RO112247B1

RO112247B1 - Metoda de tratare a materialelor

Info

Publication number: RO112247B1
Application number: RO93-01343A
Authority: RO
Inventors: Helge Bakkatun Castberg; Karin Bergmann; Peter John Hyde; Montgomery Karen Margaret Ness; Christopher John Stanley
Original assignee: Elopak Systems
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1992-04-13
Publication date: 1997-07-30
Also published as: NO933667L; AU1547392A; DE69232350D1; HU9302868D0; IN178104B; AU665533B2; BR9205883A; CZ284200B6; IE70662B1; SK110893A3; SK280916B6; EP0579679A1; US5744094A; PL170455B1; DK0579679T3; EP0579679B1; FI934485A; NO933667D0; NO307455B1; KR100219019B1

Description

Invenția se referă la o metodă de tratare a materialelor, în special, a ambalajelor, folosind radiații ultraviolete laser UV laser.

Se cunoaște că sterilizarea ambalajelor, spre exemplu, suprafața interioară a cutiilor de carton, se face în mai multe feluri, folosite împreună sau separat. Un procedeu este cel de a folosi căldura, de exemplu, sub forma aerului fierbinte sau a aburului, la o temperatură mai mare de 1OO°C, timp de câteva secunde. Alt tratament constă în folosirea radiațiilor UV de lungime de undă bactericidă (de exemplu, 254nm) oferind o densitate medie a puterii de iradiere în tratamentul suprafeței de ordinul a câtorva mW/cm², de exemplu 8 mW/ cm², timp de mai multe secunde. Un tratament ulterior constă în folosirea unei soluții relativ concentrate de H₂0₂timp de câteva secunde. Combinarea a două sau mai multe tratamente este un lucru uzual și îndreptățește reducerea parametrilor tratamentelor, cum ar fi temperatura, durata tratamentului și/ sau concentrația H₂0₂. Spre exemplu, W0-A-80/01457 face cunoscută o metodă de sterilizare aplicabilă lichidelor, de exemplu, apele reziduale și apele de răcire de la fabricile de conserve, dar mai ales sterilizării suprafețelor, de exemplu, suprafața pereților și mobila din spitale sau suprafața containerelor de alimente. Acestea din urmă sunt tratate cu o soluție de H₂0₂ cu concentrația nu mai mare de 10% în greutate, de pildă, prin trecerea containerului sau a materialului din care se va fabrica containerul printr-un rezervor conținând soluția de H₂0₂ sau prin pulverizarea soluției respective pe suprafețele containerului sau ale materialului. Iradierea este realizată cu o lampă UV plasată astfel, încât containerele sau materialele care au ieșit din rezervor sau de la pulverizator să fie supuse la radiații UV în tot spectrul sau predominant sub 325 nm, astfel ca microorganismele să fie distruse prin sinergismul dintre UV si H₂0₂.

Folosirea radiației UV ca agent fizic pentru reducerea cantității de microorganisme este bine stabilită. ADN-ul celular absoarbe energia radiațiilor între 250 și 260 nm, ceea ce conduce la formarea legăturilor chimice dintre bazele nucleotidelor tip timină adiacente. Aceasta distorsionează structura ADN, interferând cu replicarea și reproducerea și deci, și cu noțiunea de gene. Evenimentul este inevitabil dacă genele esențiale sunt blocate sau dacă replicarea ADN este frânată. Numărul celulelor vegetative distruse cu radiații UV depinde de expunere și doza în mW/cm²și mJ/cm², respectiv, iar radiațiile UV sunt adesea ineficace în distrugerea endosporilor bacterieni, mai ales din cauza slabei puteri de penetrare a radiațiilor UV. Folosirea combinată a radiației UV, a peroxidului de hidrogen (radicalul peroxid reacționează cu majoritatea legăturilor chimice) și a căldurii, realizează sterilizarea, dar la un preț ridicat ca timp și cost (de exemplu, cel puțin 10 secunde timp de tratare per carton) pentru ambalare. De asemenea, folosirea unei substanțe chimice, ca, de pildă, H₂0₂, pentru tratarea ambalajelor de alimente are implicații etice și este privită ca o alternativă mai puțin dorită. Este deci de interes căutarea unui sistem alternativ de sterilizare.

WD-A-88/03369 face cunoscut un sistem pentru sterilizarea unor medii precum aerul, apa, alimente variate și ambalaje alimentare prin intermediul unor pulsuri intermitente, foarte intense, cu durata foarte scurtă de lumină de frecvențe din vizibil și din domeniul apropiat, cum ar fi lumina produsă de lămpile pentru flash. Componentele fiecărui puls acoperă un domeniu spectral larg și pot include radiații din UV îndepărtat și apropiat pentru dezactivarea microorganismelor prin efecte fotochimice. Asemenea pulsuri abundente în radiații UV au cel puțin 15% și de preferat cel puțin 30% din energia lor la lungimi de undă inferioare valorii de 300nm. Astfel de pulsuri bogate în radiații UV pot avea, de obicei, o densitate totală a energiei relativ coborâtă, din domeniul de la

RO 112247 Bl cca.0,01 la 15J/cm² și în mod obișnuit de la 0,1 la 3J/cm² Cu toate acestea, pentru tratarea suprafeței produselor alimentare, poate fi de dorit să se filtreze porțiuni din spectru, astfel, încât cel puțin cca. 90% din energia radiațiilor să fie distribuită între 300 și 2500nm. în astfel de metode în care componenta UV a impulsurilor luminoase de tip flash este suprimată sau substanțial eliminată, intensitatea luminii pulsatorii trebuie să fie suficientă spre a încălzi un strat superficial din aliment sau din ambalaj cu o grosime de mai puțin de 10 μ de la cel puțin 50°C, până la o temperatură de cel puțin 75°C sau, de preferat, de cel puțin 100°C.

EP-A-0201650 descrie un sistem pentru dezinfectarea cu laser a fluidelor, în care un fascicul laser ce radiază lumină din domeniul UV este direcționat asupra unui flux de fluid de tratat. Sistemul este aplicabil mai ales la tratarea apei și folosește un laser pulsator cu gaz, viteza emiterii pulsurilor și deci intensitatea medie a luminii UV putând fi ajustate. Fasciculul UV acoperă întreaga secțiune transversală a fluxului de apă. Viteza (frecvența] emiterii pulsurilor poate varia de la lentă până la foarte rapidă, astfel, încât fasciculul să pară continuu și este ajustată în funcție de schimbările debitului de apă ce curge perpendicular pe fasciculul laser și poate fi ajustată, de asemenea, în funcție de turbiditatea apei. Alternativ, debitul de lichid poate fi variat, iar intensitatea fasciculului UV menținută constantă. Una sau mai multe suprafețe ale conductei care ghidează fluidul pot fi făcute relativ puternic reflectorizante față de radiațiile UV, astfel, încât să limiteze împrăștierea fasciculului datorită particulelor în suspensie în apă și să scadă aria secțiunii transversale a fasciculului spre a compensa alterarea fasciculului, astfel, încât să se mențină o intensitate aproximativ uniformă de-a lungul regiunii în care fasciculul și fluidul interacționează. Unghiul de penetrare al fasciculului în fluid poate fi ajustat în funcție de schimbările turbidității apei.

Mai mult încă, geometria fasciculului și în special lungimea sa, pot fi schimbate ca răspuns la schimbarea caracteristicilor apei, cum ar fi conținutul în substanțe organice. Este de preferat un laser excimer cu fluorură de kripton ce produce o lungime de undă de 249 nm.

US-A-3817703 se referă la o metodă pentru distrugerea materiei vii aflate în suspensie într-un material ce transmite lumina. El relevă posibilitatea sterilizării simultane a containerelor și a materialelor stocate în ele prin direcționarea unui fascicul laser către container, astfel, încât fasciculul să vină în contact cu toată suprafața interioară a containerului în timpul procesului de sterilizare și prin aceasta să supună întreg materialul din container la razele de lumină. Materia vie aflată ca suspensie în materialul iradiat sau depusă pe pereții interiori ai containerului este distrusă prin aceasta. Se folosesc una sau mai multe oglinzi cu poziție variabilă pentru a determina o baleiere a containerului printr-unul sau mai multe fascicule laser.

US-A-3941670 relevă folosirea unui laser IR a cărui țintă poate fi baleiată de către fasciculul laser prin oscilația unei oglinzi. Lumina schimbă activitatea biologică a speciilor macromoleculare prin excitarea stărilor vibraționale și rotaționale ale speciilor iradiate. Pot fi sterilizate diferite ținte, spre exemplu, aerul sau alte fluide, materiale plastice sau metale, cum ar fi o bandă sau o panglică din folie de aluminiu.

DE-A-2914075 prezintă un sistem pentru sterilizarea suprafețelor interioare ale cutiilor de carton preformate și împăturite. Surse UV, spre exemplu, lămpi verticale cu vapori de mercur se pot insera de sus în jos în interiorul cutiilor respective, la diferite poziții relative față de pereții laterali ai cutiilor, astfel, încât fiecare carton primind pe rând sursa UV, radiații UV de intensitate suficientă cad pe diferitele suprafețe disponibile, create de partea inferioară și de laturile laterale ale cartonului. Un

RO 112247 Bl anumit aranjament permite îmbinarea sterilizării prin UV cu sterilizarea prin căldură, astfel, încât să se elimine drojdiile și mucegaiurile. Q astfel de sterilizare termică poate fi realizată cu aburi sau prin iradiere, și anume cu surse de radiații infraroșii, ce sunt similar introduse în cutia de carton, înainte sau după iradierea cu surse UV.

Metoda, conform invenției, prezintă un mod de tratare a suprafețelor interioare ale unor tipuri de ambalaje și anume ambalaje din carton, protejate la interior cu o folie de polimer, folosind radiații laser UV, cu lungime de undă bactericidă.

Radiația laser UV poate fi însoțită ulterior sau simultan, de o radiație infraroșie IR sau laser IR. Folosirea radiațiilor laser UV și IR, (sau laser IR), are un efect sinergetic din punct de vedere bactericid.

în scopul de a putea înțelege pe deplin invenția și a o aplica ușor, se vor face referiri, în cele ce urmează, la următoarele figuri:

- fig. 1, prezintă sub formă de diagramă aparatul folosit pentru expunerea benzilor de testare la radiații laser UV, și

- fig.2 și 3, prezintă schematic două sisteme alternative folosibile în obținerea unei distribuții substanțial uniforme a energiei laser UV pe suprafața unei cutii de carton cu capacul deschis.

Este desigur bine cunoscut faptul că suprafețele termoplastice ale ambalajelor, spre exemplu suprafețele unor straturi subțiri polimerice, sunt deosebit de sensibile la încălzire. Cu toate acestea, s-a constatat că folosind radiații laser UV, este posibilă iradierea acestor suprafețe cu o densitate de putere medie mai mare decât 1 W/cm², cu valori convenabile în domeniul dintre 4 W/cm² și 10 W/cm², fără a afecta suprafața materialului termoplastic. Valori convenabile ale densității de energie sunt superioare celei de 50 mJ/ sec/cm², aplicate mai puțin de 10 s.

Este, de asemenea, posibil să se întrebuințeze radiații UV, indiferent dacă sunt radiații laser sau nu, pentru a steriliza un material și în același timp să se folosească radiații IR, indiferent dacă sunt radiații laser sau nu, pentru a încălzi acel material, încălzirea materialului servind scopului de a promova o sterilizare mai rapidă și/sau scopului de a face materialul să devină vâscos sau topit pentru sigilare și/sau scopului de a suprima spuma formată în interiorul ambalajului, pe durata umplerii. Aplicarea în acest mod a radiațiilor IR și UV este fie simultană fie cu suprapunere pe o durată limitată de timp.

Spre a obține o densitate relativ ridicată a puterii, radiațiile UV și/sau IR pot fi focalizate pe un spațiu pe care execută ulterior o baleiere, de exemplu prin folosirea unor oglinzi. Radiațiile IR și/sau UV pot fi difractate printr-o hologramă generată de un computer, astfel încât să se obțină o densitate de putere relativ uniformă pe suprafața tridimensională ce trebuie tratată. Deși un aspect important al invenției este folosirea doar a radiațiilor laser UV pentru sterilizarea suprafețelor solide, apa oxigenată poate fi folosită împreună cu radiațiile laser UV (și laser IR) spre a produce sterilizarea. Se va arăta în exemplele de realizare că folosirea radiațiilor laser UV combinate cu H₂0₂ are un efect sinergetic din punct de vedere bactericid.

Din exemplele de realizare se observă, de asemenea, că, la nivele tot mai ridicate ale densității de microorganisme, apare o cădere relativ bruscă a viabilității metodei de sterilizare, prezentând așa-numitul efect “de palier”.

S-a constatat că radiațiile UV în impulsuri sunt deosebit de avantajoase, mai ales datorită unei eficiențe mărite în sterilizarea suprafețelor solide, prin comparație cu radiațiile UV continue.

Lungimile de undă folosite din domeniul UV se află de preferință în domeniul dintre 150 și 320 nm, mai avantajos între 240 și 280 nm, spre exemplu, aproximativ 250 nm. Lungimea de undă a radiației IR utilizată este de

RO 112247 Bl preferință în domeniul dintre aproximativ 1OOO și aproximativ 10000 nm.

Folosirea unui laser pentru a furniza UV, spre deosebire de o lampă emițătoare de UV cu propietăți germicide s-a dovedit că prezintă următoarele avantaje:

1. Densități absolute de energie relativ ridicate;

2. O divergență scăzută, fascicul de ieșire perfect direcționat, ceea ce îl face deosebit de convenabil pentru tratarea unor anumite suprafețe în interiorul cutiilor de carton, acolo unde contaminarea poate fi considerabilă, spre exemplu, la colțuri sau la îmbinări.

Pentru înțelegerea metodei, se dau, în continuare, câteva exemple de realizare:

Exemplul Ί. /. 1. Materiale și metode

Organismul ales pentru investigarea tratamentului cu laser a fost bacteria ce poate forma endospori: Bacillus subtilis var. globigii. Această bacterie este clasificată drept Gram pozitivă, aerobică, cu formă de baghetă, mobilă și este non-patonegă. Ea este omniprezentă ca habitat și poate fi găsită în sol, fecale, fân, lapte și apă. Formarea sporilor permite bacteriei să supravețuiască în stare latentă (dormitând și variabilă) un timp îndelungat și o face deosebit de importantă prin faptul că sistemele de sterilizare sunt capabile să ucidă acești endospori. Deoarece sporii sunt rezistenți la temperaturi de peste 100°C și la alți agenți distructivi (chimicale), ei reprezintă indicatori utili ai eficienței sterilizării și sunt regulat folosiți pentru a urmări sterilizarea chimică și tratamentele termice. Testele microbiologice standard și cercetările microscopice sunt folosite în testarea probelor pentru evaluarea noii proceduri de sterilizare. Identificare a sporilor sub microscop este facilitată de înalta lor refringență și susceptibilitatea redusă de a fi colorate și de reacția lor specifică la anumiți coloranți.

în studiu s-au folosit drept martori un material de carton (un strat de hârtie groasă laminat cu straturi de polietilenă, cu sau fără un strat despărțitor din folie de aluminiu) și o suspensie de spori de Bacillus subtilis var. globigii obținută de la Elopak A/S din Norvegia. □ a doua cultură bacteriană (NCIMP 8649) a fost folosită spre control împreună cu cultura mai sus, menționată, servind drept confirmare independentă a speciilor. Metodologia este împărțită în trei etape principale, și anume: acoperirea benzilor-test cu bacterii împreună cu toate procedurile preliminare acestei acoperiri, expunerea benzilor la radiațiile laser UV și analiza ulterioară a acestor benzi.

1.2.1. Prepararea de dinaintea expunerii la radiațiile laser

Un sistem test a fost dezvoltat pentru depunerea culturii pe carton sub forma unor benzi de testare, insistând pe sterilitatea acestor benzi înainte de acoperire și pe plasarea specifică a bacteriei pe suprafața sterilă, astfel, încât sterilitatea benzilor să fie asigurată.

1.2.1. a. Sterilizarea cartonului

Cartonul a fost tăiat cu lame de bisturiu pentru a forma piese test de 6cm² și 2cm². Aceste benzi test au fost expuse la diferite tratamente de sterilizare:

- peroxid de hidrogem 35%, 1 ml/bandă-test, timp de 2 min;

- peroxid de hidrogen 2%, ml/bandă-test, timp de 2 s și timp de min;

- sterilizare cu abur într-o autoclavă la 121°C, timp de 20 min.

Toate benzile au fost lăsate să se usuce bine înainte de aplicarea stratului de cultură bacteriană și un număr de benzi sterile au fost puse de o parte ca martori.

Benzile sterilizate au fost ținute în săculeți de autoclavă - la temperatura camerei până la 4 zile înainte de a fi folosite. Benzile test acoperite au fost stocate în cutii Petri la 4°C, până la 4 zile.

1.2.1 b. Cultura și identificarea speciilor bacteriene

Bacillus subtilis var. globigii sub formă de suspensie de spori a fost culRO 112247 Bl tivat într-un bulion nutritiv (extract de vită, peptonă, apă, pH 6,8], crescut la 37°C și cercetat 24 h mai târziu. Metoda standard a plăcuțelor a fost folosită pentru izolarea coloniilor și pentru efectuarea unor numărători viabile. Bulionul nutritiv și apa distilată sterilă au fost folosite, în funcție de metoda aleasă în realizarea plăcuțelor (lamelelor). Agarul nutritiv (extract de vită, peptonă, agar pH 6,8] a servit drept mediu solid pentru creșterea organismului. Observarea s-a făcut vizual, ca și numărarea coloniilor după 36 h de incubare la 37°C. Culturile pure au fost folosite pentru prepararea frotiurilor și pentru procedurile ulterioare de colorare diferențială. Coloranții folosiți au fost colorantul Gram și colorantul pentru endospori Ziehl-Nielsen, iar lamelele colorate au fost analizate cu un microscop optic (10x100).

1.2.1. C. Depunerea bacteriei pe benzile de testare

Alicote de 1OO pl dintr-o diluție progresivă a culturii de pornire având 10³ și 10⁶ ufc/ml în apă distilată au fost în mod aseptic turnate pe o bandă test sterilă din carton, împrăștiate și lăsate la uscat timp de câteva ore. Banda test a fost ținută acoperită în cutie sterilă pe durata timpului de uscare, la temperatura camerei și apoi a fost ținută la 4°C. S-a dat o mare atenție menținerii cutiei Petri în poziție stabilă, pentru a evita contaminarea accidentală a părților laterale nelaminate ale cartonului, la răsturnarea cutiei.

Câte o bandă test dintr-o serie de diluții și două benzi sterile au fost plasate separat în 10 ml de bulion nutritiv și creșterea a fost cercetată după 36 h, la 37°C. Turbiditatea a fost apreciată vizual și urmată de depunere a unui strat format din 100 pl din mediul de creștere peste plăcuța nutritivă cu agar, operațiune urmată la rândul ei de o nouă perioadă de incubare de 36 h, la 37°C; observarea frotiurilor a fost făcută apoi, conform procedurii descrise mai sus.

1.2.2. Expunerea benzilor test la radiații laser UV

Laser folosit (a cărui apertură este desemnată prin Q în schema din fig. 1 a diagramelor însoțitoare) a fost un laser excimer Questek Seria 2000 ce fncționează cu o tranziție a fluorurii de Kripton (KrF) ce produce o radiație de 248 nm în UV. Laserul excimer este pulsator, producând pulsuri cu durată de 10-20 ns la frecvențe de repetare de câteva sute de herzi.

S-au folosit următorii parametri de operare:

Energia pulsului 200 mJ

Frecvența de repetiție: 100 Hz

Laserul emite un fascicul cu dimensiunile transversale de aproximativ 3x 2cm (orizontal x vertical).

Sistemul optic folosit este prezentat în figură. Densitatea de energie trimisă pe probă a fost variată prin schimbarea lentilei din silice topită L, și/sau a distanței d de la lentilă la masca M și astfel, a distanței de la lentilă la proba S.

Inițial, s-a folosit o lentilă cilindrică cu distanța focală de 25 cm pentru a extinde fasciculul pe dimensiune orizontală, producând o suprafață de iradiere de aproximativ 3x3 cm pe masca M. Densitatea de energie rezultantă pe probă per expunere a fost 40 mJ/cm², conducând la o densitate medie a puterii de 4 W/cm² la 100 Hz.

Spre a produce o densitate de putere mai ridicată pe probă, distanța până la probă a fost redusă și s-a redus corespunzător și dimensiunea probei de la 3x3 cm la 1x1 cm. Energia per expunere și densitatea medie a puterii au fost în această configurație de 130 mJ/cm² și respectiv 13 W/cm².Pentru a realiza densități de iradiere mai coborâte, lentila cilindrică a fost înlocuită printr-o lentilă sferică cu distanța focală de 20 cm.

Aria pe care cădea fasciculul peste probă depășea cu mult apertura măștii, conducând la energie per expunere și densitate medie de putere pe probă de 10 mJ/cm² și respectiv 1W/cm².

în toate cazurile, densitatea de energie a fost măsurată în planul aperRO 112247 Bl turii măștii. Blocul conținând proba a fost plasat la câțiva cm în spatele acestui plan. Cu toate acestea, diferența în expunere introdusă de acest fapt era mică, așa cum urma fasciculului era mică în comparație cu distanța d, a cărei valoare tipică era în domeniul 40-70 cm.

S-au folosit diferiți timpi de iradiere, în funcție de densitățile de energie și putere testate:

mJ/expunere/cm²: 1s și 6s mJ/expunere/cm²: 1 s și 6s 130 mJ/expunere /cm²: 15s Benzile test au fost montate folosind ace sterilizate pe o placă din lemn de balsa acoperită cu folie de aluminiu. Atât blocul, cât și folia au fost sterilizate cu abur timp de 20 min la 121°C, înainte de folosire. în funcție de mărimea benzilor de testare, douăsprezece până la șaisprezece benzi au fost tratate pe un singur bloc, blocul fiind montat pe un rastel de laborator pentru a asigura “baleierea”. Montarea probelor pe bloc a fost făcută în mod igienic, folosind un forceps sterilizat pentru fixarea benzilor.

Experiențele cu H₂0₂ au fost realizate după cum urmează:

a) s-au adăugat 100 pl sol.2% H₂0₂ peste banda test (câte una pentru fiecare diluație testată), s-au întins peste suprafața cartonului, s-au uscat prin încălzire și apoi au fost expuse razelor laser.

b] ca și a) dar nu s-a realizat uscarea prin încălzire înainte de expunerea la fasciculul laser - benzile test au fost montate între două plăci sterile din cuarț, tratate cu fasciculul laser și apoi uscate prin încălzire.

Încălzirea aplicată a fost de aproximativ 100°C, prin contactul plăcuței inferioare de silice cu o plită de laborator. în vederea procesului de uscare, plăcuța de silice de la partea superioară a fost îndepărtată.

1.2.3. Testarea sterilității benzilor test după tratamentul cu laser

Toate probele expuse fasciculului laser, inclusiv probele de control, au fost plasate imediat în containere universale separate, cu 10 ml de bulion nutritiv steril și incubate timp de 36 h, la 37°C. Sterilitatea a fost cercetată prin urmărirea turbidității soluției după perioada de incubare și urmată de o a doua cultivare pe plăci de agar nutritiv cu o a doua incubare de 36 h, la 37°C și creșterea a fost urmărită la microscop în prezența unui indicator colorant.

1.3. Rezultate

1.3.1. înainte de expunerea la fasciculul laser

Tratamentul de sterilizare a benzilor test a arătat că metoda autoclavei este procedura cea mai fiabilă și mai eficace.

Metoda uscării coloniei bacteriene pe benzile test a fost eficientă la creșterea unor colonii viabile pe probe preparate de cel mult 4 zile (benzi test mai vechi de 4 zile nu au fost testate).

Diluția în serie și metoda lamelelor aplicată ulterior au stabilit că, cultura bacteriană conține 2x10⁷ ufc (unități formatoare de colonii) per ml.(s-au folosit 5 plăci cu agar din fiecare serie de diluții pentru a stabili numărul mediu de colonii). Benzile sterile fără adaos bacterian, folosite pentru control pe toată durata studiului și indicatorii necesari aplicării cu succes a tehnicilor aseptice, s-a dovedit că rămân sterile în cele mai multe experiențe. în două cazuri în care cartoanele au fost în contact cu suprafețe nesterile, benzile test au fost puse la cultură și s-au identificat organisme Gram negative.

în toate experimentele, folosirea indicatorului Gram și colorarea endosporilor de Bacillus subtilis var. globigii au permis identificarea clară a organismelor ca fiind specii de Bacillus subtilis.

Clasificarea rezultatelor în sterile și nesterile a fost făcută fără ambiguitate, ca și diferențierea organismului testat de alți contaminați potențiali.

RO 112247 Bl

/. 3.2. Sumarul rezultatelor obținute după expunerea la radiații laser

Condiții de tratament laser ¹ —

Densitatea de putere (W/cm²)	Timpul de expunere	2% H_a0₂folosită?	Mărimea benzii test (cm x cm]	Numărul de repetări	Rata sterilizării după 36 h, și densitatea inițială de celule
13	15	nu	1x1	2 ori	1 la 10 ⁶
4	1	da	1x1	5 ori	1 la 10 ⁶
4	6	da	1x1	5 ori	1 la 10 ³ 3 la 10 ⁶
4	16	nu	1x1	2 ori	1 la 10 ⁶, 1 s 2 la 10 ⁶, 6 s
4	16	nu	2,5x2,5	2 ori	nici una
4	16	da	2,5x2,5	2 ori	2 la 10 ³, 6 s 1 la 10 ⁶, 6 s 1 la 10 ³, 1 s
4	16	da (cuarț)	2,5x2,5	2 ani	2 la 10 ³, 1 s 2 la 10 ^B, 6 1* la 10 ^e, 1 s 2 la 10 ³, 6 s
13	5	da (cuarț)	1x1	4 ori	4 la 10 ⁶ 3* la 10 ³
1	16	nu	3x3	5 ori	nici una

□ probă a fost contaminată cu mâna

1.4. Concluzii 30 serie de rezultate încurajatoare au fost obținute, demonstrând prin aceasta că distrugerea efectivă a microorganismelor poate fi realizată cu ajutorul radiațiilor laser în UV, Folosind o 35 densitate medie a puterii de 4/Wcm^a și un timp de expunere de 6 s, eficiența uciderii microorganismelor (definită ca numărul de benzi test sterile/numărul total de benzi test iluminate x 100) a 40 fost de aproximativ 30%. Includerea peroxidului de hidrogen în încercările asupra benzilor a îmbunătățit aceasta până aproape de 100%. Ar trebui menționat că rezultatul excelent obținut cu 45 H₂0₂ a fost realizat cu un timp de iluminare de numai o secundă.

Exemplul 2.11.1 .Introducere

Rezultatele exemplului I au fost o indicație privind acținea de succes a 50 laserului UV în uciderea unor micro organisme cum ar fi Bacillus subtilis. S-a arătat că duratele de iluminare cu laser de la o secundă la 6 s, la 40 mJ/expunere/cm² (4W/cm²) ucid între 1O³ și 1O⁶ celule bacteriale în câteva probe.

în exemplul de față, s-a investigat suplimentar aspectul cantitativ al procesului: câte microorganisme sunt ucise la un anumit tratament laser.

S-a testat un număr mare de probe pentru a urmări eficiența de distrugere a diferitelor proceduri de iluminare cu laser, acordând o atenție deosebită densității de putere și frecvenței de repetiție. Sensibilitatea procedurii de sterilizare cu lumină laser a fost măsurată prin observarea proporției de supraviețuire a bacteriilor după diferite tratamente.

Și alte aspecte experimentale au fost cercetare în acest stadiu.

RO 112247 Bl

Acestea sunt:

- cum afectează folia de dedesubtul benzilor căldura generată și cum afectează această căldură suplimentară, dacă ea este generată, potențialul ucigător al laserului.

- lemnul folosit pentru montarea benzilor generează oare o substanță care pătrunde în benzi și poate ajuta la distrugerea bacteriilor? Este oare această substanță, dacă e prezentă în sistem, activată prin tratarea în autoclavă și preluată de către benzi?

- oare bandă test generează ea însăși substanțe ce pot afecta viteza uciderii bacterilor? Căldura generată de către laser este oare necesară pentru uciderea bacteriilor?

- cum afectează reducerea densității de putere (W/cm²) și/sau reducerea frecvenței de repetiție (Hz) eficiența de ucidere a iluminării cu radiații laser UV?

II. 2. Materiale și metode în acest stadiu s-au folosit drept martori un material din carton (laminat cu folii de Al) și o placă de montare STUDLAND”. 0 suspensie de spori ai Bacillus subtilis var. globigii a fost folosită pentru a prepara o serie de diluții în apă distilată. Această serie de soluții tot mai diluate a fost sursa unor alicote turnate pe benzile test, ce au fost lasăte să se usuce și expuse la radiații laser UV.

Procedurile s-au împărțit în trei etape importante, și anume: acoperirea benzilor test sterilizate cu bacterii, expunerea benzilor la radiații laser UV și analiza ulterioară a benzilor.

11.2.1. Preparative Înainte de expunerea la radiații laser

Materialul de carton și placa au fost tăiate cu un bisturiu pentru a da benzi test de 1,3 cm x 1,3 cm. S-au folosit 18 benzi test per bloc din lemn de balsa (lemnul a fost acoperit cu folie de Al sau a fost lăsat descoperit). Plasarea benzilor pe lemn a fost făcută în trei rânduri și șase benzi per rând.

Toate benzile au fost menținute în poziția dorită cu o bandă de autoclavă astfel, încât numai 1 cm² din aria fie16 cărei benzi de carton a rămas expus. Fiecare bloc a fost plasat separat în câte un săculeț de autoclavă și supus autoclavizării la 121°C, timp de 20 min.

Alicote de 50 pl din fiecare diluție preparată (1Q¹, 10'² , 10’³, 10^-4] pornind de la o cultură inițială de Bacillus subtilis var. globigii a fost transferată în mod aseptic pe benzi și acestea au fost lăsate să se usuce în curent laminar de aer timp de câteva ore. S-au folosit pentru control două benzi per bloc, de exemplu,fără expunere la radiații laser UV și o bandă per bloc a fost folosită drept martor, de exemplu,pe ea nu s-a adăugat diluție bacteriană. Fiecare bloc din lemn de balsa cu benzile montate pe el a fost apoi readus la sacul steril pentru autoclavizare și sigilat până la tratamentul cu radiații laser UV.

Pentru a furniza linia de bază în raport cu care să se estimeze uciderea bacteriilor, numărul de unități formatoare de colonii depozitate pe benzi pornind de la diluții diferite a fost determinat printr-o metodă de spălare cu detergent după cum urmează:

benzile preparate cu o anumită diluție bacteriană au fost imersate într-o soluție 0,1% de Tween 20 (diluție făcută cu apă sterilă).

Eficiența de recuperare cu soluție de Tween 2Q a benzilor contaminate a fost comparată cu cea a apei sterile, astfel, încât să se poată stabili o dovadă a corectitudinii principiului ales.

S-au folosit și alte variante ale medodei spre a urmări efectul lor asupra numărului de bacterii, incluzând comparații între benzile montate pe lemn de balsa sau lăsate nemontate în cutii Petri sterile înainte de recuperarea cu detergent.

11.2.2 Expunerea benzilor test la radiații laser UV

Laserul folosit a fost același ca în exemplul I, dar a avut o energie mai mare a pulsurilor, de 250 mJ. Singurele variații introduse au fost frecvența de repetiție (Hz), timpul de iluminare și densitatea de energie folosite. Variațiile testate au fost reunite în coloana “ParaRO 112247 Bl metri ai laserului” din tabelul următor.

S-a folosit din nou o lentilă cilindrică de 25 cm spre a reduce dimensiunea verticală a fasciculului în scopul atingerii unei densități de energie de 40 5 mJ/expunere/cm². O lentilă cu distanța focală de 35 cm a fost folosită pentru a mări secțiunea transversală a fasciculului astfel, încât o densitate de energie mai coborâtă de 6 mJ/expunere/cm² să 10 poată fi realizată.

Pe un singur bloc s-au montat maximum 18 benzi, blocul fiind montat la rândul său pe un rastel de laborator de tip J pentru a permite baleierea. 15

Procedura de baleiere a fost realizată în condiții igienice, iar blocurile au fost plasate în saci de autoclavă sterili, după tratament. Sacii au fost sigilați și menținuți la temperatura camerei până 20 la începerea procedurilor analitice ulterioare. Pe majoritatea blocurilor au existat trei benzi care nu au fost iluminate cu radiații laser UV (două dintre aceste probe au fost folosite pentru control și 25 una, fără bacterii, a fost folosită drept martor).

III. 2.3 Proceduri ulterioare tratamentului cu radiații laser UV

Toate benzile montate au fost în 30 mod aseptic înlăturate de pe blocuri, introduse în sticluțe separate conținând 5 ml de diluant și agitate timp de minimum 30 s. 1OO pl din fiecare probă au fost pipetați pe plăci separate cu agar 35 nutritiv, marcate și incubate la 37°C, timp de minim 24 h.

Plăcile au fost examinate vizual pentru a urmări creșterea coloniilor și a le număra. 40

II. 3 Rezultate

II. 3.1 Rezultate preliminare expunerii laser

Procedura de întindere pe plăci de agar nutritiv a diluțiilor progresive a condus la un număr repetabil de colonii per concentrație bacteriană și a permis calcularea factorului de recuperare.

S-a găsit că cea mai bună metodă de a recupera bacteriile de pe benzi este agitarea în diluant timp de un minut. Recuperarea a variat între 50% și 90% din bacteriile de pe bandă. Experimentul cu diluții progresive a arătat că existau

1,5 x1O⁷ ufc/ml în cultura inițială.

Cele două tipuri de material testat nu au prezentat diferențe semnificative în vitezele de recuperare obținute. Experimentul cu benzi test montate pe lemn de balsa, prin comparație cu benzi rămase nemontate în cutii Petri nu a relevat vreo diferență în rezultate, excluzând orice efect chimic potențial exercitat prin suportul folosit.

II. 3.2 Expunerea post laser

Rezultatele experimentelor realizate înainte de expunerea la radiații laser, cum ar fi cercetarea substanțelor potențial bactericide din materialele folosite sau din lemn, au fost în continuare studiate cu benzi test supuse la iluminare laser UV, dar nu s-au observat efecte ale acestora. Orice efect potențial de încălzire asupra vitezei de ucidere a bacteriilor a fost deci eliminat atunci când intensitatea calorică a iluminării cu laser UV a fost redusă pentru a exclude efectele termice (durata timpului de expunere a fost ajustată pentru a obține același număr total de fotoni, de exemplu, 10 pulsuri pe secundă timp de 10 s în loc de 100 pulsuri într-o secundă).

//. 3.3 Sumarul rezultatelor din exemplul II

Parametrii laserului	Energia totală (J/cm²)	Numărul de probe^x	log_1Q Scădere^xx
40mJ/expunere/cm² 100 Hz, 1 s	4	36	>5,2

RO 112247 Bl

20

Continuare tabel

40mJ/expunere/cm² 30 Hz, 1 s	1,2	1	>5,2
6mJ/expunere/cm2 100Hz, 1 s	0,6	3	2,7
40mJ/expunere/cm² 2 Hz, 5 s	0,4	2	<1,0
40mJ/expunere/cm² 3 Hz, 1 s	1,2	2	3,3
6mJ/expunere/cm² 2 Hz, 5 s	0,06	3	1,8

x Fiecare probă are 1,5 x10⁵ spori pe 1 cm^s de suprafață a țintei *^x Definită ca log_1o (1,5 x 10⁵/numărul de supraviețuitori]

Folosirea unei densități de energie 15 de 55 mJ/expunere/cm² pe o durată mai mare de 2 s a condus la deteriorarea fizică a benzilor (formare de bășicuțe și înegrire).

11.4 Concluzii 20

Rezultatele experimentale demonstrează că eficiența distrugătoare a radiațiilor laser UV este dependentă de parametrii laserului folosit și de numărul de organisme bacteriene prezente, dar 25 este independentă de materialul substratului. Cei mai mulți din parmetrii testați ai laserului au avut o eficiență ridicată de ucidere, la numere de bacterii sub 10⁶ ufc. 30

Perioada de iluminare de o secundă la 40 mJ/expunere/cm², 100 Hz, a realizat o distrugere de 100% a unei concentrații bacteriene de 1,5x10⁵ufc. Eficiența ridicată de ucidere a colo- 35 niilor cu 1,5x10⁵ ufc la durate de iluminare de o secundă și energie relativ scăzută sau frecvență de repetiție relativ scăzută de 6 mJ/expunere/cm² la 100 Hz și 40 mJ/expunere/cm² la 3 Hz 40 este de o importanță deosebită pentru sterilizarea cartonului.

în scopul obținerii unei distribuții uniforme de energie pe întreaga suprafață interioară a cutiei de carton, cele 45 două sisteme ilustrate în fig. 2 și 3, oferă soluții posibile alternative, ce pot oferi distribuții de energie potrivite cu cerințele.

Cea dintâi, ilustrată în fig. 2, folosește o hologramă H generată de computer care difractă fasciculul de lumină UV după un model bine definit. Acesta constă dintr-o structură complexă de suprafață sau o rețea care este formată la suprafața unei bucăți de sticlă. Modelul respectiv necesită facilitățile oferite de un computer, care poate prevedea cum va interacționa lumina cu structura rețelei. Rețeaua este realizată prin acoperirea sticlei cu un fotorezist și transcriind modelul pe fotorezist cu un fascicul de electroni. Developarea fotorezistului înlătură suprafețele care au fost expuse fasciculului. Sticla este apoi atacată spre a reproduce modelul care era prezent în fotorezistul depus pe sticlă.

Cel de-al doilea sistem, ilustrat în fig. 3, folosește două galvanometre (nu sunt reprezentate) pentru a mișca oglinzile respective l\l, ce pot fi rotite în jurul axelor respective, deviind prin aceasta fasciculul incident de laser B. Combinarea celor două sisteme de baleiere permite fasciculului să fie direcționat după două axe. Adăugarea unui al treilea galvanometru (nu este reprezentat) controlând etapa (mișcarea) de translație, sau cu alte cuvinte o mișcare de focalizare F, poate fi folosită spre a varia distanța de separare dintre cele două lentile, schimbând astfel divergența fasciculului.

RO 112247 Bl

Trebuie observat că cele două sisteme se caracterizează printr-o diferență fundamentală. Holograma H trimite lumina simultan în fiecare punct al containerului C, în timp ce galvanometrul trimite lumina secvențial în diferite zone.

în plus, sistemul cu hologramă nu prezintă părți mobile.

Exemplul III.

III. 1 Introducere

Acest exemplu descrie baleierea întregii cutii de carton și, în mod special, metodele și testele microbiologice folosite în cercetarea activității și eficienței unei radiații laser UV pe un domeniu de energii laser și de concentrații bacteriene.

III. 2 Metoda

Principiul de bază de testare a constat din pulverizarea unor cutii de carton goale, cu capacul deschis, având capac cu profil triunghiular, de tip “ELOPAK” (marcă înregistrată] cu un anumit organism, iradierea cartoanelor cu radiații laser și cercetarea numărului de bacterii supraviețuitoare după iradiere.

///. 2.1 Organismul indicator

Organismul indicator folosit pentru teste a fost Bacillus Subtilis var. globigii. Pentru a asigura o rezervă suficientă de soluție de spori, 0,5 ml de probă a fost cultivată într-un bulion nutritiv și lăsată să crească la 37° C, timp de 48 h, după care s-a efectuat o centrifugare și o recoltare într-o soluție Ringers sterilă. Această soluție a fost lăsată la 4 °C, timp de minim șapte zile înainte de a fi folosită în experimente.

III. 2.2 Pulverizarea cartoanelor

Cele cinci suprafețe interioare ale cutiilor de carton au fost pulverizate cu organismul indicator. Dispozitivul de pulverizare folosit a fost un atomizor de mână care trimitea celulele în mod uniform pe suprafețele cutiei. Domeniul de concentrații bacteriene a fost între 10⁷și 10⁸ celule per cutie. Cartoanele pulverizate erau lăsate la uscat la temperatura camerei sub o hotă cu curent laminar de aer timp de maximum 18 h înainte de folosire.

III. 2.3 Detecția bacteriilor supraviețuitoare

Pentru a detecta bacteriile supraviețuitoare, s-a folosit un test de eluare (spălare).

III. 2.4 Montajul experimental

Suspensia de spori a fost diluată într-o soluție Ringers furnizând o serie de diluții cuprinse între 10'¹ și 1O⁸ față de soluția inițială.

100 pl din fiecare diluție a fost pipetată pe o placă cu agar nutritiv, care a fost marcată, apoi răsturnată și incubată la 37°C, timp de 24 h înaintea examinării vizuale a creșterii bacteriilor. Câte 2 ml din diluțiile bacteriene convenabile au fost pulverizate pe cutiile de carton folosite în încercări și lăsate să se usuce în condițiile descrise mai sus. Toate containerele de reactivi și cutiile Petri au fost sterilizate înainte de folosire și mânuite în mod aseptic sub CAL (curent de aer laminar). Soluția Ringers a fost autoclavizată de adăugarea de Tween 20.

Regularitatea pulverizării și numărul de celule depuse pe fiecare cutie de carton au fost cercetate prin încercări cu apă și deschiderea părților laterale ale cutiilor și a fost confirmată prin pulverizarea cu bacterii, peste care s-a depus un strat de agar, ca și prin testele de recuperare. înainte de folosire, pulverizatorul a fost curățit cu soluție 70% de etanol și lăsat să se usuce în CAL. Capacele cutiilor de carton au fost, de asemenea, preparate prin scufundare în soluție 70% etanol, urmată de o scurtă tratare cu etanol 100% și uscare ulterioară. După tratamentul cu etanol, câteva capace au fost testate cu bulion nutritiv pentru a verifica sterilitatea.

Fiecare experiment-test de spălare a inclus controale, asupra părților netratate, de exemplu, neiradiate cu laser, și cutii de carton nepulverizate cu spori bacterieni. Acestea din urmă au servit pentru controlul fondului contaminant. Cele mai multe experimente au inclus testarea a cel puțin două diluții bacteriene. Desfășurarea unui experiment tipic ar decurge astfel: 3 cutii de

RO 112247 Bl carton au fost stropite cu o diluție 1CT¹ a suspensiei de spori; 3 alte cutii de carton au fost stropite cu diluție 1O'² a suspensiei de spori.

Pentru diluția 1Q¹: cutiile 1, 2 și 3 au fost folosite în testul de spălare, cutiile 1 și 2 fiind testul și cutia 3 piesa de control, adică o cutie ce nu a fost iradiată cu laser.

Aceeași regulă a fost urmată pentru cartoanele stropite cu diluția de 10‘² din suspensia de spori.

Cutiile de carton au fost plasate (pe rând) într-un suport special pentru cutii, anexă a unității laser. După iradiere, cutia a fost dată la o parte de pe suport, acoperită cu un capac sterilizat, iar întreaga cutie transportată în CAL. Manipularea cutiei de carton într-un mediu non-steril a fost redusă la timpul minim, dar a implicat totuși un risc potențial de contaminare în momentul coborârii cutiei de pe suportul de iradiere și apoi pe durata mânuirii cutiei.

ml din soluția test de spălare au fost pipetați pe fiecare cutie test a spălării. Un capac sterilizat a fost așezat pe fiecare cutie, iar cutiile au fost viguros agitate de cel puțin 3D ori pe fiecare parte, apoi lăsate un timp scurt după care volumele de soluție au fost deșertate în containere universale sterile separate. □ serie de diluții au fost preparate din soluția astfel recuperată, folosind o soluție Ringers sterilă. 250 pl sau 500 pl din fiecare diluție și volumul net rămas au fost așezate pe plăci de agar nutritiv și incubate la 37°C, timp de 24 h.

III. 2.5 Detalii privind testele cu laser

Domeniul de energii testate a variat de la 1 ,□ Joule la 4,0 Joule per cm² cu timpi de iradiere de aproximativ 10 min (această durată, care este de 60 ori mai mare decât timpul rezonabil din punct de vedere comercial și anume 10 s per cutie, a fost aleasă din motive experimentale practice pentru a oferi o doză totală egală cu doza dezirabilă din punct de vedere comercial aplicată timp de 10 s). Fiecare cutie de carton a fost plasată în suportul de iradiere exact în aceeași poziție, cu numărul de cod tipărit al cutiei către partea posterioară a suportului. S-a încercat deschiderea totală a capacului cutiei de carton, dar în anumite cazuri acesta a rămas ușor înclinat. Procedura de iradiere a fost automatizată și controlată de computer.

III. 3 Rezultate

Testele inițiale făcute pentru cercetarea metodelor de testare au arătat că modalitatea de pulverizare a condus la o distribuție uniformă a bacteriilor și că testele de recuperare au condus în majoritatea experimentelor la un nivel al concentrației bacteriene identic cu cel inițial. în cele ce urmează se găsește o descriere a unor exemple tipice din metode individuale de testare urmate de un rezumat al celor mai semnificative rezultate experimentale.

III. 3.1 Seria de diluții

Pentru fiecare măsurătoare experimentală a fost preparată o serie de diluții ale stocului inițial de spori, cu scopul de a determina concentrația bacterială corectă în fiecare probă supusă testării.

III. 3.2 Testul de spălare

Rezultatele obținute cu diluțiile progresive au fost folosite pentru cuantificarea concentrației bacteriene pulverizate în cutiile de carton și pentru a urmări precizia testelor de recuperare. Un test de control al recuperării a fost inclus în fiecare șir de experimente și procentul de recuperare a fost calculat pentru fiecare concentrație bacteriană. După ce s-a stabilit că metoda de recuperare este corespunzătoare, s-a putut măsura eficacitatea iradierii laser în funcție de rezultatul înregistrat la recuperare, iar numărul actual de colonii recuperate în proba test a fost comparat cu numărul așteptat la concentrația bacteriană dată.

Rezultatele tipice privind recuperarea sunt ușor inferioare rezultatelor așteptate.

RO 112247 Bl

Exemplu de test de spălare:

Teste	Test de spălare proba 10‘¹	Control al spălării proba 10¹	Seria de diluții
pur	>200	complet	complet
10'¹	50	complet	complet
10²	4	greu de numărat	complet
10³	1	278	1315
10^	0	27	220

Exemplu de calcul: 15

Concentrația stocului inițial al coloniei de spori a fost calculată din rezultatele diluțiilor progresive: 220 de colonii la o diluție de 1O⁴ provenind din 100 pl probă pe placă, conduc la o con- 20 centrație inițială a stocului de 2,2x10'⁸

Diluția de 10‘¹ a acestei concentrații inițiale ar trebui să ducă la concentrația de 2,2x10⁷, dar deoarece, sau folosit 2 ml, concentrația depusă pe 25 carton a fost 4,4x10⁷.Recuperarea în 20 ml de soluție Ringers/Tween 20 și o alicotă de 100 pl pe placă înseamnă că orice rezultat de la testele de spălare trebuie multiplicat cu acești factori. 30 Proba de control a avut 278 colonii la diluție de 10’³ a volumului recuperat, astfel, încât concentrația recuperată se calculează ca 278 x IO³ x 10 x 20 =

5,6 x 10⁷. Aceasta diferă de concen- 35 trația de depunere prin 1,2x10⁷ ceea ce este o diferență nesemnificativă, indicând că nu apar probleme speciale cu metoda de recuperare. Actuala probă test iradiată cu laser a dat aproximativ 40 200 colonii pornind de la o alicotă de 100 μΙ preluată din 20 ml volum recuperat net, indicând astfel că în a ceastă probă au supraviețuit 4,0x10⁴colonii, conducând la log (scădere) <3,04 adică log (4,4 x10⁷ : 4,0x10⁴].

Pornind de la probă de 250 μΙ preluată dintr-un volum de spălare de 10 ml, factorul de calcul este x 40 (adică în x 4 x10], iar pentru proba de 500 μΙ preluată dintr-un volum de spălare de 10 ml factorul de calcul este x 20 (adică x 2 x 10).

Definiția mărimii log (scădere] este următoarea:

log_1o (număr de celule per cutie: numărul de celule supraviețuitoare per cutie],

III. 3.5 Date experimentale

Cutiile de carton pulverizate cu 10^10⁸ celule au fost expuse la 1,2 sau 4 Jouli/cm² de radiație UV și sporii supraviețuitori au fost determinați prin testul de spălare folosind 10 ml soluție de spălare și preluând 500 μΙ sau 250 μΙ pentru prepararea lamelelor. Vitezele de distrugere sunt date în tabelul următor.

III. 3.6 Sumarul rezultatelor

Volum test de spălare 1O ml/ probe de 500 pl sau 250 pl

încărcarea celule/cutie	Testul de spălare celule recuperate	Celule calculate în 10 ml	Energia J/cm²	log-io scădere
2,4x10⁷	80^x1	1,6x10³	1	4,18
2,4x10⁷	2,4x10^3x1	4,8x10⁴	1	2,7

RO 112247 Bl

28

Continuare tabel

2,4x10⁸	2,2x10^4x1	4,4x10⁵	1	2,7
1,3x10⁸	8,6x10^3x2	3,4x10⁵	1	2,58
1,3x10⁸	8,8x10^3x2	3,5x10⁵	1	2,57
1,3x10⁷	1,12x10^2x2	4,48x10³	1	3,46
2,6x10⁸	65^x2	2,6x10³	2	5,0
2,6x10⁸	1,44x10^2x2	5,76x10³	2	4,7
2,6x10⁸	85^x2	3,4x10³	2	4,9
2,6x10⁸	27^x2	1,08x10³	4	5,38
2,6x10^a	27,5^x2	1,10x10³	4	5,37

^<1(5OO μΙ) ^x2(25O μΙ]

III. 4 Concluzii

Iradierea cu 2 Jouli/cm² a condus la o valoare de 5 a mărimii log (scădere) a microorganismelor, iar dozarea și mai puternică de 4 Jouli/cm², la o valoare a log (scădere) chiar superioară lui 5. Rezumând rezultatele experimentale, următoarele idei pot fi expuse în concluzie:

- Baleierea cu laser UV a întregului interior al cutiilor de carton poate conduce la sterilizarea acestora;

- 2 Jouli/cm² conduc la valoarea 5 a mărimii log (scădere] pentru Bacillus subtilis var. globigii',

- Suprafața internă de 750 cm² a unei cutii de carton necesită, pentru a fi sterilizată, o energie de 1500 Jouli;

- Folosind un laser UV cu puterea de 150 W, ar fi necesare 10 s pentru a atinge valoarea 5 a mărimii log (scădere);

- Există posibilitatea de a folosi concentrații foarte scăzute de H₂0₂ în combinație cu iradierea laser, fie pentru a scădea nivelul de energie necesar fiecărui carton pe o anumită durată de timp, fie pentru a scădea timpul de iradiere per carton la același nivel energetic.

Exemplul IV. IV. 1 Introducere

Evaluarea cantitativă a vitezei de distrugere la combinarea unor radiații laser UV și laser IR (folosirea simultană] este obiectul cercetărilor din acest exemplu.

Montajul experimental a fost proiectat astfel, încât să se obțină informații suplimentare asupra căldurii dezvoltate în timpul expunerii și pentru a studia și separat efectul fiecăruia din tratamente.

IV. 2 Materiale și metode

S-a folosit drept martor un material din carton (laminat cu folie Al). Organismul indicator a fost Bacillus subtilis var. globigii. O soluție de spori de această origine a fost aplicată pe materialul de carton.

Testul a implicat existența a trei etape principale, și anume, acoperirea: suprafețelor de carton presterilizate cu bacterii, expunerea benzilor de carton la radiații și analiza ulterioară a sporilor supraviețuitori pe aceste benzi.

IV. 2.1 Preparative preliminare expunerii la radiațiilor laser

Cartonul a fost tăiat cu un bisturiu pentru a da benzi test de 2 cm x2 cm.

Diluții de 10 și 100 ori ale suspensiei inițiale de spori (conținând 4,5 x 10⁷ ufc/ml) au fost efectuate în soluții saline sterile (0,85% NaCI conținând și 0,02% Tween 20 pentru a facilita împrăștierea).

Aceste diluții conțineau 4,5x10⁶și respectiv 4,5x10⁵ ufc/ml.

Alicote de 100 pl din fiecare suspensie diluată au fost pulverizate pe benzile test pentru a da o încărcare a benzilor de 4,5 χ 10⁵ și respectiv

RO 112247 Bl

4,5x10⁴.

Benzile au fost lăsate să se usuce peste noapte la temperatura camerei. Unele dintre benzi nu au fost acoperite spre a fi verificată sterilitatea lor. După uscare, fiecare bandă a fost plasată întro cutie universală sterilă din plastic.

în timpul iradierii benzile au fost menținute în poziție verticală cu cârlige metalice presterilizate tip “buldog”.

IV. 2.2 Calibrarea laserilor

Laserul de infraroșu folosit în aceste teste a fost un laser cu C0₂ de 14W. El era controlat de o unitate care permitea pulsuri de radiații de până la

6,6 s și putere de ieșire variabilă între □ și 80% din puterea de ieșire totală.

Sistemul a fost calibrat prin măsurarea creșterii de temperatură a unei piese test din carton de aceeași mărime cu cele folosite în testele biologice. Temperatura a fost măsurată cu un termocuplu atașat la suprafața anterioară a plăcuțelor de carton.

Laserul IR a generat două pulsuri de câte 6,6 secunde cu putere de 80% (aproximativ 40 J/cm²].

Temperatura maximă a suprafeței ce putea fi atinsă la o iluminare frontală era 40 C. Aceasta era determinată de prezența unei folii subțiri de. aluminiu plasată în spatele unei acoperiri din polietilenă a feței respective a cartonului, ce reflectă o proporție semnificativă a radiațiilor IR, prevenind absorbția lor în interiorul plăcuței.

Laserul excimer folosit a fost un laser cu gaz folosind amestec de Kripton și Fluor și emitea o radiație cu lungimea de undă de 248 nm. Energia unui puls laser era aproximatov 300 mJ.Radiația laserului excimer incidență pe probă a fost calibrată folosind un detector plasat în spatele unei aperturi de 2 cm x 2 cm. Energia pulsului pe această apertură a fost 125 mJ. în acest fel s-a determinat că o densitate de energie de 1 J/cm² necesită 32 pulsuri.

IV. 2.5 Tratamente prin iradiere cu laseri

1. Numai UV 1,0 J cm'^2;

2. IR pe fața anterioară a car- tonului;

3. UV 1,0 J cm² și IR (fața anterioară), simultan;

4. UV 1,0 J cm'² urmat de IR (pe fața anterioară), câteva secunde mai târziu (2-3 s);

5. IR (pe fața anterioară) urmate de UV 1,0 J cm'² multe secunde mai târziu (30 s).

Control. Plăcuțele acoperite cu bacterii au fost lăsate neiradiate pentru a determina gradul maxim de recuperare. Plăcuțele neacoperite cu bacterii au fost expuse la atmosfera înconjurătoare timp de cca.30 s pentru a testa posibilitatea unei contaminări accidentale.

IV. 2.6 Determinarea bacteriilor supraviețuitoare

După iradiere, plăcuțele au fost imediat reașezate în sticlele lor și ținute peste noapte la 4°C.

în fiecare sticluță s-au adăugat 10 ml de soluție salină sterilă conținând 0,1% Tween 20. Sticluțele au fost viguros agitate timp de 30 s, după care plăcuțele de carton au fost înlăturate și îndepărtate. Au fost preluate câte două probe de lichid (100 pl sau 200 pl], în mod aseptic, și împrăștiate pe suprafața unei plăcuțe cu agar nutritiv. Anumite probe au fost supuse unei diluții în serie spre a efectua mai ușor numărarea coloniilor.

Plăcile au fost incubate la 37 C, timp de 24 h și apoi, au fost numărate coloniile. Pentru aceasta, numărul total de ufc din 10 ml de lichid de spălare a fost calculat mai întâi și apoi, numărul total de ufc înlăturate de pe carton.

IV. 3 Rezultate

Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor.

(IV. 4) Discuție Un fapt clar care rezultă din experiențe este acela că numai radiațiile IR nu ucid bacteriile. De asemenea, este clar că toate tratamentele folosind simultan radiații IR și UV la 1,0 J cm'²(numerele 3 și 4) conduc la valori mai mari ale mărimii log (scădere) prin comparație cu tratamentele cu radiații UV,

RO 112247 Bl cu radiații IR sau cu suma efectelor tratamentelor făcute cu UV și IR în mod separat. Putem deci trage concluzia că un efect sinergetic are loc atunci când se aplică simultan tratamentul cu radiații IR și UV.

Tratamentul	încărcarea ucf/ml	ucf recuperate	log (scădere]
1 (i) numai UV (ii)	4,7 x1O⁵	4,4x10³ 5,6x1O³	2,03 -1,98 1,92
2 (i) numai IR (ii)	4,5x10⁵ 4,5x1O⁵	0,02 -0,02 0,02
3 (i) UV și IR, simultan (ii)	2,4x10³ 1,3x10³	2,29 -2,43 2,56
4(i) UV-IR, secvențial (ii)	1,40x10³ 2,2x1O³	2,53 -2,43 2,33
5 (i) IR-UV, secvențial (ii)	7,2x10³ contaminat	1,81 -1,81

Revendicări

Claims

1. Metodă de tratare a materialelor, care face neviabile microorganismele de pe o suprafață solidă, cuprinzând iradierea suprafeței menționate cu radiații ultraviolete - UV cu o lungime de undă care este bactericidă, caracterizată prin aceea că microorganismele menționate sunt făcute neviabile printr-un proces care cuprinde iradierea suprafeței menționate cu radiații UV laser la o lungime de undă care este bactericidă.

2. Metodă, conform cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că densitatea de putere a radiației UV laser menționată, pe suprafața menționată, este produsă astfel, încât radiația UV laser să nu afecteze în mod vătămător suprafața solidă menționată.

3. Metodă, conform cu revendicarea 1 sau 2, caracterizată prin aceea că suprafața menționată este o suprafață de contact cu conținutul a materialului de ambalare.

20

4. Metodă, conform cu revendicarea 3, caracterizată prin aceea că suprafața de contact cu conținutul, menționată, este din material termoplastic.

5. Metodă, conform cu reven-

25 dicarea 4, caracterizată prin aceea că suprafața de contact cu conținutul este formată dintr-un strat subțire de polimer.

6. Metodă, conform cu oricare

30 din revendicările precedente, caracterizată prin aceea că procesul menționat include și iradierea suprafeței menționate cu radiații infraroșii-IR.

7. Metodă, conform cu revendi-

35 carea 6, caracterizată prin aceea că radiația IR menționată este radiație IR laser.

8. Metodă, conform revendicării 6 sau 7, caracterizată prin aceea că

40 suprafața menționată este iradiată cu radiația UV laser menționată și radiația IR menționată în mod simultan.

9. Metodă, conform cu revendicările 6, 7 sau 8, caracterizată prin

45 aceea că prin producerea sinergismului

RO 112247 Bl între radiația laser UV menționată și radiația IR menționată, microorganismele de pe suprafața menționată sunt făcute neviabile.

10. Metodă, conform cu oricare 5 din revendicările precedente în care suprafața menționată este tridimensională, caracterizată prin aceea că direcția și intensitatea radiației laser este controlată pentru a promova o in- 10 tensitate substanțial uniformă peste suprafața menționată.

11. Metodă, conform cu revendicarea 10, caracterizată prin aceea că radiația laser se aplică cu ajutorul 15 unei holograme (H) în scopul de a promova o intensitatea substanțial uniformă menționată, peste suprafața menționată.

12. Metodă, conform cu oricare din revendicările precedente, caracterizată prin aceea că procesul menționat include și aplicarea perhidrolului pe suprafața menționată și iradierea perhidrolului cu radiația UV laser menționată.

13. Metodă, conform cu revendicarea 12, caracterizată prin aceea că se produce sinergismul între radiația UV laser menționată și perhidrolul menționat pentru a face neviabile microorganismele de pe suprafața menționată.