KR20080063236A

KR20080063236A - 인터루킨-15 및 ｈｃｖ 특이적 펩타이드를 포함하는 만성간염 및 간암의 예방 및 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20080063236A
Application number: KR1020080032140A
Authority: KR
Inventors: 황유경; 김남경; 정혜진; 임옥재; 박만훈
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2008-04-07
Filing date: 2008-04-07
Publication date: 2008-07-03

Abstract

본 발명은 인터루킨 15 (Interleukin-15; IL-15) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 만성 간염 또는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, IL-15은 HCV에 감염되어 세포성 면역기능이 억제된 환자에서 세포독성 T 림프구, 및 자연살해세포의 수적 증가 및 활성화를 통하여 세포성 면역 반응을 활성화시킬 수 있고, 메모리 T 세포를 효력 T 세포로 동원 (recruit)할 수 있으며, TGF-β에 의한 면역 억제를 극복하여 조절 T 세포를 유의하게 감소시킬 수 있으므로, 본 발명의 IL-15을 포함하는 약학 조성물은 HCV 바이러스에 의한 만성 간염 및 간암의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

인터루킨-15 및 ＨＣＶ 특이적 펩타이드를 포함하는 만성 간염 및 간암의 예방 및 치료용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CHRONIC HEPATITIS AND LIVER CANCER COMPRISING INTERLEUKIN-15 AND HCV-SPECIFIC PEPTIDE}

도 1은 만성간염 환자의 혈구세포에 후보 분자 처리 시, 면역 반응 증강 여부를 확인한 유세포 측정 (Flow Cytometry) 분석 결과이고,

도 2는 후보물질을 본 발명자들에 의하여 선별된 C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus; HCV)에서 유래한 에피토프 펩타이드 또는 대조 펩타이드와 함께 처리 시, 면역 반응 증강 여부를 확인한 형광 세포 분석 (fluorescence-activated cell sorter; FACS) 결과이고,

도 3은 인터루킨-15 (Interleukin-15; IL-15)의 항원 특이적 살해능을 나타내는 FACS 결과이고,

도 4는 IL-15의 항원 특이적인 CD8⁺ T 세포 증가 및 활성화의 유도, 및 TGF-β에 의한 면역 억제의 극복을 나타내는 유세포 측정 분석 결과이며,

도 5는 IL-15의 자연살해세포 (natural killer cell; NK cell)의 증가 및 활 성화의 유도, 및 TGF-β에 의한 면역 억제의 극복을 나타내는 유세포 측정 분석 결과이고,

도 6은 IL-15의 메모리 T 세포 (memory T cell) 동원 및 조절 T 세포 (regulatory T cell) 감소 유도를 나타내는 유세포 측정 분석 결과이고,

도 7은 에피토프 펩타이드 및 IL-15을 코딩하는 DNA 백신 벡터의 모식도이고,

도 8은 HCV 감염환자의 혈액으로부터 유래된 수지상세포에 IL-15을 코딩하는 유전자를 형질도입하고 효력 세포 (effector cell)와 함께 배양 시, 효력 세포가 보이는 항원특이적 CD8⁺ T 세포의 IFN-γ 분비능력 및 세포살해독성을 나타내는 유세포 측정 분석 결과이며,

도 9는 HCV 감염환자의 혈액으로부터 유래된 수지상세포에 IL-15을 코딩하는 유전자를 형질도입하고 효력 세포와 함께 배양하였을 때, 면역 세포들의 활성화를 보여주는 유세포 측정 분석 결과이다.

본 발명은 인터루킨 15 (Interleukin-15; 이하, IL-15) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 만성 간염 또는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus; 이하, HCV)는 만성 간질환, 간경변 및 간세포 암종의 주요원인이다. HCV에 감염된 환자의 절반이상이 만성간염으로 발전하고 이들은 대부분 간경화나 간암으로 이어져 치사율이 매우 높으며, 전 세계 인구의 3% 이상, 약 1억 7천만으로 추정되는 사람들이 HCV에 감염되어 있는 것으로 알려져 있다 (Miller 및 Purcell, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87, 2057-2061, 2000).

HCV 감염환자의 치료를 위한 종래의 방법은 인터페론 (α-interferon) 또는 리바비린 (ribavirin)을 사용하는 것이다. 그러나, 인터페론은 반응하는 환자의 비율이 약 50%정도이고, 반응하는 환자의 50%에서 C형 간염 바이러스가 재발하는 것으로 보고되고 있으며 (Hino 등, J. Med . Virol . 42(3):299-305, 1994; 및 Tsubota 등, Hepatology. 19(5):1088-94, 1994), 가격이 비싸고 입원치료가 요구되는 단점이 있다. 반면, 리바비린은 핵산 유도체로 급성 간염 환자에서는 40 내지 70%라는 상당한 효과를 보이나, HCV 감염에 의한 만성 간염 환자에서는 그 효과가 제한적이다. 따라서, HCV에 대한 효과적인 백신이나 치료제 개발이 시급한 실정이다.

침팬지와 사람에 대한 임상 실험 보고에 의하면, HCV 환자에서는 특이적인 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응이 모두 일어날 수 있으며 (Prince A. M. 등, J. Infect . Dis., 165:438-443, 1992), HCV의 구조 단백질인 E1과 E2가 보호 면역 (protective immunity)을 유발하는데 가장 중요한 항원으로 밝혀졌다 (Choo Q. L. 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 91:1294-1298, 1994). 또한 최근에는 상기 바이러스의 제거를 위해서는 체액성 면역 반응보다는 세포독성 T 림프구를 포함한 세포 매개성 면역 반응이 필수적인 것으로 보고된 바 있다 (Cooper S. 등, Immunity, 10:439-449, 1999; 및 Rinaldo C. 등, J. Virol ., 69:5838-5842, 1995).

바이러스에 감염된 개체는 세포성 면역 반응을 통해 바이러스를 제거하는데, 종양이나 간염과 같은 만성 환자의 면역세포들은 다양한 기전을 통해 그 기능이 억제되어 있으며, 특히 만성 HCV 감염 환자에서 바이러스 특이적인 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocytes; 이하 CTL) 반응이 바이러스를 제거하기에는 너무 낮은 수준이다.

예를 들어, 간염바이러스에 감염된 세포 또는 종양세포는 HLA (Human Leukocyte antigen) 분자의 발현을 억제함으로써 항원으로 인식될 수 있는 첫 번째 단계를 회피할 수 있다 (Vossen MT 등, Immunogenetcs . 54:527-542, 2002). 또한, HCV에 감염된 환자의 혈액에서 자연살해세포 (natural killer cell)의 수가 정상인에 비하여 현저히 낮고, 불활성화 표지자 (inactivated marker)를 세포 표면에 다량 발현하고 있다 (Ute-Christiane Meier 등, Journal of Virology 79:12365-12374, 2005; Nobuaki Kawarabayashi 등, Hepatology . 32:962, 2000; 및 J. CORADO 등, Clin . Exp . Immunol. 109:451, 1997).

또한, C형 간염 바이러스에 감염된 세포는 자연살해세포 및 CTL의 활성화에 중요한 역할을 하는 수지상세포를 감소시키거나 미성숙 상태에 머무르게 하고, 항원제시세포로서 발현해야 할 공동-자극 분자 (co-stimulatory molecule)의 발현을 억제한다 (Susanne Auffermann-Gretzinger 등, Blood. 97:3171-3176, 2001; Kanto, T 등. Intervirology, 49:58, 2006; Samila Siavoshian 등, J Med Virol. 75:402, 2005; Pablo Sarobe 등, J Virol . 77:10862-10871, 2003; 및 Randy S. Longman 등, Blood. 103:1026-1029, 2004).

아울러, 만성 간염 환자의 경우, 바이러스의 제거에 있어 중요한 역할을 하는 CTL의 항원 특이적 증식 또는 세포살해 독성이 미약하고, 항원 자극에 대한 IL-2의 분비가 매우 낮으며 (David D. Eckels 등, Hum Immunol . 60:187-199, 1999; 및 Heiner Wedemeyer 등, J Immunol . 169:3447-58, 2002), 만성 간염 및 간암환자의 혈액에서 면역 억제 분자인 TGF-β가 다량 검출된다 (Sakaguchi, Eiki 등, Hepatol Res. 24:282, 2002).

따라서, 이러한 바이러스의 면역 억제 기작을 극복하고 세포성 면역 반응을 유도하는 방법으로 최근 DNA 면역 방법이 대두되고 있다. DNA 면역 방법은 병원체의 특정 성분을 코딩하는 DNA를 직접 인체에 주입하여 면역화를 달성한다는 점에서 약독화시키거나 죽인 병원체 또는 병원체의 일부 성분을 이용하는 종래의 면역 방법과 구분되며, 면역화 단백질의 실제적인 생산이 DNA를 주입받은 숙주 내에서 이루어지기 때문에 생균 또는 사균을 이용하는 경우에 발생할 수 있는 감염의 위험을 제거할 수 있는 장점이 있다. HCV에 있어서도, 캡시드 단백질 (core)과 E2 단백질 등에 이러한 DNA 면역 방법이 적용되어, 이들에 대한 특이적인 면역성을 유도하였다는 보고가 있었다 (Major M. E. 등, J. Virol ., 69:5798-5805, 1995; 및 Tedeschi V. 등, Hepatology, 25:459-462, 1997).

한편, IL-15은 일반적으로 수지상세포를 성숙시키고, 자연살해세포의 기능을 증강시킨다고 알려져 있는데, HCV와 관련해서는 HCV 코어 단백질을 형질감염(transfection)시킨 수지상세포가 IL-15의 자극에 의하여 자연살해세포 활성화 마커인 NKG2D를 자극하는 MICA/B 발현이 증가한 성숙 수지상세포가 된다는 보고가 있었다 (Masahisa Jinushi 등, The Journal of Immunology, 171: 5423-5429, 2003). 그러나 이 보고에서는 IL-15에 의하여 항원 비특이적인 자연살해세포가 활성화되는 기작을 설명한 것으로, 실제 만성 C형 간염환자의 다양한 면역세포, 특히 항원 특이적인 면역세포가 IL-15에 대하여 어떤 변화를 보이는지 관찰한 예는 없었다.

이에, 본 발명자들은 IL-15가 HCV 감염환자에서 자연살해세포 뿐만 아니라 세포독성 T 임파구의 항원특이적 인식을 향상시키며, 특히 항원특이적 메모리 T 세포의 동원에 크게 기여하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 만성 간염 또는 간암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포매개 면역반응을 효과적으로 IL-15 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 만성 간염 또는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 사용되는 IL-15 단백질은, 이를 분비하거나 형질발현시키는 포유류 세포주로부터 정제된 균일 단백질로서 수득될 수 있으며, 또한, 통상적 화학 합성에 의해 재조될 수 있다.

본 발명에 따르면, IL-15는 만성간염 환자의 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 자연살해세포의 수를 증가시키는 것 뿐 아니라, CD8⁺의 세포독성 T 세포의 수를 증가시키고, 활성화시켜 IFN-γ의 분비를 촉진시키는 등 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다.

또한, 만성간염 환자의 면역세포에는 이미 항원을 인식하였으나 기능하지 못하는 상태의 메모리 T 세포가 존재하는데, HCV 항원 유래의 펩타이드 항원과 IL-15을 처리하면, 조절 T 세포를 억제하고, 메모리 T 세포의 재활성화를 유도할 수 있다.

이러한 세포성 면역반응의 증대는 HCV 감염환자나 종양환자의 혈중에 널리 존재하면서 면역 활성화를 억제하는 TGF-β의 존재 하에서도 가능하므로, IL-15에 의해 유도된 면역반응은 HCV에 감염된 환자를 치료할 수 있을 정도로 충분히 효과적임을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 IL-15 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 약학 조성물은 만성 간염 또는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사 용될 수 있다.

상기 IL-15을 코딩하는 유전자를 포함하는 약학 조성물에서, IL-15을 코딩하는 유전자는 분리된 유전자 물질로서 유지될 수 있는 플라스미드 벡터의 형태로 세포내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 염색체 내로 통합될 수 있는 선형 DNA를 세포 내로 도입할 수 있다. DNA가 세포 내로 도입될 경우, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 염색체 내로의 DNA 혼입을 촉진시키는 시약을 첨가할 수도 있고, 혼입을 촉진시키는 DNA 서열 또한 조성물 내에 포함될 수 있다.

상기 벡터는 바람직하게는 IL-15을 코딩하는 유전자의 발현을 위해 필요한 조절 요소를 포함한다. 이러한 요소는, 예를 들면, 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이들 요소는 바람직하게는 목적하는 IL-15을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결되며, 조절 요소는 바람직하게는 이들이 투여될 종에서 작동될 수 있도록 선택된다.

상기 개시 코돈 및 정지 코돈은 바람직하게는 벡터 내에 IL-15을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로서 포함되며, 코딩 서열과 함께 프레임 내에 있는 것이 바람직하다.

상기 프로모터로는 시미안 바이러스 40 (SV40), 마우스 유방종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, HIV 장말단 반복 (LTR) 프로모터와 같은 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 몰로니 바이러스, CMV 극초기 프로모터와 같은 시토메갈로바이러스 (CMV), 엡스테인 바 바이러스 (EBV), 로우스 육종 바이러스 (RSV)로부터의 프로모터 및 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 사람 메탈로티오 네인과 같은 사람 유전자로부터의 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

상기 폴리아데닐화 신호의 바람직한 예로는, SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 IL-15 외의 다른 사이토카인, 공동 자극 분자, 항바이러스제, 또는 항체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

상기 IL-15 외의 다른 사이토카인으로는 GM-CSF, IL-12, IL-7 또는 IL-2를 사용할 수 있으며, 공동 자극 분자로는 CD40 리간드, 4-1BB 리간드, Flt-3 리간드, hsp (heat shock protein), B7-1, B7-2, 또는 MICA/B를 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 담체, 부형제 또는 매질 (medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 티로글로불린, 사람혈청 알부민, 테타누스 톡소이드, 폴리아미노산, 예컨대 폴리 L-리신 및 폴리 L-글루탐산, 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 활성 성분인 IL-15의 투여량은 처리되는 대상, 질병 또는 상태의 심각도, 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다. 본 발명의 조성물이 DNA 형태로 투여될 경우에는 1 내지 100 ㎍/kg(체중), 바람직하게는 10 내지 50 ㎍/kg(체중)의 양으로 1일 1회 또는 1달 간격으로 3회 분할하여 근육주사와 같은 비경구적 경로를 통해서 투여될 수 있다. 일부의 경우에 있어서, 상기 언급된 범위보다 적은 투여량이 보다 적합할 수 있고, 해로운 부작용을 일으키지 않으면서도 보다 많은 양이 사용될 수도 있으며, 보다 많은 투여량의 경우는 하루에 걸쳐 수회의 적은 분량으로 분배된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 구성 및 작용의 이해를 돕기 위한 것일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포성 면역 증강 분자의 선정

(단계 1) C형 간염 환자의 혈액으로부터 단핵구 분리

먼저, 일반적으로 세포성 면역반응을 활성화시킨다고 알려진 CD40L, 4-1BBL, 및 B7-1과 같은 공동-자극 분자와 IL-15 및 FLT-3L과 같은 사이토카인을 사용하여, 하기와 같이 만성 간염 환자에서 세포성 면역기능이 증대되는지 확인하였다.

구체적으로, 서울 연세의료원을 방문한 HCV 감염환자 50명을 대상으로 하여 실험을 수행하였다. 모든 환자는 HCV에 의하여 지속 (persistent) 감염된 환자이다. 상기 환자의 항-HCV 항체를 포함하는 혈청전환 (seroconversion)은 HCV ELISA 테스트 시스템으로, HCV RNA의 존재는 RT-PCR로 확인하였다. 감염환자의 혈청 내 ALT (alanine aminotransferase) 활성은 6 배 이상이었으며, 다른 원인에 의한 만성 간질환을 가질 가능성 있는 환자는 배제되었다.

우선, HCV 환자로부터 혈액을 채취하여 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 피콜-히스토파크 (Ficoll-Histopaque) 밀도 구배법 (Sigma, St. Louis, Mo)으로 분리하였고, HBSS (Hank's Balanced Salt Solution; Life technologies, Grand Island, NY)로 3번 세척한 후 바로 실험에 이용하거나 90% FCS (fetal calf serum; Life technologies)와 10% DMSO (dimethylsulfoxide; Sigma)를 첨가하여 액체 질소 용액에 초저온 보관하였다.

(단계 2) 공동-자극 분자 및 사이토카인 처리

항-CD28, 항-CD40, 및 항-4-1BB 항체 (BD Bioscience (San Diago, CA))를 1 ㎍/ml의 농도가 되도록 PBS에 희석하여 24-웰 플레이트에 웰당 500 ㎕의 양을 넣고, 4℃에서 18시간 미리 코팅한 다음, PBS로 1회 세척하였다. 또한, IL-15 (R&D System) 및 Flt-3 (Biosource)을 각각 10 ng/ml의 농도가 되도록 15 ㎕씩 넣었다. 여기에 상기 단계 1에서 준비한 만성간염환자의 혈구세포를 1×10⁶/ml 농도로 각 웰에 1.5 ml씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 5일 동안 배양하였으며, 이때 대조군으로서 강력한 T 세포 자극인자인 PHA (phytohemagglutinin; Sigma)를 10 ㎍/ml의 농도가 되도록 0.5 mg/ml의 용액을 4 ㎕씩 웰에 넣어 6시간 배양하였다.

(단계 3) 유세포 분석에 의한 면역 증강 효과 확인

배양이 끝난 후, 5×10⁵개의 세포에 항-CD8 및 항-CD3 (BD Bioscience)를 각각 10 ㎕씩 넣고, 일반적인 형광염색방법에 따라 4℃에서 30분간 염색하였다. FACS 완충액 (PBS에 1% 혈청, 0.02% 소듐 아자이드)으로 세척하고 고정액 (BD Bioscience)으로 고정한 다음, FACSCalibure (Becton Dickinson) 분석기로 형광 측정하고, CellQuest 프로그램으로 이를 분석하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 활성 표면 수용체인 CD8을 발현하는 세포 독성 T 세포 (CD8⁺ T 세포)의 수가, 강력한 T 세포 자극인자인 PHA 자극 시 9.74%였던 것에 비하여, IL-15 첨가 시 23.2%로 증가하였으며, 이는 다른 공동-자극 분자 및 사이토카인보다 월등히 높은 수치임을 알 수 있다.

실시예 2: 항원 특이적 세포성 면역 효과 확인

상기 실시예 1에서 확인된 IL-15의 CTL 유도가 항원 특이적인지 여부를 확인 하기 위하여, 하기 표 1 및 2와 같이 HCV 특이적인 펩타이드 및 비특이적 펩타이드를 사용하여 실험하였다.

표 1의 펩타이드는 HCV 항원으로부터 유래한 것으로 본 발명자들에 의하여 보고된 바 있으며 (대한민국 특허 공개 제2006-49824호), 이들 에피토프와 비교를 위해 상기 표 2의 HLA (human leukocyte antigens) 타입 특이 에피토프 (Ward 등, Clin Exp Immunol 128, 195-203, 2002; Lauer 등, J Virol 76:6104-6113, 2002; Wong 등, J Immunol 160:1479-1488, 1998; Wong 등, J Virol 75:1229-1235, 2001; 및 Koziel 등, J Clin Invest 96:2311-2321)처리군을 함께 실험에 사용하였다. 상기 표 2의 타입 특이 에피토프는 상기 표 1의 에피토프와는 달리 반응성이 특정 HLA으로 제한되므로, 펩타이드 첨가에 따른 면역 효과를 비교할 수 있다.

상기 문헌에 따라 합성된 펩타이드는 100%의 DMSO에 20 mg/ml의 농도로 초기 용해시킨 뒤 세포 배양을 위하여 RPMI 1640으로 1 mg/ml까지 희석하여 사용하였다. 96-웰 플레이트에 상기 실시예 1의 단계 1에서 준비한 말초혈액단핵세포를 1×10⁶세포/200 ㎕/웰로 분주하고, 상기 펩타이드를 각각 20 ㎍/ml의 농도로 4 ㎕/웰이 되도록 넣어, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 5일 동안 배양하였다.

공동-자극 분자 및 사이토카인의 종류에 따른 항원 특이적 면역반응을 관찰하기 위하여 96-웰 플레이트에 항-CD28, 항-CD40, 항-CD3 및 항-4-1BB 항체 (BD bioscience)를 1 ㎍/ml의 농도로 PBS에 희석하여 4℃에서 18시간 미리 코팅한 다음, PBS로 1회 세척하여 공동-자극 분자 및 사이토카인에 대한 배양 플레이트를 준비하였다. IL-15과 Flt-3L은 각각 10 ng/ml 농도가 되도록 첨가하였다. T 세포 활성화의 양성 대조군으로서 실시예 1의 항-CD3 항체 (BD Bioscience) 처리군을, 음성 대조군으로 펩타이드 미처리군을 설정하였다. 세포가 합성한 IFN-γ를 세포내에 가두기 위하여 마지막 6시간 동안 골지-스톱 (Golgi-Stop; BD Bioscience)을 처리하여 배양하였으며, 아울러, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 PHA를 6시간 동안 처리하는 양성 대조군을 설정하였다.

그 후, 세포를 수확하여, T 세포의 세포 표면형 CD8⁺ 및 활성화 표지인자 IFN-γ로 염색 (세포내 염색 키트 (intracellular staining kit; BD Bioscience))하여 상기 실시예 1의 단계 3과 같이 유세포 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 환자의 HLA 종류에 따라 에피토프 펩타이드에 대한 반응은 다양하였으나, IL-15을 첨가하고 배양한 경우에 가장 많은 IFN-γ 분비 CD8⁺ T 세포가 확인되었다.

아울러, 세포면역에서 세포독성 T 세포와 자연살해세포들에 의해 분비되는 단백질 분해 효소 (granzyme B)의 양을, 세포내 염색 키트 (BD Bioscience)로 염색하여 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 추가적으로 살펴보았으며, 상기 표 1의 C10 펩타이드 처리군 및 비처리군을 비교하여 도 3에 나타내었다. 그 결과 도면에서 확인할 수 있는 바와 같이, IFN-γ를 분비하는 CD8⁺ T 세포는 항원 특이적인 세포 독성을 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 3: TGF -β의 면역 억제를 극복하는 IL -15의 세포 면역 유도 효과

실제 만성간염 환자의 혈액에는 면역세포의 기능을 억제하는 것으로 알려진 TGF-β가 다량 존재한다. 따라서, TGF-β가 면역기능을 억제하는 환경에서도 IL-15에 의해 유도된 세포 면역반응이 유효한지 확인하기 위하여, HCV 특이적 펩타이드 (표 1), IL-15, 및/또는 TGF-β의 유무에 따라 각기 다른 조건에서 배양된 8 종류의 세포를 수확하여 96 웰 플레이트에 150 ㎕씩 10웰에 나누어 넣고, 각기 다른 형광이 표지된 항체를 이용하여 면역세포의 종류와 활성도를 측정하였다.

24-웰 플레이트에 상기 실시예 1의 단계 1에서 준비한 말초혈액단핵세포를 1.5×10⁶ 세포/1.5 ml/웰의 양으로 분주하고, IL-15 (15 ng/1.5 ml/웰), 펩타이드(상기 표 1에 기재된 HCV 항원 유래의 10 종류를 동량 섞어서 최종 농도 20 ㎍/ml이 되게 30 ㎕/1.5 ml/웰 첨가) 및/또는 10 ㎍/ml의 TGF-β (Oeoro Tech, Rocky Hill, NJ)를 15 ng/웰로 첨가하거나 첨가하지 않고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 5일 동안 배양하였다.

배양이 끝난 후, 세포를 수확하여 CD8⁺, CD4⁺, 및 T 세포 공동-자극 분자인 4-1BB 및 T 세포 활성 마커인 CD25⁺를 각각의 항체 (BD Bioscience)를 이용하여 상기 실시예 1의 단계 3과 같이 유세포 분석을 통해 살펴보고, 그 결과를 도 4에 그래프로 나타내었다.

그 결과, CD8⁺ T 세포는 TGF-β및 펩타이드의 유무에 상관없이 IL-15이 있는 경우 유의하게 증가하였으며 (도 4a), CD8⁺ T 세포에서 4-1BB 및 CD25의 발현 역시 증가하였다(도 4b 및 4c). 특히 TGF-β는 CD8⁺ T 세포의 활성화를 강하게 억제하고 있는데, CD25의 발현은 TGF-β에 의한 CD8⁺ T 세포의 억제효과가 IL-15에 의하여 상당부분 극복된 것을 의미한다.

아울러, 상기에서 배양한 말초혈액단핵세포를 각기 다른 형광물질이 표지된 자연살해세포의 세포 표면형 (CD3^-, CD56⁺) 및 세포의 활성화 표지인자 (NKG2D⁺)에 대한 항체 (항-CD3-FITC, 항-NKG2D-PE, 및 항-CD56-PE Cychrome)(BD Bioscience)로 염색하고 상기 실시예 1의 단계 3과 같이 유세포 분석법으로 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다. 그 결과, IL-15이 있을 때 자연살해세포의 수가 다소 증가하였으며, 특히 자연살해세포의 활성화 표지인자인 NKG2D의 발현은 IL-15이 없는 경우에 유의하게 감소하였다. 뿐만 아니라 자연살해세포의 활성화를 저해하는 TGF-β가 있는 경우에도, 상당한 수준으로 NKG2D 분자를 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: IL -15에 의한 메모리 T 세포의 동원 및 조절 T 세포의 감소

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 배양된 말초혈액단핵세포를 수확하여 형광물질이 표지된 항체 (BD Bioscience)를 이용하여 조절 T 세포의 세포표면형 (CD4⁺, CD25⁺, FoxP3⁺), 메모리 T 세포의 세포표면형 (CD8⁺, CD44⁺, CD62L^dim) 및 각 세포의 활성화 표지인자 (CD25⁺)로 염색하고, 상기 실시예 1의 단계 3과 같이 유세포 분석법으로 확인하였다. 핵내에 존재하는 FoxP3를 검출하기 위해서는, 조절 T 세포 염색 키트 (Regulatory T cell staining kit; e-bioscience)를 사용하였다.

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, IL-15을 넣고 배양한 경우 메모리 T 세포의 표지자를 유의하게 상실하였다. 특히 TGF-β가 없는 경우가 그렇지 않은 것에 비하여 메모리 T 세포가 더 줄어들었으며, 펩타이드 항원 특이적인 메모리 T 세포의 동원 (recruit)을 확인할 수 있었다. 펩타이드에 의한 메모리 T 세포의 동원은 이미 IL-15을 첨가하여 충분한 양의 메모리 T 세포가 동원된 경우에는 그 차이가 크게 보이지 않으나, IL-15을 첨가하지 않은 경우에 그 차이를 크게 확인할 수 있다. 이는 TGF-β에 의하여 메모리 T 세포가 무활동 (quiescent)상태로 유지되고 있다가 IL-15에 의하여 다시 동원되며, 이러한 메모리 T 세포의 동원에는 항원 특이적으로 작동되고 있음을 보여 준다 (도 6a). 따라서, 이는 메모리 T 세포를 보유하고 있으나 활성화되지 못한 만성 간염환자에게서 IL-15의 치료 효능을 예측할 수 있는 중요한 결과이다.

한편, CD4⁺ CD25⁺ T 세포 중에 FoxP3를 발현하는 조절 T 세포의 변화를 살펴보았는데, IL-15에 의하여 조절 T 세포의 수가 크게 감소하였으며, 만성 C형 간염환자의 혈중 상태와 유사하게 TGF-β에 의한 면역 억제가 있을 때 특히 그 수가 많았다 (도 6b).

실시예 5: IL -15 유전자가 삽입된 플라스미드를 이용한 T 세포 활성화 유도

생체 내에서 T 세포가 외부 항원을 인식하는 데는 항원제시세포 (antigen presenting cell, APC)의 역할이 매우 중요하다. 상기 항원제시세포로는 B 세포, 대식세포, 수지상 세포 등이 있는데, 그 중에서도 특히 수지상 세포는 전문적인 APC로 알려져 있다. 따라서, 수지상 세포를 이용한 생체내 (in vitro) DNA 백신의 방법을 이용하여 DNA 형태의 IL-15의 효능을 확인하고자, 대한민국 특허 공개 제2006-49824호에 기술된 방법으로 DNA 백신 벡터를 제조하였다. IL-15 코딩 서열 외에, 실시예 2의 표 1에 기재된 10개의 에피토프를 올리고뉴클레오타이드로 연결하여 독립된 CMV 프로모터에 의해 발현하도록 하였으며, IL-15은 세포내에서 mRNA로 전사가 되어도 단백질 발현이 매우 낮으므로, IL-15의 발현을 촉진하기 위하여 Istituto 등이 사용한 IgK 신호 서열을 제공하였다 (Eur . J. Immunol . 27:1049-1054, 1997). 상기 논문에 따라 제작된 IgK-IL-15 유전자를 에피토프를 코딩하는 유전자를 가진 pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen)에 삽입하였다 (도 7).

한편, 환자의 단핵구를 수지상 세포의 성숙을 유도하는 GM-CSF (1000U/ml, R&D System), 및 IL-4 (1000U/ml, R&D System)가 함유된 RPMI-10 배양배지를 이용하여 6일 동안 배양하고, 7일째 되는 날 50%의 단핵세포 조건 배지 (Monocyte conditioned medium)를 함유한 성숙 유도배지로 바꾸어 성숙한 수지상 세포를 배양하였다. 배양 8일째 성숙 수지상세포는 표면항원 (CD80, CD83, CD86, CD1a, CD25, CD40)의 발현을 형광이 표지된 항체 (BD Bioscience)들을 이용하여 상기 실시예 1의 단계 3과 같이 유세포 분석기로 확인한 후, 유전자가 도입된 영양세포 (feeder cell)로 사용하기 위하여 바로 전기천공을 하거나 표적세포로 사용하기 위하여 동결 보존하였다.

제조된 상기 플라스미드 각 4 ㎍씩을 환자의 단핵구로부터 분화된 5×10⁵~1×10⁶의수지상세포에 전기천공법 (electrophoration; Nucleafact, AMAXA)으로 도입하였으며, 대조군으로서 아무런 유전자가 삽입되지 않은 pcDNA3.1 플라스미드 벡터를 모의 (mock) DNA로 사용하였다. 유전자가 도입된 수지상 세포는 1000 U/ml 농도의 GM-CSF (R&D System) 및 1000 U/ml의 IL-4 (R&D System)를 함유한 RPMI-10 배양배지에서 18시간 배양하였고, 삽입된 IL-15의 발현이 확인된 다음날 수지상세포를 수확하여 동일한 환자의 말초혈액과 함께 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 5일 동안 배양하여 효력세포 (effector cell)을 유도하였다.

한편, 동결보존된 성숙 수지상세포를 해동하여 상기와 동일한 방법으로 에피토프가 코딩된 유전자와 모의 DNA가 도입된 수지상세포를 표적세포로 준비를 하고, 각 유전자와 배양된 말초혈액 (효력세포)과 1대 10의 비율로 섞어서 6시간동안 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다.

반응이 끝난 후 세포를 수확하여, CD8⁺ T 세포에 의한 IFN-γ의 분비를 세포내 사이토카인 염색 (intracellular cytokine staining; ICS)을 수행한 후 상기 실시예 1의 단계 3과 같이 FACS로 확인하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 아울러, 배양된 세포에서 다양한 면역세포의 수와 활성을 관찰하고자 전 실시예에서 사용한 항체들을 이용하여 같은 방법으로 염색하고 유세포 분석기로 확인하여, 도 9에 나타내었다.

그 결과, 펩타이드와 IL-15 코딩 벡터가 도입된 수지상 세포로 배양된 효력 세포는 모의 DNA가 형질감염된 수지상세포로 배양된 효력 세포에 비하여 항원특이적인 IFN-γ의 분비가 증가됨을 볼 수 있었다(도 8).

또한, 면역세포들의 수적 변화와 활성도를 비교해 보았는데, 단백질 형태의 IL-15이 사용된 경우에 비하여 CD8⁺ T 세포나 자연살해세포의 수가 크게 증가하지는 않았으나, CD8⁺ T 세포에서 4-1BB의 발현이 유의하게 증가한 점은 동일하였다 (도 9).

이는 재조합 IL-15 단백질이 10 ng/ml 농도로 제공되어 효력 세포를 배양한데 비하여, 수지상세포가 발현하는 IL-15의 농도는 훨씬 낮았기 때문에 면역세포 수를 유의하게 증가시키지 못한 것으로 판단된다. 그러나 IL-15이 유전자 형태로 제공되어도 항원특이적 CTL 반응을 유도할 수 있으며, CD8⁺ T 세포를 유의하게 활성화시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는 IL-15이 단백질 뿐만 아니라 유전형질을 코딩하는 플라스미드로도 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, IL-15은 HCV에 감염되어 세포성 면역기능이 억제된 환자에게서 세포독성 T 림프구 (CTL), 및 자연살해세포의 수적 증가 및 활성화를 통하여 세포성 면역 반응을 활성화시킬 수 있고, 메모리 T 세포를 효력세포로 동원할 수 있으며, TGF-β에 의한 면역 억제를 극복하여 조절 T 세포를 유의하게 감소시킬 수 있으므로, 본 발명의 IL-15을 포함하는 약학 조성물은 HCV 바이러스에 의한 만성 간염 및 간암의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CHRONIC HEPATITIS AND LIVER CANCER COMPRISING INTERLEUKIN-15 AND HCV-SPECIFIC PEPTIDE <130> FPD/200803-0076 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L4 <400> 1 Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L8 <400> 2 Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Met 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L10 <400> 3 Leu Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 <400> 4 Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 <400> 5 Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 <400> 6 Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C7 <400> 7 Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Lys Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C8 <400> 8 Met Ala Leu Met Lys Leu Ala Ala Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C9 <400> 9 Ala Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C10 <400> 10 Phe Val Gly Leu Ala Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C36 <400> 11 Leu Leu Pro Pro Arg Gly Pro Arg Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C132 <400> 12 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NS4-1789 <400> 13 Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ala Val 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NS5B-2510 <400> 14 Ser Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NS5B-2588 <400> 15 Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C41 <400> 16 Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C110 <400> 17 Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu 1 5

Claims

인터루킨 15 (Interleukin-15; IL-15) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 1 내지 10으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드들을 포함하는, C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus; HCV)에 의한 만성 간염 또는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, IL-15가 HCV 특이적인 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T Lymphocytes; CTL)를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

CTL의 활성화가 항원 특이적인 메모리 T 세포 (memory T cell)의 동원을 매개로 하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

IL-15 외의 사이토카인, 공동 자극 분자 (co-stimulatory molecule), 항바이러스제, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서,

인터루킨 15 이외의 사이토카인이 GM-CSF, IL-12, IL-7 또는 IL-2인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서,

공동 자극 분자가 CD40 리간드, 4-1BB 리간드, Flt-3 리간드, hsp (heat shock protein), B7-1, B7-2, 및 MICA/B로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

유전자가 플라스미드 벡터에 삽입된 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.