PT98534A - Processo de preparacao de derivados da golfomicina de composicoes farmaceuticas e de clivagem de adn - Google Patents

Description

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3'

MEMÓRIA.....O.ESÇRIIIVA

Campo Técnico 0 presente invento refere-se ao processo de preparação de novos compostos para clivagem de AON, antibióticos e antitumor e, mais especifícamente, a um grupo de compostos 5-hídroxiberizo--(1”,2S)-ciclodeca-2,7-di-ino~l-ona, incluindo um sistema de anel fundido* aromático, monocíclico ou bicíclico, na posição 9,10, que serão aqui designados por golfomicina, e dos seus derivados-

Ai;t®.....AlLtej:.i.or·

Desde há muito tempo que os produtos naturais têm captado o interesse e a imaginação dos químicos interessados no Isolamento, na síntese e ria química medicinal, devido às suas estruturas fascinantes e actividade biológica- As moléculas concebidas pelo Homem ("moléculas de projecto") com propriedades químicas e biológicas pré-definidas poderiam enriquecer e complementar este arsenal de substâncias e aumentar a capacidade da química em proporcionar compostos biologicamente e terapeuticamente úteis-

No presente invento descrevem-se a concepção, síntese e actividade química e biológica de novas moléculas de projecto com propriedades de clivagem de AON e antitumor; para alguns exemplos recentes de moléculas concebidas para clivagem de ADN, ver; (a)

Nicolaou et al-, Am.,......Chem-......Soe» - 110;7247 (1988); (b) Nicolaou et ah, Arigew- Ç.hem„ J..nt- Ed. En.g.1.-., 28.= 1272 (1989); (c) Povsic et al-, J- Am- Chem- Soc.-.., 1.11;3059 (1989); (d) Hertzberg et al-, J.„.

Am............Chem...........Soc. . 104:313 (1982); (e) Moser et al., Science.., 2.3.8.= 645 (1987); (f) Corey et al -, ,1- Am-................Soc.. 1.11 = 8523 (1989); (g) Pyle et al-, J*......Anu.......Chem.,,......Soc - - 111;4520 (1989); (h)

Sigman, 1-........Am-........Chern.-.........Soc.-., 1.11,4941 (1989); (i) Ohno et al-, ,1-.

Am.,..........Qhgm-......Soc., 1.1.2.= 0000 (1990); (j) DanishefsKy, J, Org- Chem-, 5.4; 2781 (1989).,

Além dos compostos concebidos pelo Homem para clivagem de ADN, também têm sido referidos e estudados compostos eno-di-ino de ocorrência natural- A caliqueamicina e a esperimicina, que têm porções aglicona substancialmente idênticas e porções açúcar di- -4 201-0 (POR) ferentes C(a) Lee et al., J. Am, Chem. Soe.. 109:3464. 3466 (1987); (b) Hicolaou et aí., J. Am. Chem. Soc.. 110:7247 (1988); (c) Hawley et al., Proc._______Natl.___Acad. Sei. USA. 86:1105 (1989); (d) QoliK et al., ........βιm,. Chem. Soc.. 109:3461, 3462 (1987)3 e a neocarzinostatina, que também contém cadeias laterais de derivados de açúcar [(a) Edo et al., Tetr.ahedron Lett., 2.6:331 (1984); (b) Chin et al. Bipchemistrv. 27:8106 (1988); (c) Lee et al., Bi-ochemlstry, 2.8:1019 (1989)3 estão incluídas entre os eno-di-ínos de ocorrência natural.

Breve Sumário.....do.....Invento 0 presente invento refere-se a um processo de preparação de novos compostos para clivagem de AON, antibióticos e antitumor, que serão designados por golfomícina e dos seus derivados. Um composto do invento corresponde à fórmula estrutural

O

onde o grupo Y é seleccíonado de entre um grupo consistindo em hidrogénio, trimetilsililo, formilo, acetilo propionilo, buti-ri lo, 2-metilbutirilo, hexanoilo, acil benzoílo, um sal de um éster de fosfato de um di-metal monovalente (POgh^)s c o anel W, conjuntamente com os átomos de carbono não saturados do grupo vinileno ilustrado, forma um anel monocíclico aromático ou um sistema de anel fundido bícíclico, que incluí cinco ou seus átomos no anel contendo o grupo vinileno ilustrado.

Os compostos onde o anel W è benzilo ou naftilo são, particularmente, preferidos.

No âmbito do presente invento inclui-se também o processo de preparação de urna composição farmacêutica que contém um dos compostos anteriormente definidos, presente numa quantidade eficaz para clivagem de ADN, acção antimicrobiana ou inibição do crescimento de tumores, dissolvido ou disperso num diluente fisiologí-

-5- 72 944 201-0 (POR) camente tolerável

No presente invento, descreve-se também um método que utiliza uma composição como a que se descreveu anteriormente- Neste caso põe-se em contacto o ADN a ser clivado, as células microbianas alvo que se pretendem matar ou as células de tumor alvo cujo crescimento se pretende inibir, com uma das composições anterioi— mente descritas- Mantém-se este contacto durante um período de tempo suficiente para se obter o resultado desejado- Também estão contempladas administrações múltiplas da composição -

Breve.....descrição.....dos desenhos

Nos desenhos, que formam uma porção desta descrição, a Figura 1 mostra um esquema reaccíonal (Esquema 1) que proporciona um mecanismo racional para as propriedades de clivagem de AON de um composto do presente invento e, especificamente, do Composto 1, golfomicina» No Esquema, um nucleófilo com dois elec-trões RNuH reage com o Composto 1 para formar o intermediário, Composto 2, que cicliza para formar um bi-radical, espécie 3, que pode clivar o ADN pelo percurso a- No segundo percurso o ADN ac-tua como nucleófilo contendo dois electroes (ADN-Nu) que se adiciona através do acetileno conjugada, formando uma espécie carregada, espécie 4, que cliva o ADN pelo percurso b- A Figura 2 mostra urn esquema reaccíonal (Esquema 2) para a preparação do Composto 1, golfomicina A, a partir do Composto 5„ A Figura 3 é uma fotografia de um gel de agarose a 1 por cento, corado com brometo de etídio, que ilustra a clivagem de ADN 0X174, forma I, pelo Composto 1, a 1000 μΜ, após 20 horas a 37°C a vários valores de pH. A faixa 1 mostra o ADN sozinho a pH 8,5- As faixas 2-11 correspondem a reacçoes realizadas a valores de pH de 5,0, 6,0, 7,0, 7,4, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 e 10,7, respectivamente- As formas I, II e III, indicadas à esquerda da fotografia, mostram a migração relativa do ADN superenrolado (forma I), distendido (forma II) e linear (forma III), respectivamente- —6— 201.0 (POR) A Figura 4 mostra um esquema reaccional (Esquema 3) para a reacção da golfomicina A (Composto 1) na presença de DBU» A Figura 5 mostra dois esquemas reaccionais relacionados (a e b) (Esquema 4) para a reacção dos Compostos 12 e 15 com tiogli-colato de metilo* na presença de DBU e de uma base» A Figura 6 mostra um esquema reaccional (Esquema 5) para a sintese da naftiIgolfomicina, Composto 37, a partir do Composto 30»

Descricão detalhada do invento I- Antecedentes 0 Esquema 1 da Figura 1 ilustra o mecanismo racional que conduziu à concepção do Composto 1 (golfomicina A) como molécula para a clivagem de AON» Consideraram~se plausíveis dois modos alternativos de acção: ataque nucleófilo conduzindo a um di-radical, e ataque nucleófilo conduzindo a uma espécie carregada.

Um ataque nucleófilo (p»e», de um co~factor ou de AON) à função inona conduzirá à estrutura 2, aleno-eno-ino, que se espera, com base nos resultados anteriores, que seja facilmente ci-clizada formando a espécie di-radicalar, espécie 3» Esperava-se que a espécie 3 clivasse o AON por um mecanismo radicalar (a, Esquema 1) Por outro lado, a adição nucleof ilica pelo AON ao Composto 1, poderia gerar uma espécie 4 que se concebeu para sofrer as alterações químicas necessárias para a clivagem de AON, através de um mecanismo nucleófilo (b3 Esquema 1). Esperava-se que a natureza altamente tensa do Composto 1 facilitasse as reacções postuladas, apresentadas no Esquema 1» 11 - Os compostos A fórmula estrutural geral dos compostos possuidores destas propriedades desejáveis é ilustrada de seguida: (segue fórmula.) 72 944 201.0 (POR) 7~

onde o grupo Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, trimetilsililo, formilo, acetilo, propionilo, bu™ tirilo, 2-metilbutirilo, hexanoilo, acil benzoilo, um sal. de um éster de fosfato de um di-metal monovalente (POgt^); e o anel W, conjuntamente com os átomos de carbono não saturados do grupo vinileno ilustrado, forma um anel monociclico aromático ou um sistema de anel fundido bieíclico, que inclui cinco ou seis átomos no anel contendo o grupo vinileno ilustrado.

Além disso, o sistema de anel W pode ter vários substituin-tes, em várias posições (outras que não as necessárias para a fusão do anel decadi-ino), tais como metilo, atilo, isopropilo, n-propilo, isobutilo, sec-butilo, t~butilo (alquilo Οχ-^,)meto-xilo, etoxilo, propoxilo, butoxilo, iso-butoxilo, ciclopentiloxi-lo, ciclo-hexiloxilo (alcoxilo 0χ_6), perfluorometilo, perfluorometoxilo, hidroxilo, acil 0χ«.6 oxilo, benziloxilo, nitro, halogéneo (fluoro, cloro, bromo e iodo) e amino de fórmula NRSR6, onde R5 é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio (H), alquilo 0χ_6, benzilo, acilo ϋχ„£ e benzoílo, e R6 é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alqui-1° e benzilo, ou NR^R^ formam, conjuntamente, um anel de 5 ou 6 membros.

Exemplos de anéis W não substituídos incluem: benzeno, fura-no, tiofeno, piridina, oxazOle, pirazina, pirimidina, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, isobenzofurano, isobenzotiofeno, N--alquil C-l„6 indole, N-alquil iso-indole, N-alquil Cx„6 ben- zimidazole, quinolina, isoquinolina, benzoxazole e quinoxalina.

Dos sistemas de anel W anteriores, preferem-se os anéis ben- r zilo e naftilo, sendo o anel benzilo o mais preferido. Um anel 8- 72 944 201.0 (POR) benzi lo substituído também é contemplado no presente invento, bem como outros sistemas de anel W substituídos, e os substituintes 1-4 podem estar ligados às posições restantes não utilizadas na fusão do anel macrocíclico decadi-ino. Estes substituintes também podem estar acoplados para formar um outro anel aromático fundido. Seguidamente, ilustra-se a fórmula estrutural para um tal composto, sendo Y definido como anteriormente,

onde R1, R2, R3 e R4 são seleccionados, independentemente, de entre os substituintes anteriormente descritos, ou R1 e R2, R2 e R3 ou R3 e R4, conjuntamente com o anel benzi lo ilustrado, formam um sistema de anel aromático biclclico, fundido.

Os compostos particularmente preferidos do presente invento sâo a golfomicina A (Composto 1) e a naftilgolfomicina (Composto 37) cujas estruturas se mostram de seguida, onde Y é definido como anteriormente.

De outro modo, no caso de W ser um anel fenilo não substituído, a estrutura é simétrica e, assim, não há qualquer possibilidade de haver isómeros devido à natureza do anel fenilo. Não é este o caso para estruturas heterocíclicas, tais como o furano. A fusão do furano, como anel W,, pode realizai—se não só nos lados 2-3, 3-4 ou 4-5 do furano mas o oxigénio pode estar do mesmo lado ou no lado oposto, como grupo ceto no anel ciclodecadi-ino. De modo a evitar confusões no que diz respeito ao modo como ocorre a 9- 201.0 (POR) fusão destes anéis heterocíclicos, a convenção que será aqui usada adopta para o anel os números de posição do anel heterocíclico (Sistema do Chemical Abstracts) sendo a direcção de fusão indicada por um par de numeros, onde o primeiro destes números é a posição junto ao grupo ceto do anel ciclodecadi-ino.

Por exemplo, a numeração do anel furano começa pelo oxi-génio, como 1% e os restantes números são atribuídos em volta do anel., Deste modo, a fusão pode ocorrer na ligação 3^,4% o que conduziria a uma estrutura simétrica- No entanto, o lado 2* 9Z* pode estar orientado de modo a que o oxigénio esteja, quer do mesmo lado, quer do lado oposto do grupo ceto no anel adjacente. Para diferenciar estas duas possibilidades, 3^,25 indica que a posição 3* do anel furano está ligada ao grupo ceto. 0o mesmo modo, a designação 2^,33 indica que a posição 2" está ligada ao grupo ceto. Assim para qualquer anel W, heterocíclico ou assimétrico, fundido com o anel ciclodecadi-ino, o primeiro número de uma designação de fusão indica um átomo ligado ao grupo ceto» A numeração de todo o sistema de anel fundido começa pelo grupo ceto, contínua à volta do anel acetilénico e, depois, à volta do anel aromático. As posições de testa de ponte não são numeradas pois não é possível efectuar maís substituições nestas posições. As orientações com plica, que indicam a orientação de um heteroãtomo de um anel aromático estão entre parêntesis. A estrutura para a 5-hidroxifuranQ-(3s,2*)~ciclodeca~2,7~di~ -ino-l-ona é ilustrada a seguir, apresentando-se a numeração de cada átomo de carbono π 0

A Tabela seguinte ilustra vários exemplos de vários compostos do presente invento, substituídos com H ou alquilo C^_6, sendo as posições dos compostos de anel fundido numeradas de acordo

72 944 201.0 (POR) -10- com a convenção do Chemical Abstracts, tal como se discutiu ante™ riormente» Por questões de brevidade apenas se ilustram as fusões 3? ,4’ e 3S ,2’. DERIVADOS.....DE.JURAN0.....FyND.IDOS....EM......(.3.1.,..4..1)......E......[3.1.,.2.1.1

Fusão Posição 9 Posição 10 Posição 1.1 3’ ,4’ H - H " metilo - H II H - metilo II metilo - metilo 1« propilo - H II H - propilo 1 1 propilo - butilo II metilo - ciclo-hexilo H propilo - metilo " etilo - H II H - etilo II etilo - pentilo It etilo - etilo II hexilo - propilo II metilo etilo II propilo butilo 3%2a H H II metilo H 11 H metilo II metilo metilo II etilo H II H etilo II pentilo etilo II metilo etilo II etilo metilo II H propilo 1« propilo H II propilo propilo II ciclo-hexilo metilo 11 metilo propilo 11 propilo etilo 11 etilo 2-metilbutilo

72 944 201«0 (POR) —11—

No caso anterior os substituintes nas posições 9, 10 e 11 , podem ser todos diferentes ou todos iguais e podem ser H ou alquilo conforme se ilustra na Tabela, mas também podem ser como se discutiu anteriormente* 0 substituinte da posição 5 é -ΟΥ, e é como se definiu anteriormente*

Exemplos de sistemas de anel W monoaromãtico, fundido, incluem os seguintes:

Posição Número

Anel Aromático Fusão 9 10 11 12 f eriilo -f a .^3 rtU fj Λ. X X X X furano 3’ ,4’ X - X - f urano 2\3a “ X X - furano 3" ,29 - X X tiof eno 3a ,4a X - X - tiofeno 2a ,3a ~ X X - tiof erio v*· ti 3 w j$ <4 - X X - piridína 3a ,2a ~ X X X piridina 2a, 35 X X X - piridina 3a ,4a X X - X piridina 4a ,3a X X X oxazole 4a,5a ~ - X oxazole 5a ,4a X - - ~ oxazole 3a ,4a X - - ·“· axazole 4a ,3a ~ X - pirazina 2a ,3a X X .... pirimidiria 3 a ,6 ~ X - X pirimidina 6a ,5a X - X .... piridina 2a ,3a - - ~ piridina 2a ,3a ~ X ~ .... piridina 2a,3a ~ - X X piridina 3a ,4a - - X - piridina 3a,2a “ X -

Os compostos de anel monoaromãtico apresentados na tabela anterior têm substituintes (x) nas posições 9, 10, 11 e 12, que podem ser todos iguais ou diferentes, e são como se discutiu an-

-12- teriormente» Novamente» o substituinte da posição 5 é -QY, definido tal como anteriormente» A tabela seguinte apresenta derivados adequados» baseados em sistemas de anel aromático bicíclicos como anel W;

Posição.....Número,

Anel Aromático Fusão 9 10 11 12 13 14 naftaleno 6’ »7* X X X X X X naftaleno 5“ »6* X X X X X X naftaleno 63 ,5S X X X X X X benzofurano 2a »3 3 X X X X - benzofurano 33 »23 - X X X X - benzofurano 53 »63 X ~ X X X .... benzofurano ó3 »53 X X X - X - benzofurano ó3 »73 - X X X X .... benzofurano 73 »ó3 X X X X - - benzofurano 43 »5* X X - X X ~ benzofurano 59 »43 X X - X X - benzotiofeno j,. h y Z ^ o X X X X - - benzotiofeno 33 »23 - X X X X - benzotiofeno 53 ,63 X - X X X .... benzotiofeno 6 * »53 X X X - X ” benzotiofeno 63 ,7a ~ X X X X - benzotiofeno 7%ós X X X X - - benzotiofeno 43 »53 X X ~ X X .... benzotiofeno 53 »43 X X ” X X - isobenzofurano 5a »63 X X _ X X xsoben zof u ran o 43 »53 X X X - X - isobenzofurano 53 »43 X - X X X - i soben zot í of eno 53 »63 X X - X X ~ isobenzotiofeno 43 »53 X X X - X - i soben zot i of en o 53 ,43 X “ X X X - N-metilindole 33 »23 - X X X X ··.' N-etilíndole 23 ,33 X X X X - - N-butilindole 53 ,63 X - X X X - N-propilíndole 63 »53 X X X - X - N-ciclo-hexilindole 43 »53 X X - X X ··- 72 944 201.0 (POR) 13

.Posição.....Número

Anel Aromático Fusão 9 10 11 12 13 14 N-metilindole 5\43 X X - X X - N~iso~propilindole 6 % 7 * - X X X X .... M-pentilíndole 73 „ 63 X X X X - - N-metiliso-índole 53 ,6a X X - X X N-metiliso-indole 43 ,53 X X X ~ X - N-metiliso-indole 53 ,43 X - X X X ... N~metilbenzimidazole 53 „ 63 X - X - X N-i so~pen t i1ben z i m i dazo1e 63 ,5’ X - X - X -- N-eti1benzimidazole 43 *53 X X - X - ~ N~pentilbenzimidazole 53 ,,43 - X ~ X X ... N-butiIbenzimidazole 63,73 - X - X X - N-hexilbenzimidazole 73 „ 63 X X - X - ... quinolina 23 ,33 X X X X X - quinolina V o» w tf X. - X X X X X quinolina 33 9 43 X X X X - X quinolina 43 ,33 X - X X X X quinolina 53,63 X X - X X X quinolina 63 * 53 X X X - X X quinolina 63 9 73 X ~ X X X X quinolina 73 ,63 X X X X ~ X quinolina 73 s 83 - X X X X X quinolina 83 s.73 X X X X X .... ísoquinolina 33 ,4’ X X X X ” X isoquinolina 43 9 33 X - X X X X Ísoquinolina 63,73 X ~ X X X X isoquinolina 73 n 63 X X X X ~ X berizoxazole 43 a53 X X „ - X - benzoxazole 53 9 43 X - - X X .... berizoxazole 53 ,63 X - X X ~ benzoxazole 63 s,5S X X - ~ X ... berizoxazole 63 s73 ~ - X X X - benzoxazole 73 s63 X X X ~ ~ ... quinoxalina 23 s33 - X X X X - quinoxalina 53 ,63 X X ~ X X ... quinoxalina 63 „ 53 ~ X X - X X quinoxalina 63 ,73 X - X X - X 72 944 201»0 (POR)

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Ha tabela anterior, os substituintes (x) nas posições 9 a 14 podem ser todos diferentes ou todos iguais, e são definidos como anteriormente. 0 substituinte da posição 5 é -GY, como se definiu anteriormente» A golfomicina A, onde W da fórmula geral, conjuntamente com os carbonos do grupo vinilideno, forma um anel benzeno, e a naf-tilgolfomicina, onde W, conjuntamente com os átomos de carbono do grupo vinilideno, forma um anel naftaleno, são particularmente preferidos neste invento» III» Sínteses

Um composto do presente invento é facilmente preparado» Assim, faz-se reagir um composto aromático que forma o anel W, contendo um grupo halogéneo, preferivelmente um grupo iodo, e um grupo hidroxirrietilo bloqueado adjacente, com um 4-0-protegido-~Hepta~l,,7-di~ina na presença de trifeniIfosfenopaládio e iodeto de cobre» A reacçâo resulta num, consumo do halogeneto aromático e na adição do 4-0-protegido-hepta-l,7-di"ino ao anel aromático.

Remove-se o grupo protector (bloqueante) do grupo hidroxime-tilo, normalmente um grupo trialquilsililo tal como o t-butildi-metilsililo, e oxída-se o álcool a aldeído» Fecha-se o anel de dez membros, por remoção do hidrogénio acetilénico livre com uma base adequada, tal como cli-(trimetilsilil) amiria de potássio, e por reacçlo do carbanião acetilénico resultante com o grupo aldeído para fechar o anel com a formação de uma porção álcool secundário, a partir do aldeído» 0 álcool secundário resultante é oxidado para formar a cetona correspondente do sistema de anel fundido» Remove-se o grupo protector do 4-0-protegido~hepta-l,7™di”ino original para formar um álcool, que pode ser usado tal e qual ou que p>ode reagir ainda mais para formar um fosfato ou um outro éster.

Analisando, rnais especifícamente, a síntese da golfomicina A, utiliza-se o composto 1 como um exemplo mais específico desta sequência reacciorial e a sua síntese está detalhada no Esquema 2 72 944 201-0 (POR) -15' apresentado na Figura 2.

Assim, a reacção de um excesso de reagente de Qrignard, Composto 5, com formato de etiio conduz ao 4-Q~protegído-hepta-l,7--di-ino diacetílénico, Composto 6 (80 por cento), que é sililado obtendo-se o Composto 7 (95 por cento) - Por acoplamento do Composto 7 com um iodeto «aromático, Composto 8, sob a influência catalítica de Pd(PPhg)^-CuI obteve-se o Composto 9 (70 por cento), que foi oxidado com Mn02 obtendo-se, por sua vez, o aldeído acetilénico, Composto 10 (82 por cento)- Por adição iri-tramolecular do acetilido derivado do Composto 10 e de KNÍSiMeg^ à função aldeído do Composto 10 obteve-se um álcool com um anel de 10 membros, Composto 11 (51 por cento) que foi suavemente oxi-dado (80 por cento) e des-sililado (89 por cento), obtendo-se o produto desejado, Composto 1, através do seu éter silílico (Composto 12) -

Um composto aromático halo-hidroximetilo de partida é, ele próprio, tipicamente, um composto conhecido ou pode ser preparado por processos análogos «aos processos referidos na arte- Numa síntese exemplifícatíva, um aminoácido aromático vicinal, tal como o ácido 3-amino-2-naftenoico, Composto 30, é o material de partida- Esta sequência reaccional é apresentada no Esquema 5 da Figura 6-

Assim, o grupo carboxilo é esterífiçado com um álcool de alquilo Cx„6 conveniente, tal como metanol, e o éster, Composto 31, ê reduzido p«ara formar o derivado de hidroximetilo, Composto 32. Um agente de redução conveniente é o hidreto de di-isobutilalumi-nio (OIBAL). Por diazotização, seguida de reacção com um sal de iodeto tal como Kl, forma-se o iodeto de hidroximetilo aromático vicinal, Composto 33, que se faz reagir, tal como anteriormente, com o Composto 6 para formar um Composto de anel parcialmente fechado, Composto 34- 0 Composto 34 é oxidado para formar o álcool--aldeído, Composto 35- Bloqueia-se o álcool e fecha-se o anel macrocíclico para formar o álcool, Composto 36, Por oxidação do álcool, formando a cetona correspondente, e remoção do grupo blo™ queador do álcool obtém-se o derivado de golfomicina desejado.

72 944 201- 0 (POR) neste caso a naftilgolfomicina* Composto 37» Vários aminoácidos aromáticos vicinais estão disponíveis comercialmente» Por exemplo* a Aldrich Chemical Company de Milwau-kee, WI, E-U»A», comercializa o ácido aminonaftóico anterior* bem como o ácido 2~aminonicotiníco, o ácido 3~amínopirazina~2~carbo~ xilico* o ácido antranílico (ácido 2-aminobenzõico) e três ácidos antranílicos substituídos com metilo»

Adicionalmente, há vários compostos de hidroximetilo disponíveis comereialmente e apenas necessitam de ser adequadamente halogenados para serem utilizados no presente invento» Por exemplo, todas as três hidroxímetilpiridinas, ambos os hidroxímetil-naftalenos e o indole-3-carbinol são também comercializados pela Aldrich»

Os compostos aromáticos de hidroximetilo também podem ser preparados a partir dos ésteres de ácido carboxílico correspondentes, conforme se referiu anteriormente» Continuando com o mesmo fornecedor, a Aldrich Chemical Co* comercializa três ácidos quinolino-carboxílicos* dois ácidos índole-carboxilicos e um ín-dole-carboxaldeído, bem como o ácido pirazíno-carboxílico e o cloreto de quinoxalino-carbonilo, e todos eles podem ser reduzidos para formar os compostos de hidroximetilo correspondentes, depois halogenados e usados para formar um composto do invento» 1V» Composições, farmacêuticas.

Um composto do presente invento, é útil como agente para a clivagem de AON e, também, como agente antimicrobiano (antibiótico) e citotóxico (antitumor), tal como a dinamicina A, a calique-amicina, a esperimicina e a neocarzinostatina» Oeste modo* um composto do invento também pode ser designado por "agente activo" ou "ingrediente activo". A clivagem de AON pode ser testada usando as técnicas depois aqui descritas bem como as descritas por Mantlo et al», á.,.. Qrq. Chem. . 5.4:2781 (1989); Nicolaou et al», J,5... Am. Chem. Spc.,..., -17- 201.0 (POR) 110:7147 (1989); Nicolaou et al„, J*. Am,.. Chem. Soc.. 110:7247 (1988) ou Zfôin et al., Science. 240:1198 (1988) e as citações aí contidas. Os testes antímicrobianos e antitumor também podem ser realizados por técnicas descritas na Patente dos E.U.A. Νδ. 4 837 206, cuja descrição é aqui incorporada como referência, bem como por procedimentos que aqui se descrevem seguidamente.

Também se pode mostrar que um composto anteriormente descrito reage segundo uma reacção de cicloaromatização de Bergman na presença de benziImercaptano, trietilamina e 1,4-ciclo-oxadieno, conforme se discute em Hseltine et al., J.,„. Am. Chem. Soc.. 111:7638 (1989). esta reacção forma um produto tetracíclico, tal como o que se forma durante a clivagem de AON, e pode ser usado como uma co-pesquisa para seleccionar compostos mais activos.

Assim, contempla-se uma composição farmacêutica que contenha um composto do invento, anteriormente descrito, como agente ac-tivo. Prepara-se uma composição farmacêutica por qualquer um dos processos bem conhecidos na arte da farmácia, envolvendo todos eles o contacto entre o composto activo e o seu transportador. Para uso terapêutico, pode-se administrar um composto do presente invento sob a forma de composições farmacêuticas convencionais. Estas composições podem ser formuladas de modo a serem adequadas para administração oral ou parentérica, ou como supositórios. Nestas composições, o agente é, tipicamente, dissolvido ou disperso num transportador fisiologicamente tolerável.

Um transportador ou diluente é um material útil para administrar o composto activo e deve ser "farmaceuticamente aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição e não deve ser pernicioso ao seu receptor. Deste modo, tal como são aqui usados, as frases "fisiologicamente tolerável" ou "farmaceuticamente aceitável" são usadas indiferentemente e referem-se a entidades moleculares e composições que não produzam uma reacção alérgica ou irritante, similar, tal como perturbações gástricas, tonturas e similares, quando administradas a um mamífero. Um transportador fisiologicamente tolerável pode tomar várias formas dependendo da preparação desejada para a admiriis- 72 944 201-0 (POR) -18- tração e do modo de administração pretendida.

Como exemplo de uma composição útil pode-se utilizar um composto do presente invento (agente activo) dissolvido ou disperso numa composição líquida;, tal como uma suspensão ou solução esterilizada, ou como um preparado isotónico contendo os conservantes adequados- Os meios injectáveis constituídos por soluções salinas ou de glucose, aquosas, injectáveis, tamponadas ou não tampona-das, isotónicas e esterilizadas, bem como a água, por si só, ou uma solução aquosa de etanol, são partícularmente adequadas para os presentes objectivos. Formas liquidas adicionais, onde estes compostos podem ser incorporados para administração, incluem emulsões aromatizadas com óleos alimentares, tais como óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, óleo de coco, óleo de amendoim e similares, bem como elixires e veículos farmacêuticos similares- Exemplos adicionais de diluentes líquidos podem ser encontrados em Remmington’s Pharmaceutical Sciences. fiack Publishing Co_, Easton, PA E.U.A. (1980).

Um agente activo também pode ser administrado sob a forma de lipossomas- Como é bem conhecido na arte os lipossomas são, geralmente, derivados de fosfolípidos ou de outras substâncias li-pídicas. Os lipossomas são formados por cristais líquidos hidratados, mono ou muItilamelares, dispersos num meio aquoso. Pode-se usar qualquer lipido não tóxico, fisiologicamente aceitável e metabolizável, capaz de formar lipossomas. As presentes composições sob a forma de lipossomas podem conter estabilizantes, conservantes, excipientes e similares, além do agente. Os lípidos preferidos são os fosfolípidos e as fosfatidilcolinas (lecitinas), quer naturais quer sintéticas»

Os métodos para a formação de lipossomas são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Prescott, Ed», Metho.ds in. çell. iiol.ggy., Vol- XIV, Academic press, Neu York, N.Y», E,U„A. (1976), p- 33 et seq..

Um agente activo também pode ser usado em composições, tais como comprimidos ou pílulas, contendo, preferivelmente, uma

unidade de dosagem do composto- Com este objectivo mistura-se o agente (ingrediente activo) com ingredientes convencionais para a preparação de comprimidos, tais como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, gomas ou materiais similares, usados como transportadores fisiologicamente toleráveis, não tóxicos. Os comprimidos ou pílulas podem ser laminados ou constituídos de outro modo, para proporcionarem formas de dosagem unitária que permitam uma acçao prolongada ou retardada.

Deve ser entendido que, além dos ingredientes transportadores anteríormente referidos, a formulação farmacêutica aqui descrita pode incluir, conforme apropriado, um ou mais ingredientes transportadores adicionais, tais como diluentes, tampões, agentes aromatizantes, ligantes, agentes activos de superfície, espessan-tes, lubrificantes, conservantes (incluindo antioxidantes) e similares, e substâncias incluídas com o propósito de tornar a formulação isotõnica com o sangue do receptor desejado.

Os comprimidos ou pílulas também podem ser preparados com uma camada entérica, na. forma de um envelope que serve para resistir â desintegração no estômago e permite que o ingrediente activo passe intacto para o duodeno ou que a sua libertação seja retardada. Pode-se usar uma variedade de materiais para formar essa camada ou revestimento entérico, incluindo ácidos polimêricos ou misturas desses ácidos com materiais tais como go~ ma-laca, goma-laca e álcool cetílico, acetato e ftalato de celulose, e similares. Um revestimento entérico particularmente adequado compreende um copolímero de estireno/ácido maleico, conjuntamente com materiais conhecidos que contribuem para as propriedades entéricas do revestimento. Na Patente dos E.U.A. NQ. 4 079 125 de Sipos, que é aqui incorporada como referência, descrevem-se métodos para a produção de comprimidos revestidos entericamente. 0 termo "dose unitária", tal como é aqui usado, designa unidades fisicamente discretas adequadas como unidades de dosagem para administração a animais de sangue quente, contendo, cada 72 944 201.0 (POR)

20 unidade* uma quantidade predeterminada de agente* calculada para produzir o efeito terapêutico desejado* conjuntamente com o dilu-ente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de formas de dosagem unitária adequadas* de acordo com o presente invento* incluem comprimidos* cápsulas* pílulas* pacotes de pó* grânulos* bolachas* hóstias* colheres de chá cheias* conta-gotas* ampolas* frascos* múltiplos segregados de qualquer uma das anteriores e similares.

Um composto do presente invento está presente, numa tal composição farmacêutica* numa quantidade eficaz para se obter o resultado desejado. Por exemplo* quando se pretende obter a clivagem de ADN in vitro. pode-se utilizar um composto do presente invento numa quantidade suficiente para proporcionar uma concentração de cerca de 1,0 a cerca de 5 000 micromolar (μΜ)* com uma concentração de cerca de 0*02 pg/pl. Como agente citotóxico (an~ titumor) uma quantidade eficaz de um composto do presente invento é de cerca de 0*1 a cerca de 15 mg por quilograma de peso coi— poral ou uma quantidade suficiente para proporcionar uma concentração de cerca de 0*01 a cerca de 50 Mg/ml na corrente sanguínea. Um composto do presente invento exibe actividade antimicrobiana numa gama de concentração de cerca de 0*01 a cerca de 50 μά/ΐΐ»1. As concentrações e dosagens anteriores variam com o composto particular do presente invento usado bem como com o alvo* p.e. AON* tumor e micróbio* como é bem conhecido. V. Métodos

Um composto do presente invento é útil para a clivagem de AON* como agente citotóxico e também para a inibição do crescimento de células neoplásticas* e é utilizado num método para proporcionar esses resultados. Um composto do presente invento é* tipicamente* utilizado numa composição tal como se descreveu an-teriormente.

De acordo com esse método* o AON ou as células alvo que se pretendem matar ou cujo crescimento se pretende inibir* são postas em contacto com uma composição que contém um composto do presente invento (ingrediente activo)* presente numa quantidade efi- 72 944 201-0 (POR)

21 caz ou suficiente para esse efeito» tal como se discutiu anteri-ormente, dissolvido ou disperso num diluente fisiologicamente tolerável (farmaceuticamente aceitável)- Mantém-se o contacto durante um tempo suficiente para se obter o resultado desejado» i-e- a clivagem do AON» a morte das células ou a inibição do crescimento das células neoplásticas-

Quando se pretende obter o resultado desejado in vitro o contacto é realizado pela simples mistura do AON ou das células alvo com a composição e, depois, mantém-se em contacto sob condições apropriadas de temperatura e para crescimento celular, tal como para as células de controlo não tratadas. Oeste modo, uma única mistura e contacto são tipicamente suficientes para os objectivos in. vitro. 0 método anterior também é útil in vivo, tal como quando se trata um mamífero, tal como um roedor, por exemplo uma ratazana, um ratinho ou um coelho, gado, por exemplo um cavalo, uma vaca ou uma cabra, ou um primata, por exemplo um macaco, urn chimpanzé ou um humano. Neste caso, o contacto de uma composição e das células que se pretendem matar ou cujo crescimento se pretende inibir, é efectuado pela administração de composições ao mamífero, por administração nasal, oral ou anal, ou por introdução intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal. Deste modo, o contacto in vivo é efectuado através do sangue ou dos sistemas linfáticos.

Embora uma única administração (mistura) e o seu contacto seja, geralmente, suficientes para manter o contacto requerido e obter o resultado desejado in vitro., utilizam-se in. vivo, tipicamente, administrações múltiplas. Deste modo, devido à intolerância do organismo e à excreção, o contacto entre o ingrediente ac-tivo de uma composição e as células alvo é, tipicamente, mantido por administração repetida de um composto do presente invento durante um período de tempo, tal como dias, semanas ou meses, ou mais, dependendo das células alvo.

Seguidamente, ilustram-se métodos exemplificativos da invenção, para clivagem de ADN e inibição das células alvo de carcino- 22- 72 944 201.0 (POR) ma pancreático humano MIA PaQa-2 (ATCC CRL 1420) e das células alvo de carcinoma de bexiga de murino MB49 (obtidos do Dr- Lan Bo Chen do Dana Farber Câncer Research Institute, Boston, MA E. U. A.,). V1„ Resultados

Verificou-se que a golfomicina A (Composto 1) cliva o AON de um modo dependente do pH, conforme se mostra na Figura 3. A adição de tioglicolato de metilo como co-factor inibiu, em vez de realçar, a actividade do Composto 1, enquanto que a presença de catalase não teve qualquer efeito mensurável na clivagem- A naf-tilgolfomicina, Composto 37, exibiu uma clivagem de AON similar.

Investigou-se então a química do Composto 1, de modo a pei— ceber o seu modo de funcionamento, e essa química é ilustrada no Esquema 3 da Figura 4.

Assim, converteu-se rapidamente o Composto 1, por reacção com l,8-diazabicicloC5-4.03undec-7-eno (DBU), num composto intensamente fluorescente (75 por cento) cuja estrutura foi identificada como Composto 15 (golfomicina B em cunha) com base nas suas propriedades químicas e espectrais. A golfomicina B (Composto 15) reagiu rapidamente com NaBH^ a zero graus C, produzindo, quantitativamente, o Composto 16, cuja estrutura foi confirmada por análise cristalográfíca de Raios X do seu p-bromobenzoato, Composto 17 (preparado a partir do Composto 16 com um rendimento de; 80 por cento). Para explicar a formação do Composto 15 a partir do Composto 1, sob condições básicas, assumiram-se os seguintes passos, que se apresentam no Esquema 3 da Figura 4; a) reacção de retroaldolízação (1 -> 13); b) isomerização induzida por base (13 -> 14=; e c) cicloadição 4+ +2 intramolecular (14 15)- A segunda onda de clivagem de AON, observada a pH > 9, pode indicar o início desta reacção em cadeia.

Estudos de RMM a baixa temperatura revelaram a presença transiente do Composto 13 [~20~>25*Ό, δ 9,77 (t, J=2,5 Hz, C HO) “] 72 944 201.0 (POR)

23-na mistura reaccional* mas não se detectaram quaisquer sinais do Composto 14 sob as mesmas condições [provavelmente devida a natureza rápida da reacção de cicloadição].

Depois* ínvestigou-se a química da golfomicina A (Composto 1) e B (Composto 15) em relação a nucleófilos, usando o tioglico-lato de metilo como reagente modelo (Esquema 4 da Figura 5). Nestas condições o éter de sililo* Composto 12* reagiu suavemente com um excesso de reagente tioglicolato de metilo e com DBU, a 10*0 sob condições básicas* obtendo-se os Compostos 19 (55 por cento) e 20 (20 por cento)* provavelmente através do aduto intermediário* Composto 18* inicialmente formado. Aparentemente* o grupo -SH do tioglicolato de metilo adiciona-se ao acetileno de um modo trans obtendo-se o Composto 18, pois de outro modo o passo seguinte 18 -> 19 seria geometricamente impossível. De acordo com esta observação* os cálculos de MM2 revelaram que o Composto 18 está sujeito a uma tensão menor* cerca de 4*9 kcal/mol» do que o seu isómero geométrico. Não se determinou a estereoquímica do Composto 19.

Sob condições similares* excepto a temperatura de 25°C* o Composto 15 produziu o 1,6-aduto* Composto 21, com um rendimento de 67 por cento e com uma regiosselectividade oposta à que se obtêm na redução de hidreto do Composto 15 a Composto 16 (Esquema 3). A propensão de ambos os Compostos 12 e 15, para sofrerem facilmente um ataque nucleófilo é, provavelmente* devida à libertação de tensão (para os Compostos 12 e 15) e ao aumento de aroma-ticidade (para o Composto 15). Os cálculos de MM2 confirmam os aumentos de energia para estas reacções. Com efeito* um análogo de cadeia aberta do Composto 1 não apresentou a mesma reactivida-de nem clivou o ADN* sob as mesmas condições.

Os resultados anteriormente apresentados suportam fortemente um mecanismo nucleófilo (percurso b, Esquema 1) em vez de um mecanismo radicalar (percurso a* Esquema 1) para a clivagem do ADN pela golfomicina A (Composto 1) e* similarmente* pela golfomicina B (Composto 15). 72 944 201.0 (POR)

24

As propriedades cias golfomicinas A e B sugeriram que se determinasse se possuíam actividade antitumor. Com efeito* testes preliminares In. vit.ro mostram que a golfomicina A inibe o crescimento das células de carcinoma de bexiga de muririo MB49, com uma CI5Q de 3,4 micromolar, durante quatro dias de exposição (370C, 7 por cento de C02) - Usando um ensaio similar., verificou-se que o valor de CI^q para células de carcinoma pancreático humano PaCa-2 era de 0,,93 micromolar. M.g..l.b.P.r forma, de realizar o invento

Exemplo 1: Síntese da golfomicina A (Composto l). A 12,30 g (504 mrnole) de magnésio, esmagado e seco à chama, em 50 ml de éter etílico, adicionaram-se 2,0 g de cloreto de mei— cúrio e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois, adicionaram-se 50,00 g (420 mrnole) de brometo de propargilo â mistura reaccional, a -30^0, e deixou-se a mistura aquecer, lentamente, até zero graus C. Depois, a zero graus C, adicionaram-se 15,50 ml (382 mrnole) de formato de etilo e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 2 horas. Acidificou-se a mistura reaccional com HC1 2N, até que se obtivesse um pH igual a 4. Extractou-se a mistura reaccional acidificada com 1 1 de acetato de etilo, lavou-se com 200 ml de salmoura, secou-se sobre HgSO^ e concentrou-se in. vácuo. Purificou-se o produto por cromatografia "flash" (30 por cento de éter em êter de petróleo), obterido-se 33,04 g (305 mrnole) do álcool. Composto 6 (rendimento de 80 por cento). A 13,00 g (120 mrnole) do álcool, Composto 6, em 100 ml de DMF seca, adicionaram-se 16,40 g (240 mrnole) de imidazole e 27,10 g (180 mrnole) de cloreto de terc-butildimetíIsililo, a zero graus C. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 8 horas. Depois, adicionaram-se 200 ml de água à mistura reaccional e extractou-se o produto com 600 ml de acetato de etilo, lavou-se com salmoura, secou-se sobre MgSQ^ e concentrou-se in. vácuo.. Purificou-se este produto por cromatografia "flash" (5 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 25,35 g (114 mrnole) do álcool sililado, Composto 7 (rendimento de 95 por cento). 72 944 201.0 (POR) 25

A 1,90 g (1,64 mmole) de Pd(PPhg)4 em 100 ml de benzeno des-gaseificado, adicionaram-se 9,57 g (40,88 mole) de álcool 2-iodobenzílico e agitou-se a mistura reaccional durante 30 minutos. Depois, adicionaram-se 5,66 ml (57,23 mmole) de butilamina e agitou-se a mistura reaccional durante 45 minutos. Arrefeceu-se a mistura reaccional até zero graus C e adicionaram-se 1,25 g (6,54 mmole) de iodeto de cobre e 20,00 g (89,93 mmole) do diacetileno, por esta ordem. Agitou-se a mistura reaccional durante 3 horas à temperatura ambiente. Diluiu-se a mistura reaccional com 500 ml de acetato de etilo, lavou-se com 200 ml de NH^Cl saturado e com 100 ml de salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se i.n. vacuo. Purificou-se o produto por cromatografia "flash" (10 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 9,33 g (28,62 mmole) do álcool benzilico acoplado, Composto 9 (rendimento de 70 por cento). A 10,00 g (30,67 mmole) do álcool benzilico acoplado. Composto 9, em 200 ml de cloreto de metíleno adicionaram-se 50,0 g de dióxido de manganês a zero graus C. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 4 horas. Filtrou-se a mistura reaccional, concentrou-se i,n. yac;u.g. e purificou-se por cromatograf ia "flash" (5 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 8,15 g (25,15 mmole) do aldeído correspondente, Composto 10 (rendimento de 82 por cento). A 6,00 g (18,50 mmole) do aldeído, Composto 10, em 600 ml de THF, adicionaram-se 44,40 ml (22,20 mmole) de ((^3)381 a -78^0. Agitou-se a mistura reaccional a -780ϋ durante 45 minutos e, depois, adicionaram-se 100 ml de NH4C1 saturado. Deíxou-se a temperatura subir até à temperatura ambiente e extractou-se a mistura reaccional com 500 ml de acetato de etilo, lavou-se com salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se in. yas.y,g. Purificou-se o produto por cromatografia "flash" (5 por cento de acetato de etilo em éter de petróleo), obtendo-se 3,08 g (9,44 mmole) do álcool de anel fechado, Composto 11 (rendimento de 51 por cento) . A 3,08 g (9,44 mmole) do álcool de anel fechado, Composto -26- 72 944 201.0 (POR) 11, em 100 ml de cloreto de metileno, adicionaram-se 15,0 g de dióxido de manganês a 25¾. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 4 horas. Filtrou-se a mistura reaccional, concentrou-se in vácuo e purificou-se por cromatografia "flash" (2,5 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 2,51 g (7,74 mmole) da cetona, Composto 12 (rendimento de 82 por cento). A 1,84 g (5,66 mmole) da cetona. Composto 12, em 95 ml de acetonitrilo, adicionaram-se 35 ml de HF 0,55 M, em GH3CN, a zero graus C. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 3 horas e, depois, adicionaram-se 50 ml de NaHCO^ saturado. Extractou-se o produto com 300 ml de acetato de etilo, secou-se sobre MgS04, concentrou-se in vacuo e purificou-se por cromatograf ia "flash" (20 por cento de acetato de etilo em éter de petróleo) obtendo-se 1,06 (5,04 mmole) do produto final, Composto 1 (rendimento de 89 por cento).

Resultados espectrais Sólido amorfo amarelo claro; - 0,36 (sílica, 70 por cento de éter em éter de petróleo)5 RHN (500 MHz, CDCI3) 5 8,17 (1H, d, J~8,7Hz, Ar), 7,46 (3H, m, Ar), 4,16 (1H, m, CH-OH), 2,92 (4H, m, propargilico), 2,58 (1H, d, .;;f“8,SHz, OH); IV (CHCI3) H? max 3607, 3556, 3019, 2255, 2227, 1630, 1592, 1280, 1216, 668; 13C RMN (125MHz, COCI3) õ 176,06 (-0=0), 136,30(Ar), 133,07(Ar), 132,67(Ar), 129,19(Ar), 128,13(Ar), 124,44(Ar), 95,80(acetíleno), 65,14(C-0H), 28,96(propargílico), 28,69(propargílico); UV(MeOH) λ max 330 (e=0,5X104 M"1 cm"1), 274(1,4X104) , 240(5,9X104) nm; HRMS calc. para C14H1002 (M+) 211,0759, determinado 211,0791.

Exemplo 2 2 Síntese da naf ti lgol forni c in a (Composto, 3,7,),, A 500 ml de metanol (MeOH) e 50 ml de cloreto de acetílo adicionaram-se 11,950 g (63,83 mmole) de ácido 3-amino-2--naftóico, Composto 30, em 100 ml de MeOH. A esta mistura adicionaram-se 50 ml de benzeno e 50 ml de Cl-UClo. Agitou-se a mistura

At% reaccional à temperatura ambiente, durante duas horas, e depois ao refluxo durante três horas. Depois, adicionou-se MgSQ4 e aqueceu-se a mistura reaccional ao refluxo durante 12 horas. Substi- 72 944 201.0 (POR)

27- tuiu“se o MgSO^ por peneiros moleculares 3$ e aqueceu-se a mistu-ra reaccional ao refluxo durante 48 horas. Depois, diluiu-se a mistura reaccional com 500 ml de acetato de etilo (EtQAc), lavou--se com 100 ml de NH^Cl saturado, 100 ml de NaHCOg saturado, 100 ml de Na2C03 a 5 por cento e com salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se. Purificou-se o produto por cromatografia em coluna (10 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 7,412 g (36,83 mmole) do éster arninonaftóico, Composto 31 (rendimento de 58 por cento). A 0,500 g (2,500 mmole) do éster, Composto 31, em 25 ml de * adicionaram-se 10 ml de DIBAL (1M em hexanos) a -78*0 e aqueceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente. A mistura reaccional adicionaram-se 20 ml de MeOH, 50 ml de EtOAc e 20 ml de sal de Rochelle. Lavou-se a fase orgânica com cloreto de amónio saturado, secou-se sobre MgSO^ e concentrou-se. Recris-talizou-se o produto em tolueno, obtendo-se 0,255 g (1,472 mmole) de álcool 3-amirio~2~naftilico, Composto 32 (rendimento de 59 por cento).

Aqueceu-se o álcool amirionaf ti lico, Composto 32 (1,340 g; 7,736 mmole), em 13 ml de ácido sulfúrico óM, para formar uma solução e, depois, arrefeceu-se até zero graus C. A suspensão resultante adicionaram-se 0,587 g (8,510 mmole) de NaNQ2 em 2 ml de água e agitou-se a mistura reaccional a zero graus C durante 10 minutos. Adicionou-se ureia (0,200 g) em 2 ml de água, a zero graus C, com agitação, durante 5 minutos e, depois, adicionaram-se 1,926 g (11,604 mmole) de Kl em 2 ml de água, a zero graus C, com agitação à temperatura ambiente, durante 15 minutos. Adicionaram-se uma porção de 50 ml de éter:acetato de etilo 1:1, 20 ml de cloreto de amónio saturado e 20 ml de bissulfato de sódio, separou-se a fase orgânica, lavou-se com cloreto de amónio, bicarbonato de sódio e salmoura e secou-se sobre HgS04. Purificou-se o produto por cromatografia em coluna (30 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 0,585 g (rendimento de 27 por cento) do álcool 3-iodo-2-naftí1ico, Composto 33.

72 944 201.0 (POR) -28- A 0,174 g (0,151 mmole) de Pd(PPh3)4 em 10 ml de THF desga-seifiçado adicionaram-se 1,070 g (3,768 mmole) do álcool iodonaftílico, Composto 33, e agitou-se a mistura reaccional durante 30 minutos» Depois, adicionaram-se 0,521 ml (5,275 mmole) de butilamina e agitou-se a mistura reaccional durante 45 minutos. Arrefeceu-se a mistura reaccional até zero graus C e adicionaram-se 0,115 g (0,603 mmole) de iodeto de cobre e 0,896 g (8,289 mmole) do Composto 6, por esta ordem» Agitou-se a mistura reaccional durante 3 horas à temperatura ambiente. Depois, diluiu-se a mistura reaccional com 50 ml de acetato de etílo, lavou-se com 20 ml de NH4C1 saturado e com 20 ml de salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se in. vacuo. Purificou-se o produto por cromatografia "flash" (80 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 0,524 g (1,982 mmole) do diol acoplado, Composto 34 (rendimento de 53 por cento)» A 0,524 g (1,982 mmole) do diol, Composto 34, em 20 ml de cloreto de metíleno adicionaram-se 6,0 g de dióxido de manganês, a zero graus C» Agítou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 4 horas» Filtrou-se a mistura reaccional, concentrou-se in vacuo e purificou-se por cromatograf ia "flash" (40 porcento de éter em éter de petróleo), obtendo-se 0,385 g (1,468 mmole do álcool-aldeído, Composto 35 (rendimento de 74 por cento)» A 0,385 g (1,469 mmole) do álcool-aldeído, Composto 35, em 5 ml de DMF seca adicionaram-se 0,200 g (2,938 mmole) de imidazole e 0,332 g (2,204 mmole) de cloreto de terc-butildimetilsililo a zero graus C» Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 2 horas» Adicionaram-se 20 ml de água à mistura reaccional e extractou-se o produto com 60 ml de acetato de eti-lo, lavou-se com salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se in vacuo. Purificou-se o produto por cromatograf ia "flash" (5 porcento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 0,437 g (1,161 mmole) do álcool-aldeído silílado, Composto 35a (rendimento de 79 por cento). A 0,025 g (0,066 mmole) do álcool-aldeído sililado, Composto 72 944 201-0 (POR)

-29-35a, em 70 ml de THF adieionaram-se 0,160 ml (0,080 mmole) de ((CH^)^!)2NK, a ""78'“C- Deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e, depois, adicionaram-se 10 ml de NH^Cl saturado- Extractou-se a mistura reaccional com 50 ml de EtOAc, lavou-se com salmoura, secou-se sobre HgSO^ e concentrou-se ijQ. vácuo- Purificou-se o produto por cromatografia “flash" (lo por cento de acetato de etilo em éter de petróleo) obtendo-se 0,010 g (0,026 mmole) do álcool de anel fechado, Composto 36 (rendimento de 40 por cento)- A 0,020 g (0,054 mmole) do álcool, Composto 36, em 5 ml de cloreto de metileno adicionaram-se 0,200 g de dióxido de manganês, a zero graus C- Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante l hora. Depois, filtrou-se a mistura reaccional, concentrou-se iri. vacuo e purificou-se por cromatograf ia "flash" (5 por cento de éter em éter de petróleo) obtendo-se 0,005 g (0,013 mmole) da cetona, Composto 36a (rendimento de 25 por cento)- A 0,005 g (0,013 mrnole) da cetona. Composto 36a, em 1 ml de acetonitrilo, adicionaram-se 1,0 ml de HF a 0,55 M, em CH3CN, a zero graus C. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 12 horas e, depois, adicionaram-se 5 ml de NaHC03 saturado- Extractou-se o produto com 20 ml de acetato de etilo, secou-se sobre MgSO^, concentrou-se in. vacuo e purificou-se por cromatografia "flash" (50 por cento de éter em éter de petróleo), obtendo-se 0,002 g (0,008 mmole) do produto final naftilgolfomí-cina, Composto 37 (rendimento de 59 por cento)-

Exemplo 3π Estudos, de ç.H vagem de ADN A um frasco contendo uma solução 50 micromolar, por par de bases de ADN de cadeia dupla, PX174, forma I, em 2,0 rnicrolitros de vários tampões, cujos valores de pH se apresentam na Figura 3, p..e. pH 8,5 tris-HCl, adicionaram-se 6,0 rnicrolitros da mesma solução tampão e 2,0 rnicrolitros de uma solução 5,0 mil imolar do Composto 1 ou Composto 37, em etanol-

Colocaram-se os frascos numa estufa a 37°C durante 20 horas- 72 944 201-0 (POR)

30-

Adicionou-se uma porção de 2,0 rnicrolitros de solução tampão de carga de glicerol, contendo indicador azul de bromotimol, a cada frasco- Retirou-se, depois uma alíquota de 10 rnicrolitros de cada frasco- Efectuou-se uma análise de electroforese em gel das ali-quotas, usando um gel de agarose a 1,0 por cento com brometo de etídio, efectuando o ensaio a 115 volt durante 1 hora. A clivagem de AON foi indicada pela formação de AON da forma II que foi de-tectada por inspecção visual do gel sob uma luz ultravioleta de 310 nanometros.

Exemplo 4: Procedimento para um ensaio de citoxicidade em 6. cavidades

Colocaram-se células MIA PaCa~2 ou células MB49 em cada uma das cavidades de uma placa de 6 cavidades, com uma densidade de 100 000 células/cavidade em 3 ml de meio de cultura- Incubaram-se durante 4 horas (37^0, 7 por cento de CC^)» Depois, adicionaram--se & rnicrolitros de uma solução do Composto 1 aos 3 ml de meio (RPMI-1640, com 5% de soro fetal bovino e 1 por cento de glutami-na) numa diluição de 500x e a uma cavidade adicionou-se etanol para fazer um controlo de etanol a 0,2 por cento- Depois, incubaram-se as placas durante 4 dias (37°C, 7 por cento de CO2)- Escorreu-se então o meio, adicionou-se corante de violeta de cristal (fórmula de Hucker) para tapar o fundo das cavidades e depois enxaguaram-se com água da torneira até que as águas de enxaguar estivessem limpas. Solubilizaram-se as células coradas para quantificação com solução de Sarkosyl (N-Lauril sarcosina, 1 por cento em água) numa quantidade de 3 ml/cavidade. Depois efectuou-se a leitura da absorvância da solução a 590-650 nm«

Embora o presente invento tenha sido agora descrito em relação a certas concretizações preferidas, e aqui exemplificadas neste sentido, um perito na arte facilmente se apercebe que se podem fazer várias modificações, alterações, omissões e substituições sem que o seu espírito seja alterado.

Claims (28)

1. 72 944 201.,0 (POR)

   31~ R E I. V I N Ο I C. & 0. Õ E. 8 1 - Processo de preparação de um composto de fórmula estrutural π O

   na qual W, em conjunto com os átomos de carbono ligados ao grupo vinileno apresentado, é um anel monocíclico aromático ou um sistema de anéis fundidos bicíclíco, que inclui seis átomos no anel contendo o grupo vinileno apresentado, caracterizado por compreender a reacção de um composto com a fórmula estrutural mostrada a seguir para substituir o grupo R por H O

   na qual R é um grupo protector»
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por todos os átomos que constituem o anel W serem átomos de carbono
3. « 3 ~ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por W ser um anel monocíclico-
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por W ser um sistema de anéis biciclico, contendo dois anéis de seis membros fundidos-
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um dos átomos constituintes de W ser urn átomo de azoto do anel- 72 944 201-0 (POR)

   32”
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterízado por W conter um átomo de azoto do anel, um átomo de oxigénio do anel, sendo os restante© átomos do anel átomos de carbono,,
7. 7 -Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterízado por W conter um átomo de azoto do anel, sendo os restantes átomos do anel átomos de carbono»
8. 8 ™ Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterízado por W ser um sistema de anel monocíclico»
9. 9 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterízado por W incluir um ou maís grupos substítuintes ligados a um ou mais átomos do anel, além dos substítuintes ligados ao grupo viníleno apresentado»
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterízado por um ou mais dos referidos substítuintes serem seleccionados de entre o grupo consistindo em alquilo alcoxi 0χ~06, perfluorometilo, perfluorometoxi, hidroxilo, aciloxi C^-C^, benziloxi, nitro, halo e amino possuindo a fórmula NR^R6, onde R5 é selaccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo benzilo, acílo e benzoilo, e R6 é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo C1-C6 e benzilo, ou NR^R6 formam em conjunto um anel de 5 ou 6 membros»
11. 11 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por o composto preparado ser a golfomicina A.
12. 12 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterízado por o referido composto ser a naftilgolfomicina»
13. 13 - Processo de preparação de um composto de fórmula estrutural:

    72 944 201..0 (POR) -33 na qual R1, R2, R3 e R4 são iguais ou diferentes e são se-leccionados de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo Crc6, alcoxi crc6. perfluorometilo, perfluorometoxi, hidroxilo., aciloxi C^-C^, benziloxi, nitro, halo e amino possuindo a fórmula NR5R6, onde R5 é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo benzilo, acilo C^-C^ e benzoilo, e R1^ é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo CjfC6 e benzilo, ou NR^R6 formam em conjunto um anel de 5 ou 6 membros; ou R1 e R2, R2 e R"3 ou R'3 e R4 formam em conjunto com o anel benzo apresentado um sistema de anéis fundidos, aromático, bicíclico caracterizado por compreender a reacçâo de um composto com a fórmula estrutural mostrada a seguir, para substituir o grupo R por H

    R« na qual R é um grupo protector.
14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por R·** e R2 serem hidrogénio e R"3 e R4 formarem em conjunto com o anel fenilo apresentado um sistema de anel aromático, biciclico.
15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido sistema de anel aromático, bicíclico ser um sistema de anel naftalénico.
16. 16 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se dispersar num transportador farmacêutica-’ mente aceitável uma quantidade que clive AON, de um composto de fórmula estrutural: (segue fórmula)

    na qual W, em conjunto com os átomos de carbono ligados ao grupo vinileno apresentado,, é um um anel monocíclico aromático ou um sistema de anéis fundidos bícíclico, que incluí seis átomos no anel contendo o grupo vinileno apresentado; e

    Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, e benzei lo, em que H é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, amónio e um iâo de metal alcalino.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri” zado por todos os átomos que constituem o anel W serem átomos de carbono.
18. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracteri zado por W ser um anel monocíclico.
19. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri-zado por pelo menos um dos átomos constituintes de W ser um átomo cie azoto do anel.
20. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteri-zado por W conter um átomo de azoto do anel, sendo os restantes átomos do anel átomos de carbono..
21. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri-zado por o referido composto ter a fórmula estrutural: R1 ?,

    72 SM 4 201-0 (POR)

    -35 na qual R-'-, R2, e R4 são iguais ou diferentes e são se-leccionados de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo cx-c6, alcoxi Cl-C6s perfluorometilo, perfluorometoxi, hidroxilo, aciloxi benziloxi, nitro, halo e amino possuindo a fórmula NRSR6, onde R5 é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo benzi lo, acilo C^-C^ e benzoílo, e R6 é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo C^-C^ e benzilo, ou NR^R6 formam em conjunto um anel de 5 ou 6 membros; ou R1 e R2, R2 e R3 ou e R4 formam em conjunto com o anel benzo apresentado um sistema de anéis fundidos, aromático, bicíclico; e Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, PO3M2, acilo Cjl~C6 e benzoílo, em que M é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, amónio e um ião de metal alcalino,
22. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteri-zado por R1 e R4 serem hidrogénio e R2 e R3 formarem em conjunto com o anel fenilo apresentado um sistema de anel aromático, bicíclico-
23. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteri-zado por o sistema de anel aromático, bicíclico ser um sistema de anel naftalénico.
24. 24 - Processa de acordo com a reivindicação 21, caracterí-zado por Y ser hidrogénio-
25. 25 - Processa de acordo com a reivindicação 21, caracteri-zado por o referido composto ser a golfomicina A,
26. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteri-zado por o referido composto ser a naftilgolfomicina.. caracteri-
27. 27 - Processo de acordo com a reivindicação 23 zado por o referido composto ser a golfomicina A- 72 944 201.0 (POR) ~·3ό~~
28. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri-zado por o referido composto ser a naftílgolfomicina. Lisboa, -t isa 1991 Por THE 3CRIPPS RESEARCH INSTITUTE