JPS63223556A - 生体機能物質の直接固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生体機能物質の直接固定化法及びそれを用い
たバイオセンサ用電極に関する。特に。

特定の物質を迅速に、高感度かつ連続的に測定するため
の電極の微小化技術とこの技術で得られるバイオセンサ
に関する。更に、詳細には、微少電極表面に電気化学的
に微粒子層を形成しつつ、酵素などの生体機能物質を架
橋剤を使用しないで直接に固定化する方法と、その方法
で得られる高性能ミクロバイオセンサに関する。

［従来の技術］ 白金や炭素表面に酵素や抗体、微生物等を固定化したバ
イオセンサが種々の化学物質、生体物質を迅速且つ連続
的に測定できることは既に知られている。バイオセンサ
においては生体機能物質は、一つは生体機能物質を含有
した膜を別途調整しておき、これを電極上に貼り付ける
。他は表面を化学処理した電極に酵素等を塗布し、酵素
等と表面との間に共有結合を形成せしめる方法によって
固定化されてきた。然し乍ら、バイオセンサの性能は、
再現性、耐久性、高感度、応答速度等によって評価され
るが、前者の方法では応答速度の点で難があり、後者の
方法では固定化密度を大きくすることが困難であった。

また、いずれの方法においても、固定化には数段階の工
程を必要とし、また、一つのセンサ上に数種類の生体機
能物質電極を取り付けた多機能センサとするには困難が
あった。

また、従来の固定化酵素電極は平板状の白金表面に酵素
固定化膜を装着した構造を有している。

そして、その作製法としては、別途調整した固定化酵素
膜を白金電極に貼り合わせる方法２表面を化学処理した
平滑な白金電極に酵素を塗布し固定化する方法などがあ
る。然し乍ら、このような方法では微小化が困難である
。一方、この微小化技術として最近注目されているもの
が半導体集積化技術がある。この半導体技術を用いる方
法では。

数ｍｍのサイズの酵素電極も作製できるが、電位検出法
であるために、感度及び応答などの面で満足のゆく結果
が得られていない上に、現在得られるサイズ以下のミク
ロ化もかなり困難視されている。

［発明が解決しようとする問題点］ 上記のような状況において１本発明者らは、従来のセン
サ電極構造と異なり、上記の従来のセンサの有する難点
を克服することを目的に、微小化生体機能物質電極で、
迅速かつ高感度で測定することのできるバイオセンサ電
極を提供する。また１本発明は、微小電極表面に微粒子
を形成することにより電極表面を見掛けの電極表面の数
千値にした結果、見掛けは微小電極であるにもかかわら
ず”７クロな挙動をし、その結果検出感度を上げること
のできるバイオセンサ電極を提供することを目的とする
。更に９本発明は、電極表面が微粒子状であるために充
分量の生体機能物質を電極の深部まで浸漬固定化でき、
そのために迅速な応答性を有するバイオセンサを提供す
ることを目的とする。また９本発明は、導電性微粒子物
質の空隙に生体機能物質を直接固定化したバイオセンサ
電極を提供することを目的とする。従って１本発明は、
生体機能物質の直接固定化が極めて容易な生体機能物質
固定化方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］ ［問題点を解決するための手段］ 本発明者は、上記の問題を解決するために、酵素や抗体
に代表される生体機能物質を導電性物質表面に固定化す
る方法において。

微小導電性物質表面に、該導電性物質の微粒子を電気化
学的に析出させながら、該生体機能物質を電気化学的に
吸着させる単一工程で、生体機能物質固定化微小電極を
作製することを特徴とする前記生体機能物質の直接固定
化方法を提供した。

また１本発明は、微小導電性物質表面に、導電性物質の
微粒子を電気化学的に析出させながら、該生体機能物質
を電気化学的に吸着きせた微粒子導電性物質表面層を有
することを特徴とする分子識別部力を持つバイオセンサ
用電極である。

本発明による生体機部を有するミクロ電極は。

白金などからなる微小な平板電極（例えば、径＝１０〜
１００μｍ）の表面に酵素などの生体機能ゼ質を含浸さ
せた導電性物質微粒子層を有する構造の電極である。特
に、白金の電気化学析出による白金黒表面層を有する電
極は、水素還元の触媒活性が高いことで知られているが
９本発明のように、白金黒を生体機能物質の担体とする
ことは。

従来性なわれていなく（白金板を腐食により多孔質にし
てそれに酵素などを架橋剤でつなぐ固定化法があるが）
、更に１本発明による白金黒微粒子のサイズをコントロ
ールして、生体機能物質を包括し、固定化する方法は、
従来なかったものである。即ち１本発明による生体機能
物質の直接固定化方法は、従来化学試薬（架橋剤）を使
用しなければならなかった担体結合法ではなく、化学処
理なしで生体機能物質の直接固定化が行なえるものであ
る。

本発明によるバイオセンサ電極の作製方法によると１例
えば、白金などの導電性物質上に直接に生体機能物質を
電着し、同時に金属塩を電解還元（電析）させて、導電
性（例えば、金属）微粒子物質を生体機能物質とともに
析出させるものである。即ち、微小白金電極上に導電性
物質微粒子を形成させつつ、生体機能物質を該微粒子内
のボアに取り込んでいくことにより作製されるものであ
る。ボアの大きさ及び固定化される生体機能物質の量は
、電流密度、電析時間などを調整することよってフント
ロールができる。このようにして得られる固定化生体機
能物質電極の機能は、長期にわたり、保持できるもので
ある。

更に１本発明による得られる電極は、蛋白質。

多糖類などの高分子物質を塗布し架橋剤で架橋した薄膜
を形成し、生体適合上の付与、性能の維持、生体機能物
質の溶解を最小にすることもできる。

ここにおいては、「生体機能物質、とは、酵素、抗体に
代表されるもので、各種の触媒、微生物菌体、増殖微生
物１才ルガネラ、抗原、抗体。

ハブテンなどを含むものである。また１本発明において
、白金の代わりに、金、ロジウムなどの「導電性物質」
を使用出来、「導電性物質」の微粒子層を該導電性物質
表面に形成することができるものは、他に障害のない限
り、好適に本発明において使用できる。

また９本発明のバイオセンサ電極を被覆するために付加
的に使用できる高分子物質には、アルブミンなどの蛋白
質、或いはヘパリンなどの多糖類などが挙げられる。架
橋剤としては、使用高分子物質に対して適する架橋剤が
あり９例えば、アルブミンに対しては、ゲルタールアル
デヒド、また、カルボジイミド、マレイミド架橋剤など
が用いられる。

本発明の生体機能物質の固定化方法は、バイオセンサの
ミクロ化、多機能化などの多項目計測が要求きれる臨床
化学分析、携帯型の健康監視システムの開発に、極めて
重要な技術の一つである。

即ち、最近、集積回路技術を用いた各種のマルチバイオ
センサが創案されているが、この点でも本発明による微
小電極表面（酵素などを固定化する方法が重要なもので
ある。更に１本発明で得られた酵素電極は高感度で、し
かも迅速な応答を示すことが明らかである。

即ち０本発明により生体機能物質を固定化した導電性物
質層の構造は、第２図に示されるものである。生体機能
物質の微粒子が図示のように、微粒子導電性微粒子の中
に均一に取り込まれているものである。即ち、微小電極
に酵素などを電着し９次いで導電性物質を微粒子状に電
解析出させることにより、直接酵素等を固定化した生体
機能物質固定化電極を得るものである。

このように高密度に生体機能物質を固定化した導電性物
質を利用すれば、高感度のバイオセンサ用電極が得られ
る。即ち４例えば、白金黒の表面層を有する白金電極の
白金黒表面層中に酵素などを固定化して作製した電極は
２次の実施例に示すように、アンペロメトリ法によるバ
イオセンサ用電極として、高い感度を有するものとなる
０以上の本発明による固定化法を用いると、微小電極系
よりなるバイオセンサを構成することもできる。

本発明に利用する微粒子のサイズ或いはポアサイズは、
形成条件を変えることにより、即ち、還元電流、還元時
間或いは還元電圧を調整すること、或いは白金黒形成の
場合、析出溶液中の酢酸鉛の含有率を調整することによ
り、変えることができる。

このような電極としては、白金以外に、金、他の貴金属
、或いはＲ素即ち、グラフシイＲ１１１１，グラフアイ
ト等を基板として、その上に白金黒、金微粒子、貴金属
微粒子、導電性金属酸化物微粒子の微粒子層を生体機能
物質とともに形成したものある。

［実施例］ グルツースはグルコースオキシダーゼの存在下でグルフ
ン酸と過、酸化水素に変換されるが、酵素と白金電極を
一体化して、グルコース濃度に対応する過酸化水素の酸
化電流を測定することにより、グルコース濃度を決定で
きる。

先ず２本発明による酵ｌ＃固定化電極の作製方法を示し
３次に、その電極を用いてグルコースａ度の測定実験を
行なった。その結果を示す。

先ず、直径ｔｏｏａｍの白金線をソーダガラス管に封入
し、アルミナパウダーで研磨した。

酵素の固定化は１次の２つの方法で行なった。

（Ａ）塩化白金酸（Ｉｇ＊ｇ／ｍｊりとグルコースオキ
シダーゼ（１ｓｔｇ／　ｔｍｌ　）を含む硫酸ナトリウ
ム溶液（０，２１１、ｐＨ３，２）中で銀／塩化銀電極
を参照電極として。

該白金電極を作用電極としてに定電位（−０，２Ｖ）で
数十分間電解を行ない、酵素を固定化しつつ白金黒を析
出させた。

（Ｂ）塩化白金酸（３３ｍｇ）、酢酸鉛（０，６ｍｇ）
とグルコースオキシダーゼ（１０ｍｇ＞を含む溶液（ｐ
Ｈ３，５＞１ｍｊ！中で定電流（−５μＡ）で１０分間
電解して、グルコースオキシダーゼ含浸白金黒を析出さ
せた。

以上の方法で作製した電極を、０．１Ｍ燐酸緩衝液中で
一昼夜攪拌し洗浄し１次のグルコース濃度測定実験に供
した。

以上の方法で作製した電極は、１段工程で容易に調整で
きるものであり、以下のように安定した。迅速な応答が
得られるものである。即も、その？Ｅ看析出した表面層
は、第２図に示す断面のセンシング部分である。

本発明による上記のような電極作製では、正に荷電して
いるグルコースオキシダーゼ（等電点寓４．２）が電極
に電着されつつ、白金が電解析出される結果、白金黒微
粒子のボア内に酵素が第２図に示すように固定化される
ものである。上記の２種類の電極作製法のいずれでも酵
素が固定化できるが、酵素固定化量の調整は、（Ｂ）法
の方が。

負の電位域で酵素電極を促進しつつ、定電流で白金黒を
一定速度で成長形成でき、均質な酵素析出の微粒子白金
黒層を得るために、容易である。これに対して、定電位
で析出させる（Ａ＞法は析出した白金黒層が増えるに従
い電流が徐々に減少するために９時間がかかり、均質析
出が得られ難い傾向にある。

次に、第１図に示す測定装置で、燐酸緩衝液中で１本発
明によるバイオセンサ電極の応答性を測定する。即ち、
１は参照電極（基準電極）であり、２は対極（白金）で
、３は作用極即ち０本発明により作製したグルコースオ
キシダーゼ固定化白金黒電極である。各電極を図示のよ
うにポテンシオスタットに各々接続し、参照電極１に対
して作用極３を＋〇、６ｖに保持した状態で、攪拌しな
がら、グルコースを注入し、対極と作用極間に流れた過
酸化水素による酸化電流の値を測定した。

グルコース添加後直ちに出力が増大し、３秒以内に一定
値となった。グルコース濃度とセンサの出力との関係を
測定した結果は、第３図に示すものである。即ち０本発
明によるバイオセンサでは、グルコースは、第３図に示
すように、０．１ｖｓｇ／ｄｌの濃度でも測定でき、測
定範囲も、０．１ｓｇ／ａ〜１００　ｍｇ／　ｄａの範
囲で直線性が示された。

グルコースの添加に伴う本発明のセンサ出力即ち、過酸
化水素の酸化電流の変化は、第４図に示す如く、非常に
応答性のよいものであった。前述のように１０．４％応
答まで３秒以内であった。センサの応答は極めて速く、
直ちに、定常値に達した０以上のように本発明による生
体機能物質の固定化法によるバイオセンサでは、迅速な
応答を有し、しかも高感度であり、簡単な方法でミクロ
バイオセンサが作製できることが明らかにされた。

［発明の効果］ 本発明の生体機能物質の固定化方法とそれを利用したバ
イオセンサにより、第１に、応答性よく、感度よく検出
できる電極が提供できたこと。

第２に、酵素など生体機能物質を容易に包括固定化でき
、生体機能物質を傷つけずに固定化しであるために活性
のほとんど失われていない生体機能物質電極が得られる
こと。

第３に、高密度の生体機能物質の固定化ができ。

迅速な応答性が得られる電極を提供できたこと。

第４に、酵素など生体機能物質を微小電極表面に化学処
理なしで簡単に固定化できる方法を提供できたこと。

第５に、複数の酵素を微小電極表面に固定化した多機能
酵素センサができることを示唆できたことなどの顕著な
技術的効果が得られた。

【図面の簡単な説明】 第１図は２本発明によるバイオセンサを用いたグルツー
ス濃度測定法を示す説明図である。 第２図Ａは１本発明により作製したバイオセンサ電極の
構造を示す模式断面図である。第２図Ｂは、第２図Ｂの
円形点線部分を拡大して示した模式拡大断面図であり、
生体機能物質を含浸させた微粒子層の構造を示す。 第３図は１本発明のバイオセンサ電極で測定した応答セ
ンサ出力とグルコース濃度の関係を示すグラフである。 第４図は９本発明によるバイオセンサの応答性を示すグ
ラフである。 ［主要な部分の符号の説明］ １８１．参照電極 ２０．、対極 ３０００作用極（本発明の電極） ４００．導電性物質微粒子 ５６０．生体機能物質 ７０１．基板導電体 特許出願人　国立身体障害者リハビリテーション　　　
　゛センター 代理人　　弁理士　倉　持　　裕（外１名）第３図 第４図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素や抗体に代表される生体機能物質を導電性物
   質表面に固定化する方法において、 微小導電性物質表面に、該導電性物質の微粒子を電気化
   学的に析出させながら、該生体機能物質を電気化学的に
   吸着させる単一工程で、生体機能物質固定化微小電極を
   作製することを特徴とする前記生体機能物質の直接固定
   化方法。
2. （２）微小導電性物質表面に、導電性物質の微粒子を電
   気化学的に析出させながら、該生体機能物質を電気化学
   的に吸着させた微粒子導電性物質表面層を有することを
   特徴とする分子識別能力を持つバイオセンサ用電極。