FI108517B - Menetelmä mikro-organismien tappamiseksi kiinteällä pinnalla - Google Patents

Description

;' B S1 7

Menetelmä mikro-organismien tappamiseksi kiinteällä pinnalla Tämä keksintö kohdistuu materiaalin käsittelemiseen, erityisesti materiaalin alistamiseen, laser-UV:lie.

5 Tunnetaan pakkausmateriaalien, esimerkiksi rasioiden sisäpintojen, sterilointi erilaisilla yhdessä tai erikseen käytetyillä keinoilla. Eräs keino on kuumuuden käyttäminen, esimerkiksi kuuman ilman tai virran muodossa lämpötilassa yli 100 °C useita sekunteja. Toinen käsittely on aallonpituudeltaan bakteereita 10 tappavan UV-säteilyn (esimerkiksi 254 nm) käyttäminen, joka tuottaa käsittelypinnalle keskimmäisen tehotiheyden, joka on luokkaa mW/cm2, esimerkiksi 8 mW/cm2, useita sekunteja. Toinen käsittely on suhteellisesti erittäin konsentroidun H202-liuok-sen käyttäminen useita sekunteja. Kahden tai useamman kä-15 sittelyn yhdistäminen on konventionaalista ja mahdollistaa käsittelyjen tiettyjen parametrien, esimerkiksi lämpötilan, käsittelyä jän ja/tai H202-konsentraation, pienentämisen. Esimerkiksi WO-A-80/01457:ssä kuvataan sterilointimenetelmä, jota voidaan soveltaa nesteisiin, esim. jäteveteen ja säilyketehtaan ; :·: · 20 jäähdytysveteen, mutta joka soveltuu erityisesti sairaaloiden pintojen, esimerkiksi seinien ja huonekalujen pintojen sekä ruoka-astioiden steriloimiseen. Viimeksi mainitut pinnat käsi-, tellään H202-konsentraatiolla alle 10 paino-%, esimerkiksi vie- mällä astia tai materiaali, josta astia valmistetaan, säiliön » · 25 läpi, joka sisältää H202-liuosta tai sulauttamalla astian tai materiaalin pinnat liuoksella. Säteilytys suoritetaan UV-lam-pulla, joka on sijoitettu siten, että astiat tai materiaali, f · ... jotka on tulevat säiliöstä tai sumutuksesta alistetaan UV:lie, joka on kokonaan tai pääasiallisesti alle 325 nm, siten, että : ’·’ 30 UV:n ja H202:n välinen synergia tekee mikro-organismit elin- : : kyvyttömiksi.

Ultraviolettisäteilyn käyttö fysikaalisena aineena mikro-orga- » ”·"· nismien vähentämiseen on hyvin vakiintunutta. Solu-DNA absorboi säteilyn energian välillä 250-260 nm, mikä johtaa kemiallisten 35 sidosten muodostumiseen viereisten tymiininuk- 2 '08517 leotidiemästen välille. Tämä muutos vääristää DNA-juosteet, häiritsee replikoitumista ja transkriptiota ja siten geenien ilmentymistä. Fataalisuus on väistämätöntä, jos oleelliset geenit suljetaan tai DNA-replikoituinen este-5 tään. UV-säteilyllä tapettujen vegetatiivisten solujen määrä riippuu altistuksesta ja annoksesta mW/cm^jna ja vastaavasti mJ/cm2:na ja UV on usein tehotonta tapettaessa bak-teerisisäitiöitä, erityisesti siksi, että UV:n tunkeutumis-voima on huono. UV-säteilyn, vetyperoksidin (peroksidiradi-10 kaali reagoi useimpien kemiallisten sidosten kanssa) ja kuumuuden yhdistetyllä käytöllä saavutetaan sterilointi mutta suurella hinnalla aika- ja kustannusmääräisesti (esimerkiksi vähintään 10 sekunnin käsittelyaika per rasia) pakkaajan osalta. Kemikaalin, esimerkiksi Η2θ2:η, käyttö 15 ruokapakkausten käsittelyyn voi olla myös eettinen näkökohta ja siten se voidaan luokitella vähemmän toivottavaksi. Siten on erittäin houkuttelevaa etsiä vaihtoehtoista ste-rilointij ärj estelmää.

20 WO-A-88/03369:ssä kuvataan järjestelmä sellaisten asioiden, kuten ilman, veden, ruoan ja ruokapakkausten, steriloimiseksi jaksoittaisilla, hyvin voimakkailla, hyvin lyhytkes-• toisilla valosykäyksillä, jotka ovat näkyvissä olevilla tai lähes näkyvissä olevilla taajuuksilla, kuten valolla, joka 25 on tuotettu esimerkiksi salamalampuilla. Jokaisen sykäyksen komponentit kattavat laajan spektrialueen ja voivat sisäl-tää kauko- ja lähi-UV:ta mikro-organismien deaktivoimiseksi fotokemiallisilla vaikutuksilla. Tällaisilla UV-rikkailla ’·’ ’ sykäyksillä on vähintään 15 % ja edullisesti vähintään noin 30 30 % energiasta aallonpituuksilla, jotka ovat lyhyempiä : kuin 300 nm. Tällaisissa UV-rikkaissa sykäyksissä voi olla V : tyypillisesti alhainen kokonaisenergiatiheys, kuten alueel- la noin 0,01-15 J/cm^ ja tyypillisesti noin 0,1-3 J/cm2. Kuitenkin ruokatuotepintojen käsittelyä varten voi olla 35 toivottavaa suodattaa pois spektrin alueita siten, että vä-• ’ hintään noin 90 % niiden energiasta jakautuu 300 ja 2500 nm:n välille. Tällaisissa menetelmissä, joissa sykäysvalo-salaman UV-komponentti on tukahdutettu tai oleellisesti eliminoitu, sykäysvalon voimakkuuden on oltava riittävä 3 -;8b17 kuumentamaan ruoka-aineen tai pakkausmateriaalin pintakerros, jonka paksuus on vähintään alle 10 mikronia, vähintään noin 50 °C:eesta lämpötilaan vähintään noin 75 °C ja edullisesti noin 100 °C.

5 EP-A-0201650:ssä selostetaan nesteiden laserdesinfiointi-järjestelmä, jossa lasersäde, joka säteilee UV-alueella olevaa valoa, suunnataan käsiteltävän nesteen virtaan. Järjestelmä sopii erityisen hyvin veden käsittelyyn ja sii-10 nä käytetään kaasusykäytettyä laseria, jonka sykäytys-nopeutta ja siten keskimääräistä UV-valonvoimakkuutta voidaan säätää. UV-säde täyttää vesivirran poikkileikkauksen. Nopeus voi vaihdella hitaasta niin nopeaan, että se on oleellisesti jatkuva säde ja se säädetään lasersäteen läpi 15 kulkevan vesivirran virtausnopeuden muutoksia varten ja se voidaan säätää myös veden sameuden muutoksia varten. Vaih-! toehtoisesti virran virtausnopeutta voidaan vaihdella ja UV-säteen voimakkuus pitää vakiona. Virtaa ohjaavan kanavan yksi tai useampi pinta voidaan tehdä UV:tä suhteellisen 20 runsaasti heijastavaksi säteen leviämisen rajaamiseksi, joka johtuu vedessä olevista suspendoituneista partikkeleista, ja säteen poikkileikkausalueen pienentämiseksi sä-: .·. teen muutoksen kompensoimiseksi pitäen siten lähes yhtenäi- nen voimakkuus alueen pituudelta, jossa säde ja virta ovat 25 vuorovaikutuksessa. Säteen virtaan tunkeutumiskulmaa voi-**’!_ daan säätää vasteena veden sameuden muutoksiin. Lisäksi '1*1 säteen geometriaa, erityisesti sen pituutta voidaan muuttaa *.,* vasteena veden piirteiden, kuten orgaanisen sisällön, muu- ’·’ * toksiin. Fluorikryptoniekskimeerilaser, joka tuottaa 249 30 nm:n aallonpituuden, on edullinen.

• · · v : US-A-3817703 kohdistuu menetelmään valoa läpipäästävään .··. materiaaliin suspendoituneen elävän aineksen tuhoamiseksi.

Siinä selostetaan mahdollisuus steriloida samanaikaisesti 35 astiat ja niihin varastoidut materiaalit suuntaamalla la-sersäde astiaan siten, että säde tulee kosketuksiin astian sisäpintojen kanssa sterilointiprosessin aina ja siten myös kaikki säiliössä oleva materiaali alistetaan valosäteille. Materiaaliin suspendoitunut tai astian seiniin takertunut i 1 λ rt HS I i 4 elävä aines tuhotaan siten. Yhtä tai useampaa värähtelevää peiliä käytetään, jotta yksi tai useampi lasersäde pyyhkäisee astian.

! US-A-3941670:ssä selostetaan IR-laserin käyttäminen kohteeseen, i | 5 joka voidaan pyyhkäistä lasersäteillä värähdyttämällä peiliä.

Valo muuttaa makromolekyylisten lajien biologisen aktiivisuuden ärsyttämällä säteilytettyjen lajien värähtely- ja rotaatiotilo-ja. Voidaan steriloida erilaisia kohteita, esimerkiksi ilmaa tai tai muita nesteitä, muoveja tai metalleja, kuten alumiini-10 kalvokaistaleita tai -nauhoja.

DE-A-2914075:ssä selostetaan järjestelmä ennalta muodostettujen taitettujen pahvirasioiden sisäpintojen steriloimiseksi. UV-lähteet, esimerkiksi vertikaaliset, elohopeahöyrylähteet, ovat insertoitavissa alaspäin vastaaviin pahvirasioihin eroavissa 15 asemissa suhteessa pahvirasioiden sivuseiniin siten, että jokainen pahvirasia vastaanottaa UV-lähteet vuorollaan, voimakkuudeltaan riittävä UV-säteily saavuttaa muutoin varjossa olevat kulma-alueet, jotka pahvirasian pohja ja sivusaumat muodostavat. Suoritusmuodossa saadaan aikaan UV-sterilointi, joka yh-20 distetään kuumasterilointiin siten, että kuumuudelle herkät hiivat ja homeet voidaan eliminoida. Tällainen kuumasterilointi * ; voidaan suorittaa virtauksella tai säteilyttämällä, nimenomaan infrapunasäteilylähteillä, jotka ovat samaten insertoitu asti-aan ennen tai jälkeen UV-lähteitä.

• * 25 Esillä olevan keksinnön ensimmäisen kohteen mukaisesti saadaan aikaan menetelmä kiinteän pinnan steriloimiseksi, joka käsittää mainitun pinnan säteilyttämisen UV:llä, jolla on aallonpituus, joka on bakteereita tappava, jolle menetelmälle on tunnusomais-

* I

·;·* ta että mainittu UV on laser-UV.

30 Esillä olevan keksinnön toisen kohteen mukaisesti saadaan ai-'t kaan menetelmä kolmiulotteisen kohteen pinnan alistamiseksi La- sersäteilylle, jolle on tunnusomaista, että säteilyn suuntaa ja 'f! voimakkuutta kontrolloidaan siten, että tuotetaan suhteellises ti tasainen säteilyvoimakkuus mainitulle pinnalle.

•8517 5

Esillä olevan keksinnön kolmannen kohteen mukaisesti saadaan aikaan menetelmä materiaalin steriloimiseksi, joka käsittää materiaalin säteilyttämisen IR:llä ja UV:llä bakteereita tappavan vaikutuksen tuottamiseksi materiaaliin, jolle menetelmälle on 5 tunnusomaista, että IR:llä ja IVrllä säteilyttäminen suoritetaan oleellisesti samanaikaisesti.

Esillä olevan keksinnön neljännen kohteen mukaisesti saadaan aikaan menetelmä materiaalin steriloimiseksi, joka käsittää materiaalin säteilyttämisen IR:llä ja UV:llä bakteereita tappavan 10 vaikutuksen tuottamiseksi mainittuun materiaaliin, jolle menetelmälle on tunnusomaista, ettfä mainittu UV on laser-UV.

Esillä olevan keksinnön viidennen kohteen mukaisesti saadaan aikaan menetelmä materiaalin steriloimiseksi, joka käsittää materiaalin säteilyttämisen laser-UV:llä ja sen alistamisen vety-15 peroksidille bakteereita tappavan vaikutuksen tuottamiseksi mainittuun materiaaliin, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että mainittu UV on laser-UV.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa tenttivaatimuksissa.

• · · 20 Tiedetään erittäin hyvin, että pakkausmateriaalien kes:o-··· muovimateriaalit, esimerkiksi ohuiden polymeerikerrosten pin- nat, ovat erityisen lämpöherkkiä. Kuitenkin olemme havainneet, t * · · :·,·. että käyttämällä laseria on mahdollista säteilyttää näitä pin- toja keskimääräisellä tehotiheydellä, joka on yli 1 W/cm2, · · * 25 edullisesti alueella 4 W/cm2 - 10 W/cm2 ilman että vaikutetaan vahingollisesti kestomuovipintaan. Energiatiheys on edullisesti yli 50 mj/sek/cm2, käytettynä alle 10 sekuntia.

On myös mahdollista käyttää UV:tä joko laser-UV:tä, taikka ei, materiaalin steriloimiseen ja käyttää samanaikaisesti • · 30 IR:ää joko laser-IR:ää, taikka ei, tämän materiaalin kuumenta- : miseen, mikä edistää nopeampaa sterilointia ja/tai estää ma- ·;· teriaalin tahmeutumisen tai sulamisen suljettaes- 6 MH517 sa ja/tai estää vaahdon muodostumisen pakkaussisältöön täyttämisen aikanana. IR:n ja UV:n käyttäminen tällä tavalla on joko samanaikaista tai limittyy ajassa.

5 Suhteellisen suuren tehotiheyden saamiseksi UV ja/tai IR voidaan kohdistaa kohtaan, joka saadaan aikaan pyyhkäisyn siirtämisen suorittamiseksi, esimerkiksi käyttämällä peilejä. IR ja/tai UV voidaan taivuttaa tietokoneella synnytetyn hologrammin läpi suhteellisen tasaisen tehotiheyden 10 saamiseksi käsiteltävällä kolmiulotteisella pinnalla. Vaikkakin keksinnön tärkeä kohde on UV:n käyttäminen yksinään kiinteän pinnan steriloimiseen, H2C>2:ta voidaan käyttää la-ser-UV:n kanssa (ja laser-IR:n kanssa) steriloimisen saamiseksi. Olemme havainneet, että laser-UV:n käyttönä yh-15 distettynä H2C>2:een on synergistä vaikutusta bakteereita tappavasta näkökulmasta.

i

Olemme myös havaineet, että mikro-organismien tiheyden noustessa esiintyy sterilointimenetelmän elinvoimaisuuden 20 suhteellisen äkillinen putoaminen, mikä tuottaa niin kutsutun "halkeama"vaikutuksen.

> Mielestämme sykäytetty UV on erityisen edullinen, erityi- sesti sen ollessa tehokkaampi kiinteiden pintojen steri- ; 25 loinnissa verrattuna jatkuvaan UVrhen.

j ϋ”. Käytetty UV-aallonpituus on edullisesti alueella 240-280 nm, esimerkiksi noin 250 nm. Käytetty IR-aallonpituus on t < » ’·* ’ edullisesti alueella noin 1 000 - noin 10000 nm.

30 ti * ί Laserin käyttämisen UV:n aikaansaamiseksi vastakohtana V : UV:tä välittävään pieneliöitä tuhoavaan lamppuun on havait- ,···, tu antavan seuraavat edut: (1) suhteellisen korkeat absoluuttiset energiatiheydet . 35 (2) alhainen hajaantuminen, erittäin suunnattava lähtösäde, joka tekee sen erityisen sopivaksi pahvirasioiden spesifis-ten alueiden käsittelyyn, joissa kontaminoituminen voi olla vakavaa, esim. pahvirasioiden kulmat ja taitteet.

j 8 S 1 7 7

Keksinnön ymmärtämiseksi selvästi ja sen helposti voimaan saattamiseksi viitataan nyt seuraaviin piirroksiin ja esimerkkeihin: kuvio 1 esittää kaaviollisesti laitteen, jota käytetään 5 testikaistaleiden altistamiseen laser-UV:lie, ja I kuviot 2 ja 3 esittävät kaaviomaisesti kaksi vaihtoehtoista järjestelmää, jotka ovat käyttökelpoisia saataessa oleellisesti yhtenäinen laser-UV-emergian jakautuminen yläosastaan avoimen rasian sisäpinnalle.

10

ESIMERKKI I

(1.1) MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Kohdeorganismiksi laserkäsittelytutkimuksissa valittiin sisäitiöitä muodostava bakteeri: Bacillus subtilis var. 15 globicii. Tämä bakteeri luokitellaan gram-positiiviseksi, aerobiseksi, sauvanmuotoiseksi, liikkuvaksi ja ei-patogee-niseksi. Se on kasvupaikaltaan kaikkialla läsnäoleva ja se voidaan löytää maaperästä, ulosteista, heinäpölystä, maidosta ja vedestä. Itiöiden muodostuminen mahdollistaa bak-20 teerin hengissä pysymisen latentisssa tilassa (lepäävänä ja elinkykyisenä) pitkän aikaa ja tekee erityisen tärkeäksi sen, että sterilointijärjestelmät pystyvät tappamaan nämä ’ sisäitiöt. Koska itiöt kestävät yli 100 °C:n lämpötiloja .V, ja muita tuhoavia aineita (kemikaaleja), ne tulee käyttö- * » 7 25 kelpoisia indikaattoreita steriloinnin tehokkuuteen ja nii- i tä käytetään säännöllisesti kemiallisen steriloinnin ja lämpökäsittelyjen tarkkailemiseen. Standardeja mikrobiolo- · *gisia testejä ja mikroskooppitutkimuksia käytetään testat- , I 1 ’·’ ‘ taessa näytteitä uuden sterilointimenetelmän arvioimiseksi.

30 Itiöiden identifiointia mikroskoopin alla auttaa niiden i suuri valontaittokyky ja vähentynyt taipumus värjäytyä ja s : : niiden spesifinen reagoiminen tiettyihin väreihin.

8 ; Väritöntä pahvirasiamateriaalia (pahvimateriaal ikerros , 35 joka on laminoitu polyetyleenikerroksilla, joissa on alu-miinikalvosulkukerros tai sitä ei ole) ja Bacillus subtilis '‘: var. globicii -itiösuspensiota, joka saatiin Elopak A/S:s- tä, Norjasta, käytettiin koko tutkimuksen läpi. Toista bak-teeriviljelmää (NCIMP 8649) käytettiin verrokkina aikaan- e -H517 saadun viljelmän ohella, joka toimi lajin itsenäisenä vahvistuksena. Menettelytapa jaettiin kolmeen päävaiheeseen, nimenomaan bakteerien päällystäminen testiliuskoille ja kaikki siihen liittyvät esipäällystysmenetelmät, näiden 5 liuskojen altistaminen laser-UV:lle ja sitä seuraava liuskojen analysointi.

(1.2.1) VALMISTEET ENNEN LASERILLE ALISTAMISTA Tehtiin testausjärjestelmä viljelmän päällystämiseksi pah-j 10 virasiamateriaalille testikaistaleiden muodossa painottaen kaistaleiden steriiliyttä ennen päällystämistä ja bakteerien spesifistä sijoittamista steriilille pinnalle siten, että kaistaleiden steriilius varmistettiin.

15 (1.2.1.a) PAHVIRASIAMATERIAALIEN STERILOINTI

Pahvirasiamateriaali leikattiin skalpelliterillä 6 cm2 ja 2 cm2 testikappaleiden saamiseksi. Nämä testikaistaleet altistettiin useille erilaisille sterilointikäsittelyille.: Vetyperoksidi 35 %t 1 ml / testikaistale, 2 minuuttia 20 Vetyperoksidi 2 %t 1 ml / testikaistale, 2 sekuntia sekä 2 minuuttia Höyrsterilointi autoklaavissa 121 °C:ssa 20 min.

- r i ‘ f * y. Kaikkien kaistaleiden annettiin kuivua hyvin ennen kuin 25 bakteeriviljelmä levitettiin ja joukko steriileitä kaista- t ;t leita asetettiin sivuun verrokeiksi.

t * » » > i \ *

Steriloituja kaistaleita pidettiin autoklaavipusseissa huo-* ' neenlämpötilassa 4 päivää ennen käyttöä. Päällystettyjä 30 testikaistaleita varastoitiin petrimaljoissa 4 °C:ssa 4 päivää.

y\ (1.2.1.b) BAKTEERILAJIEN VILJELEMINEN JA IDENTIFIOIMINEN

Bacillus subtilis var. globigii -itiösuspensiota alaviljel- » i 35 tiin ravintoaineliemessä (naudanuute, peptoni, vesi, pH 6,8), viljeltiin 37 °C:ssa ja tutkittiin 24 tunnin kulut-'· tua. Pesäkkeiden erottamiseen ja elinkykyisten laskelmien tekemiseen käytettiin standardeja "kaatolevy "menetelmiä. Ravintolientä ja steriiliä tislattua vettä käytettiin riip- 9 ; H 5 1 7 puen käytetystä "kaatolevy"menetelmästä. Ravintoaineagar (naudanutte, peptoni, agar, pH 6,8) toimi kiinteänä väliaineena organismin kasvulle. Pesäkkeiden visuaalinen havainnointi ja laskeminen tehtiin 36 tunnin 37 °C:ssa inkuboin-5 nin jälkeen. Puhtaita viljelmiä käytettiin sivelyvalmistei-siin ja niitä seuraaviin erottaviin värjäysmenetelmiin.

Käytetyt värit olivat Gram-väri ja Ziehl-Nielsenin sisä- i | itiöväri ja värjätyt valmisteet analysoitiin valomikroskoo- pilla (10x100).

10 (I.2.1.C) BAKTEERIEN PÄÄLLYSTÄMINEN TESTIKAISTALEILLE Lähtöviljelmän sarjalaimennoksesta peräisin olevat 100 μΐ alikvootit, jotka tuottivat 103 ja 10^ cfu/ml, tislatussa vedessä levitettiin aseptisesti steriilille pahvirasialius-15 kalle, levitettiin ja annettiin kuivua useita tunteja. Tes-tikaistaletta pidettiin päällystettynä steriilissä petri-J maljassa kuivausajan huoneenlämpötilasssa ja jälkeenpäin I varastointia varten 4 °C:ssa. Suurta huolta pidettiin sii tä, että petrimalja oli pystyssä koko ajan ei-laminoidun 20 pinnan onnettomuuskontaminoitumisen välttämiseksi.

Yksi testikaistale sarjalaimennosta kohti ja kaksi steriiliä näytettä sijoitettiin erikseen 10 mlraan ravintolientä : ja kasvu tutkittiin 36 tunnin kuluttua 37 °C:ssa. Sameus « · 25 arvioitiin visuaalisesti ja sitä seurasi 100 μ1:η kasvuvä-,‘j' liainetta sijoittaminen ravintoagarlevyille toiseksi 36 ·· tunnin inkubointijaksoksi 37 °C:ssa ja valmistehavainnot tehtiin edellä kuvatusti.

30 (1.2.2) TESTIKAISTALEIDEN ALTISTAMINEN LASER-UV:LLE

Käytetty laser (avautuma, joka osoitetaan Q:na oheisten piirrosten kaaviomaisessa kuviossa 1) oli Questek 2000 Se-ries -ekskimeerilaser, joka toimii kryptoni fluoridi (KrF) -transitiolla, joka tuottaa säteilyn ultraviolettina 248 35 nmrssä. Ekskimeerilaseria sykäytettiin tuottaen 10-20 ns ‘ ; pulsseja toistoarvoina muutamaan sataan Hertsiin saakka.

Käytettiin seuraavia toimintaparametrejä:

Pulssienergia: 200 mj 10 --/8517

Toistoluku: 100 Hz

Laser välittää säteen, joka on suunnilleen 3 x 2 cm (horisontaali x vertikaali).

5 Käytetty optinen järjestelmä on esitetty kuviossa. Energia-tiheyttä näytteessä muutettiin muuttamalla fuusioitua pii-dioksidilinssiä L ja/tai d:n etäisyyttä linssistä maskiin M ja siten linssistä näytteeseen.

10

Aluksi käytettiin 25 cm polttovälin sylinterilinssiä säteen laajentamiseksi horisontaalimitassa tuottaen suunnilleen 3 x 3 cm:n säteilytysalue maskissa M. Saatu energiatiheys/-laukaisu oli näytteessä 40 mJ/cmf mikä tuotti keskimääräi-15 sen tehotiheyden 4 W/cm 100 Hz:ssä.

Suuremman tehotiheyden tuottamiseksi näytteessä etäisyyttä näytteeseen pienennettiin ja näytteen kokoa pienennettiin myös vastaavasti 3x3 emistä 1 cm x 1 emiiin. Energia/lau-20 kaus- ja keskimääräiset tehotiheydet olivat tässä konfigu-raatiossa 130 mJ/cm2 ja vastaavasti 13 W/cm^.

Alempien säteilytiheyksien mahdollistamiseksi sylinteri-·'·· · linssi korvattiin pallolinssillä, jonka polttoväli on 20 25 cm. Saatu sädealue täytettiin näytteessä oleellisesti mas-kiavaumalla, mikä sai aikaan energia/laukaisu- ja keskimää-räiset tehotiheydet näytteessä 10 mj/cm^ ja vastaavasti 1 • · : mJ/cm^ » * « 30 Kaikissa tapauksissa energiatiheys mitattiin maskiavauman :v. tasolla. Näyteestä oli muutamia senttimetrejä tämän tason takana. Kuitenkin tällä viety altistumisen ero oli pieni • ♦ · kun siirtymä oli pieni verrattuna etäisyyteen d, joka oli *...· tyypillisesti alueella 40-70 cm.

·:··: 35 Käytettiin erilaisia säteilytysaikoja riippuen testatuista energia- ja tehotiheyksistä: 1 0 mJ/cm2; -| . ja 6.

40 mJ/cm^: 1. ja 6.

I · 11 , , ’ ) f Λ ry - - b ! / 130 mJ/cm^: 15.

Valmistetut testikaistaleet asetettiin steriloituja neuloja käyttäen balsapuukappaleelle, joka oli peitetty alumiini-5 kalvolla. Sekä kappaletta että kalvoa steriloitiin sitten 20 min. 121 °C:ssa ennen käyttöä. Riippuen testikaistalei-den koosta käsiteltiin kahdestatoista kuuteentoista näytettä yhtenä kappaleenaa kappaleen ollessa asetettu labjack J:hen pyyhkäisyn aikaansaamiseksi. Näytteiden asettaminen 10 kappaleeseen tapahtui hygieenisissä olosuhteissa käyttäen steriloituja pihtejä kaistaleiden kiinnittämiseen.

Kokeet H202illa tehtiin seuraavasti: a) 100 μ1:η 2-% lista H2O2 lisääminen testikaistaleeseen 15 (yksi kuhunkin testilaimennokseen), levitettynä pahvin pinnalle, kuumakuivattu, sitten altistettu lasersäteelle b) kuten a) mutta ei kuumakuivattu ennen lasersäteelle altistamista, testikaistaleet kerrostettiin steriilien pii-dioksidigeelilasilevyjen väliin, käsiteltiin laserilla ja 20 lämpökuivattiin sitten.

Käytetty lämpö oli suunnilleen 100 °C pohjapiidioksidilevyn laboratoriolämpölevyyn kosketuksen ajan. Päällyspiidioksi-: dilevy poistettiin kuivaamismenetelmää varten.

25

(1.2.3) TESTI KAISTALEIDEN STERIILIYDEN TESTAUS LASERKÄSIT-TELYN JÄLKEEN

! ·': Kaikki lasersäteelle alistetut näytteet mukaan lukien ver- rokkinäytteet sijoitettiin välittömästi erillisiin yleis-30 säiliöihin, joissa oli 10 ml steriiliä ravintolientä ja niitä inkuboitiin 36 tuntia 37 °C:ssa. Steriiliys tutkit-_ tiin arvioimalla liuoksen sameus inkubointiajan jälkeen ja sitä seurasi alaviljeleminen ravintoaineagralevyilla ja toinen inkubointi 36 tuntia 37 °C:ssa ja kasvu tutkittiin 35 mikroskoopilla indikaattorikannan läsnäolon osalta.

» » » ♦ »

_ (1.3). TULOKSET

(1.3.1) ENNEN LASERILLE ALTISTAMISTA

‘R S 1 7 12 - ' 1 1

Testikaistaleiden sterilointikäsittelyt osoittivat auto-klaavimenetelmän luotettavimmaksi ja menestyksekkäämmäksi menetelmäksi.

5 Bakteerivi 1 j elmän kuivausmenetelmä testikaistaleissa oli menestyksellinen neljän näytteen elinkykyisen pesäkekasvun ollessa 4 päivää vanha (testikaistaleita, jotka olivat yli I neljä päivää vanhoja, ei testattu). Sarjalaimennos ja sitä seuraava "kaatolevy"menetelmä osoittivat, että bakteerivil-10 jelmä sisältää 2 x 10? cfu (pesäkettä muodostavaa yksikköä) millilitraa kohti (5 agarlevyä laimennussarjaa kohti käytettiin pesäkkeiden keskimäärisen luvun toteamiseen). Steriilien kaistaleiden, joihin ei lisätty bakteereita ja joita käytettiin tutkimuksessa verrokkeina sekä aseptisten 15 tekniikoiden menestyksellisen käytön indikaattoreina, havaittiin pysyvän steriileinä useimmissa kokeissa. Kahdessa kokeessa, joissa kortit olivat olleet kosketuksessa ei-ste-riilin pinnan kanssa, testikaistaleita viljeltiin ja gram-negatiivinen organismi identifioitiin.

20

Kaikissa kokeissa Gram-värin ja Bacillus subtilis var. glo-bigii -bakteerin itiövärjäyksen käyttö identifioi selvästi organismin Bacillus subtilis -lajiksi.

25 Tulosten luokittelussa steriileiksi ja ei-steriileiksi ja testiorganismin erottelussa muista potentiaalisista konta-minanteista ei ollut epäselvyyttä.

ί ‘ · • « · 1

• I

♦ · 13 ' 8 517 (1.3.2) IHOSEN YHEENVEUD IASERHIE ΑΚΠΗΚΜΕΪΝ JÄLKEEN lönbi- Lasatesfcaus- 2 % Itesti- Ibisbokiku Sberiilimää- 1¾¾ olosuhteet, Η£>2, laista- rä 36 h ku- (W/στΐ) altisbusaika käytte- leei kko luttua ja 5 ty? (an x an) älcitusso- lutiheys 13 15 ei 1x12 jckaista 1 loissa 4 1 kyllä 1x1 5 jckaista 1 Koissa 10 | 4 6 kyllä 1x1 5 jckaista 1 10lissa 3 Koissa 4 1 ei 1 x 1 2 jckaista 1 106;ssa,1 | 15 6 2 106:ssa,2 4 1 ei 2,5 x 2,5 2 jckaista ei mitään 6 29 1 kyllä 2,5 x 2,5 2 jckaista 2 103;ssa,6 6 1 1()6:ssa,6.

1 103;ssa,1.

4 1 kyllä 2,5 x 2,5 2 jckaista 2 103;ssa,1 25 6 (silliä- 2 Koissa,2.

lasi) 11106:ssa,1.

2 ionissa,6.

13 5 kyllä 1x1 4 jckaista (silika- 4 ionissa 30 lasi) 31103:353 1 1 ei 3x45 jckaista ei mitään 6 : 35

* käsikontaminoituminen yhdessä näytteessä ’7i. (1.4) JOHTOPÄÄTÖKSET

II‘I Saatiin joitakin rohkaisevia tuloksia, jotka osoittavat 40 siten, että mikro-organismien tehokas tappaminen voidaan ·1 saada käyttämällä laser-UV:tä. 4 W/cm^ keskimääräisellä tehotiheydellä 6 sekunnin altistusajalla tappoteho (määri-: V tettynä steriilien testikaistaleiden luku/testikaistaleiden V ·' kokonaisluku valaistuna x 100) oli noin 30 %. Vetyperoksi- .·1·. 45 din sisällyttäminen testikaistaleeseen paransi tämän lähes 77 100 %,:iin. On huomattava, että H202:Ha saatiin erinomai nen tulos vain 1 sekunnin valaistusajalla.

ESIMERKKI II 50 (II.1) JOHDANTO

' M S 1 7 14 - D \ /

Esimerkin I tulokset osoittavat laser-UV:n mikro-organismeja, kuten Bacillus subtilis, menestyksellisen tappamis-tehon. Laservalaisujaksojen 1 sekunnista 6 sekuntiin 40 mJ/laukaus/cm^r (4 Wcm2) osoitettiin tappavan 10^-10^ bak-5 teerisolua useissa näytteissä.

Tässä esimerkissä tutkitaan edelleen määrällistä arviointia siitä kuinka monta organismia spefisellä laserkäsittelyllä tapetaan. Suuri määrä näytteitä testattiin erilaisten la-10 servalaisumenetelmien tappamistehon tarkkailemiseksi painottaen tehotiheyttä ja toistoasteita. Laservalosteriloin-timenetelmän herkkyys mitattiin havaitsemallla bakteerien eloonjääntiluvut erilaisten käsittelyjen jälkeen.

15 Useita muita koekysymyksiä tutkittiin tutkimuksen aikana. Ne olivat seuraavat:

Kuinta tauskalvo, jolle kaistaleet kiinnitetään, vaikuttaa syntyneeseen lämpöön ja kuinka tämä ylimääräinen lämpö, jos sitä on läsnä, vaikuttaa laserin tappotehoon? 20 Kuinka kaistaleiden asettamiseen käytetty puu vapauttaa kaistaleisiin substanssia, joka voi auttaa bakteerien tuhoamista? Aktivoiko autoklaavaus tätä substanssia, jos sitä on läsnä, ja ottaako kaistale sen itseensä? : Vapauttaako itse kaistale substansseja, jotka voivat vai- :.V 25 kuttaa bakteeritappoarvoon? Onko laserin synnyttämä lämpö j tarpeellista bakteerien kyseiseen tappamiseen.? '·’ Kuinka tehotiheyden vähentäminen (W/cm^) ja/tai toistoas-i ·*: teiden vähentäminen (Hz) vaikuttaa laser-UV-valaisun tappo- tehoon? 30

(II. 2 ) MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Tutkimuksessa käytettiin painamatonta rasiamateriaalia (Al-kalvolaminaatti) ja Studland-kiinnityskartonkia (laminoi-maton). Bacillus subtilis var. globigii -itiösuspensiota *:··: 35 käytettiin sarjalaimennosten tekemiseen tislattuun veteen. >ii-; Nämä laimennossarjat jaettiin testikaistaleille, niiden annettiin kuivua ja ne altistettiin laser-UV:lle.

is "-'3517

Menettely jaettiin kolmeen päävaiheeseen, nimenomaan bakteerien päällystämiseen steriloiduille testikaistaleille, kaistaleiden altistamiseen laser-UV:lle ja sitä seuraavaan näiden kaistaleiden analysointiin.

5 (II.2.1.) VALMISTEET ENNEN LASERILLE ALTISTAMISTA Rasiamateriaali ja kartonki leikattiin skalpellilla levyiksi 1,3 cm x 1,3 cm testikaistaleiden saamiseksi. Balsami-puukapppaletta kohden käytettiin 18 testikaistaletta (Puu 10 peitettiin Al-kalvolla tai jätettiin päällystämättä). Kaistaleet sijoitettiin puulle kaikkiaan kolmeen riviin kappaletta kohti kuusi kaistaletta rivissä.

Kaikki kaistaleet pidettiin paikallaan autoklaavinauhalla 15 siten, että 1 cm^rn kartonkialue kaistaletta kohti pysyi altistettuna. Jokainen kappale sijoitettiin erilliseen au-toklaavipussiin ja autoklavoitiin 121 °C:ssa 20 minuuttia.

50 μΐ jokaista valmistettua laimennosta 10-1, 10-2, 10-3f 20 10-4 lähtöviljelmästä Bacillus subtilis var. globigii jaet tiin aseptisesti kaistaleille ja niiden annettiin kuivia laminaari-ilmavirtausolosuhteissa useita tunteja. Kahta . . kaistaletta puukappaletta kohti käytettiin verrokkeina, so.

: ei altistettu laserille ja yhtä kaistaletta puukappaletta 25 kohti käytettiin blankona, so. mitään bakteeri laimennosta ei lisätty. Jokainen balsamipuukappale, jossa kaistaleet olivat, palautettiin sitten steriiliin autoklaavipussiin ja j ' : suljettiin laser-UV-käsittelyyn saakka.

30 Peruslinjan, josta bakterien tappaminen voidaan arvioida, tuottamiseksi yksikköjä muodostavan pesäkkeen lukumäärä, » * joka kerrostettiin kaistaleille erilaisista laimennoksista, arvioitiin käyttämällä detergenttitalteenottomenetelmää » i ► seuraavasti:

Sopivalla bakteerilaimennoksella valmistetut kaistaleet upotettiin 0,1-%:iseen Tween 20:een (steriili laimennettu vesilaimennos).

35 H S 1 7 16 ....... 1 '

Ympättyjen kaistaleiden Tween 20:n talteentottotehoa verrattiin steriilin veden talteenottoon siten, että voitiin määrittää menetelmän periaatteen todiste.

5 Kaistaleiden, jotka on kiinnitetty balsamipuuhun tai jotka on jätetty kiinnittämättä steriileihin petrimaljoihin, välisiin vertailuihin ennen talteenottoa sisällytettiin muita menetelmävaihtoehtoja sen näkemiseksi, onko läsnä vaikutusta bakteereihin.

10 (II.2.2.) TESTIKAISTALEIDEN ALTISTAMINEN LASER-UV:LLE Laseria käytettiin kuten esimerkissä I, mutta sykäysenergia | nostettiin 250 mJ:een. Ainoat tehdut muuntelut olivat käy tetty toistoaste (Hz), valaisuaika ja energiatiheys. Tes-15 tatut muuntelut on esitetty seuraavan taulukon kaistassa "Laserparametrit".

25 cm:n sylinterilinssiä käytettiin jälleen säteen pystymi-tan pienentämiseksi 40 mJ/laukaus/cm^ :n energiatiheyden 20 saamiseksi.

Yksittäisellä puukappaleella käsiteltiin korkeintaan 18 . . kaistaleet kappaleen ollessa asetettu labjack J:hen pyyh- ;V käisyn aikaansaamiseksi. Pyyhkäsymenetelmä suoritettiin ·'·’ 25 hygieenisissä olosuhteissa ja kappaleet sijoitettiin ste-···! riileihin autoklaavipusseihin käsittelyn jälkeen. Pussit suljettiin ja niitä varastoitiin huoneenlämpötilassa siihen ! ! saakka, kunnes seuraavat analyyttiset menetelmät aloitet- : tiin. Useimmalla puukappaleista oli kolme kaistaletta, jot- 30 ka eivät saaneet UV-valaisua (kahta näistä näytteistä käy-·*·’. tettiin verrokkeina ja yhtä kaistaletta, jossa ei ollut bakteereita, käytettiin nollaverrokkina).

(II. 2.3) MENETELMÄT LASERILLE ALTISTAMISEN JÄLKEEN ’ 35 Kaikki kiinnitetyt kaistaleet poistettiin aseptisesti puu- • ;..j kappaleilta, ne lisättiin erillisiin pulloihin, jotka sisälsivät 5 ml laimenninta ja niitä pyörresekoitettiin vähintään 30 sekuntia. 100 μΐ jokaista näytettä pipetoitiin 1 o c i n 17 erillisille ravintoagarlevyille, siveltiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa vähintään 24 tuntia.

Levyt tutkittiin visuaalisesti pesäkekasvun osalta ja pe-5 säkkeiden lukumäärä laskettiin.

(II.3) TULOKSET

(II.3.1) ENNEN LASERILLE ALTISTAMISTA

Sarjalaimennosten ravintoaineagarlevymenetelmä sai aikaan 10 toistuvan määrän pesäkkeitä bakteerikonsentraatiota kohti ja mahdollisti talteenottokertoimen laskemisen.

Havaittiin, että paras menetelmä bakteerien talteenottami-seksi kaistaleista oli 1 minuutin pyörresekoittamisen käyt-15 tö laimentimessa. Talteenotto oli 50 % - 90 % kaistaleessa olevista bakteereista. Sarjalaimennoskoe osoitti, että läh-töviljelmässä oli 1,5 x 10? cfu/ml.

Kahdessa testatussa materiaalissa ei esiintynyt mitään eroa 20 saadussa talteenottoasteessa. Koe, jossa testikaistaleet olivat balsamipuulla, verrattuna kaistaleisiin, jotka jätettiin petrimaljoihin, ei antanut mitään eroja tuloksissa, mikä sulkee pois taustakantoaineen aiheuttaman minkä tahan-···' ·* sa kemiallisen vaikutuksen.

:Λ: 25

(II. 3.2) LASERILLE ALTISTAMISEN JÄLKEEN

Tuloksia, jotka saatiin kokeista ennen laserille altista-i’·': mistä sekä tutkimuksista materiaalissa tai puussa olevista potentiaalisista bakteerisubstansseista, tutkittiin edel-30 leen testikaistaleiden avulla, jotka alistettiin laser-UV-valaisuun, mutta mitään vaikutuksia ei havaittu. Kaikki [..! potentiaaliset kuumennuksen vaikutukset bakteerintappomää- rään osoitettiin vääriksi, kun laser-UV-valaisun lämmönvoi-makkuutta laskettiin lämpövaikutuksten poissulkemiseksi '*’· 35 (altistusajan pituus säädettiin fotonien saman kokonaislu-vun saamiseksi, so. 10 sykäystä sekunnissa 10 sekunniksi 100 sykäyksen sekunnissa asemasta).

' s S j 7 1 8 ” ' -

(II.3.3) ESIMERKIN II TULOSTEN YHTEENVETO

Laserpara- Kokonaisener- Näytteiden Log-io vähe- metrit gia (J/cm) lukumäärä* neminen** 5 4 0 mJ/lau- 4 36 >5,2 kaus/cm2 100 Hz, 1 sek 4 0 m J / 1 au - 1 ,2 1 >5,2 10 kaus/cm2 j 30 Hz, 1 sek 6mJ/lau- 0,6 3 2,7 kaus/cm2 15 100 Hz, 1 sek 40 mJ/lau- 0,4 2 <1,0 kaus/cm2 2 Hz, 5 sek 20 40 mJ/lau- 0,12 2 3,3 kaus/cm2 3 Hz, 1 sek I · · :.V 25 6 mJ/lau- 0,06 3 1 ,8 kaus/cm2 2 Hz, 5 sek | i ·’: * Jokaisessa näytteessä oli 1 ,5 x 10^ itiötä 1 cm2:n koh-30 teen pinnalla ** Määritetty logio·11^ (1#5 x 10^ eloonjääneiden lukumää-ra).

Energiatiheyden 55 mJ/laukaus/cm2 käyttö yli 2 sekuntia sai 35 aikaan kaistaleiden fysikaalisen vahingoittumisen (kupli-mis- ja ruskettumisvaikutus).

(II.4) JOHTOPÄÄTÖS

19 i:J8517

Koetulokset osoittavat, että laser-UV:n tappoteho riippuu käytetyistä laser-parametreista ja läsnäolevista bakteeri-organismeista mutta se ei riipu substraattimateriaalista. Useimmista testatuista laserparametreistä paljastui suuri 5 bakteerilukujen tappoteho alle 106 cfu. Yhden sekunnin va-laisuajalla 40 mJ/laukaus/cm2, 100 Hz, saavutettiin baktee-rikonsentraation 1,5 x 105 cfu 100 ¾ tappaminen. 1,5 x 105 cfu:n suurella tappoteholla yhden sekunnin valaisuaikoina ja suhteellisen alhaisilla energia- tai toistoarvoparamet-10 reillä, kuten 6 mJ/laukaus/cm2 100 Hztssä ja 40 mJ/lau-kaus/cm2 3 Hzrssä, on erityistä tärkeyttä kartongin steriloinnissa.

i Yhtenäisen energiajakauman saamiseksi pahvirasian sisäpin- t j 15 nalle kuvioissa 2 ja 3 esitetyt kaksi järjestelmää tarjoa- I vat mahdolliset vaihtoehtoiset liuokset, joilla voidaan saada aikaan mitoitetut energiajakaumat.

Ensimmäisessä, kuviossa 2 esitetyssä, käytetään tietoko-20 neella generoitua hologrammia H, joka heijastaa UV-valosä-teen B hyvin määritettynä kuviona. Se koostuu kompleksises-i ta pintarakenteesta tai -ristikosta, joka muodostuu lasin- palan pintaan. Sen suunnitteleminen edellyttää laskentavä-·'·’ : lineitä, joilla voidaan ennakoida kuinka valo on vuorovai- :.V 25 kutuksessa ristikkorakenteen kanssa. Ristikko tuotetaan päällystämällä lasi valonkestävällä aineella ja piirtämällä ...‘I' kuvio valonkestävään aineeseen elektronisäteellä. Valonkes- | ’ : tavan aineen kehittäminen poistaa alueet, jotka on altis- i*;*: tettu. Sitten lasi syövytetään kuvion tuottamiseksi uudel- 30 leen lasiin, joka kuva oli läsnä valonkestävässä aineessa.

• » · ,·/, Toisessa järjestelmässä, joka on esitetty kuviossa 3, käy tetään kahta galvanometriä (ei esitetty) vastaavien peilien ohjaamiseen, joita voidaan pyörittää vastaavien akselien 35 ympäri, jolloin tulevaa lasersädettä B poikkeutetaan. Kah-den skannerin yhdistelmä mahdollistaa sen, että säde voi-(i_. daan suunnata kahdella akselilla. Kolmannen galvanometrin (ei esitetty) lisäämistä, joka ohjaa lineaarista siirtymävaihetta, toisin sanoen polttopisteen liikettä F, voidaan 20 ! 18 5 1 7 käyttää kahden linssin erottelun vaihtamiseen muuttaen siten säteen hajaantumista.

j On havaittava, että näissä kahdessa järjestelmässä on pe- j 5 rusteellinen ero. Hologrammi H osoittaa säiliön C jokaisen kohdan samanaikaisesti, kun taas galvanometriohjain osoittaa alueet jaksoittain.

Lisäksi hologrammijärjestelmässä ei ole oleellisesti liik-10 kuvia osia.

ESIMERKKI III

(III.1) JOHDANTO

Tässä esimerkissä kuvataan kokonaisen kartongin skannausta, 15 erityisesti menetelmiä ja mikrobiologisia testejä, joita käytetään laser-UV-säteilyn tehokkuuden ja tehon tutkimiseen laserenergioiden ja bakteerikonsentraatioiden alueella .

20 (III.2) MENETELMÄ

Perustestiperiaate, johon kuuluu tyhjän, ylhäältä avoimen, yläosaltaan harjamaisten ELOPAK (rekisteröity tavaramerkki) -rasioiden sumuttaminen erityisellä indikaattoriorga- • * « nismilla, rasioiden säteilyttäminen laserenergialla ja sä- 25 teilyttämisen jälkeen eloonjääneiden bakteerisolujen luku- .määrän tutkiminen.

* ! (III.2.1) Indikaattoriorganismi : i : Testeissä käytetty indikaattoriorganismi oli Bacillus sub- 30 tilis var. globii. Varastoitiöliuoksen riittävän välittä-misen varmistamiseksi 0,5 ml:n näytettä alaviljeltiin ra-vintoaineliemessä ja sen annettiin kasvaa 37 °C:ssa 48 tuntia ennen sentrifugointia ja keräämistä steriiliin Ringerin ’··’ liuokseen. Tämän liuoksen annettiin olla 4 °c:ssa vähintään ' · 35 seitsemän päivää ennen kuin sitä käytettiin kokeisiin.

»Il»» (III.2.2) Rasioiden sumuttaminen • H S 1 7 21 ' ’ ’

Rasian viisi sisäpintaa sumutettiin indikaattoriorganismil-la. Käytetty sumutuslaite oli kädessä pidettävä sumutus-pumppu, joka välitti solut tasaisesti rasian pinnoille. Bakteerikonsentraatioiden alue oli luokkaa 107 ja 1 O8 solua 5 rasiaa kohti. Sumutettujen kartonkirasioiden annettiin kuivaa huoneenlämpötilassa laminaari-ilmakanavassa enintään 18 tuntia ennen käyttöä.

(111.2.3) Elossa olevien bakteerien havainnointi 10 Elossa olevien bakteerien havaitsemiseksi käytettiin huuh-telutestiä.

(111.2.4) Koejärjestys

Itiösuspensio laimennettiin Ringerin liuokseen varaston 15 1 0 — 1 —1 0 — 8 laimennossarjojen saamiseksi. 100 μΐ jokaista | liuosta pipetoitiin ravintoagarlevyille, siveltiin, levy invertoitiin ja sitä inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia ennen kuin bakteerikasvun visuaalinen tarkastus suoriotettiin. 2 ml jokaista sopivaa bakteerilaimennosta sumutettiin testi-20 rasioille ja niiden annettiin kuivua edellä esitetysti. Kaikki reagenssitölkit ja petrimaljat olivat steriilejä ennen käyttöä ja niitä käsiteltiin aseptisesti LAF-(Laminar , . Air Flow - laminaari-ilmavirta)-olosuhteissa. Ringerin liu- * i · > · · ;·/ os autoklavoitiin ennen Tween 20:n lisäystä.

25 >··! Sumutuskuviot ja solulukumäärän panostuminen rasiaa kohti r tutkittiin koeajoilla vedellä ja rasian reunojen aukeami-! *,· sella ja vahvistettiin bakteerisumutuksella ja agarin pääl- lystämisellä sekä talteenottotesteillä. Sumutuspumppu puh-30 distettiin 70-%:isella etanolilla ennen käyttöä ja sen an-nettiin kuivaa LAF-olosuhteissa. RAsian kannet valmistet-tiin liottamalla 70-%:isessa etanolissa, mitä seurasi lyhyt t;_ 100 etanolipäällyste ja sen jälkeen kuivaaminen. Muutama '··’ näytekansi testattiin ravintoaineliemellä steriiliyden f ‘ · 35 osalta etanolikäsittelyn jälkeen.

> i » ) I

Jokainen huuhtelutestikoe sisälsi käsittelemättömien, so. laserilla säteilyttämättömien, rasioiden ja bakteeri-itiöillä sumuttamattomien rasioiden verokkeja. Viimeksi mai 22 !B 51 7 nittu toimi taustakontaminaation verrokkina. Useimmat kokeet sisälsivät vähintään kahden bakteerilaimenteen testauksen. Tyypillinen koeajo näyttää seuraavalta: i 3 kartonkirasiaa sumutettiin itiösuspension 1 0-^-laimennok- 5 sella, 3 muuta rasiaa sumutettiin itiösuspension 10-2-lai-mennoksella.

10-1-laimennoksen osalta huuhtelutestiin käytettiin rasioita 1 , 2 ja 3 1:n ja 2:n ollessa testi ja 3:n verrokki, so. 10 rasiaa ei säteilytetty laserilla.

Samaa kaaviota seurattiin itiösuspension 10_2-laimennoksel-la sumutettujen rasioiden osalta.

15 Rasiat sijoitettiin (yksi kerrallaan) laseryksikön erityiseen rasianpitimeen. Säteilytysajan jälkeen rasia poistettiin pitimestä ja peitettiin steriloidulla kannella ja rasia siirrettiin laminaari-ilmavirtaukseen. Rasian käsittely ei-steriileissä ympäristöissä pidettiin absoluttisessa mi-20 nimissä mutta siihen ei kuulunut mitään potentiaalista kon-taminoitumisriskiä hetkellä, jolloin rasia poistettiin ra-sianpitimestä ja eikä rasiaa sen jälkeen käsiteltäessä.

• · · » » · ! *;V 10 ml huuhtelunesteliuosta pipetoitiin jokaiseen huuhtelu- * * « { 25 testirasiaan. Steriloitu kansi sijoitettiin jokaiselle ra- j ···* sialle ja rasioita ravistettiin voimakkaasti vähintään 30 * * * ·.·. kertaa sivua kohti, sitten niiden annettiin seisoa lyhyen ! aikaa minkä jälkeen tilavuudet kaadettiin erillisiin ste- * * * V ·’ riileihin yleissäiliöihin. Laimennussarjat valmistettiin 30 talteenotetusta tilavuudesta käyttäen steriiliä Ringerin liuosta. 250 μΐ tai 500 μΐ tilavuuksia jokaista liuosta ja verkkotalteenottotilavuus siveltiin ravintoagarlevyille ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia.

• » * * » » » ' ’ 35 (III.2.5) Lasertestin yksityiskohdat

Testattujen energioiden alue vaihteli 1,0 joulista 4,0 jou-liin cm^ kohti säteilytysaikojen ollessa suunnilleen 10 minuuttia (tämä ajanjakso, joka on kuusikymmentä kertaa maksimaalisesti kaupallisesti kohtuullinen aika kymmenen 23 ‘ B b 1 7 sekuntia rasiaa kohti, valittiin käytännöllisistä kokeen syistä kokonaisannoksen saamiseksi, joka on yhtäläinen yli kymmenen sekunnin aikana käytetyn kaupallisesti toivattavan annoksen kanssa). Jokainen rasia sijoitettiin pitimeen täs-5 mälleen samassa asemassa rasian koodipainatuksen kanssa pitimien takaosaan. Rasian yläosa pyrki olemaan kokonaan auki mutta joissakin tapauksissa se oli hieman taivutettu. Säteilytysmenetelmä oli automatisoitu ja tietokoneohjattu.

10 (III.3) TULOKSET

Aloitustulokset testausmenetelmien tutkimiseksi osoittivat, että sumutuskaaviot saivat aikaan bakteerien tasaisen jakautumisen ja että talteenottotestit olivat useissa kokeissa samalla konsentraatiotasolla kuin alkuperäinen sisään-15 tulo. Jäljempänä on yksittäisten testausmenetelmien tyypillisten esimerkkien kuvaus, jota seuraa merkittävimpien koetulosten yhteenveto.

(III.3.1) Laimennusarjat 20 Itiövarastoliuoksen laimennussarjat valmistettiin jokaista koeajoa varten oikean bakteeripanostuskonsentraation määrittämiseksi testinäytettä kohti.

' * I

· (III.3.2) Huuhtelutesti • # « ‘ ‘•‘25 Laimennussajöistä peräisin olevia tuloksia käytettiin ra-·.! sioille sumutetun bakteerikonsentraation määrän määrittä- .,miseen ja talteenottotestitarkkuuden varmentamiseksi. Ver-; rokkitalteenottotesti sisällytettiin jokaiseen koeajoon ja - i : jokaisen bakteerikonsentraation osalta lasketiin talteenot- 30 toprosentti. Kun talteenottomenetelmä oli vahvistettu luo-tettavaksi, voitiin lasersäteilyn tehokkuus mitata vasten , r, tallennettua talteenottotulosta ja testinäytteestä taiteen-otettujen pesäkkeiden todellista lukumäärää verrattiin tas-sä erityisessä bakteerikonsentraatiossa oleviin odotettui- f ' 1 35 hin lukuihin. Tyypilliset talteenottotulokset olivat hieman ·;·· odotetun tuloksen alapuolella.

Huuhtelutestiesimerkki: B S1 7 24

Testit Huuhtelutes- Huuhteluver- Laimennussar- tinäyte 10-1 rokkinäyte jät 10-1 5 verkko >200 huntu huntu 10_1 50 huntu huntu 10~2 4 ei lasketta- huntu vissa 10-3 -] 278 131 5 10 10-4 0 27 220

Laskentaesimerkki:

Varaston konsentraatio laskettiin laimennossarjatuloksista: ; 15 200 pesäkettä laimennoksena 10-4 levyllä olevasta 100 μΐ näytteestä siten 2,2 x 10® varasto.

Varaston 1 0-1-laimennoksen tulee siten olla 2,2 x 107, mutta koska käytettiin 2ml:aa, rasian panostuskonsentraatio 20 oli 4,4 x 107. Talteenotot 20 mlrssa Ringerin /Tween 20 -liuosta ja 100 μΐ levyalikvootti tarkoittaa, että kaikki huuhtelutestilaimennoksesta peräisin olevat tulokset on ; ,·, kerrottava näillä kertoimilla. Verrokkinäytteesä oli 278 f · a ”.V pesäkettä talteenotetun tilavuuden 10-3-laimennoksessa jo-Ϊ * * · ~ * ; 25 ten talteenotettu konsentraatio lasketaan 278 x 10·) x 10 x * * •”i 20=5,6x107. Tämä eroaa panostuskonsentraatiosta 1,2 x *·> 10'illä, joka on merkityksetön ero, mikä osoittaa siten, » I * : että talteenottomenetelmässä ei ole oleellista ongelmaa.

» I i | «V ' Varsinainen laserilla säteilytetty testinäyte tuottaa suun- 30 nilleen 200 pesäkettä 20 ml:n verkkotalteenottotilavuuden V: 100 μ1:η alikvootista, mikä osoittaa että 4,0 x 104 pesä- V; kettä tuottaa log-laskun <3,04 so. log (4,4 x 107 : 4,0 x i°4)· i · i » » * » 1 • . » f » ’ ' 35 10 ml:n huuhtelutestitilavuuden 250 μ1:η näytteenotannan Ί”: osalta laskentakerroin on x 40 (so. x 4 x 10), 10 ml:n ..<! huuhtelutestitilavuuden 500 μ1:η näytteen osalta laskenta- kerroin on x 20 (so. 2x10).

Log-laskun määrittely on seuraava: ' 1 · H S1 7 25 w D ! ’ logio (solua rasiaa kohti: elossa olevien solujen lukumäärä rasiaa kohti).

(111.3.5) Koetiedot 5 Rasiat, jotka oli sumutettu 1 ¢)7-1()8 solulla, altistettiin 1,2 tai 4 joulille/cm2. UV-säteily ja elossa olevat itiöt määritettiin huuhtelutestillä käyttäen 10 ml huuhteluliuos-ta ja ottaen 500 μ1:η ja 250 yl:n näytteet päällystykseen. Havaitut tappoluvut on annettu seuraavassa taulukossa.

10 (111.3.6) Tulosten yhteenveto i 10 ml:n huuhtelutestitilavuus / 500 μΐ tai 250 μΐ näytteitä

Panostus so- Huuhtelutes- Soluja las- Energia Logio-vähe- 15 lua/rasia ti, talteen- kettu 10 J/αιr- neminen otetut solut ml:aa kohti 2.4 x 107 80 *1 1,6 x 103 1 4,18 2.4 x 107 2,4 x 103*1 4,8 x 104 1 2,7 2.4 x 108 2,2 x 104*1 4,4 x 10$ 1 2,7 20 1 ,3 x 108 8,6 x 103*2 3,4 x 1θ5 1 2,58 1 ,3 x 108 8,8 x 103*2 3,5 x 1θ5 1 2,57 1 ,3 x 107 1 ,12 x 102*2 4,48 x 103 1 3,46 2,6 x 108 65*2 2,6 x 103 2 5,0 2,6x108 1,44x102*2 5,76 x 1θ3 2 4,7 25 2,6 x 108 85*2 3,4 x io3 2 4,9 2,6x108 27*2 1,08 χ1θ3 4 5,38 2,6x108 2,75*2 1,10 χ1θ3 4 5,37 : *1 (500 ai) :y; 30 *2 (250 μΐ) * «

",”. (III. 4) JOHTOPÄÄTÖS

!!'!_ 2 joulia/cm2 säteily sai aikaan mikro-organismien 5 log- laskun ja jopa suuremman annoksen 4 joulia/cm^ suuremmassa ·’ 35 kuin 5 log-laskussa. Seuraavassa voidaan tehdä johtopäätös yhteenvetona koetuloksista: : Kokokartonkirasioiden Laser-UV-skannaus voi tuottaa karton- V · kirasioiden steriloinnin.

.···. 2 joulia/cm2 tuottaa Bacillus subtilis var. globigiin 5 » * » 40 log-laskun.

I · • Rasian 750 cm2:n sisäpinta edellyttää 1500 joulia energiaa ' ’ steriloitavaksi.

Teholtaan 150 W:n UV-laserilla 5 log-laskun saavuttaminen vie 10 sekuntia.

26 -‘8b I 7

On mahdollista käyttää hyvin alhaisia H202~konsentraatioita yhdistettynä lasersäteiluyn joko energiatason vähentämiseen, jota tarvitaan samaksi aikaa rasiaa kohti tai vähentää aikaa rasiaa kohti samalla energiatasolla.

5

ESIMERKKI IV (IV.1) JOHDANTO

Tappoluvun määrällinen arviointi, kun käytetään UV-laserin ja IR-laserin yhdistelmää samanaikaisesti, tutkittiin tässä 10 esimerkissä.

Koejärjestys suunniteltiin siten, että altistamisen aikana kehittyneestä lämmöstä sekä erikseen jokaisen kokeen vaikutuksesta on lisäinformaatiota.

1 5

(IV.2) MATERIAALIT JA MENETELMÄT

| Käytettiin painamatonta kartonkirasiamateriaalia (Al-kal- volaminaatti). Indikaattoriorganismi oli Bacillus subtilis i var. globigii. Tästä lajista peräisin olevien itiöiden va- 20 rastoliuosta levitettiin rasiamateriaalille.

Testiin kuului kolme päävaihetta, nimittäin bakteereiden päällystäminen ennalta steriloiduille kartonkikaistaleille, | kaistaleiden altistaminen säteilylle ja näillä kaistaleilla 25 olevien elossa pysyneiden analysointi seuraavaksi.

(IV.2.1) Valmisteet ennen laserille altistamista I il'; Rasiamateriaali leikattiin skalpellilla 2 cm x 2 cm testi- ·’ kaistaleiden saamiseksi.

V *’ 30

Varastoitiösuspension (sisältää 4,5 x 10? cfu/ml) 10-ker- i täiset ja 100-kertaiset laimennokset tehtiin steriiliin · suolaliuokseen (0,85 % NaCl, joka sisältää 0,02 % Tween 20 ,···. levittämisen helpottamiseksi).

35 . Nämä laimennokset sisältävät 4,5 x 10^ ja 4,5 x 10^ cfu/ml » • '· vastaavasti.

Jokaisen laimennetun suspension 100 al:n alikvootit levi- -H SI 7 tettiin kaistaleiden poikki kaistalepanostuksen 4,5 x 105 ja 4,5 x 104 saamiseksi vastaavasti.

Kaistaleiden annettiin kuivua yön yli huoneenlämpötilassa. 5 Jotkin kaistaleet jätettiin päällystämättä steriiliyden testaamiseksi. Kuivaamisen jälkeen jokainen kaistale sijoitettiin steriiliin muoviseen yleispulloon.

Säteilyttämisen aikana kaistaleet pidettiin vertikaalisesti 10 ennalta steriloidulla bulldogimetallipidikkeellä.

(IV.2.2) Laserin kalibrointi Näihin testeihin käytetty infrapunalaser oli 15 W CC>2-la-ser. Sitä kontrolloitiin yksiköstä, joka salli säteilysy-15 käykset 6,6 sekuntiin saakka ja lähtövirtamuuttujan alueella 0-80 % täyslähtötehosta.

i j Järjestelmä kalibroitiin mittaamalla biologisiin testeihin käytetyn samankokoisen rasiamateriaalin testikappaleen läm-| 20 pötilan nousu. Lämpötila mitattiin käyttämällä lämpöparia, joka kiinnitettiin kartongin etupintaan.

Annettu IR oli kaksi 6,6 sekunnin sykäystä 80 % tehoa j (suunnilleen 40 J/cm2).

25 ^ Maksimaalinen pintalämpötila, joka voitiin saavuttaa edestä valaisulla, oli noin 40 °C. Tämän aiheutti ohuen alumiini-kalvon läsnäolo kartongin tällä puolella olevan polyetylee-nipäällysteen takana, joka kalvo heijasti merkittävän osuu-'·' ‘ 30 den IR-säteilystä estäen sen absorboitumisen kartongin pak suuteen.

: : Ekskimeerilaser käytti kryptonifluorikaasuseosta ja se .···. välitettiin 248 nm:n aallonpituudessa. Lasersykäyksen ener- 35 gia oli noin 300 mJ. Näytteeseen tuleva ekskimeerisäteily kalibroitiin käyttäen detektoria, joka oli sijoitettu 2 cm 'x 2 cm aukon taakse. Sykäysenergia oli tässä aukossa 125 *mJ. Tällä tavalla määritettiin, että 1 J/cm^rn energiavoi-makkuus edellytti 32 sykäystä.

28 Ί8 b 1 7 (IV.2.5) Lasersäteilykäsittelyt 1. pelkästään UV 1,0 Jem-2 2. IR kartongin etupuolelle 5 3. UV 1,0 Jcm-2 ja IR (etupuolelle) samanaikaisesti 4. UV 1,0 Jem-2, jonka jälkeen IR (etupuolelle) muutamat (2-3 sekuntia) myöhemmin 5. IR (etupuolelle), jonka jälkeen UV 1,0 Jcm_2monta (30) sekuntia myöhemmin.

10

Verrokit. Bakteereilla päällystetyt kartongit jätettiin säteilyttämättä maksimitalteenoton määrittämiseksi. Bakteereilla päällystämättömät kartongit altistettiin ilmankehäl-le noin 30 sekunniksi satunnaiskontaminaation tarkistami-15 seksi.

(IV.2.6) Elossa olevien bakteerien määrittäminen Säteilyttämisen jälkeen kartongit palautettiin välittömästi pulloihinsa ja niitä varastoitiin yön yli 4 °C:ssa.

20 10 ml steriiliä suolaliuosta, joka sisältää 0,1 ¾ Tween- 20:ä, lisättiin jokaiseen pulloon. Pulloja ravistettiin voimakkaasti 30 sekuntia, minkä jälkeen kartongit poistet-. . tiin ja hylättiin. Pesujen (100 μΐ tai 200 μΐ) duplikaat- ';/ 25 tinäytteet poistettiin aseptisesti ja levitettiin ravinto-• ; aineagarlevyn pinnalle. Jotkin näytteet laimennettiin sar- joittain laskemisen helpottamiseksi. Levyjä inkuboitiin 37 ··.: °C:ssa 24 tuntia ja pesäkkeet laskettiin. Tästä laskettiin ; ’.· 10 ml:n pesuissa oleva cfu:n kokonaisluku, mikä tuottaa : : 30 kartongista talteenotetun cfu:n luvun.

·*·': (IV.3) TULOKSET

. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

29 • :) 8 S 1 ?

Taulukko Käsittely Panostettu Talteenotettu Log-lasku cfu/ml cfu 5 1 (i) pelkkä 4,7 x 10$ 4,4 x103 2,03 UV “1,98 (ii) " 5,6 x 103 1 ,92 2 (i) pelkkä " 4,5 x 10$ 0,02 10 IR “0,02 (ii) " 4,5 x 105 0,02 3 (i ) UV j a " 2,4 x 1 03 2,29 IR saraanaik. “2,43 15 (ii) " 1,3 x 103 2,56 4 (i) UV-IR, " 1 ,40 x 1 03 2,53 jaksoittain “2,43 (II) " 2,2 x 103 2.33 20 5 (i) IR-UV, " 7,2 x 103 1 ,81 jaksoittain “1 ,81 (ii) " kontaminoi- : tunut ;:v 25

(V. 4 ) SELOSTUS

♦ » *

Kokeista ilmenevä selkeä tosiasia on, että IR-käsittely yksinään ei tapa bakteereita. On myös selvää, että kaikki • ’ käsittelyt, joihin kuuluu IR ja UV 1,0 J/cm~2 oleellisesti · 30 samanaikaisesti (nrot 3 ja 4) tuottavat suuremmat log-|o-laskut kuin UV yksinään, IR yksinään tai UV:n yksinään ja : IR:n yksinään summa. Siksi teimme johtopäätöksen, että sy- nerginen vaikutus esiintyy kun IR ja UV annetaan oleelli-sesti samanaikaisesti.

Claims (10)

30 · 8 b i 7

1. Förfarande för att förgöra mikroorganismer pä en fast * ! 20 yta innefattande besträlning av nämnda yta med UV pä en väglängd som förintar bakterier, kännetecknat av att för-·;··’ farandet innefattar besträlning av ytan med laser-UV, vars väglängd förintar bakterier, varvid nämnda laser-UV har en .·: effektdensitet pä nämnda yta som gör att laser-UV inte pä- 25 verkar den fasta ytan skadligt. ... 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda yta är ytan pä ett förpackningsmaterial som kommer : '·· i beröring med innehället.

1. Menetelmä mikro-organismien tappamiseksi kiinteällä pinnalla, joka käsittää sanotun pinnan säteilyttämisen UV:llä aallonpituudella, joka on bakteereita tappava, 5 tunnettu siitä, että menetelmä käsittää pinnan säteilyttämisen laser-UV:llä, jonka aallonpituus on bakteereja tappava, jolloin mainitun laser-UV:n tehotiheys mainitulla pinnalla on sellainen, että laser-UV ei vaikuta kiinteään pintaan vahingoittavasti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottu pinta on pakkausmateriaalin pinta, joka tulee yhteyteen sisällön kanssa.

3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att 30 nämnda yta som kommer i beröring med innehället är termo-plast. 32 " .· h s; 7

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu pinta, joka tulee yhteyteen sisällön 15 kanssa, on kestomuovia.

4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att nämnda yta som kommer i beröring med innehället är ett tunt polymerskikt.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu pinta, joka tulee yhteyteen sisällön kanssa, on ohut polymeerikerros. *;*/ 5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen me- ·"·' 20 netelmä, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää mainitun pinnan säteilyttämisen IR:llä.

5. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, kän-5 netecknat av att förfarandet innefattar besträlning av nämnda yta med IR

6. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att IR är laser-IR.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu | siitä, että IR on laser-IR.

7. Förfarande enligt patentkrav 5 eller 6, kännetecknat av 10 att nämnda yta besträlas med nämnda laser-UV och nämnda laser-IR samtidigt.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tun-25 nettu siitä, että mainittua pintaa säteilytetään maini- tulla laser-UV:llä ja mainitulla laser-IR:llä samanaikai-sesti.

8. Patenttivaatimuksen 5, 6 tai 7 mukainen menetelmä, . tunnettu siitä, että saadaan aikaan synergismiä laser-UV:n 30 ja laser-IR:n välille tapettaessa mikro-organismeja mainitulta pinnalta. · u, - ! 7 π . ί /

9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa mainittu pinta on kolmiulotteinen, tunnettu siitä, että lasersäteilyn suuntaa ja voimakkuutta säädetään siten, että mainitulle pinnalle tuotetaan suh-5 teellisen tasainen säteilyvoimakkuus.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lasersäteilyä käytetään hologrammina (H) suhteellisen tasaisen säteilyvoimakkuuden saamiseksi mainitulle pinnalle. 10 li. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää vetyperoksidin tuomisen mainitulle pinnalle ja vetyperoksidin säteilyttämisen laser-UV:llä.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että saadaan aikaan synergismiä laser-UV:n ja vetyperoksidin välille tapettaessa mikro-organismeja mainitulta pinnalta.

8. Förfarande enligt patentkrav 5, 6 eller 7, kännetecknat av att synergism ästadkoms mellan laser-UV och laser-IR vid förgörning av mikroorganismer pä nämnda yta. 15

9. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, där nämnda yta är tredimensionell, kännetecknat av att laser-strälningens riktning och intensitet regleras sä att en relativt jämn strälningsintensitet tillförs nämnda yta. :Y:

10. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att ··· 20 lasersträlningen används som hologram (H) för att fä en relativt jämn strälningsintensitet pä nämnda yta. : ·' li. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, kän- v · netecknat av att förfarandet innefattar tillförsel av vä- teperoxid pä nämnda yta och besträlning av väteperoxid med :··: 25 laser-UV. Y 12. Förfarande enligt patentkrav 11, kännetecknat av att • ’·· synergism ästadkoms mellan laser-UV och väteperoxid vid : : förgörning av mikroorganismer pä nämnda yta.