PT98075B - Processo para a preparacao de um electrodo bio-sensor para imobilizacao de biomoleculas por precipitacao electroforetica - Google Patents

Description

h i όπιό I ê-d qual é que a fabricação da biosonda requer a deposição de uma cuia apenas sobre a superfície do eléctrodo ds trabalho? utilizado para controlar um produto da reacção enzimática, As biomolêculas depositadas em outras zonas da biosonda devem reagir para produzir um produto que não deve ser detestado? desperdiçando as biomolêculas que são frequentemente dispendiosas»

Um método previsto para ultrapassar as problemas na deposição de biomolêculas reside na electroforese, para promover a migração das biomolêculas carregadas, tais como proteínas? lípides antipáticos ou ácidos nucléicos» No meio apropriado? estas biomolêculas contêm metades carrsqatías positiva e negativa-mente que se fixam a um polo oposto de um campo eléctrico produzido» A migração das biomolêculas contidas dentro do meio e a deposição sobre um eléctrodo com uma polaridade oposta à das moléculas carregadas é desse modo promovida? se se criar um potencial através de dois eléctrodos num determinado meio» promover

Por exemplo? foram utilizadas técnicas de deposição electrof orética por IkariYama et ai»? J » EI sc 1 r oc bem » Soc »„ 136(6)? pàgs» 7632—7*36 (1989)= Este método promove a codeposição de partículas de platina, com a oxidase de glucose de enzima» Ao pH em que a platinização tem normalmente lugar (pH = 3?55 ? a oxidase de glucose apresenta o mesmo sinal ds carga positiva? uma vez que o pH é menor do que o respectivo ponto isoeléctrico de 4,3. A oxidase de glucose é por isso atraída para um eléctrodo de carga oposta? conjuntamente com os iSes de platina, Para aumentar a estabilidade do enzima depositado? a sonda è mergulhada em soluções de albumina e glutaraldeído? a fim de cruzar as ligações das moléculas» No entanto? esta técnica pode resultar na. inactivação do enzima? por causa, do pH relativamente baixo empregue para 'w

Kaishi)

Aizswa et al»5 J. Chem, óoc„ Jagan (Nippon Kagaku U, náq a 221 ã-221.3 (1987) descreveram o desenvolvimento de uma técnica de slsetrodeposição da oxitíase de glucose. A oxidas© de glucose foi absorvida sobre a superfície de um eléc— trodo de platinaa um potencial controlado, a partir de uma solução aquosa. As condições óptimas para a sua deposição foram de '3P1 V vs. Ag/AgCi e pH = 3, A espessura máxima obtida através deste método foi de 4 camadas espessas de moléculas de glucose de

_ —O oxidas©, equivalente a aproximadament© bó x 1Θ ' m de espessura máxima de película de oxidas© de glucose» A técnica foi avaliada a valores de pH entre 3 e 95 obtendo-ss a deposição óptima a um pH de 3. A camada extremamente fina depositada por esta técnica é inadequada para muitos fins que exijam que a interseção da ligando com a biomolécula seja um fautor limitado não proporcional na reacção. Uma outra desvantagem é o tempo de vida limitado e a capacidade de reutilização destas camadas finas de moléculas imobilizadas.

Deste modo» é um objectivo do presente invento propor— cionar um método para deposição e imobilização de uma camada relativamente fina de biomoléculas de moléculas sobre um substrato condutor, de modo que a interseção de um ligando com uma biomolécula não esteja limitado proporcionalmente. é outro objectivo deste invento proporcionar um método de reprodução e deposição precisa e imobilização de biomoléculas sobre sondas electrónicas miniaturas» έ ainda outro objectivo deste invento proporcionar um método de deposição silmutânea a de imobilização de uma pluralidade de diferentes biomoléculas sobre um substrato condutor» é um objectivo adicionai deste invento proporcionar um métotio de deposição e imobilização de biomoléculas de modo a ™g obterem-se camadas com espessuras entre 1® “eiΰ m« a preparação de um eléctrodo condutor revestida com uma compreende a preparação de de biomoléculas destinadas gama suficiente para evitar um valor tal que todas as a deposição possuam o mesmo

Desce moda, um me Lodo para para biosonda que possuí um substrato espécie biomolecular desejada, o qual uma. solução ds pelo menos uma espécie a deposição, tamponada dentro de uma a desnaturação das hiomoléculas e a espécies de biomoléculas destinadas sinal de carga eléctrica, líquida devido aos seus pontos isoeléc tricôs respectivos» 0 eléctrodo para bi«j=». são imersos na solução & provoca-se unja diferença de potencial de cerca de 1ΘΘ milivolts a 1 volt, entre os eléctrodos, obrigando a corrente a passar, 0 potencial é feito variar ao longo do tempo de uma maneira calculada, de modo a fazer com que a corrente que passa entre os sléctrodos se mantenha praticamente constante, induzindo a migração e a deposição subsequente sobre o eléctrodo para biosonda. Depois da espessura desejada de biomoléculas se ter depositado sobre o eléctrodo para biosonda., a estabilidade da película biomolecular depositada pode ser aumentada por cruzamento de ligações com um agente de cruzamento de ligações adequado.

Nos modelos contém uma biomolécula para biosonda e o cont r% O mA/cm·^, A voltagem processo de deposição. de realização preferidos, a solução que é aquosa e a corrente entre o eléctrodo ra-eléctrodo é escolhida para ser cerca de é ajustada com aumento da mesma durante o para manter uma corrente constante, apesar do aumento da ’SÍst'é'ncia eléctrica do eléctrodo, devido è lar., A deposição é man a sobre o eléctrodo para tida até biosonda depusxção da peliuuia bxomulecu que a espessura média de pelicul seja superior a 5 mieromeiros*

StTi p 1

Uma vantagem do presenta invento reside na sua gama de possibilidade ds c; e 1 ec t roforé ticas .£ «- J X, ~ , iSi i.3. ue domolêcu le. Q0S ejada apenas é .ta candu tor« ,de Pt -ΞΙίΗ:- camada ,S ΓΒ lativame n te ÍSiB ser Q 0 DOS .1. tadas sobre- um >lic iaÇSeS f 2. S Í. G ilógic as envol vem rei ativa men te gran dss de um ;er detec t-ado s ' uma biomoléc u 1 a ? aplicações a substratos condutores com geometrias diferentes. Devido ao facto da deposição biomolecular ser baseada na electroforese, as biomoléculas podem ser depositadas virtualmente sobre qualquer condutor ou semicondutorr, independentemente da forma ou topografia. Por exemplo* uma superfície condutora muito rugosa pode ser revestida uniformemente com uma película, biomolecular, ou então o interior de um material condutor, tal como um tubo de platina, pode ser revestido muito facilmente com uma biomolécula e ser inserido num sistema de corrente passante para fins analíticos. Igualmente, em contraste com muitas outras técnicas de deposição de películas, a deposição das biomoléculas é, nestas técnicas uma forma localizada, em que a

Uma outra vantagem n espessas de biomoléculas que j eléctrodc* para biosenda. Muitas ap! a interseção entre quantidade·; determinado ligando fisiológico < depositada sobre um elèctrodo para biosonda» Películas monomole-culares muito finas ou películas com uma espessura muito menor do que 1 micrómetro podem fazer com que a reacção entre o ligando fisiológico e a biomolécula seja limitada proporcionalmente, devido á quantidade reduzida de biomoléculas disponíveis para a reacção, è. diminuição da sensibilidade da sonda e ao proporcio— naraento de uma interseção não-linear (entre a biomolécula e o ligando) que podem tornar difícil a determinação da quantidade de ligando εκistente numa solução,

Uma outra vantagem do presente invento resulta da aplicação de uma corrente constante ao longo da deposição sobre o

eléctrodo para biosonda. Isto resulta numa deposição estável da hiomolécula sobre o eléctrodo para biosonda, mesmo que a deposição da biafliolêcula bloqueie a superfície do eléctrodo e aumente a resistência elèctrica. Devido ao facto da resistência do eléctrodo para biosonda aumentar ao longo do curso do processo de deposição, a corrente e a taxa de deposição de biomoléculas diminui normalmente, a menos que a voltagem seja aumentada gradualmente» Esta diminuição da taxa de deposição continuará até que deixe de haver deposição, ainda que a película depositada tenha uma espessura muito menor do que a pretendida. Em contraste, o presente inventa mantém a corrente constante e permite que a voltagem aumente à medida que a resistência aumenta, até que aquela atinja um valor ao qual a água, ou seja reduzida, ou oxidada produzindo bolhas de gás. Deste modo, promove-se a formação de películas com uma espessura maior do que íΘ micróme-tros = ua utilida

Uma outra vantagem do presente invento é

I de a valores de pH comparáveis com os valores de pH aos quais a biomolécula é formada. Películas muito espessais de biomoléculas proteinâceas, tais como enzimas, podem ser depositadas ao pH fisiológico (7,4) em soluçSes aquosas, minimizando os problemas de potencial com a inactivação ou desnaturação do encima que podem ser encontrados com outros métodos de deposição de películas de enzimas.

Outras características e vantagens do presente invento tornar—se—So evidentes para os especialistas da arte face à. seguinte descrição pormenorizada dos modelos de realização preferidos que exemplificam o melhor modo de realização do invento, como é compreendido presentemente.

Breve Descrição da Figura A Fig. 1 é uma representação esquemática de um aparelho para electrodeposição de biomoléculas sobre um eléctrodo para biosonda submerso num fluido aquoso que contém uma hiomolécula desejada.

Descrido dos Modelos de Realização Preferidos

Conforme está representado na Fig. í, o aparelho (10) é adequado para implementação do processo do presente invento» O aparelho (1Θ? compreende um contentor <12> 5 configurado para conter o liquido (30)» 0 liquido (30? pode ser uma solução ou uma suspensão que contém as espécies desejadas de biomoléculas. Uma fonte d© energia eléctrica (14) com um fio condutor íi&> ligado ao eléctrodo para biosonda (22) e ucn fio condutor negativa (18? ligado ao contraeléctrodo (20? está prevista para fazer passar um fluxo ds corrente praticamante constante entre os dois eléetrodos (20) e (22). Q eléctrodo para biosonda (22? forma uma parte de uma unidade de biosonda (25) que é constituída pelo eléctrodo para biosonda (22) s por um substrato nao conoutor electricaments (24). Os fios condutores (16) e (18) sãu isola.uOs electricamente com um material não condutor que ê capaz de um® imersão resistente no liquido (30). A direcçlo do fluxo da corrente pode ser invertida se desejado, por troca das 1 igaçSes dos fios condutores ».16? e -,18.1 na fonte de energia (14), de modo a fazer o fio conoutor (16) os :4> um negativo e o fio condutor (18? positivo. Uma vez que ambas fios condutores (16) e (18) são isolados, e que o substrato C que envolve o eléctrodo para biosonda é construído a par tir d© material não condutor, contida na líquido (3Θ) a deposição de uma espécie biomolecular apenas se dá sobre o eléctrodo (20) ou 9

(22) que se encontra carregado com o sinal contrária ao da carga da bioíTiD-lécula que está dentro do líquido (3®), fts b i utiiO 1 éi_ u 1 as adequadas para. deposição tb-U Q O S eléctrodos (2 0) e (22) podem ser, mas não 1hss estão 1 imi ta.das, as seguintes classes de mo 1 éc u 1 as ou. agr upamentos mo 1 ecu. 1 ares naturais ou artificiais que podem existir como componentes de sistemas biológicos;; peptidos, oligopeptidos. proteínas, apoprc-teinas, glicoproteínas, antigenos e anticorpos dos mesmos, receptores e outras proteínas de membrana, análogos de proteínas nos quais pelo menos uma ligaçlto nSío-peplido substitui uma ligação peptido, enzimas e percursores de enzimas, coenzimas, inibidores de enzimas, amino ácidos e os seus derivados, hormonas, lípidos, fosfolipidos, glicolipidos, liposomas, nucleotidos, oligonucleotidos, polinucleotidos e os seus análogos e derivados funcionais e biológicos reconhecidos na arte, os quais são por exemplo? polinucleotidos metilados e análogos de nucleotido com ligações de fos foro ti oa to ; plasmidos, cosmidos, cromossomas artificiais, outros vectores de ácidos nucleícoss polinucleotidos anti-sentido, incluindo aqueles substancial.mente complementares de pelo menos um ácido nucleíco endogenoso ou aqueles com sequências com um sentido oposto a pelo menos partes de genomas virais e retrovirais seleccionados, e qualquer outra molécula activa biologicamente» Qualquer uma das biomoléculas precedentes que possua uma polaridade fraca ou mesmo nula ou então uma polaridade induzívei sob as condições existentes no aparelha C1Θ) pode ser ligada covalentementes um veículo carregado apropriado para deuosx taoo sobre formar um complexo carregado que possa ser eléctrodos (2Θ) s (22)»

Os membros das c1as; qualquer combinação de membros postos em solução ou suspen* s de biomoléculas precedentes e específicos das mesmas podem ser '0 como partículas coloidais no 10 - ν’*' - χ\·' líquido (3©)? por utilização de técnicas reconhecidas na arte que dependem da composição do líquido (3©)» Bera 1 mente, o liquide:* (30) é uma solução aquosa, tal como soro fisiológico, capaz de conduzir uma corrente eléctrica. Podem-se também adicionar à solução, se desejado, outros aditivos, tais como surfactantes nlo-iónicos e agentes anti-espumantes» A direcção, a taxa de migração a a taxa de deposição das biomoléculas originalmente em solução ou suspensas no líquido <3β) sobre os eléctrodos <2Θ) s <22) podem ser controladas com uma grande sensibilidade por ajuste apropriado do pH do liquido í30>„ Este controlo é baseado na utilização de técnicas electro-foréticas convencionais aplicáveis a metades carregadas permanentemente que dão á biomolécula um sinal da carga na líquida (30) que depende do pH do mesmo» D pH ao qual a molécula apresenta um sinal de carga negativa nula, e que por consequência não migra sob a influência de um campo eléctrico, é definida como o seu ponto isoeléctrico. A valores de pH maiores do que o ponto isoelétrico, a molécula apresenta uma carga negativa líquida; contrariamente, a valores ds pH menores do que o ponto isoeléc— trico, a molécula apresenta uma carga positiva líquida, Deste modo, no aparelho mostrado na Figura, o pH do líquido (30) é ajustado para ser maior ou menor do que o ponto isoeléctrico da biomolécula desejada que se pretende depositar sobre os eléctrodos (20) e (22). Este ajuste pode ser realizada por utilização de ácidos conhecidos ou de agentes alcalinos, conforme for desejado»

Os agentes de ligação cruzada, qut « inu UUUilUU^ .SM, solução conjuntamente com a introdução da biomolécula desejada, quer introduzidos após a deposição sobre os eléctrodos (2Θ) e (22), são úteis para promover a formação de uma massa depositada sobre os eléctrodos essencialmente insolúvel em água» Os agentes

'ν_> de ligação cruzada compreendem geralmente grupos de ponte poli··· funcionais capazes de formarem uma ligação covalente com a bioiBOlécula desejada, mas podem também compreender agentes radiantes ou outros qus actuem no sentido de promoverem a ligação cova lente entra biomoléculas sem grupos de ponte. 0 tipo de agente de ligação cruzada empregue variará em função das hiomo™ léculas especificas depositadas, e poderá ser por exempio um agente de silano, um agente de ligação de alquilamina, u.m agente de ligação de isotiocianato, um agente de ligação de triazina, um agente de ligação azo, um agente de ligação de fenilidrazina, um agente de ligação de carbodiimida e um agente de ligação de cloreto de ácido. A utilização de glutaraldeido ê de utilidade particular para o presente invento, embora se possam utilizar outros agentes de ligação químicos como agentes de ligação cruzada bivalentes, tais como brometo de 4-azidofenacilo, diani-dride benzofenona-3,3',4,4'-tetracarbozílico, éster de N-hidroxi-succinimida de bioestanha, éster de 4-nitrofenilo de bioestanha, ácido 2,2'-biquinolona-4,4'-dicarboxí1ico, bisí 4-f 1uoro-3-nitro- fsnil}sultona. 1,5—bis < succ in imidooM icar bon i lá>; i > pen tano, 4- —(BOC—aminometil)fenilisotiocianato, cloridrato de N—B0D-í,6— —diamino-hexano, ácido bromopirúvico, cloreto cianúrico, sal de bissódio do ácido 4,4'-diazidoestilbeno-2,2'—dissulfónico, dianidrido do ácido pentaacético dé dietilenotriamina, pirocar-bonato de dietileno, 1,5~difluoro“2,4-diniirobenzeno, l,è-diiso-cianohexano, sal de disódio do ácido 4,4'-diisotiocíanatoestil-beno-2,2'—dissulfónico, dicloridrato de adipimidato de dimetilo, cloridrato de N-(dimetilaminopropil~N'-etilcarbodiimida, dicloridrato de 3,3'—ditiodipropionimidato de dimetilo, dicloridrato de dimetilpimelinodiifflidato, dicloridrato de suberimidato de disneti-lo, bisCéster de N-hidroxissucinimida? de ácido 3,3'-ditiodipro-piónica, azeto de 4-fluoro-3-nitrofanilo, formaldeído, fumaroni-trilo, glutaraldeído, glutaronitrilo, glicolaldeído, tíiisocianato de hexametileno, dissulfureto de è-hidróxi-2-naftila. 6

Ν-hidroHÍssuKÍnimidéster da ácido 3-<4--hidro?;ifsni 1)prapiónica, cloridrato de 2-iminotiolano, 4~maleimidofautiramidometiI--polisti·-renos N 5 -M ‘ - < 1 , 4 - f ©n i 1 eno 3 d i ® a 1 e i. m i d a , diácido de polietileno glicol N-succiniínidil-3-í2-piridiltio)propionato? 3-maleimi~ dabenzaato de N-siccinimidilo, 4-maIeimidobutirato de N--succini-midilo, 6—maleimidocaproato de N“succinimidi lo, 3—maleimidcpro— pionato de N-succinimidilo, tiodietilenoglicol , toluileno-2,4— -diisocianato e diisocianato de m-Kileno,

Os eiéctrodos para biosonda produzidos de acordo com o método do invento podem ser utilizados numa grande variedade de sistemas de detecçSo moleculares* incluindo biosondas electroaui— acústicas, micas aperomêtricas e biosondas calorimêtricas, potenciomátricas, ópticas e à base de ISFET.

Para se apreciarem melhor determinadas características da presente invento, apresentam—se os seguintes Exemplos.

(I - 13

Exemplo i 5% em peso ds QK de uraa solução Sâ

Uma solução de 5% preparada por utilização de uma solução salina tamponada com fosfato (ρΗ = 7» 4) como solvente. A oxidas© de glucose é dissolvida cuidadosamente na solução salina por agitação lenta5 havendo o cuidado durante a agitação de se evitar a formação de espuma que pode provocar a desnaturação da oxidas© de glucose» Uma célula de electrodeposição é cheia com esta solução e o eléctrodo para faiosonda sobre o qual se pretende depositar o enzima, conjuntamente com o contra eléctrodo, é submerso na célula» As 1iqaçoes elécfcricas são feitas a um galvanostato e a corrente é 2 ,, . mantida a uma densidade constante de 5 mA/cm sobre a superficis do eléctrodo» 0 fluxo de corrente é orientado segundo a direcção que resulta num sinal de carga positiva sabre a superfície do eléctrodo para atrair as moléculas de- oxidas© de glucose carregadas negativamente» A corrente é aplicada durante 2 minutos» Ao longo do curso do processo de deposição, a voltagem aplicada não deve exceder Θ, 5 Volt. 0 eléctrodo é então removido da solução de enzima e é submerso em água destilada e d es-ionizada sem agitação durante 5 segundos, a fim de se remover a oxidase de glucose residual»

I 0 eléctrodo ê então submerso numa solução que contém 2,5% em volume de glutaraldeído em salina tamponada com fosfata (pH = 7,4) durante 30 minutos para cruzar covalentemente as ligações das moléculas d© glucose e para formar uma massa insolúvel em água» 0 eléctrodo é submerso novamente em água destilada e desionizada durante 5 segundos e é deixado secar ao ar durante 30 minutos. A inspecção ao eléctrodo revela que a camada de oxidase de glucose tem uma espessura de aproximadamente 1.,5 pm depois de ι

seca» Num ensaio subsequente, observou-se que o cruzamento das ligações pelo glutarsldeído è eficaz no sentido de evitar que a oxidase de glucose entre em solução novemente» Observa-se que o componente en.zimático da biosonda é funcional neste ponto.

Exemplo A codeposiçã.o de duas ou ma is bíomoléculas- sobre a superfície de um eléctrodo é também possível, desde que os seus pontos isoeléctricôs sejam todos ou superiores ou inferiores relativamente ao pH da solução de deposição» Neste exemplo, prepara-se uma solução de salina tamponada com fosfato (pH - 7,4) que contêm 5% em peso de oxidase de glucose e 5% em peso de albumina» A oxidase de glucose e a albumina tim pontos isoeléc- trxcus de 4-,3 e respectivamente, o que faz com que -ambas as moléculas possuam carpa negativa dentro da solução de pH = 7,4» Aplica-se uma densidade de corrente de 5 mA/cm^ ao eléctrodo durante 2 minutos, ao mesmo tempo que o mesmo é submerso na solução de oxidase ds glucose/albumina» As moléculas são submetidas a cruzamento de ligações na solução . de glutaraldeído, conforme foi descrito no Exemplo 1, são lavadas e secas» Observa-se uma camada resultante ds oxidase da glucose/albumina de aproximadamente 5 μπ; de espessura» Num ensaio de longa duração da actividade da oxidase de glucose, constata-se que a camada ds oxidase de glucose/albumina é apreciavelmente mais estável do que a de apenas oxidase de glucose formada no Exemplo 1»

Exemplo 5

Uma solução de 2,4 fng/ml do anticorpo anti—fluresceína de coelho íafenidads purificada) é preparada por utilização de uma solução tampão borato CpB 9,Θ) cama solvente» 0 valor de pH foi seleccionado pare. reter o máximo da actividade de ligação do 7/ 7/ célula de electrodeposiçSo é cheia com esta an ti-corpo. Uma solução e o eléctroda para biosonda sobre o qual se pretende depositar o anti-corpo, conjuntamente com o contra eléctroda, é submerso dentro da célula» As ligações eléctricas são feitas a um galvanosiato ε a corrente é mantida a uma densidade constante de 5 mA/cm^ sobre a superfície do eléctroda» 0 fluxo de corrente ê orientado segundo uma direcção qus resulta, num sinal de carga negativa sobre a superfície do eléctroda para biosonda, para atrair as moléculas de anticorpos carregadas positivamente» A corrente é aplicada durante 5® minutos» 0 eléctroda è removido da solução de anticorpos e é submerso em ãgu.a desionizada e destilada sem agitação durante 5 segundos, para remover qualquer quantidade residual do anticorpo. O elêetrodo foi então submerso numa solução que contém 2,5% em volume de glutaraldêítio em salina tamponada com fosfato <pH 7,4) durante 3© minutos para cruzar covalentemente as ligações das moléculas do anticorpo e para formar uma massa insolúvel effs água. 0 eléclrodo é submerso novamente em água des-ionizada s destilada durante 5 segundos e é deixado secar ao ar durante 3® minutos. A inspecção do eléctrodo revela que a camada do anticorpo e 1 ectrodepositada tem uma espessura aproximada de 5,5 psn depois de seca.

Embora o invento tenha sido descrito em pormenor relativamente a determinados modelos de realização e exemplos específicos, variações e modificações estão dentro do âmbito e espírito do invento, conforme -é descrito e definido nas reivindicações seguintes»

1 ò < θ' *- V REIVINSICftCSES s 11,- Processo para a preparação de um eléctrodo bío— —sensor datado de um componente biomolecular, ca.racterisdo por compreender as etapas de preparação de uma solução de pelo menos uma espécie de biomolêcula destinada a deposição tamponada dentro de uma gama suficiente para evitar a desnaturação das biomoléculas, s para um valor de modo que todas as espécies de biomoléculas destinadas a deposição possuam o mesmo sinal de carga eléctrica? devida aos seus respectivos pontos isoeléctrleos, imersão do referida eléctrodo bio-sensor e de um contra— -eléctrodo na solução. aplicação de um potencial variável de 1 volt ao eléctrodo bio-sensor e ao contra-eléctrorio, em que o potencial é feito variar de uma determinada maneira sslsccionadaP para se obter uma corrente sléctrica praticaments constante entre os eléctrodos suficiente para provocar a migração das biomoléculas destinadas a deposição na direcçSo do eléctrodo bio-sensor, e a sua acumulação ai.»

aJ 2ã „ - Processo de acordo com a reivindicação í,, caracte-rizado por compreender ainda a etapa de manutenção da corrente eléctrica praticamente constante entre os eléctrodos durante um período de tempo suficiente, para permitir a acumulação no eléctrodo bio-sensor de uma película de biomoléculas com. uma espessura média maior do que 1,Θ micrámetros. 3ã.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizado por compreender a etapa de introdução do eléctrodo

Claims (2)

17 - bXQ ‘Ξ-'Ξ-Π30Γ~ ;; ΐ-ϋΓ uma solução de numa quantidade possibilite q

- ? f Ο Λ ,ν η te a deposição scumu i j. ada = .te de 1: igação crucad a que es-te j a an te um período de tempo suf icií mto das 1 i q-aç Ses d a s biomolécu elas5 para bio—sensor» formar uma massa insolúvel sobre o elèctrodo 4®«- Processo de acordo com a reivindicação 15 caracte-rizado por a etapa de preparação compreender a produção de uma solução que contém uma proteína destinada a ser depositada= 5ao — processo de acordo com a reivindicação 4S caracte— risada por a proteína ser um encimar. ôã„ — Processo de acordo com a reivindicação 4... caracte-riçado por a proteína ser um anti-corpo, 7â«— Processo para a preparação de um elèctrodo bio— -sensor dotado de um componente proteináceos caractericado por compreender as etapas de preparação de uma solução de pelo menos uma espécie de proteína destinada a deposição tamporiada dentro de urna gama suficiente para evitar a desnaturação da proteína^ imersão do referido elèctrodo faio—sensor e de um contra--elèctrodo na solução,. ação de um potencial variável b .to sensor e ao contra—elèctrodo ar de uma determinada maneira de menos de 1 volt ao i em que o potencial é feito variar de uma determinada maneira seleccions.da5 para se obter uma corrente eléctrica praticamente constante entre os eléctrodos suficiente para provocar a migração das biomoléculas V V

✓7· Λ Í8 destinadas a deposição na direcção do eléetrodo bio-sensor« s a sua acumulação si5 e cruzamento de ligações da referida acumulação depositada no eléetrodo bio—sensor com um agente da cruzamento de ligações, para se formar uma massa insolúvel em água. sobre o referido e1éc trodo bio-sensor.

81.- Processo para a preparação de um bio-sensor ensimáticos caracterizado por compreender as etapas de preparação de uma solução de oxidas© de glicose destinada a deposição num eléetrodo bio-sensors imersão do referido eléetrodo bio—sensor e os um contra· -eléetrodo na solução. se aplicação de um potencial variável de menos de 1 volt eléetrodo bio-sensor e ao contra—eléetrodo5 em que o potencial feito variar de uma determinada maneira seleccionada? para' obter uma corren ls :a uf· ·3 0ι_άί!Ί·9πΐΗ ί_ΟΠ5 as eléctrodos suficiente para provocar a minraç:ao da o glicose destinada a deposição na direcção do eléetrodo 3. d ase d bio—sen sor 3 e a sua acumulação no mesmo sob a l& micrómetros de espessura. orma de uma psl£<_ula com 24 de unho de 1991

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3« 1200 LISBOA θ'. ·' -t.

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