konstantnog domena IgG, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od triptofana (W), metionina (M), tirozina (Y) i serina (S). U ostalim aspektima, YTE mutant dalje sadrži supstituciju na poziciji 434 konstantnog domena IgG, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od triptofana (W), metionina (M), tirozina (Y) i serina (S), i supstituciju na poziciji 428 konstantnog domena IgG, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od treonina (T), leucina (L), fenilalanina (F) i serina (S).
[0322] U još jednom aspektu, YTE mutant dalje sadrži supstituciju na poziciji 434 konstantnog domena IgG, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, tirozinom (Y), i supstituciju na poziciji 257 konstantnog domena IgG, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, leucinom (L). U nekim aspektima, YTE mutant dalje sadrži supstituciju na poziciji 434 konstantnog domena IgG, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, serinom (S), i supstituciju na poziciji 428 konstantnog domena IgG, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata, leucinom (L).
[0323] U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment koji su ovde otkriveni sadrže konstantni domen IgG1 koji sadrži mutaciju metionina (M) u tirozin (Y) na poziciji 252, mutaciju serina (S) u treonin (T) na poziciji 254 i mutaciju treonina (T) u glutaminsku kiselinu (E) na poziciji 256 konstantnog domena IgG1, numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata.
[0324] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment koji su ovde otkriveni sadrže najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju konstantnog domena IgG1 izabranu iz grupe koja se sastoji od:
(a) supstitucije aminokiseline na poziciji 252 tirozinom (Y), fenilalaninom (F), triptofanom (W) ili treoninom (T);
(b) supstitucije aminokiseline na poziciji 254 treoninom (T);
(c) supstitucije aminokiseline na poziciji 256 serinom (S), argininom (R), glutaminom (Q), glutaminskom kiselinom (E), asparaginskom kiselinom (D) ili treoninom (T);
(d) supstitucije aminokiseline na poziciji 257 leucinom (L);
(e) supstitucije aminokiseline na poziciji 309 prolinom (P);
(f) supstitucije aminokiseline na poziciji 311 serinom (S);
1
(g) supstitucije aminokiseline na poziciji 428 treoninom (T), leucinom (L), fenilalaninom (F) ili serinom (S);
(h) supstitucije aminokiseline na poziciji 433 argininom (R), serinom (S), izoleucinom (I), prolinom (P) ili glutaminom (Q);
(i) supstitucije aminokiseline na pozicije 434 triptofanom (W), metioninom (M), serinom (S), histidinom (H), fenilalaninom (F) ili tirozinom; i,
(j) kombinacije dve ili više navedenih supstitucija,
pri čemu su pozicije numerisane prema EU indeksu kao kod Kabata, i pri čemu modifikovani IgG ima produženi poluživot u serumu u poređenju sa poluživotom u serumu IgG koji ima konstantni domen IgG divljeg tipa.
[0325] U nekim aspektima, aminokiselinske sekvence VH i/ili VL anti-CD73 antitela (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji su ovde otkriveni mogu biti 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% slične sekvencama VH i VL koje su prethodno date, i obuhvatati 1, 2, 3, 4, 5 ili više konzervativnih supstitucija. CD73 antitelo sa regionima VH i VL koji imaju veliku (tj.80% ili više) sličnost sekvence ili identičnost sekvence sa VH regionima SEQ ID NO: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 111, 113, 114, 115, 116 ili 117, i/ili regionima VL sa SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 86, 88, 112, 118, 119, 120, odnosno 121, može se dobiti mutagenezom (npr. mutageneza usmerena na mesto ili PCR posredovana mutageneza) molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 ili 121, nakon čega sledi testiranje kodiranog izmenjenog antitela na zadržavanje funkcije pomoću ovde opisanih funkcionalnih testova.
[0326] U nekim aspektima, Fc domen ovde otkrivenog anti-CD73 antitela ili Fc domen fuzionog proteina koji sadrži CD73-vezujući fragment ovde otkrivenog antitela ima smanjeno vezivanje za Fc receptor kako bi se smanjila citotoksičnost, npr. putem ADCC. U nekim aspektima, Fc domen antitela ili Fc fuzioni protein povećao je vezivanje za Fc receptor kako bi se povećala citotoksičnost, npr. putem ADCC. U nekim aspektima, Fc domen antitela ili Fc fuzioni protein sadrži aminokiselinski ostatak koji smanjuje ADCC i ne javlja se u prirodi, na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245,247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 279, 280,
2
284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 i 443, u skladu sa numeracijom prema EU indeksu kako je dat kod Kabata. Brojne specifične mutacije koje mogu da smanje ADCC aktivnost antitela poznate su u struci i uključuju, na primer, 234F, 235E, 235F, 235Q (ili 235Y), 239A, 332Q, 331S i njihove kombinacije. Na primer, vidite mutacije opisane u U.S. patentima br. 5,624,821, 5,648,260, 7,597,889, 8,961,967, 7,371,826, 7,785,791, 7,790,858, U.S. patentnoj publikaciji br. 20140378663, 20130071390, 20110212087, 20150118227, 20060194290, 20060194291, 20080274105, 20080274506, US20130089541 i US20130108623. Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom ADCC takođe uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (vidite, npr. U.S. pat. br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju i Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više aminokiselinskih pozicija 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (vidite, npr. U.S. pat. br. 7,332,581). Opciono mogu da se uključe mutacije koje smanjuju i ADCC i CDC. U nekim aspektima, ovde otkrivena anti-CD73 antitela ili njihov antigen-vezujući fragment sa mutacijama koje smanjuju ili ukidaju ADCC i/ili CDC mogu da se koriste za stvaranje konjugata antitelo-lek (ADC).
[0327] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD73 antitelo, pri čemu je antitelo IgG1, IgG2 ili IgG3, i sadrži najmanje jednu modifikaciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 234, 235 i 331 u skladu sa numeracijom iz EU indeksa kako je dato kod Kabata. U još jednom specifičnom aspektu, Fc region je Fc region IgG1, IgG2 ili IgG3, i aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi su izabrane iz grupe koja se sastoji od 234F, 235E, 235F, 235Q (ili 235Y), 239A, 332Q, 331S, 332Q u skladu sa numeracijom iz EU indeksa kako je dato kod Kabata.
[0328] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD73 antitelo, pri čemu je antitelo IgG4 i sadrži najmanje jednu modifikaciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 228 i 235 u skladu sa numeracijom iz EU indeksa kako je dato kod Kabata. U još jednom specifičnom aspektu, Fc region je Fc region IgG4, i aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi su izabrane iz grupe koja se sastoji od 228P, 235E i 235Y u skladu sa numeracijom iz EU indeksa kako je dato kod Kabata. U specifičnim aspektima, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD73 antitelo, pri čemu je antitelo IgG1, IgG2 ili IgG3, i sadrži modifikacije na pozicijama (i) 234F, 235E i 331S; (ii) 234F, 235F i 331S; (iii) 234F, 235Q i 322Q. U još jednom specifičnom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD73 antitelo, pri čemu je antitelo IgG4 i sadrži modifikacije 228P i 235E.
III. CD73-vezujući molekuli koji se takmiče za epitop
[0329] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje CD73-vezujuće molekule koji se vezuju za isti epitop kao različita ovde opisana anti-CD73 antitela, na primer, molekule koji se vezuju za isti epitop kao MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili za isti epitop kao klon 2C5 antitelo.
[0330] Takva antitela mogu da se identifikuju na osnovu njihove sposobnosti da se unakrsno takmiče (npr. da konkurentski inhibiraju vezivanje na statistički značajan način) sa ovde otkrivenim anti-CD73 antitelima, kao što su CD730010 antitelo, CD730002 antitelo, CD730004 antitelo i njihovi antigen-vezujući fragmenti, u standardnom testu vezivanja CD73 (npr. testovi protočne citometrije, površinska plazmonska rezonanca, ili testovi u rastvoru).
[0331] U skladu sa tim, u jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD73 antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente, npr. humana monoklonska antitela, koja se takmiče u vezivanju za CD73 sa drugim anti-CD73 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, kao što su CD730010 antitelo, CD730002 antitelo, CD730004 antitelo, njihove varijante (npr. MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovi antigenvezujući fragmenti. Sposobnost testiranog antitela da inhibira vezivanje, npr. CD730010 antitela (ili klon 10.3 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta) ili CD730002 antitela (ili klon 2C5 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta) pokazuje da testirano antitelo može da se takmiči sa tim antitelom u vezivanju za CD73; takvo antitelo, prema neograničavajućoj teoriji, može da se vezuje za isti ili srodni (npr. strukturno slični ili prostorno blizak) epitop na CD73 kao anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa kojim se takmiči. U jednom aspektu, anti-CD73 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se vezuje za isti epitop na CD73 kao, npr. CD730010 antitelo (ili klon 10.3 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment) ili CD730002 antitelo (ili klon 2C5 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment), predstavlja humano monoklonsko antitelo.
[0332] Kao što je ovde opisano, identifikovan je epitop MEDI9447, monoklonskog antitela koje direktno inhibira enzimsku aktivnost CD73, kako bi se razjasnio mehanizam delovanja MEDI9447. Epitop se nalazi unutar apikalne površine N-terminalnog domena CD73, regiona
4
distalnog od vezivanja supstrata i ostataka aktivnog mesta. Strukturne i mehaničke studije su otkrile da MEDI9447 antagonizuje CD73 kroz dvostruki mehanizam koji sprečava CD73 da usvoji katalitički aktivnu konformaciju. Ovi rezultati daju prvi izveštaj o fino mapiranom epitopu koji može biti ciljan za selektivnu, snažnu i nekonkurentsku inhibiciju CD73 kao sredstvo za modulaciju signalizacije adenozina u mikrookruženju tumora.
[0333] Koristeći masenu spektrometriju (MS) sa razmenom vodonik-deuterijum (HDX) i strategije mutageneze, definisali smo epitop MEDI9447 i ispitali potencijalna dejstva vezivanja antitela na globalnu strukturu CD73. Antitelo se vezuje za mesto u N-terminalnom domenu CD73 koje omogućava nekonkurentsku inhibiciju hidrolize AMP. U različitim aspektima, epitop sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka CD73 koji odgovaraju V144, K180 i N185. U različitim aspektima, epitop dodatno sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka CD73 koji odgovaraju Y135, K136 i N187 iz CD73. Izuzetno je to što je epitop pozicioniran tako da vezivanje antitela onemogućava konverziju CD73 iz otvorenog konformera u katalitički aktivan, zatvoreni konformer. Nadalje, naše studije pokazuju da MEDI9447 može da inhibira i usidrene i rastvorljive CD73 putem dvostrukog mehanizma inhibicije koji je posredovan valencom interakcije antitela sa CD73.
IV. Funkcionalne karakteristike anti-CD73 antitela
[0334] Afinitet ili aviditet antitela prema antigenu može biti određen eksperimentalno korišćenjem bilo kog odgovarajućeg postupka dobro poznatog u predmetnoj oblasti, npr. protočnom citometrijom, testom sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA) ili radioimunološkim testom (RIA) ili kinetički (npr. BIACORE™ analiza). Direktno vezujući testovi kao i testovi formata kompetitivnog vezivanja mogu biti upotrebljeni. (Vidite, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); i opisane ovde postupke. Izmereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može da varira ako je izmeren pod različitim okolnostima (npr. koncentracija soli, pH, temperatura). Dakle, merenja afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena (npr. KDili Kd, Kon, Koff) izvedena su sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i standardizovanim puferom, kao što je poznato u struci i kao što je pufer ovde opisan.
[0335] U struci je takođe poznato da afiniteti izmereni pomoću analize površinske plazmonske rezonance (npr. BIACORE™) mogu da variraju u zavisnosti od toga koji je od reaktanata vezan za čip. U tom pogledu, afinitet može da se izmeri koristeći format u kome je ciljajuće antitelo (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) imobilisano na čipu (naziva se format „imobilisani IgG“) ili koristeći format u kome je ciljni protein (npr., CD73) imobilisan na čipu (naziva se, npr., format „imobilisani CD73“).
[0336] U jednom aspektu predmetnog otkrića, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment specifično vezuju CD73 i/ili njegove antigene fragmente sa konstantom disocijacije ili kd(koff/kon) manjom od 10-6 M, ili manjom od 10-7 M, ili manjom od 10-8 M, ili manjom od 10-9 M, ili manjom od 10-10 M, ili manjom od 10-11 M, ili manjom od 10-12 M, ili manjom od 10-13 M.
[0337] U drugom aspektu, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za CD73 i/ili njegove antigene fragmente sa Koffmanjim od 1×10-3 s-1 , ili manjim od 2×10-3 s-1. U drugim aspektima, antiCD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za CD73 i njegove antigene fragmente sa K -1
offmanjim od 10-3 s , manjim od 5×10-3 s-1 , manjim od 10-4 s-1 , manjim od 5×104 s-1 , manjim od 10-5 s-1 , manjim od 5×10-5 s-1 , manjim od 10-6 s-1 , manjim od 5×10-6 s-1 , manjim od 5×10-7 s-1 , manjim od 10-8 s-1 , manjim od 5×10-8 s-1 , manjim od 10-9 s-1 , manjim od 5×10-9 s-1 , ili manjim od 10-10 s-1.
[0338] U drugom aspektu, anti-CD73 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje se za CD73 i/ili njegove antigene fragmente sa konstantom brzine asocijacije ili brzinom k -1
onod najmanje 105 M s-1 , najmanje 5×105 M-1 s-1 , najmanje 106 M-1 s-1 , najmanje 5×106 M-1 s-1 , najmanje 107 M-1 s-1 , najmanje 5×107 M-1 s-1 , ili najmanje 108 M-1 s-1 , ili najmanje 109 M-1 s-1.
[0339] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za CD73 na površini MB-MDA-231 ćelija sa KDod najmanje oko 60 pM, najmanje oko 70 pM, najmanje oko 80 pM, najmanje oko 90 pM, najmanje oko 100 pM, najmanje oko 110 pM, najmanje oko 120 pM, najmanje oko 130 pM, najmanje oko 140 pM, najmanje oko 150 pM, najmanje oko 160 pM, ili najmanje oko 170 pm, kako je izmereno protočnom citometrijom. U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za CD73 na površini MB-MDA-231 ćelija sa KDod oko 150 pM, kako je izmereno protočnom citometrijom. U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za CD73 na površini MB-MDA-231 ćelija sa KDod oko 80 pM kako je izmereno protočnom citometrijom.
[0340] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za površinu mišjih 3T1 ćelija sa KDod najmanje oko 40 pM, najmanje oko 50 pM, najmanje oko 60 pM, najmanje oko 70 pM, najmanje oko 80 pM, najmanje oko 90 pM, najmanje oko 100 pM, najmanje oko 120 pM, ili najmanje oko 130 pM, kako je izmereno protočnom citometrijom. U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za CD73 na površini mišjih 3T1 ćelija sa KDod oko 110 pM, kako je izmereno protočnom citometrijom. U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za CD73 na površini mišjih 3T1 ćelija sa KDod oko 55 pM, kako je izmereno protočnom citometrijom.
[0341] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za CD73 na površini MK-1 ćelija cinomolgusa sa KDod najmanje oko 40 pM, najmanje oko 50 pM, najmanje oko 60 pM, najmanje oko 70 pM, najmanje oko 80 pM, najmanje oko 90 pM, ili najmanje oko 100 pM, kako je izmereno protočnom citometrijom. U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za CD73 na površini MK-1 ćelija cinomolgusa sa KDod oko 80 pM, kako je izmereno protočnom citometrijom. U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za CD73 na površini MK-1 ćelija cinomolgusa sa KDod oko 60 pM, kako je izmereno protočnom citometrijom.
[0342] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za humani CD73 sa KDod najmanje oko 3 pM, najmanje oko 4 pM, najmanje oko 5 pM, najmanje oko 6 pM, najmanje oko 7 pM, najmanje oko 8 pM, najmanje oko 9 pM, ili najmanje oko 10 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®). U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za humani CD73 sa KDod oko 4 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®). U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za humani CD73 sa KDod oko 9 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®).
[0343] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov ovde otkriveni antigen-vezujući fragment vezuju se za mišji CD73 sa KDod najmanje oko 1 pM, najmanje oko 2 pM, najmanje oko 3 pM, najmanje oko 4 pM, najmanje oko 5 pM, najmanje oko 6 pM, najmanje oko 7 pM, najmanje oko 8 pM, najmanje oko 9 pM, najmanje oko 10 pM, najmanje oko 11 pM, najmanje oko 12 pM, najmanje oko 13 pM, najmanje oko 14 pM, najmanje oko 15 pM, najmanje oko 16 pM, najmanje oko 17 pM, najmanje oko 18 pM, najmanje oko 19 pM, najmanje oko 20 pM, najmanje oko 21 pM, najmanje oko 22 pM, najmanje oko 23 pM, najmanje oko 24 pM, ili najmanje oko 25 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®). U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za mišji CD73 sa KDod oko 1 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®). U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za mišji CD73 sa KDod oko 22 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®).
[0344] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za CD73 cinomolgusa sa KDod najmanje oko 3 pM, najmanje oko 4 pM, najmanje oko 5 pM, najmanje oko 6 pM, najmanje oko 7 pM, najmanje oko 8 pM, najmanje oko 9 pM, ili najmanje oko 10 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®). U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za CD73 cinomolgusa sa KDod oko 7 pM, kako je izmereno putem SPR (Proteon). U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za CD73 cinomolgusa sa KDod oko 9 pM, kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (PROTEON®).
[0345] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za humani CD73 sa KDod najmanje oko 40 pM, najmanje oko 50 pM, najmanje oko 60 pM, najmanje oko 70 pM, najmanje oko 80 pM, najmanje oko 90 pM, najmanje oko 100 pM, ili najmanje oko 110 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru. U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za humani CD73 sa KDod oko 80 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru. U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za humani CD73 sa KDod oko 80 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru.
[0346] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za mišji CD73 sa KDod najmanje oko 100 pM, najmanje oko 200 pM, najmanje oko 300 pM, najmanje oko 400 pM, najmanje oko 500 pM, najmanje oko 600 pM, najmanje oko 700 pM, najmanje oko 800 pM, najmanje oko 900 pM, najmanje oko 1000 pM, najmanje oko 1100 pM, najmanje oko 1200 pM, najmanje oko 1300 pM, najmanje oko 1400 pM, najmanje oko 1500 pM, najmanje oko 1600 pM, najmanje oko, ili najmanje oko 1700 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru. U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za mišji CD73 sa KDod oko 130 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru. U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za mišji CD73 sa KDod oko 1500 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru.
[0347] U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju se za CD73 cinomolgusa sa KDod najmanje oko 60 pM, najmanje oko 70 pM, najmanje oko 80 pM, najmanje oko 90 pM, najmanje oko 100 pM, najmanje oko 110 pM, ili najmanje oko 120 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru. U jednom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 10.3 antitelo i vezuje se za CD73 cinomolgusa sa KDod oko 90 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru. U drugom specifičnom aspektu, anti-CD73 antitelo je klon 2C5 antitelo i vezuje se za CD73 cinomolgusa sa KDod oko 100 pM, kako je izmereno vezivanjem u rastvoru. U posebnom aspektu, MEDI9447 vezuje CD73 sa KDod oko 1 x 10-12 , 5 x 10-12 , 10 x 10-12 , 100 x 10-12 , ili 150 x 10-12.
[0348] U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da ublaže AMP-posredovanu supresiju T ćelijske deobe. U drugim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da spasu ATP-indukovanu supresiju Teffputem Treg.
[0349] U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu značajno da inhibiraju rast singenetskog tumora. U jednom aspektu, tumor je nemikrocelularni tumor pluća, tumor dojke, glave i vrata, pankreasa, kolorektalni kancer, melanoma, limfom. U jednom aspektu, tumor je CT26 mišji singenetski CRC tumor, B16F10 melanom, EG7-OVA limfom ili LL2 tumor (Lewis Lung). U nekim aspektima, CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo ili njegov ovde otkriveni antigen-vezujući fragment (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu značajno da inhibiraju rast tumora, pri čemu je tumor neresponsivan na terapiju anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-PD-L2 i/ili anti-CTLA-4 antitelima. U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu značajno da inhibiraju rast tumora kada se primenjuju u koncentraciji od oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, ili oko 10 mg/kg.PD1.
[0350] U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu da se internalizuju nakon vezivanja za ćelije. U nekim aspektima, CD73-vezujući molekul je konjugat antitelo-lek (ADC).
V. Priprema anti-CD73 antitela i antigen-vezujućih fragmenata
[0351] Monoklonska anti-CD73 antitela (npr. MEDI9447, klon 10.3 antitela ili klon 2C5 antitelo) i njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da se pripreme koristeći postupke hibridoma, kao što su oni koje opisuju Kohler i Milstein (1975) Nature 256:495. Koristeći hibridoma metod, miš, hrčak ili druga odgovarajuća životinja domaćin, imunizovana je kao što je gore opisano da izazove produkciju limfocita antitela koja će specifično da se vežu za imunizujući antigen. Limfociti mogu biti imunizovani i in vitro. Nakon imunizacije, limfociti su izolovani i spojeni sa odgovarajućom ćelijskom linijom mijeloma koristeći, na primer, polietilen glikol, radi formiranja ćelije hibridoma koje onda mogu biti izabrane između nespojenih limfocita i ćelija mijeloma. Hibridomi koji daju monoklonska antitela usmerena specifično na izabrani antigen, kao što je određeno imunoprecipitacijom, imunoblotingom ili in vitro testom vezivanja (npr. radioimunološki test (RIA); test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA)) mogu da se propagiraju u in vitro kulturi koristeći standardne postupke (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) ili in vivo kao tumori sa ascitesom kod životinje. Monoklonska antitela zatim mogu da se prečiste iz medijuma za uzgajanje ili ascitne tečnosti, kao što je prethodno opisano za poliklonska antitela.
[0352] Alternativno, anti-CD73 monoklonska antitela (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) i njihovi antigen-vezujući fragmenti takođe mogu da se načine koristeći postupke rekombinantne DNK, kako je opisano, na primer, u U.S. patentu br.
4,816,567. Polinukleotidi koji kodiraju monoklonsko antitelo su izolovani iz zrelih B ćelija ili ćelija hibridoma, kao što je pomoću RT-PCR korišćenjem oligonukleotidnih prajmera koji specifično amplifikuju gene koji kodiraju teške i lake lance antitela i njihova sekvenca je određena korišćenjem konvencionalnih procedura. Izolovani polinukleotidi koji kodiraju teške i lake lance su potom klonirani u odgovarajuće vektore ekspresije, po čijoj transfekciji u ćelije domaćina kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne produkuju na drugi način protein imunoglobulina, monoklonska antitela se stvaraju od strane ćelije domaćina. Takođe, rekombinantna anti-CD73 monoklonska antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti željene vrste mogu biti izolovani iz biblioteka displeja faga koji eksprimiraju CDR željenih vrsta, kao što je opisano (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clarkson et al., 1991, Nature, 352:624-628; i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
[0353] Polinukleotidi koji kodiraju anti-CD73 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovi antigen vezujući fragmenti mogu dalje da se modifikuju na brojne različite načine korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK radi stvaranja alternativnih antitela. U nekim aspektima, konstantni domeni lakih i teških lanaca, na primer, mišjeg monoklonskog antitela mogu biti supstituisani (1) onim regionima, na primer, humanog antitela radi stvaranja himernog antitela ili (2) neimunoglobulinskim polipeptidom radi stvaranja fuzionog antitela. U nekim aspektima, konstantni regioni su skraćeni ili uklonjeni radi stvaranja željenog fragmenta antitela monoklonskog antitela. Mutageneza usmerena prema mestu ili mutageneza visoke gustine varijabilnog regiona može biti korišćena da se optimizuje specifičnost, afinitet itd. monoklonskog antitela.
[0354] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment je humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Humana antitela mogu biti direktno pripremljena korišćenjem različitih tehnika
1
poznatih u struci. Mogu da se stvore imortalizovani humani B limfociti imunizovani in vitro ili izolovani od imunizovanog pojedinca, koji proizvode antitelo usmereno na ciljni antigen (vidite, npr. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; i U.S. patent 5,750,373).
[0355] Takođe, anti-CD73 humano antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da se izaberu iz biblioteke faga, pri čemu ta biblioteka faga eksprimira humana antitela, kako je opisano, na primer, u Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom i Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Tehnike za stvaranje i korišćenje biblioteka antitela faga su takođe opisane u U.S. patentima br. 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; i 7,264,963; i Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018.
[0356] Strategije afinitetnog sazrevanja i strategije mešanja lanaca (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783) poznate su u struci, i mogu da se koriste za stvaranje humanih antitela velikog afiniteta ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata.
[0357] U nekim aspektima, anti-CD73 monoklonsko antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) može biti humanizovano antitelo. Metode inženjeringa, humanizovanja ili preuređivanja površine nehumanih ili humanih antitela mogu takođe biti korišćene i dobro su poznate u struci. Humanizovano, sa preuređenom površinom ili slično konstruisano antitelo može da ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz izvora koji je nehuman, ali nije ograničen na, npr. miša, pacova, zeca, nehumanog primata ili drugog sisara. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci su zamenjeni ostacima koji se često označavaju kao uneti ostaci, koji se obično uzimaju od unete varijable, konstantnog ili drugog domena poznate humane sekvence. Takve unete sekvence mogu biti korišćene da smanje imunogenost ili smanje, povećaju ili modifikuju vezivanje, afinitet, brzinu asocijacije, brzinu disocijacije, aviditet, specifičnost, poluživot, ili bilo koju drugu odgovarajuću karakteristiku, kao što je poznato u struci. Uopšteno, CDR ostaci su direktno i najviše suštinski uključeni u uticaj na CD73 vezivanje. Shodno tome, deo ili sve nehumane ili humane CDR sekvence se održavaju, dok nehumane sekvence varijabilnih i konstantnih regiona mogu da budu zamenjene humanim ili drugim aminokiselinama.
2
[0358] Antitela takođe mogu opciono da budu humanizovana, sa preuređenom površinom, konstruisana, ili humana antitela konstruisana uz održavanje velikog afiniteta prema antigenu CD73 i drugih povoljnih bioloških karakteristika. Radi postizanja ovog cilja, humanizovana (ili humana) ili obrađena inženjeringom anti-CD73 antitela i antitela sa preuređenom površinom mogu opciono da budu pripremljena procesom analize matične sekvence i drugih konceptualnih humanizovanih ili inženjeringom obrađenih proizvoda, koristeći trodimenzionalne modele matičnih, obrađenih inženjeringom i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su obično dostupni i poznati stručnjacima. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture izabranih kandidata sekvenci imunoglobulina. Pregled ovih prikaza omogućava analizu moguće uloge ostataka u funkcionisanju kandidata za sekvence imunoglobulina, tj. analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidata za imunoglobulin da vezuje svoj antigen, kao što je CD73. Na ovaj način, ostaci okvira (FW) mogu biti izabrani i kombinovani od sekvenci konsenzusa i unetih sekvenci, tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećan afinitet prema ciljnom antigenu.
[0359] Humanizacija, preuređivanje površine ili konstruisanje anti-CD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovih antigen vezujućih fragmenata mogu da se obave koristeći bilo koji poznati postupak, kao što su, bez ograničenja, oni opisani u Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), U.S. pat. br. 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 5,9,55,358; 6,204,023; 6,180,370; 6,331,431; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; 5,969,108; 7,635,666; 7,723,270; 7,557,189; 7,538,195; i 7,342,110; International Application br. PCT/US98/16280; PCT/US91/05939; PCT/US94/01234; PCT/GB92/01755; International Patent Application Publication br. WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; i European Patent Publication br. EP 229246.
[0360] Anti-CD73 humanizovana antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti mogu takođe biti napravljeni u transgenim miševima koji sadrže humane imunoglobulinske lokuse koji su sposobni nakon imunizacije da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu endogene produkcije imunoglobulina. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentu br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016.
[0361] U određenim aspektima, obezbeđen je fragment anti-CD73 antitela (na primer, fragment iz klon 10.3 antitela ili iz klon 2C5 antitela). Za proizvodnju fragmenata antitela poznate su različite tehnike. Tradicionalno, ovi fragmenti se dobijaju proteolitičkom digestijom netaknutih antitela (na primer, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). U određenim aspektima, fragmenti anti-CD73 antitela su proizvedeni rekombinantno. Fab, Fv i scFv fragmenti antitela mogu svi da budu eksprimirani u i sekretovani od strane E. coli ili drugih ćelija domaćina, time omogućujući proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Takvi fragmenti anti-CD73 antitela mogu takođe biti izolovani iz gorenavedenih biblioteka antitela faga. Fragmenti anti-CD73 antitela mogu takođe biti linearna antitela kao što je opisano u U.S. Patentu br. 5,641,870. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela, npr. hemijska sinteza, biće očigledne iskusnom stručnjaku.
[0362] Prema predmetnom pronalasku, tehnike mogu biti adaptirane za proizvodnju jednolančanih antitela specifičnih za CD73 (vidite, npr. U.S. pat. br. 4,946,778). Pored toga, postupci mogu da se prilagode za konstruisanje biblioteka za ekspresiju Fab (vidite, npr. Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)) kako bi se omogućila brza i delotvorna identifikacija monoklonskih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću prema CD73, ili njegovih derivata, fragmenata, analoga ili homologa. Fragmenti antitela mogu da se proizvedu tehnikama iz struke uključujući, bez ograničenja: (a) F(ab')2 fragment proizveden digestijom pepsina molekula antitela; (b) Fab fragment dobijen smanjenjem disulfidnih mostova F(ab')2 fragmenta, (c) Fab fragment dobijen tretiranjem molekula antitela papainom i redukujućim agensom i (d) Fv fragmente.
[0363] Anti-CD733 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov ovde otkriveni antigen-vezujući fragment mogu biti modifikovani da bi se povećao njihov poluživot u serumu. Ovo se može postići, na primer, unošenjem epitopa koji vezuje receptor spasa u antitelo ili fragment antigena, mutacijom odgovarajućeg regiona u antitelu ili fragmentu antigena ili unošenjem epitopa u peptidnu oznaku koja je zatim fuzionisana sa antitelom ili fragmentom antitela na bilo kom kraju ili u sredini (npr. putem sinteze DNK ili peptida) ili putem YTE mutacije. Drugi postupci za produženje poluživota antitela ili
4
njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u serumu, npr. konjugacija sa heterolognim molekulom, kao što je PEG, poznati su u struci.
[0364] Heterokonjugatna antiCD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) i njihovi antigen-vezujući fragmenti takođe su u okviru predmetnog otkrića. Heterokonjugatna antitela se sastoje od dva kovalentno vezana antitela. Takva antitela su, na primer, predložena za ciljanje imunih ćelija na neželjene ćelije (vidite, npr. US pat. br.
4,676,980). Razmatra se da heterokonjugatna anti-CD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) i njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da se pripreme in vitro koristeći postupke poznate u hemiji sintetičkih proteina, uključujući one koji obuhvataju agense za umrežavanje. Na primer, imunotoksini mogu da se konstruišu koristeći reakciju disulfidne razmene, ili stvaranjem tioetarske veze. Primeri prikladnih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.
[0365] U određenim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli, npr. antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da se kombinuju sa drugim terapeutskim agensima (npr. u kombinovanoj terapiji) ili mogu biti fuzionisani (npr. genetski fuzionisani da grade fuzioni protein) ili konjugovani (npr. hemijski ili enzimski konjugovani) sa najmanje jednim heterolognim ostatkom. Dakle, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli mogu biti fuzionisani ili konjugovani sa drugim terapeutskim agensima ili toksinima da grade imunokonjugate i/ili fuzione proteine. Predmetno otkriće takođe obezbeđuje konjugate antitelo-lek (ADC) koji sadrže najmanje jedan od ovde otkrivenih CD73-vezujućih molekula koji je derivatizovan ili povezan (npr. hemijski ili rekombinantno) sa drugim molekulom (npr. peptid, mali molekul leka, detektabilni molekul, itd.). Uopšteno, anti-CD73 antitela ili njihovi delovi su derivatizovani tako da derivatizacija ili obeležavanje ne utiču štetno na njihovo vezivanje CD73. Prema tome, anti-CD73 antitela i delovi antitela iz predmetnog otkrića treba da obuhvataju i netaknute i modifikovane oblike anti-CD73 vezujućih molekula koji su ovde opisani. Na primer, ovde otkriveni anti-CD73 vezujući molekul ili njegov Cd73-vezujući deo mogu biti funkcionalno povezani (hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem, ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je citotoksični agens, farmaceutski agens, agens za detekciju i/ili protein ili peptid koji može da posreduje u vezivanju anti-CD73 vezujućeg molekula sa drugim molekulom (kao što je region streptavidinskog jezgra ili polihistidinska oznaka).
[0366] Jedna vrsta derivatizovanih molekula može da se proizvede biokonjugacijom dva ili više molekulskih entiteta, npr. ovde otkrivenog anti-CD73 vezujućeg molekula i terapeutskog agensa (npr. citotoksin kao što je tubulizin ili MEDI 1508). Prikladni agensi za biokonjugaciju uključuju one koji su heterobifunkcionalni, tj. koji imaju dve različite reaktivne grupe odvojene prikladnim spejserom (npr. m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar); ili homobifunkcionalni (npr. disukcinimidil suberat). Takvi biokonjugatori mogu da se nabave, na primer, od Pierce Chemical Company, Rockford, II. Dodatni bifunkcionalni agensi za kuplovanje uključuju N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat, iminotiolan (IT), bifunkcionalne derivate imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivne estre (kao što je disukcinimidil suberat), aldehide (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivate bis-diazonijuma (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanate (kao što je tolien 2,6-diizocijanat) i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen).
[0367] Druga vrsta derivatizovanih molekula može da se proizvede uključivanjem detektabilne oznake. Korisni agensi za detekciju uključuju fluorescentna jedinjenja (npr. fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin, lantanid fosfore i slično), enzime koji su korisni za detekciju (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza, glukoza oksidaza, i slično), epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. parovi sekvenci leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake, itd.). U nekim aspektima, detektabilne oznake mogu biti povezane najmanje jednim krakom spejsera. Kraci spejsera mogu biti različitih dužina kako bi se smanjile potencijalne sterne smetnje.
[0368] Ovde otkriveni anti-CD73 vezujući molekuli takođe mogu biti obeleženi radiološki obeleženom aminokiselinom. Radiološka oznaka može da se koristi i za dijagnostičke i za terapeutske svrhe. Na primer, radiološka oznaka može da se koristi za detekciju CD73-eksprimirajućih ćelija putem rendgena ili drugih dijagnostičkih tehnika, kao što je pozitronska emisiona tomografija (PET).
[0369] Dalje, radiološka oznaka može da se koristi terapeutski kao toksin za CD73-eksprimirajuće ćelije, kao što su one koje uzrokuju neželjeni imunski odgovor. Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće radioizotope ili radionuklide: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I i 131I. U nekim aspektima, anti-CD73 vezujući molekul može biti obeležen paramagnetnim, radioaktivnim ili fluorogenim jonom koji može da se detektuje snimanjem. U nekim aspektima, paramagnetni jon je hrom (III), mangan (II), gvožđe (III), gvožđe (II), kobalt (II), nikl (II), bakar (II), neodim (III), samarijum (III), iterbijum (III), gadolinijum (III), vanadijum (II), terbijum (III), disprozijum (III), holmijum (III) ili erbijum (III). U drugim aspektima, radioaktivni jon je jod-123, tehnecijum-99, indijum-111, renijum-188, renijum-186, bakar-67, jod-131, itrijum-90, jod-125, astat-211 i galijum-67. U drugim aspektima, anti-Cd73 vezujući molekul je obeležen agensom za rendgensko snimanje kao što je lantan (III), zlato (III), olovo (II) i bizmut (III). Ovde otkriveni anti-CD73 vezujući molekuli takođe mogu biti derivatizovani sa hemijskom grupom, na primer, polimerom kao što je polietilen glikol (PEG), metil grupa, etil grupa ili ugljovodonična grupa. Te grupe su korisne za unapređenje bioloških karakteristika antitela, npr. za produženje poluživota u serumu ili povećanje vezivanja tkiva.
[0370] Termin „citotoksični agens“, kako se ovde koristi, široko je definisan i odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili uzrokuje uništavanje ćelija (ćelijska smrt) i/ili vrši antineoplastična/antiproliferativna dejstva. Na primer, citotoksični agens može da spreči, neposredno ili posredno, razvoj, sazrevanje ili širenje neoplastičnih ćelija tumora. Pojam uključuje i one agense koji uzrokuju samo citostatičko dejstvo, a ne prosto citotoksično dejstvo. Termin uključuje hemoterapeutske agense kako su u nastavku navedeni, kao i druge antagoniste CD73, antiangiogene agense, inhibitore tirozinske kinaze, inhibitore proteinske kinaze A, članove familije citokina, radioaktivne izotope i toksine, kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla.
[0371] Termin „hemoterapeutski agens“ je podskup termina „citotoksični agens“ koji obuhvata prirodna ili sintetička hemijska jedinjenja. Primeri za hemoterapeutike ili agense uključuju alkilujuće agense, na primer, azotne iperite, jedinjenja etilenimina, alkil sulfonate i druga jedinjenja sa alkilujućim dejstvom, kao što su nitrozureje, cisplatin i dakarbazin; antimetabolite, na primer, folnu kiselinu, antagoniste purina ili pirimidina; mitotične inhibitore, na primer, vinka alkaloide i derivate podofilotoksina; citotoksične antibiotike i derivate kamptotecina. Drugi hemoterapeutski agensi su amifostin (ETHYOL®), cisplatin, dakarbazin (DTIC), daktinomicin, mehloretamin (azotni iperit), streptozocin, ciklofosfamid, karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), doksorubicin (ADRIAMYCIN®), doksorubicin lipo (DOXIL®), gemcitabin (GEMZAR®), daunorubicin, daunorubicin lipo (DAUNOXOME®), prokarbazin, mitomicin, citarabin, etopozid, metotreksat, 5-fluorouracil (5-FU), vinblastin, vinkristin, bleomicin, paklitaksel (TAXOL®), docetaksel (TAXOTERF®), aldesleukin, asparaginaza, busulfan, karboplatin, kladribin, kamptotecin, CPT-11, 10-hidroksi-7-etilkamptotecin (SN38), gefitinib (IRESSA®), dakarbazin, floksuridin, fludarabin, hidroksiureja, ifosfamid, idarubicin, mesna, interferon alfa, interferon beta, irinotekan, mitoksantron, topotekan, leuprolid, megestrol, melfalan, merkaptopurin, plikamicin, mitotan, pegaspargaza, pentostatin, pipobroman, plikamicin, streptozocin, tamoksifen, tenipozid, testolakton, tioguanin, tiotepa, iperit uracila, vinorelbin, inhibitori hlorambucil aromataze, i njihove kombinacije.
[0372] U svrhe predmetnog otkrića, treba da bude jasno da modifikovana anti-CD73 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da sadrže bilo koju vrstu varijabilnog regiona koji obezbeđuje povezivanje antitela ili polipeptida sa CD73. U ovom pogledu, varijabilni region može da sadrži ili da bude izveden iz bilo koje vrste sisara koji može biti indukovan da pokrene humoralni odgovor i stvori imunoglobuline na željeni antigen povezan sa tumorom. Kao takav, varijabilni region modifikovanih anti-CD73 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenta može biti, na primer, humanog, mišjeg porekla, porekla od nehumanog primata (npr. majmuna cinomolgus, makakija itd.) ili vučjeg porekla. U nekim aspektima, i varijabilni i konstantni regioni modifikovanih anti-CD73 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata su humani. U drugim aspektima, varijabilni regioni kompatibilnih antitela (obično dobijenih iz nehumanog izvora) mogu biti konstruisani ili specifično prilagođeni da poboljšaju osobine vezivanja ili smanje imunogenost molekula. U ovom pogledu, varijabilni regioni mogu biti humanizovani ili na drugi način izmenjeni kroz uključivanje unetih aminokiselinskih sekvenci.
[0373] U određenim aspektima, varijabilni domeni u teškom i lakom lancu anti-CD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta su izmenjeni barem delimičnom zamenom jednog ili više CDR-a i, po potrebi, delimičnom zamenom regiona okvira i promenom sekvence. Iako CDR-i mogu biti izvedeni iz antitela iste klase ili čak potklase kao antitelo iz kog su izvedeni regioni okvira, predviđeno je da će CDR-i biti izvedeni iz antitela različite klase i, u nekim aspektima, iz antitela različite vrste. Nije neophodno da se zamene svi CDR-i kompletnim CDR-ima iz varijabilnog regiona donora da bi se prenela sposobnost za vezivanje antigena jednog varijabilnog domena za drugi. Zapravo, jedino je neophodno da se prenesu oni ostaci koji su neophodni za održavanje aktivnosti mesta za vezivanje antigena. Pošto su objašnjenja data u U.S. Pat. br. 5,585,089, 5,693,761 i 5,693,762, stručnjaci će biti u mogućnosti da dobiju funkcionalno antitelo smanjene imunogenosti, bilo putem izvođenja rutinskih eksperimenata ili testiranjem postupkom probe i greške.
[0374] Ne uzimajući u obzir izmene varijabilnog regiona, stručnjaci će imati u vidu da će modifikovana anti-CD73 antitela (na primer, modifikovani klon 10.3 antitelo ili modifikovani klon 2C5 antitelo) ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sadržati antitela (npr. antitela kompletne dužine ili njihove imunoreaktivne fragmente) u kojima je najmanje deo jednog ili više domena konstantnih regiona izbrisano ili na drugi način izmenjeno kako bi se obezbedile željene biohemijske karakteristike, kao što je povećana lokalizacija tumora ili kraći poluživot u serumu u poređenju sa antitelom približno iste imunogenosti koje sadrži prirodni ili neizmenjeni konstantni region. U nekim aspektima, konstantni region modifikovanih antitela sadržaće humani konstantni region. Modifikacije konstantnog regiona kompatibilne sa ovim ovde otkrivenim anti-CD73 molekulima uključuju adicije, delecije ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena. To jest, modifikovana antitela opisana ovde mogu sadržati promene ili modifikacije na jednom ili više od tri konstantna domena teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) i/ili konstantna domena lakog lanca (CL). U nekim aspektima, razmatraju se modifikovani konstantni regioni, pri čemu je jedan ili više domena delimično ili potpuno obrisano. U nekim aspektima, modifikovana antitela će sadržati konstrukcije obrisanog domena ili varijante naznačene time što je ceo CH2 domen uklonjen (ΔCH2 konstrukcije). U nekim aspektima, izostavljeni domen konstantnog regiona biće zamenjen kratkim aminokiselinskim spejserom (npr.10 ostataka) koji obezbeđuje određenu molekulsku fleksibilnost koju uobičajeno daje odsutni konstantni region.
[0375] Pored njegove konfiguracije, u struci je poznato da konstantni region posreduje u nekoliko efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa za antitela aktivira sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna za opsonizaciju i lizu ćelijskih patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše inflamatorni odgovor i takođe može imati ulogu u autoimunoj hipersenzitivnosti. Dalje, antitela se vezuju za ćelije putem Fc regiona, sa Fc receptorskim mestom na Fc regiona antitela koje se vezuje za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji više Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (eta receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mi receptore). Vezivanje antitela Fc receptora na površini ćelije pokreće više važnih i raznolikih bioloških odgovora uključujući obuhvatanje i uništavanje čestica obloženih antitelom, čišćenje imunskih kompleksa, lizu ciljnih ćelija obloženih antitelom od strane ćelija ubica (nazvanu ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela ili ADCC), otpuštanje inflamatornih medijatora, placentarni transfer i kontrolu proizvodnje imunoglobulina.
[0376] U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment obezbeđuje izmenjene efektorske funkcije koje, sa druge strane, utiču na biološki profil primenjenog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Na primer, delecija ili inaktivacija (kroz tačkaste mutacije ili na druge načine) domena konstantnog regiona može da smanji vezivanje Fc receptora cirkulišućeg modifikovanog antitela, što povećava lokalizaciju u tumoru. U drugim slučajevima, može biti slučaj da modifikacije konstantnog regiona, konzistentne sa ovim otkrićem, ublažavaju vezivanje komplementa i tako smanjuju poluživot u serumu i nespecifično vezivanje konjugovanog citotoksina. Druge modifikacije konstantnog regiona mogu biti korišćene da se eliminišu disulfidne veze ili oligosaharidni ostaci koji dozvoljavaju povećanu lokalizaciju usled povećane antigenske specifičnosti ili fleksibilnosti antitela. Slično, modifikacije konstantnog regiona u saglasnosti sa ovim otkrićem mogu lako da budu napravljene koristeći dobro poznate biohemijske tehnike ili tehnike molekulskog konstruisanja koje su u delokrugu iskusnog stručnjaka.
[0377] U određenim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekul koji je antitelo (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment nema jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, u nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment nema aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i/ili nema aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). U određenim aspektima, anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ne vezuje Fc receptor i/ili faktore komplementa. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment nema efektorsku funkciju.
[0378] Treba uočiti da, u određenim aspektima, anti-CD73 modifikovana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu biti konstruisani da fuzionišu CH3 domen neposredno sa regionom šarke odgovarajućih modifikovanih antitela ili njihovih fragmenata. U drugim konstrukcijama može biti poželjno obezbediti peptidni spejser između regiona šarke i
1
modifikovanih domena CH2 i/ili CH3. Na primer, mogu biti eksprimirani kompatibilni konstrukti u kojima je CH2 domen izbrisan, i preostali CH3 domen (modifikovan ili nemodifikovan) je povezan sa regionom šarke putem spejsera od 5-20 aminokiselina. Takav spejser može biti dodat, na primer, da se obezbedi da regulatorni elementi konstantnog regiona ostanu slobodni i dostupni ili da region šarke ostane fleksibilan. Međutim, treba napomenuti da se u nekim slučajevima može pokazati da su aminokiselinski spejseri imunogeni i izazivaju neželjeni imunski odgovor na konstrukt. Prema tome, u određenim aspektima, bilo koji spejser dodat konstruktu će biti relativno neimunogen ili čak potpuno izostavljen, da bi se održale željene biohemijske osobine modifikovanih antitela.
[0379] Pored delecije čitavih domena konstantnog regiona, biće jasno da anti-CD73 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti iz predmetnog otkrića mogu da se obezbede delimičnom delecijom ili supstitucijom nekoliko aminokiselina, ili čak samo jedne aminokiseline. Na primer, mutacija pojedinačne aminokiseline u izabranim regionima CH2 domena može da bude dovoljna da suštinski smanji Fc vezivanje i tako poveća tumorsku lokalizaciju. Slično tome, može biti poželjno jednostavno izbrisati taj deo jednog ili više domena konstantnog regiona koji kontroliše efektorsku funkciju (npr. vezivanje C1Q komplementa) koju treba modulisati. Takve parcijalne delecije konstantnih regiona mogu da poboljšaju izabrane karakteristike antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta (npr. poluživot u serumu), pri čemu ostale željene funkcije povezane sa domenom konstantnog regiona ispitanika ostaju netaknute. Štaviše, kao što je prethodno pomenuto, konstantni regioni otkrivenih anti-CD73 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata mogu da budu modifikovani kroz mutaciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselina koje poboljšavaju profil dobijene konstrukcije. U ovom pogledu, moguće je prekinuti aktivnost obezbeđenu očuvanim mestom vezivanja (npr. Fc vezivanje) dok se suštinski održava konfiguracija i imunogeni profil modifikovanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Određeni aspekti mogu da sadrže dodatak jedne ili više aminokiselina konstantnom regionu radi poboljšanja željenih karakteristika, kao što je smanjenje ili povećanje efektorske funkcije ili obezbeđivanje vezivanja više citotoksina ili ugljenih hidrata. U takvim aspektima može biti poželjno umetanje ili replikacija određene sekvence izvedene iz odabranih domena konstantnog regiona.
[0380] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje varijante i ekvivalente koji su suštinski homologni sa ovde datim himernim, humanizovanim i humanim anti-CD73 antitelima ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima. Oni mogu da sadrže, na primer, mutacije
1 1
konzervativne supstitucije, tj. supstituciju jedne ili više aminokiselina sličnim aminokiselinama. Na primer, konzervativna susptitucija označava supstituciju jedne aminokiseline drugom unutar iste opšte klase kao što je, na primer, jedna kisela aminokiselina drugom kiselom aminokiselinom, jedna bazna aminokiselina drugom baznom aminokiselinom ili jedna neutralna aminokiselina drugom neutralnom aminokiselinom. Ono što se smatra konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom je dobro poznato u struci.
[0381] Anti-CD73 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može biti dalje modifikovan da obuhvata dodatne hemijske ostatke koji nisu normalno deo proteina. Ovi izvedeni ostaci mogu da poboljšaju rastvorljivost, biološki poluživot i apsorpciju proteina. Ostaci mogu takođe da smanje ili eliminišu bilo koje željene sporedne efekte proteina i slično. Pregled ovih ostataka može se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, 20. izd, Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
VI. Polinukleotidi koji kodiraju CD73-vezujuće molekule
[0382] U određenim aspektima, predmetno otkriće obuhvata polinukleotide koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid koji specifično vezuje CD73 ili njegov antigen-vezujući fragment. Na primer, predmetno otkriće obezbeđuje polinukleotid koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira anti-CD73 antitelo (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili kodira antigen-vezujući fragment takvog antitela. Polinukleotidi iz predmetnog otkrića mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK. DNK uključuje cDNK, genomsku DNK i sintetičku DNK i može biti dvolančana ili jednolančana, i ako je jednolančana, može biti kodirajući niz ili nekodirajući (besmisleni) niz.
[0383] U određenim aspektima, polinukleotidi su izolovani. U određenim aspektima, polinukleotidi su suštinski čisti. U određenim aspektima, polinukleotid sadrži kodirajuću sekvencu za zreli polipeptid fuzionisan u istom okviru za čitanje sa polinukleotidom koji pomaže, na primer, u ekspresiji i sekreciji polipeptida iz ćelije domaćina (npr. vodeća sekvenca koja deluje kao sekretorna sekvenca za kontrolisanje transporta polipeptida iz ćelije). Polipeptid koji ima vodeću sekvencu je preprotein, i može imati vodeću sekvencu koja je otcepljena od strane ćelije domaćina radi formiranja zrelog oblika polipeptida. Polinukleotidi mogu takođe da kodiraju CD73-vezujući proprotein koji je zreli protein, plus dodatne 5' aminokiselinske ostatke.
1 2
[0384] U određenim aspektima, polinukleotidi sadrže kodirajuću sekvencu za zreli CD73-vezujući polipeptid, npr. anti-CD73 antitelo (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment fuzionisan u istom okviru za čitanje sa sekvencom markera koja omogućava, na primer, prečišćavanje kodiranog polipeptida. Na primer, marker sekvenca može biti heksahistidinska oznaka obezbeđena od pQE-9 vektora da obezbedi prečišćavanje zrelog polipeptida fuzionisanog sa markerom, u slučaju bakterijskog domaćina, ili marker sekvenca može biti hemaglutininska (HA) oznaka izvedena iz proteina hemaglutinina influence kada se koristi domaćin sisar (npr. COS-7 ćelije).
[0385] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje varijante opisanih polinukleotida koje kodiraju, na primer, CD73-vezujuće fragmente, analoge i derivate ovde otkrivenih CD73-vezujućih molekula (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo).
[0386] Polinukleotidne varijante mogu da sadrže izmene u kodirajućem regionu, nekodirajućem regionu, ili u oba. U nekim aspektima, polinukleotidne varijante sadrže izmene koje proizvode tihe supstitucije, adicije ili delecije, ali ne menjaju svojstva ili aktivnosti kodiranog polipeptida. U nekim aspektima, nukleotidne varijante su proizvedene tihim supstitucijama usled degeneracije genetskog koda. Polinukleotidne varijante mogu biti proizvedene iz mnogobrojnih razloga, npr. da optimizuju ekspresiju kodona za određenog domaćina (promene kodona u humanoj iRNK u one preferentne za bakterijskog domaćina, kao što je E. coli). Vektori i ćelije koji sadrže ovde opisane polinukleotide su takođe predstavljeni.
[0387] U nekim aspektima, sekvenca DNK koja kodira CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment može da se konstruiše hemijskom sintezom koristeći oligonukleotidni sintetizator. Takvi oligonukleotidi mogu biti stvoreni na bazi aminokiselinske sekvence željenog polipeptida i izborom onih kodona koji su preferirani u ćeliji domaćina u kojoj će rekombinantni polipeptid od interesa biti proizveden. Standardne metode mogu biti primenjene da se sintetiše izolovana polinukletidna sekvenca koja kodira izolovani polipeptid od interesa. Na primer, kompletna aminokiselinska sekvenca može biti korišćena da se konstruiše gen koji se translatuje unazad. Dalje, DNK oligomer koji obuhvata nukleotidnu sekvencu za kodiranje određenog izolovanog polipeptida može da bude sintetisan. Na primer, više malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu biti sintetisani i
1
potom povezani. Pojedinačni oligonukleotidi tipično sadrže 5' ili 3' spojnice za komplementarni sklop.
[0388] Nakon sklapanja (sintezom, mutagenezom usmerenom na mesto ili drugim postupkom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju određeni izolovani polipeptid od interesa biće umetnute u ekspresioni vektor i operativno povezane sa kontrolnom sekvencom za ekspresiju odgovarajućom za ekspresiju u proteinu željenog domaćina. Pravilno sastavljanje može da se potvrdi sekvenciranjem nukleotida, restriktivnim mapiranjem i ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u odgovarajućem domaćinu. Kao što je dobro poznato u struci, da bi se dobili visoki nivoi ekspresije transficiranog gena kod domaćina, gen mora biti operativno povezan sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama za ekspresiju koje su funkcionalne u izabranom domaćinu za ekspresiju.
[0389] U određenim aspektima, rekombinantni ekspresioni vektori se koriste da povećaju i eksprimiraju DNK koja kodira anti-CD73 antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihove antigen vezujući fragmente. Rekombinantni ekspresioni vektori su replikabilni konstrukti DNK koji imaju sintetičke DNK fragmente ili DNK fragmente izvedene iz cDNK, koji kodiraju polipeptidni lanac anti-CD73 antitela ili njegov antigen vezujući fragment, operativno povezane sa odgovarajućim transkripcionim ili translacionim regulacionim elementima izvedenim iz gena sisara, mikroba, virusa ili insekata.
[0390] Transkripciona jedinica obično obuhvata skup (1) genetičkog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gena, na primer, transkripcioni promoteri ili pojačivači, (2) strukturnu ili kodirajuću sekvencu koja se transkribuje u mRNK i prevodi se u protein i (3) odgovarajuće sekvence za inicijaciju i terminaciju transkripcije i translacije, kako je detaljno opisano u nastavku. Takvi regulatorni elementi mogu da uključe sekvencu operatora radi kontrole transkripcije. Sposobnost replikacije u domaćinu, obično određena poreklom replikacije, kao i selekcioni gen za olakšavanje prepoznavanje transformanta, mogu dodatno da se uključe. DNK regioni su operativno povezani kada su funkcionalno povezani jedan sa drugim. Na primer, DNK za pojedinačni peptid (sekretorni vodič) je operativno povezan sa DNK za polipeptid ako je eksprimiran kao prekursor koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako ona kontroliše transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma je operativno povezano za kodirajuću sekvencu ako je tako pozicionirano da dozvoljava translaciju. Strukturni elementi namenjeni
1 4
za korišćenje u sistemima ekspresije kvasca uključuju vodeću sekvencu koja omogućava ekstracelularnu sekreciju translatovanog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, kada je rekombinantni protein eksprimiran bez vodeće ili transportne sekvence, može da uključuje N-terminalni metioninski ostatak. Ovaj ostatak opciono može da sledstveno bude pocepan od eksprimiranog rekombinantog proteina da obezbedi finalni proizvod.
[0391] Izbor sekvence za kontrolu ekspresije i vektora ekspresije će zavisiti od izbora domaćina. Širok izbor kombinacija domaćina/vektora za ekspresiju može biti upotrebljen. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine uključuju, na primer, vektore koji sadrže kontrolne sekvence za ekspresiju iz SV40, kravljeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Korisni ekspresioni vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pCR 1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, širi opseg plazmida domaćina, kao što su M13 i filamentozni jednolančani DNK fagi.
[0392] Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju CD73-vezujućeg molekula, npr. anti-CD73 antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta uključuju prokariote, ćelije kvasca, insekata ili viših eukariota pod kontrolom odgovarajućih promotera. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Više eukariotske ćelije uključuju ćelijske linije porekla od sisara, kako je opisano u nastavku. Takođe mogu da se koriste translacioni sistemi bez ćelija. Odgovarajući klonirajući i ekspresioni vektori za upotrebu sa ćelijama domaćinima bakterija, gljiva, kvasaca i sisara opisani su u Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985). Dodatne informacije vezane za postupke proizvodnje proteina, uključujući proizvodnju antitela, mogu se naći, npr. u U.S. patentnoj publikaciji br.
2008/0187954, U.S. patentima br.6,413,746, 6,660,501, i 7,932,087.
[0393] Različiti sistemi ćelijskih kultura sisara ili insekata mogu takođe pogodno da se koriste za ekspresiju rekombinantnih CD73-vezujućih molekula, npr. anti-CD73 antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata. Ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara može da se postigne jer su takvi proteini uobičajeno pravilno presavijeni, prikladno modifikovani i u potpunosti funkcionalni.
1
[0394] Primeri za pogodne ćelijske linije domaćina sisara uključuju HEK-293 i HEK-293T, COS-7 linije ćelija bubrega majmuna, koje opisuje Gluzman (Cell 23:175, 1981), kao i druge ćelijske linije koje uključuju, na primer, L ćelije, C127, 3T3, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa i BHK ćelijske linije. Ekspresioni vektori sisara mogu da sadrže netranskribovane elemente, kao što je mesto početka replikacije, odgovarajući promoter i pojačivač povezan sa genom koji se eksprimira, kao i druge 5' ili 3' bočne netranskribovane sekvence, kao i 5' ili 3' netranslantovane sekvence, kao što su neophodna mesta za vezivanje ribozoma, mesto poliadenilacije, mesto donora spejsera i akceptora, i sekvence za terminaciju transkripcije. Sistemi bakulovirusa za proizvodnju heterologih proteina u ćelijama insekata su predstavljeni od strane Luckow and Summers, BioTechnology 6:47 (1988).
[0395] CD73-vezujući molekuli, npr. anti-CD73 antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovi antigen-vezujući fragmenti proizvedeni od strane transformisanog domaćina mogu biti prečišćeni u skladu sa bilo kojim odgovarajućim postupkom. Takvi standardni postupci uključuju hromatografiju (npr. jonoizmenjivačku, afinitetnu i hromatografiju na molekulskim sitima), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost, ili bilo koje druge standardne tehnike za prečišćavanje proteina. Afinitetne oznake, kao što je heksahistidin, domen za vezivanje maltoze, sekvenca oblaganja influence i glutation S-transferaza, mogu biti vezane za protein da omoguće lako prečišćavanje putem prelaska preko odgovarajuće afinitetne kolone. Izolovani proteini mogu takođe biti fizički okarakterisani korišćenjem tehnika kao što je proteoliza, nuklearna magnetna rezonanca i rendgenska kristalografija.
[0396] Na primer, supernatanti iz sistema koji luče rekombinantni protein u medijum za uzgajanje mogu biti prvo koncentrovani korišćenjem komercijalno dostupnog filtera za koncentrovanje proteina, na primer, AMICON® ili Millipore PELLICON® jedinice za ultrafiltraciju. Nakon koraka ultrafiltracije, koncentrat može biti primenjen na odgovarajuću matricu za prečišćavanje. Alternativno, može biti upotrebljena smola za jonsku izmenu, na primer, matrica ili supstrat koji ima bočne dietilaminoetil (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamid, agaroza, dekstran, celuloza, ili druge vrste koje se uobičajeno koriste u prečišćavanju proteina. Alternativno, korak izmene katjona se može upotrebiti. Odgovarajući izmenjivači katjona uključuju različite nerastvorljive matrice koje sadrže sulfopropil ili karboksimetil grupe. Na kraju, jedan ili više koraka reversno fazne tečne hromatografije visokih performansi (RP-HPLC) koji koristi hidrofobni RP-HPLC medijum, npr. silika gel
1
koji ima bočne metil ili druge alifatične grupe, može da se koristi za dalje prečišćavanje CD73-vezujućeg molekula (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo). Neki ili svi gorepomenuti koraci za prečišćavanje, u različitim kombinacijama, mogu takođe biti upotrebljeni da omoguće homogeni rekombinantni protein.
[0397] Rekombinantni CD73-vezujući protein, npr. anti-CD73 antitelo (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigen-vezujući fragment proizvedeni u bakterijskoj kulturi mogu da se izoluju, na primer, inicijalnom ekstrakcijom iz ćelijskih peleta, nakon čega sledi jedan ili više koraka koncentracije, isoljavanja, jonske izmene u vodi ili hromatografije na molekulskim sitima. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) može biti upotrebljena za krajnje korake prečišćavanja. Mikrobne ćelije upotrebljene u ekspresiji rekombinantnog proteina mogu biti prekinute bilo kojim odgovarajućim metodom, uključujući ciklus zamrzavanja-otapanja, sonikaciju, mehanički prekid ili korišćenje agensa za lizu ćelija.
[0398] Metode poznate u struci za prečišćavanje antitela i drugih proteina takođe uključuju, na primer, one opisane u publikaciji U.S. Patent Publication br.2008/0312425, 2008/0177048 i 2009/0187005.
[0399] U određenim aspektima, CD73-vezujući molekul je polipeptid koji nije antitelo. U struci su poznati različiti postupci za identifikaciju i proizvodnju polipeptida koji nisu antitela koji se sa velikim afinitetom vezuju za proteinski cilj. Vidite, npr. Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008), i Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008). U određenim aspektima, tehnologija displeja faga može da se koristi za identifikaciju/proizvodnju CD73-vezujućeg polipeptida. U određenim aspektima, polipeptid sadrži proteinsku konstrukciju vrste koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od proteina A, lipokalina, domena fibronektina (npr. domen fibronektina kao što je tenascin-3 Fn III domen), ponavljajućeg domena konsenzusa ankirina i tioredoksina.
VI. Postupci lečenja koristeći terapeutska anti-CD73 antitela
[0400] Predmetno otkriće obezbeđuje postupke usmerene na upotrebu anti-CD73 vezujućih molekula, npr. antitela, uključujući njihove antigen-vezujuće fragmente, varijante i derivate (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), u lečenju pacijenata koji imaju bolest
1
povezanu sa ekspresijom CD73 ili ćelijama koje eksprimiraju CD73, npr. kancer. U nekim specifičnim aspektima, takav kancer je kancer pluća, kancer dojke, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer bešike, kancer pankreasa, kancer bubrega, kancer želuca, kancer prostate, kancer dojke, kancer pluća-kolona i limfom.
[0401] Pod „ćelijom koja eksprimira CD73“ podrazumeva se ćelija koja eksprimira CD73. CD73 može biti vezan za membranu putem usidravanja glikozil fosfatidilinozitolom i takođe prisutan kao rastvorljivi protein. Postupci za detekciju ekspresije CD73 u ćelijama i drugim odgovarajućim uzorcima su dobro poznati u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na imunohistohemiju, protočnu citometriju, vestern blot, ELISA, i slično.
[0402] Iako se sledeće razmatranje odnosi na dijagnostičke postupke i lečenje različitih bolesti i poremećaja CD73-vezujućim molekulom iz predmetnog otkrića (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), ovde opisani postupci su takođe primenljivi na sva druga anti-CD73 antitela, i antigen-vezujuće fragmente, varijante i derivate (npr. fuzioni proteini ili konjugati) ovih anti-CD73 antitela koji zadržavaju željena svojstva ovde otkrivenih anti-CD73 antitela, npr. sposobnost specifičnog vezivanja CD73 i neutralisanja njegove aktivnosti 5'-nukleotidaze. U nekim aspektima, CD73-vezujući molekuli su humana ili humanizovana antitela koja ne posreduju humanu ADCC, ili su anti-CD73 antitela koja su konstruisana tako da ne posreduju ADCC.
[0403] U nekim aspektima, CD73-vezujući molekul je CD730010 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, klon 10.3 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, CD730002 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, klon 2C5 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, ili CD73004 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U ostalim aspektima, CD73-vezujući molekul je klon 10.3 mutantno antitelo. U nekim aspektima, CD73-vezujući molekul je klon 10.3 monoklonsko antitelo. U nekim aspektima, CD73-vezujući molekul je klon 10.3 monoklonsko antitelo konstruisano da produži poluživot u serumu. U drugim aspektima, CD73-vezujući molekuli je klon 10.3 YTE mutantno antitelo. U ostalim aspektima, CD73-vezujući molekul je klon 2C5 mutantno antitelo. U nekim aspektima, CD73-vezujući molekul je klon 2C5 monoklonsko antitelo. U nekim aspektima, CD73-vezujući molekul je klon 2C5 monoklonsko antitelo konstruisano da produži poluživot u serumu. U drugim aspektima, CD73-vezujući molekul je klon 2C5 YTE mutantno antitelo.
1
[0404] U jednom aspektu, lečenje uključuje primenu ili administraciju anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, varijante ili derivata iz predmetnog otkrića na ispitaniku ili pacijentu, ili primenu ili administraciju anti-CD73 vezujućeg molekula na izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji ispitanika ili pacijenta, pri čemu ispitanik ili pacijent ima bolest, simptom bolesti ili predispoziciju za bolest. U drugom aspektu, lečenje takođe treba da uključuje primenu ili administraciju farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD73 vezujući molekul, npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata iz predmetnog otkrića na ispitaniku ili pacijentu, ili primenu ili administraciju farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD73 vezujući molekul na izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji ispitanika ili pacijenta koji ima bolest, simptom bolesti ili predispoziciju za bolest.
[0405] Anti-CD73 vezujući molekuli, npr. antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati iz predmetnog otkrića korisni su u lečenju različitih kancera. U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD73 vezujuće molekule, npr. antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihove antigen-vezujuće fragmente, varijante ili derivate za upotrebu kao lek, naročito za upotrebu u lečenju ili profilaksi kancera (npr. kancer debelog creva, melanom, kancer dojke, limfom ili nemikrocelularni karcinom pluća, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom i Burkitov limfom, kancer jajnika, kancer dojke, kanceri glave i vrata i kancer pankreasa).
[0406] U nekom aspektu, kancer predstavlja prometastatski fenotip. U nekim aspektima, kancer koji predstavlja prometastatski fenotip je melanom ili kancer dojke. U nekim aspektima, kancer je metastatski kancer. U nekim aspektima, ovde otkriveni anti-CD73 vezujući molekuli mogu da aktiviraju adaptivnu antitumorsku aktivnost i/ili da inhibiraju metastazu. U nekim određenim aspektima, ovde otkriveni anti-CD73 vezujući molekuli mogu da inhibiraju metastazu kod kancera dojke.
[0407] U skladu sa postupcima iz predmetnog otkrića, najmanje jedan anti-CD73 vezujući molekul, npr. antitelo (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegov antigenvezujući fragment, varijanta ili derivat, kako su definisani na drugom mestu u ovom tekstu, koristi se za promovisanje pozitivnog terapeutskog odgovora na kancer. Termin „pozitivni terapeutski odgovor“, u pogledu lečenja kancera, odnosi se na poboljšanje bolesti povezano sa aktivnošću ovih anti-CD73 vezujućih molekula, npr. antitela ili njihovih antigen-vezujućih
1
fragmenata, varijanti ili derivata i/ili na poboljšanje simptoma povezanih sa bolešću. Poboljšanje bolesti tako, na primer, može da se okarakteriše kao potpuni odgovor. Pod „potpunim odgovorom“ podrazumeva se odsustvo bolesti koja klinički može da se detektuje uz normalizaciju rezultata bilo kojih prethodnih testova. Alternativno, poboljšanje bolesti može da se okarakteriše kao parcijalni odgovor. „Pozitivan terapeutski odgovor“ obuhvata smanjenje ili inhibiciju progresije i/ili trajanja kancera, smanjenje ili ublažavanje težine kancera i/ili ublažavanje jednog ili više njegovih simptoma usled primene anti-CD73 vezujućeg molekula koji je ovde otkriven.
[0408] U specifičnim aspektima, takvi termini se odnose na jedan, dva ili tri ili više rezultata nakon primene ovde otkrivenih anti-CD73 vezujućih molekula: (1) stabilizacija, smanjenje ili uklanjanje populacije ćelija kancera; (2) stabilizacija ili smanjenje rasta kancera; (3) ometanje nastanka kancera; (4) iskorenjivanje, uklanjanje ili kontrola primarnog, regionalnog i/ili metastatskog kancera; (5) smanjenje mortaliteta; (6) povećanje preživljavanja, trajanja ili stope bez bolesti, bez relapsa, bez progresije i/ili ukupnog; (7) povećanje stope odgovora, trajnosti odgovora ili broja pacijenata koji reaguju ili su u remisiji; (8) smanjenje stope hospitalizacije, (9) smanjenje trajanja hospitalizacije, (10) veličina kancera se održava i ne povećava, ili povećava za manje od 10%, poželjno manje od 5%, poželjno manje od 4%, poželjno manje od 2%, i (12) povećanje broja pacijenata u remisiji.
[0409] Klinički odgovor može da se ispita koristeći tehnike skrininga kao što su skeniranje magnetnom rezonancom (MR), rendgensko radiografsko snimanje, skeniranje kompjuterizovanom tomografijom (CT), protočna citometrija ili fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje (FACS), histologija, ukupna patologija i hemijsko ispitivanje krvi, uključujući, bez ograničenja, promene koje mogu da se detektuju putem ELISA, RIA, hromatografije, i slično. Pored ovih pozitivnih terapeutskih odgovora, ispitanik koji je podvrgnut terapiji anti-CD73 vezujućim molekulom, npr. antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom, varijantom ili derivatom, može iskusiti korisno dejstvo poboljšanja simptoma koji su povezani sa bolešću.
[0410] Anti-CD73 vezujući molekuli, npr. antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovi ovde otkriveni antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu da se koriste u kombinaciji sa bilo kojim poznatim terapijama za kancer, uključujući bilo koji agens ili kombinaciju agensa za koje je poznato da su korisni, ili koji su korišćeni ili se
11
trenutno koriste, za lečenje kancera, npr. kancera debelog creva, melanoma, kancera dojke, limfoma, nemikrocelularnog karcinoma pluća, Hodžkinovog limfoma, non-Hodžkinovog limfoma i Burkitovog limfoma, kancera jajnika, kancera dojke, kancera glave i vrata, i kancera pankreasa). Drugi agens ili kombinacija agensa iz farmaceutske kombinovane formulacije ili doznog režima poželjno ima komplementarne aktivnosti sa antitelom ili polipeptidom iz predmetnog otkrića, tako da ne utiču štetno jedan na drugi.
[0411] Agensi protiv kancera uključuju lekove koji se koriste za lečenje malignosti, kao što je kancerozni rast. Terapija lekovima može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim lečenjima, kao što je operacija ili terapija zračenjem. Nekoliko klasa lekova može da se koristiti u lečenju kancera, u zavisnosti od prirode organa koji je uključen. Na primer, kanceri dojke su obično stimulisani estrogenima, i mogu da se leče lekovima koji inaktiviraju polne hormone. Slično tome, kancer prostate može da se leči lekovima koji inaktiviraju androgene, muški polni hormon. Agensi protiv kancera za upotrebu u određenim postupcima iz predmetnog otkrića uključuju, između ostalog, antitela (npr. antitela koja vezuju IGF-1R, antitela koja vezuju EGFR, antitela koja vezuju Her2 ili antitela koja vezuju cMET), male molekule koji ciljaju IGF1R, male molekule koji ciljaju EGFR, male molekule koji ciljaju Her2, antimetabolite, alkilujuće agense, inhibitore topoizomeraze, agense koji ciljaju mikrotubule, inhibitore kinaze, inhibitore sinteze proteina, imunoterapeutske agense, hormonske terapije, glukokortikoide, inhibitore aromataze, inhibitore mTOR, hemoterapeutske agense, inhibitore proteinske kinaze B, inhibitore fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K), inhibitore kinaze zavisne od ciklina (CDK), RLr9, CD289, enzimske inhibitore, anti-TRAIL, MEK inhibitore, itd.
[0412] U specifičnim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli, npr. antitela (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da se primenjuju u kombinaciji sa antitelima ili fragmentima antitela koji ciljaju, na primer, PD-1 (protein programirane smrti 1), njegova dva liganda PD-L1 (ligand programirane smrti 1) i/ili PD-L2 ili CTLA-4 (protein antigena citotoksičnog T limfocita 4). Vidite, npr. Stagg et al. PNAS 107:1547-1552 (2010); Jin et al. Cancer Res.70(6): (2010); Allard et al. Clin. Cancer Res. 19:5626 (2013). U nekim aspektima, anti-CTLA-4 antitelo je ipilimumab ili njegov antigen-vezujući fragment. U drugim aspektima, anti-CTLA-4 antitelo je tremelimumab (ticilimumab, CP-675,206) ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim aspektima, anti-PD-1 antitelo je pembrolizumab (KEYTRUDA®, ranije lambrolizumab, poznat i kao MK3475) ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim aspektima, anti-PD-1 antitelo je nivolumab (BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538, OPDIVA®) ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim aspektima, anti-PD-L1 antitelo je BMS-936559 ili njegov antigenvezujući fragment. U drugim aspektima, anti-PD-Ll antitelo je MPDL3280A. U drugim aspektima, anti-PD-1 antitelo je AMP-224 (anti-PD-1 Fc fuzioni protein) ili njegov antigenvezujući fragment. U različitim aspektima, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736 ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0413] U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu da se primene u kombinaciji sa anti-PD-1 ili anti-PD-1 antitelom. U različitim otelotvorenjima, anti-CD73 antitelo se primenjuje u koncentraciji od oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 16 mg/kg, oko 17 mg/kg, oko 18 mg/kg, oko 19 mg/kg, ili oko 20 mg/kg. U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu da se primene u kombinaciji sa anti-PD-1, anti-PD-Ll, ili anti-CTLA4 antitelom, pri čemu se anti-PD-1, anti-PD-Ll, ili anti-CTLA4 antitelo primenjuje u koncentraciji od oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 16 mg/kg, oko 17 mg/kg, oko 18 mg/kg, oko 19 mg/kg, ili oko 20 mg/kg. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo i anti-PD-1 antitelo, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 se primenjuju u odnosu od oko 1:1, 1:2, 1:3 ili 1:4. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo se primenjuju u odnosu od oko 1:2. U određenim aspektima, koncentracija anti-CD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) je oko 10 mg/kg, a koncentracija anti-PD-1 antitela je oko 20 mg/kg. U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu da se primenjuju u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom. U nekim aspektima, primena kombinovanog lečenja koje obuhvata ovde otkriveni CD73-vezujući molekul (na primer, MEDI9447, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) u kombinaciji sa anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelom može da poveća preživljavanje za oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, ili oko 100% u poređenju sa nelečenim ispitanicima ili ispitanicima lečenim monoterapijom (npr. anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo sa anti-CD73 antitelom ili bez njega). U nekim aspektima, primena kombinovanog lečenja koje obuhvata ovde otkriveni CD73-vezujući molekul (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) u kombinaciji sa anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelom može da poveća preživljavanje za oko 2 puta, oko 3 puta, oko 4 puta, oko 5 puta, oko 6 puta, oko 7 puta, oko 8 puta, oko 9 puta, ili oko 10 puta u poređenju sa nelečenim ispitanicima ili ispitanicima lečenim monoterapijom (npr. anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo sa anti-CD73 antitelom ili bez njega).
[0414] Kada kombinovane terapije obuhvataju primenu anti-CD73 vezujućeg molekula u kombinaciji sa primenom drugog terapeutskog agensa (npr. anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo), ovde otkriveni postupci obuhvataju zajedničku primenu, koristeći odvojene formulacije ili jednu farmaceutsku formulaciji, i uzastopnu primenu bilo kojim redosledom. U nekim aspektima, ovde opisana anti-CD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) primenjuju se u kombinaciji sa drugim lekovima, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat i terapeutski agensi mogu da se primenjuju sekvencijalno, bilo kojim redosledom, ili simultano (tj. istovremeno ili u istom vremenskom okviru).
[0415] Kombinovana terapija može da obezbedi „sinergiju“ i da se pokaže „sinergijskom“, tj. dejstvo ostvareno kada se aktivni sastojci koriste zajedno je veće nego zbir dejstava nastalih kada se jedinjenja koriste odvojeno. Sinergijsko dejstvo može da se ostvari kada su aktivni sastojci: (1) zajedno formulisani i primenjeni ili isporučeni istovremeno u kombinovanoj jediničnoj doznoj formulaciji; (2) isporučeni naizmenično ili u paralelnim odvojenim formulacijama; ili (3) nekim drugim režimom. Kada se isporučuju u naizmeničnoj terapiji, sinergijsko dejstvo može da se ostvari kada je jedinjenja primenjuju ili isporučuju sekvencijalno, npr. različitim injekcijama u posebnim špricevima. Uopšteno, prilikom naizmenične terapije, delotvorna doza svakog aktivnog sastojka se primenjuje sekvencijalno, tj. redno, pri čemu se, u kombinovanoj terapiji, delotvorne doze dva ili više aktivnih sastojaka primenjuju zajedno.
[0416] U drugim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu da se primene u kombinaciji sa inhibitorima tirozinske kinaze. U nekim drugim specifičnim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli mogu da se primene u kombinaciji sa inhibitorima aktivnosti tirozinske kinaze povezanim sa EGFR i/ili HER2/neu, npr. lapatinibom. U nekim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući
11
molekuli mogu da se primene u kombinaciji sa antimitotskim agensima. U nekim specifičnim aspektima, ovde otkriveni CD73-vezujući molekuli mogu da se primene u kombinaciji sa agensima koji stabilizuju sklop mikrotubula mitotskog vretena, npr. paklitakselom ili docetakselom, Dalji aspekt je upotreba anti-CD73-vezujućih molekula, npr. antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, varijanti ili derivata (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), za dijagnostičko praćenje nivoa proteina u tkivu u okviru postupka kliničkog ispitivanja, npr. kako bi se utvrdila delotvornost datog režima lečenja. Na primer, detekcija može da se olakša uparivanjem antitela sa supstancom koja može da se detektuje.
[0417] Primeri supstanci koje mogu da se detektuju uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne supstance, luminescentne supstance, bioluminescentne supstance i radioaktivne supstance. Primeri odgovarajućih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri odgovarajućih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri odgovarajućih fluorescentnih supstanci uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlortriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentne supstance uključuje luminol; primeri bioluminescentnih supstanci uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin; a primeri odgovarajuće radioaktivne supstance uključuju<125>I,<131>I,<35>S ili 3H.
VIII. Terapeutske kombinacije i zajednička terapija anti-CD73 antitela
[0418] Predmetno otkriće obezbeđuje postupke usmerene na upotrebu terapeutskih kombinacija koje sadrže anti-CD73 vezujuće molekule, npr. antitela, uključujući njihove antigen-vezujuće fragmente, varijante i derivate (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), za lečenje pacijenata koji imaju kancer (uključujući kancer debelog creva, melanom, kancer dojke, limfom, nemikrocelularni karcinom pluća, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom, Burkitov limfom, kancer jajnika, kancer dojke, kancere glave i vrata, i kancer pankreasa).
[0419] Iako se sledeće razmatranje odnosi na terapeutske kombinacije koje sadrže CD73-vezujući molekul iz predmetnog otkrića (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), ovde opisani postupci su takođe primenljivi na sva druga anti-CD73 antitela, i antigen-vezujuće fragmente, varijante i derivate (npr. fuzioni proteini ili konjugati) ovih anti-CD73 antitela koji zadržavaju željena svojstva ovde otkrivenih anti-CD73 antitela, npr. sposobnost specifičnog vezivanja CD73 i neutralisanja njegove aktivnosti 5'-nukleotidaze. U nekim aspektima, CD73-vezujući molekuli su humana ili humanizovana antitela koja ne posreduju humanu ADCC, ili su anti-CD73 antitela koja su konstruisana tako da ne posreduju ADCC.
[0420] Lečenje pacijenta sa solidnim tumorom koristeći kombinaciju iz otkrića, kao što je anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u kombinaciji sa anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelom ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima, može dovesti do zbirnog ili sinergijskog dejstva. Kako se ovde koristi, termin „sinergijski“ odnosi se na kombinaciju terapija (npr. kombinacija anti-CD73 antitela (npr. MEDI9447) i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitela) koja je delotvornija od zbirnih dejstava pojedinačnih terapija.
[0421] Sinergijsko dejstvo kombinacije terapija (npr. kombinacija anti-CD73 antitela (npr. MEDI9447) i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitela) omogućava upotrebu manjih doza jednog ili više terapeutskih agensa i/ili ređu primenu navedenih terapeutskih agensa na pacijentu sa solidnim tumorom. Mogućnost korišćenja manjih doza terapeutskih agensa i/ili ređe primene navedenih terapija smanjuje toksičnost povezanu sa primenom navedenih terapija na ispitanicima bez smanjenja delotvornosti navedenih terapija u lečenju solidnih tumora. Pored toga, sinergijsko dejstvo može dovesti do poboljšane delotvornosti terapeutskih agensa u kontrolisanju, lečenju ili poboljšavanju solidnog tumora. Sinergijskim dejstvom kombinacije terapeutskih agensa mogu da se izbegnu ili smanje štetna ili neželjena dejstva povezana sa upotrebom bilo koje pojedinačne terapije.
[0422] Kod zajedničke terapije, kombinacija anti-CD73 antitela (npr. MEDI9447) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, opciono može biti uključena u istu farmaceutsku kompoziciju, ili može biti uključena u zasebnu farmaceutsku kompoziciju. U ovom potonjem slučaju, farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-CD73 antitelo (npr. MEDI9447) ili njegov antigen-vezujući fragment pogodna je za primenu pre ili nakon primene farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, ili istovremeno sa njom. U određenim slučajevima, anti-CD73 antitelo (npr. MEDI9447) ili njegov antigen-vezujući fragment i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo se primenjuju u preklapajućim terminima u odvojenoj kompoziciji.
11
[0423] Anti-CD73 antitelo (npr. MEDI9447) ili njegov antigen-vezujući fragment i anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, mogu da se primenjuju samo jednom ili retko, pri čemu i dalje obezbeđuju korist za pacijenta. U daljim aspektima, na pacijentu se primenjuju dodatne prateće doze. Prateće doze mogu da se primenjuju u različitim vremenskim intervalima u zavisnosti od pacijentove starosti, težine, kliničke procene, opterećenja tumorom i/ili drugih faktora, uključujući procenu nadležnog lekara.
[0424] Ovde navedeni postupci mogu da smanje ili uspore rast tumora. U nekim aspektima, smanjenje ili usporavanje mogu biti statistički značajni. Smanjenje rasta tumora može da se izmeri poređenjem rasta pacijentovog tumora na početku, u odnosu na očekivani rast tumora, u odnosu na očekivani rast tumora na osnovu velike populacije pacijenata, ili u odnosu na rast tumora kontrolne populacije. U drugim otelotvorenjima, postupci iz otkrića povećavaju preživljavanje.
IX. Anti-PD-L1 antitela
[0425] Antitela koja se specifično vezuju i inhibiraju aktivnost PD-L1 (npr. vezivanje za PD-1 i/ili CD80) korisna su za lečenje tumora. B7-H1, poznat i kao PD-L1, predstavlja transmembranski protein tipa I veličine oko 53 kDa. Kod ljudi, B7-H1 se eksprimira na brojnim vrstama imunskih ćelija, uključujući aktivirane i anergijske/iscrpljene T ćelije, na naivnim i aktiviranim B ćelijama, kao i na mijeloidnim dendritskim ćelijama (DC), monocitima i mastocitima. Takođe se eksprimira na neimunskim ćelijama, uključujući ostrvca pankreasa, Kupferove ćelije jetre, vaskularni endotel i odabrani epitel, na primer, epitel disajnih puteva i epitel renalne tubule, pri čemu je ekspresija pojačana tokom inflamatornih epizoda. Ekspresija B7-H1 povišenim nivoima se takođe može naći kod brojnih tumora, uključujući, bez ograničenja, tumor dojke, debelog creva, kolorektalni, renalni tumor, uključujući karcinom bubrežnih ćelija, kancer stomaka, bešike, nemikrocelularni kancer pluća (NSCLC), hepatocelularni kancer (HCC) i kancer pankreasa, kao i melanom.
[0426] Poznato je da B7-H1 vezuje dva alternativna liganda, prvi od njih, PD-1, je transmembranski receptor tipa I od 50-55 kDa koji je prvobitno identifikovan u T ćelijskoj liniji koja prolazi apoptozu indukovanu aktivacijom. PD-1 se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, B ćelijama i monocitima, kao i na drugim ćelijama imunološkog sistema, i vezuje i
11
B7-H1 (PD-L1) i srodni B7-DC (PD-L2). Drugi je član porodice B7, B7-1, koji se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, B ćelijama, monocitima i antigen prezentujućim ćelijama.
[0427] Smatra se da signalizacija putem PD-1/B7-H1 ose vrši značajne, neredundantne funkcije u imunološkom sistemu, putem negativne regulacije T ćelijskih odgovora. Smatra se da ekspresija B7-H1 na ćelijama tumora pomaže tumorima da izbegnu otkrivanje i uklanjanje od strane imunološkog sistema. B7-H1 funkcioniše u tom pogledu kroz nekoliko alternativnih mehanizama, uključujući pokretanje iscrpljenosti i anergije T limfocita koji infiltriraju tumor, stimulisanje sekrecije imunorepresivnih citokina u mikrookruženju tumora, stimulisanje represivno regulatorne funkcije T ćelija i zaštitu B7-H1 eksprimirajućih tumorskih ćelija od lize od strane citotoksičnih T ćelija specifičnih za tumor.
[0428] MEDI4736 je primer anti-PD-Ll antitela koje je selektivno za B7-H1 i blokira vezivanje B7-H1 za PD-1 i CD80 receptore. MEDI4736 može da ublaži B7-H1-posredovanu supresiju aktivacije humanih T ćelija in vitro i inhibira rast tumora na modelu ksenografta putem mehanizma zavisnog od T ćelija. Ostali agensi koji mogu da se koriste uključuju agense koji inhibiraju PD-L1 i/ili PD-1 (AB ili duge).
[0429] Informacije vezane za MEDI4736 (ili njegove fragmente) za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima mogu se naći u US20130034559 / US 8779108 i US20140356353. Domen kristališućeg fragmenta (Fc) MEDI4736 sadrži trostruku mutaciju u konstantnom domenu teškog lanca IgG1 koja smanjuje vezivanje za komponentu komplementa C1q i Fcγ receptore odgovorne za posredovanje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC).
[0430] MEDI4736 i njegovi antigen-vezujući fragmenti za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrže teški lanac i laki lanac, ili varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. U specifičnom aspektu, MEDI4736 ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrže varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:131. U specifičnom aspektu, MEDI4736 ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, definisane prema Kabatu, SEQ ID NO: 132-134 i pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, definisane prema
11
Kabatu, SEQ ID NO: 135-137. Stručnjaci u ovoj oblasti lako bi mogli da identifikuju CDR definicije definisane prema Čotiji, definisane prema Abm, ili druge definicije poznate stručnjacima. U specifičnom aspektu, MEDI4736 ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrže CDR sekvence varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca 2.14H9OPT antitela, kako je otkriveno u US20130034559 / US 8779108 i US20140356353.
X. Anti-CTLA4 antitela
[0431] Shodno tome, u jednom otelotvorenju, terapeutske kombinacije iz otkrića sadrže CTLA4 blokirajuće antitelo (npr. tremelimumab) i/ili antitela koja smanjuju interakcije PD1/PD-L1. Dva modulatorna puta T ćelija kojima je do danas posvećena značajna pažnja signaliziraju kroz antigen-4 citotoksičnog T limfocita (CTLA4, CD152) i ligand programirane smrti 1 (PD-L1, poznat i kao B7H-1 ili CD274).
[0432] CTLA4 se eksprimira na aktiviranim T ćelijama i služi kao koinhibitor za održavanje T ćelijskih odgovora nakon CD28-posredovane T ćelijske aktivacije. Veruje se da CTLA4 reguliše amplitudu rane aktivacije naivnih i memorijskih T ćelija nakon uključenja TCR, i da je deo centralnog inhibitorskog puta koji utiče i na antitumorski imunitet i na autoimunitet. CTLA4 se eksprimira prvenstveno na T ćelijama, a ekspresija njegovih liganada CD80 (B71) i CD86 (B7.2) u velikoj meri je ograničena na antigen prezentujuće ćelije, T ćelije i druge imunske posredujuće ćelije. Objavljeno je da antagonistička anti-CTLA4 antitela koja blokiraju put signalizacije CTLA4 pojačavaju T ćelijsku aktivaciju. Jedno takvo antitelo, ipilimumab, odobrio je FDA 2011. godine za lečenje metastatskog melanoma. Drugo anti-CTLA4 antitelo, tremelimumab, testirano je u ispitivanjima faze III za lečenje uznapredovalog melanoma, ali nije značajno povećalo ukupno preživljavanje pacijenata u poređenju sa standardnom negom (temozolomid ili dakarbazin) u tom trenutku.
[0433] Informacije vezane za tremelimumab (ili njegove antigen-vezujuće fragmente) za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima mogu se naći u US 6,682,736 (gde su navedene pod 11.2.1). Tremelimumab (poznat i kao CP-675.206, CP-675, CP-675206 i ticilimumab) je humano IgG2 monoklonsko antitelo koje je veoma selektivno za CTLA4 i blokira vezivanje CTLA4 za CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2). Pokazalo se da dovodi do imunske aktivacije in vitro, i kod nekih pacijenata lečenih tremelimumabom uočena je regresija tumora.
11
[0434] Tremelimumab za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrži teški lanac i laki lanac, ili varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. U specifičnom aspektu, tremelimumab ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca. U specifičnom aspektu, tremelimumab ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrže ovde identifikovani varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. Stručnjaci u ovoj oblasti lako bi mogli da identifikuju CDR definicije definisane prema Čotiji, definisane prema Abm, ili druge definicije poznate stručnjacima. U specifičnom aspektu, tremelimumab ili njegov antigenvezujući fragment za upotrebu u ovde obezbeđenim postupcima sadrže sekvence CDR varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca 11.2.1 antitela kako je otkriveno u US 6,682,736.
XI. VII. Farmaceutske kompozicije i postupci primene
[0435] Postupci pripreme i primene anti-CD73 vezujućih molekula, npr. antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenta, varijanti ili derivata (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) na ispitaniku kome je to potrebno, dobro su poznati ili se lako određuju od strane stručnjaka. Način primene anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata može biti, na primer, oralni, parenteralni, putem inhalacije ili topikalni. Termin parenteralni, kako se ovde koristi, uključuje, npr. intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu, supkutanu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Međutim, u drugim postupcima koji su kompatibilni sa ovde datim razmatranjima, anti-CD73 vezujući molekuli, npr. antitela, njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati iz predmetnog otkrića mogu se isporučiti direktno na mesto neželjene ćelijske populacije, čime se povećava izloženost bolesnog tkiva terapeutskom agensu.
[0436] Kao što je ovde razmotreno, anti-CD73 vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati iz predmetnog otkrića (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu da se primene u farmaceutski delotvornoj količini za in vivo lečenje bolesti posredovanih ćelijama koje eksprimiraju CD73, kao što su određene vrste kancera.
[0437] Postupci pripreme i primene terapeutskih kombinacija koje sadrže anti-CD73 vezujuće molekule, npr. antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, varijante ili derivate
11
(npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) u kombinaciji sa anti-PD-1, anti-PD-L1 i/ili anti-CTLA4 antitelom ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima na ispitaniku kome je to potrebno, dobro su poznati ili se lako određuju od strane stručnjaka. Put primene njihove kombinacije može biti, na primer, oralni, parenteralni, inhalacijom ili topikalni. Termin parenteralni, kako se ovde koristi, uključuje, npr. intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu, supkutanu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Međutim, u drugim postupcima koji su kompatibilni sa ovde datim razmatranjima, kombinacija iz predmetnog otkrića može da se isporuči direktno na mesto neželjene ćelijske populacije, čime se povećava izloženost bolesnog tkiva terapeutskom agensu. Kao što je ovde razmotreno, kombinacija anti-CD73 antitela (npr. MEDI9447) i anti-PD-1, anti-PD-L1 i/ili anti-CTLA4 antitela može da se primeni u farmaceutski delotvornoj količini za in vivo lečenje bolesti posredovanih ćelijama koje eksprimiraju CD73, kao što su određene vrste kancera.
[0438] Farmaceutske kompozicije korišćene u ovom otkriću mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive nosače, uključujući, npr., vodu, jonoizmenjivače, proteine, puferske supstance i soli. Takođe, mogu biti prisutni konzervansi i drugi aditivi. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum. Odgovarajuće formulacije za upotrebu u ovde otkrivenim terapeutskim postupcima opisane su u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16. izd. (1980).
[0439] U svakom slučaju, sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme uključivanjem terapeutske kombinacije iz otkrića, aktivnog jedinjenja (npr. anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat, na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo, samostalno ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensima), u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču, a zatim sterilnom filtracijom. Dalje, preparati mogu da se pakuju i prodaju u obliku kompleta. Takvi proizvodi će imati oznake ili uputstva za upotrebu koja pokazuju da su povezane kompozicije korisne za lečenje ispitanika koji boluje od bolesti ili poremećaja, ili ima predispozicije za njih.
[0440] Parenteralne formulacije mogu biti jedna bolus doza, infuzija ili početna bolus doza praćena dozom za održavanje. Ove kompozicije mogu da se primenjuju u specifičnim fiksnim ili promenljivim intervalima, npr. jednom dnevno ili „po potrebi“.
12
[0441] Kompozicija može biti primenjena kao pojedinačna doza, više doza ili tokom utvrđenog vremenskog perioda u infuziji. Dozni režimi takođe mogu biti prilagođeni da se obezbedi optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski ili profilaktički odgovor).
[0442] Terapeutski delotvorne doze kompozicija iz predmetnog otkrića za lečenje bolesti posredovanih ćelijama koje eksprimiraju CD73, kao što su određene vrste kancera, uključujući, npr. kancer debelog creva, melanom, kancer dojke, limfom, nemikrocelularni karcinom pluća, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom i Burkitov limfom, kancer jajnika, kancer dojke, kancere glave i vrata i kancer pankreasa, menjaju se u zavisnosti od brojnih različitih faktora, uključujući put primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju, i da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Obično, pacijent je čovek, ali nehumani sisari, uključujući transgene sisare, mogu takođe biti tretirani. Doze za lečenje mogu biti titrisane korišćenjem rutinskih postupaka poznatih stručnjacima da se optimizuje bezbednost i efikasnost.
[0443] Količinu najmanje jednog anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili terapeutske kombinacije iz otkrića koja se primenjuje, stručnjak jednostavno može da utvrdi bez nepotrebnog eksperimentisanja, imajući u vidu otkriće iz predmetnog otkrića. Faktori koji utiču na način primene i odgovarajuću količinu najmanje jednog anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela, njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, ili terapeutske kombinacije iz otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na, ozbiljnost bolesti, istoriju bolesti, kao i starost, visinu, težinu, zdravlje i fizičko stanje osobe koja prima terapiju. Slično tome, količina anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, ili terapeutske kombinacije iz otkrića koja se primenjuje, zavisiće od načina primene i toga da li će ispitanik primiti pojedinačnu dozu ili više doza ovog agensa.
[0444] Predmetno otkriće takođe predviđa upotrebu anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), ili terapeutske kombinacije iz otkrića u proizvodnji leka za lečenje vrste kancera, uključujući, npr. kancer debelog creva, melanom, kancer dojke, limfom, nemikrocelularni karcinom pluća, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom i Burkitov limfom, kancer jajnika, kancer dojke, kancere glave i vrata i kancer pankreasa.
[0445] Otkriće takođe predviđa upotrebu anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), u proizvodnji leka za lečenje ispitanika za lečenje određene vrste kancera. U određenim aspektima, lek se koristi kod ispitanika koji je prethodno lečen najmanje jednom drugom terapijom.
[0446] Pod „prethodno lečenim“ ili „prethodnim lečenjem“ podrazumeva se ispitanik koji je primio jednu ili više drugih terapija (npr. lečen je najmanje jednom drugom antikancerskom terapijom) pre primanja leka koji sadrži anti-CD73 vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivat (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo). Nije neophodno da kod ispitanika postoji odgovor na prethodno lečenje prethodnom terapijom ili terapijama. Dakle, ispitanik koji prima lek koji sadrži anti-CD73 vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivat može da ima odgovor, ili se može desiti da nema odgovor na prethodno lečenje prethodnom terapijom, ili na jednu ili više prethodnih terapija, kada prethodno lečenje obuhvata više terapija.
[0447] Predmetno otkriće takođe predviđa zajedničku primenu anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) i najmanje jedne druge terapije. Anti-CD73 antitelo i najmanje jedna druga terapija mogu da se primenjuju zajedno u jednoj kompoziciji, ili mogu da se primenjuju zajedno u isto vreme ili u preklapajućim terminima u odvojenim kompozicijama. U nekim aspektima, anti-CD73 antitelo može da se primenjuje, na primer, zajedno sa antitelom koje cilja PD-1 (protein programirane smrti 1). Predmetno otkriće takođe predviđa upotrebu anti-CD73 vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, varijante ili derivata (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), u proizvodnji leka za lečenje ispitanika za lečenje kancera, pri čemu se anti-CD73 vezujući molekul primenjuje pre nego što je ispitanik lečen najmanje jednom drugom terapijom.
VIII. Dijagnostika
[0448] Predmetno otkriće dalje predviđa dijagnostičke postupke korisne prilikom dijagnoze bolesti posredovanih ćelijama koje eksprimiraju CD73, kao što su određene vrste kancera, koji obuhvataju merenje nivoa ekspresije CD73 proteina u tkivu ili drugim ćelijama ili telesnim tečnostima pojedinca, i poređenje izmerenog nivoa ekspresije sa standardnim nivoom ekspresije CD73 u normalnom tkivu ili telesnoj tečnosti, te je porast nivoa ekspresije u odnosu na standard pokazatelj poremećaja.
[0449] Ovde otkrivena anti-CD73 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante i derivati (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) mogu da se koriste za testiranje nivoa CD73 proteina u biološkom uzorku koristeći klasične imunohistološke postupke koji su poznati stručnjacima (npr. vidite Jalkanen, et al., J. Cell. Biol.101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Drugi postupci bazirani na antitelu korisni za otkrivanje ekspresije proteina CD73 uključuju imuno testove, kao što je test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), imunoprecipitacija ili vestern bloting. Odgovarajući testovi su opisani u drugom delu ovog teksta.
[0450] „Testiranje nivoa ekspresije CD73 polipeptida“ podrazumeva kvalitativno ili kvantitativno merenje ili procenu nivoa CD73 polipeptida u prvom biološkom uzorku bilo direktno (npr. određivanjem ili procenom apsolutnog nivoa proteina) ili relativno (npr. poređenjem sa nivoom proteina u vezi sa bolešću u drugom biološkom uzorku). Nivo ekspresije CD73 polipeptida u prvom biološkom uzorku može biti meren ili procenjen i upoređen sa standardnim nivoom CD73 polipeptida, pri čemu je standard uzet iz drugog biološkog uzorka dobijenog od pojedinca koji nema poremećaj, ili je određen uprosečavanjem vrednosti nivoa iz populacije pojedinaca koji nemaju poremećaj. Kao što se smatra u struci, jednom kada je poznat standardni nivo polipeptida CD73, može biti ponovo korišćen kao standard za poređenje.
[0451] Pod biološkim uzorkom se smatra bilo koji biološki uzorak dobijen od pojedinca, ćelijske linije, kulture tkiva ili drugog izvora ćelija koje potencijalno eksprimiraju CD73. Metode za dobijanje biopsija tkiva i telesnih tečnosti sisara su dobro poznate u struci.
IX. Kompleti koji sadrže molekule koji vezuju CD73
12
[0452] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje komplete koji sadrže najmanje jedan od ovde opisanih CD73-vezujućih molekula, npr. anti-CD73 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, varijanti ili derivata iz ovde otkrivenog molekula (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), koji mogu da se koriste da se obave ovde opisani postupci. U određenim aspektima, komplet obuhvata najmanje jedno prečišćeno anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u jednoj ili više ambalaža. U nekim aspektima, kompleti sadrže sve komponente neophodne i/ili dovoljne da se izvede test za detekciju, uključujući sve kontrole, uputstva za izvođenje testa i bilo koji softver neophodan za analizu i predstavljanje rezultata. Stručnjak u ovoj oblasti će lako prepoznati da otkriveni CD73-vezujući molekul, npr. anti-CD73 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment iz predmetnog otkrića (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), može lako da se uključi u jedan od uspostavljenih formata kompleta koji su dobro poznati u struci.
X. Imuno testovi
[0453] Ovde otkriveni anti-CD73 vezujući molekuli, npr. anti-CD73 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati ovde otkrivenih molekula (npr. klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), mogu da se testiraju na imunospecifično vezivanje bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Imunološki testovi koji mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničeni na, kompetitivne i nekompetitivne sisteme testova koji koriste tehnike kao što su vestern blot, radioimunološki testovi, ELISA (test sa imunosorbentom vezanim za enzim), „sendvič“ imunološki testovi, testovi imunoprecipitacije, reakcije precipitacije, precipitinske reakcije gel difuzije, testovi imunodifuzije, testovi aglutinacije, testovi za fiksiranje komplementa, imunoradiometrijski testovi, fluoroscentni imunotestovi i imunotestovi sa proteinom A, da navedemo samo nekoliko. Takvi testovi su rutinski, i dobro poznati u struci (vidite, npr. Ausubel i sar. eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) sveska 1).
[0454] CD73-vezujući molekuli, npr. anti-CD73 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti i njihove varijante ili derivati (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo), mogu da se koriste histološki, kao u imunofluorescenciji, imunoelektronskoj mikroskopiji ili neimunološkim testovima, za in situ detekciju CD73 ili njegovih očuvanih varijanti ili peptidnih fragmenata. In situ detekcija može da se postigne uklanjanjem histološkog uzorka iz pacijenta, i nanošenjem na njega obeleženog CD73-vezujućeg molekula, npr. anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, poželjno se nanosi premazivanjem obeleženog CD73-vezujućeg molekula (npr. i antitela ili fragmenta) na biološki uzorak. Kroz upotrebu takve procedure, moguće je odrediti ne samo prisustvo CD73 ili konzerviranih varijanti ili peptidnih fragmenata, već takođe njegovu distribuciju u ispitanom tkivu. Koristeći predmetno otkriće, osobe uobičajene stručnosti će lako primetiti da bilo koja iz širokog raspona histoloških metoda (kao što su procedure bojenja) može biti modifikovana da bi se postigla takva in situ detekcija.
[0455] Aktivnost vezivanja date serije CD73-vezujućeg molekula, npr. anti-CD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, njegove varijante ili derivata, može da se utvrdi u skladu sa dobro poznatim postupcima. Stručnjaci će moći da odrede operativne i optimalne uslove za test za svaku determinaciju upotrebom rutinskih eksperimenata.
[0456] Postupci i reagensi pogodni za utvrđivanje karakteristika vezivanja izolovanog CD73-vezujućeg molekula, npr. anti-CD73 antitela (na primer, klon 10.3 antitelo ili klon 2C5 antitelo) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, njegove varijante ili izmenjenog/mutantnog derivata, poznati su u struci i/ili su komercijalno dostupni. Oprema i softver dizajniran za takve kinetičke analize su komercijalno dostupni (npr. BIAcore, BIAevaluation software, GE Healthcare; KinExa Software, Sapidyne Instruments).
[0457] U primeni predmetnog otkrića će se koristiti, ako nije drugačije naznačeno, uobičajene tehnike ćelijske biologije, ćelijskog uzgajanja, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su pokrivene znanjima u struci. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pogledajte, na primer, Sambrook i sar. urednik (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2. izd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook i sar., urednik (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover urednik, (1985) DNA Cloning, svezak I i II; Gait, urednik (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis i sar. U.S. Pat. br. 4,683,195; Hames i Higgins, urednici (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames i Higgins, urednici (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller i Calos urednici (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu i sar., urednici, Methods In Enzymology, svezak 154 i 155;
12
Mayer i Walker, urednici (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir i Blackwell, urednici, (1986) Handbook Of Experimental Immunology, svezak I–IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); i u publikaciji Ausubel i sar. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
[0458] Opšti principi konstruisanja antitela su dati u Borrebaeck, urednik (1995) Antibody Engineering (2. izd.; Oxford Univ. Press). Opšti principi konstruisanja proteina su dati u Rickwood i sar., urednici (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Opšti principi antitela i vezivanja antitelo-hapten su dati u: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2. izd.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); i Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Pored toga, standardni postupci u imunologiji poznati u struci koji nisu specifično opisani generalno se prate kao u Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites i sar., urednici (1994) Basic and Clinical Immunology (8. izd; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) i Mishell i Shiigi (urednici) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).
[0459] Standardni referentni radovi koji postavljaju generalne principe imunologije uključuju Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett i sar., urednici (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" u Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, izd. Burden i sar. (Elsevere, Amsterdam); Goldsby i sar. izd. (2000) Kuby Immunnology (4. izd.; H. Freemand & Co.); Roitt i sar. (2001) Immunology (6. izd.; London: Mosby); Abbas i sar. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5. izd.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann i Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach i Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).
[0460] Sledeći primeri su dati kao ilustracija, i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće.
12
PRIMERI
[0461] Aspekti predmetnog pronalaska mogu biti dalje definisani putem upućivanja na sledeće neograničavajuće primere, koji detaljno opisuju pripremu određenih antitela predmetnog pronalaska i postupaka za korišćenje antitela predmetnog pronalaska. Biće očigledno stručnjacima da mnoge modifikacije, i materijala i metoda, mogu biti izvedene bez odstupanja od opsega predmetnog pronalaska.
[0462] CD73 (klaster diferencijacije 73), poznat i kao ekto-5'-nukleotidaza (NT5E), transmembranski je receptor koji se nalazi na ćelijama tumora, kao i u normalnim stromalnim ćelijama poput endotelnih ćelija i određenih leukocita. CD73 katalizuje adenozin monofosfat u adenozin i organski fosfat. Vezivanje ekstracelularnog dela receptora adenozina signalizira putem cikličnog AMP radi inhibicije aktivacije T ćelijskog receptora (pregled dali Linden i Cekic, 2012). Veruje se da CD73 igra ulogu u posredovanju inhibitorske funkcije regulatornih B i T limfocita (Saze et al, 2013), kao i u održavanju integriteta endotela (pregled dali Jalkanen i Salmi, 2008).
[0463] Pored uloge u normalnoj biologiji, CD73 i adenozin utiču na biologiju tumora. Prisustvo ekstracelularnog adenozina u mikrookruženju tumora opisano je kao imunosupresivni „oreol“ (Antonioli et al, 2013). U skladu sa ovom ulogom adenozina, pokazalo se da nokaut miševi koji nemaju receptore adenozina odbacuju tumore lakše od normalnih miševa (Ohta et al, 2006). Veruje se da je primarni izvor ekstracelularnog adenozina u tumorima CD73 (Augusto et al, 2013). U skladu sa ovom hipotezom, kao i sa studijama sa miševima s nedostatkom A2A, nokaut miševi kojima nedostaje CD73 imaju povećani antitumorski imunitet (Stagg et al, 2011) i pokazuju smanjenu karcinogenezu (Stagg et al, 2012) u poređenju sa normalnim miševima. Konkretno, veruje se da ekstracelularni adenozin posreduje imunosupresivno dejstvo regulatornih T ćelija i mijeloidno dobijenih supresorskih ćelija (MDSC), između ostalog (pregled dali Antonioli et al, 2013). Zajedno sa drugim studijama koje pokazuju da molekulska inhibicija CD73 malim molekulima ili antitelima može da inhibira stvaranje, rast i metastaze tumora (pregled dali Young et al, 2014), pretpostavlja se da tumori koriste CD73 za stvaranje adenozina, i tako suzbijaju antitumorski imunitet. Shodno tome, anti-CD73 antitela koja se selektivno vezuju za ektonukleotidazu i inhibiraju aktivnost ektonukleotidaze CD73 mogu biti korisna za pojačavanje antitumorskog imunskog odgovora.
12
PRIMER 1: Izolacija i identifikacija anti-CD73 antitela
[0464] Biblioteke displeja humanog scFv faga su panovane biotinilovanim ekstracelularnim domenom (ECD) CD73 radi izolovanja antitela koja se vezuju za CD73 čoveka, cinomolgusa i miša. Pokazalo se da se vodeće antitelo, CD730010, specifično vezuje za ćelije koje eksprimiraju humani, mišji i cinomolgusov CD73 (određeno protočnom citometrijom), i da inhibira aktivnost rekombinantnog rastvorljivog ECD CD73, kao i nativnog CD73 prikazanog na ćelijama. Započeto je afinitetno sazrevanje CD730010 kako bi se povećao afinitet vezivanja CD730010 za humani CD73.
[0465] Pre optimizacije afiniteta, načinjen je pokušaj da se što više ostataka okvira CD730010 vrati do najbližih humanih germinativnih sekvenci (na osnovu IMGT repertoara) bez oštećenja afiniteta. To je učinjeno kako bi se smanjila potencijalna imunogenost finalnog leka od antitela kod ljudi. Svi ostaci okvira VL domena i svi osim jednog ostatka okvira VH domena mogu da se vrate da se podudaraju sa aminokiselinskom sekvencom humanih germinativnih linija IGLV1-44, IGLJ3, IGHV3-23 i IGHJ2. Lizin na poziciji 94 (Kabatova numeracija; Kabat. 1991) VH domena CD730010 nije moguće vratiti bez gubitka afiniteta.
[0466] Afinitet i potentnost germinatizovanog CD730010 antitela su optimizovani stvaranjem biblioteka varijanti CDR i testiranjem varijanti na poboljšano vezivanje za CD73. Kombinovano je nekoliko mutacija sa najboljim poboljšanjem afiniteta kako bi nastao kandidat za lek MEDI9447. Nukleotidne i izvedene aminokiselinske sekvence MEDI9447 prikazane su na slikama 1A-1D.
[0467] CD73-specifična scFv antitela su izolovana iz biblioteke displeja humanog scFv faga u nizu ponovljenih naizmeničnih ciklusa odabira na biotinilovanom ekstracelularnom domenu (ECD) humanih i mišjih CD73 proizvedenih interno od ćelija sisara suštinski kako je prethodno opisano u Lloyd et al., PEDS 22:159-68 (2009). ScFv geni proistekli iz 2. i 3. ciklusa odabira su konvertovani u šarži u bakterijske scFv-Fc ili Fab ekspresione vektore. Supernatanti bakterijskih kultura koji nose rastvorljivi scFv-Fc ili Fab su ispitani na njihovo vezivanje za ECD humanog, mišjeg ili cinomolgusovog CD73 putem ELISA ili homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF). Najveća slaganja koja pokazuju unakrsnu reaktivnost su izabrana, podvrgnuta sekvenciranju DNK i konvertovana u format trostrukog mutantnog antitela celog imunoglobulina G1 („IgG-TM“, IgG1 Fc sekvenca koja obuhvata
12
mutacije L234F, L235E i P331S). IgG1 TM antitela su eksprimirana u ćelijama sisara, prečišćena afinitetnom hromatografijom i rangirana na osnovu karakteristika u testovima vezivanja i funkcionalnim testovima.
PRIMER 2: Binovanje epitopa anti-CD73 antitela
[0468] Sposobnost anti-CD73 antitela da se međusobno takmiče u vezivanju za ECD humanog CD73 je procenjena na Octet instrumentu suštinski kako je opisano (Abdiche YN et al., Anal Biochem 386: 172-80 (2009). ECD protein CD73 i prvo anti-CD73 antitelo su prethodno inkubirani i dodati biotinilovanom drugom anti-CD73 antitelu uhvaćenom na streptavidinskom senzoru. Ako je prvo anti-CD73 antitelo blokiralo vezivanje ECD CD73 za drugo anti-CD73 antitelo, oba antitela su stavljena u iste ili preklapajuće grupe epitopa. Ako su oba antitela mogla istovremeno da se vezuju za ECD CD73, stavljena su u nepreklapajuće grupe epitopa. Ispitivanje u parovima anti-CD73 antitela pokazalo je da spadaju u 3 nepreklapajuće grupe epitopa (Tabela 2).
Tabela 2: Grupe epitopa anti-CD73 antitela
PRIMER 3: Vezivanje anti-CD73 antitela za CD73
[0469] Afinitet vezivanja i specifičnost anti-CD73 antitela utvrđeni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) i protočnom citometrijom.
[0470] Instrument ProteOn XPR36 je korišćen za karakterisanje vezivanja MEDI9447 za ECD CD73 čoveka, miša i cinomolgusa. MEDI9447 je afinitetno zarobljen koristeći antihumano Fc antitelo. ECD CD73 je bio u mobilnoj fazi. Asocijacija CD73 za MEDI9447 i njegova disocijacija mogle bi precizno da se opišu Lengmirovim 1:1 modelom. Rezultati
12
prikazani u Tabeli 3 pokazuju da je afinitet MEDI9447 prema ECD CD73 tri vrste uporediv, i u malom pikomolskom opsegu.
Tabela 3: Afinitet MEDI9447 prema ECD CD73 određen površinskom plazmonskom rezonancom
[0471] Vezivanje MEDI9447 za nativni CD73 eksprimirano na ćelijskim linijama čoveka, miša i majmuna cinomolgus okarakterisano je protočnom citometrijom. Ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama MEDI9447, i vezivanje antitela je praćeno anti-humanim Fc antitelom obeleženim fluoroforom. Grafikon medijane intenziteta fluorescencije u zavisnosti od koncentracije MEDI9447 iscrtan je nelinearno koristeći model izoterme jednog mesta vezivanja radi izračunavanja ravnotežne konstante disocijacije. Analiza protočnom citometrijom potvrđuje vezivanje MEDI9447 za CD73 čoveka, miša i cinomolgusa sa uporedivim afinitetima (Tabela 4), iako su vrednosti KD13-126 puta veće od vrednosti određenih pomoću SPR, verovatno zbog konformacionih razlika između rekombinantnog i nativnog CD73.
Tabela 4: Afinitet MEDI9447 prema nativnom CD73 utvrđen protočnom citometrijom
[0472] Da bi se odredila specifičnost MEDI9447 za humani CD73 protočnom citometrijom, razvijene su ćelijske linije. MDA-MB-231 ćelije, koje su ćelije humanog kancera dojke
1
dobijene iz pleuralne efuzije, transficirane su kratkom ukosnicom RNK (shRNK) humanog CD73 kako bi se smanjila ekspresija CD73 na ćelijskoj površini. Jurkat ćelije, linija T ćelija dobijenih iz ćelija Burkitovog limfoma, transficirane su plazmidom koji eksprimira iRNK humanog CD73 kako bi se izbacila ekspresija CD73 na ćelijskoj površini. Jurkatove ćelije eksprimiraju malo endogenog CD73.
[0473] Specifičnost MEDI9447 prema humanom CD73 određena je odnosom MEDI9447 koji se vezuje za ćelijsku liniju sa velikom ekspresijom CD73 (MDA-MB-231) i ćelijske linije sa malom ekspresijom (MDA-MB-231, CD73-shRNK). Specifičnost MEDI9447 za humani CD73 takođe je određena odnosom ćelijske linije sa velikom ekspresijom CD73 (Jurkat-ubačen CD73) i Jurkatove ćelijske linije sa manjom ekspresijom.
[0474] Specifičnost MEDI9447 za mišji CD73 (mCD73) određena je protočnom citometrijom, poređenjem mišje ćelijske linije 4T1 (velika ekspresija mCD73) sa smanjenom ćelijskom linijom (4T1 mCD73 -shRNK). Pored toga, poredi se specifičnost MEDI9447 za Jurkatove ćelije sa ubačenim mišjim CD73 u poređenju sa divljim tipom Jurkatovih ćelija (nema mišjeg CD73).
Tabela 5: Specifičnost MEDI9447 za CD73 čoveka i miša
1 1
PRIMER 4: Internalizacija CD73 preko anti-CD73 antitela MEDI9447
[0475] Internalizacija ili osipanje CD73 posredovano antitelima procenjeno je protočnom citometrijom. MDA-MB-231 ćelije su inkubirane u prisustvu 100 nM MEDI9447 ili antitela negativne kontrole R347 u medijumu za rast na 37°C tokom 0-4 sata. Ćelije su isprane i ponovo suspendovane u ledeno hladnom PBS-u. Prisustvo CD73 na ćelijskoj površini otkriveno je dodavanjem 10 nM antitela za detekciju obeleženog sa DyLight488. Ćelije su inkubirane tokom 15 minuta, isprane i analizirane protočnom citometrijom. Detekciono antitelo se vezuje za epitop CD73 koji je različit od epitopa MEDI9447 i oba antitela se istovremeno vezuju za CD73 bez ometanja. Ekspresija CD73 na ćelijskoj površini pala je na 73% od svoje prvobitne vrednosti nakon 4 sata inkubacije sa MEDI9447, što sugeriše da je 27% CD73 bilo internalizovano ili osuto nakon vezivanja MEDI9447 (Greška! Referentni izvor nije pronađen.).
Tabela 6: Procenat CD73 koji ostaje na ćelijskoj površini MDA-MB-231 ćelija nakon inkubacije sa test antitelom
[0476] Internalizacija MEDI9447 u ćelijske linije MDA-MB-231 (karcinom mlečne žlezde čoveka) i 4T1 (karcinom mlečne žlezde miša) procenjena je koristeći komplet za internalizaciju humanog antitela koji se komercijalno prodaje kao FabZAP test (Advanced Targeting Systems, San Diego CA). Serijska razblaženja MEDI9447 ili negativnog kontrolnog antitela R347 prethodno su inkubirana sa 40 nM FabZAP reagensom (Fab fragment poliklonskog antihumanog IgG antitela konjugovanog sa citotoksičnim proteinom saporinom) i zatim dodata u ćelijske linije. Nakon 3 dana u kulturi, ćelijska proliferacija je izmerena koristeći test vijabilnosti luminescentnih ćelija koji se komercijalno prodaje kao CellTiter-Glo test (Promega, Madison WI). Ovaj test je korišćen za izračunavanje EC50vrednosti i maksimalne toksičnosti. FabZAP reagens ne može samostalno da se internalizuje
1 2
u ćelije. Vezuje se za test antitelo (npr. MEDI9447), i citotoksičan je samo nakon internalizacije test antitela. MEDI9447 uzrokuje internalizaciju FabZAP i inhibira ćelijsku proliferaciju na način zavisan od doze.
Tabela 7: Internalizacija citotoksičnog FabZAP reagensa posredovana antitelima u MDA-MB-231 i 4T1 ćelije
[0477] Ćelijska proliferacija MDA-MB-231 ćelija i 4T1 ćelija tretiranih serijskim razblaženjima test antitela i FabZAP reagensa izmerena je CellTiter-Glo testom (Slika 2). Signal negativnog kontrolnog antitela R347 u testu CellTiter-Glo oduzet je od signala MEDI9447, a vrednost EC50 i maksimalna toksičnost izračunati su postavljanjem krive dozaodgovor koristeći nelinearnu regresionu analizu.
PRIMER 5: Inhibicija aktivnosti 5'ektonukleotidaze anti-CD73 antitelom MEDI9447 [0478] U ovoj studiji, funkcionalna aktivnost MEDI9447 određena je u in vitro testu koji je merio CD73-katalizovanu hidrolizu AMP koristeći ćelijsku liniju humanog nemikrocelularnog karcinoma, NCI-H322. Formulacija MEDI9447 pripremljena je razblaživanjem njegovog matičnog rastvora u RPMI medijumu bez seruma do finalne koncentracije od 1 µM. Formulacija R347 pripremljena je razblaživanjem njegovog matičnog rastvora u RPMI do finalne koncentracije od 1 µM.
[0479] NCI-H322 ćelije su centrifugirane 5 minuta pri 1500 o/min. Supernatant je uklonjen i zamenjen RPMI medijumom bez seruma. Ćelijska suspenzija je prebrojana koristeći ćelijski brojač ViCell (Beckman, Coulter). Ćelije su nanete na ploče sa 96 bunarčića sa gustinom ćelija od 10.000 ćelija na 100 µl po bunarčiću. Dodato je 50 µl 4X koncentrovanog AMP (200 µM). Ploče su zatim inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom 24 sata. Ploče su centrifugirane, i 50 µl supernatanta kulture je prebačeno iz bunarčića u bunarčić na ploče sa neprozirnim okruglim dnom sa 96 bunarčića. Zatim je dodat 2X ATP. CellTiterGlo® (Promega) dodat je prema uputstvu proizvođača. Inhibicija ćelijskog enzima 5'
1
ektonukleotidaze izmerena je na multilabel čitaču, Perkin-Elmer Envision Workstation. Uzorci su analizirani pomoću softvera Prism.
[0480] MEDI9447 je specifično inhibirao defosforilaciju adenozin monofosfata (AMP) u humanom in vitro sistemu. U testu na bazi ćelija CD73 eksprimiranog na površini, konverzija adenozin monofosfata u adenozin je smanjena na način zavisan od doze putem MEDI9447, ali ne i putem irelevantnog izotipskog kontrolnog antitela (Slika 3). Rezultati prikazani na slici 3 dobijeni su koristeći NSCLC ćelije koje eksprimiraju CD73, koje su zasejane na ploče koje nisu tretirane kulturom tkiva sa 96 bunarčića (Falcon 3788) sa 10.000 ćelija po bunarčiću u 100 µl RPMI medijuma bez aditiva. Antitela su dodata u duplikatu zajedno sa AMP (konačna koncentracija od 200 µM) i ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom 24 sata. Ploče su zatim centrifugirane 3 minute pri 1500 o/min. Supernatanti su sakupljeni u novu ploču sa 96 bunarčića (Costar br. 3605) i dodat je ATP do konačne koncentracije od 100 µM. CellTiter-Glo® reagens (Promega) dodat je u odnosu 1:1, i aktivnost ćelijskog CD73 enzima AMP fosforilaze određena je merenjem nivoa ATP koristeći Envision čitač luminescentnih ploča (Perkin Elmer). Pufer koji sadrži samo ATP i AMP korišćen je kao negativna kontrola. Test je ponovljen, a rezultati prikazani na slici 3 reprezentativni su za dva slična eksperimenta korišćenjem drugih ćelijskih linija humanog kancera.
[0481] Ovi rezultati pokazuju da je MEDI9447 inhibirao proizvodnju adenozina u ćelijama kancera. Smatra se da adenozin posreduje u imunosupresivnom dejstvu tumora u mikrookruženju tumora.
PRIMER 6: Smanjenje mijeloidno dobijenih supresorskih ćelija koje infiltriraju tumor putem MEDI9447
[0482] CT26 ćelije, koje su dobijene od kancera debelog creva miša, isporučene su supkutanom (SC) injekcijom sa 5x105 ćelija suspendovanih u 0,1 ml PBS-a u desni bok 4 do 6 nedelja starih ženki miša. Miševi su tretirani sa MEDI9447 ili kontrolnim antitelom.
[0483] U ovoj studiji je korišćeno 10 miševa po grupi. Životinje su nasumično raspoređene u grupe. Životinje iz 1. grupe nisu lečene, a 2. grupa je primala izotipsku kontrolu. MEDI9447 je primenjen na 3. grupi. Ispitivani proizvodi su primenjivani intraperitonealno dva puta nedeljno počevši od 3. dana.16. dana, na 5 životinja iz svake grupe je obavljena nekropsija i tumori su izolovani.
1 4
[0484] Oznaka grupe i dozni nivoi su prikazani u Tabeli 8.
Tabela 8: Oznaka grupe i dozni nivoi
[0485] Tumori su izmereni pomičnim merilom 1, 7, 9, 12, 14 i 16. dana, i zapremine tumora su izračunate na sledeći način:
(1) (dužina zapremine tumora (mm) x (širina zapremine tumora)<2>(mm)) / 2 Antikancersko dejstvo MED19447 izraženo je kao procenat inhibicije rasta tumora, što je izračunato na sledeći način:
(2) (prosečna zapremina tumora kod MEDI9447/prosečna zapremina tumora kod R347-TM)x100
[0487] Tumori su izolovani za protočnu citometriju. Tumori su disecirani od CT26 miševa koji nose tumor 16. dana studije. Tumori su isečeni na male komade i digestirani kolagenazom. Nakon 30-minutne inkubacije, digestovani uzorak je propušten kroz filter od 70 mikrona. Disocirane ćelije su peletirane na 1000 o/min tokom 5 minuta na 4°C i ponovo suspendovane u puferu za sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS). Ćelije su prebrojane na uređaju Vi-Cell koristeći zadate postavke. Zasejano je 1x10<6>ćelija po bunarčiću. Ćelije su obojene sa anti-CD45 (za detekciju svih leukocita), anti-GR1 (za detekciju MDSC) i anti-Ly6g (Gran MDSC). Podaci su prikupljeni na protočnom citometru LSRII. Značajne p-vrednosti, ako ih ima, dobijene iz MDSC analiza predstavljene su na slici 4 uz deskriptivnu statistiku (tj. srednju vrednost i standardnu devijaciju).
[0488] MEDI9447 je inhibirao rast tumora na CT26 singenskom modelu tumora Balb/C miševa (Slika 4).
1
[0489] MEDI9447 je smanjio udeo MDSC koji infiltriraju tumor na CT26 singenetičkom modelu tumora Balb/C miševa (slika 5).
[0490] MEDI9447 je inhibirao rast CT26 mišjih singenskih tumora. Pored toga, mijeloidno dobijene supresorske ćelije su smanjene kod singenskih CT26 tumora karcinoma debelog creva nakon lečenja sa MEDI9447. Intratumorski MDSC imaju imunosupresivno dejstvo na mikrookruženje tumora, što omogućava pojačani rast tumora. Uočeno smanjenje intratumorskih MDSC nakon lečenja sa MEDI9447 pokazuje mehanizam putem kojeg lečenje sa MEDI9447 smanjuje imunsku supresiju tumora.
PRIMER 7: Kombinacija MEDI9447 mIgG1 i anti-PD-1 antitela smanjila je rast tumora i povećala preživljavanje.
[0491] Singenski tumori su uspostavljeni supkutanom (SC) injekcijom 0,1 ml 5×106 CT26 ćelija/ml suspendovanih u HBSS-u, u desni bok 8 do 10 nedelja starih životinja. Tumori su izmereni pomičnim merilom, i zapremine tumora (VT) su izračunate koristeći sledeću formulu:
gde je L dužina tumora u milimetrima, a W širina tumora u milimetrima
[0492] Miševi su randomizovani u grupe na osnovu telesne težine. Nije bilo menjanja životinja. U ovom istraživanju je korišćeno 60 ženki Balb/c miševa.
[0493] Životinje su nasumično raspoređene u 6 grupa. Na životinjama je primenjivan MEDI9447 (mIgG1). Ispitivani proizvodi su primenjivani intraperitonealnom (IP) injekcijom dva puta nedeljno počevši od 3. dana. Oznaka grupe i dozni nivoi prikazani su u Tabeli 9.
Tabela 9: Oznaka grupe i dozni nivoi
1
(a) Rezultati in vivo studije inhibicije tumora
[0494] CT26 mišji karcinom debelog creva implantiran je u singenske Balb/C miševe i tretiran sa anti-CD73 (MEDI9447 mIgG1), anti-PD1 ili njihovom kombinacijom. Kombinovano lečenje je značajno inhibiralo rast tumora u poređenju samo sa anti-CD73 (p = 0,015, ANOVA). Zapremine tumora svake grupe životinja su predstavljene za pojedinačne životinje do 40. studijskog dana. Nijedan miš iz kontrolne grupe nije bio bez tumora na kraju studijskog perioda od 40 dana. Samo lečenje sa anti-CD73 dalo je 10% životinja bez tumora na kraju studije. Samo lečenje sa anti-PD1 takođe je dalo 10% životinja bez tumora na kraju studije. Izuzetno je to što je kombinacija tretiranja sa anti-CD73 i anti-PD dala 60% miševa bez tumora. Nijedan miš iz kontrolne grupe nije bio bez tumora na kraju studije. CT26 tumori su izmereni kod miševa koji su lečeni sa anti-CD73 (MEDI9447 mIgG1), anti-PD1 ili kombinacijom anti-CD73 i anti-PD1. Miševi su mereni do 40. dana studije i žrtvovani su na human način kada su tumori dostigli 2000 mm<3>. Kombinacija zajedničkog lečenja sa anti-CD73 i anti-PD 1 dovela je do statistički značajnog povećanja preživljavanja u poređenju sa samostalnim lečenjem sa anti-CD73 ili anti-PD1 (p vrednost = 0,005, odnosno p = 0,038, log
1
rank test) (Slika 7). Medijana preživljavanja se povećala sa 25 i 33 dana (anti-CD73, odnosno anti-PD1) u odnosu na „nedefinisano“ 40. dana za kombinaciju (Tabela 10).
Tabela 10: Ishod 40. dana studije
[0495] Ukratko, anti-CD73 antitelo, MEDI9447 mIgG1, pokazalo je pojačanu antitumorsku aktivnost kada se kombinuje sa anti-PD-1 antitelom na mišjem modelu singenskog CT26 karcinoma debelog creva. Pored toga, kombinacija anti-CD73 i anti-PD lečenja dala je 60% miševa bez tumora. Kombinacija zajedničkog lečenja sa anti-CD73 i anti-PD 1 takođe je dovela do statistički značajnog povećanja preživljavanja kada se poredi sa samostalnim lečenjem sa anti-CD73 ili anti-PD 1.
[0496] PRIMER 8: Anti-PD-1 indukuje tumorsko mikrookruženje bogato sa CD73, kako je izmereno ekspresijom CD73 na ćelijama tumora (Slika 9), mijeloidno dobijenim supresorskim ćelijama (MDSC) i CD4+, FoxP3+ limfocitima koji infiltriraju tumor (Slika 15).
[0497] Singenski tumori su uspostavljeni supkutanom (SC) injekcijom singenskih B 16F10 ćelija melanoma ili singenskih EG7-OVA ćelija limfoma. Miševi su dva puta nedeljno lečeni sa MEDI9447 (10 mg/kg), anti-PD-L1 antitelom (10 mg/kg) ili kombinacijom MEDI9447 (10 mg/kg) i anti-PD-L1 antitela (10 mg/kg). Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno. Primena MEDI9447 i anti-PD-L1 u kombinaciji značajno pojačava inhibiciju rasta tumora kod tumora melanoma (Slika 12) i tumora limfoma (slika 13).
1
[0498] Da bi se razumelo dejstvo anti-PD-L1 na mikrookruženje tumora, proučavana je ekspresija CD73 na limfocitima. Miševima (n=4) su supkutano injektovane singenske CT26 kolorektalne ćelije, i tretirani su dva puta nedeljno sa 10 mg po kg anti-PD-L1 ili irelevantnim izotipskim kontrolnim antitelom. Jedan dan nakon prvog tretmana, ćelije su izolovane iz drenažnih limfnih čvorova i analizirane na površinski fenotip putem protočne citometrije. Tri dana nakon prvog tretmana tumori su izolovani, ćelije disocirane i analizirane na površinski fenotip putem protočne citometrije. Anti-PD-L1 indukuje tumorsko mikrookruženje bogato sa CD73, kako je izmereno površinskom ekspresijom CD73 na B limfocitima drenažnog limfnog čvora (slika 14) i na CD4+, FoxP3+ limfocitima koji infiltriraju tumor (Slika 15).
[0499] Miševi koji nose kolorektalne CT26 singenske tumore su dva puta nedeljno lečeni sa MEDI9447 (30 mg/kg), anti-PD-L1 (30 mg/kg) ili kombinacijom MEDI9447 (30 mg/kg) i anti-PD-L1 (30 mg/kg). Tumori i periferne ćelije pune krvi su 16. dana sakupljeni i analizirani na površinsku ekspresiju CD73 pomoću protočne citometrije i enzimske aktivnosti. MEDI9447, samostalno ili u kombinaciji sa anti-PD-L1, smanjuje ekspresiju CD73 na perifernim ćelijama pune krvi (Slika 16), CD4+, FoxP3+ limfocitima koji infiltriraju tumor (Slika 17) i CD8+ limfocitima koji infiltriraju tumor (Slika 18). MEDI9447, samostalno ili u kombinaciji sa anti-PD-L1, takođe smanjuje ekspresiju CD73 na ćelijama tumora (Slika 19).
[0500] MEDI9447 i antitela ili fuzioni proteini specifični za CTLA4, OX40, PD-1, i PD-L1 inkubirani su tokom 72 h sa primarnim humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi u mešovitoj reakciji leukocita. Navedeni citokini u duplikatima supernatanta kvantifikovani su pomoću ELISA. Prikazani podaci predstavljaju optimalne kombinacije doza anti-CD73 antitela sa 4 različita partnerska agensa. Kombinacija anti-PD-1 i anti-CD73 pokazala je značajnu (p<0,05) sinergiju (slika 20) utvrđenu metodom Blisovog površinskog odgovora (Zhao et al.). Profil citokina pokazuje da je bilo uticaja i na mijeloidne i na limfoidne loze. Testirano je više od 50 donorskih parova.
[0501] Ukratko, anti-PD-1 i anti-PD-L1 antitela stvorila su mikrookruženje tumora bogato sa CD73 koje može da se detektuje na periferiji i može da se preokrene lečenjem anti-CD73 antitelom, MEDI9447 mIgG1. Konkretno, nivoi ekspresije CD73 na ćelijskoj površini i enzimske aktivnosti dramatično su se povećali na mišjim CT26 tumorima kada su miševi koji nose ove tumore tretirani anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelom. Dalje, nivoi ekspresije i
1
aktivnosti su smanjeni tretmanom anti-CD73 antitelom MEDI9447, samostalno ili u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom. Ove promene su uočene kod oba tumora, kao i u cirkulišućim perifernim ćelijama pune krvi. Dakle, ekspresija i aktivnost CD73 mogu da posluže kao farmakodinamički marker za anti-PDL1 i anti-CD73 lečenje, ili kao prediktivni biomarker za segmentaciju pacijenata lečenih sa anti-PD-1 ili anti-PD-L1 čiji tumori su „pobegli“ putem neregulisanja ekspresije i aktivnosti CD73. Važno je da anti-CD73 antitelo, MEDI9447, u kombinaciji sa anti-PD1 ili anti-PD-L1, MEDI 4736, pokazuje pojačanu antitumorsku aktivnost.
[0502] Zajedno, ovi rezultati različitim merama potvrđuju da anti-PD-1 i anti-PD-L1 antitela indukuju „CD73 bogato“ mikrookruženje tumora i pružaju snažan argument za kombinovanje MEDI9447 sa terapijama koje ciljaju PD-1/PD-L1 osu.
Primer 9: anti-CD730010 antitelo i varijante antitela
[0503]
Tabela 11: Afinitet matičnog anti-CD730010 antitela i varijanti antitela sa germinatizovanim aminokiselinama.
[0504] Za CD730002, najbliži germinativni geni bili su IGHV3-23 i IGHJ3 za VH domen, i IGLV3-1 i IGLJ3 za VL domen. Identifikovana su četiri negerminativna ostatka izvan CDR regiona: R94 u VH, i T20, R57, L81 i F87 u VL (Kabatova numeracija) (Tabela 11). Nukleotidi u ekspresionom vektoru CD730002 IgG1-TM povratno su mutirani standardnim
14
tehnikama molekulske biologije, tako da nastali ekspresioni vektori kodiraju germinativne aminokiseline na tim pozicijama (K94 u VH, i S20, G57, M81 i Y87 u VL). Proteinske varijante CD730002 IgG1-TM su eksprimirane, prečišćene i testirane na vezivanje za rekombinantni humani i mišji CD73 pomoću protočne citometrije. Sve 4 negerminativne aminokiseline u VL mogu da se promene u svoje germinativne ostatke bez oštećenja vezivanja. Međutim, R94 u VH je važan za vezivanje, i njegova promena u K ometa vezivanje. Varijanta CD730002 SGMY (negerminatizovani V, potpuno germinatizovani VL) korišćena je kao predložak za stvaranje afinitetno optimizovanih varijanti antitela.
PRIMER 10: Optimizacija afiniteta anti-CD73 antitela CD730010GL9
[0505] CD730010GL9 IgG1-TM je optimizovan skriningom Fab biblioteka koje sadrže varijante sekvenci CDR sa pojedinačnim aminokiselinskim mutacijama. Svaka od 61 pozicije u šest CDR-a pojedinačno je randomizovana na 19 aminokiselina (sve prirodne aminokiseline, osim cisteina), stvarajući biblioteku sa teoretskom raznovrsnošću od 1159 jedinstvenih klonova (19 aminokiselina po poziciji puta 61 pozicija). Bakterijski Fab fragmenti su proizvedeni od 4224 klona iz biblioteke, i skrinirani su na vezivanje za humani i mišji CD73 protein pomoću ELISA za hvatanje (test 2). Odabrano je 180 klonova sa povećanim signalom vezivanja u odnosu na matični CD730010 GL9 IgG1-TM, i mutacije u VH ili VL domenu su identifikovane DNK sekvenciranjem. Koncentracija Fab u bakterijskim supernatantima je normalizovana, a vezivanje normalizovanih supernatanta za humani i mišji CD73 protein je procenjeno direktnim ELISA (Test 1). Tabela 12 navodi odabrane korisne supstitucije pojedinačnih aminokiselina i njihovo dejstvo na vezivanje za rekombinantni CD73 protein.
Tabela 12: Pojedinačne aminokiselinske varijante CD730010 GL9 sa poboljšanim afinitetom.
[0506] Da bi se dalje poboljšao afinitet anti-CD73 antitela, nekoliko pojedinačnih aminokiselinskih promena koje su poboljšale vezivanje u poređenju sa matičnim CD730010 GL9 kombinovano je da bi se stvorila kombinatorna Fab biblioteka (Test 4). Fragmenti Fab 4224 klona iz kombinatorne biblioteke su proizvedeni u E.coli i ispitani na vezivanje za humani i mišji CD73 protein putem ELISA sa hvatanjem antitela. Najboljih 20 klonova iz svakog testa skrininga je izabrano za dalju karakterizaciju. Koncentracija Fab u supernatantima je normalizovana, a serijska razblaženja normalizovanih supernatanta su testirana na vezivanje za humani i mišji CD73 putem ELISA sa hvatanjem antitela i direktnog ELISA testa. Klonovi C1, C2, D3 i G10 pokazali su snažno vezivanje za humani i mišji CD73, i izabrani su za dalju karakterizaciju.
[0507] Antigensko vezivanje CD730010 GL9 takođe je optimizovano koristeći odabir faga na bazi afiniteta. Velike scFv biblioteke dobijene od vodeće CD730010 GL9 sekvence stvorene su putem mutageneze usmerene na oligonukleotid regiona za određivanje komplementarnosti 3 (CDR3) varijabilnog teškog (VH) ili CDR3 varijabilnog lakog (VL) lanca koristeći standardne tehnike molekularne biologije, kako je opisano (Finch et al., JMB 411, 791-807 (2011)). Biblioteke su panovane u nizu ponovljenih naizmeničnih ciklusa selekcije sa biotinilovanim humanim i mišjim CD73 proteinom ekstracelularnog domena. ScFv geni iz 3. ciklusa odabira su konvertovani u šarži u bakterijske IgG ekspresione vektore. Supernatanti bakterijskih kultura koji sadrže rastvorljivi IgG ispitani su na vezivanje za humani i mišji CD73. IgG varijante sa značajno poboljšanim vezivanjem za CD73 u poređenju sa matičnim CD730010 GL9 podvrgnute su DNK sekvenciranju. Za dalju karakterizaciju su odabrane dve varijante, GRVE i HPT.
[0508] Da bi se stvorila dalja poboljšanja afiniteta, korisne mutacije identifikovane iz kombinatorne biblioteke Fab i iz selekcije faga na bazi afiniteta su kombinovane, čime nastaju varijante 73combol do 73combo6.
14
PRIMER 11: Optimizacija afiniteta anti-CD73 antitela CD730002SGMY
[0509] CD730002SGMY IgG1-TM je optimizovan skriningom Fab biblioteka koje sadrže varijante sekvenci CDR sa pojedinačnim aminokiselinskim mutacijama, kako je opisano za CD730010GL9. Identifikovano je pet aminokiselinskih mutacija u VH domenu i četiri aminokiselinske mutacije u VL domenu koje dovode do pojačanog signala vezivanja za rekombinantni CD73. Tabela 13 navodi korisne supstitucije pojedinačnih aminokiselina i njihovo dejstvo na vezivanje za rekombinantni CD73.
Tabela 13: Pojedinačne aminokiselinske varijante CD730002SGMY sa poboljšanim afinitetom.
[0510] Da bi se dalje poboljšao afinitet anti-CD73 antitela CD730002SGMY, pripremljene su varijante IgG koje sadrže jednu korisnu promenu aminokiseline u VH domenu i jednu korisnu promenu aminokiseline u VL domenu. Varijante antitela su pripremljene tranzijentnom transfekcijom 293F ćelija, i pomoću protočne citometrije su ispitane na vezivanje za MDA-MB-231 ćelije. Klon 2C5 je imao trostruko nižu vrednost EC50 od matičnog CD730002SGMY
PRIMER 12: Afinitet optimizovanih anti-CD73 antitela
[0511] Afinitet optimizovanih anti-CD73 antitela (u IgG1-TM formatu) prema CD73 čoveka, miša i cinomolgusa određen je protočnom citometrijom i površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) (Tabela 14). Optimizovana antitela su imala pM afinitet prema ćelijskom i rekombinantnom CD73 tri vrste.
14
Tabela 14: Afinitet anti-CD73 antitela prema CD73 čoveka, miša i cinomolgusa
14
PRIMER 13: Internalizacija anti-CD73 antitela
[0512] Internalizacija anti-CD73 antitela u ćelijske linije MDA-MB-231 i 4T1 procenjena je primenom FabZAP testa (Advanced Targeting Systems, San Diego CA). Ćelijske linije su inkubirane u prisustvu anti-CD73 antitela i reagensa FabZAP. Nakon 3 dana, izmerena je proliferacija ćelija kako bi se izračunale vrednosti EC50 i maksimalna toksičnost (Tabela 15). FACS podaci pokazuju da je brzina internalizacije afinitetno optimizovanih antitela mala.
Tabela 15: Internalizacija anti-CD73 antitela
[0513] U drugom eksperimentu, internalizacija antitela u ćelijske linije procenjena je analizom citotoksičnog dejstva konjugata anti-CD73 antitelo/saporin na CD73 pozitivne ćelijske linije (Tabela 15). Anti-CD73 antitela su direktno konjugovana sa toksinom saporinom koristeći S-HyNic i 4FB hemiju (Solulink, San Diego CA), i utvrđena je koncentracija konjugata antitelo/saporin potrebna za inhibiciju rasta ćelija za 50%.
TABELA 15: Karakterizacija anti-CD73 antitela.
14
PRIMER 14: Anti-humano CD73 antitelo, Phen0203 hIgG1, inhibiralo je AMP posredovanu supresiju proliferacije CD4+CD25- T ćelija in vitro, na način zavisan od koncentracije.
[0514] Sprovedena je studija kako bi se odredila sposobnost anti-CD73 antitela (Phen0203) da ublaži AMP posredovanu T ćelijsku supresiju in vitro. U ovoj in vitro studiji, ispitivana je sposobnost anti-humanog CD73 antitela (Phen0203 hIgG1) da inhibira katalizu adenozin monofosfata do adenozina i organskog fosfata pomoću CD73 i posledični uticaj na funkciju T-ćelija. Phen0203 hIgG1 ima slična funkcionalna svojstva kao MEDI9447, uključujući sposobnost inhibicije ćelijske i biohemijske enzimske aktivnosti CD73 in vitro).
[0515] Phen0203 hIgG1 antitelo je mAb humanog IgG1 bez konstruisanja u konstantnom regionu teškog lanca. Slično MEDI9447, takođe se selektivno vezuje i inhibira proizvodnju imunosupresivnog adenozina putem aktivnosti ektonukleotidaze humanog CD73. Međutim, Phen0203 nema unakrsnu reaktivnost na mišji CD73.
14
[0516] U testu AMP posredovane T ćelijske supresije, primarne humane CD4<+>T ćelije bez CD25+ ćelija su izolovane iz sadržaja leukocitnih konusa i korišćene kao efektorske ćelije; svaki konus je zasebno obrađen. Ukratko, sadržaj iz leukocitnog konusa je razblažen u PBS-u, zatim nanet u slojevima na Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK) i centrifugiran na 400×g tokom 40 minuta sa isključenim kočnicama. Zatim su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane iz međupovršine i isprane PBS-om centrifugiranjem na 200×g tokom 10 minuta. Supernatant je odbačen, a ćelije suspendovane u PBS-u. Vijabilne ćelije su određene, zatim peletirane na 350×g tokom 5 minuta i suspendovane u Robosep puferu (Stem Cell, Grenoble, Francuska) u koncentraciji od 5×107 po ml. CD4+ T ćelije su izolovane iz PBMC negativnom selekcijom koristeći EasySep komplet za obogaćivanje humanih CD4<+>T ćelija (Stem Cell, Grenoble, Francuska) i RoboSep (Stem Cell, Grenoble, Francuska). Prečišćene CD4<+>T ćelije su peletirane i ponovo suspendovane sa 1,5×107 po ml Robosep pufera. Dynabeads CD25 (komponenta Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T ćelijskog kompleta; Life Technologies, Paisley, UK) dodate su sa 200 µl na 1,5 × 107 ćelija, i inkubirane tokom 25 minuta na 4°C uz neprekidno mešanje. Ćelije su zatim stavljene na magnet DynaMag-15 (Life Technologies, Paisley, UK) tokom 1 minuta, i supernatant koji sadrži CD4<+>CD25<->efektorske ćelije prebačen je u novu epruvetu.
[0517] Izolovane efektorske ćelije su obeležene CFSE sondom (3 µM) koristeći CellTrace CFSE komplet za proliferaciju ćelija (Life Technologies, Paisley, UK) sa gustinom ćelija od 1×106 ćelija po ml u PBS-u koji sadrži 0,1% BSA sa periodom inkubacije od 15 minuta na 37°C. Ćelije su dva puta isprane toplim X-Vivo 15 medijumom i suspendovane sa 5×10<5>ćelija po ml u istom medijumu. Obeležene efektorske ćelije su aktivirane 1 sat na 37°C dodavanjem 25 µl mikroperlica obloženih sa anti-CD3 i anti-CD28 (Dynabeads humani T-aktivator CD3/CD28; Life Technologies, Paisley, UK) sa 1×106 ćelija i 60 IU/ml rhIL-2. Nakon toga, aktivirane CD4+CD25- ćelije (približno 50.000 u 100 µl) dodate su u bunarčiće sterilnih ploča sa okruglim dnom sa 96 bunarčića. Serijska razblaženja sledećih reagensa su obavljena u X-Vivo 15 medijumu (Lonza, Slough, UK): test proizvod Phen0203 hIgG1 i R347 kontrolno antitelo,
[0518] Ćelijama na ploči dodato je 50 µl razblaženih reagensa, nakon čega je sledilo 50 µl X-Vivo 15 (Lonza, Slough, UK) koji sadrži 400 µM ili 800 µM AMP (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK). Uključeni su i sledeći kontrolni bunarčići: aktivirane CFSE obeležene CD4+CD25- ćelije bez AMP (aktivirana kontrola); CFSE obeležene CD4<+>CD25<->ćelije sa
14
AMP ali bez ispitivanih/kontrolnih proizvoda (netretirana kontrola); i neaktivirana (mirujuća kontrola) CFSE obeležene CD4<+>CD25<->ćelije bez AMP. Ćelije u testu su lagano peletirane centrifugiranjem, na 100×g tokom 2 minuta, i stavljene u humidifikovani inkubator za uzgajanje tkiva na 37°C sa 5% CO2tokom 72 sata.
[0519] Nakon 72 sata inkubacije, ćelije su peletirane centrifugiranjem na 380 g tokom 4 minuta, isprane jednom sa 100 µl FACS pufera (eBioscience, Hatfield, UK) i na kraju suspendovane u 100 µl PBS-a koji sadrži 3,7% formaldehida za analizu protočnom citometrijom na uređaju BD FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK). Bunarčić sa mirujućim CFSE<+>CD4<+>CD25<->ćelijama bez AMP je korišćen za identifikaciju ćelija koje su prošle ćelijsku deobu (podeljene ćelije).
[0520] Utvrđeno je da je CD73 eksprimiran na podskupu CD4<+>T ćelija. U prisustvu ekstracelularnogAMP, CD73+ T ćelije mogu da omoguće panakrini/autokrini put, što uključuje metabolizam AMP u adenozin putem CD73, nakon čega sledi aktivacija adenozinskih receptora i posledična regulacija funkcije T ćelija. Ovaj put CD73/adenozina je modelovan in vitro koristeći prečišćene CD4<+>CD25<->primarne humane T ćelije aktivirane putem TCR signalizacije i rhIL-2. Proliferacija T ćelija je suzbijena u prisustvu 100 ili 200 µM ekstracelularnog AMP.
[0521] Phen0203 hIgG1, anti-humano CD73 antitelo, moglo je da inhibira AMP posredovanu supresiju proliferacije CD4+CD25- T ćelija in vitro, na način zavisan od koncentracije. Podaci pružaju naučno obrazloženje za pristup anti-CD73 antitelima koji cilja imunosupresivno dejstvo puta AMP/CD73/adenozina.
PRIMER 15: Mapiranje epitopa i paratopa MEDI9447
[0522] Kako bi se identifikovala vezujuća međupovršina MEDI9447 i CD73, MS analiza izmene vodonika deuterijumom (HDX-MS) izvršena je sa MEDI9447 Fab i rekombinantnim rastvorljivim CD73 (sCD73), samostalno ili u kompleksu (Slike 19A, 19B i 20A-20E). Poslednjih godina, pokazalo se da je MS izmena vodonika deuterijumom (HDX-MS) moćan alat za mapiranje mesta interakcija protein-protein i karakterizaciju strukture proteina i konformacione dinamike. Korišćenjem diferencijalnog obeležavanja proteinskih regiona na način koji je uslovljen dostupnošću rastvaraču, epitopi antitela su uspešno mapirani koristeći HDX-MS. Upoređivanjem kinetike razmene vodonika između slobodnog i kompleksnog
1
CD73 otkrivena su dva regiona locirana u N-terminalnom domenu sCD73 (aminokiseline (aa) 132-143 i 182-187) koji ispoljavaju smanjen unos deuterijuma kada se vežu za Fab (Slike 19A, 20A i 20B). Region 132-143 (HDX_E1) pokazao je značajnu promenu unosa samo u najkraćim terminima izloženosti. Pri dužem vremenu izloženosti nije bilo razlike u razmeni. Bez vezivanja za određenu teoriju, ovo ukazuje da je mesto samo delimično zaštićeno od rastvarača. Nasuprot tome, stepen diferencijalnog unosa deuterijuma u regionu 182-187 (HDX_E2) povećavao se sa vremenom izlaganja. Bez vezivanja za određenu teoriju, to je u skladu sa visoko afinitetnom interakcijom protein-protein koja smanjuje dostupnost rastvaraču (slika 19A). Analiza Fab je pokazala da region za određivanje komplementarnosti (CDR) 1 i 3 teškog lanca i CDR1 i CDR2 lakog lanca pokazuju najveće smanjenje razmene kada su u kompleksu sa CD73, što pokazuje da su ovi regioni primarni činioci paratopa (Slike 20C i 20D). Iako su CD73 aa 132-143 (HDX_E1) i 182-187 (HDX_E2) diskontinualni u prostoru sekvence, oni su susedni kada se mapiraju na savijenu strukturu CD73 (Slika 19B). Razlike u razmeni vodonika su uočene i u drugim regionima u CD73. Međutim, veći deo promena mase, uključujući promene peptida koji sadrže poznate supstrat-vezujuće ostatke i aktivnog mesta, nije bio statistički značajan (Slike 19A i 20E).
[0523] Kako HDX izveštava o promenama zavisnim od konteksta kod izlaganja polipeptidnog skeleta rastvaraču, potrebna je potvrda da bi se uočila razlika između razmene vodonika usled maskiranja skeleta u međupovršini epitop-paratop u odnosu na konformacione izmene koje su indirektno ili alosterno indukovane vezivanjem antitela. Da bi se utvrdilo da li HDX_E1 i HDX_E2 čine epitop MEDI9447, ispitano je vezivanje antitela za himerne CD73 mutante sa zamenjenim domenom (Slike 21A-21H i Tabela 16).
Tabela 16: Vezivanje MEDI9447 za varijante CD73
1 1
[0524] Zamena domena je tehnika u kojoj je homolog ciljnog proteina (tj. humani CD73) koji ne vezuje antitelo od interesa korišćen za stvaranje himera koje otkrivaju te ostatke koji čine epitop. Za razliku od uvođenja delecija, razmena sekvenci između homologa smanjuje
1 2
verovatnoću globalnog narušavanja strukture proteina ili sprečavanja ekspresije proteina. CD73 kokoške (Gallus gallus) deli ∼65% identičnosti sekvence sa zrelim humanim CD73 (Slika 22). Kada su humani CD73 N-terminalni domen (KO_1-291), ili i N- i C-terminalni domen (KO_1-291+311-523) izbačeni zamenom odgovarajućom sekvencom kokoške, vezivanje zamenjenih himera za MEDI9447 je izgubljeno (Slike 21A-21H i Tabela 16). Izbacivanje samo C-terminalnog domena (aa 311-523) ili regiona linkera alfa spirale (aa 292-310) nije uticalo na vezivanje u poređenju sa divljim tipom (WT) proteina (Slike 21A, 21D, 21E i Tabela 16). Ovi rezultati su u skladu sa lokacijom epitopa u N-terminalnom domenu CD73. Nadalje, svaki region međupovršine HDX je izbačen zasebno i u kombinaciji. Vezivanje MEDI9447 za KO_HDX_E1 bilo je uporedivo sa WT CD73, iako je došlo do manjeg smanjenja brzine asocijacije ka(Slika 21F i Tabela 16). Nasuprot tome, afinitet vezivanja za KO_HDX_E2 bio je značajno slabiji nego WT CD73, usled brže disocijacije (Slika 21F i Tabela 16). Izbacivanje oba regiona (KO_HDX_E1+E2) dovelo je do malog smanjenja vezivanja u poređenju sa E2 regionom samostalno (Slika 21G i Tabela 16). Ova otkrića pokazuju da, iako region 182-187, i u manjoj meri 132-143, sadrže ostatke značajne za vezivanje antitela, dodatni ostaci izvan identifikovane HDX međupovršine sačinjavaju epitop.
[0525] Da bi se u potpunosti definisao epitop MEDI9447, stvoren je panel himera sa zamenjenim sekvencama, zamenom ∼70 aa delova N-terminalnog domena humanog CD73 odgovarajućom sekvencom kokoške (Slike 22, 23A i 23B). Izbacivanje samo regiona 2 (DS2) ili 3 (DS3) takođe je smanjilo vezivanje, a zamena oba regiona zajedno (DS2_3) izbacila je vezivanje (slike 23A i 23B). Izbacivanje regiona 4 (DS4) ili dela regiona 1 (DS1a) (zamena celog regiona je sprečila ekspresiju) nije uticalo na vezivanje (slike 23A i 23B). Analiza vezivanja sa himerama koje sadrže regione sa zamenom ∼20-30 aa otkrila je da podregion DS2d (aa 135-152) i DS3b (aa 171-188) sadrže ostatke koji utiču na vezivanje MEDI9447 (Slike 23A i 23B). Kada je deo podregiona 2d (DS2dmod) zamenjen regionom 3b (DS2dmod_3b), vezivanje je izgubljeno (Slike 23A i 23B). Značajno je da ova dva podregiona obuhvataju međupovršinu identifikovanu studijom HDX (Slika 22). Zapažanje da zamena oba HDX regiona zajedno nije ukinula vezivanje pokazuje da su dodatni podaci koji posreduju u vezivanju locirani u podregionima 2d i 3b, ali ne u identifikovanim mestima HDX. Da bi se mapirali ovi dodatni ostaci epitopa, procenjeno je vezivanje antitela za panel CD73 himera koji sadrži pojedinačne tačkaste mutacije, ili kombinaciju tačkastih mutacija i zamene regiona. Mutageneza sa alaninom je takođe izvršena na ostacima koji se nalaze u
1
HDX međupovršini i prostorno su joj bliski, koji su očuvani između CD73 kokoške i čoveka (Slike 22, 23A i 23B). Ove analize su otkrile da su V144, K180 i N185 primarni ostaci epitopa, pri čemu je N185 najvažniji (Slike 23A, 23B i 24). Kombinacija N185G mutacije sa K180A ili V144K ukinula je vezivanje dok je mutiranje K180 i V144 zajedno dovelo do smanjenja vezivanja (Slike 23A i 23B). Pored K180, utvrđeno je da su još tri očuvana ostatka, Y135, K136 i N187, uticala na vezivanje, ali u manjoj meri (Slike 23A, 23B i 24A). Uticaj ova poslednja tri ostatka je otkriven njihovim mutiranjem u alanin u kontekstu KO pozadine sa zamenjenim domenom; kao isključivo tačkaste mutacije imali su minimalno ili nikakvo dejstvo na afinitet (Slike 23A i 23B). Da bi se V144, K180 i N185 potvrdili kao važni konstituenti epitopa, CD73 kokoške je zamenjen sa V144 i N185 (K180 je očuvan). Prisustvo ova tri ostatka omogućilo je vezivanje putem MEDI9947 sa subnanomolarnim afinitetom (KD= 79 pM) (Slike 23A, 23B i 24B). Bez vezivanja za određenu teoriju, ovo ukazuje na to da je vezivanje MEDI9447 za CD73 primarno posredovano pomoću ove tri pozicije aminokiselina. Značajno je da, iako je HDX analiza identifikovala uopšteno mesto vezujuće međupovršine, dva od tri značajna ostatka epitopa nisu sadržana u peptidima koji ispoljavaju promenu u razmeni vodonika (Slike 20A i 20B).
[0526] Nanošenje identifikovanog epitopa na strukturu CD73 pokazuje da se mesto vezivanja nalazi na apikalnoj, bočnoj površini otvorene konformacije CD73 (Slike 24C-24E). N185 je pozicioniran blizu vrha N-terminalnog domena u regionu petlje koji se pruža od spirale G, koji sadrži K180 (slika 24C). Smešteni na β-lancu 6, i pored K180, nalaze se Y135 i K136. V144 je smešten unutar β-lanca 7, u bliskom kontaktu sa N187 (Slika 24C). Zajedno, bočni lanci ovih ostataka čine skoro neprekinutu vezujuću površinu (Slika 24D). Kada se gleda u otvorenoj strukturi monomera CD73, očito je da je epitop i na suprotnoj strani i prostorno udaljen od mesta vezivanja supstrata (Slika 24F). Pored toga, mesto vezivanja ne obuhvata nijedan ostatak aktivnog mesta, uključujući one koji koordiniraju interakciju sa Zn<2>kofaktorom (Slika 24F). Bez vezivanja za određenu teoriju, bilo je predviđeno da se MEDI9447 ne takmiči u vezivanju AMP, već inhibira enzimsku aktivnost CD73 kroz potencijalno alosterni mehanizam, na osnovu pozicije epitopa.
PRIMER 14: MEDI9447 je inhibirao aktivnost enzima CD73
[0527] Da bi se okarakterisao način inhibicije MEDI9447, prvo je ispitana kinetika sCD73 hidrolize AMP u prisustvu MEDI9447 ili inhibitora CD73 koji ne može da se hidrolizuje, APCP. MEDI9447 je nekonkurentno inhibirao sCD73, što je dokazano smanjenim Vmaks
1 4
(4,59 ± 0,26 prema 1,21 ± 0,03), bez obzira na koncentraciju supstrata (Slika 25A). Nasuprot tome, APCP je povećao Mihaelisovu konstantu Km(75,85±3,36 prema 26,03±3,87), ali nije smanjio Vmax(3,35±0,04 prema 3,50±0,11), u skladu sa prethodnim nalazima da je APCP konkurentski inhibitor CD73 (slika 25B). Ovi rezultati pokazuju da je MEDI9447 blokirao sposobnost sCD73 da hidrolizuje AMP. Pored toga, oni ukazuju da MEDI9447 ne blokira vezivanje supstrata AMP, što je u skladu sa pozicijom epitopa.
[0528] Dalje, inhibicija sCD73 testirana je u funkciji rastuće koncentracije MEDI9447 bilo u IgG ili Fab formatu. MEDI9447 IgG je inhibirao aktivnost sCD73 na način zavisan od doze, pri čemu je maksimalna inhibicija postignuta u molskom odnosu od ∼1:1 između IgG i sCD73 dimera (Slika 25C). Međutim, kada je IgG bio u stehiometrijskom višku u odnosu na sCD73, primećen je gubitak inhibicije (Slika 25C). Ovaj takozvani „efekat udice“ uočen je u drugim imunološkim testovima, i može dovesti do vezivanja jednovalentnog antitela pokrenutog kracima Fab na istom molekulu IgG koji se takmiči za ograničena mesta vezivanja na ciljnom antigenu. U skladu sa ovim zapažanjem, Fab format MEDI9447 nije inhibirao aktivnost sCD73 (Slika 25C). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je za inhibiciju funkcije sCD73 potrebna dvovalentna interakcija MEDI9447.
PRIMER 15: MEDI9447 je sprečio konformacioni prelaz CD73 u zatvoreno stanje
[0529] Prethodne strukturne studije CD73 otkrile su da enzimska aktivnost CD73 zahteva prelaz „zatvorene“ u „otvorenu“ konformaciju. U otvorenom stanju, enzim je neaktivan, dok se u zatvorenom stanju formira aktivno mesto, što omogućava hidrolizu supstrata. Određivanje kristalne strukture humanog CD73 pokazalo je da prelaz između otvorenih i zatvorenih konformera zahteva opsežno savijanje i rotaciju regiona linkera alfa-spirale kako bi se omogućilo da se N-terminalni domen ponovo pozicionira naspram C-terminalnog domena gradeći aktivno mesto. Pretpostavljalo se da bi uključivanje svakog Fab kraka MEDI9447 na dva CD73 N-terminalna domena moglo da gradi most koji ograničava prelaz CD73 iz neaktivnog, otvorenog stanja u katalitički aktivno, zatvoreno stanje. Da bi se ispitalo da li MEDI9447 inhibira konformacioni prelaz CD73, korišćeno je antitelo, mAb A, koje je razvijeno kao reporter konformacije CD73. Mapiranje vezujuće površine mAb A pokazalo je da interaguje i sa N- i sa C-terminalnim domenom CD73 (Slike 26A-26C). Imajući u vidu lokaciju vezujućeg regiona, zaključeno je da će epitop biti prisutan u otvorenom konformeru CD73, ali će biti prekinut u zatvorenom konformeru (Slika 26B). Da bi se to testiralo, izmereno je vezivanje mAb A za otvoreni sCD73 bez supstrata i zatvoreni sCD73 (Slike
1
27A-27C). Da bi se indukovala zatvorena konformacija, sCD73 je prethodno inkubiran sa Zn2+ i APCP; ovaj kofaktor i supstrat koji ne može da se hidrolizuje su prethodno korišćeni da se stvori kristalna struktura zatvorenog konformera humanog CD73. Analiza vezivanja pokazala je da se mAb A vezuje za otvoreni sCD73, ali je vezivanje ukinuto kada je CD73 prethodno inkubiran sa Zn2+ i APCP (slika 27A). Bez vezivanja za određenu teoriju, ovo otkriće je u skladu sa prisustvom mAb A epitopa samo u otvorenoj strukturi CD73. Nasuprot tome, vezivanje MEDI9447 nije bilo osetljivo na stanje CD73, što ukazuje da se može vezati za CD73 bez supstrata ili za vezani CD73 (Slika 27A). Gubitak vezivanja mAb A zavisio je i od Zn2 i od APCP (Slika 28A). Nakon što smo utvrdili da se vezivanje mAb A odražava na konformaciono stanje CD73, dejstvo MEDI9447 na Zn2+/APCP-indukovanu strukturnu tranziciju CD73 je zatim testirano. mAb A se vezivao za sCD73 koji je prethodno inkubiran sa MEDI9447, što pokazuje da se dva antitela vezuju za posebne epitope (Slika 27B). Ono što je najvažnije, kada je kompleks sCD73-MEDI9447 naknadno inkubiran sa Zn<2>i APCP, zadržalo se vezivanje putem mAb A (Slika 27B). Nasuprot tome, kontrolni IgG i Fab format MEDI9447 nije vratio vezivanje mAb A kada je prethodno kompleksiran sa sCD73 pre dodavanja Zn2+ i APCP (Slika 28B). Ovi rezultati podržavaju hipotezu da vezivanje dvovalentnog MEDI9447 sprečava prelazak sCD73 iz otvorenog stanja u potpuno zatvorenu, hidrolitički aktivnu konformaciju. Zapažanje da se vezivanje mAb A samo delimično održava kada je MEDI9447 vezan pokazuje da Zn2+ i APCP mogu da indukuju CD73 da usvoji katalitički neaktivni intermedijer koji se sa manjim afinitetom vezuje za reportersko antitelo (Slika 27C).
PRIMER 16: sCD73 i MEDI9447 grade interdimerne premošćene komplekse [0530] Uočena inhibitorska aktivnost MEDI9447 mogla bi da se odigra preko N-terminalnog domena, interdimernog premošćavanja pojedinačnog molekula CD73, ili intradimernog premošćavanja odvojenih molekula CD73. Da bi se ovi scenariji razlikovali, okarakterisana je veličina kompleksa nastalih u rastvoru. Na osnovu izmerene mase nevezanog MEDI9447 i CD73 (145, odnosno 125 kilodaltona (kD)), predviđena veličina interdimerno premošćenog kompleksa 1:1 antitela sa CD73 bila bi ∼270 kD (Slika 29A). Kada su MEDI9447 i sCD73 vezani u molskom odnosu 1:1, nastala su dva kompleksa. Prevladavajuće vrste imale su prosečnu molsku masu (Mm) od ∼1,74 megadaltona, a manje zastupljene vrste Mm od ∼0,66 kD (Slika 30A). Mm najvećeg kompleksa je konzistentna sa oligomerom koji sadrži sedam CD73 dimera i šest IgG (7 x 125 kD 6 x 150 kD = 1,745 megadaltona). Kada je MEDI9447 ograničavajući (0,5:1, 0,1:1), nastaju kompleksi sa uporedivom Mm, ali je
1
relativna razlika u obilju svake vrste manje izražena (Slika 30A). Kompleksi sa MEDI9447 upoređeni su sa onima koji su nastali sa različitim anti-CD73 antitelom, mAb B. Analiza vezivanja mAb B za panel CD73 himera CD73 sa zamenjenim domenom pokazala je da se vezuje za region u N-terminalnom domenu CD73 koji je, nasuprot MEDI9447, blizu žleba nastalog između CD73 monomera (Slike 29B i 19B). Pretpostavljalo se da vezivanje na ovoj interno pozicioniranoj površini može da spreči da Fab krakovi mAb B grade mostove između dimera CD73. Zapravo, SEC-MALS je pokazao da mAb B gradi komplekse od ∼270-295 kD, Mm blizu one predviđene za interakciju 1:1 (Slika 30C). Zajedno, rezultati ukazuju da MEDI9447 gradi interdimerne mostove između više sCD73 dimera, i da stvaranje ovih oligomera daje epitop.
PRIMER 17: MEDI9447 je inhibirao usidreni CD73 putem jednovalentne interakcije [0531] Iako se CD73 osipa sa ćelijske površine in vivo i zadržava enzimsku aktivnost u rastvorljivom obliku, većina nativnog CD73 postoji u GPI usidrenom formatu. U svetlu ovoga i činjenice da su prethodne studije rađene sa rastvorljivim oblikom CD73, bilo je potrebno okarakterisati aktivnost MEDI9447 sa CD73 u imobilisanom stanju. Hvatanje rekombinantnog CD73 putem C-terminalne šest histidinske oznake na mikrotitarskim pločama obloženim niklom omogućilo nam je da testiramo enzimsku aktivnost imobilisanog CD73 koji je prostorno orijentisan na način koji podseća na GPI usidreni CD73 na ćelijskoj površini. Slično našim prethodnim rezultatima, MEDI9447 IgG je inhibirao hidrolizu AMP na način zavisan od doze (Slika 31A). Međutim, kada je antitelo bilo u molskom višku u odnosu na CD73 dimer, nije primećen gubitak inhibicije ili efekat udice (Slike 31A i 32). Neočekivano, MEDI9447 Fab je takođe inhibirao aktivnost CD73, ali sa nižom maksimalnom inhibicijom u odnosu na MEDI9447 IgG (Slike 31A i 32). Ovi rezultati pokazuju da, za razliku od rastvorljivog CD73, usidreni CD73 može da se inhibira jednovalentnom interakcijom antitela. Razlika u inhibiciji između IgG i Fab sugeriše da veličina molekule antitela može da diktira potentnost. Da bi se to istražilo, MEDI9447 Fab je prethodno inkubiran sa anti-Fd antitelom (xFd) u takvim uslovima da jedan krak Fab xFd antitela vezuje MEDI9447 Fab a drugi krak vezuje nespecifični, poliklonski Fab (pFab) (Slika 31B). Formiranje ovog kompleksa delotvorno je povećalo veličinu MEDI9447 Fab, uz zadržavanje jednovalentnosti na CD73. Ovaj xFd-vezani Fab je inhibirao aktivnost CD73 u istoj meri kao MEDI9447 IgG (Slika 31A). Da bi se potvrdilo ovo zapažanje, izmerena je inhibicija antitela endogeno eksprimiranog CD73 u ćelijskoj liniji humanog epitelnog kancera dojke MBA-MD-231. Slično imobilisanom rekombinantnom CD73, GPI usidreni CD73 je
1
robusno inhibiran putem MEDI9447 IgG, umereno putem MEDI9447 Fab, a prethodno vezivanje Fab za xFd antitelo je povećalo maksimalnu inhibiciju do nivoa koji je jednak IgG (Slika 31C). Na kraju, testirana je inhibicija sCD73 pomoću MEDI9447 Fab vezanog za jedan ili oba kraka xFd antitela. Za razliku od površinski vezanog CD73, sCD73 nije inhibiran putem MEDI9447 Fab koji je vezan za jedan krak xFd (Slika 31D). Međutim, dobijanje dvovalentnosti putem vezivanja MEDI9447 Fab za oba kraka xFd dovelo je do inhibicije sCD73 uporedive sa MEDI9447 IgG (Slike 31B i 31D). Ovi nalazi pokazuju da površinski usidreni CD73 može biti inhibiran vezivanjem jednovalentnog antitela, i da je potentnost posredovana veličinom antitela. To je u direktnoj suprotnosti sa sCD73, koji je inhibiran od strane MEDI9447 samo dvovalentnom interakcijom.
PRIMER 18: MEDI9447 inhibira CD73 konformacione promene i hidrolizu AMP dvostrukim, nekonkurentskim mehanizmom delovanja
[0532] Kao što je ovde opisano, određeni su epitop i mehanizam delovanja terapeutskog monoklonskog antitela koje inhibira enzimsku aktivnost CD73. Rezultati ove studije otkrili su mesto vezivanja unutar CD73 N-terminalnog domena koje je omogućilo inhibiciju kroz dva različita mehanizma. Važno je da ova funkcija daje MEDI9447 sposobnost da blokira i rastvorljivi CD73 i CD73 usidren na ćelijskoj površini na nekonkurentski način.
[0533] Koristeći HDX-MS identifikovana je vezujuća međupovršina između CD73 i MEDI9447 Fab. Usled relativno velikih peptida dobijenih iz digestije pepsinom, mesto interakcije identifikovano analizom razmene bilo je relativno široko, i obuhvatalo je ukupno osamnaest aminokiselina u dva neuzastopna peptida. Eksperimenti zamene domena i mutageneze pokazali su da je samo podskup ovih ostataka uticao na vezivanje antitela, a dve od tri aminokiseline sa najvećim uticajem (V144 i K180) sadržane su u peptidima koji nisu pokazivali diferencijalnu razmenu vodonika. Jedno od objašnjenja za ovo odstupanje je da, iako bočni lanci V144 i K180 mogu biti isključeni usled kontakta sa CDR ostacima antitela, amidni atomi vodonika povezanog peptidnog skeleta koji podležu razmeni sa deuterijumom mogu biti relativno otkriveni rastvaraču. Rezultati HDX-MS takođe su pokazali da je region sastavljen od aa 132-143 pokazivao značajne promene u kinetici razmene samo pri najkraćim terminima izlaganja. Bez vezivanja za određenu teoriju, ovo je ukazivalo na to da je vezivanje u ovom regionu relativno slabo. Zapravo, dva ostatka za koja je utvrđeno da utiču na vezivanje unutar ovog regiona (Y135 i K136) imala su samo malo dejstvo na afinitet MEDI9947 (Slike 23A i 23B). Nasuprot tome, region sa najznačajnijom diferencijalnom
1
razmenom, aa 182-187, sadržao je najvažniji ostatak za vezivanje (N185). U odsustvu kokristalne strukture, formalno ne može da se isključi mogućnost da neki ostaci koji su isključeni jer interaguju sa MEDI9447 zaista ostvaruju kontakte sa paratopom. Međutim, opsežna analiza mutantnog vezivanja ukazuje da bi ovi potencijalni ostaci minimalno doprineli termodinamici vezivanja. Kako je CDR3 teškog lanca važan za formiranje mesta kontakta sa antigenima, ovaj CDR je pokazao najveći stepen diferencijalne razmene. Rezultati HDX takođe su ukazali da je laki lanac važan za vezivanje antigena, posebno CDR1 i 2 (Slike 20C i 20D). Ovi rezultati zajednički ističu korisnost HDX-MS u mapiranju epitopa, kao i značaj potvrde predviđene vezujuće međupovršine ortogonalnom tehnikom kao što je mutageneza.
[0534] Lokacija epitopa na poziciji u N-terminalnom domenu koja je udaljena od vezivanja CD73 supstrata i ostaci aktivnog mesta su u skladu sa rezultatima koji pokazuju da MEDI9447 ima nekonkurentski režim inhibicije. Na osnovu uticaja samo epitopa, moglo bi da se pretpostavi da antitelo deluje kao klasični alosterni inhibitor, indukujući dalekosežnu konformacionu promenu u CD73 koja izvrće ostatke aktivnog mesta na način koji sprečava hidrolitičku aktivnost. Međutim, podaci HDX-MS nisu otkrili značajne izmene u strukturi CD73 u regionima izvan vezujuće međupovršine koje bi podržale ovaj vid alosternosti. Alternativno, epitop može da sugeriše da vezivanje MEDI9447 ograničava kretanje petlji, βlanaca ili α spirala u N-terminalnom domenu koji je potreban za katalitičku aktivnost. Nasuprot tome, zabeležena je mala ili nikakva razlika u sekundarnoj ili tercijarnoj strukturi unutar N-terminalnog domena između otvorene i zatvorene strukture CD73. Lokalne, interdomenske konformacione promene koje se javljaju ograničene su na linker i C-terminalni domen.
[0535] Kao alternativa indukciji strukturnih promena, smatralo se da bi lokacija epitopa bila dobro pozicionirana da omogući premošćavanje antitela ili biokonjugaciju CD73 dimera, što bi ograničilo neophodnu promenu konformacije. Ovaj koncept premošćavanja je podržan podacima koji pokazuju da je IgG bio potreban za inhibiciju rastvorljivog oblika CD73, i da MEDI9447 gradi komplekse koji sadrže više CD73 dimera. Potonji rezultat je u suprotnosti sa mAb B, koje nije gradilo interdimerne mostove, što ističe značaj MEDI9447 epitopa u davanju aktivnosti biokonjugacije. Racionalno, ako su dva N-terminalna domena CD73 vezana Fab domenima istog IgG, to bi fizički moglo da ograniči kretanje N-terminalnog domena i regiona linkera koje je potrebno da enzim poprimi svoju zatvorenu, aktivnu
1
strukturu. Upotrebom mAb A, koji deluje kao konformaciona sonda stanja CD73, pokazano je da vezivanje MEDI9447 sprečava da CD73 poprimi potpuno zatvoreni konformaciju, kako je indukovano putem Zn2+ i APCP. Srednji nivo vezivanja od strane reporterskog mAb A kada je MEDI9447 bio prethodno kompleksiran sa CD73 ukazuje na to da Zn2+ i APCP i dalje indukuju određeni stepen konformacione tranzicije. Smanjeno vezivanje mAb A može da pokazuje da je njegov epitop delimično izobličen u ovom intermedijernom stanju, ali i dalje dovoljan da se dobije vezivanje. S obzirom na visok stepen fleksibilnosti regiona šarke, nije iznenađujuće da bi, čak i kada MEDI9447 premošćava CD73 dimere, i dalje postojale neke strukturne izmene CD73 usled vezivanja supstrata. Bez vezivanja za određenu teoriju, teško je zamisliti da bi vezani IgG zarobio CD73 u potpuno krutoj konformaciji.
[0536] Iznenađujući rezultat ovog rada je da, osim premošćivanja dvovalentnom interakcijom, MEDI9447 može takođe da inhibira CD73 i kada je površinski vezan jednovalentnim mehanizmom vezivanja. Iako deluje zbunjujuće, drugi, sterno posredovani mehanizam blokiranja aktivnosti usidrenog CD73 je u skladu sa ovde opisanim zapažanjima. Nastanak katalitički aktivnog, GPI usidrenog CD73, zahteva da se N-terminalni domen rotira nadole, u položaj koji je blizu ćelijske površine. Nativni dimer CD73 je ∼130 kDa. U poređenju sa veličinom IgG ili Fab (∼150 kD, odnosno -50 kD), logično je da bi antitelo vezano za N-terminalni domen moglo sterno da blokira potpunu rotaciju CD73 radi poprimanja zatvorene konformacije. Ovaj mehanizam potkrepljuju dva zapažanja. Prvo, činjenica da Fab pokazuje nižu maksimalnu inhibiciju u odnosu na IgG slaže se sa sternim dejstvom koje zavisi od veličine. Razlika između Fab i IgG verovatno nije posledica razlika u vezivanju, jer je Fab afinitet i dalje sub-nanomolaran (KD= 327 pM, podaci nisu prikazani). Dalje, povećana potentnost dodeljena povećanjem delotvorne veličine Fab konjugacijom sa xFd antitelom takođe snažno podržava sterni mehanizam zavisan od veličine, a ne od valence ili aviditeta. Drugo zapažanje koje podržava ovaj način inhibicije je da efekat udice, ili gubitak inhibicije, nije uočen sa IgG MEDI9447 kada je CD73 površinski vezan. Pretpostavlja se da je to zato što antitelo može da blokira hidrolizu usidrenog CD73 AMP putem dvo- ili jednovalentne interakcije (Slika 33). Nasuprot tome, efekat udice je uočen kada je CD73 rastvorljiv usled odsustva čvrste faze koja je potrebna da jednovalentno vezani IgG ili Fab sterno blokira rotaciju N-terminalnog domena.
[0537] Stoga je predložen model u kome MEDI9447 antagonizuje funkciju rastvorljivog i GPI usidrenog CD73 kroz dvojni mehanizam inhibicije koji je suštinski povezan sa njegovim
1
epitopom (Slika 33). Iako ovde opisane studije pokazuju da MEDI9447 može da blokira i rastvorljivi i vezani CD73, in vivo nije poznato da li bi GPI usidreni CD73 bio inhibiran putem jednog ili oba mehanizma. Pretpostavlja se da bi gustina, orijentacija i interdimerna udaljenost CD73 na ćelijskoj površini diktirali dominantan način inhibicije. S obzirom na to da većina ćelija kancera prekomerno eksprimira CD73, što bi povećalo verovatnoću da dimeri budu u neposrednoj blizini, očekuje se da će MEDI9447 stupati i u dvo- i u jednovalentne interakcije. Na normalnom, netumorskom tkivu, gde bi ekspresija CD73 bila sa relativno manjom površinskom gustinom, MEDI9447 bi mogao da inhibira hidrolizu AMP primarno putem sternog režima blokiranja.
[0538] Iz mehaničke perspektive, blokiranje CD73 je imunoonkološka strategija koja se razlikuje od strategije uporedivih ciljeva kao što su PD-1 i CTLA-4, za koje već postoje odobreni lekovi. Sa terapeutskog stanovišta, aktivnost MEDI9447 je korisna. On nekonkurentno inhibira CD73, te stoga ne mora da se takmiči sa vezivanjem endogenog nukleotida putem blokiranja aktivnog mesta. Time se izbegava potencijalna unakrsna reaktivnost sa drugim nukleotidnim/bočnim vezujućim proteinima sa strukturno očuvanim aktivnim mestima. Nadalje, MEDI9447 može da inhibira i rastvorljivi i membransko vezani CD73 jedno- ili dvovalentnim angažovanjem. Očekuje se da će obe ove osobine doprineti in vivo delotvornosti. Ovo terapeutsko mAb ima imunomodulišući potencijal za lečenje kancera, samostalno i u kombinaciji sa postojećim hemoterapeutskim agensima koji ciljaju komplementarne imunomodulišuće puteve.
[0539] Prethodno opisani rezultati su sprovedeni koristeći sledeće supstance i postupke.
Test 1: Direktni ELISA test
[0540] ELISA ploče sa 384 bunarčića su obložene sa oko 1,5 ng/bunarčiću rekombinantnog CD73 proteina, blokirane sa 1% BSA/0,1%Tween20/PBS i inkubirane sa uzorcima antitela tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi. To je praćeno inkubacijom sa konjugatom kozjeganti-Iglambda-peroksidaze rena (HRP) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Aktivnost HRP je detektovana sa supstratom tetra metil benzidinom (TMB), i reakcija je prekinuta sa 1 M HCl. Ploče su očitane na 450 nm.
1 1
Test 2: ELISA sa hvatanjem antitela
[0541] ELISA ploče sa 384 bunarčića su obložene sa oko 3 ng/bunarčiću ovčijeg-antihumanog Fd antitela (za skrining antitela u Fab formatu), blokirane sa 1% BSA/0,1%Tween20/PBS i inkubirane sa uzorcima tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat biotinilovani CD73 protein tokom 1 h na sobnoj temperaturi. To je praćeno inkubacijom sa konjugatom streptavidin-peroksidaza rena (HRP) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Aktivnost HRP je detektovana sa supstratom tetra metil benzidinom (TMB), i reakcija je prekinuta sa 1 M HCl. Ploče su očitane na 450 nm.
[0542] Oko 50 ng/bunarčiću biotinilovanog rekombinantnog CD73 je korišćeno za skrining klonova sa pojedinačnim aminokiselinskim mutacijama. Za skrining klonova iz kombinatorne biblioteke korišćeno je 10 ng/bunarčiću biotinilovanog rekombinantnog CD73.
Test 3: Test vezivanja protočnom citometrijom
[0543] Svi eksperimenti protočne citometrije su izvedeni na 4C, i reagensi su pripremljeni u PBS/1% FBS puferu.10.000 ćelija je inkubirano sa test antitelom u zapremini od 50 ul tokom 4 sata. Ćelije su dva puta isprane i inkubirane u 50 ul konjugata kozji antihumani IgGFc-AlexaFluor647 tokom 15 minuta. Ćelije su isprane, ponovo suspendovane u puferu sa dodatkom Dapi, i analizirane protočnom citometrijom. Mrtve ćelije, identifikovan bojenjem velikom količinom Dapi, isključene su iz analize. Za određivanje vrednosti KD, grafikon medijane intenziteta fluorescencije u funkciji koncentracije test antitela prikazan je nelinearno koristeći model izoterme sa jednim mestom vezivanja.
Test 4: Stvaranje biblioteke antitela sa promenama pojedinačnih aminokiselina [0544] Mutageneza usmerena na mesto CDR kodona CD730010 ili CD730002 izvedena je pomoću QuikChange Lightning kompleta za mutagenezu usmerenu na više mesta (Agilent) i prajmera. Svaki kodon je mutagenizovan prajmerom koji je divlji tip kodona zamenio kodonom NNS. Mutagenizovani geni VH i VL su klonirani u Fab vektor za bakterijsku ekspresiju. E.coli soj BL21(DE3) transformisan je bibliotekom antitela, pojedinačne kolonije su sakupljane i kultivisane u Magic Media (Invitrogen) tokom 24 sata na sobnoj temperaturi da bi se dobili bakterijski Fab fragmenti. Bakterijski supernatant je pripremljen i korišćen za skrining biblioteke antitela u ELISA testovima vezivanja.
1 2
Test 5: Stvaranje biblioteke antitela sa kombinatornim aminokiselinskim promenama [0545] CD730010GL9 VH i VL geni su klonirani u vektor za bakterijsku ekspresiju Fab. Mutageneza usmerena na mesto CDR kodona CD730010GL9 izvedena je pomoću QuikChange Lightning kompleta za mutagenezu usmerenu na više mesta (Agilent) i preklapajuće PCR i degenerativnih prajmera. Degenerativni prajmeri su konstruisani da kodiraju odabrane aminokiselinske promene, kao i matičnu aminokiselinu na istoj poziciji. E.coli soj BL21(DE3) transformisan je Fab bibliotekom, pojedinačne kolonije su kultivisane u Magic Media (Invitrogen) tokom 24 sata na sobnoj temperaturi da bi se dobili bakterijski Fab fragmenti. Bakterijski supernatanti su korišćeni za skrining biblioteke antitela u ELISA testovima vezivanja.
Test 6: FabZAP test
[0546] 1000 ćelija/bunarčiću je uzgajano na pločama sa 96 bunarčića u RPMI/10%FBS. Serijska razblaženja anti-CD73 antitela, počevši od 5 nM, pomešana su sa FabZAP reagensom (Advanced Targeting Systems, San Diego CA) i dodata ćelijama. Nakon 3 dana inkubacije na 37°C, proliferacija ćelija je izmerena koristeći CellTiter-Glo test (Promega, Madison WI).
[0547] Sledeći testovi (testovi 7-11) izvedeni su pomoću sledećih reagensa CD73 i antitela.
[0548] Konstruisan je plazmid ekspresionog vektora sisara koji kodira rekombinantni zreli humani CD73 (aminokiselinske pozicije 1-526) (MedImmune). Da bi se postigla ekspresija rastvorljivog, izlučenog oblika CD73, GPI usidreni signalni peptid je uklonjen i zamenjen C-terminalnom 6x-histidinskom oznakom. Numerisanje sekvence CD73 se zasniva na zrelom proteinu bez signalnog peptida (humani NT5E, NCBI referentna sekvenca NP_002517.1). Plazmidi koji kodiraju rekombinantne himerne „nokaut“ (KO) mutante sa zamenom domena čoveka/kokoške stvoreni su koristeći sintetičku DNK gBlocks (IDT, Inc.) koja kodira optimizovanu kokošju sekvencu CD73 DNK (kokošji NT5E, NCBI referentna sekvenca XP_004940453.1). Na osnovu poravnanja sa sekvencom humanog CD73 proteina, aminokiselinska kodirajuća pozicija 1 konstrukata koji sadrže kokošji N-terminalni domen odgovara poziciji 20 nezrelog kokošjeg CD73 koji sadrži predviđeni signalni peptid. KO DNK konstrukti kompletne dužine su napravljeni putem PCR ekstenzije sa jednim preklapanjem gBlocks i PCR amplikona humanog CD73. Svi konstrukti su sadržali C-terminalnu 6x histidinsku oznaku. Jedna ili više tačkastih mutacija u humanim i himernim konstruktima načinjene su mutagenezom usmerenom na mesto koristeći Quick Change
1
Lightning komplet za mutagenezu usmerenu na više mesta (Stratagene). Svi CD73 konstrukti su eksprimirani u suspenziji HEK293 ćelija. Histidinski označeni divlji tip humanog CD73 (bez signalne sekvence GPI sidra) prečišćen je koristeći HisTrap nikl afinitetnu kolonu (GE Healthcare Life Sciences) nabavljenu od MedImmune Protein Sciences group. Potvrđeno je da je protein dimer u rastvoru, sa molskom masom od ~125 kDa (vidite Slike 18A i 18B). Svi mutantni CD73 konstrukti su eksprimirani tranzijentnom transfekcijom suspenzije HEK293 ćelija koristeći 293Fectin (Life Technologies). Ćelije su uzgajane i transficirane u 293Freestyle medijumu bez seruma (Life Technologies) u blokovima sa 24 bunarčića sa dubokim bunarčićima. Sirovi ćelijski supernatanti su sakupljeni šest dana nakon transfekcije i filtrirani su kroz filter od 0,45 µm radi uklanjanja ćelijskog otpada pre korišćenja. Koncentracije supernatanta varijanti CD73 su utvrđene merenjem vezivanja histidinski označenih proteina za HIS2 biosenzore (FortéBio/Pall Life Sciences) na instrumentu Octet QK384 za interferometriju biosloja (BLI) (FortéBio/Pall Life Sciences). Koncentracije su izračunate pomoću Octet softvera za analizu podataka poređenjem vezujućeg signala sa standardnom krivom dobijenom od razblaženja prečišćenog, rekombinantnog 6x-histidinski označenog humanog CD73 poznate koncentracije. MEDI9447 (formati humanog IgG1 i mišjeg IgG1), mAb A (humani IgG1) i mAb B (humani IgG1) i MEDI9447 Fab (humani IgG1) eksprimirani su i prečišćeni od strane MedImmune Protein Sciences i grupe za ekspresiju. IgG su eksprimirani u ćelijama sisara i prečišćeni hromatografijom sa proteinom A i hromatografijom na molekulskim sitima. Da bi se dobio MEDI9447 Fab, 10 mg IgG je digestovano tokom 5 sati na 37°C sa imobilisanim papainom (Thermo Scientific/Life Technologies) i Fab je prečišćen pomoću HiTrap Q kolone (GE Healthcare Life Sciences).
Test 7: HDX-MS analiza
[0549] Rekombinantni uzorci humanog CD73 i MEDI9447 Fab pripremljeni su u koncentraciji od 2 mg/ml. Kompleks CD73 Fab je nastao prethodnom inkubacijom u odnosu koncentracija od 1:1. Svi HDX eksperimenti su izvedeni koristeći Waters HDX Technology (Waters Corporation) opremljenu Leap robotom za automatizaciju. Ukratko, uzorci proteina od 1,25 µl su dvadeset puta razblaženi sa H2O ili D2O puferom (10 mM fosfat, pH 7,0) na 20°C. Nakon različitih vremena inkubacije (0 sekundi za nedeuterisane eksperimente ili 0,5, 1, 5, 10, 30, 60 i 120 minuta za deuterisane eksperimente), obeleženi uzorci su ugašeni dodatkom jednake zapremine ledeno hladnog rastvora 4,0 M gvanidin HCl (Pierce Biotechnology), 500 mM Tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorida (TCEP) (Pierce Biotechnology), pH 2,4. Odmah nakon toga, uzorci su digestovani koristeći Poroszyme
1 4
patronu sa imobilisanim pepsinom (Applied Biosystems) na 20°C. Pepsinski fragmenti su sakupljeni i obesoljeni koristeći ACQUITY BEH C18 VanGuard pretkolonu (2,1x5 mm, Waters), i eluirani na ACQUITY BEH C18 kolonu (1,7 µm, 1,0 x 100 mm, Waters) na 0°C. Peptidi razdvojeni na koloni su analizirani pomoću masenog spektrometra SYNAPT G2 (Waters). Za analizu podataka, peptidi su identifikovani koristeći softver ProteinLynx Global Server (Waters) i nivoi inkorporacije deuterijuma za svaki pepsinski peptid iz svakog vremena obeležavanja su izračunati koristeći DynamX (Waters). Za svaki protein izvedena su četiri eksperimenta bez deuterijuma i tri kompletna HDX eksperimenta. Vrednosti značajnih razlika (±1,6 daltona) izračunate su koristeći eksperimentalnu nesigurnost i interval pouzdanosti od 98% kako je prethodno opisano, osim što je objedinjena varijansa standardnih devijacija korišćena umesto srednje vrednosti pojedinačnih standardnih devijacija. Relativni unosi frakcija između CD73 Fab kompleksa i CD73 stvoreni su pomoću softvera DynamX (Waters) i eksportovani u PyMOL (Shrödinger, Inc.) radi strukturnog modelovanja. Sve strukturne slike humanog CD73 su stvorene koristeći PyMol i objavljene kristalne strukture otvorenih i zatvorenih konformacija CD73 (PDB referentni brojevi 4H2F, odnosno 4H2I).
Test 8: SPR i BLI analiza vezivanja
[0550] Vezivanje MEDI9447 za divlji tip i mutantne CD73 proteine izmereno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) koristeći ProteOn instrument (BioRad). Uzorci sirovog ćelijskog supernatanta CD73 su razblaženi do 3 µg/ml u PBS-u, 0,005% Tween-20, pH 7,4 (BioRad) i imobilisani do ∼400 RU na HTG tris-NTA senzorskom čipu (BioRad) prethodno aktiviranom sa 10 mM NiSO4, 10 mM MES, pH 6,0 (BioRad). Podjednako razblaženi uzorak sirovog ćelijskog supernatanta od netransficiranih ćelija uključen je kao kontrola referentnog kanala. Senzorgrami su snimljeni propuštanjem dvostrukih razblaženja MEDI9447 pripremljenog u PBS-u, 0,005% Tween-20, pH 7,4, u rasponu od 5 nM do 0,31 nM. U nekim slučajevima, za varijante CD73 koje su se slabo vezivale za MEDI9447, razblaženja antitela su se kretala od 20 nM do 1,25 nM. Vezivanje antitela je mereno pri protoku od 100 µl/min sa fazom asocijacije od 3 min i fazom disocijacije od 20 min. Površina senzorskog čipa je regenerisana između svakog pokušaja sa injekcijom 300 mM EDTA, pH 8,5 (BioRad), od 800 s, sa protokom od 30 µl/min. Kinetika vezivanja je analizirana koristeći softver za analizu podataka ProteOn. Obavljeno je dvostruko referenciranje i, ako nije drugačije naznačeno, za unos podataka je korišćen je 1:1 Lengmirov model vezivanja. Neke varijante CD73 koje sadrže mutacije u aminokiselinskom regionu 171-188 slabo se uklapaju u model 1:1 (tj. vrednosti hi2 >10% Rmax). Kada je napomenuto, te varijante su uklopljene u model
1
heterogenog antigena (2:1). Usled velikog afiniteta MEDI9447 (∼4 pM) i ograničenja osetljivosti uređaja ProteOn, samo su promene izmerene kinetike >2-strukih smatrane značajnim kada se porede sa vezivanjem MEDI9447 za varijante CD73. Zbog formata testa (imobilisani antigen) i dimernog stanja CD73, KDvrednosti mogu biti preterane zbog efekata aviditeta. Međutim, ne očekuje se da će ovo uticati na rangiranje MEDI9447 koji se vezuje za različite varijante CD73.
[0551] Mapiranje žarišta vezivanja anti-CD73 antitela mAb A i mAb B izvršeno je pomoću BLI koristeći instrument Octet QK384. Svi proteini su pripremljeni u 1x kinetičkom puferu (FortéBio/Pall Life Sciences). C-terminalne histidinom označene varijante CD73 iz sirovih ćelijskih supernatanta su razblažene do 6 µg/ml i imobilisane na HIS2 biosenzorima do praga vezujućeg odgovora od 0,8 nm. Nakon početnog koraka od 300 sekundi, senzori su potopljeni u 30 nM antitelo. Vreme asocijacije i disocijacije bilo je 600 s. Netransficirani ćelijski supernatant za referentnu kontrolu je uključen za oduzimanje osnovnog vezivanja tokom analize podataka. Podaci su obrađeni i grafikoni pripremljeni pomoću softvera FortéBio Data Analysis.
Test 9: Testovi enzimske aktivnosti CD73
[0552] Hidroliza AMP do adenozina i neorganskog fosfata katalizovana pomoću CD73 analizirana je kvantifikacijom neorganskog fosfata (test sa malahitno zelenim; R&D Systems) ili merenjem ATP-zavisne oksidacije luciferina inhibirane putem AMP (CellTiterGlo test; Promega). Grafikoni podataka i merenja kinetike enzima (Mihaelis-Mentenova nelinearna regresija) dobijeni su pomoću softvera Prism (Graphpad). Eksperimenti su izvedeni u dva ili u tri primerka.
[0553] Za merenje rastvorljivog rekombinantnog CD73 koristeći CellTiterGlo test, 400 pM rekombinantni CD73 i različite koncentracije anti-CD73 antitela su inkubirani u test puferu (25 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,005% Tween-20) tokom 1 sata na 37°C pre dodavanja jednake zapremine 200 µM AMP/600 µM ATP (u test puferu). Nakon 1 sata inkubacije na 37°C, koncentracija AMP u uzorku je određena pomoću testa sa CellTiterGlo prema uputstvu proizvođača.
[0554] Za merenje rastvorljivog rekombinantnog CD73 koristeći test sa malahitno zelenim, 1 nM rekombinantni CD73 i 1 nM antitelo ili 40 µM adenozin 5'-(α,β-metilen)difosfat (APCP;
1
Sigma-Aldrich) inkubirani su u test puferu (25 mM Tris pH 7,5,5 mM MgCl2, 0,005% Tween-20) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Dodata je jednaka zapremina 400 µM AMP (za anti-CD73 antitela) ili 3 mM AMP (za APCP) u test puferu, i uzorci su inkubirani tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Koncentracija neorganskog fosfata je utvrđena koristeći test sa malahitno zelenim prema uputstvu proizvođača.
[0555] Za merenja imobilisanog rekombinantnog CD73, 50 µl CD73 sa 100 ng/ml u test puferu (25 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,005% Tween-20) sa dodatkom 100 µg/ml BSA imobilisano je na pločama obloženim niklom (Life Technologies). Nevezani CD73 je ispran, i dodato je 50 µl antitela (u test puferu). Nakon inkubacije tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane, dodato je 100 µl 500 µM AMP (u test puferu) i uzorci su inkubirani tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Koncentracija neorganskog fosfata je utvrđena koristeći test sa malahitno zelenim prema uputstvu proizvođača. U nekim eksperimentima sa imobilisanim i rastvorljivim CD73, anti-CD73 antitelo (IgG i Fab) prethodno je inkubirano tokom najmanje 2 sata sa 10-strukim molskim viškom poliklonskog humanog Fab fragmenta (Bethyl Laboratories) i 100-strukim molskim viškom ovčijeg-antihumanog IgG(Fd) (Meridian Life Sciences) pre dodavanja u CD73.
[0556] Za merenje endogene aktivnosti CD73 u uzgajanim ćelijama, 20.000 MDA-MB-231 ćelija po bunarčiću je zasejano u RPMI/10% FBS (Life Technologies) na ploču sa 96 bunarčića. Nakon inkubacije preko noći, bunarčići su 3 puta isprani sa RPMI bez seruma, i dodato je 50 µl antitela (u RPMI bez seruma). Nakon 30 minuta inkubacije na 37°C, dodato je 25 µl 1,2 mM AMP (u RPMI bez seruma) po bunarčiću. Ploče su inkubirane tokom 3 sata na 37°C. Pomešano je 25 µl ćelijskog supernatanta i 25 µl 100 mM ATP, a koncentracija AMP u uzorku je određena pomoću CellTiterGlo testa prema uputstvu proizvođača.
Test 10: mAb A reporterski test konformacione tranzicije CD73
[0557] Vezivanje MEDI9447 i mAb A za prečišćeni rekombinantni humani CD73 izvedeno je na instrumentu Octet QK384. Za poređenje vezivanja mAb A i MEDI9447, CD73 je razblažen do 6 µg/ml u PBS-u, pH 7,4 (Life Technologies) plus 0,5% goveđeg serumskog albumina (PBSB; Sigma-Aldrich) i nanet na HIS2 biosenzore do praga signala vezivanja od 1,0 nm. Biosenzori su zatim prebačeni ili u sam PBSB ili u PBSB sa 10 µM ZnCl2(Sigma-Aldrich), APCP i/ili 2 mM etilendiamin tetrasirćetnom kiselinom (EDTA) (Life Technologies)
1
i inkubirani su 15 minuta. Nadalje, biosenzori su prebačeni u PBSB koji sadrži MEDI9447 ili mAb A razblažen na 30 nM u PBSB, i merena je asocijacija antitela tokom 10 minuta.
[0558] Kako bi se testiralo dejstvo MEDI9447 na konformacionu tranziciju CD73 u prisustvu ZnCl2i APCP, mAb A razblažen do 10 µg/ml u PBS-u, pH 7,4 imobilisan je na antihumanom Fc AHC biosenzoru (FortéBio/Pall Life Sciences). Nakon koraka imobilizacije od 400 s, biosenzori su blokirani tokom 10 minuta u nespecifičnom poliklonskom humanom IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) sa 50 µg/ml u PBS-u, pH 7,4. Nakon početnog koraka od 4 minuta, vezivanje mAb A je izmereno inkubacijom biosenzora tokom 600 s u bunarčićima koji sadrže CD73 razblažen do 250 nM (na osnovu molekulske težine dimera) samo u PBS-u ili u PBS-u koji sadrži 10 µM ZnCl2i/ili 0,5 mM APCP. Za uzorke koji sadrže MEDI9447 vezan za CD73, mišja IgG1 verzija MEDI9447 (korišćena kako bi se izbeglo vezivanje za anti-humani Fc biosenzor) razblažena do 250 nM u PBS-u prethodno je inkubirana sa CD73 tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi pre inkubacije sa ZnCl2i APCP. MEDI9447 Fab i mišji izotipski podudarni kontrolni IgG1 (stvoren u kompaniji MedImmune) testirani su na 500 nM. Brzina tresenja za sve korake ispitivanja bila je 1000 o/min. Analiza vezivanja i grafikoni sa podacima stvoreni su pomoću softvera ForteBio Data Analysis.
Test 11: SEC-MALS analiza
[0559] Za eksperimente koji analiziraju komplekse nastale sa CD73 i MEDI9447 ili mAb B, 900 pmola CD73 inkubirano je sa 900, 450, 90 ili 0 pmola antitela, razblaženih u PBS-u, pH 7,4. Takođe je pripremljen zasebni uzorak od 900 pmola antitela. Uzorci su inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim je 100 µl svakog uzorka odvojeno na HP 1100 HPLC (Agilent) upotrebom TSKgel G3000WxL 5 µm, 7,88 mm x 30 cm (Tosoh Bioscience, LLC) pri protoku od 1 ml/min tokom 20 min. Radni pufer za uzorak je bio 0,1 M NaPi, 0,1 M NaSO4, pH 6,8. Nakon HPLC razdvajanja, svi uzorci su analizirani pomoću Dawn Heleos II MALS detektora i Optilab T-rEx detektora indeksa prelamanja (Wyatt). Podaci su analizirani pomoću softvera Astra (Wyatt).
1
SEKVENCE [0560]
1
�
11
> SEQ ID NO: 25 CD7300010 matični FW1-VL
LPVLTQPPSVSGTPGQRVTISC
>SEQ ID NO:26 CD7300010 GL FW1-VL
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC
> SEQ ID NO: 27 CD7300010 matični FW2-VL
WYKQVPGTAPKLLIY
>SEQ ID NO:28 CD7300010 GL FW2-VL
WYQQLPGTAPKLLIY
>SEQ ID NO:29 CD7300010 matični/GL FW3-VL
GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC
>SEQ ID NO:30 CD7300010 matični/GL FW4-VL (takođe CD370002 i 2C5) FGGGTKLTVL
>SEQ ID NO:31 CD7300010 matični/GL FW1-VH (takođe CD370002 i 2C5) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
>SEQ ID NO:32 CD7300010 matični/GL FW2-VH (takođe CD370002 i 2C5) WVRQAPGKGLEWVS
>SEQ ID NO:33 CD7300010 matični/GL FW3-VH (takođe CD370002 i 2C5) RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
>SEQ ID NO:34 CD7300010 matični/GL FW4-VH
WGRGTLVTVSS
>SEQ ID NO:35 CD7300010 CDR1-VH (takođe CD370002 i 2C5)
SYAMS
>SEQ ID NO:36 CD7300010 CDR1-VH
SYAYS
>SEQ ID NO:37 CDR2-VH (takođe CD370002)
AISGSGGSTYYADSVKG
1 2
>SEQ ID NO:38 CDR2-VH LIWGSWGSTYYADSVKG
>SEQ ID NO:39 CDR2-VH AISGSGGRTYYADSVKG
>SEQ ID NO:40 CDR2-VH AISGSWGRTYYADSVKG
>SEQ ID NO:41 CDR3-VH LGYSTIDY
>SEQ ID NO:42 CDR3-VH LGYSTIDK
>SEQ ID NO:43 CDR3-VH LGYSTIDM
>SEQ ID NO:44 CDR3-VH LGYSTIDL
>SEQ ID NO:45 CDR3-VH LGYGRVDE
>SEQ ID NO:46 CDR1-VL SGSLSNIGRNPVN
>SEQ ID NO:47 CDR1-VL SGSLSNIGRNEVN
>SEQ ID NO:48 CDR1-VL SGSLSNIGRNDVN
>SEQ ID NO:49 CDR2-VL LNNQRPS
>SEQ ID NO:50 CDR2-VL LDNLRLG
>SEQ ID NO:51 CDR2-VL LDNLRLS
>SEQ ID NO:52 CDR2-VL LNNQRLG
>SEQ ID NO:53 CDR3-VL ATWDDSLNGWL
>SEQ ID NO:54 CDR3-VL ATWDDSLKGWL
1 >SEQ ID NO:55 CDR3-VL ATWDDSLIGWL
>SEQ ID NO:56 CDR3-VL ATWDDSHPGWT
1 4
�
�
>SEQ ID NO:89 CD730002 matični/2C5 FW4-VH WGQGTMVTVSS
> SEQ ID NO: 90 CD730002 matični FW1-VL QSVLTQPPSVSVSPGQTATITC
>SEQ ID NO:91 CD73000022C5 FW1-VL QSVLTQPPSVSVSPGQTASITC
>SEQ ID NO:92 CD730002 matični/2C5 FW2-VL WYQQKPGQSPVLVIY
> SEQ ID NO: 93 CD730002 matični FW3-VL RIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYFC
>SEQ ID NO:94 CD730002/2C5 FW3-VL GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC
>SEQ ID NO:95 CD730002/2C5 CDR2-VH AISGSGGSTYYADSVKR
>SEQ ID NO:96 CD730002 matični/2C5 CDR3-VH DKGYYWYMDV
>SEQ ID NO:97 CD730002 matični/2C5 CDR1-VL SGDKVGDKYAS
> SEQ ID NO: 98 CD730002 matični CDR2-VL EDTKRPS
>SEQ ID NO:99 CD7300022C5 CDR2-VL EDTKRLS
>SEQ ID NO:100 CD730002 matični/2C5 CDR3-VL QAWDTSFWV
1
�
>SEQ ID NO:1222SGMY FW3-VL GIPERFSGSNRGNTATLTISGTQAMDEADYYC
>SEQ ID NO:123 CDRH1 Y32V CDR1-VH SVAMS
>SEQ ID NO:124 CDRH1 M34R CDR1-VH SYARS
>SEQ ID NO:125 CDRH2 T57P CDR2-VH AISGSGGSPYYADSVKG
>SEQ ID NO:126 CDRH2 A60G CDR2-VH AISGSGGSTYYGDSVKG
>SEQ ID NO:127 CDRL2 T52S CDR2-VL EDSKRPS
>SEQ ID NO:128 CDRL2 R54H CDR2-VL
1
EDTKYPS
>SEQ ID NO:129 CDRL2 P55H CDR2-VL
EDTKRLS
>SEQ ID NO:132 Tremelimumab VH CDR1 iz U.S.6,682,736
GFTFSSYGMH
>SEQ ID NO:133 Tremelimumab VH CDR2 iz U.S.6,682,736 VIWYDGSNKYYADSV
>SEQ ID NO:134 Tremelimumab VH CDR3 iz U.S.6,682,736 DPRGATLYYYYYGMDV
>SEQ ID NO:135 Tremelimumab VL CDR1 iz U.S.6,682,736
RASQSINSYLD
>SEQ ID NO:136 Tremelimumab VL CDR2 iz U.S.6,682,736
AASSLQS
>SEQ ID NO:137 Tremelimumab VL CDR3 iz U.S.6,682,736
>SEQ ID NO:140 - VH CDR1
US 20130034559_73 sekvenca 73 iz US 20130034559 Orgazam: Homo sapiens RYWMS
>SEQ ID NO:141 - VH CDR2
US 20130034559_74 sekvenca 74 iz US 20130034559 Organizam: Homo sapiens NIKQDGSEKYYVDSVKG
>SEQ ID NO:142 - VH CDR3
1
US 20130034559_75 sekvenca 75 iz US 20130034559 Organizam: Homo sapiens EGGWFGELAFDY
>SEQ ID NO:143 - VL CDR1
US 20130034559_78 sekvenca 78 iz US 20130034559 Organizam: Homo sapiens RASQRVSSSYLA
>SEQ ID NO:144 - VL CDR2
US 20130034559_79 sekvenca 79 iz US 20130034559 Organizam: Homo sapiens DASSRAT
>SEQ ID NO:145 - VL CDR3
US 20130034559_80 sekvenca 80 iz US 20130034559 Organizam: Homo sapiens QQYGSLPWT
1 1

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuju za CD73, koji sadrže VLi VHkoji obuhvataju VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VHCDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 46, 51, 56, 36, 39, odnosno 45.
2. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VLkoji sadrži SEQ ID NO: 68, i VHkoji sadrži SEQ ID NO: 82.
3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je CD73 humani CD73.
4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je anti-CD73 antitelo MEDI9447 ili Phen0203 hIgG1.
5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju kancera.
6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 5, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera bešike, leukemije, limfoma, glioma, glioblastoma, melanoma, kancera jajnika, tiroidnog kancera, kancera jednjaka, kancera prostate i kancera dojke.
7. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od zahteva 5 do 6, pri čemu je ispitanik podvrgnut, bio je podvrgnut ili će biti podvrgnut anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapiji.
8. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 7, pri čemu anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 terapija obuhvata primenu anti-PD-1, anti-PD-L1 ili anti-CTLA4 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
9. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu je anti-PD-1 antitelo pembrolizumab (KEYTRUDA®, lambrolizumab, MK-3475), nivolumab (OPDIVA®, BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), AMP-224 ili njegov antigen-vezujući fragment.
10. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu je anti-PD-L1 antitelo MEDI4736, BMS-936559 ili MPDL3280A, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti.
11. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu je anti-CTLA-4 antitelo ipilimumab, tremelimumab (ticilimumab, CP-675,206) ili njegov antigen-vezujući fragment.
12. Farmaceutska formulacija koja sadrži delotvornu količinu anti-CD73 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 1 do 4, i
(i) anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment; ili
(ii) anti-CTLA4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
13. Farmaceutska formulacija iz zahteva 12, pri čemu je anti-PD-L1 antitelo MEDI4736, BMS-936559 ili MPDL3280A ili njegov antigen-vezujući fragment.
14. Farmaceutska formulacija iz zahteva 12, pri čemu je anti-CTLA4 antitelo ipilimumab ili tremelimumab (ticilimumab, CP-675,206) ili njegov antigen vezujući fragment.
1
RS20210770A 2014-11-10 2015-11-09 Vezujući molekuli specifični za cd73 i njihove upotrebe RS62003B2 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462077486P 2014-11-10 2014-11-10
US201562147329P 2015-04-14 2015-04-14
US201562188999P 2015-07-06 2015-07-06
EP15791298.1A EP3218406B2 (en) 2014-11-10 2015-11-09 Binding molecules specific for cd73 and uses thereof
PCT/EP2015/076111 WO2016075099A1 (en) 2014-11-10 2015-11-09 Binding molecules specific for cd73 and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS62003B1 RS62003B1 (sr) 2021-07-30
RS62003B2 true RS62003B2 (sr) 2025-01-31

Family

ID=54478033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210770A RS62003B2 (sr) 2014-11-10 2015-11-09 Vezujući molekuli specifični za cd73 i njihove upotrebe

Country Status (28)

Country Link
US (5) US9938356B2 (sr)
EP (2) EP3901176A1 (sr)
JP (4) JP6755866B2 (sr)
KR (3) KR102781223B1 (sr)
CN (2) CN107001472B (sr)
AU (1) AU2015345202B2 (sr)
CA (1) CA2967118A1 (sr)
CL (2) CL2017001154A1 (sr)
CY (1) CY1124791T1 (sr)
DK (1) DK3218406T4 (sr)
ES (1) ES2877080T5 (sr)
FI (1) FI3218406T4 (sr)
GB (1) GB2537445A (sr)
HR (1) HRP20210888T4 (sr)
HU (1) HUE054339T2 (sr)
IL (1) IL251891B (sr)
LT (1) LT3218406T (sr)
MX (1) MX385320B (sr)
MY (1) MY191423A (sr)
PL (1) PL3218406T5 (sr)
PT (1) PT3218406T (sr)
RS (1) RS62003B2 (sr)
RU (1) RU2730665C2 (sr)
SG (1) SG11201703332SA (sr)
SI (1) SI3218406T2 (sr)
SM (1) SMT202100353T1 (sr)
TW (1) TWI710576B (sr)
WO (1) WO2016075099A1 (sr)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201604738TA (en) 2013-12-12 2016-07-28 Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
BR122023025321A2 (pt) * 2014-05-13 2024-02-20 Medimmune Limited Uso de anticorpos anti-b7-h1 e anti-ctla-4
HRP20210888T4 (hr) * 2014-11-10 2024-12-06 Medimmune Limited Vezujuće molekule specifične za cd73 i njihova upotreba
HK1246304A1 (zh) 2014-11-11 2018-09-07 Medimmune Limited 包含抗cd73抗体和a2a受体抑制剂的治疗组合及其用途
LT3221363T (lt) 2014-11-21 2020-08-10 Bristol-Myers Squibb Company Antikūnai prieš cd73 ir jų panaudojimas
EP3789399A1 (en) 2014-11-21 2021-03-10 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
EP3932428A1 (en) 2015-05-21 2022-01-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
US11130817B2 (en) 2015-10-12 2021-09-28 Innate Pharma CD73 blocking agents
KR20230038311A (ko) 2016-03-04 2023-03-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-cd73 항체와의 조합 요법
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
EA038358B1 (ru) 2016-06-02 2021-08-13 Медиммун Лимитед Антитела к альфа-синуклеину и их применение
CA3026474A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
JP7206193B2 (ja) * 2017-01-24 2023-01-17 アイ－エムエービー バイオファーマ ユーエス リミテッド 抗ｃｄ７３抗体およびその使用
MX2019010848A (es) 2017-03-16 2019-10-30 Innate Pharma Composiciones y procedimientos para el tratamiento del cancer.
US20210107989A1 (en) * 2017-04-04 2021-04-15 Corvus Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cd73hi tumors
KR102376863B1 (ko) 2017-05-12 2022-03-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 메소텔린 결합 단백질
JP7366755B2 (ja) 2017-05-30 2023-10-23 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ オクラホマ 抗ダブルコルチン様キナーゼ１抗体および使用方法
US20200172628A1 (en) * 2017-06-22 2020-06-04 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
MA49457A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis Ag Molécules d'anticorps se liant à cd73 et leurs utilisations
AU2018308312B2 (en) * 2017-07-26 2021-05-27 Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp. Composition for preventing or treating cancer comprising a vascular disrupting agent and immune checkpoint inhibitor
EP3692068B1 (en) 2017-10-06 2022-12-07 Innate Pharma Restoration of t cell activity via the cd39/cd73 axis
CN111630070B (zh) 2017-10-13 2024-07-30 哈普恩治疗公司 三特异性蛋白质及使用方法
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
JP2021509009A (ja) 2017-11-30 2021-03-18 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａターゲティングキメラ抗原受容体及びその使用
EP3720481A4 (en) * 2017-12-04 2021-10-13 Coare Holdings, Inc. ANTI-DCLK1 ANTIBODIES AND CHIMERA ANTIGEN RECEPTORS AND COMPOSITIONS AND METHODS OF USING THEREOF
AU2019227607C1 (en) 2018-02-27 2023-07-20 Incyte Corporation Imidazopyrimidines and triazolopyrimidines as A2A / A2B inhibitors
CN110240654A (zh) * 2018-03-07 2019-09-17 复旦大学 结合cd73的抗体-药物偶联物
WO2019170131A1 (zh) 2018-03-07 2019-09-12 复旦大学 靶向cd73的抗体及抗体-药物偶联物、其制备方法和用途
AU2019231791B2 (en) * 2018-03-09 2022-08-11 Agenus Inc. Anti-CD73 antibodies and methods of use thereof
CA3090008A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-cd73 antibodies and uses thereof
JP2021521182A (ja) 2018-04-12 2021-08-26 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｄ７３アンタゴニストとｐｄ−１／ｐｄ−ｌ１軸アンタゴニストの組み合わせ治療
MA52940A (fr) 2018-05-18 2021-04-28 Incyte Corp Dérivés de pyrimidine fusionnés utilisés en tant qu'inhibiteurs de a2a/a2b
EP3569618A1 (en) * 2018-05-19 2019-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Antagonizing cd73 antibody
UY38247A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
EP3802611A2 (en) 2018-06-01 2021-04-14 Novartis AG Binding molecules against bcma and uses thereof
JP7500442B2 (ja) 2018-06-18 2024-06-17 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム 癌を処置するための組成物及び方法
CA3105721A1 (en) 2018-07-05 2020-01-09 Incyte Corporation Fused pyrazine derivatives as a2a / a2b inhibitors
US11034771B2 (en) 2018-07-25 2021-06-15 I-Mab Biopharma Us Limited Anti-CD73 anti-PD-L1 bispecific antibodies
WO2020061482A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Egfr binding proteins and methods of use
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
JP2022509930A (ja) 2018-11-12 2022-01-25 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗ｃｄ７３抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの使用
CN111499747B (zh) * 2019-01-11 2022-03-18 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种抗cd73单克隆抗体及其应用
AU2020205753B2 (en) 2019-01-11 2025-05-29 Omeros Corporation Methods and compositions for treating cancer
CN111434688A (zh) * 2019-01-11 2020-07-21 上海开拓者生物医药有限公司 Cd73抗体及其制备方法和应用
TWI829857B (zh) 2019-01-29 2024-01-21 美商英塞特公司 作為a2a / a2b抑制劑之吡唑并吡啶及三唑并吡啶
CA3133078A1 (en) 2019-03-12 2020-09-17 Arcus Biosciences, Inc. Treatment of oncogene-driven cancers
CN113874397A (zh) 2019-03-29 2021-12-31 艾库斯生物科学有限公司 利用鉴定的腺苷指纹治疗癌症
CN119857140A (zh) * 2019-04-02 2025-04-22 免疫医疗有限责任公司 用于治疗肿瘤的抗-cd73、抗-pd-l1抗体和化疗
CN112111008B (zh) * 2019-06-19 2024-04-30 海正生物制药有限公司 抗cd73抗体及其应用
CN112300279A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 针对抗cd73抗体和变体的方法和组合物
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
WO2021032173A1 (en) * 2019-08-21 2021-02-25 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd. Anti-cd73 antibody and application thereof
EP4021489A4 (en) 2019-08-30 2023-10-11 F. Hoffmann-La Roche AG DEVELOPMENT OF AN EFFICIENT HYBRIDOMA PLATFORM FOR THE DISCOVERY OF THERAPEUTIC ANTIBODIES
US11634500B2 (en) 2019-09-06 2023-04-25 Les Laboratoires Servier Anti-CD73 antibodies and compositions
EP4031578A1 (en) 2019-09-18 2022-07-27 Novartis AG Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies
BR112022009317A2 (pt) * 2019-11-15 2022-08-09 Genzyme Corp Anticorpos de cd73 biparatópicos
KR20220137013A (ko) 2020-01-03 2022-10-11 인사이트 코포레이션 Cd73 억제제 및 a2a/a2b 아데노신 수용체 억제제 병용 요법
CN115135341A (zh) * 2020-01-03 2022-09-30 因赛特公司 抗cd73抗体及其用途
EP4132975A4 (en) * 2020-04-09 2024-10-23 Aprilbio Co., Ltd MONOCLONAL ANTIBODIES AND THEIR ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS FOR SUPPRESSING THE CD73 IMMUNE CHECKPOINT AND USES THEREOF
CN113527489B (zh) * 2020-04-22 2024-04-26 中山康方生物医药有限公司 抗cd73的抗体及其用途
KR20230004726A (ko) * 2020-04-22 2023-01-06 아케소 바이오파마, 인크. 항-cd73/항-pd-1 이중특이항체 및 이의 용도
CN115551888A (zh) * 2020-05-12 2022-12-30 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗cd73抗体及其用途
WO2021241729A1 (ja) 2020-05-29 2021-12-02 ブライトパス・バイオ株式会社 抗ｃｄ７３抗体およびその用途
WO2021247188A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Bristol-Myers Squibb Company Cd73 antagonist potency assay and methods of use thereof
CN111714642A (zh) * 2020-06-18 2020-09-29 复旦大学 Cd73抗体-药物偶联物的应用
JP2023532234A (ja) * 2020-06-22 2023-07-27 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド 抗ｃｄ７３抗体とその用途
AU2021306613A1 (en) 2020-07-07 2023-02-02 BioNTech SE Therapeutic RNA for HPV-positive cancer
CA3191745A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Akeso Biopharma, Inc. Anti-cd73 antibody and use thereof
WO2022083049A1 (zh) * 2020-10-19 2022-04-28 中山康方生物医药有限公司 抗cd73的抗体及其用途
IL302182A (en) * 2020-10-23 2023-06-01 Akeso Biopharma Inc Anti-CD73 antibody and its use
MX2023005353A (es) 2020-11-06 2023-05-22 Novartis Ag Moleculas de union a cd19 y usos de las mismas.
CN117285630A (zh) * 2020-11-09 2023-12-26 江苏中新医药有限公司 抗cd73单克隆抗体及其在制备肿瘤药物中的应用
JP2023554326A (ja) * 2020-12-11 2023-12-27 上海華奥泰生物藥業股▲フン▼有限公司 Ｃｄ７３の抗原結合蛋白及びその使用
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022147092A1 (en) * 2020-12-29 2022-07-07 Incyte Corporation Combination therapy comprising a2a/a2b inhibitors, pd-1/pd-l1 inhibitors, and anti-cd73 antibodies
CN113061177B (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 浙江大学 一种cd73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体的制备方法
CN113045659B (zh) * 2021-03-18 2022-03-18 上海近岸科技有限公司 抗cd73人源化抗体
GB202105110D0 (en) * 2021-04-09 2021-05-26 Cancer Research Tech Ltd Anti-CD73 antibodies
EP4349867A1 (en) * 2021-05-28 2024-04-10 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd Specific binding protein targeting pd-l1 and cd73
CA3225254A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023143227A1 (zh) 2022-01-25 2023-08-03 石药集团巨石生物制药有限公司 抗cd73抗体及应用
US12187806B2 (en) 2022-03-04 2025-01-07 Development Center For Biotechnology Anti-CD73 antibodies and use thereof
JP2025509563A (ja) * 2022-03-14 2025-04-11 上海華奥泰生物藥業股▲フン▼有限公司 抗体薬物複合体及びその使用
KR20250004779A (ko) 2022-04-13 2025-01-08 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Trop-2 발현 암을 치료하기 위한 병용 요법
US12487299B2 (en) 2022-06-20 2025-12-02 Shanghai United Imaging Healthcare Co., Ltd. Magnetic resonance imaging devices and radiation therapy systems including the magnetic resonance imaging devices
CN117304316A (zh) * 2022-06-22 2023-12-29 复旦大学 靶向cd73的纳米抗体及纳米抗体-药物偶联物、其制备方法和用途
CN116903744B (zh) * 2022-08-12 2024-03-08 南京蓬勃生物科技有限公司 抗cd73抗体或其抗原片段及其应用
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
EP4626552A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 MedImmune Limited Combination therapy for treatment of cancer comprising anti-pd-l1 and anti-cd73 antibodies
KR20250120305A (ko) 2022-12-14 2025-08-08 아스텔라스 파마 유럽 비.브이. Cldn18.2 및 cd3에 결합하는 2중 특이성 결합제와 면역 체크포인트 저해제를 수반한 조합 요법
WO2024232976A1 (en) * 2023-05-07 2024-11-14 Bioatla, Inc. Protein therapeutics for treatment of senescent cells
WO2024249954A1 (en) 2023-05-31 2024-12-05 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025076127A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025120866A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
WO2025120867A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and anti-vegfr2 antibodies
WO2025121445A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
US20250230168A1 (en) 2023-12-22 2025-07-17 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025162964A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of endometriosis
US20250302763A1 (en) 2024-02-22 2025-10-02 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025233264A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd73 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3590766C2 (sr) 1985-03-30 1991-01-10 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
IL100460A (en) 1990-12-20 1997-06-10 Ixsys Method for optimization of binding proteins and nucleic acids encoding a binding protein produced thereby
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6706484B1 (en) 1995-08-18 2004-03-16 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
US6331431B1 (en) 1995-11-28 2001-12-18 Ixsys, Inc. Vacuum device and method for isolating periplasmic fraction from cells
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DE60044997D1 (de) 1999-07-02 2010-11-04 Morphosys Ag Erzeugung spezifischer bindungspartner die an von genomischen dns-fragmenten oder ests kodierten (poly)peptiden binden
KR20020091170A (ko) * 2000-03-31 2002-12-05 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 림프종의 치료를 위한 항-사이토카인 항체 또는길항제 및 항-ｃｄ２０의 조합된 사용
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
CA2504818C (en) 2002-11-07 2013-04-23 Immunogen, Inc. Anti-cd33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
US7158164B2 (en) 2003-08-29 2007-01-02 Fuji Photo Film Co., Ltd. Thermal development method and apparatus
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
AU2005279347A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
WO2008007648A1 (fr) 2006-07-10 2008-01-17 Institute For Antibodies Co., Ltd. Procédé de classification d'antigène, procédé d'identification d'antigène, procédé d'obtention d' un ensemble d'antigènes ou d'anticorps, procédés de construction d'un panel d'anticorps, anticorps et ens
AU2007273055B2 (en) * 2006-07-14 2014-05-01 The Regents Of The University Of California Cancer biomarkers and methods of use thereof
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
WO2009092014A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Gagnon Peter S Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
PL2374883T3 (pl) * 2008-12-26 2017-05-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Przeciwciało anty-CD4
PT2504364T (pt) 2009-11-24 2017-11-14 Medimmune Ltd Agentes de ligação direcionados contra b7-h1
ES2609043T3 (es) 2009-11-30 2017-04-18 Janssen Biotech, Inc. Anticuerpos mutantes Fc con funciones de efecto abladas
BR112012024489A2 (pt) 2010-03-29 2016-05-31 Zymeworks Inc anticorpos com função efetora suprimida ou aumentada
ES2608475T3 (es) * 2010-04-13 2017-04-11 Celldex Therapeutics, Inc. Anticuerpos que se unen a cd27 humana y usos de los mismos
RU2604811C2 (ru) 2010-05-27 2016-12-10 Мерк Шарп Энд Домэ Корп. Способ получения антител с улучшенными свойствами
EP2537864B1 (en) 2011-06-24 2019-08-07 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Fc variants with reduced effector functions
SG10201707813YA (en) 2011-10-11 2017-11-29 Medimmune Llc Cd40l-specific tn3-derived scaffolds and methods of use thereof
WO2014153424A1 (en) 2013-03-19 2014-09-25 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Reducing diabetes in patients receiving hmg-coa reductase inhibitors (statins)
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
RU2746804C2 (ru) 2014-10-10 2021-04-21 Иннейт Фарма Блокада cd73
HRP20210888T4 (hr) * 2014-11-10 2024-12-06 Medimmune Limited Vezujuće molekule specifične za cd73 i njihova upotreba
LT3221363T (lt) 2014-11-21 2020-08-10 Bristol-Myers Squibb Company Antikūnai prieš cd73 ir jų panaudojimas
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201703332SA (en) 2017-05-30
SMT202100353T1 (it) 2021-07-12
RU2017117596A (ru) 2018-12-17
PL3218406T3 (pl) 2021-10-04
CN112778418B (zh) 2025-04-22
CA2967118A1 (en) 2016-05-19
AU2015345202B2 (en) 2021-05-13
JP2018501197A (ja) 2018-01-18
IL251891A0 (en) 2017-06-29
FI3218406T4 (fi) 2024-12-07
RS62003B1 (sr) 2021-07-30
US10556968B2 (en) 2020-02-11
EP3901176A1 (en) 2021-10-27
US20190292274A1 (en) 2019-09-26
CN107001472B (zh) 2020-12-11
KR102698502B1 (ko) 2024-08-26
HRP20210888T4 (hr) 2024-12-06
ES2877080T3 (es) 2021-11-16
DK3218406T3 (da) 2021-06-21
US9938356B2 (en) 2018-04-10
ES2877080T5 (en) 2025-02-27
HUE054339T2 (hu) 2021-08-30
WO2016075099A1 (en) 2016-05-19
MX2017005976A (es) 2017-06-29
SI3218406T1 (sl) 2021-08-31
LT3218406T (lt) 2021-06-25
IL251891B (en) 2021-03-25
NZ731332A (en) 2024-11-29
US11525012B2 (en) 2022-12-13
JP7069261B2 (ja) 2022-05-17
US20160194407A1 (en) 2016-07-07
CN107001472A (zh) 2017-08-01
KR102781223B1 (ko) 2025-03-12
KR20240130830A (ko) 2024-08-29
US20230340152A1 (en) 2023-10-26
CL2020003409A1 (es) 2021-07-02
HRP20210888T1 (hr) 2021-07-23
PT3218406T (pt) 2021-06-17
US10287362B2 (en) 2019-05-14
JP2022115962A (ja) 2022-08-09
GB2537445A (en) 2016-10-19
PL3218406T5 (pl) 2025-01-27
EP3218406B2 (en) 2024-10-02
CY1124791T1 (el) 2022-11-25
MX385320B (es) 2025-03-18
US20200079877A1 (en) 2020-03-12
RU2017117596A3 (sr) 2019-06-17
CN112778418A (zh) 2021-05-11
GB201519761D0 (en) 2015-12-23
MY191423A (en) 2022-06-27
CL2017001154A1 (es) 2018-01-12
JP6755866B2 (ja) 2020-09-16
EP3218406B1 (en) 2021-03-24
DK3218406T4 (da) 2024-12-09
JP2020195394A (ja) 2020-12-10
EP3218406A1 (en) 2017-09-20
KR20170080607A (ko) 2017-07-10
US20180194858A1 (en) 2018-07-12
AU2015345202A1 (en) 2017-05-18
TWI710576B (zh) 2020-11-21
RU2730665C2 (ru) 2020-08-24
JP2024109819A (ja) 2024-08-14
SI3218406T2 (sl) 2025-05-30
KR20250037600A (ko) 2025-03-17
TW201632555A (zh) 2016-09-16
BR112017009398A2 (pt) 2018-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230340152A1 (en) Binding molecules specific for cd73 and uses thereof
US10864269B2 (en) Therapeutic combinations comprising anti-CD73 antibodies and uses thereof
HK40062540A (en) Binding molecules specific for cd73 and uses thereof
HK40047499A (en) Therapeutic combinations comprising anti-cd73 antibodies and a2a receptor inhibitor and uses thereof
HK1242710A1 (en) Binding molecules specific for cd73 and uses thereof
HK1242710B (en) Binding molecules specific for cd73 and uses thereof
BR122024010856A2 (pt) Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígenos que se liga especificamente a cd73, e formulação farmacêutica
BR112017009398B1 (pt) Anticorpo isolado que se liga especificamente a cd73, e seu uso