RS51402B - Imunostimulatorne kombinacije za profilaksu i lečenje hepatitisa c - Google Patents

Imunostimulatorne kombinacije za profilaksu i lečenje hepatitisa c

Info

Publication number
RS51402B
RS51402B RSP-2010/0373A RSP20100373A RS51402B RS 51402 B RS51402 B RS 51402B RS P20100373 A RSP20100373 A RS P20100373A RS 51402 B RS51402 B RS 51402B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
combination according
immunostimulatory combination
protein
cells
hepatitis
Prior art date
Application number
RSP-2010/0373A
Other languages
English (en)
Inventor
Aintzane Zabaleta Azpiroz
Francisco Borras Cuesta
Pablo Sarobe Ugarriza
Juan José LASARTE SAGASTIBELZA
Jesús PRIETO VALTUEÑA
Original Assignee
Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from ES200601563A external-priority patent/ES2334472B1/es
Application filed by Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. filed Critical Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
Publication of RS51402B publication Critical patent/RS51402B/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Imunostimulatorna kombinacija za profilaksu i lečenje hepatitisa C, naznačena time štosadrži:a) Poli(I:C) koji deluje kao agonist TLR3,b) agonist CD40 ili sekvenca DNK koja ga kodira, ic) polipeptid, koji sadrži NS3 protein virusa hepatitisa C, ili fragment navedenog NS3 proteina sa kapacitetom za indukciju CD8+ i CD4+ odgovora.Prijava sadrži još 17 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na imunostimulatomu kombinaciju za profilaksu i lečenje hepatitisa C, koji uključuje NS3 protein iz HCV, zajedno sa adjuvantima izabranim na osnovu njihovog kapaciteta da indukuju specifične potentne i dugotrajne CD8+ i CD4+ odgovore na HCV virus.
STANJE TEHNIKE
[0002]Sa procenjenim brojem inficiranih ljudi u svetu od preko 170 miliona, infekcija virusom hepatitisa C (HCV) danas predstavlja veliki teret za zdravstvo. Ovo je takođe broj inficiranih koji će verovatno ostati nepromenjen tokom sledećih godina.
[0003]Infekciju HCV karakteriše visoka tendencija prema kroničnom oboljenju. HCV opstaje kod 70% inficiranih, od kojih se kod 20% razvija ciroza i kod 2.5% razvija se do kancera jetre.
[0004]Sadašnje referentno terapeutsko sredstvo predstavljaju terapeutski protokoli zasnovani na primeni interferona. Ipak, ove antivirusne terapije su skupe, relativno toksične i efikasne kod samo 50-60% tretiranih pacijenata. Prema tome, neophodno je i poželjno razviti nove terapeutske strategije koje su efikasnije i koje pacijenti bolje podnose.
[0005]Ažurirani prikaz HCV može se naći u Nature ("Insights: Hepatitis C". Nature 2005, Supplements; Vol. 436, Nr. 7053, pp 929-978).
[0006]Iako, nažalost, još uvek nemamo efikasnu vakcinu protiv virusa hepatitisa C, postoje eksperimentalni podaci i dokazi koji navode na zaključak daje efikasna vakcina moguća. Iako se antivirusna antitela sintetišu kao odgovor na infekciju, kronično stanje karakteriše odsustvo ćelijskog imunog odgovora porekom od citotoksičnih T-ćelija (CD8+) i pomoćnih T-ćelija (CD4+). Prema tome, pretpostavlja se daje HCV razvio strategije koje mu omogućavaju da specifično izbegne antivirusne imune odgovore, pri čemu snaga i kvalitet citotoksičnih T i pomoćnih T odgovora određuju da li će se pacijenti oporaviti (spontano ili kao odgovor na tretman) ili da li će oni razviti hroničnu infekciju.
[0007] Glavni cilj svake vakcine je da stimuliše stečeni imunitet specifičan za antigen, čiji su medijatori B i T-limfociti. U ovom kontekstu, antigen prikazujuće ćelije (APC) imaju važnu ulogu u započinjanju specifičnih imunih odgovora i naročito u aktivaciji T-limfocita. APC, uglavnom dendritske ćelije, hvataju antigene na perifernim organima i, posle primanja aktivacionog stimulusa, migiraju ka limfatičkim organima. Tamo, dendritske ćelije prikazuju na svojoj površini, spojene sa stvarnim molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti MHC, peptidne proizvode poreklom od razgradnje antigena (epitopa), i oni istovremeno proizvode himokine i citokine u cilju privlačenja i aktiviranja T-ćelija. Aktivacioni proces dendritskih ćelija, takođe poznat kao sazrevanje, karakteriše visoka ekspresija MHC molekula (signal 1), ko-stimulatornih molekula (signal 2) i polarizator citokina kao što je interleukin-12 (IL-12) (signal 3). Sazrevanje je indukovano faktorima kao što su komponente patogena ili molekuli domaćina koji su česti u inflamaciji ili procesima ćelijskog oštećenja. Ovi faktori deluju na dendritske ćelije preko specifičnih receptora za proizvode poreklom od mikroorganizama, kao što su receptori TLR tipa (Toll-slični receptori), receptori za citokine (TNF-a, IL-1, IFN-a) ili receptori za Ugande na ćelijskim površinama (npr., CD40).
[0008] Stimulacija i aktivacija različitih populacija T-ćelija od strane APC ograničena je tipom MHC molekula sa jedne strane, i, sa druge strane, karakteristikama epitopa koji formiraju komplekse sa tim MHC molekulima. Tako, na primer, identifikovani su određeni fragmenti virusnih proteina koji specifično indukuju akitvaciju citotoksičnih CD8+ T-limfocita (CTL), koji su poznati kao epitopi limfocita ili epitopi CD8+ T-ćelija ili CD8+ epitopi; ili epitopi koji specifično indukuju aktivaciju CD4+ pomoćnih T-limfocita (HTL), CD4+ epitopa. Baza podataka "HCV Immunology Database"
(http://hcv.lanl.gov/content/immmo/immuno-mam.html) sakuplja epitope za T-limfocite, kako CD8+ CTL tako i CD4+ HTL, identifikovane na osnovu virusnih proteina različitih sojeva i izolata virusa hepatitisa C.
[0009] Razvoj imunizacionih protokola na bazi upotrebe epitopa u obliku peptida prema tome zahteva prethodan izbor onih peptida koji su pogodni za svaku osobu, u zavisnosti od MHC molekula koje oni prikazuju. Ovo ukazuje na to da, u zavisnosti od MHC svake osobe, određena kombinacija peptida bi se izabrala koja bi mogla da se ponaša kao epitopi u tom kontekstu. Upotreba velikih antigena omogućava prevazilaženje ovog problema, s obzirom na to da su normalno poliepitopni i unutar njihove sekvence prikazuju različite epitope, kako za CD8+ CTL tako i za CD4+ HTL, koji mogu biti prikazani od strane MHC molekula različitih osoba. Na ovaj način, jedan antigen se može koristiti kao vakcina kod osoba sa različitim
MHC.
[0010]Unutar različitih proteina HCV, jezgro i NS3 predstavljaju veliku imunogenost i u onim osobama koje prevaziđu infekciju, protiv njih su detektovani snažni CD8+ CTL i CD4+ HTL odgovori. Međutim, postoje podaci koji pokazuju da jezgro takođe može imati štetne efekte za ćelije imunog sistema, kada je ono u kontaktu sa njima, što ih čini nepreporučljivim kao antigena u strategijama vakcinacije. Sa druge strane, NS3 je protein koji je retko pokazivao ovaj tip efekta i mogao bi biti dobar kandidat kao antigen za indukciju CD8+ CTL i CD4+ HTL odgovora.
[0011]U tom smislu, WO 2002/014362 A2 daje korišćenje HCV NS3 proteina kao antigena u proizvodnji vakcina za profilaksu i lečenje HCV infekcija. NS3 može biti zajedno sa adjuvantom ribavirinom, koji može biti u istoj ili različitoj farmaceutskoj kompoziciji. Dodatno, primena adjuvanta može biti istovremena sa antigenom ili može biti u različito vreme. Ovaj dokument, međutim, ne pokazuje da ribavirin pojačava CD8 imuni odgovor na NS3.
[0012]CD4+ HTL ima ulogu u stečenom imunitetu, između ostalog putem APC aktivacije, CTL aktivacije i indukcije memorije. Naročito, opisano je da su CD4+ ćelije specifične za HCV neophodne za održavanje antivirusnog CTL (Grakoui A. et al., "HCV persistence and imrnune evasion in the absence of memorv T-cell help"; Science, 2003; 302: 659-662). Stoga, efikasna vakcina protiv virusa hepatitisa C treba da obezbedi maksimalnu snagu u smislu indukcije ne samo CD8+ CTL odgovora, već takođe i CD4+ HTL odgovora. Takva vakcina bi stoga zahtevala selekciju specifičnih antigena koji bi obezbedili ove odgovore.
[0013]Ipak, izgleda da sama kombinacija antigena nije sposobna da obezbedi efikasnu vakcinu protiv HCV. Uzimajući u obzir da je sazrevanje dendritskih ćelija neophodno za efikasnu inicijaciju i aktivaciju T-limfocita, takva vakcina bi mogla imati koristi od uključivanja nekih adjuvanata u imunostimulatornu kombinaciju, a koji bi stimulisali sazrevanje dendritskih ćelija. Kao adjuvanti mogli bi biti korisni ligandi TLR receptora, citokinski receptori, ili receptori za intracelularne ligande koji su već navedeni, ili još bolje sinergistička kombinacija tih adjuvanata.
[0014]Tako, na primer, Rouas et al. (International Immunology, May 2004, 16(5): 767-773) dajuin vitrokorišćenje CD40L, IFN-y i poli(I:C), sintetičkog liganda TLR3, u farmaceutskoj kompoziciji za proizvodnju zrelih dendritskih ćelija. Pokazano je da su dendritske ćelije koje su sazrevale sa poli(I:C) jedine koje izlučuju IL-12p70 nakon stimulacije sa CD40L, što se ne dešava nakon sazrevanja sa IFN-y. Takođe je dato sazrevanje dendritskih ćelija kada su inkubirane i sa CD40L i sa poly(I:C). Zrele dendritske ćelije su veoma važne u imunom odgovoru, jer IL-12, koji izlučuju ove ćelije, aktivira i Thl limfocite i citotoksične T limfocite.
[0015]Dodatno, US2004/0141950 opisuje imunostimulatorne kombinacije koje uključuju TLR antagonist i antagonist molekula iz superfamilija faktora nekroze tumora (TNF) ili njihovih receptora (TNFR), koji takođe mogu uključivati antigen. Među brojnim mogućim kombinacijama data je i kombinacija liganda CD40 (anti-CD40 antitelo) i od poli(I:C), kombinacija za koju je sinergistički efekat pokazan u ekspanziji CD8+ T-limfocita. Slično tome, Ahonen et al. (J. Exp. Med. 2004; 199: 775-784) daju podatke o sinergističkom kapacitetu TLR/CD40 agonista za indukciju ekspanzije i diferencijacije antigen specifičnih D8+ CTL na način koji je nezavisan od CD4+ T-limfocita. Iako ovi radovi opisuju kapacitet TLR/CD40 za aktivaciju CD8+ T-limfocita iz antigen specifične memorije, pomenuti radovi ne dozvoljavaju da se ustanovi da li kombinacija TLR/CD40 agonista može takođe pojačati CD4+ HTL odgovore.
[0016]U slučaju infekcije sa HCV, jasne razlike su nađene u CD4+ HTL odgovorima kada su inficirani pacijenti upoređivani sa pacijentima koji su bili u stanju da eliminišu infekciju. Ipak, iako sa manjim intenzitetom nego kod izlečenih pacijenata, CD8+ CTL odgovori su još uvek detektabilni kod inficiranih pacijenata. Stoga, iako se CTL ponaša kao važna efektorna populacija u čišćenju HCV infekcije, CD4+ ćelije takođe igraju važnu ulogu u kontroli bolesti. Dodatno, opisano je da je indukcija CD4+ T-limfocita važna za održavanje antivirusnih CTL odgovora (Grakoui A. et al., "HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T-cell help"; Science, 2003; 302: 659-662). Ovi podaci sugerišu da je indukcija potentih i dugotrajnih antivirusnih odgovora, i CD8+ i CD4+, važna za vakcinaciju i terapiju virusnih bolesti izazvanih sa HCV.
[0017]Stoga je cilj ovog pronalaska selekcija imunostimulatornih kombinacija antigena i adjuvanata pogodnih za profilaksu i lečenje hepatitisa C, koje bi obezbedile stimulaciju i CD8+ i CD4+ odgovora koji su potentniji, kompletniji i dugotrajniji.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0018]Prvi cilj pronalaska odnosi se na imunostimulatornu kombinaciju za profilaksu i lečenje hepatitisa C, nadalje označeno kao inventivna imunostimulatorna kombinacija, koja sadrži TLR3 agonist, CD40 agonist ili DNK sekvencu koja ga kodira, i polipeptid koji sadrži NS3 protein virusa hepatitisa C, ili fragment pomenutog NS3 proteina sa sposobnošću da indukuje CD8+ i CD4+ odgovore.
[0019]"TLR3 agonist" odnosi se na ligand koji može biti kombinovan ili vezan za TLR3 receptore ("Toll-slični receptor 3") i proizvodi ćelijski odgovor. TLR3 je receptor za dvolančanu RNK koja prenosi signale koji aktiviraju NF-kB i proizvodnju interferona (IFN) tipa I (IFN-a i IFN-(i) i koji stimulišu sazrevanje dendritskih ćelija. Miševi bez TLR3 ekspresije pokazali su smanjen odgovor na poli(I:C) - TLR3 ligand sličan dvolančanoj RNK stvorenoj tokom replikacije virusa HCV tipa, zajedno sa otpornošću na letalni efekat poli(I:C) kada je osetljivost povećana sa D-galaktozaminom i smanjenjem proizvodnje inflamatornih citokina (Alexopoulou et al. Nature, 2001, Vol. 413, pp. 732-738). U naročitoj varijanti pronalaska, pomenuti ligand TLR3 može biti virusna dvolančana RNK ili dvostruki lanac poliinozinske-policitidinske kiseline, poli(I:C).
[0020]"CD40 agonist" odnosi se na ligand, koji se može kombinovati ili vezati za CD40 receptore uz indukciju ćelijskog odgovora. CD40 je molekul koji je eksprimiran u membranama različitih tipova ćelija, kao što su B-limfociti ili antigen prikazujuće ćelije (makrofagi, dendritske ćelije, itd.). Prirodni ligand CD40 (CD40L ili CD154) je uglavnom eksprimiran u T-limfocitima koji su aktivirani nakon prepoznavanja antigena. Interakcija CD40L sa CD40 koja se javlja u ćelijama koje prikazuju antigene indukuje sazrevanje poslednje pomenutih. Ovaj fenomen, na određen način sličan stimulusu koji dolazi od patogena, uzrokuje da antigen prikazujuće ćelije imaju veći kapacitet za indukovanje imunih odgovora. Prema tome, CD40 agonist inventivne imunostimulatorne kompozicije se odnosi sa jedne strane na CD40L ligand ili na fragment onog CD40L koji zadržava sposobnost za vezivanje sa CD40 i indukciju ćelijskog ili imunog odgovora. U naročitoj varijanti, ligand može biti antitelo specifično za CD40 (anti-CD40) ili njegov fragment koji zadržava sposobnost vezivanja za CD40. Dodatno, CD40 ligand ili njegov fragment može biti prisutan u imunostimulatornoj kombinaciji bilo u formi proteina ili takođe kao rekombinantna nukleinska kiselina (DNK) koja kodira taj ligand, na primer u virusnom vektoru za trasfer ili gensku terapiju.
[0021]"Antigen" se odnosi na bilo koju supstancu koja je sposobna da indukuje imuni odgovor, i humoralni i ćelijski, u organizmu individue (čovek ili životinja), ili koja može indukovati ćelijski imuni odgovor (ekspanziju, aktivaciju i/ili sazrevanje imunih ćelija, proizvodnju citokina, ili antitela) kada dođe u kontakt sa ćelijama imunog sistema. Naročito, antigen može biti virusni protein, peptid ili fragment pomenutog virusnog proteina, rekombinantni protein takvih virusnih proteina ili čak sintetički peptid sposoban da indukuje signalizovane odgovore.
[0022] "CD8+ indukujući epitop" odnosi se na fragment ili delimični polipeptidni lanac antigena koji je sposoban da specifično indukuje aktivaciju CD8+ citotoksičnih T-limfocita (CTL). "CD4+ indukujući epitop" odnosi se na fragment ili delimični polipeptidni lanac antigena koji je sposoban da specifično indukuje aktivaciju CD4+ pomoćnih T-limfocita
(HTL).
[0023] "NS3 protein" odnosi se na ne-strukurni protein NS3 virusa hepatitisa C, protein od 67 kDa koji uključuje 2 domena, serin-proteinazu koja pokriva 189 aminokiselina N-terminalnog kraja i domen sa helikaza-nukleozidtrifosfatnom aktivnošću koji pokriva 442 aminokiseline C-terminalnog kraja. Sekvenca NS3 proteina koja je uključena u polipeptid inventivne imunostimulatorne kombinacije može odgovarati bilo kojem soju ili izolatu virusa hepatitisa C, naročito bilo kojem soju ili izolatu virusa humanog hepatitisa C. U naročitoj varijanti, polipeptid, koji obuhvata NS3 protein, dobijen je rekombinantnom tehnologijom. U specifičnoj neograničavajućoj varijanti pronalaska, rekombinantni NS3 protein je korišćen sa sekvencom SEQ ID. NO: 1 (odgovaraju Genebank pristupnim brojevima DQ068198.1 i AAY84763.1, VRL 28-NOV-2005). Takođe smo koristili drugi rekombinantni protein sekvence SEQ ID. NO: 2 (odgovara Genebank pristupnom broju D90208).
[0024] U sledećoj alternativnoj varijanti pronalaska, moguće je takođe koristiti polipeptid, koji obuhvata fragment proteina NS3, na takav način da je pomenuti fragment sposoban da indukuje CD4+ i CD8+ odgovore. Stoga, pomenuti fragment treba da uključi najmanje jedan CD8+ indukujući epitop ijedan CD4+ indukujući epitop.
[0025] U specifičnoj varijanti, inventivna imunostimulatorna kombinacija obuhvata poli(I:C), anti-CD40 antitelo, i polipeptid koji sadrži NS3 protein.
[0026] U poželjnoj varijanti pronalaska, imunostimulatorna kombinacija poseduje sve komponente koje formiraju deo iste farmaceutske kompozicije, gde je svaka od komponenti prisutna u farmaceutski prihvatljivim količinama. Dodatno, pronalazak se takođe odnosi na pomenutu farmaceutsku kompoziciju.
[0027] U sledećoj specifičnoj varijanti ovog pronalaska, komponente imunostimulatorne kombinacije formiraju deo najmanje dve farmaceutske kompozicije. Slično tome, pronalazak se odnosi na upotrebu pomenute imunostimulatorne kombinacije naznačenu time što se pomenute farmaceutske kompozicije primenjuju istovremeno. U sledećoj varijanti pronalaska, upotreba pomenute imunostimulatorne kombinacije je naznačena time što su pomenute farmaceutske kompozicije primenjene u različitom trenutku, preko istog puta primene ili različitim putem. Stoga, jedna specifična varijanta pronalaska se odnosi na komplet za primenu prethodno opisane imunostimulatorne kombinacije, naznačen time što obuhvata najmanje dve različite farmaceutske kompozicije.
[0028] U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju imunog odgovora na virus hepatitisa C naznačen time što se sastoji od primene prethodno definisane stimulatome kombinacije, u efikasnoj količini za indukciju imunog odgovora. U poželjnoj varijanti, postupak pronalaska se sastoji iz profilaktičkog tretmana. U poželjnijoj varijanti, postupak pronalaska sastoji se od terapeutskog tretmana.
[0029] Konačno, pronalazak se takođe odnosi na vakcinu protiv virusa hepatitisa C, naznačenu time što obuhvata prethodno definisanu imunostimulatornu kombinaciju i tako ostvaruje cilj ovog pronalaska.
KRATAK OPIS SLIKA
[0030] Slika 1. Imunizacija sa anti-CD40 i poli(I:C) zajedno sa NS3 proteinom indukuje multi epitopske CD4+ i CD8+ T odgovore. HHD miševima (dva po grupi) injekcijom je ubrizgano 50 g anti-CD40 (i.p.). Četiri sata kasnije, injekcijom je ubrizgano 50 g poli(I:C) (i.v.) i 500 g rekombinantnog NS3 proteina (i.p.) (SEQ. ID. NO: 1). Šest dana kasnije, životinje su ubijene i splenocite su ekstrahovane zain vitrostimulaciju sa različitim antigenima i analizu indukovanih imunih odgovora. (A) Ćelije su stimulisane pet dana sa epitopima CD8+ 1073, 1406 ili 1038 (10 uM) u prisustvu IL-2. Nakon toga, za svaku grupu splenocita, litički odgovor je meren za ciljne ćelije koje su napunjene (peptid; cme trake) ili ne (kontrola; bele trake) sa odgovarajućim peptidom. Dobijeni rezultati pokazani su sa efektorna:ciljna ćelija odnosom od 100:1. (B) Na isti način, splenocite su kultivisane sa različitim koncentracijama (0.1-10 uM) peptida 1073 (crni krugovi), 1406 (beli trouglovi) ili 1038 (crni trouglovi), i u supernatantima kulture koji su dobijeni nakon 48 časova od stimulacije sa IFN-y sadržaj je meren pomoću ELISA. (C) Splenocite su takođe stimulisane 48 časova sa 5 ili 1 ug/ml NS3 proteina korišćenog u imunizaciji (SEQ. ID. NO: 1), sa 1 ug/ml NS3 proteina proizvedenog u bakteriji (SEQ. ID. NO: 3), ili sa podlogom za kulturu (kontrola) da bi se izmerio CD4+ odgovor. Nakon ovog vremena supernatanti su sakupljeni i količina proizvedenog IFN-y merena je pomoću ELISA. Slika 2. Merenje količine NS3 proteina koja je neophodna za indukciju CD4+ i CD8+ T odgovora kod imunizacije sa poli(LC) i anti-CD40. HHD miševi (dva po grupi) imunizovani su sa NS3 proteinom (SEQ. ID. NO: 1) (500, 250, 125 ili 25 ug/mišu) zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40, prateći protokol opisan na Slici 1. Takođe je bila uključena i kontrolna grupa imunizovana na isti način, za koju je kao antigen korišćeno 5 ug NS3 (SEQ. ID. NO: 1) i 50 ug peptida 1073 i 1038, zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40. Šest dana kasnije životinje su ubijene i splenocite su ekstrahovane i stimulisane sa različitim antigenima (A). Da bi se izmerio indukovani litički odgovor ćelije su stimulisane pet dana sa epitopom CD8+ 1073 (10 uM) i IL-2. Nakon toga, taj odgovor je meren ukrštanjem različitih količina efktornih ćelija sa fiksnim brojem ciljnih ćelija napunjenih peptidom. Dodatno, CD8+ odgovor koji je indukovan takođe je analiziran pomoću proizvodnje IFN-y. Da bi se to postiglo, ćelije su stimulisane sa različitim koncentracijma peptida 1073 (B) i 1038 (C). Ćelije su takođe stimulisane sa NS3 proteinom (SEQ. ID. NO: 1) (D), da bi se kvantitativno odredio CD4+ odgovor. Nakon 48 časova, merena je količina IFN-y prisutna u supernatantima. Slika 3. Imunizacija sa poli(LC) i anti-CD40 zajedno sa NS3 proteinom indukuje CD4+ i CD8+ odgovore u drugim sojevima miševa sa različitim MHC. C57BL6 miševi (koji imaju MHC molekule tipa H-2b) (dva po grupi) primili su jednu (beli kvadrati) ili dve (crni kvadrati) imunizacije sa 100 ug NS3 (SEQ. ID.NO: 1) zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40, prateći protokol naznačen na Slici 1. Šest dana kasnije, životinje su ubijene i splenocite su kultivisane sa različitim antigenima da bi se izmerili indukovani CD8+ i CD4+ odgovori. Restrikcioni epitop H-2 Db 1629-1637 (GAVONEVTL) (SEQ. ID. NO: 7) korišćenje za stimulaciju splenocita i merenje CD8+ odgovora (A). NS3 protein (SEQ. ID. NO: 1) (B) korišćen je kao stimulus za određivanje CD4+ odgovora. Nakon dva dana u kulturi, supernatanti su sakupljeni i merena je količina proizvedenog IFN-y. Slika 4. Imunizacija sa NS3 proteinom zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40 indukuje CD8+ odgovore sposobne da prepoznaju ćelije koje eksprimiraju HCV proteine. (A) HHD miševima (dva po grupi) injekcijom je ubrizgano 100 ug NS3 proteina (SEQ. ID. NO: 2) plus poli(I:C) i anti-CD40 kao što je naznačeno na Slici 1. Šest dana kasnije, životinje su ubijene i njihove splenocite su stimulisane sa Tl/HCVcon ćelijama (TI ćelije transficirane sa plazmidom koji eksprimira HCV proteine) tretiranim mitomicinom, u prisustvu IL-2. Nakon pet dana stimulacije, merena je sposobnost splenocita da prepoznaju Tl/HCVcon ćelije pomoću testa litičke aktivnosti. Da bi se ovo postiglo, različite količine splenocita konfrontirane su sa fiksnim brojem Tl/HCVcon ćelija (crni krugovi) ili TI kontrolnih ćelija koje nisu transficirane (beli krugovi).
Slika 5. Imunizacija sa poli(I:C) i anti-CD40 zajedno sa NS3 proteinom indukuje dugotrajne T CD4+ and CD8+ odgovore. HHD miševima (dva po grupi) injekcijom je ubrizgano 100 ug
NS3 proteina (SEQ. ID. NO: 2) plus poli(I:C) i anti-CD40 kao što je naznačeno na Slici 1. Dve nedelje kasnije, životinje su imunizovane drugi put pod istim uslovima. Šezdeset dana nakon druge imunizacije životinje su ubijene i splenocite su ekstrahovane za proučavanje dugotrajnog CD8+ i CD4+ T odgovora. (A) Splenocite su stimulisane sa epitopom CD8+ 1073 (10 uM) ili u odsustvu antigena, i 48 časova kasnije supernatanti kulture sakupljeni su za merenje količine proizvedenog IFN-y. (B) Splenocite su kultivisane pet dana sa peptidom 1073 (10 uM) i IL-2, nakon čega je proučavana njihova sposobnost da liziraju ciljne ćelije napunjene peptidom 1073. Da bi se to postiglo, različite količine efektomih ćelija konfrontirane su sa fiksnim brojem ciljnih ćelija napunjenih peptidom 1073 (crni krugovi) ili bez punjenja peptidom (beli krugovi). (C) CD4+ odgovor je proučavan pomoću stimulacije splenocita sa NS3 proteinom (1 pg/ml) (SEQ. ID. NO: 2) ili u odsustvu antigena. Nakon 48 časova, supernatanti su sakupljeni i merena je količina proizvedenog IFN-y.
VARIJANTA PRONALASKA
[0031]Sledeći primeri, koji nikako nisu ograničavajući, imaju za cilj da ilustruju varijantu pronalaska koja formira predstavljenu patentnu prijavu.
MATERIJAL I METODE
Epitopi, antigeni i reagensi
[0032]Korišćeni peptidi ili epitopi sintetisani su manuelno u uređaju za sintezu većeg broja peptida primenom Fmoc hernije (Wellings DA. and Atherton E. Methods Enzvmol 1997; 289: 44-67). Kaiser ninhidrinski test je korišćen za praćenje svakog koraka. Na kraju sinteze oni su splajsovani i deprotektovani sa trifluorosirćetnom kiselinom i isprani dietil etrom. Čistoća peptida bila je svaki put veća od 90% što je određeno pomoću HPLC.
[0033]Numeracija peptida ili epitopa odnosi se na njegov relativni HCVH položaj, uzimajući kao referentnu kompletnu sekvencu u H soju humanog hepatitisa C koji se obično uzima kao prototip (GeneBank pristupni broj M67463). Tako, na primer, baza podataka "HCV Immunologv Database" (http://hcvJanl.gov/content/immuno/immunomain.html) sakuplja epitope za T-limfocite, kako citotoksične T-limfocite tako i pomoćne T-limfocite, identifikovane u virusnim proteinima različitih sojeva i izolata virusa hepatitisa C, pri čemu su svi oni uređeni u skladu sa njihovim relativnim položajem u vezi sa H sojem virusa prema navedenoj referenci GeneBank.
[0034]Kao imunogen, korišćenje rekombinantni polipeptid od 655 aminokiselina koji sadrži kompletnu sekvencu NS3 proteina (SEQ. ID. NO: 1; Genebank pristupni broj AAY84763.1, VRL 28-NOV-2005; 631 aminokiseline). Kao i 631 aminokiselina NS3 proteina, polipeptid takođe obuhvata rep sa c-myc sekvencom, za detekciju sa monoklonalnim antitelom anti-myc, i rep od histidina. Protein je proizveden uPichia pastoris.Održavanje u suspenziji u rastvoru Tris 22.5 raM / Urea 3.76 M / NaCl 300 mM. Protein je prečišćen pomoću hromatografije na Ni koloni.
[0035]Sledeći rekombinantni polipeptid takođe je korišćen kao imunogen, koji sadrži 635 aminokiselina koje sadrže kompletnu sekvencu NS3 proteina (SEQ. ID. NO: 2; Genebank pristupni broj D90208). Kao i aminokiseline koje odgovaraju NS3, poliprotein takođe obuhvata rep od histidina za svoje prečišćavanje. DNK sekvenca koja odgovara NS3 dobijena je razgradnjom sa Sal I i Not I plazmida gWIZ, koji je sadržao NS3 sekvencu (nabavljen od Dr. G. Inchauspe, Lyon, France). Proizvod razgradnje kloniranje između mesta BsrG I i Not I plazmida pET-45 (+) (Novagen, Madison WI). On je eksprimiran sa E. coli i prečišćen pomoću afinitetne hromatografije na nikl koloni, a zatim jono-izmenjivačkom hromatografij om.
[0036]Slično tome, zain vitrotestove rekombinantni polipeptid (Mikrogen; kataloški broj 94302) korišćen je kao antigen, koji sadrži poslednjih 20 aminokiselina ne-strukturnog proteina NS2 i prvih 508 aminokiselina NS3 proteina HVC (SEQ. ID. NO: 3).
[0037]Kao agonist TLR3, korišćen je poli(I:C) dobijen iz Amersham (kataloški broj 27-4732-01).
[0038]Kao agonist CD40, korišćena su anti-CD40 antitela, prečišćena počevši od hibridoma FGK-45 (Rolink A. et al., Immunity 1996. 5: 319-330).
[0039]Svi reagensi su sadržali <1 jedinice endotoksina po mg proizvoda, što je određeno pomoću testa lizata QCL-1000 amoebocvte limulus (Bio Whittaker).
Miševi
[0040]C57B1/6 miševi starosti od šest do osam nedelja dobijeni su iz Harlan. HHD miševi su takođe korišćeni, transgeni za humane molekule HLA-A2.1 (Pascolo S. et al., J. Exp. Med. 1997. 185: 2043-2051). Sve životinje su održavane pod uslovima bez patogena i tretirane u skladu sa pravilima ustanove.
Celijske linije
[0041]T2 ćelije su korišćene (Šalter R. et al. Immunogenetics, 1985 21: 235-246) kao ciljne ćelije za testove oslobađanja hroma sa citotoksičnim T-limfocitima (CTL) poreklom od HHD miševa.
[0042]TI ćelije su korišćene, transficirane sa plazmidom nosačem kodirajućeg regiona HCV (Tl/HCVcon ćelije), za testove prepoznavanja ćelija koje eksprimiraju proteine HCV. Ove ćelije je obezbedio Dr. D. Moradpour (Freiburg, Germanv; Volk B. et al., J Gen Virol. 2005; 86: 1737-1746). TI ćelije bez transfekcije (ATCC, kataloški br. CRL-1991) takođe su korišćene kao kontrola.
[0043]Sve ćelije su gajene na kompletnoj podlozi (RPMI 1640 10% fetusnog goveđeg seruma, 100 U/ml penicilina, 100 ug/ml streptomicina, 2 mM glutamina i 50 uM 2-merkaptoetanola). Kultura linije Tl/HCVcon takođe je sadržala 2 mg/ml G418 (Gibco).
Imunizacija
[0044]Grupe od dva miša imunizovane su i.p. primenom 50 ug anti-CD40. Četiri časa kasnije, njima je injektirano 50 ug poli(I:C) (i.v.) i različite količine antigena: NS3 protein ili smeše NS3 sa peptidima (i.p.).
Stimulacija ćelija slezine za proizvodnju citokina
[0045]Ćelije slezine su resuspendovane u kompletnoj podlozi i postavljene u količini od 8 x 10<5>ćelija/komorici u 0.2 ml na 96~komorne ploče sa dnom u obliku slova U, u odsustvu ili prisustvu peptida ili rekombinantnog NS3 proteina HCV.
[0046]Nakon dva dana, supernatanti su sakupljeni za merenje prisustva IFN-y pomoću ELISA (BD-Pharmingen), prateći uputstva proizvođača.
Merenje litičke aktivnosti CTL
[0047] Da bi se izmerili CTL odgovori, splenociti poreklom iz imunizovanih životinja inkubirani su sa peptidima (10 uM) 2 časa na 37 °C, dva puta isprani i kultivisani na 24-komornim pločama sa konfluentnošću od 7.5 x 106 ćelija/komori. U eksperimentima izvedenim za merenje prepoznavanja Tl/HCVcon ćelija, 7.5 x 106 splenocita iz HHD miševa je kultivisano sa 7.5 x 105 Tl/HCVcon ćelija prethodno tretiranih sa Mitomvcin C (Sigma). U svim slučajevima, dva dana kasnije, 2.5 U/ml IL-2 (Boehringer-Mannheim GmbH, Germanv) dodato je u komore i pet dana kasnije ćelije su rekuperovane da bi se izveo test oslobađanja hroma.
[0048] Litička aktivnost je merena inkubiranjem različitih količina efektornih ćelija u trajanju od 4 časa sa 3000 T2 ciljnih ćelija prethodno napunjenih sa 51 Cr, sa ili bez peptida (ciljna struktura). U slučaju ćelija stimulisanih sa Tl/HCVcon, efektorne ćelije su konfrontirane sa Tl/HCVcon ili TI, prethodno napunjenih sa 51Cr. Supernatanti kulture su sakupljeni posle 4 č inkubacije.
[0049] Procenat specifične lize je izračunat prema formuli:
(cpm eksperimentalno-cpm spontano) / (cpm maksimum-cpm spontano) x 100
gde spontana liza (merena kao cpm spontano) odgovara ciljnim ćelijama inkubiranim u odsustvu efektornih ćelija, a maksimalna liza (cpm maksimum) je dobijena inkubiranjem ciljnih ćelija sa 5% Tritonxl00.
Primer 1
Imunizacija sa anti-CD40 i poli(LC) zajedno sa NS3 proteinoim indukuje multiepitopske CD4+ i CD8+ T odgovore.
[0050] Pokazano je da je imunizacija sa anti-CD40 i poli(LC) veoma efikasna u indukciji CD8+ odgovora putem korišćenja sintetičkih peptida koji predstavljaju epitope CD8+ ćelija kao imunogena. Iako ova strategija indukuje potentne odgovore, pokazano je da kada se vrši istovremena imunizacija sa malom količinom NS3 proteina (5 ug/mišu), koja indukuje CD4+ odgovor, ona pojačava CD8+ odgovor i takođe povećava visoko afinitetni CD8+ odgovor, drugim rečima, prepoznaju se male koncentracije antigena. Dodatno, imunizacija sa peptidima je efikasna samo kod onih individua koje poseduju HLA molekule iste restrikcije kao izabrani epitopi. U cilju spajanja ova dva aspekta, izvedena je studija da li će imunizacija sa većim količinama rekombinantnog NS3 proteina biti sposobna da indukuje odgovore, ne samo CD4+ već i CD8+. Da bi se ovo postiglo, miševi su imunizovani sa NS3 zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40, a indukovani odgovori su proučavani. Stoga, HHD miševima (dva po grupi) injekcijom su ubrizgane i.p. 50 ug anti-CD40. Četiri časa kasnije, injekcijom je ubrizgano 50 ug poli(I:C) (i.v.) i 500 ug rekombinantnog NS3 proteina (i.p.) (SEQ. ID. NO: 1). Šest dana kasnije, životinje su ubijene i splenocite su ekstrahovane. U cilju analiziranja kapaciteta NS3, kada je adjuvant poli(I: C) + anti-CD40 formulisan da indukuje CD8+ i CD4+ T odgovore, splenocite su stimulisanein vitrosa različitim antigenima koji specifično aktiviraju ove ćelijske populacije. (A) Da bi se analizirao CD8+ odgovor, u prvom eksperimentu splenocite su stimulisane pet dana sa epitopima CD8+ 1073, 1406 ili 1038 u prisustvu IL-2. Nakon toga, za svaku grupu ćelija stumulisanu peptidom, merena je njihova sposobnost da liziraju ciljne ćelije koje su napunjene sa odgovarajućem peptidom (crne trake) ili kontrolne ciljne ćelije bez peptida (bele trake). Slika 1A pokazuje rezultate dobijene sa efektorne:ciljne ćelije odnosom od 100:1. (B) CD8+ odgovor indukovan nakon imunizacije sa NS3 takođe je analiziran preko proučavanja proizvodnje IFN-y prema istim CD8+ epitopima. Di bi se ovo postiglo, splenocite su kultivisane sa različitim količinama 1073 (crni krugovi), 1406 (beli trouglovi) ili 1038 (crni trouglovi). Nakon 48 časova kultivisanja, supernatanti su sakupljeni i sadržaj IFN-y je meren. (C) U cilju analize indukovanog CD4+ odgovora, splenociti su stimulisani sa NS3 proteinom korišćenim u imunizaciji (SEQ. ID. NO: 1). Takođe, ćelije su stimulisane sa komercijalnim NS3 proteinom proizvedenim u bakteriji (SEQ. ID. NO: 3). Na isti način kao i u prethodnom aspektu, stepen aktivacije je meren preko proizvodnje IFN-y.
[0051]Pre svega, bilo je moguće proveriti da li je ovaj antigen sposoban da indukuje CD8+ odgovore, koji su mogli biti detektovani i u testu oslobađanja hroma (Slika 1A) i preko indukcije proizvodnje IFN-y (Slika 1B). Dodatno, ovaj odgovor je bio multiepitopski, usmeren ka različitim CD8+ epitopima, koji su karakterizovani unutar NS3 sekvence (npr., peptidi 1073, 1406 i 1038). Konačno, takođe je potvrđeno daje bio sposoban da indukuje CD4+ odgovore, koji je prepoznao NS3 protein korišćen u imunizaciji i komercijalni NS3 protein proizveden u bakteriji (Slika 1 C). Odgovor prema poslednje pomenutom bio je niži, verovatno usled činjenice da su postojale određene promene u sekvenci oba proteina i da je protein eksprimiran u bakteriji kraći, čime je mogao izgubiti određene epitope koje prepoznaju CD4+ T-limfociti.
Primer 2
Primena 25 ug rekombinantnog NS3 zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40 je dovoljna za indukciju CD4+ i CD8+ T odgovora.
[0052]Na osnovu prethodnih eksperimentata bilo je poznato da je sa 5 ug NS3 indukovan CD4+ odgovor, ali ne i CD8+, pa smo stoga želeli da otkrijemo minimalnu količinu NS3 koja bi bila dovoljna za indukciju CD8+ odgovora. Da bi se ovo postiglo, HHD miševi su imunizovani sa 500, 250, 125 i 25 ug NS3 (SEQ. ID. NO: 1). Takođe je uključena i kontrolna grupa imunizovana sa peptidima koji odgovaraju CD8+ epitopima, koji bi indukovali CD8+ odgovore, plus 5 ug NS3 (SEQ. ID. NO: 1), koji bi indukovao CD4+ odgovore. U tu svrhu, svaka grupa životinja imunizovana sa dozom NS3 analizirana je u odnosu na CD8+ odgovor i CD4+ odgovor. CD8+ odgovor je analiziran kao sposobnost lize ciljnih ćelija napunjenih sa epitopom CD8+ 1073 (SI. 2A), zajedno sa sposobnošću da proizvedu IFN-y u odnosu na različite koncentracije epitopa CD8+ 1073 (SI. 2B) i 1038 (SI. 2C). CD4+ odgovori mereni su preko sposobnosti proizvodnje IFN-y u odnosu na različite koncentracije NS3 (SEQ. ID. NO: 1) (SI. 2D). Ovaj eksperiment je pokazao da su sve testirane količine NS3 bile sposobne da indukuju CD8+ odgovore, kada su proučavani litički odgovori na peptid 1073 (SI. 2A), pri čemu je doza od 25 ug indukovala najslabije odgovore. Dodatno, sve doze su bile sposobne da indukuju proizvodnju IFN-y u odnosu na epitope 1073 (SI. 2B) i 1038 (SI. 2C), što je ukazivalo na to da je sposobnost indukovanja multiepitopskih odgovora održavana čak i kada su doze smanjene. Konačno, kao što je i očekivano, sve su indukovale CD4+ odgovore. Uzimajući u obzir daje, u većini slučajeva, indukovani odgovor bio manji kad je korišćeno 25 ug NS3, za kasnije eksperimente izabrana je doza od 100 ug/mišu, jer počevši od ove doze nije primećeno povećanje u indukciji odgovora.
Primer 3
Imunizacija sa poli(I:C) i anti-CD40 zajedno sa NS3 proteinom indukuje CD4+ i CD8+ odgovore u drugim sojevima miševa sa različitim MHC.
[0053] Uzimajući u obzir daje u antigenu koji je veliki kao NS3 protein, moguće naći CD4+ i CD8+ epitope, koji mogu biti prikazani različitim molekulima MHC, proučavan je kapacitet ovog imunizacionog protokola za indukciju CD4+ i CD8+ odgovora u drugom soju miševa sa različitim MHC molekulma. Da bi se ovo postiglo, C57/BI6 miševi, koji imaju H-2b restrikcione MHC molekule, imunizovai su sa 100 ug NS3 (SEQ. ID. NO: 1). U cilju poboljšanja odgovora, jedna grupa je primila pojedinačnu imunizaciju, a druga grupa je primila drugu buster imunizaciju. Pre svega, CD8+ odgovor je meren, kao proizvodnja IFN-y protiv peptida 1629-1637 (SEQ. ID. NO: 7), koji sadrži CD8+ epitop prikazan od strane MHC molekula Klase I H-2 Db. Kao što se može videti na Slici 3A, detektabilni odgovor je indukovan u obe grupe miševa, iako su nivoi bili značajno veći u grupi koja je primila dve imunizacije (crni kvadrati) nego kod one koja je primila jednu imunizaciju (beli kvadrati). CD4+ odgovor, meren kao proizvodnja IFN-y protiv rekombinantnog NS3 proteina (SEQ. ID. NO: 1) takođe je detektovan u dve grupe (Slika 3B), i ponovo je pokazao da su dve imunizacije (crni kvadrati) indukovale potentnije odgovore nego pojedinačna imunizacija (beli kvadrati).
Primer 4
Imunizacija sa NS3 proteinom zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40 indukuje CD8+ odgovore sposobne da prepoznaju ćelije koje eksprimiraju proteine HCV.
[0054]U cilju proučavanja da li bi imunizacija korišćenjem NS3 proteina zajedno sa poli(I:C) i anti-CD40 bila sposobna da indukuje odgovore koji bi potencijalno mogli ubiti ćelije inficirane sa HCV, korišćenjein vitromodel ciljnih ćelija transficiranih sa plazmidom koji je eksprimirao proteine HCV (Tl/HCVcon). Ove ćelije su eksprimirale iste peptide u svojim MHC molekulima Klase I kao što bi bili eksprimirani od strane ćelije inficirane sa HCV; stoga se kao odgovor na poslednje pomenute može pretpostaviti bilo koji siguran odgovor protiv njih. NS3 protein (SEQ. ID. NO: 1) korišćen u eksperimentima iz Slika 1 do 3 odgovara različitom virusnom soju iz virusnog soja prisutnog u Tl/HCVcon ćelijama. Ova dva soja pokazuju određene razlike u do sada proučavanim CD8+ epitopima. U cilju optimizacije kapaciteta prepoznavanja CD8+ epitopa prisutnih u Tl/HCVcon ćelijama, za ovaj eksperiment je kao imunogen korišćen NS3 protein (SEQ. ID. NO: 2), čija je sekvenca imala stepen homologije veći od proteina prisutnog u Tl/HCVcon ćelijama. Šest dana nakon imunizacije HHD miševa sa 100 ug NS3, splenocite su stimulisane sa Tl/HCVcon ćelijama. Kapacitet prepoznavanja Tl/HCVcon ćelija analiziran je testom litičke aktivnosti. Da bi se ovo postiglo, stimulisani splenociti konfrontirani su sa 1/HCVcon ćelijama i TI kontrolnim ćelijama. Kao stoje pokazano na Slici 4, imunizacija sa NS3 indukovala je odgovore sa većim kapacitetom da liziraju TI ćelije, koje su eksprimirale proteine HCV (crni krugovi) nego TI kontrolne ćelije (beli krugovi).
Primer 5
Imunizacija sa poli(I:C) i anti-CD40 zajedno sa NS3 proteinom indukuje dugotrajne T CD4+ i CD8+ odgovore.
[0055] Jedna od glavnih osobina koje vakcinacioni protokol mora posedovati je njegov kapacitet da indukuje dugotrajne imune odgovore, tako da se zaštita proistekla iz imunizacije može dugotrajno održati. Da bi se proučilo da li bi imunizacija sa anti-CD40 i poli(I:C) zajedno sa NS3 proteinom bila sposobna da indukuje ovu vrstu odgovora, HHD miševi su imunizovani sa 100 ug NS3 u skladu sa protokolom opisanim u Primeru 1. U cilju pojačavanja odgovora, nakon 15 dana životinje su primile buster dozu pod istim uslovima. Šezdeset dana nakon druge imunizacije životinje su ubijene i njihove splenocite su stimulisane sa različitim antigenima da bi se analizirali trenutno prisutni CD8+ i CD4+ T odgovori. Da bi se proučio CD8+ T odgovor, ćelije su stimulisane sa epitopom 1073 i merena je proizvodnja IFN-y i litička aktivnost. Kao što je pokazano na Slici 5A, šezdeset dana nakon druge imunizacije, splenocite miševa imunizovanih sa anti-CD40 i poli(I:C) zajedno sa NS3 proteinom bile su sposobne da proizvedu velike količine IFN-y kada su stimulisane sa peptidom 1073, ali ne u odsustvu antigena. Dodatno, ove ćelije su bile sposobne da liziraju ciljne ćelije radioaktivno obeležene sa peptidom 1073 (crni krugovi) ali ne ciljne ćelije bez antigena (beli krugovi) (Slika 5B). Konačno, CD4+ odgovor je takođe proučavan, korišćenjem NS3 proteina korišćenog u imunizaciji kao antigena. Slika 5C pokazuje da je ovaj imunizacioni protokol takođe indukovao potentne i dugotrajne CD4+ odgovore, koji specifično prepoznaje NS3.

Claims (18)

1. Imunostimulatorna kombinacija za profilaksu i lečenje hepatitisa C, naznačena time što sadrži: a) Poli(I:C) koji deluje kao agonist TLR3, b) agonist CD40 ili sekvenca DNK koja ga kodira, i c) polipeptid, koji sadrži NS3 protein virusa hepatitisa C, ili fragment navedenog NS3 proteina sa kapacitetom za indukciju CD8+ i CD4+ odgovora.
2. Imunostimulatorna kombinacija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je agonist CD40 izabran od anti-CD40 antitela, CD40L, i fragmenata prethodno navedenog koji imaju očuvan kapacitet za vezivanje sa CD40.
3. Imunostimulatorna kombinacija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što je agonist CD40 - anti-CD40 antitelo.
4. Imunostimulatorna kombinacija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što sadrži: a) poli(I:C), b) anti-CD40 antitelo, i c) polipeptid koji sadrži NS3 protein.
5. Imunostimulatorna kombinacija prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačena time što je polipeptid koji sadrži NS3 protein, polipeptid sa SEQ ID. NO: 1.
6. Imunostimulatorna kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 naznačena time što sve komponente formiraju deo jedne farmaceutske kompozicije.
7. Imunostimulatorna kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 naznačena time što sve komponente formiraju deo najmanje dve različite farmaceutske kompozicije.
8. Primena imunostimulatorne kombinacije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 u pripremi leka za profilaksu i lečenje hepatitisa C.
9. Primena imunostimulatorne kombinacije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 u pripremi leka za lečenje hepatitisa C.
10. Primena imunostimulatorne kombinacije prema patentnim zahtevima 8 ili 9, naznačena time što navedeni lek sadrži najmanje dve farmaceutske kompozicije pogodne za istovremenu primenu.
11. Primena imunostimulatorne kombinacije prema patentnim zahtevima 8 ili 9, naznačena time što navedeni lek sadrži najmanje dve farmaceutske kompozicije pogodne za odvojenu primenu.
12. Primena imunostimulatorne kombinacije prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što su navedene farmaceutske kompozicije pogodne za odvojenu primenu različitim načinima primene.
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži imunostimulatornu kombinaciju prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što je svaka od komponenti prisutna u farmaceutski prihvatljivim količinama.
14. Komplet za primenu imunostimulatorne kombinacije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što sadrži najmanje dve različite farmaceutske kompozicije kao što su definisane u patentnom zahtevu 13, pri čemu svaka od njih sadrži najmanje jednu od komponenti a), b) ili c) navedene imunostimulatorne kombinacije kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.
15. Imunostimulatorna kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, u efikasnoj količini za indukciju imunog odgovora na virus hepatitisa C.
16. Imunostimulatorna kombinacija prema patentnom zahtevu 15, za primenu kao profilaktički tretman.
17. Imunostimulatorna kombinacija prema patentnom zahtevu 15, za primenu kao terapeutski tretman.
18. Vakcina protiv virusa hepatitisa C,naznačena time štosadrži imunostimulatornu kombinaciju prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.
RSP-2010/0373A 2005-10-07 2006-10-05 Imunostimulatorne kombinacije za profilaksu i lečenje hepatitisa c RS51402B (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200502446 2005-10-07
ES200601563A ES2334472B1 (es) 2006-06-09 2006-06-09 Combinacion inmunoestimuladora para profilaxis y tratamiento de hepatitis c.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS51402B true RS51402B (sr) 2011-02-28

Family

ID=37942331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP-2010/0373A RS51402B (sr) 2005-10-07 2006-10-05 Imunostimulatorne kombinacije za profilaksu i lečenje hepatitisa c

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20100047231A1 (sr)
EP (1) EP1949913B1 (sr)
JP (1) JP2009511452A (sr)
CN (1) CN101330928B (sr)
AT (1) ATE469657T1 (sr)
AU (1) AU2006301171B9 (sr)
BR (1) BRPI0616978A2 (sr)
CA (1) CA2625506C (sr)
CY (1) CY1110744T1 (sr)
DE (1) DE602006014720D1 (sr)
DK (1) DK1949913T3 (sr)
ES (1) ES2346570T3 (sr)
HR (1) HRP20100473T1 (sr)
PL (1) PL1949913T3 (sr)
PT (1) PT1949913E (sr)
RS (1) RS51402B (sr)
RU (1) RU2431499C2 (sr)
SI (1) SI1949913T1 (sr)
WO (1) WO2007042583A1 (sr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2857038B1 (en) 2006-09-18 2019-04-10 The Board of Trustees of the University of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses
CA2704457A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Walter Bottje Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium
PT2214701T (pt) 2007-11-01 2016-11-02 Univ Guelph Composições e métodos de potenciar respostas imunes a eimeria
CA2745603A1 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Use of phenol soluble modulins for the development of vaccines
CN105837691B (zh) 2009-03-10 2021-06-29 贝勒研究院 靶向抗原呈递细胞的癌症疫苗
WO2011091255A1 (en) 2010-01-21 2011-07-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses
CA2800830C (en) 2010-06-09 2020-09-08 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vaccine and methods to reduce campylobacter infection
ES2758759T3 (es) 2013-02-14 2020-05-06 Univ Arkansas Composiciones y métodos para potenciar las respuestas inmunitarias a eimeria o limitar la infección por eimeria
CN105142653B (zh) 2013-03-15 2019-11-15 阿肯色大学评议会 增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法
JP7467027B2 (ja) 2016-05-03 2024-04-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 免疫刺激性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドを含む酵母ワクチンベクター並びにそれを使用する方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5049390A (en) * 1987-09-02 1991-09-17 Allergy Immuno Technologies, Inc. Liposome containing immunotherapy agents for treating IgE mediated allergies
AU5285899A (en) * 1998-07-21 2000-02-14 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Anti hepatitis c virus antibody and uses thereof
US7022830B2 (en) * 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
KR20070114209A (ko) * 2000-08-17 2007-11-29 트리펩 아베 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법
EP2258712A3 (en) * 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
EP2572714A1 (en) * 2002-12-30 2013-03-27 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory Combinations

Also Published As

Publication number Publication date
CY1110744T1 (el) 2015-06-10
CN101330928A (zh) 2008-12-24
AU2006301171A1 (en) 2007-04-19
DE602006014720D1 (de) 2010-07-15
CN101330928B (zh) 2012-11-14
CA2625506A1 (en) 2007-04-19
RU2431499C2 (ru) 2011-10-20
HRP20100473T1 (hr) 2010-10-31
EP1949913B1 (en) 2010-06-02
RU2008117328A (ru) 2009-11-20
ATE469657T1 (de) 2010-06-15
US20100047231A1 (en) 2010-02-25
WO2007042583A1 (es) 2007-04-19
SI1949913T1 (sl) 2011-02-28
PL1949913T3 (pl) 2010-10-29
EP1949913A1 (en) 2008-07-30
BRPI0616978A2 (pt) 2011-07-05
AU2006301171B9 (en) 2012-03-29
DK1949913T3 (da) 2010-10-04
AU2006301171B2 (en) 2011-10-27
PT1949913E (pt) 2010-08-24
ES2346570T3 (es) 2010-10-18
US20140056943A1 (en) 2014-02-27
JP2009511452A (ja) 2009-03-19
CA2625506C (en) 2014-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20140056943A1 (en) Immuno-stimulant combination for prophylaxis and treatment of hepatitis c
US20230241204A1 (en) Polypeptide vaccine coupled with tlr7 agonist for novel coronavirus and use thereof
Chase The impact of BVDV infection on adaptive immunity
CN114096675A (zh) 冠状病毒免疫原性组合物和其用途
US11833220B2 (en) Artificial multi-antigen fusion protein and preparation and use thereof
TWI754817B (zh) 以人工混雜ｔ輔助細胞抗原決定位以有限度的ｔ細胞發炎反應促進目標抗體的生產
AU2006259041A1 (en) Agents and methods based on the use of the EDA domain of fibronectin
Shi et al. The expression of membrane protein augments the specific responses induced by SARS-CoV nucleocapsid DNA immunization
US20100322972A1 (en) HCV Vaccines For Chronic HCV Patients
WO2005042564A1 (en) Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines and methods of use
Mansilla et al. Immunization against hepatitis C virus with a fusion protein containing the extra domain A from fibronectin and the hepatitis C virus NS3 protein
Wang et al. Bursin as an adjuvant is a potent enhancer of immune response in mice immunized with the JEV subunit vaccine
Zabaleta et al. Induction of potent and long-lasting CD4 and CD8 T-cell responses against hepatitis C virus by immunization with viral antigens plus poly (I: C) and anti-CD40
ES2334472B1 (es) Combinacion inmunoestimuladora para profilaxis y tratamiento de hepatitis c.
CN115894713B (zh) 异源三聚体化融合蛋白、组合物及其应用
HK40045220A (en) Artificial promiscuous t helper cell epitopes that facilitate targeted antibody production with limited t cell inflammatory response
ELLIS WI MORRISON, G. TAYLOR, RM GADDUM
Huang et al. Duck CD40L as an adjuvant enhances systemic immune responses of avian
KR20080063236A (ko) 인터루킨-15 및 ｈｃｖ 특이적 펩타이드를 포함하는 만성간염 및 간암의 예방 및 치료용 약학 조성물
KR20080062357A (ko) 인터루킨-15를 포함하는 만성 간염 및 간암의 예방 및치료용 약학 조성물