JPS63222256A - 生体機能物質の固定化法及びそれを用いた電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生体機能物質の固定化法及びそれを用いたバ
イオセンサ川電極に関する。特に、特定の物質を迅速に
、高感度かつ連続的に測定するための電極の微小化技術
とこの技術で得られるバイオセンサに関する。

［従来の技術］ 白金や炭素表面に酵素や抗体、微生物等を固定化したバ
イオセンナが種々の化学物質、生体物質を迅速かつ連続
的に測定できることは既に知られている。バイオセンナ
においては生体ａｔｅ物質は、一つは生体機能物質を含
有した膜を別途調整しておき、これを電極上に貼り付け
る。他は表面を化学処理した電極に酵素等を塗布し、酵
素等と表面との間に共有結合を形成せしめる方法によっ
て固定化されてきた。然し乍ら、バイオセンサの性【ｔ
は、内現性、耐久性、高感度、応答速度等によって評価
されるが、前者の方法では応答速度の点で難があり、後
者の方法では固定化密度を大きくすることが困難であっ
た。また、いずれの方法においても、固定化には数段階
の複雑な工程を必髪とし、また、一つのセンサ上に数種
類の生体機能物質電極を取り付けた多機能センサとする
には困難があった。

また、従来の固定化酵素′１ｖ、極はモ板状の白金表面
に酵素固定化膜が装管させた構造を有している。その作
製法としては、別途調整した固定化酵素膜を白金電極に
貼り合わせる方法１表面を化学処理した平滑な白金電極
に酵素を塗布し固定化する方法などがある。然し乍ら、
このような方法では微小化が困難である。一方、この微
小化技術として最近注目されているものが半導体集積化
技術がある。この半導体技術を用いる方法では、数ｍｍ
のサイズの酵素電極も作製できるが、電位検出法である
ために、感度及び応答などの面で満足のゆく結果が得ら
れないもので、現在得られるサイズ以ドのミクＩノ化も
かなり困難視されている。

［発明が解決しようとする問題点］ 上記のような状況において９本発明者らは、従来のセン
サ電極構造と異なり、上記の従来のセンナの欠点を克服
ｒることを目的に、微小化できる生体機能物質電極作製
法で、迅速かつ高感度の測定が可能なバイオセンサ電極
を提供する。また。

本発明は、微小電極表面を微粒子化することにより電極
表面を見掛けの電極表面積より数百倍以上にした。見掛
けは微小電極であるにもかかオ）らず検出感度を上げる
ことのできるバイオセンサ電極を提供することを目的と
する。更に１本発明は。

電極表面が微粒子状であるために充分量の生体機能物質
を電極の深部まで浸漬固定化でき、そのために迅速な応
答性を有するバイオセンサを提供することを目的とする
。

［発明の構成］ ［問題点を解決するための手段］ 本発明者は、上記の問題を解決するために、酵素や抗体
に代表される生体機能物質を導電性物質内部及び表面に
固定化する方法において。

微粒子一層よりなる多孔性導電性物質表面を、該生体機
能物質の溶液に浸漬し付着せしめた後、高分子・薄膜を
形成して被覆することにより前記生体機能物質の固定化
を行なう方法である。更に２本発明は、多孔性導電性物
質の微粒子層を表面に形成した電極りに、該微粒子を生
体機能物質の溶液に浸漬し、微粒子内部に取り込んだ後
、高分子薄膜で被覆することにより前記生体機能物質の
固定化した表面層を有することを特徴とする分子識別能
力を持つ電極である。

本発明による生体機能を有するミクロ電極は。

白金などからなる微小な電極（例えば、径：１０〜１０
０　ｌｔｍ）の表面に酵素などの生体機能物質を含浸さ
せた導電性物質微粒子層を有する構造の電極である。特
に、白金の電気析出による白金黒表面層を有する電極は
、水素還元の触媒活性が高いことで知られているが９本
発明のように、白金黒を生体機能物質の担体とすること
は、従来行なわれていなく、白金板を腐食により多孔質
にしてそれに酵素などを架橋剤でつなぐ固定化法がある
がこの方法で作製した多孔体は比表面積が数Ｃ／ｇ程度
にしか達しないのが杵通である。更に本発明による白金
黒微粒そのサイズをコント〔１−ルして、生体機能物質
を包括し、固定化する方法は。

従来なかったものである。即ち１本発明による生体機能
物質の固定化方法は、従来化学試薬（架橋剤）を使用し
なければならなかった担体結合法ではなく、化学処理な
しで生体機能物質の直接固定化が行なえるものである０
本発明において、被覆に用いられる高分子−薄膜は酵素
溶出の完全一方＋Ｌ　。

及び生体適合性の付与、のために主として用いられる。

微粒子内部の酵素を架橋剤で連結すると酵素は完全に溶
出しなくなるため、この場合は表面の薄膜化は生体適合
性の付与が主目的となる。

本発明の酵素などの生体機能物質の固定化方法は１例え
ば白金黒などの導電性微粒子層中に、その生体機能物質
を固定化するものである。具体的には、該微粒子層を持
つ金属電極を、生体機能物質の水溶液中に浸漬し、或い
は、それを塗布することにより含浸せしめ２次に、生体
機能物質のわずかな溶出を防止し、かつ抗血栓性を付与
するために、アルブミンやヘパリンなどの高分子物質を
その上に含浸せしめ、これを架橋剤により不溶性化し、
不溶性高分子薄膜を形成したものである。

このような本発明の固定化方法は、酵素をゲルや高分子
中に包括固定化する。所謂、包括法を金属電極系に適用
したものと考えることができるが。

形成高分子膜は、厚さ数百人程度以下の薄膜に仕上げる
ことができ、高分子膜の存在が、生体機能物質の生体機
能の発現の阻害要因になることはないものである。

ここにおいては、′生体機能物質、とは、酵素、抗体に
代表されるもので、各種の酵素、微生物菌体１．増殖微
生物１オルガネラ、抗原、抗体。

ハプテンなどを含むものである。また１本発明において
、白金の代わりに、ロジウム、金９次素などの「導電性
物質」を使用出来、ｒ導電性物質」の微粒子層を該導電
性物質表面に形成することができるものは、他に障害の
ない限り、好適に本発明において使用できる。

−よた９本発明で使用でさる高分子物質には、アルブミ
ンなどの蛋白質、或いはヘパリンなどの多糖類などが挙
げられる。架橋剤としては、使用した高分子に対して適
する架橋剤があり９例えば。

アルブミンに対しては、ゲルタールアルデＬド。

また、カルボジイミド、マレイミド架橋剤などが用いら
れる。

本発明の生体機ｒｔ物質の固定化方法は、バイオセンサ
のミク「Ｊ化、多機能化などの多項目計洞が安来される
臨床化学分析、携帯型の健康盈視システｌ、の開発に、
極めて重要な技術の一つである。

即ら、Ｒ近、集積回路技術を用いた各種のマルチバイオ
センサが創案されているが、この点でも本発明による微
小電極表面に酵素などを固定化する方法が重要なもので
ある。更に９本発明で得られた酵素電極は高感度で、し
かも迅速な応答を示すことが明らかである。

即ち９本発明により生体機能物質を固定化した導電性物
質層の構造は、第１図に示されるものである。生体機能
物質が図示のように、微粒子導電性微粒Ｆの中に均一に
取り込まれているものである０例えば、基板上に電析さ
れた白金粒子は、電析条件によりカサ高い黒色の粒子と
して析出し。

電析諮れた白金黒層は水溶液中で強く攪拌しても簡単に
剥離ｒるものでなく、基板白金と同様に電極の一部とな
り、言わば、電極内に酵素などの生体機能物質が一体化
された形状のものである。白金黒層は、アルブミンなど
の高分子を含浸させ。

架ＭＨ’ＦＩ例えばグルタルアルデヒドなどで架橋して
酵素などが溶出しないようにできる。

このように高密度に生体機能物質を固定化した導電性物
質を利用すれば、高感度のバイオセンサ用電極が得られ
る。即し１例えば、白金黒の表面層を有する白金電極の
白金黒微粒子内部或いは微粒子表面に酵素などを固定化
して作製した電極は１次の実施例に示すように、アンペ
ロメトリ法によるバイオセンサ用電極として、高い感度
を有するものとなる１以上の本発明による固定化法を用
いると、微小電極系よりなるバイオセンサを構成４゛る
こともできる。

本発明に利用する微粒子のサイズ或いは粒子間距離は、
形成条件を変えることにより、−Ｊント［Ｉ−ルするこ
とができる。

このような′ＴＬ極としては、白金以外に、ロジウム、
金、炭素即ち、グラファイトを基板として。

その」二にロジウム微粒子、金微粒子、白金黒１次素グ
ラファイト微粉、或いは、導電性金属酸化物微粒子の微
粒子層を形成したもので、その微粒子層中に生体機能物
質を固定化したものである。

［実施例］ グルーｌ−スはグルコースオキシダーゼの存在下でグル
コン酸と過酸化水素に分解されるが、酵素と白金電極を
組合わせて、グルコース濃度に対応した′ｊ５酸化水素
の酸化電流を測定することにより、グルコース濃度を決
定できる。この点から。

本発明により作製したＴＬ極を用いて１次に、実験を行
なった。

先ず、直径１００μｍの白金線をソーダガラス管に封入
した。この白金線を研磨し９円形の微小白金電極を得た
０次いで０．５Ｍ硫酸水溶液中で銀／塩化銀電極を参照
電極として、該白金電極に電位＋１．３Ｖから−０，２
５Ｖ（７）範囲一’ｒｌｏＯｍＶ／秒の走査速度で電位
走査を３０分間行なった。上記の電極を３００ｐｐｍの
酢酸鉛含有の３％塩化白金酸溶液中に浸し、電流値−５
０μＡで１０分間白金黒の電気析出を行なった。析出し
た白金黒層の厚さは、約数μｍであった０次に、得られ
た白金黒析出電極を２５℃で６０秒間風乾を行なう、そ
の後、０．５Ｍ硫酸水溶液中で銀／塩化銀電極を参照電
極として該白金黒析出電極を一〇、３ｖに３０分間保ち
、白金黒析出電極から水素を発生させた。

この白金黒Ｍ、極を２０°Ｃで６０秒間風乾させた後に
５５００単位のグルコースオキシダーゼを含む燐酸緩衝
液（ｐＨ６，８）Ｉｎりに２０分間浸漬した。再度２０
℃で３０秒風乾した後、得られた酵素固定化微小電極を
用いて、燐酸緩衝液中でブドウ糖濃度を測定した。即ち
、参照電極（基窄電極）、対極（白金）１作用極部ら１
本発明により作製したグル：コースオキシダーゼ固定化
白金黒電極を用いてグル７Ｉ−スを測定した。各電極を
ボデンシオスタットに各々接続し、参照電極に対して作
用極を＋〇、６■に保持した状態で、グルコースを注入
し、対極と作用極間に流れた過酸化水素による酸化電流
値を測定した。その結果、この電極は１００％応答は３
秒以内で、しかもグルコースを第２図に示すように、　
０　、　Ｏｌｆｆ１ｇ／ｄｉの濃度でも測定でき、測定
範囲も、　０　、０　ｉｎ＋ｇ／ｄＱ〜１００ｍｇ／ｄ
Ｑの範囲で直線性が示された。

グルー１−ス（０、９ｍｇ／ｄ悲）の添加に伴う本発明
のセンサ出力即ち、過酸化水素の酸化電流の変化は、第
３図に示す如く、非常に応答性のよいものであった。前
述のように１００％応答まで３秒以内であった。センサ
の応答は極めて速く、直ちに定常値に達した０以上のよ
うに本発明による生体機能物質の固定化法によるバイオ
センサは、迅速な応答を示し、かつ高感度であり、簡単
な方法でミクロバイオセンサが作製できることが明らか
にされた。

［発明の効果］ 本発明の生体機能物質の固定化方法とそれを利用したバ
イオセンサにより、第１に感度よく検出できる電極が提
供できたこと、第２に酵素など生体機能物質を容易に包
括固定化でき、生体機能物質を傷つけずに固定化できる
ために活性がほとんど失われていない生体機能物質固定
化電極が得られること、第３に高密度の生体機能物質の
固定化ができ、迅速な応答性が得られる電極を提供でき
たことなどの顕著な技術的効果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは１本発明により作製したバイオセンナ電極の
構造を示す断面図である。また第１図Ｂは、第１図Ａの
一部を拡大した断面図であり、生体機能物質を含浸させ
た微粒子表面の構造を示す。 第２図は１本発明のバイオセンサ電極で測定した応答出
力とグル：１−ス濃度のｌｉｔ係を示すグラフである。 第３図は、本発明によるバイオセンサの応答性を示すグ
ラフである。 ［１四な部分の符号の説明］ １１１．導電性物質微粒子 ２２１．生体機能物質微粒子 ３０１．高分子薄膜 特許出願人　　国立リハビリテーションセンター住友セ
メント株式会社 代理人　　弁理士　倉　持　　裕（外１名）第２図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素や抗体に代表される生体機能物質を導電性物
   質に固定化する方法において、 導電性微粒子物質を、該生体機能物質の溶液に浸漬し、
   該生体機能物質を微粒子内部に取り込んだ後、或いは表
   面に付着せしめた後、直接酵素同士を架橋するか或いは
   微粒子表面に高分子薄膜を形成することにより被覆する
   ことで酵素溶出を防止することを特徴とする前記生体機
   能物質の固定化方法。
2. （２）導電性物質の微粒子層を表面に形成した電極上に
   、該微粒子表面層を生体機能物質の溶液に浸漬し、該生
   体機能物質を粒子内部、粒子表面に取り込んだ後、酵素
   同士の架橋或いは高分子薄膜化処理により被覆して、前
   記生体機能物質を固定化した表面層を有することを特徴
   とする分子識別能力を持つ電極。