RO137312A2 - Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creştere a miceliilor din tulpini de pleurotus eryngii pentru sporirea cantităţii de biomasă miceliană obţinută in vitro - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu biotehnologic de obţinere biomasă miceliană in vitro din tulpini de Pleurotus eryngii. Procedeul, conform invenţiei, constă în etapele: obţinerea şi propagarea culturilor-mamă pe medii agarizate cu extract de compost pentru cultivarea ciupercilor Agaricus bisporus având un pH de 6,5...6,7, un raport C/N de 13:1 şi un conţinut de azot total de 2,6...2,7% s.u., propagarea /subcultivarea submersă a miceliilor, în mediu lichid, pentru utilizare ca inocul/miceliu lichid sau pentru obţinerea de biomasă miceliană/fungică, rezultând o rată de creştere optimizată a miceliilor şi o cantitate sporită de biomasă miceliană in vitro.

Description

OFICIUL DE STAT PENTRU INVENpi Șl MĂRCI Cerere de brevet de invenție

Nr.

Data depozit ϋ&ί.

Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro.

Invenția se referă la un procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro.

Prin acest procedeu, utilizându-se formule îmbunătățite de medii nutritive suplimentate cu extract de compost specific culturii ciupercilor champignon {Agancus bisporus), se asigură un start mai bun și o creștere mai rapidă a miceliilor de Pleurotus eryngii cultivate in vitro. în plus, utilizarea acestui procedeu are efect amplificator de etapă în fluxul biotehnologiei producerii de miceliu pentru ciupercării, obținându-se un spor semnificativ de producție.

Este cunoscut faptul ca ciupercile din grupul Pleurotus constituie agenți foarte eficienți de reciclare biologică a diferitelor deșeuri/subproduse lignocelulozice agroforestiere sau provenind din industria alimentară, textilă, a hârtiei, etc. 1n cadrul grupului, specia Pleurotus eryngii (DC.:Fr.) Quel se distinge prin bazidiocarpii/ciupercile cele mai mari, cele mai gustoase atunci când sunt gătite și cu cea mai mare perioadă de păstrare în stare proaspătă.

încadrarea lor sistematică este următoarea: regnul Fungi, diviziunea/încrengătura Basidiomycota, clasa Agaricomycetes, ordinul Agaricales, familia Pleurotaceae, genul Pleurotus (Fr.) P.Kummer

Sunt cunoscute diferite metode de obținere a mediului de cultivare a miceliilor de

Pleurotus eryngii ca de exemplu:

Brevetul RO 121718 - Metodă de producere a miceliului comercial de ciuperci comestibile, pe substraturi constituite din deșeuri viti-vinicole” utilizează medii nutritive constituite preponderent din deșeuri vegetale, rezultate în cursul proceselor de prelucrare agroindustrială, care se aplică în agricultură și în vinificație, respectiv, a coardelor și a frunzelor de viță de vie, precum și a tescovinei din struguri.

Brevetul RO 129413 - Tehnologie pentru produs miceliu de ciuperci cu ajutorul microundelor se referă la obținerea miceliului de ciuperci in condiții sterile prin dezinfectarea/sterilizarea cerealelor sortate, prespălate și preinpregnate cu ajutorul câmpului de microunde, fără a realiza un grad ridicat de încălzire a suportului.

Brevetul MD 1522 - „Procedeu pentru cultivarea ciupercilor Pleurotus” - cuprinde tratamentul blocurilor de substrat inoculate cu un câmp magnetic alternativ pulsat cu o inducție de 40-50 μΤ și o frecvență de 16,5 Hz, timp de 15 minute, cu plasarea ulterioară a acestora în ferma de ciuperci pentru creștere.

Brevetul RO 108697 - ’Suport de creștere, pentru miceliu intermediar inocul de Pleurotus sp și procedeu de realizare a acestuia” - prezintă etapele succesive reprezentate prin obținerea și utilizarea următoarelor biopreparate pe medii/suporturi nutritive solide: cultura-stock - cultura pură reprezentativă pentru o izolată/tulpină/specie, păstrată pe medii agarizate în colecție, la +1-3°C, frigider; cultura-mamă - cultură pură obținută direct din cultura-stock, printr-un singur transfer /pasaj pe mediu proaspăt agarizat; miceliu intermediar (inocul) - se obține prin inocularea cu miceliu dintr-o cultura-mamă a unui flacon cu suport granulat (boabe grâu)/suport lemnos (baghete din lemn) steril; miceliu comercial - materialul biologic pentru însămânțare în ciupercărie, obținut în flacoane din sticlă/polipropilenă sau pungi din polipropilenă cu suport granulat sterilizat, prin inoculare cu miceliu intermediar (Brev.Inv.RO 108697 B1-1994; Mateescu și Zăgrean, 2003; Zăgrean, A.V., 2008).

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unor medii nutritive pentru cultura in vitro a miceliilor unor tulpini de ciuperci din specia Pleurotus eryngii, folosind un extract de compost specific cultivării ciupercilor Agaricus bisporus, care asigura și susțin creșterea mai rapidă, un start mai bun și un amplificator de etapă în producția de miceliu pentru ciupercării și/sau pentru obținerea unor cantități sporite de biomasă miceliană cu multiple utilizări în domenii diverse: nutriție, prevenirea și tratarea unor afecțiuni medicale, prevenirea îmbătrânirii premature.

Procedeul biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro conform invenției se desfășoară în două etape.

- etapa/faza obținerii și propagării culturilor-mamă pe medii agarizate;

- etapa/faza tehnologică a propagării/subcultivării submerse a miceliilor, în mediu lichid, pentru utilizare ca inocul/miceliu lichid sau pentru obținerea de biomasă miceliană/fungică.

Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro,

constă în aceea că se prepară un extract de compost pentru ciupercile Agancus bisporus folosind 200 g compost gata preparat și măcinat cu particule £1 mm; care se lasă la macerat într-un vas cu 2.0 I apă distilată timp de 4 ore la temperatura de 25°C, amestecându-se de 2-3 ori; acesta se strecoară prin sită fină, iar lichidul rezultat se filtrează la vid; depozitul solid rămas se resuspendă în 0,5 I lichid din prima extracție și se fierbe 10 min; se filtrează din nou, iar lichidul rezultat se amestecă împreună cu primul , utilizat ca supliment organic complex atât în etapa obținerii și propagării culturilor-mamă pe medii agarizate cât și în etapa propagării/subcultivării submerse a miceliilor în mediu lichid, pentru utilizare ca inocul/miceliu lichid sau pentru obținerea de biomasă miceliană/fungică.

Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro, pentru obținerea de cultura-mamă pe mediu nutritiv cu extract de compost se procedează astfel:

- se prepară extractul de compost pentru ciupercile Agancus bisporus,

- se prepară mediul de cultură solid (agarizat): extract de cartofi 2,4% + extract de malț 1,7% + extract de compost pentru ciupercile Agancus bisporus 50 ml /L + agar 2%;

- mediul nutritiv se aduce la valoarea de pH 6,5 și se repartizează în flacoane de 500/1000 ml cu dop care se sterilizează în autoclav 20 min la 121°C;

- mediul sterilizat se scoate din autoclav și se repartizează în plăci Petri (0 90 mm), cîte 15-18 ml mediu/placă în condiții sterile

- după 24 ore, plăcile Petri cu mediu solid agarizat sunt inoculate, la hota sterilă cu flux laminar: în mijlocul fiecărei plăci Petri se dispune câte un fragment rotund de inocul cu 0 5 mm recoltat de la marginile coloniilor miceliene ale culturilor-stock din colecție;

- plăcile inoculate sunt incubate timp de 10-12 zile la 25-27°C (incubator/termostat), până când miceliile în creștere acoperă întreaga suprafață a mediilor de cultură; rata de creștere a miceliului este de 183 % pe varianta cu extract de compost față de varianta martor, după 7 zile de la inoculare la temperatura de 25 -27 °C.

Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro, pentru propagarea/subcultivarea submersă a miceliilor în mediu lichid se procedează astfel:

^J

- se prepară extractul de compost pentru ciupercile Agancus bisporus,

- se prepară mediul de cultură lichid: extract de cartof 2,4% + extract de drojdie 2 g/L + K2HPO4 1 g/L + extract de malț 2 g/L + fructoză 10 g/L + extract de compost 50 ml/L și se aduce indicele pH la valoarea de 6,5;

- mediul lichid preparat se repartizează în flacoane Erlenmeyer închise cu dop, se sterilizează în autoclav 20 min la 121°C; se scot din autoclav și se lasă să se răcească la o temperatură sub 28°C într-o incintă sterilă.

- flacoanele cu mediu lichid sunt inoculate la hota cu flux laminar cu miceliu provenit din culturile-mamă pregătite, respectiv cu câte 4-5 fragmente rotunde de miceliu recoltate cu 0 5 -10 mm din marginile coloniilor miceliene ale culturilor-mamă,

- flacoanele cu mediu lichid inoculat sunt incubate pe agitatorul orbital cu 100 rpm la întuneric timp de 14 zile, la 25-27°C;

- miceliile tulpinilor testate sunt separate de lichidul din flacoane prin filtrare;

- biomasa obținută se spală de mai multe ori cu cu apă distilată;

- biomasa este apoi deshidratată (uscată) la etuvă timp de cca. 36 ore la 40°C, până când masa cântărită rămâne constantă; sau este liofilizată ;

- rata de creștere a cantității de biomasă uscată este de 152,93% raportată la 1000 ml soluție nutritivă față de varianta martor.

Invenția, prin îmbunătățirea rețetei de mediu de propagare in vitro, prezintă următoarele avantaje:

- pe fluxul de producere a miceliului pentru însămânțare se reduce timpul de obținere al produsului final, cu economii energetice;

- se reduce perioada de incubare a miceliilor cultivate in vitro

- scade posibilitatea apariției și dezvoltării infecțiilor cu microorganisme (fungi, bacterii) concurente/potențial patogene;

- se îmbunătățește starea de nutriție a miceliilor, acestea capătă valențe suplimentare de vigoare și rezistență la factori biotici/abiotici adverși,

- se asigură o pregătire mai bună pentru procesul de colonizare a substratului de cultură după însămânțare și pentru fructificare;

- miceliu pentru însămânțare - miceliu lichid, obținut prin cultivare submersă asigură o viteză sporită de creștere în substratul lignocelulozic și, ca urmare, colonizarea rapidă a acestuia și micșorarea riscului dezvoltării microorganismelor contaminante în perioada premergătoare fructificării;

- miceliu lichid asigură o puritate excepțională a materialului biologic de însămânțare, reprezentat prin miceliile speciilor de ciuperci propagate

- ușurința deosebită cu care pot fi manipulate;

- în cazul obținerii de biomasă miceliană, mediul mai bogat în elemente nutriționale asigură, atât sporirea cantității de biomasă, cât și o calitate superioară a acesteia printr-un conținut sporit de compuși bioactivi cu utilizări în medicină, farmacie, industrie agro-alimentară.

- miceliul crescut în cultură submersă pe/în medii lichide pentru obținerea de biomasă fungică are diverse întrebuințări în produse nutraceutice, extracte utilizate în protocoale pentru întârzierea îmbătrânirii, prevenirea și tratarea unor afecțiuni;

Se dă în continuare un exemplu de realizare în legătură și cu fig. 1-10 care reprezintă:

Fig. 1 - Schema procedeului biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro.

Fig. 2 - Efectul extractului de compost asupra creșterii miceliilor de P. eryngii pe medii agarizate, incubate 7 zile la temperatura de 25-27 °C. Variantele de mediu nutritiv V₄ și V₅ conțin extract de compost (foto)

Fig. 3 - Creșterea miceliului la 3 tulpini de Pleurotus eryngii pe medii agarizate suplimentate cu surse de azot, carbon și minerale, incubate 7 zile la temperatura de 25-27 °C pe plăci Petri (0 90 mm). Variantele de mediu V₄ și V5 conțin extract de compost (grafic)

Fig. 4 - Efectul extractului de compost asupra creșterii miceliilor de P.eryngii pe medii agarizate, incubate 10 zile la temperatura de 25-27 °C pe plăci Petri (0 90 mm) - Varianta de mediu nutritiv V7 conține extract de compost (foto)

Fig. 5 - Creșterea miceliului la 3 tulpini de Pleurotus eryngii pe medii agarizate suplimentate cu surse de azot, carbon și minerale, incubate 7 zile la temperatura de 25-27 °C. Varianta de mediu V7 conține extract de compost (grafic)

Fig. 6 - Cantitatea de biomasă uscată obținută în cultură submersă (g/L) la Pleurotus eryngii - tulpinile PeM-41 și PeM-45. Varianta de mediu nutritiv lichid V₇ conține extract de compost. 14 zile de incubare la 25-27 °C (grafic)

Fig. 7 - Efectul extractului de compost asupra creșterii miceliilor de P.eryngii, tulpina PeM-41, în culturi submerse (medii lichide) incubate 10 zile la temperatura de 25-27 °C - fara extract de compost vs cu extract de compost.

Fig. 8 - Efectul extractului de compost asupra creșterii miceliilor de P.eryngii, tulpina PeM-45, în culturi submerse (medii lichide) incubate 10 zile la temperatura de 25-27 °C - fara extract de compost vs cu extract de compost

Conform invenției, procedeul biotehnologic pentru obținere a unui mediu de cultivare in vitro a ciupercilor din specia Pleurotus eryngii (DC.:Fr.) Quel se desfășoară în două etape astfel:

- Prima etapă se referă la obținerea și propagarea culturilor-mamă pe medii agarizate cu formula/compoziția îmbunătățită cu extract de compost specific cultivării ciupercilor Agaricus bisporus

Este cunoscut faptul că cele două mari grupuri de ciuperci cultivate, Agaricus spp. (champignon) și Pleurotus spp (bureți), au mecanisme de nutriție și sisteme enzimatice aferente diferite, tehnologii de cultivare diferite. Ciupercile de tip champignon necesită introducerea în compostul pentru cultivarea lor de dejecții de animale - cai sau/și păsări - pentru a completa necesarul de azot specific metabolismului și enzimelor proprii.

Ciupercile Pleurotus nu au aceste cerințe, ele dezvoltându-și în timp capacitatea de a crește pe substraturi lignocelulozice (lemn, paie, deșeuri vegetale diverse, etc.) care sunt, prin natura lor, sărace în azot, structurile lor fiind bogate în schimb în carbon celuloză, hemiceluloză, lignină. Raportul optim C/N caracteristic pentru substraturile de cultivare ale ciupercilor Agaricus bisporus este de 15:1, în timp ce la substratul de cultură pentru ciupercile Pleurotus prezintă o plajă largă de 40-80:1, deci puțin azot necesar.

Se cunoaște că ciupercile de tip champignon (ex. Agaricus bisporus) sunt cultivate pe un substrat mixt pe bază de paie de grâu, gunoi de grajd/dejecții de cal sau de pasăre, ipsos și apă. Compostul gata preparat are un pH de 6,5 - 6,7, un raport C/N de 13:1 și un conținut de azot total de 2.6-2,7% s.u.

Extractul de compost, conform invenției, se prepara astfel:

- se cântăresc 200 g compost gata preparat și măcinat cu particule £1 mm;

- se lasă la macerat într-un vas cu 2.0 I apă distilată timp de 4 ore la temperatura de 25°C, amestecându-se de 2-3 ori;

- se strecoară prin sită fină, iar lichidul rezultat se filtrează la vid;

- depozitul solid rămas se resuspendă în 0,5 I lichid din prima extracție și se fierbe 10 min;

- se filtrează din nou, iar lichidul rezultat se amestecă împreună cu primul;

- extractul obținut poate fi păstrat 1-2 zile la frigider ( 2-4°C)

Astfel obținut, extractul de compost pentru ciupercile Agaricus bisporus ca supliment organic complex va livra mediului de cultură folosit in vitro pentru miceliile tulpinei de P.eryngii macroelemente esențiale pentru creștere și dezvoltare - N, P, K dar și microelemente cu rol fiziologic.

Extractul de compost astfel preparat este utilizat în ambele etape ale tehnologiei de producere a miceliului in vitro, deci atât la obținerea culturilor-mamă pe medii agarizate cât și la producerea inoculului/miceliului lichid în culturi submerse - pentru biomasă miceliană. Schematic, procedeul este prezentat în fig. 1.

Materialul biologic - reprezentat de culturi pure (culturi-stock) aparținând unor tulpini din specia Pleurotus eryngii din Colecția de germoplasmă fungică a ICDLF Vidra.

Culturile-stock, realizate pe plăci Petri (0 90 mm) cu mediu solid agarizat cu extract de cartofi (potato dextrose agar -PDA), cu pH inițial 6,5 sunt incubate la 24-26°C la întuneric timp de 8-10 zile, până la acoperirea totală a suprafeței mediului de cultură. Pentru realizarea culturilor-mamă pe mediu nutritiv cu extract de compost, conform invenției, se procedează astfel:

- se prepară extractul de compost pentru ciupercile Agaricus bisporus',

- se prepară mediul de cultură solid (agarizat): extract de cartofi 2,4% + extract de malț 1,7% + extract de compost 50 ml /L + agar 2%;

- mediul nutritiv se aduce la valoarea de pH 6,5 și se repartizează în flacoane de 500/1000 ml cu dop;

- mediul repartizat în flacoane Erlenmeyer se sterilizează în autoclav 20 min la 121°C;

- mediul sterilizat se scoate din autoclav și se repartizează în plăci Petri (0 90 mm), cîte 15-18 ml mediu/placă; operațiunea se execută în condiții sterile la hota cu flux de aer laminar filtrat (filtre HEPA);

- după 24 ore, plăcile Petri cu mediu solid agarizat sunt inoculate, la hota sterilă cu flux laminar: în mijlocul fiecărei plăci Petri se dispune câte un fragment rotund de inocul cu 0 5 mm recoltat cu preduceaua (cork borer) de la marginile coloniilor miceliene ale culturilor-stock din colecție;

- plăcile inoculate sunt incubate timp de 10-12 zile la 25-27°C (incubator/termostat), până când miceliile în creștere acoperă întreaga suprafață a mediilor de cultură;

- în perioada de incubare sunt efectuate observații și măsurători privind creșterea miceliului și caracterele culturale ale colonilor dezvoltate pe plăcile cu mediu nutritiv agarizat;

- plăcile Petri care la finalul perioadei de incubare etalează colonii miceliene cu caractere atipice, creștere lentă, posibile contaminări cu microorganisme competitoare/parazite sunt îndepărtate;

- plăcile cu micelii care prezintă caracteristici culturale morfo-fiziologice normale, identice cu cele ale culturilor-mamă, tipice pentru tulpina și specia de ciuperci utilizată, confirmând vitalitate, vigoare, integritate fenotipică și omogenitate între replicatele surori - sunt selectate în vederea propagării și/sau folosirii lor la obținerea de biomasă miceliană cu utilizări multiple.

Efectul adăugării extractului de compost comparativ cu influența altor surse de C și N în compoziția mediilor solide agarizate verificate în cadrul experimentelor întreprinse se poate observa în fig. 2, - fig. 3 (grafic) și fig 4 (foto) - fig.5 (grafic).

în fig. 2. și fig. 3 este redat efectul extractului de compost asupra creșterii miceliilor de P.eryngii pe medii agarizate. Materialul biologic a fost incubat timp de 7 zile la temperatura de 25 -27 °C pe plăci Petri (0 90 mm). Dintre cele 6 variante de mediu nutritiv agarizat, doar variantele V4 și V5 conțin extract de compost:

V _o: mediu cu extract de cartofi 2,4% + agar 2%

Vf mediu cu extract de malț 1,7% + agar 2%

V 2: mediu cu extract de cartofi 2,4% + extract de drojdie 1 g/L + agar 2%

V ₃: mediu cu extract de cartofi 2,4% + extract de malț 1,7% + agar 2%

V ₄: mediu cu extract de cartofi 2,4% + extract de compost 50 ml /L + agar 2%

V 5: mediu cu extract de cartofi 2,4% + extract de malț 1,7% + extract de compost 50 ml /L + agar 2%

V ₆: mediu cu extract de cartofi 2,4% + extract de malț 1,7% + K2HPO4 1 g/L + agar 2%.

In cazul mediilor solide agarizate rezultatele cele mai bune le-a prezentat, la toate cele 3 tulpini, varianta de mediu cu extract de compost, V5 : mediu cu extract de cartofi 2,4% + extract de malț 1,7% + extract de compost 50 ml /L + agar 2%

Cea mai mare valoare a ratei de creștere a miceliului a fost înregistrată la tulpina PeM-41: 32,66 mm pe varianta cu extract de compost V5, depășind varianta martor Pe-M39/V₀ (17,83 mm) cu 14,83 mm (183%), rezultat foarte semnificativ asigurat statistic.

A doua etapă a procedeului de propagarea/subcultivarea submersă a miceliilor în mediu lichid, conform invenției, pentru utilizare ca inocul/miceliu lichid sau pentru obținerea de biomasă miceliană/fungică constă în următoarele:

- se prepară extractul de compost pentru ciupercile Agaricus bisporus, conform invenției;

- se prepară mediul de cultură lichid: extract de cartof 2,4% + extract de drojdie 2 g/L + K2HPO4 1 g/L + extract de malț 2 g/L + fructoză 10 g/L + extract de compost 50 ml/L; se aduce indicele pH la valoarea de 6,5;

- mediul lichid preparat se repartizează în flacoane Erlenmeyer închise cu dop (vată/polipropilenă);

- flacoanele cu mediu se sterilizează în autoclav 20 min la 121 °C;

- flacoanele cu mediul sterilizat se scot din autoclav și se lasă să se răcească într-o incintă sterilă;

- după răcirea lor sub 28°C, flacoanele cu mediu lichid sunt inoculate la hota cu flux laminar cu miceliu provenit din culturile-mamă pregătite în etape anterioară, respectiv cu câte 4-5 fragmente rotunde de miceliu recoltate cu preduceaua de 0 5 mm (pot fi și mai mari) din marginile coloniilor miceliene ale culturilor-mamă; pot fi utilizate și mai multe fragmente de inocul, în funcție de capacitatea/volumul flacoanelor cu mediu lichid utilizate;

- flacoanele cu mediu lichid inoculat sunt incubate pe agitatorul orbital cu 100 rpm la întuneric timp de 14 zile, la 25-27°C;

- pe toată perioada incubării sunt efectuate observații privind creșterea și morfologia maselor miceliene submerse;

- pentru obținerea și evaluarea biomasei rezultate la sfârșitul perioadei de creștere activă a miceliilor tulpinilor testate, acestea sunt, mai întâi, separate de lichidul din flacoane prin filtrare;

io

- biomasa obținută se spală de mai multe ori cu cu apă distilată;

- biomasa este apoi deshidratată (uscată) la etuvă timp de cca. 36 ore la 40°C, până când masa cântărită rămâne constantă; un alt procedeu este cel al liofilizării;

- prin cântărire la balanță se determină, pentru fiecare probă greutatea biomasei înainte și după uscarea la etuvă;

- rezultatele obținute în urma evaluării cantitative a biomasei fungice, proaspătă și uscată, sunt înregistrate ca atare - raportate la cantitatea de mediu lichid din vasul/flaconul de cultivare sau, aceste valori se pot raporta la 1000 ml mediu.

In fig 7 și 8 este redat efectul extractului de compost asupra creșterii miceliilor de P.eryngii în cultură submersă pe medii nutritive lichide (foto).

Efectul adăugării extractului de compost comparativ cu influența altor surse de C și N în compoziția mediilor lichide verificate în cadrul experimentelor întreprinse este bine reprezentat în graficul din fig. 6.

Varianta de mediu lichid V₇ ( mediu cu extract de cartof 2,4% + extract de drojdie 2 g/L + K2HPO4 1 g/L + extract de malț 2 g/L + fructoză 10 g/L + extract de compost 50 ml/L), singura la care mediul nutritiv a fost suplimentat cu extract de compost, a susținut creșterea cea mai mare pentru biomasa miceliană a ambelor tulpini de P.eryngii verificate.

Cel mai bun rezultat a fost realizat de tulpina PeM-41 pe varianta de mediu nutritiv lichid V7, cantitatea medie de biomasă uscată obținută după 14 zile de incubare și raportată la 1000 ml soluție nutritivă fiind de 7,029 g, cu un surplus de 4.25 g (152,93%) față de martorul PeM-41/V1, care a dat doar 2,779 g în condițiile experimentale. Adăugarea extractului de compost (50 ml/L) asigură variantei PeM41/V7 un surplus de biomasă uscată de 1,082 g/L (18,15%) față de varianta similară, dar fără extract de compost, PeM-41/V6.

Claims (3)

REVENDICĂRI

1 - Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro, caracterizat prin aceea că se prepară un extract de compost pentru ciupercile Agaricus bisporus folosind 200 g compost gata preparat și măcinat cu particule mm; care se lasă la macerat într-un vas cu 2.0 I apă distilată timp de 4 ore la temperatura de 25°C, amestecându-se de 2-3 ori; acesta se strecoară prin sită fină, iar lichidul rezultat se filtrează la vid; depozitul solid rămas se resuspendă în 0,5 I lichid din prima extracție și se fierbe 10 min; se filtrează din nou, iar lichidul rezultat se amestecă împreună cu primul; extractul obținut poate fi păstrat 1-2 zile la frigider ( 2-4°C) ca supliment organic complex și se folosește atât în etapa obținerii și propagării culturilor-mamă pe medii agarizate cât și în etapa tehnologică a propagării/subcultivării submerse a miceliilor, în mediu lichid, pentru utilizare ca inocul/miceliu lichid sau pentru obținerea de biomasă miceliană/fungică.

2 - Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că pentru cultura-mamă pe mediu nutritiv cu extract de compost se procedează astfel.

- se prepară extractul de compost pentru ciupercile Agaricus bisporus;

- se prepară mediul de cultură solid (agarizat): extract de cartofi 2,4% + extract de malț 1,7% + extract de compost pentru ciupercile Agaricus bisporus 50 ml /L + agar 2%;

- mediul nutritiv se aduce la valoarea de pH 6,5 și se repartizează în flacoane de 500/1000 ml cu dop care se sterilizează în autoclav 20 min la 121°C;

- mediul sterilizat se scoate din autoclav și se repartizează în plăci Petri (0 90 mm), cîte 15-18 ml mediu/placă; operațiunea se execută în condiții sterile la hota cu flux de aer laminar filtrat;

- după 24 ore, plăcile Petri cu mediu solid agarizat sunt inoculate, la hota sterilă cu flux laminar: în mijlocul fiecărei plăci Petri se dispune câte un fragment rotund de inocul cu 0 5 mm recoltat de la marginile coloniilor miceliene ale culturilor-stock din colecție;

- plăcile inoculate sunt incubate timp de 10-12 zile la 25-27°C (incubator/termostat), până când miceliile în creștere acoperă întreaga suprafață a mediilor de cultură; rata de creștere a miceliului este de 183%, pe varianta cu extract de compost față de varianta mart, după 7 zile de la inoculare la temperatura de 25 -27 °C.

3 - Procedeu biotehnologic de optimizare a ratei de creștere a miceliior din tulpini de Pleurotus eryngii pentru sporirea cantității de biomasă miceliană obținută in vitro, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că pentru propagarea/subcultivarea submersă a miceliilor în mediu lichid se procedează astfel:

- se prepară extractul de compost pentru ciupercile Agaricus bisporus,

- se prepară mediul de cultură lichid: extract de cartof 2,4% + extract de drojdie 2 g/L + K2HPO4 1 g/L + extract de malț 2 g/L + fructoză 10 g/L + extract de compost 50 ml/L și se aduce indicele pH la valoarea de 6,5;

- mediul lichid preparat se repartizează în flacoane Erlenmeyer închise cu dop (vată/polipropilenă);

- flacoanele cu mediu se sterilizează în autoclav 20 min la 12ΓΟ; se scot din autoclav și se lasă să se răcească la o temperatură sub 28°C într-o incintă sterilă;

- flacoanele cu mediu lichid sunt inoculate la hota cu flux laminar cu miceliu provenit din culturile-mamă pregătite conform revendicării 2, respectiv cu câte 4-5 fragmente rotunde de miceliu recoltate cu 0 5 - 10 mm din marginile coloniilor miceliene ale culturilor-mamă;

- flacoanele cu mediu lichid inoculat sunt incubate pe agitatorul orbital cu 100 rpm la întuneric timp de 14 zile, la 25-27°C;

- miceliile tulpinilor testate sunt separate de lichidul din flacoane prin filtrare;

- biomasa obținută se spală de mai multe ori cu cu apă distilată;

- biomasa este apoi deshidratată (uscată) la etuvă timp de cca. 36 ore la 40°C, până când masa cântărită rămâne constantă; sau este liofilizată ;

- rata de creștere a cantității de biomasă uscată este de 152,93% raportată la 1000 ml soluție nutritivă față de varianta martor.