JPS6161049A - オキシダ−ゼ電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ０）産業上の利用分野 この発明は、オキシダーゼ電極に関する。さらに詳しく
は、電解質中に存在するグルコース、ガラクトース等の
オキシダーゼ酵素の基質となシうる物質の濃度をアンペ
ロメトリックに測定でき、ことに血清、血漿、尿等の生
体試料中や酵素反応器中の基質濃度測定に有用であ如、
また酵素反応器あるいは燃料電池の電極としても有用な
オキシダーゼ電極に関する。

（ロ）従来技術 最近、酸化還元酵素固定化電極が注目されるようになっ
てきた。この電極は酵素反応に対する化学的な電子受容
体又は供与体の代わりとして挙動するものでいわゆる生
体触媒電極と呼称されておシ、酵素電極、フローシステ
ムの検出器、生物化学的燃料電池、酵素反応器等の新し
い用途に使用できることが提案されている。

かような電極は、従来の酵素センサーに用いられる電極
、すなわち酸素電極や白金電極等の感応面に酵素固定化
膜を積層し、酵素反応で生じる物質例えば過酸化水素の
発生量を測定して間接的に酵素反応に寄与する基質を定
量する方式の電極とは異なυ、直接的に酵素反応に関す
る電流や電圧を利用する方式の４のである。

この点に関し、本発明者らは、先に、グルコースオキシ
ダーゼ固定化電極が、溶液中の電子伝達媒体（リアージ
エント）の存在下においてグルコースの電気酸化用の生
体触媒電極として作用することを見出した。

（ハ）　　　目　　　的 この発明は、新た人オキシダーゼ同定化電極を提供する
ことを目的とするものであシ、ことに電子受容体として
の酸素を必要とせず、かつ被測定液中の酸素分圧の変動
にも影響されずにオキシダーゼ酵素に対する種々の基質
の＃度を測定しうるオキシダーゼ電極を提供することを
主目的とするものである。

に）構成 かくしてこの発明によれば、黒鉛ペースト中に電子受容
性化合物を含量させたペースト状電極と、該ペースト状
電極の表面に固定化されたオキシダーゼ酵素及びその外
面を被覆するオキシダーゼ酵素の基質の透過性薄膜、と
から構成された基質感応部を備えて々るオキシダーゼ電
極が提供される。

この発明のオキシダーゼ電極は、通常、上配基質感応部
を被測定液に接触又は浸漬した状態でペースト状電極を
陽極とする電解系を設定して用いられる。すなわちアン
ペロメトリックな電極、ことにセンサーとして用いるこ
とができる。この場合の陰極（対極）は特に限定される
ことはなく種々の電極例えば白金電極、銀／塩化銀電極
、水釧／塩化第１水銀電極等を用いることができる。な
お、測定は通常、定電圧電解によシ行なわれる。

この発明の電極は、通常、円筒状の絶縁体の一端部に基
質感応部を設定し適宜、引出し電極を設けた形態とされ
る。しかしながら用途に応じてこれ以外の形Ｉ（例えば
、フロー流路に直接組み込んだ形態）でおってもよく、
少なくとも基質感応部が前記の如く構成されておればよ
い。なお、場合によっては、対極をセンサー支持材に組
み込んだ形態とすることも可能である。

この発明の最も特徴とする点は、オキシダーゼ酵素を固
定化する電極としてペースト状電極を用い、それによシ
被測定液中の酸素などの電子伝達媒体の存在を不用とし
た点にある。そしてかような構成での種々の基質のアン
ペロメトリックな測定を可能とするために、咳ペースト
状電極として、黒鉛ペースト中に電子受容性化合物を含
有させたものを用いた点にある。

上記黒鉛ペーストとしては、黒鉛（グラファイト）粉末
と流動パラフィン、ウンデカン等の非極性結合剤との混
合物が用いられる。このペースト中の黒鉛含量は通常、
導電性や形状維持性の点で６０〜７０重量−程度が適し
ている。また黒鉛粉末としては１μｍ〜５０μｍ程度の
ものが適しているＯ 上記黒鉛ペーストに含有させる電子受容性化合物として
は、ｐ−ベンゾキノン、フェリシアン化カリウム、ジブ
ロモイドサリシリツクアシツド、ジクロロフェニールイ
ンドフェノール（ＤＣＩＰ）、フエナジンメトサルフエ
ー）（ＰＭＳ）等が挙けられ、これ以外にもオキシダー
ゼ酵素と基質の存在下で電子受容体として反応に関与し
かつ黒鉛ペースト中に安定に混和しうる化合物が使用可
能である。これらの適切な含有量は用いる酵素によって
異なるが、例えば、ｐ−ベンゾキノンを用いた際には０
．２〜３０重量％が適している。含有量が黒鉛ペースト
中０．２重量−未満では、電流感度の点で好ましくなく
、３０重量−を越えると電極の形状維持性や経済性の点
で好ましくない。最も好ましい含有量は１５〜２５重量
％である。

上記ペースト状電極に固定化するオキシダーゼ酵素とし
ては、検知や変換を意図する基質に応じて種々のものを
適宜選択することができる。その酵素／基質の組合せと
しては、グルコースオキシダーゼ／グルコース、ガラク
トースオキシダーゼ／ガラクトース、アルコールオキシ
ダーゼ／エタノール、コレステロールオキシダーゼ／コ
レステロール、アミノ酸オキシダーゼ／アミノ識、尿酸
オキシダーゼ／尿酸等が代表的である０上記オキシダー
ゼ酵素のペースト状電極への固定化は、通常、溶液法す
なわち、オキシダーゼ酵素の溶液をペースト状電極表面
に塗布、滴下埠によシ保持させ、溶媒を蒸発させること
によシ行カわれる。この際、ペースト状電極の表面はで
きるだけ平滑化させておくことが好ましい。人お、用い
るオキシダーゼの固定量は、例えばグルコースオキシダ
ーゼの場合、１０〜２００μｆ／ａｉ　、ｉｆ！度が好
ましい。

この発明における基質の透過性薄膜は、上記電極表面に
付着したオキシダーゼ酵素の保持固定に役立つものであ
る。この透過性薄膜としては、セルロースアセテート族
、ニトロセルロースａ、Ｋ−カラギナンゲル膜、ポリア
クリルアミドゲル展等が使用可能であり、ことにコロジ
オン含有液を塗布し乾燥させることにより形成されるニ
トロセルロース膜を採用するのが好ましい。なお、膜厚
に１制眠けないが、一般に応答時間をより短かくするに
は膜厚のより薄いものが、また応答濃度をより広濃度範
囲に広けるには膜厚のより厚いものが適しており、膜拐
質の種類にもよるが、通常、約２０〜５００μｍが適し
ている。

（ホ）実施例 以下、この発明を実施例により鮮鋭する。

実施例１ （オキシダーゼとしてグルコースオキシダーゼを用い、
電子受容性化合物としてｐ−ベンゾキノンを用いたグル
コースオキシダーゼ電極）囚　電極の作製 試薬 Ｏグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・Ｔｙｐｅ　ＩＩ　＋シグマ
社ｌｌ（アスペリギルス、ニガー由来のＥＣＩ、１，３
．４） ｏｐ−ベンゾキノン（ＢＱ）・・・・・・・・・・・・
・・・和光紬薬社製（使用前に昇華して精製） Ｏコロジオン液（５％）・・・・・・・・・・・・・・
・和光紬薬社製０流動パラフィン・・・・・・・・・・
・・・・・メルク社製Ｏグラファイト粉末・・・・・・
・・・・・・・・・ＡＡＣＰ　　日本黒鉛社製（１０μ
ｍ） 所定量のｐ−ベンゾキノンを３−の流動パラフィンと混
合し、次いで５ｔのグラファイト粉末を加えた。このよ
うにして得られたｐ−ベンゾキノン−黒鉛ペーストを、
内径３．４−のガラス管の一端に充填した。仁の無出表
面をワックスペーパーを用いて平滑化させて９．０Ｘ１
０””−の表面積を有するペースト状電極を設定した。

次いで、所定濃度のＣＯＤ水溶液を上記ペースト状電極
の表面上にシリンジで滴下保持させ、溶媒を蒸発させた
。その後、２０μｔのコロジオン−エタノール（容量比
１：４）混液を流延・乾燥するととＫより、電極表面に
ニトロセルロースの薄膜を形成させた。

このようにして得られた電極に、白金線からなる引き出
し電極を取り付け、さらにニトロセルロース膜の支持用
のナイロンネット及びテフロンチューブを取シ付けるこ
とＫより、第１図に示すごときこの発明のグル；−スオ
キシダーゼ電極（ＧＯＤ−固定化ベンゾキノン−黒鉛ペ
ースト電極）（１）を得九。なお、図中、（２）はｐ−
ベンゾキノン−黒鉛ペースト電極、（３）は固定化され
九〇ＯＤ、（４１はニトロセルロース薄膜、＋５）ｔｉ
白金線、（６）はガラス管、（７）はナイロンネツ）、
＋８）は熱収縮性のテフロンチューブをそれぞれ示すも
のである。

なお、この電極をセンサーとして使用に供するまで蒸留
水で数回洗浄し、ｐＨ５，０の酢酸塩バッファー中に一
晩浸漬保存した。

ω）　サイクリックポルタンメトリー 上記グルコースオキシダーゼ電極についての三極法によ
るポルタンメトリーを行なった。測定条件は以下の通り
である。

装置 Ｏポテンショスタット（扶余社製） Ｏ信号発生器（ＨＢ−１０４；北斗電工社Ｈ）Ｏ対　極
　（白金板） ０参照電極（飽和カロメル電極） Ｏ記俺計（Ｘ−Ｙレコーダー；横筒電機社製）電解質 Ｏ脱酸素したｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸塩バッファー〇
温度　・・・・・・・・・　２３±１℃Ｏ攪拌速度　・
・・・・・・・・　５００　ｒ、ｐ−ｍ結果 １Ｂ１１９のＣＯＤを、０．２５重量５ｏｐ−ベンゾキ
ノンを含有する黒鉛ペースト電極に固定化したこの発明
の電極を、上記酢酸塩バッファーに浸漬し、５０　ｍＶ
／ｓの電位走査速度でサイクリックボルタンモグラムを
記録した。第２図Ａの実線に示すようにカソード波及び
アノード波についてそれぞれ−００７ｖ及び＋〇、４０
Ｖ　（ｖｓ　５ＣＥ）にピークが認められた。サイクリ
ックな電位走査を更に連続して数時間性なり′ＩＣが電
流の減少は見られなかった。ｐ−ベンゾキノンを含有し
ていない同様な電極について同様な評価を行なったが第
２図Ａの破線のごとくポルタンメトリックなピークは生
じ彦かった。

このように、ポルタンメトリックなピークは、黒鉛ペー
スト電極とニトロセルロース薄膜との境界領域にペース
トから整向しｋｐ−ベンゾキノンの電気化学的な還元及
び再酸化反応に基づいており、ｐ−ベンゾキノン分子が
電気化学的還元反応ＫＷ与していることが判明した。

なお、ｐ−ぺ／ゾキノンは、ニトロセルロース薄膜を介
して電解質中に徐々に漏れ出すかもしれないが、これら
は、黒鉛ペースト媒体中から補給されるため、黒鉛ペー
ストとニトロセルロース薄膜との界面におけるｐ−ベン
ゾキノンの濃度は実質的に一定に保たれる。

（Ｏグルコースの電気触媒的酸化 上記バッファー中にグルコースを添加したところ、第２
図Ｂ来線のようにこの発明の電極のアノード電流が著し
く増加することが昭めら九九。そして、被測定液中のグ
ルコース濃度を増加させるに従い、定常電流工８が与え
られた電位において第３図Ａ、Ｂに示す如く増加するこ
とが判明した。

この電流工ｓは黒鉛ペースト中のｐ−ベンゾキノンの量
が０．２５〜１０重量−の範囲においてｐ〜ベンゾキノ
ン量に従って増加し、１０重量％を越えるとほぼ限界値
に達することが判明した。さらに電流Ｉ８は、電極表面
のＣＯＤ量にも依存し、例えば、ｐ−ベンゾキノンを２
０重量％含有させたペースト電極の場合に、１．８μＶ
及び１８μＶのＣＯＤを固定化した際にそれぞれ２μＡ
及び３２μＡの値を示していた。

これらの結果は、固定化されたＣＯＤは活性を維持して
おシ、そのため固定化ＣＯＤとペースト電極の開におい
て界面にトラップされたｐ−ベンゾキノンが電子伝達体
として作用していることを示している。

１８μ２のＣＯＤをｐ−ベンゾキノン（３０重量ｔｓ）
−黒鉛ペーストに固定化した電極について、〇、５■印
加におけるＩ８のグルコース濃度（Ｃｇｌｕ）依存性は
第３図Ａ、Ｈに示される。図中におけるデータの二重逆
数プロットの外挿交差点及び傾きから、最大ｔｔ流Ｉ、
ＩＴｌａＸ　　及び見かけのミバエリス定数がそれぞれ
１２４μＡ及び１０４ｍＭであることが測定された。こ
の１　、ｍａＸ値から、固定化されたＣＯＤ分子と被測
定液中に溶解されたＣＯＤ分子の触媒活性が同じである
として、電極に固定化された電気触媒活性を有するＣＯ
Ｄの量は３×１０−１１　モル／ｃＩＩ　となり、これ
は用いられたＣＯＤ量の約３％に相当する。

上記電極は、第３図Ａに示されるごとく、グルコース濃
度１５ｍＭ迄直線的応答を示し、その相関係数は０．９
９９９であった。バックグラウンドの電流は非常に小さ
い（０，２±０．０１μＡ）から、Ｃｇｌｕが１ｒｒＭ
の際の変動係数（ｎ　＝５　＊　５．３　％　）で１　
ｍＭ以下のグルコースを測定することができる（第３図
Ｂ＃照）。電流の応答は迅速であシ、２０秒以内で定常
電流に達する。

８．３ｍＭのグルコースに対する応答を定期的に試験し
てセンサーとしての安定性を評価したところ、初期の活
性は１週間以上保たれることが判った。ここで不使用の
際には電極をバッファー中に５℃以下で保存した。

１８μｔのＣＯＤをｐ−ベンゾキノン（３０重量％）−
黒鉛ペースト電極に固定化したセンサーを４個作製して
、電極作製の再現性を８．３ｍＭグルコースに対する応
答によって評価したところ、Ｉｓの平均値は７．９μＡ
で標準偏差は０７μＡであった。

散票による影響を評価するため、空気飽和液の工８と脱
気液のＩｓとを、５から４０ｍＭのグルコース溶液につ
いてそれぞれ測定した。この結果は第４図に示す如くで
あり、この濃度範囲のグルコース濃度についてはその影
響は小さいことが判った。この濃度範囲は血液試料中に
通常検知される濃度をカバーしている。

この発明の電極Ｆｉ　ｐＨ５〜８の間の液中で好適に作
用する。

実施例２ 電子受容性化合物として、ｐ−ベンゾキノンの代わシに
フェリシアン化カリウムを用いる以外、実施例１と同様
にしてグルコースオキシダーゼ電極を作製した。

この電極について、実施例１と同様にしてサイクリック
ポルタンメトリーを行なったところ、第５図に示すごと
くポルタンメトリックなピークが生じ、フェリシアン化
カリウムが電気化学的還元反応に寄与することが判明し
た。

実施例３ 対極をガラス管（１）内に組み込んだ構成の電極を実施
例１．囚に準じて作製した。この構成を８６図に示した
。なお、図中、叫り対極（陰極）である銀／塩化銀電極
を示すものでわシ、内部支持体（６′）に巻回固定して
なり、＋９１は塩化カリウムを含む酢酸バッファーから
なる電極内部液を示すものであシ、他は前述した番号に
対応するものである。

（へ）効果 この発明のオキシダーゼ電極は、被測定液中に他のいか
なる電子伝達媒体を加えることなく、グものである。従
って、各種基質のセンサーとして好適に用いることがで
きる。しかも、この電極は被測定液中に版木の存在を必
要とせず、また酸素が存在する場合にも酸素分圧の変動
に対しても実質的に影響を受けないという効果も有する
ものである。また、従来のグルコース測定用電極等でみ
られた酸素不足による高濃度領域での測定値の頭打ち現
象も、この発明の電極によれば解消することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例のグルコースオキシダー
ゼ電極を示す構成説明図である。第２図Ａ、Ｂはそれぞ
れサイクリックポルタン七グラムを示すグラフで、Ａは
グルコース未添加時、Ｂは４１ｍＭのグルコース添加時
のものを示し、破ｌｃ及びｄｔｌｉペースト中にｐ−ベ
ンゾキノン未含有の電極（比較例）を示し、実線ａ、ｂ
はこの発明の電極を示すものである。第３図Ａ、Ｂは、
それぞれこの発明の電極についての０．５ｖ印加におけ
るグルコース癩度とアノード電流Ｉｓ　との関係を示す
グラフである。飴４図は、同じ（０，５Ｖ印加における
グルコース錆度とアノード電ｆ＆　Ｉ　ｓとの関係を示
すグラフであり、プロット０は脱気測定液についてのも
の、プロット・は空気飽和測定液についてのものでを・
る。第５図は、この発明の他の実施例（７）グルコ−・
スオキシダーゼ電極のタイクリックボルタンモグラムを
示すグラフである０第６図は、この発明のさらに他の実
施例のグルコースオキシダーゼ電極を示す構成説明図で
ある。 （１）・・・・・・・・・ｆＡ−コースオキシダーゼ電
［、（２＋・・・・・・・・・］］ｌ−ヘンゾキノンー
黒鉛ペースト％Ｌ＆（３）・・・・・・・・・ＧＯＤ、
＋４１・・・・・・・・・ニトロセルロースＮＩＬ（５
１・・・・・・・・・白金線、（６）・・・・・・・・
・ガラス管。 ）塙−８ 代理人　弁理士　　野　河　信太牢・１゛−＝１６− ４−　ｅｌ朔 ←ｌｓ）梱 第３図Ｂ Ｃｇｌｕ／ｍＭ 第４図 第６図 ワ１Ａ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）黒鉛ペースト中に電子受容性化合物を含有させた
   ペースト状電極と、該ペースト状電極の表面に固定化さ
   れたオキシダーゼ酵素及びその外面を被覆するオキシダ
   ーゼ酵素の基質の透過性薄膜、とから構成された基質感
   応部を備えてなるオキシダーゼ電極。