PL170455B1

PL170455B1 - Sposób niszczenia drobnoustrojów na powierzchni ciala stalego PL

Info

Publication number: PL170455B1
Application number: PL92301005A
Authority: PL
Inventors: Helge B Castberg; Karin Bergmann; Peter J Hyde; Karen M M Ness; Christopher J Stanley
Original assignee: Elopak Systems; Elopak Systems Ag
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1992-04-13
Publication date: 1996-12-31
Also published as: NO933667L; AU1547392A; DE69232350D1; HU9302868D0; IN178104B; AU665533B2; BR9205883A; CZ284200B6; IE70662B1; SK110893A3; SK280916B6; EP0579679A1; US5744094A; DK0579679T3; EP0579679B1; FI934485A; NO933667D0; NO307455B1; RO112247B1; KR100219019B1

Abstract

1. Sposób niszczenia drobnoustrojów na powierzchni ciala stalego, w którym naswietla sie te powierzchnie promieniowaniem ultrafioletowym o bakteriobójczej dlugosci fali, zna- mienny tym, ze w procesie niszczenia drobnoustrojów powierzchnie naswietla sie ultrafio- letowym promieniowaniem laserowym o bakteriobójczej dlugosci fali. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób niszczenia drobnoustrojów na powierzchni ciała stałego, z wykorzystaniem naświetlania tej powierzchni ultrafioletem.

Znany jest sposób sterylizacji materiału pakowego, na przykład wewnętrznych powierzchni pudełek kartonowych, z zastosowaniem grzania gorącym powietrzem lub parą o temperaturze około 100°C, przez kilka sekund. W innym znanym sposobie stosuje się promieniowanie ultrafioletowe o bakteriobójczej długości fali, na przykład 254 nm. Zapewnia się przy tym średnią gęstość energii na naświetlanej powierzchni około 8 mW/cm², przez kilka sekund. Dla sterylizacji powierzchni stosuje się również roztwór H2O2 o stosunkowo wysokim stężeniu, przez kilka sekund. Korzystnie, znane metody stosuje się łącznie, co umożliwia zmniejszenie pewnych parametrów obróbczych, na przykład temperatury, czasu obróbki i/lub stężenia H2O2.

Na przykład w opisie patentowym nr WO-A-80/01457 przedstawiono sposób sterylizacji płynów, na przykład wody odpadowej i wody chłodzącej w fabryce konserw, a zwłaszcza do

170 455 sterylizacji powierzchni, na przykład powierzchni ścian w szpitalach i powierzchni pojemników na żywność. Powierzchnie pojemników na żywność poddaje się działaniu H 2 O2 o stężeniu nie większym niż 10% wagowo, na przykład przeprowadzając ten pojemnik lub materiał, z którego pojemnik ten będzie wytworzony, poprzez zbiornik zawierający roztwór H2O2. Można też stosować spryskiwanie powierzchni pojemnika lub materiału tym roztworem. Napromieniowanie powierzchni ultrafioletem o długości fali mniejszej od 325 nm, przeprowadza się za pomocą lamp ultrafioletowych tak rozmieszczonych, że pojemnik lub materiały, które wynurzają się z tego zbiornika lub rozpylonej cieczy są poddane ultrafioletowi, całkowicie lub w przeważającej części, czyniąc drobnoustroje niezdolnymi do życia, dzięki współdziałaniu pomiędzy ultrafioletem i H 2 O2.

Zastosowanie promieniowania ultrafioletowego jako czynnika fizycznego do redukcji drobnoustrojów jest znane. Komórkowy DNA pochłania energię promieniowania o długości fali pomiędzy 250 a 260 nm, co prowadzi do tworzenia chemicznych wiązań pomiędzy sąsiednimi zasadami nukleotydu - resztami tyminy. Zmiana ta zniekształca łańcuchy DNA, przeszkadzając w replikacji i transkrypcji, a w ten sposób w ekspresji genów. Umieralność komórek jest nieunikniona, jeśli istotne geny zostaną zablokowane, lub zostanie zahamowana replikacja dNa. Liczba komórek wegetatywnych zabitych promieniowaniem ultrafioletowym zależy od naświetlenia i dawki, odpowiednio w mW/cm 1 mJ/cm², a ultrafioletjest często nieskuteczny w zabijaniu przetrwalnika bakteryjnego, zwłaszcza z powodu słabej mocy przenikania ultrafioletu. W połączonym zastosowaniu promieniowaniaultrafioletowego, nadtlenku wodoru (rodnik nadtlenkowy reaguje z większością wiązań chemicznych) oraz ciepła, osiąga się sterylizację, ale przy wysokich kosztach.

W opisie patentowym WO-A-88/03369 przedstawiono sposób sterylizacji powietrza, wody, żywności i opakowań żywnościowych, za pomocą przerywanego, bardzo intensywnego impulsu światła o bardzo krótkim okresie trwania, w zakresie częstotliwości światła widzialnego i bliskich widzialnego. Światło takie jest wytwarzane na przykład przez lampy błyskowe. Składowe takiego impulsu pokrywają szeroki zakres spektralny i mogą obejmowć daleki i bliski ultrafiolet, dla dezaktywacji drobnoustrojów za pomocą efektów fotochemicznych. Takie impulsy bogate w ultrafiolet mają co najmniej 15%, a korzystnie co najmniej około 30% swojej energii w zakresie fal krótszych od 300 nm. Takie impulsy bogate w ultrafiolet mogą mieć zwykle stosunkowo niską całkowitą gęstość energii, w zakresie od około 0,01 do 15 J/cm2, a zwykle od około 0,1 do 3 J/cm2. Jednak do sterylizacji powierzchni produktu żywnościowego może być pożądane przefiltrowanie części tego widma tak, że co najmniej 90% jego energii jest rozłożone w zakresie fal o długości pomiędzy 300 a 2500 nm. W takich sposobach, w których składowa ultrafioletu błysków światła impulsowego jest tłumiona, lub całkowicie wyeliminowana, intensywność światła impulsowego powinna wystarczyć do nagrzania powierzchniowej warstwy artykułu spożywczego lub materiału pakowego mającego grubość mniejszą od 10 mikrometrów, od temperatury co najmniej 50°C do temperatury co najmniej 75°C i korzystnie co najmniej około 100°C.

W opisie patentowym nr EP-A-0201650 przedstawiono sposób laserowej dezynfekcji cieczy, w którym kieruje się wiązkę laserową promieniującą światłem w zakresie ultrafioletu, na strumień dezynfekowanej cieczy. Sposób ten jest szczególnie korzystny do dezynfekcji wody i wykorzystuje gazowy laser impulsowy z regulowaną średnią intensywnością światła ultrafioletowego. Wiązka ultrafioletu pokrywa przekrój poprzeczny strumienia wody. Częstotliwość zmienia się od wolnej do tak szybkiej, że staje się w istocie wiązką ciągłą, z możliwością regulacji w zależności od zmian prędkości przepływu strumienia wody przez wiązkę laserową i od zmian zmętnienia wody. Można również zmieniać prędkość przepływu wody, utrzymując stałą intensywność wiązki ultrafioletu. Przynajmniej jedna ze ścian przewodu prowadzącego wodę może mieć stosunkowo wysoki współczynnik odbicia dla ultrafioletu, aby ograniczyć rozproszenie tej wiązki spowodowane cząstkami zawieszonymi w wodzie i zmniejszyć pole przekroju poprzecznego wiązki, dla kompensacji zmiany tej wiązki, aby utrzymać równomierną jej intensywność w obszarze oddziaływania na strumień. Kąt przenikania wiązki do strumienia jest regulowany pod wpływem zmian zmętnienia wody. Ponadto, można zmieniać geometrię tej wiązki, zwłaszcza jej długość, pod wpływem zmian parametrów wody, takich jak zawartość organiczna.

170 455

Korzystny jest ekscymerowy laser fluorowo kryptonowy wytwarzający promieniowanie o długości fali 249 nm.

W opisie patentowym nr US-A-3817703 przedstawiono sposób niszczenia żywej substancji zawieszonej w materiale przepuszczającym światło, z możliwością równoczesnej sterylizacji pojemników i materiałów przechowywanych w nich, przy użyciu wiązki laserowej skierowanej na ten pojemnik tak, aby dotknęła podczas sterylizacji wszystkich jego wewnętrznych powierzchni. Przy tym cała zawartość pojemnika podlega działaniu promieni światła. W ten sposób zostaje zniszczona żywa substancja w materiale, lub przylegająca do wewnętrznych ścian pojemnika. Wykorzystuje się przy tym jedno lub więcej oscylujących zwierciadeł, powodujących, że jedna lub więcej wiązek laserowych omiata pojemnik.

W opisie patentowym nr US-A-3941670 ujawniano zastosowanie lasera podczerwieni, którego cel jest przeszukiwany wiązką laserową z użyciem oscylującego zwierciadła. Światło zmienia aktywność biologiczną napromieniowanego wielkocząsteczkowego gatunku, za pomocą wzbudzenia stanów wibracyjnych i skrętnych. Mogą być sterylizowane różne cele, na przykład powietrze lub inne ośrodki ciekłe, tworzywa sztuczne i metale, takie jak taśma lub wstęga folii aluminiowej.

Ponadto, w opisie patentowym nr DE-A-2914075 przedstawiono sposób sterylizacji wewnętrznych powierzchni wstępnie ukształtowanych pudełek kartonowych. Źródła ultrafioletu, na przykład pionowe źródła z lampą rtęciową, wprowadza się od dołu w każde pudełko kartonowe, przy różnych położeniach względem ścian bocznych tego pudełka. Promieniowanie ultrafioletowe o wystarczającej intensywności, osiąga różnie zasłonięte kąty utworzone przez dno i boczne spojenia tego pudełka kartonowego. W korzystnym przykładzie wykonanie połączono sterylizację ultrafioletem ze sterylizacją cieplną, tak że zostają wyeliminowane wrażliwe na ciepło drożdże i pleśń. Taką cieplną sterylizację przeprowadza się przy użyciu dwóch wiązek promieniowania. Promieniowanie podczerwone oddziaływuje na pudełka kartonowe przed, lub po promieniowaniu ultrafioletowym.

W opisie patentowym nr US-A-5 068 514 przedstawiono sposób polerowania powierzchni polimerowych soczewek kontaktowych, laserowym promieniowaniem ultrafioletowym, o długości fali 193 nm, aby uzyskać kontrolowany poziom stopnia powierzchni soczewki, ale bez nadmiernej fotodekompozycji, przy czym powierzchnia soczewki zostaje wygładzona.

W opisie patentowym nr JP-A-60 28235 przedstawiono sposób oczyszczania powierzchni półprzewodnikowej płytki podłożowej, dla usunięcia chemicznych cząsteczek i atomów substancji obcych z powierzchni płytki. W korzystnym przykładzie wykonania, w którym formuje się diodę shot key na górnej powierzchni krzemowej płytki podłożowej typu N, wcześniej stosuje się termoutlenianie, dla uformowania na górnej powierzchni krzemowej płytki, bardzo cienkiej warstewki tlenku krzemu. Następnie wykonuje się wydrążenie w warstewce tlenku krzemu, aby odsłonić krzemową płytkę podłożową. Płytkę czyści się wówczas chemicznie z użyciem mieszaniny ciekłego amoniaku, nadtlenku wodoru i wody. Następnie płytkę myje się w czystej wodzie przez dziesięć minut i suszy się. Płytkę wprowadza się następnie do komory próżniowej i naświetla promieniowaniem ultrafioletowym lampy o energii promieniowania około 10 mW/cm². Po naświetlaniu przez określony czas w komorze próżniowej, płytkę przenosi się do komory natryskowej połączonej z komorą próżniową i płytkę natryskuje się platyną.

W opisie patentowym nr JP-A-60-28235 wyjaśniono, że energia wiązania O-H cząsteczek wody wynosi 4,8 eV, a energia wiązania C-H substancji organicznej wynosi 4,5 eV. Aby oczyścić powierzchnię półprzewodnikowej płytki podłożowej, potrzebna jest porcja światła o wyższej energii niż powyższe połączenie energii,abardziej skuteczne jest naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym o długości fali poniżej 300 nm.

W alternatywnym urządzeniu komorowym zastosowano lampę rtęciową o promieniowaniu ultrafioletowym i ksenową lampę błyskową o promieniowaniu podczerwonym. Lampa rtęciowa służy do naświetlania powierzchni półprzewodnikowej płytki podłożowej promieniowaniem ultrafioletowym natomiast lampa błyskowa służy do nagrzewania tej powierzchni. Promieniowanie ultrafioletowe przerywa wiązania cząstek wody i wiązania C-H, w tym samym czasie, gdy powierzchnia jest ogrzewana przez promieniowanie podczerwone lampy błyskowej. Określona energia kinetyczna zostaje przekazana do małych cząstek powodując ich

170 455 szybkie opuszczanie powierzchni płytki. Stwierdzono, że warunkiem dla oczyszczenia jest promieniowanie ultrafioletowe 10mW/cm², naświetlanie lampą błyskową o nastężeniu 4 J/cm²przy szerokości impulsu 50 mikrosekund i przerwie między impulsami 5 minut.

Sposób według wynalazku jest przeznaczony do niszczenia drobnoustrojów na powierzchni ciała stałego, w którym naświetla się tę powierzchnię promieniowaniem ultrafioletowym o bakteriobójczej długości fali. Sposób ten charakteryzuje się tym, że w procesie niszczenia drobnoustrojów powierzchnię naświetla się ultrafioletowym promieniowaniem laserowym o bakteriobójczej długości fali.

Korzystnie stosuje się gęstość mocy bakteriobójczego ultrafioletowego promieniowania laserowego nieuszkadzającą powierzchni ciała stałego. Naświetlana powierzchnia jest korzystnie powierzchnią materiału do pakowania, stykającą się z zawartością opakowania. Powierzchnia stykająca sie z zawartością opakowania jest powierzchnią tworzywa termoplastycznego. Korzystnie powierzchnia stykająca się z zawartością opakowania jest cienką warstwą polimerową.

Powierzchnię naświetla się dodatkowo promieniowaniem podczerwonym. Korzystnie powierzchnię naświetla się podczerwonym promieniowaniem laserowym. Powierzchnię naświetla się laserowym promieniowaniem ultrafioletowym i promieniowaniem podczerwonym równocześnie. Ponadto, powierzchnię naświetla się laserowym promieniowaniem ultrafioletowym i promieniowaniem podczerwonym uzyskując efekt synergiczny na naświetlanej powierzchni.

W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku naświetla się powierzchnię trójwymiarowego ciała stałego, reguluje się kierunek i natężenie promieniowania laserowego i utrzymuje się równomierne natężenie promieniowania na naświetlanej powierzchni. Promieniowanie laserowe doprowadza się z wykorzystaniem hologramu i utrzymuje się równomierne natężenie promieniowania na naświetlanej powierzchni.

Korzystnym jest, gdy ultrafioletowym promieniowaniem laserowym naświetla się powierzchnię, na której znajduje się nadtlenek wodoru. Ponadto, powierzchnię sterylizuje się ultrafioletowym promieniowaniem laserowym i nadtlenkiem wodoru uzyskując efekt synergiczny na naświetlanej powierzchni.

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że impulsowe promieniowanie ultrafioletowe jest szczególnie korzystne w rozwiązaniu według wynalazku, jako bardziej skuteczne dla niszczenia drobnoustrojów na powierzchni ciała stałego, w porównaniu z ciągłym promieniowaniem ultrafioletowym.

Zalecaną stosowaną długością fali ultrafioletu jest długość mieszcząca się w zakresie od 150 do 320 nm, a korzystnie 240 do 280 nm, zwłaszcza około 250 nm. Zalecaną długością fali podczerwieni jest długość w zakresie pomiędzy 1 000 a 10 000 nm.

Stwierdzono, że zastosowanie lasera dla dostarczenia ultrafioletu, w przeciwieństwie do bakteriobójczej lampy emitującej ultrafiolet, daje określone korzyści, jak stosunkowo wysoka gęstość bezwzględnej energii oraz mała rozbieżność ukierunkowanej w wysokim stopniu wiązki wyjściowej, co zapewnia jej szczególną przydatność do sterylizacji określonych obszarów wewnątrz pudełka kartonowego, gdzie mogą być silne skażenia, na przykład rogi i zagięcia pudełka kartonowego.

Sposób według wynalazku jest bliżej objaśniony w przykładach, w nawiązaniu do rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat urządzenia zastosowanego do naświetlania ultrafioletem laserowym badanych pasków, a fig. 2 i 3 przedstawiją schematycznie dwa odmienne układy dla otrzymywania jednorodnie rozłozonej energii laserowego ultrafioletu na wewnętrznej powierzchni pudełka kartonowego z otwartym wierzchem.

Przykład I. Jako organizm badany w procesie sterylizacji promieniowaniem laserowym, wybrano przetrwalnik bakteryjny tworzący bakterię: Bacillus subtilis var. globigii. Bakteria ta jest sklasyfikowana jako Gram dodatnia, tlenowa, pałeczkowa, ruchoma i niechorobotwórcza. Jest ona wszechobecna w środowisku bytowania i można ją znaleźć w ziemi, kałach, kurzu z siana, mleku i wodzie. Uformowanie przetrwalników umożliwia przeżycie bakterii w stanie utajonym (uśpionym i zdolnym do życia) przez długi czas. W związku z tym jest szczególnie ważnym, aby sposób sterylizacji był zdolny do zabicia tych przetrwalników bakteryjnych. Ponieważ przetrwalniki są odporne na temperatury ponad 100°C i inne niszczące

170 455 czynniki (chemikalia), to stanowią użyteczne wskaźniki skuteczności sterylizacji i są systematycznie wykorzystywane do kontroli sterylizacji chemicznej i obróbki cieplnej. Przy ocenie nowej procedury sterylizacji, do badania próbek, są stosowane standardowe testy mikrobiologiczne i badania mikroskopowe. Identyfikacja przetrwalników pod mikroskopem jest ułatwiona dzięki ich wysokiemu współczynnikowi załamania i zmniejszonej podatności na barwienie oraz dzięki ich specyficznej reakcji na określone barwniki.

W badaniach używano czystego półproduktu na pudełka kartonowe (warstwa kartonu laminowana warstwami polietylenu, z lub bez warstwy barierowej z folii aluminiowej) oraz zawiesiny przetrwalników Bacillus subtilis var. globigii, uzyskanej z Elopak A/S w Norwegii. Druga hodowla bakteryjna (NCIMP 8649) była wykorzystywana do kontroli, służąc jako niezależne potwierdzenie dla tego gatunku. Procedurę metodologiczną podzielono na trzy główne etapy, a mianowicie pokrycie pasków testowych bakteriami i wszystkie związane procedury przed pokryciem, wystawienie tych pasków na działanie ultrafioletu laserowego i następnie analiza tych pasków.

Przed naświetlaniem laserem, przygotowano układ do nanoszenia hodowli na materiał kartonowy w postaci pasków testowych, ze szczególnym uwzględnieniem utrzymania sterylności tych pasmo przed pokryciem i umieszczeniem bakterii na sterylnej powierzchni pasków z zachowaniem ich sterylności.

Materiał kartonowy cięto ostrzami skalpelowymi, aby uzyskać kawałki testowe 6 cm i 2 cm . Te paski testowe poddano kilku różnym procesom sterylizacji: 35% nadtlenkiem wodoru, 1 ml/pasek testowy, przez 2 min; 2% nadtlenkiem wodoru, 1 ml/pasek tastowy, przez 2 s i przez 2 min; sterylizacji parowej w autoklawie przy temperaturze 121°C przez 20 min.

Wszystkie paski były dobrze wysuszone przed nałożeniem hodowli bakteryjnej, a szereg sterylnych pasków odłożono na bok, aby spełniały rolę kontrolnych.

Wysterylizowane paski, przez użyciem trzymano w torbach autoklawowych w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Pokryte paski testowe przechowywano na płytkach Petriego w temperaturze 4°C przez 4 dni.

Zawiesinę przetrwalników Bacillus subtilis var. globigii hodowano jako subkulturę w pożywce bulionowej (wyciąg wołowy, pepton, woda, pH 6,8), w temperaturze 37°C i badano po 24 godzinach. Wykorzystywano standardowy sposób polanej płytki (pour-plate) izolowania kolonii i zliczania zdolnych do życia. Używano pożywki bulionowej sterylnej wody destylowanej, w zależności od zastosowanego sposobu polanej płytki. Pożywka agarowa (wyciąg wołowy, pepton, agar pH 6,8) służyła jako pożywka stała dla hodowli tego organizmu. Obserwacje wizualne i zliczanie kolonii przeprowadzono po 36 godzinach, po inkubowaniu przy temperaturze 37°C. Do przygotowania rozmazu i następnie procedur barwienia różnicującego, stosowano hodowle bez domieszek. Zastosowanymi barwnikami był barwnik Grama i barwnik przetrwalnika bakteryjnego Ziehla-Nielsena, a zabarwione preparaty analizowano w mikroskopie świetlnym (10 x 100).

100 gl próbki z seryjnego rozcieńczenia hodowli wyjściowej w destylowanej wodzie, 10³ i 10⁶ jednostek kolonizujących/ml, w sposób aseptyczny umieszczono na sterylnym kartonowym pasku testowym, rozprowadzono na min i pozostawiono do wyschnięcia przez kilka godzin. Paski testowe w trakcie suszenia przechowywano pod przykryciem na sterylnych płytkach Petriego w temperaturze pokojowej i następnie przechowywano w temperaturze 4°C. Zachowano szczególną ostrożność, aby utrzymać cały czas płytkę Petriego do góry, dla uniknięcia przypadkowego skażenia nielaminowanej powierzchni.

Jeden pasek testowy na seryjne rozcieńczenie i dwie sterylne próbki oddzielnie umieszczono w 10 ml pożywki bulionowej i badano wzrost po 36 godzinach w temperaturze 37°C. Zmętnienie szacowano wizualnie, po czym umieszczono 100 gl pożywki hodowlanej na płytkach z pożywką agarową do dalszej inkubacji w ciągu 36 godzin w temperaturze 37°C i obserwowano skosy, jak opisano powyżej.

Następnie naświetlano paski testowe ultrafioletowym promieniowaniem laserowym. Zastosowanym laserem o otworze Q, jak przedstawiono na fig. 1, był ekscymerowy laser kryptonowo fluorowy (KrF) Questek, serii 2000. Laser generował promieniowanie ultrafioletowe o długości fali 248 nm. Laser ten jest laserem impulsowym, dając impulsy 10-20 nS przy częstotliwościach powtórzeń aż do kilkuset Hertzów.

Stosowano następujące parametry pracy: energia impulsu 200 mJ częstotliwość powtórzeń 100 Hz

Laser wysyłał wiązkę, która ma w przybliżeniu wymiary 3x2 cm (pozim x pion).

Zastosowany układ optyczny przedstawiony jest na fig. 1. Gęstość energii skierowanej na próbkę zmieniano przez zmianę spojonej soczewki krzemianowej L, i/lub odległości d od soczewki do przesłony M, a więc od soczewki do próbki.

Początkowo, do rozciągnięcia wiązki w kierunku poziomym stosowano soczewkę walcową o ogniskowej 25 cm, dającą na przesłonie M pole napromieniowania w przybliżeniu 3x3 cm. Wynikowa gęstość energii strzału na próbkę wynosiła 40 mJ/cm², dając przeciętną gęstość mocy 4 W/cm2 przy częstotliwości 100 Hz.

Aby wytworzyć wyższą gęstość mocy na próbkę, zmniejszano odległość od próbki i zmniejszanorownieestosownierozmiarpróóbiz3x3cmdo 1 x 1cm. Energia strzału i przeciętne gęstości mocy w tym układzie wynosiły odpowiednio 130 mJ/cm2 i 13 W/cm2.

Aby umożliwić obniżenie gęstości napromieniowania, soczewkę walcową zastąpiono soczewką sferyczną o ogniskowej 20 cm. Wynikowe pole wiązki na próbce, znacznie przekraczające otwór przesłony, daje w wyniku energię i przeciętne gęstości mocy na próbce odpowiednio 10 mJ/cm i 1 W/cm2.

We wszystkich przypadkach gęstość energii była mierzona w płaszczyźnie otworu przesłony. Blok próbek był kilka centymetrów poza tą płaszczyzną. Jednak wprowadzona przez to różnica w naświetleniu była mała, ponieważ małe było przesunięcie w porównaniu z odległością d, która zwykle mieści się w zakresie 40 - 70 cm.

Stosowano różne czasy napromieniowania, zależnie od testowej gęstości energii i mocy: 10 mJ/strzał/cm^: 1 s oraz 6 s 40 mJ/strzał/cm : s oraz 6 s

130 mJ/strzał/cm2: 15 s

Spreparowane paski testowe montowano, przy użyciu wysterylizowanych szpilek, na bloku balsy pokrytym folią aluminiową. Zarówno blok jak i folia były przed użyciem sterylizowane w parze, przez 20 min, przy temperaturze 121°C. Zależnie od rozmiaru pasków testowych, na jednym bloku mocowano dwanaście do szesnastu próbek, blok montowano na dźwigniku laboratoryjnym J, aby zapewnić skanowanie. Montaż próbek na bloku odbywał się w warunkach higienicznych, przy użyciu sterylnych szczypiec do mocowania pasków.

Doświadczenia z H2O 2 przeprowadzano dwoma metodami.

W pierwszej dodano 100 (tl 2% H2O2 do paska testowego (jednego na każdy roztwór testowy), rozprowadzono po powierzchni pudełka kartonu, wysuszono w cieple, następnie naświetlano wiązką laserową. Drugie doświadczenie przeprowadzano jak pierwsze, ale bez suszenia w cieple przed naświetlaniem wiązką laserową. Natomiast paski testowe ułożono warstwowo pomiędzy sterylnymi płytkami szkła kwarcowego, naświetlano wiązką laserową i następnie suszono w cieple.

Zastosowana temperatura wynosiła w przybliżeniu 100°C, a ciepło doprowadzone było poprzez styk spodniej płytki krzemianowej z płytką grzejnika laboratoryjnego. Wierzchnia płytka krzemianowa była usunięta w procesie suszenia.

Wszystkie próbki naświetlone wiązką laserową, włączając próbki kontrolne, były natychmiast umieszczane w oddzielnych pojemnikach uniwersalnych z 10 ml sterylnej pożywki bulionowej i były poddane inkubacji przez 36 godzin w temperaturze 37°C. Sterylność była badana poprzez oszacowanie zmętnienia roztworu po okresie inkubacji, po którym prowadzono subkulturę na płytkach z pożywką agarową i drugą inkubację przez 36 godzin przy temperaturze 37°C. Wzrost badano pod mikroskopem, na obecność szczepu wskaźnikowego.

Rozpatrzono wyniki przeprowadzonych doświadczeń przed naświetlaniem laserowym. Procesy sterylizacji pasków testowych wykazują, że sposób autoklawowy jest procedurą najbardziej pewną i pomyślną.

170 455

Sposób suszenia hodowli bakteryjnej na paskach testowych był pomyślny z próbkami namnożonej kolonii zdolnej do życia, do 4 dni (paski testowe starsze od 4 dni nie były badane). Przez seryjne rozcieńczenie i następnie sposób polanej płytki uzyskano hodowlę bakteryjną zawierąjącą2x 10⁷ jednostek kolonizujących/ml (cfu/ml). Do ustalenia przeciętnej liczby kolonii stosowano 5 płytek agarowych narozcieńczenie. Stwierdzono, że sterylne paski bez dodatku bakteryjnego, stosowane do kontroli w trakcie badań i wskazujące na pomyślne zastosowanie technik aseptycznych, pozostały sterylne w większości doświadczeń. W dwóch przypadkach, w których karty te stykały się z niesterylną powierzchnią pasków testowych, zidentyfikowano hodowlę i ustrój Gram-ujemny.

We wszystkich doświadczeniach zastosowanie barwnika Grama i zabarwienie endosporów bakterii Bacillus subSihs var. globigii wyraźnie wskazywało, że organizm jest gatunku Bacillus subtilis.

Klasyfikacja wyników na sterylne i niesterylne, jak również odróżnienie organizmu testowego od innych potencjalnych skażeń, były jednoznaczne.

Zestawienie wyników doświadczeń, w których stosowano naświetlanie laserem, przedstawiono w tabeli 1.

W przykładzie I uzyskano zachęcające wyniki, demonstrujące, że może być osiągnięta skuteczna sterylizacja, przy użyciu ultrafioletu laserowego. Przy średniej gęstości mocy 4 W/cm², dla czasu naświetlenia 6 sekund, skuteczność zabijania droboustrojów (określona jako liczba sterylnych pasków testowych do ogólnej liczby pasków testowych powiększona x 100) wynosiła około 30%. Wtrącenie nadtlenku wodoru na pasek testowy poprawia wynik do prawie 100%. Należy pokreślić, że doskonały wynik z H2 O2 został osiągnięty przy czasie oświetlenia tylko 1 sekundy.

Tabela 1

Zestawienie wyników po naświetleniu laserowym

Gęstość mocy (W/cm²)	Warunki obróbki laserowej, czas naświetlania (s)	Użycie H2O2?	Rozmiar paska testowego (cm x cm)	Liczba replik	Stopień sterylności po 36 godz. i początkowa gęstość komórek
13	15	Nie	1 x 1	2 każdej	1 przy 10⁶
4	1	Tak	1 x 1	5 każdej	1 przy 10⁶
4	6	Tak	1 x 1	5 każdej	1 przy 10³ 3 przy 10⁴
4	1	Nie	1 x 1	2 każdej	1 przy 10⁴
	6				2 przy 10⁴, 6 s
4	1 f	Nie	2,5 x 2,5	2 każdej	żaden
4	1	Tak	2,5 x 2,5	2 każdej	2 przy 10³, 6 s
	6				1 przy 10⁶, 6 s 1 przy 10³, 1 s
4	1	Tak	2,5 x 2,5	2 każdej	2 przy 10³, 1 s
	6	(szkło kwarcowe)			2 przy 10⁶. 6 s 1* przy 10⁶, 1 s 2 przy 10³, 6 s
13	5	Tak	1 x 1	4 każdej	4 przy 10⁶
		(szkło kwarcowe)			3 przy 1(0'
1	1 6	Nie	3x3	5 każdej	żaden

skażenie od ręki na jednej próbce

Przykład II. Wyniki przykładu I wskazały na pomyślne działanie ultrafioletem laserowym, unieszkodliwiające drobnoustroje , takie jak Bacillus subtilis. Okresy naświetlania

170 455

2 3 laserem od 1 sekundy do 6 sekund, przy 40 mJ/strzał/cm (4 Wcm ), wykazały zabicie 10 do 10⁶ komórek bakteryjnych w kilku próbkach.

Ilościowe oszacowanie jak wiele organizmów zostało zabitych za pomocą określonej obróbki laserowej było dalej badane w przykładzie II. Badano dużą liczbę próbek dla kontroli skuteczności zabijania przy stosowaniu różnych procedur naświetlania promieniowaniem laserowym, ze szczególnym uwzględnieniem zmian gęstości mocy i częstotliwości powtarzania. Skuteczność procesu sterylizacji światłem laserowym mierzona była za pomocą obserwacji współczynników przeżycia bakterii po różnych zabiegach.

W trakcie badań rozpatrywano kilka innych problemów doświadczalnych. Rozpatrywano kolejno w jakim stopniu folia podłożowa, na której zostały umieszczone paski, wpływa na wytworzone ciepło i jak to dodatkowe ciepło, jeśli występuje, wpływa na potencjał zabijania lasera; czy drewno zastosowane do montowania pasków uwalnia substancję na te paski, które może wspomagać niszczenie bakterii, czy substancja ta, jeśli występuje, jest aktywowana przez autoklaw i jest przejmowana przez pasek; czy sam pasek uwalnia substancje, które mogą wpływać na stopień zabijania bakterii, czy ciepło wytworzone za pomocą lasera jest niezbędne do faktycznego zabijania bakterii; jak zmniejszenie gęstości mocy (W/cm²) i/lub zmniejszenie częstotliwości powtórzeń (Hz) wpływa na skuteczność zabijania laserowym oświetleniem ultrafioletowym.

W badaniu wykorzystano półprodukt na pudełka kartonowe (laminat z folią aluminiową) i tekturową kartę montażową StUDLAND (nielaminowaną). Do przygotowania seryjnego rozcieńczenia w destylowanej wodzie stosowano zawiesinę przetrwalników Bacillus subtilis var. globigii. To rozcieńczenie było rozdzielone w jednakowych ilościach na paski testowe, które następnie poddano suszeniu i naświetlaniu ultrafioletem laserowym.

Postępowanie przeprowadzono w trzech głównych etapach, a mianowicie naniesiono warstwę bakteryjną na wysterylizowane paski testowe, naświetlano paski ultrafioletem laserowym i następnie dokonano analizy tych pasków.

Materiał kartonowy pocięto ostrzem skalpelowym aby uzyskać paski testowe 1,3 cm x 1,3 cm. Stosowano 18 pasków testowych na bloku balsy (drewno pokryte było folią Al, lub było pozostawione bez pokrycia). Układ pasków na drewnie rozłożony był w trzech rzędach na blok, z sześcioma paskami w rzędzie.

Wszystkie paski przytrzymywano na miejscu taśmą autoklawową tak, że 1 cm2 pola kartonu na pasku pozostawał odsłonięty. Każdy blok umieszczono w oddzielnej torbie autoklawowej i sterylizowano w autoklawie w temperaturze 121°C, przez 20 minut.

jxl każdego przygotowanego rozcieńczenia (10'¹, 10'2, 10'³, W⁴) każdej hodowli wyjściowej Bacillus subtilis var. globigii zostało rozmierzone w równych ilościach na paski i pozostawione do wyschnięcia w warunkach laminarnego przepływu powietrza przez kilka godzin. Dwa paski na blok używano do kontroli, to znaczy bez naświetlenia ultrafioletem laserowym i jeden pasek na blok używano jako pusty, to znaczy bez dodania rozcieńczenia bakteryjnego. Następnie każdy blok balsy z paskami powracał do sterylnej torby autoklawowej i był szczelnie zamknięty, aż do naświetlania ultrafioletem laserowym.

Dla zapewnienia punktu odniesienia, od którego szacuje się unieszkodliwienie bakterii, szacowano liczbę jednostek kolonizujących rozmieszczonych na paskach dla różnych rozcieńczeń, przy następującym użyciu detergentowego sposobu odzysku:

Przygotowane paski ze stosownym rozcieńczeniem bakteryjnym zanurzane w 0,1% Tween'ie 20 (sterylne, rozcieńczenie w wodzie destylowanej). Skuteczność Tweenu 20 do odzysku posiewu bakteryjnego z pasków porównano z odzyskiem sterylną wodą tak, że można było ustalić potwierdzenie zasady tego sposobu.

Zmieniano inne metody, aby sprawdzić czy występował ich wpływ na liczbę bakterii, włączając w to porównanie pomiędzy paskami zamontowanymi na balsie lub pozostawionymi w stanie niezmontowanym na sterylnych płytkach Petriego przed odzyskiem.

Następnie naświetlano paski próbne ultrafioletem laserowym. Stosowano laser taki jak w przykładzie I, ale przy zwiększonej energii impulsu do 250 mJ. Jedynymi wprowadzonymi zmianami była częstotliwość powtórzeń (Hz), czasy naświetlania i zastosowana gęstość energii. Badane odmiany zestawiono w kolumnie Parametry lasera w tabeli 2.

170 455

Zastosowano cylindryczne soczewki 25 cm do redukcji pionowego wymiaru wiązki, aby uzyskać gęstość energii 40 mJ/strzał/cm2. Zastosowano soczewki o ogniskowej 35 cm do rozciągnięcia tej wiązki tak, że można było uzyskać obniżoną gęstość energii do 6 mJ/strzał/cm2.

Na pojedynczym bloku naświetlano do 18 pasków, blok został zamontowany na laboratoryjnym podnośniku J, aby zapewnić skanowanie. Procedura skanowania odbywała się w warunkach higienicznych, a po obróbce bloki umieszczano w sterylnych torebkach autoklawu. Torebki te były szczelnie zamknięte i były przechowywane w temperaturze pokojowej, aż do rozpoczęcia następnych procedur analitycznych. Na większości bloków znajdowały się trzy paski, które nie były naświetlone ultrafioletem laserowym. Dwie z tych próbek były użyte jako kontrolne, a jedna - bez bakterii - wykorzystana była do kontroli.

Po naświetlaniu laserem, wszystkie paski zostały w sposób aseptyczny wyjęte z bloków, włożone do oddzielnych butelek zawierających 5 ml rozcieńczalnika i wirowane przez minimum 30 sekund. 100 gl z każdej próbki pobrano pipetą na oddzielne płytki pożywki agarowej, rozprowadzono na prążki i inkubowano w temperaturze 37°C przez minimum 24 godziny.

Wizualnie badano wzrost kolonii na płytkach i zliczano liczby kolonii.

Wyniki uzyskane bez naświetlania laserem wskazują, że procedura posiewania bakterii na pożywce agarowej seryjnego rozcieńczenia, dawała powtarzalną liczbę kolonii na stężenie bakteryjne i umożliwiła obliczenie współczynnika odzysku.

Stwierdzono, że najlepszym sposobem odzysku bakterii z pasków było zastosowanie 1 minutowego wirowania w rozcieńczalniku. Odzysk zmieniał się w zakresie 50% do 90% bakterii na pasku. Doświadczenie rozcieńczenia seryjnego wskazywało, że w hodowli wyjściowej znajdowało się 1,5 x 10⁷jednostek kolonizujących w ml.

Dwa rodzaje badanych materiałów nie wykazały żadnych różnic w uzyskanym stopniu odzysku. Doświadczenie z paskami testowymi na balsie również nie wykazało żadnych różnic w wynikach w porównaniu z paskami, które pozostawiono na płytkach Petriego, wykluczając w ten sposób jakiś potencjalny wpływ chemiczny ich podłoża.

Wyniki doświadczeń przed naświetlaniem laserowym, takie jak badania potencjalnych substancji bakteriobójczych w materiale lub w drewnie, były dodatkowo rozpatrywane z paskami testowymi poddanymi naświetleniu ultrafioletem laserowym, ale nie stwierdzono żadnego wpływu tego naświetlenia. Wpływ potencjalnego grzania na stopień zabijania bakterii został w sposób rozstrzygający zanegowany, gdy intensywność grzania ultrafioletu laserowego została tak zmniejszona, aby wykluczyć efekty cieplne. Czas naświetlania został tak ustawiony by uzyskać taką samą ogólną liczbę fotonów, na przykład 10 impulsów na sekundę przez 10 sekund, zamiast 100 impulsów w jednej sekundzie.

Tabela 2

Zestawienie wyników dla przykładu II

Parametry lasera	, 2 Energia całkowita (J/cm )	Liczba próbek;*	** Logio redukcji
2 40 mJ/strzał/cm 100 Hz, 1 s	4'	36	>5,2
40 mJ/strzał/cm2 30 Hz, 1 s	1,2	1	>5,2
6 mJ/strzał/cm 100 Hz, 1 s	0,6	3	2,7
40 mJ/strzał/cm 2 Hz, 5 s	0,4	2	<1,0
40 mJ/strzał/cm2 3 Hz, 1 s	0,12	2	3,3
6 mJ/strzał/cm 2 Hz, 5 s	0,06	3	1,8

*Kazda próbka miała 1,5 x 10 przetrwalników na powierzchni 1 cm celu. **Określony jako logio (1,5 x 10r/liczbę przeżywających).

170 455

Zastosowanie gęstości energii 55 mJ/strzał/cm przez więcej niż 2 sekundy powodowało fizyczne uszkodzenie pasków (zjawisko bańki i brązowienia).

Wyniki doświadczalne demonstrują, że skuteczność zabijania wiązką ultrafioletu laserowego zależy od stosowanych parametrów lasera i liczby istniejących drobnoustrojów bakteryjnych, ale jest niezależna od materiału podłoża. Większość z badanych parametrów lasera wskazuje skuteczność zabijania liczby bakterii ponieważ 10⁶ jednostek kolonizujących. Okres oświetlenia jednej sekundy przy 40 mJ/strzał/cm² i 100 Hz dawał 100% unieszkodliwienia stężenia bakteryjnego 1,5 x 106 jednostek kolonizujących. Wysoka skuteczność zabicia 1,5 x 10⁵jednostek kolonizujących przy czasach oświetlenia jednej sekundy i stosunkowo niskich parametrach energii lub częstotliwości powtarzania, takich jak 6 mJ/strzał/cm2 przy 100 Hz i 40 mJ/strzał/cm przy 3 Hz, jest szczególnie ważne dla sterylizacji pudełek kartonowych.

Dwa układy zilustrowane na fig. 2 i 3 rysunku stanowią możliwe odmiany rozwiązań, które zapewniają zaplanowany rozdział energii, aby otrzymać równomiernie rozłożoną energię po wewnętrznej powierzchni pudełka kartonowego.

W przykładzie przedstawionym na fig. 2, wykorzystuje się hologram H wytworzony komputerowo, który powoduje dyfrakcję wiązki B światła ultrafioletowego o określonym wzorze. Składa się on ze złożonej struktury powierzchniowej lub siatki, którajest utworzona na powierzchni kawałka szkła. Jej zaprojektowanie wymaga urządzeń komputerowych, które mogą przewidzieć jak światło będzie oddziaływać ze strukturą siatkową. Siatka ta jest wytworzona za pomocą pokrycia szkła maską fotolitograficzną i zapisu wzoru na tej masce fotolitograficznej wiązką elektronową. Wywołanie maski fotolitograficznej usuwa pola naświetlone. Szkło jest następnie trawione, aby odtworzyć wzór istniejący w masce fotolitograficznej na szkle.

Układ drugi, zilustrowany na fig. 3, wykorzystuje dwa galwanometry (nie pokazane) do napędu zwierciadeł N, które zainstalowane są obrotowo wokół swych osi, odchylając przez to podającą wiązkę laserową B. Połączenie dwóch skanerów umożliwia kierowanie wiązki w dwóch osiach. Dodanie trzeciego galwanometru (nie pokazanego) napędzającego liniowe przesunięcie stanowiska do ruchu ogniskowego F, służy korzystnie do zmiany rozdzielenia dwóch soczewek, co zmienia rozbieżność wiązki.

Należy podkreślić, że te dwa układy zasadniczo się różnią. Hologram H kieruje promieniowanie do każdego punktu pojemnika C jednocześnie, podczas gdy galwanometr wybiera kolejno kierunki pól. Ponadto, układ hologramowy nie ma żadnych ruchomych części.

Przykład III. Przykład ten opisuje skanowanie całego pudełka kartonowego, a szczególnie sposoby i próby mikrobiologiczne stosowane w badaniu skuteczności i sprawności napromieniowania laserem ultrafioletowym w zakresie energii laserowej i stężenia bakteryjnego.

Zadanie próby podstawowej obejmuje spryskanie pustych, otwartych z wierzchu, dwustronnie przykrywanych pudełek kartonowych typu ELOPAK określonym organizmem wskaźnikowym, napromieniowanie tych pudełek kartonowych energią laserową oraz badanie liczby komórek bakteryjnych, które przeżyły po napromieniowaniu.

Organizmem wskaźnikowym używanym w tych badaniach była Bacillus subtilis var. globigii. Aby zapewnić wystarczający zapas podstawowego roztworu przetrwalnikowego, próbka 0,5 ml była wyhodowana jako pochodna w pożywce bulionowej i miała możliwość namnożenia w temperaturze 37°C przez 48 godzin przed wirowaniem i zebraniem hodowli bakteryjnej w sterylnym roztworze Ringersa. Roztwór ten pozostawiono w temperaturze 4°C na minimum siedem dni przed zastosowaniem w doświadczeniach.

Pięć powierzchni wewnętrznych pudelka kartonowego zostało spryskane roztworem wskaźnikowym. Urządzeniem spryskującym było trzymane w ręku działko rozpylające, które rozprowadzało komórki równo po powierzchniach pudełka kartonowego. Zakres stężenia bakteryjnego był rzędu 10⁷ do 10⁸ komórek na pudełko kartonowe. Spryskane pudełka kartonowe pozostawiono przez użyciem do wyschnięcia, w temperaturze pokojowej, w kołpaku z laminarnym powietrzem, przez maksimum 18 godz.

Do wykrycia bakterii które przeżyły, zastosowano test płukania.

Dla przeprowadzenia badania, zawiesina przetrwalników została rozcieńczona w roztworze Ringersa, aby zapewnić seryjne rozcieńczenie tego materiału od 10’¹ do 108 100 gl każdego

170 455 rozcieńczenia nałożono i rozprowadzono pipetą na płatki pożywki agarowej, płytkę odwrócono i inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godz. Następnie przeprowadzono wizualne sprawdzenie namnożenia bakteryjnego. 2 ml każdego rozcieńczenia bakteryjnego zostało rozpylone na badane pudełka kartonowe, które pozostawiono do wyschnięcia. Wszystkie pojemniki odczynnikowe i płytki Petriego były sterylne przed użyciem i były obsługiwane aseptycznie w warunkach laminamego przepływu powietrza LPP. Roztwór Ringersa był sterylizowany w autoklawie przed dodaniem Tween'u 20.

Wzory spryskiwania i ładowania liczby komórek na pudełko kartonowe były sprawdzane za pomocą przebiegów próbnych z wodą i otwierania boków pudełka kartonowego. Były również potwierdzone za pomocą spryskiwania bakteryjnego i nakładania na agar, jak również w próbach odzysku. Działko rozpylające było oczyszczone 70% etanolem przed zastosowaniem i miało możliwość wyschnięcia w warunkach laminamego przepływu powietrza. Pokrywy pudełka kartonowego przygotowano za pomoc nasączenia 70% etanolem, po czym następowało zabezpieczenie !00%o etanolem i następne suszenie. Kilka próbek pokryw badano na sterylność pożywką bulionową po obróbce etanolowej.

Każde doświadczenie testu płukania obejmowało sprawdzenie dla stanu bezobróbkowego, to znaczy pudełek kartonowych bez napromieniowania laserowego i pudełek kartonowych nie spryskanych przetrwalnikami bakteryjnymi. Te ostatnie służyły jako kontrola skażenia tła. Większość doświadczeń obejmowała badanie co najmniej dwóch rozcieńczeń bakteryjnych. Typowy przebieg doświadczenia wyglądał następująco: 3 pudełka kartonowe spryskano rozcieńczeniem 10’¹ zawiesiny przetrwalników, 3 dalsze pudełka kartonowe spryskano rozcieńczeniem 10‘² zawiesiny przetrwalników. Dla rozcieńczenia 10‘1, pudełka kartonowe 1, 2 i 3 użyto do testu płukania, przy czym pudełka 1 i 2 były badanymi, a pudełko 3 kontrolnym, tj. pudełko to nie było napromieniowane laserem, Tak samo postępowano z pudełkami kartonowymi spryskanymi rozcieńczeniem 10'2 zawiesiny przetrwalników.

Pudełka kartonowe umieszczano (każde w określonym czasie) w specjalnym uchwycie zespołu laserowego. Po czasie napromieniowania pudełko wyjmowano z tego uchwytu, zakrywano wysterylizowaną pokrywą i pudełko transportowano w laminarnym przepływie powietrza. Manipulowanie pudełkiem kartonowym w otoczeniu niesterylnym sprowadzono do absolutnego minimum. Występowało jedynie potencjalne ryzyko skażenia w momencie usuwania pudełka kartonowego z uchwytu i następnie jego przenoszenia.

ml roztworu dla próbnego płukania nanoszono pipetą na każde pudełko do próbnego płukania. Wysterylizowaną pokrywę umieszczano na każdym pudełku kartonowym i pudełka te potrząsano energicznie co najmniej 30 razy z każdej strony. Następnie miały one możliwość stania przez krótki czas, po czym ich zawartości zostały zlane do oddzielnych, sterylnych pojemników. Z odzyskanej zawartości przygotowano seryjne rozcieńczenia, przy użyciu sterylnego roztworu Ringersa. Objętości 250 gl lub 500 gl każdego rozcieńczenia i odzyskana zawartość nie rozcieńczona, zostały rozprowadzone na płytkach pożywki agarowej i poddane inkubacji w temperaturze 37°C przez 24 godz.

Następnie przeprowadzono testy laserowe. Zakres badanych energii zmieniał się od 1,0 Joula do 4,0 Jouli na cm2, przy czasach napromieniowania w przybliżeniu 10 minut. Ten okres czasu, który jest sześćdziesiąt razy większy od maksymalnego czasu dziesięciu sekund na pudełko kartonowe, uzasadnionego względami handlowymi, został wybrany do realnego doświadczenia z tego względu, aby uzyskać całkowitą dawkę równą dawce pożądanej ze względów handlowych, stosowaną przez dziesięć sekund. Każde pudełko kartonowe było umieszczane w uchwycie dokładnie w tej samej pozycji, z nadrukiem kodowym tego pudełka z tyłu uchwytu. Starano się, aby wierzch pudełka kartonowego był całkowicie otwarty, ale w pewnych przypadkach był nieznacznie wygięty. Procedura napromieniowania była zautomatyzowana i sterowana komputerowo.

Początkowe próby badania sposobu testowania pokazały, że układ spryskiwania wywołuje równomierne rozmieszczenie bakterii, oraz że próby odzyskowe były w większości doświadczeń na tym samym poziomie stężenia jak pierwotnie wprowadzone. Poniżej przedstawiono opis

170 455 typowych przykładów poszczególnych sposobów testowania, po którym następuje zestawienie najistotniejszych wyników doświadczalnych.

Seryjne rozcieńczenia roztworu podstawowego przetrwalników przygotowano do każdego przebiegu doświadczalnego, aby oszacować poprawnie stężenie bakteryjne każdej badanej próbki.

Następnie przeprowadzono test płukania. Wyniki dla seryjnych rozcieńczeń były wykorzystane do kwalifikacji stężenia bakterii naniesionych na pudełka kartonowe i do sprawdzenia dokładności próby odzysku. Kontrolny test odzysku był włączony w każdym przebiegu doświadczalnym i obliczany był procent odzysku dla każdego stężenia bakteryjnego. Skoro ustalono, że sposób odzysku był prawidłowy, to skuteczność napromieniowania laserowego może być zmierzona na podstawie zarejestrowanych wyników odzysku. Rzeczywista liczba odzyskanych kolonii w badanej próbce była porównana ze spodziewaną liczbą określonego stężenia bakteryjnego. Typowe wyniki odzysku były nieznacznie poniżej wyników spodziewanych.

Przykład testu płukania:

Testy	Próbka 10’1 testu płukania	Próbka 101 kontroli płukania	Seryjne rozcieńczenie
nie rozcieńczony	>200	kożuszek bakterii	kożuszek bakterii
10‘1	50	kozuszek bakterii	kożuszek bakterii
10-2	4	niepoliczalne	kożuszek bakterii
10-3	1	278	1315
10⁴	0	27	220

Przykład obliczeniowy:

Stężenie materiału podstawowego obliczono z wyniku seryjnego rozcieńczenia:

220 kolonii w rozcieńczeniu 10^ dla próbki 100 gl na płytce, więc dla materiału podstawowego 2,2 x 10⁸.

Rozcieńczenie materiału podstawowego 10’¹ powinno więc być 2,2 x 10⁷, ale ponieważ użyto 2 ml, to stężenie ładunku na kartonie wynosiło 4,4 x 107. Odzysk w 20 ml roztworu Ringersa/T weena 20 i 100 gl odmierzonej podwielokrotności na płytkę oznacza, że każdy wynik dla rozcieńczenia testu płukania musi być mnożony przez te współczynniki. Próbka kontrolna wykazuje 278 kolonii w rozcieńczalniku 10'³ odzyskanej objętości, tak więc obliczenie stężenia odzysku jest 278 x 10³ x 10 x 20 = 5,6 x 107. Różni się to od stężenia naładowania o 1,2 x 107, co stanowi różnicę nieznaczną, i nie wskazuje żadnego istotnego problemu sposobu odzysku. Rzeczywista próbka testu napromieniowania laserowego dala w przybliżeniu 200 kolonii z odmierzonej ilości 100 gl z 20 ml objętości odzysku bez rozcieńczenia, wskazując w ten sposób, że przetrwało 4,0 x 10⁴ kolonii w tej określonej próbce, dając log redukcji <3,04, to jest log (4,4 x 10⁷: 4,0 x 10⁴).

Dla pobranej próbki 250 gl z objętości 10 ml testu płukania, współczynnik obliczeniowy jest x40 ( to jest x4 x 10), dla pobranej próbki 500 gl z objętości 10 ml testu płukania, współczynnik obliczeniowy jest x20 (to jest x2 x 10).

Definicja Log redukcji jest następująca:

logio (komórek na pudełko kartonowe: liczba komórek na pudełko, które przetrwały).

Pudełka kartonowe spryskano przez 1 θ7 - 108 komórek, napromieniowano ultrafioletem przy 1, 2 lub 4 Jouli/cm² i określono przetrwalniki, które przeżyły za pomocą testu płukania, stosując 10 ml roztworu płukania i biorąc na posiew bakteryjny próbki 500 gl. Stwierdzone współczynniki zabijania podano w tabeli 3.

170 455

Tabela 3

Zestawienie wyników 10 ml objętości testu płukania/próbki 500 gl lub 250 gl

Ładunek komórek/pudełko	Komórki odzyskane testu płukania	Komórki obliczone na 10 ml	Energia J/cm²	Logio redukcji
2,4 x 10⁷	80**	1,6 x 10³	1	4,18
2,4 x 10⁷	2,4 x 10³ *'	4,8 x 104	1	2,7
2,4 x 10⁸	2,2 x 104 *1	4,4 x 105	1	2,7
1,3 x 108	8,6 x 10³ *²	3,4 x 105	1	2,58
3,3 x 108	8,8 x 10³ *2	3,5 x 105	1	2,57
1,3 x 10⁷	1,12 x 102 *2	4,48 x 10³	1	3,46
2,6 x 10⁸	65 *2	2,6 x 10³	2	5,0
2,6 x 10⁸	1,44 x 102 *2	5,76 x 10³	2	4,7
2,6 x 10⁸	85 *2	3,4 x 10³	2	4,9
2,6 x 10⁸	27 *2	1,08 x 10³	4	5,38
2,6 x 10⁸	27,5 *2	1,10 x 10³	4	5,37

*1 (500 ul) 2 (250 gl)

Napromieniowanie 2 J/cm daje log redukcji większy od 5. Z zestawienia dla wyników doświadczalnych wyciągnięto następujące wnioski: Skanowanie laserem ultrafioletowym całych pudełek kartonowych powoduje sterylizację tych pudełek. Napromieniowanie 2 J/cm2 daje log redukcji Bacillus subtilis var. globigii równy 5. Pole wewnętrzne pudełka kartonowego o powierzchni 750 cm2 wymaga do sterylizacji energii 1500 Jouli. Osiągnięcie log redukcji równego 5 zajmuje 10 sekund, przy promieniującym ultrafiolet laserze o mocy 150 W. Istnieje możliwość użycia H2O 2 o bardzo niskim stężeniu, w połączeniu z napromieniowaniem laserowym, zarówno do zmniejszenia wymaganego poziomu energii dla tego samego czasu na pudełko kartonowe, jak i do zmniejszenia czasu na pudełko kartonowe dla tego samego poziomu energii.

Przykład IV. W przykładzie tym badano jakościowe oszacowanie współczynnika zabijania, gdy połączone działanie ultrafioletu laserowego i podczerwieni laserowej jest zastosowane jednocześnie. Zestaw doświadczalny tak zaprojektowano, aby mieć dodatkowe informacje o cieple powstałym w trakcie naświetlania i również o wpływie każdej z tych próbek oddzielnie.

Użyto półprodukt na pudełko kartonowe (laminat folii Al). Organizmem wskaźnikowym była Bacillus subtilis var. globigii. Do materiału na pudełko kartonowe zastosowano roztwór podstawowy przetrwalników tego szczepu.

Próba zawierała trzy główne fazy, a mianowicie pokrycia bakterii na wstępnie sterylizowanych paskach kartonu, wystawienia tych pasków na promieniowanie oraz analizy przetrwalników, które przetrwały na tych paskach.

Przed naświetleniem laserowym materiał kartonowy cięto skalpelem, aby uzyskać paski testowe 2 cm x 2 cm. 10-krotne i 100-krotne rozcieńczenie podstawowej zawiesiny przetrwalników, zawierającej 4,5 x 10 ⁷ jednostek kolonizujących/ml, wykonano w sterylnej solance (0,85% NaCl zawierającego 0,02% Tweenu 20 dla ułatwienia rozpryskania), Rozcieńczenia te zawierały odpowiednio 4,5 x 10⁶ i 4,5 x 10⁵ jednostek kolonizujących/ml.

Odmierzone ilości 100 gl każdej rozcieńczonej zawiesiny rozprowadzono na paskach, aby uzyskać odpowiednio ładunki 4,5 x 10⁵ i 4,5 x 10⁴.

Paski pozostawiono na noc do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Niektóre paski pozostawiono bez pokrycia do sprawdzenia sterylności. Po wyschnięciu każdy pasek umieszczono w sterylnej butelce w tworzywa sztucznego.

W trakcie napromieniowania paski trzymano pionowo na uprzednio wysterylizowanym metalowym zacisku typu krokodylek.

Zastosowanym do tych prób laserem promieniującym podczerwień był laser CO 2 15 W. Był on sterowany z zespołu, który zapewniał impulsy promieniowania trwające do 6,6 sekundy i zmienną moc wyjściową w zakresie 0-80% całkowitej mocy wyjściowej.

170 455

Układ ten kalibrowano za pomocą pomiaru wzrostu temperatury kawałków testowych materiału kartonowego tego samego rozmiaru, jak stosowane do testów biologicznych. Temperaturę mierzono przy użyciu termopary, która była umocowana do przedniej powierzchni karty.

Promieniowanie podczerwone miało dwa impulsy po 6,6 sekundy o mocy 80% (w przybliżeniu 40 J/cm2).

Największa temperatura powierzchni, która mogła być osiągnięta przy czołowym oświetleniu wynosiła około 40°C. Było to spowodowane obecnością cienkiej folii aluminiowej pod pokryciem polietylenu, po tej stronie karty, która odbijała znaczną część promieniowania podczerwonego, zapobiegając jego pochłanianiu w masie tej karty.

Laser ekscymerowy wykorzystywał mieszaninę gazową kryptonu i fluoru i emitował wiązkę świetlną przy długości fali 248 nm. Energia impulsu laserowego wynosiła około 300 mJ. Promieniowanie lasera padające na próbkę, kalibrowano przy użyciu detektora umieszczonego poza otworem 2 cm x 2 cm. Energia impulsu w tym otworze wynosiła 125 mJ. W ten sposób określono, że gęstość energii 1 J/cm2 wymagała 32 impulsów. Przeprowadzono następujące próby stosując promieniowanie laserowe:

1. Tylko ultrafiolet 1,0 Jcm2

2. Podczerwień z przodu kartonu

3. Równocześnie ultrafiolet 1,0 Jcm2 i podczerwień (przód)

4. Ultrafiolet 1,0 Jcm2, a następnie w kilka sekund (2 do 3) później podczerwień (przód)

5. Podczerwień (przód), a następnie ultrafiolet 1,0 Jcm2 (30) sekund później.

Karty pokryte bakteriami były pozostawione bez napromieniowania do określenia maksymalnego odzysku. Karty nie pokryte bakteriami były wystawione do atmosfery przez około 30 s, dla sprawdzenia przypadkowych skażeń. Następnie określono ilość bakterii, które przeżyły. Po napromieniowaniu, karty wracały natychmiast do swoich butelek i były przechowywane przez całą noc przy temperaturze 4°C.

Do każdej butelki dodano 10 ml sterylnej solanki zawierającej 0,1% Tween'u-20. Butelki były energicznie wstrząsane przez 30 sekund, po czym karty te były wyjmowane i wyrzucane. Wtórne próbki popłuczyn (100 gl lub 200 tl) były wyjmowane w sposób aseptyczny i rozprowadzone na powierzchni płytki pożywki agarowej. Niektóre próbki zostały seryjnie rozcieńczone, aby ułatwić zliczanie. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godz. i zliczano kolonie. Obliczano z tego całkowitą liczbę jednostek kolonizujących w 10 ml popłuczyn, co daje liczbę jednostek kolonizujących odzyskanych z tej karty.

Wyniki są przedstawione w tabeli 4.

Tabela 4

Obróbka	Załadowane jk/ml	Odzyskane jk.	Log. redukcji
1 (i) Tylko ultrafiolet 00	4,7 x 10⁵ II	4,4 x 10³ 5,6 x 10³	2,03 1,92 = 1,98
2 (i) Tylko podczerwień (ii)	11 II	4,5 x 10⁵ 4,5 x 10⁵	0,02 0,02 = 0,02
3 (i) Ultrafiolet i podczerwień równocześnie (ii)	,,	2,4 x 10³ 1,3 x 10³	2,29 2,56 = 2,43
4 (i) Ultrafiolet-podczerwień kolejno (ii)	,,	1,40 x 10³ 2,2 x 10³	2,53 2, 33 = 2,43
5 (i) Podczerwień-ultrafiolet, kolejno (ii)	,,	7,2 x 10³skażone	1,81 2,56 = 1,81

170 455

Jak wynika z przeprowadzonych doświadczeń, samo naświetlanie podczerwienią nie spowodowało zabicia bakterii. Jest również jasne, że wszystkie obróbki wymagające w zasadzie równocześnie podczerwieni i ultrafioletu przy 1,0 Jem2 (nr 3 i 4), dają większy logio redukcji niż sam ultrafiolet, sama podczerwień lub suma samego ultrafioletu i samej podczerwieni. Wynika więc z tych doświadczeń, że występuje efekt współdziałania, gdy podczerwień i ultrafiolet są zastosowane łącznie.

170 455

Fig.3

170 455

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób niszczenia drobnoustrojów na powierzchni ciała stałego, w którym naświetla się tę powierzchnię promieniowaniem ultrafioletowym o bakteriobójczej długości fali, znamienny tym, że w procesie niszczenia drobnoustrojów powierzchnię naświetla się ultrafioletowym promieniowaniem laserowym o bakteriobójczej długości fali.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gęstość mocy bakteriobójczego ultrafioletowego promieniowania laserowego nieuszkadzającą powierzchni ciała stałego.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że naświetlana powierzchnia jest powierzchnią materiału do pakowania, stykającą się z zawartością opakowania.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że powierzchnia stykająca się z zawartością opakowania jest powierzchnią tworzywa termoplastycznego.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że powierzchnia stykająca się z zawartością opakowania jest cienką warstwą polimerową.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że powierzchnię naświetla się dodatkowo promieniowaniem podczerwonym.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że powierzchnię naświetla się podczerwonym promieniowaniem laserowym.
8. Sposób według zastrz. 6, albo 7, znamienny tym, że powierzchnię naświetla się laserowym promieniowaniem ultrafioletowym i promieniowaniem podczerwonym równocześnie.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że naświetla się powierzchnię laserowym promieniowaniem ultrafioletowym i promieniowaniem podczerwonym uzyskując efekt synergiczny na naświetlanej powierzchni.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że naświetla się powierzchnię trójwymiarowego ciała stałego, reguluje się kierunek i natężenie promieniowania laserowego i utrzymuje się równomierne natężenie promieniowania na naświetlanej powierzchni.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że promieniowanie laserowe doprowadza się z wykorzystaniem halogramu (H) i utrzymuje się równomierne natężenie promieniowania na naświetlanej powierzchni.
12. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że ultrafioletowym promieniowaniem laserowym naświetla się powierzchnię, na której znajduje się nadtlenek wodoru.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że sterylizuje się powierzchnię ultrafioletowym promieniowaniem laserowym i nadtlenkiem wodoru uzyskując efekt synergiczny na naświetlanej powierzchni.