JPH04331362A - 強化電気泳動塗装による生体分子の固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、生体分子を導電性支持体に固定
化するための方法に関する。より詳細には、本発明は、
酵素および抗体などの生体分子を導電性支持体に電着さ
せた後、生体分子を化学的に架橋して水不溶性の固形物
を生成させるための方法に関する。

【０００２】生体分子を支持体に固定化することは、生
体分子を利用する多くの通常使用されている分析または
工業的適用に必要とされている。固定化によって通常は
、少なくとも幾つかの生体分子を水不溶性の物理的支持
物質に結合することによって、酵素または抗体などの水
溶性の生体分子が水不溶性の複合体に変換される。この
ようにして固定化された生体分子は経時的に濃度または
活性が変化することなく、多くの用途で使用できること
が多い。固定化は、生体分子が装置またはセンサーの特
異的な所望領域においてのみ保持され得るので材料費が
最小限に抑えられ、検出可能な生物活性を最大限発揮さ
せることができるという、さらなる利点を有している。

【０００３】酵素、抗体または、レクチンなどの糖タン
パク質のような固定化生体分子における重要な分析用途
は、選択された生理学的分子の存在または濃度を生理学
的リガンドと固定化生体分子との相互作用の結果として
検出するバイオセンサーにおける用途である。しかし、
従来からの半導体製造法を使用して製作されるミニチュ
ア電気化学的バイオセンサーに関して使用される既知の
固定化法を適用するのは困難な場合がある。通常の半導
体法では、１．０μｍ２程に小さな表面積のセンサーを
製造することができる。バイオセンサーの製作には酵素
反応の生成物をモニターするのに使用される作動電極の
表面にのみ生体分子を電着させる必要があるのが一般的
であるので、面積寸法が小さいことはセンサーの構築を
困難にする。バイオセンサーの他の領域に電着する生体
分子は反応を起こして、検出することができない生成物
を産しかねず、それは生体分子を浪費させることが多い
。

【０００４】生体分子の電着に関連する問題を克服する
ための１つの方法は、タンパク質、両親媒性の脂質また
は核酸などの電荷を帯びた生体分子の移動を促進するた
めの電気泳動に頼るものである。生体分子は、適当な媒
質においては生成する電気領域の反対の極に引き寄せら
れる正または負に帯電した部分を含有している。従って
、電位的に対峙する２つの電極が媒質中に形成された場
合、媒質内に含有される生体分子におけるこの電荷分子
の極性とは反対の電荷を有する電極への移動およびそこ
への電着が促進される。

【０００５】例えば、電気泳動塗装法はＩｋａｒｉｙａ
ｍａらに利用された［Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，１３６（６），７０２−７０６頁（１９８９）
］。この方法により、白金粒子とグルコースオキシダー
ゼ酵素の共同電着（ｃｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）が促進
された。白金化（ｐｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）が起こ
る普通のｐＨ（ｐＨ＝３．５）では、そのｐＨがグルコ
ースオキシダーゼの等電点４．３よりも低いので、グル
コースオキシダーゼは正味で正の電荷を有する。従って
、グルコースオキシダーゼは白金イオンと共に反対に帯
電した電極に引き寄せられる。電着する酵素の安定性を
増大させるため、得られたセンサーをアルブミンおよび
グルタルアルデヒドの溶液に浸してその分子を架橋する
。しかし、この方法では、酵素の共同電着を促進するた
めに使用するｐＨが比較的低いので、その酵素を不活化
させる場合がある。

【０００６】ＡｉｚａｗａらのＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
Ｊａｐａｎ（日本化学会社），１１，２２１０−２２１
３頁（１９８７）は、グルコースオキシダーゼを電着す
るための技術開発法を報告している。ここでは、グルコ
ースオキシダーゼを水溶液から制御した電圧で白金電極
表面に吸着させた。この電着の最適条件は０．１ｖに対
してＡｇ／ＡｇＣｌ　およびｐＨ３であった。 この方法によって得られる最大の厚さは、約５６×１０
−９ｍという最大グルコースオキシダーゼ膜の厚さと同
等であるグルコースオキシダーゼ４分子層の厚さであっ
た。この方法はｐＨ値を３から９に変化させて評価され
、ｐＨ３が最適の電着と判明した。この方法によって電
着される極めて薄い層は、リガンドと生体分子との相互
作用が反応物中において非−速度制限因子である必要の
ある多くの目的にとって不適切である。さらに欠点とし
て、このような固定化分子の薄層の生存時間と再利用の
可能性とが限定されていることがある。

【０００７】従って、本発明の目的は、比較的厚い層分
子の生体分子を導電性支持体に電着、固定化し、生体分
子とリガンドとの相互作用を速度制限しないための方法
を提供することにある。本発明の別の目的は、生体分子
をミニチェア電気センサーに再現性よくかつ正確に電着
、固定化するための方法に関する。本発明のさらなる目
的は、多くの別種の生体分子を導電性支持体に同時に電
着、固定化するための方法に関する。また、本発明は、
厚さ１０−８から１０−５ｍの層になるように生体分子
を電着、固定化するための方法に関する。

【０００８】従って、所望の生体分子種で被覆された導
電性支持体を有するバイオセンサー電極を調製するため
の方法には、電着しようとする少なくとも１種の生体分
子の溶液であって該生体分子の変性を防ぎ、かつ電着し
ようとする生体分子のすべての種がそれら個々の等電点
から照らして同じ正味の帯電性を有するに十分な範囲に
緩衝化された溶液を調製することが包含される。バイオ
センサー電極および反対の電極をその溶液に浸漬し、約
１００ミリボルトと１ボルトの電位差を電極間に設け、
電流を流す。電圧は、電極間の電流が実質的に一定とな
るように計算し、経時的に変動させ、バイオセンサー電
極側に移動させて次いで電着させる。生体分子が所望の
厚さでバイオセンサー電極に電着した後、電着された生
体分子膜の安定性を適当な架橋剤によって強化すればよ
い。

【０００９】好ましい態様では、生体分子を含有する溶
液は水性とし、バイオセンサー電極および反対電極間の
電流は約５ｍＡ／ｃｍ２となるように選択する。生体分
子膜の電着のために電気抵抗が上昇するが、一定電流を
維持させるため、電着工程の間は電圧を上げるように調
節する。電着はバイオセンサー電極全体の膜の平均の厚
さが５マイクロメーター以上になるまで続ける。

【００１０】本発明の１つの利点は、種々の形状大きさ
を有する導電性支持体に対するその広い適用性である。 生体分子の電着は電気泳動性を基礎としているので、生
体分子は実質的にすべての導体または半導体に、その形
状、形態にかかわりなく電着することができる。例えば
、非常に粗い導体表面は生体分子膜で均一に被覆され得
、または生体分子によって白金管などの導電性支持体の
内側を極めて容易に被覆することができ、そして分析目
的の流れストリームシステムに挿入することができよう
。さらに、多くの他の膜付着法とは対照的に、本発明の
生体分子の電着はこのような電気泳動法により局在化さ
れるので、所望の生体分子は導電性支持体の近傍にのみ
電着する。

【００１１】もう１つの利点は、バイオセンサー電極に
沈着され得る生体分子の層の厚さが比較的厚い点にある
。多くの生理学的適用には、検出しようとする比較的大
量の個々の生理学的リガンドと、バイオセンサー電極に
電着される生体分子との間の相互作用が関与する。非常
に薄い単分子膜または厚さが１マイクロメーターよりも
小さな膜は、生体分子と生理学的リガンドとの間の反応
をその反応に利用される生体分子が少量であるために速
度制限してしまう場合があり、それによりセンサーの感
受性が低下して、溶液中に存在するリガンドの定量を難
しくしかねない非−一次相互作用関数（生体分子とリガ
ンドとの関数）にする。

【００１２】本発明のもう１つの利点は、バイオセンサ
ー電極への電着の間に適用する電流が一定であることに
由来する。生体分子の電着により電極表面が遮蔽されて
電気抵抗が増大する結果になるにしても、電流が一定で
あるために生体分子はバイオセンサー電極に一様に電着
することになる。バイオセンサー電極の抵抗は電着工程
の間に増大するので、通常は電流と生体分子の電着速度
とは電圧を徐々に上げていかなければ共に減少する。こ
の電着速度の減少は、電着膜の厚さが要求される厚さよ
りも薄くてよいとしても、電着が起こらなくなるまで続
くであろう。これとは対照的に、本発明は一定電流を保
持しており、水が還元または酸化されて気泡を発生する
電圧近くになるまでは電圧を抵抗の増大に伴って上げる
ことができ、そうすることにより、１０マイクロメータ
ー以上の厚さの膜の形成が促進されることになる。

【００１３】本発明の別の利点は、生体分子が形成され
る生理学的ｐＨ値に適合したｐＨ値におけるその利用性
である。酵素などのタンパク質生体分子の非常に厚い膜
は、水溶液中、生理学的ｐＨ（７．４）で電着すること
ができ、酵素膜を電着させるための他の方法では起こり
得る酵素の不活化または変性に伴う問題が最小限に抑え
られる。

【００１４】本発明を実施するための現在考えられるベ
ストモードによって本発明の好ましい態様を以下に詳細
に説明するが、これらを考慮に入れることにより当業者
においては、本発明のさらなる特徴と利点が明らかとな
るであろう。

【００１５】図面の説明 　　図１は、所望の生体分子を含有する水性液中に浸し
たバイオセンサー電極に生体分子を電着させるための装
置の模式図である。

【００１６】好ましい態様の説明 　　図１に示している電着装置１０は、本発明の方法を
実施するのに適している。装置１０は、液３０を保持す
る形態にある容器１２を包含している。液３０は生体分
子の所望の種を含有する溶液または懸濁液のいずれであ
ってもよい。電源１４は、バイオセンサー電極２２に接
続した正のリード線１６と反対電極２０に接続した負の
リード線１８を有しており、これら２つの電極２０およ
び２２間に実質的に一定の電流を提供するものである。 バイオセンサー電極２２は、バイオセンサー電極２２と
電気的に非−導電性の支持体２４とからなるバイオセン
サーユニット２５の一部を形成している。リード線１６
および１８は、液３０の浸水に抗することのできる非導
体によって電気的に保護されている。

【００１７】リード線１６および１８の電源１４との接
続を変換してリード線１６を負電荷に、リード線１８を
正電荷にすることにより、要すれば電流の方向は逆にす
ることができる。リード線１６および１８は共に保護さ
れており、バイオセンサー電極を囲む支持体２４は非−
導体から構成されているので、液３０に含有される生体
分子は、液３０内における生体分子の電荷と反対の電荷
に帯電している電極２０または２２に電着する。

【００１８】電極２０または２２への電着に適する生体
分子としては、生物系の成分として存在することのでき
る天然の、または人工的に合成された以下に記載のクラ
スの分子または分子原子団が挙げられるが、これらに限
定されない：ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、
アポタンパク質、糖タンパク質、抗原およびその抗体、
抗体フラグメント、ハプテンおよびその抗体、レセプタ
ーおよび他の膜タンパク質、少なくとも１つの非−ペプ
チド連結部がペプチド連結部と置き換わっているタンパ
ク質アナログ、酵素および酵素前駆体、補酵素、酵素イ
ンヒビター、アミノ酸およびその誘導体、ホルモン、脂
質、リン脂質、糖脂質、リポソーム、ヌクレオチド、オ
リゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ならびに当業界
で認識されており生物学的に機能的なそれらのアナログ
およびその誘導体であり、例えば、メチル化ポリヌクレ
オチドおよびホスホチオ酸連結部を有するヌクレオチド
アナログ；プラスミド、コスミド、人工染色体、他の核
酸ベクター；少なくとも１つの内生核酸との実質的な相
補性を有するアンチセンスなポリヌクレオチド、または
選択したウイルスもしくはレトロウイルスのゲノムの少
なくとも一部とは反対のセンスの配列を有するもの、お
よび他の生物学的に活性な分子などがある。弱い極性を
有しているかもしくは極性が存在していない上記の生体
分子、または装置１０で通常行う条件下で誘導され得る
極性を有している上記の生体分子はいずれも、適当に帯
電された担体と共有結合して、電極２０または２２に電
着され得る帯電性の複合体を形成することができる。

【００１９】上記のクラスの各生体分子およびその特定
のものの組合わせ物は、液３０の組成に応じた当業界周
知の操作法によって、溶液に、または液３０中のコロイ
ド粒子として懸濁液に入れればよい。一般には、液３０
は、実質的に電流を流すことのできる生理食塩水などの
水溶液である。非−イオン性の界面活性剤および消泡剤
などの他の添加剤も要すれば溶液に加えることができる
。

【００２０】液３０の溶液または懸濁液中における電極
２０および２２への最初の生体分子の方向性、移動速度
および電着速度は液３０のｐＨを適当に調節することに
よって感度が増大するよう制御することができる。この
制御は、液３０のｐＨに応じて液３０中での正味の電荷
を生体分子に付与する常帯電性の部分に適用できる通常
の電気泳動法の使用に基づいている。分子の正味の負電
荷が０（ゼロ）になる、従って電場の影響下に移動しな
いｐＨは、その等電点として規定される。等電点よりも
大きなｐＨ値では、分子は正味の負の電荷を有しており
、反対に等電点よりも小さなｐＨ値では、分子は正味の
正の電荷を有している。従って、図１に示している装置
では、電極２０または２２に電着させるべき所望の生体
分子の等電点よりも高く、または低くなるように液３０
のｐＨを調節する。この調節は、要すれば既知の酸また
はアルカリ試薬を使用して行うことができる。

【００２１】所望の生体分子の導入と同時に加えるか、
または電極２０および２２への電着後に加える架橋剤は
、本質的に水不溶性の電着固形物が電極において形成す
るのを促進させるのに有用である。架橋剤は一般に、所
望の生体分子と共有結合できる多機能性の連結基を含有
しているが、連結基が無くても生体分子間の共有結合を
促進するよう作用する他の活性物質または放射性物質を
含有している場合もある。使用される架橋剤のタイプは
、個々の電着生体分子によって変わり得るが、例えばシ
ラン剤、アルキルアミンカップリング剤、イソチオシア
ネートカップリング剤、トリアジンカップリング剤、ア
ゾカップリング剤、フェニルヒドラジンカップリング剤
、カルボジイミドカップリング剤、および酸クロライド
カップリング剤などを挙げることができる。グルタルア
ルデヒドを使用すると本発明では特に有用であるが、他
の化学的カップリング剤、例えば以下のものも二価架橋
剤として使用することができる：４−アジドフェナシル
・ブロミド、ベンゾフェノン−３，３’，４，４’−テ
トラカルボン酸二無水物、ビオチン・Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル、ビオチン・４−ニトロフェニル
エステル、２，２’−ビキノロン−４，４’−二カルボ
ン酸、ビス（４−フルオロ−３−ニトロフェニル）スル
ホン、１，５−ビス（スクシンイミドオキシカルボニル
オキシ）ペンタン、４−（ＢＯＣ−アミノメチル）フェ
ニルイソチオシアネート、Ｎ−ＢＯＣ−１，６−ジアミ
ノ−ヘキサン塩酸塩、ブロモピルビン酸、シアヌル酸ク
ロライド、４，４’−ジアジドスチルベン−２，２’−
ジスルホン酸二ナトリウム塩、ジエチレントリアミン五
酢酸二無水物、ジエチレンピロカルボネート、１，５−
ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１，６−ジイ
ソシアノヘキサン、４，４’−ジイソチオシアナートス
チルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩、ジ
メチルアジピン酸ジヒドロクロライド、Ｎ−（ジメチル
アミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩
、ジメチル３，３’−ジチオジプロピオンイミデート二
塩酸塩、ジメチルピメリンジイミデート二塩酸塩、ジメ
チルスベルイミデート二塩酸塩、３，３’−ジチオジプ
ロピオン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル）、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、ホル
ムアルデヒド、フマロニトリル、グルタルアルデヒド、
グルタロニトリル、グリコールアルデヒド、ヘキサメチ
レンジイソシアネート、６−ヒドロキシ−２−ナフチル
ジスルフィド、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピ
オン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２−イ
ミノチオラン塩酸塩、４−マレイミドブチルアミドメチ
ル−ポリスチレン、Ｎ，Ｎ’−（１，４−フェニレン）
ジマレイミド、ポリエチレングリコール６００　二酸、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロ
ピオネート、Ｎ−スクシンイミジル・３−マレイミドベ
ンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−マレイミドブチ
レート、Ｎ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエ
ート、Ｎ−スクシンイミジル３−マレイミドピロピオネ
ート、チオジエチレングリコール、トルイレン−２，４
−ジイソシアネート、およびｍ−キシリレンジイソシア
ネート。

【００２２】本発明の方法によって製造されるバイオセ
ンサー電極は、アンペア測定電気化学的バイオセンサー
、カロリー測定、音響、電位差測定、光学およびＩＳＦ
ＥＴ基礎バイオセンサーなど、広範な分子検出系に使用
することができる。

【００２３】本発明の特定の特徴をより理解し易くする
ため、以下に実施例を挙げて説明する。 実施例１ 　　溶媒としてリン酸緩衝化食塩溶液（ｐＨ７．４）を
利用し、グルコースオキシダーゼの５重量％溶液を調製
する。グルコースオキシダーゼはゆっくり撹拌して食塩
溶液に注意して溶解し、撹拌するときはグルコースオキ
シダーゼの変性を招きかねない泡状化を防ぐよう注意す
る。電着セルをこの溶液で充満させ、酵素が電着するバ
イオセンサー電極を反対の電極と共にそのセル内に浸漬
する。電流安定装置（ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ）に電気
接続し、電極表面における電流を一定密度５ｍＡ／ｃｍ
２に維持する。電流の方向は、負に帯電するグルコース
オキシダーゼ分子を引き付けるように電極表面が正の正
味の電荷を有するように設定する。電流を２分間流す。 電着の間に適用する電圧は０．５ボルト以上でない。次
いで、電極を酵素溶液から取り出し、撹拌することなく
５秒間脱イオン性の蒸留水に浸し、残ったグルコースオ
キシダーゼを除去する。

【００２４】次に、電極をリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７
．４）中、２．５体積％グルタルアルデヒド溶液に３０
分間浸し、グルコース分子と共有結合的に架橋連結させ
て水不溶性の固形物を形成させる。電極を再び脱イオン
性蒸留水に５秒間浸し、３０分間風乾する。

【００２５】得られた電極を調べ、グルコースオキシダ
ーゼ層の厚さが乾燥時で約１．５μｍ　であることが判
明した。次の試験により、グルタルアルデヒドの架橋が
、グルコースオキシダーゼの溶液への逆戻りを防止して
いることが観察された。このバイオセンサーの酵素成分
はこの時点で機能的であることが認められた。

【００２６】実施例２ 　　２つまたはそれ以上の生体分子を電極表面に共同電
着することは、それらすべての等電点が電着溶液のｐＨ
よりも高いかまたは低ければそれもまた可能である。こ
の実施例では、５重量％のグルコースオキシダーゼおよ
び５重量％のアルブミンを含有するリン酸緩衝化食塩溶
液（ｐＨ７．４）を調製する。グルコースオキシダーゼ
およびアルブミンはそれぞれ４．３および４．７に等電
点を有しており、ｐＨ７．４の溶液中では両方とも負に
帯電した分子となる。グルコースオキシダーゼ／アルブ
ミン溶液に電極を浸すとともに、電流密度５ｍＡ／ｃｍ
２を電極に２分間適用する。実施例１に記載しているよ
うにしてグルタルアルデヒド溶液中で分子を架橋し、す
すぎ、乾燥する。得られたグルコースオキシダーゼ／ア
ルブミン層は約５μｍ　の厚さであることが判明した。 グルコースオキシダーゼ活性の長期試験では、グルコー
スオキシダーゼ／アルブミン層は実施例１において製造
したグルコースオキシダーゼのみの層よりも好適に安定
であると認められた。

【００２７】実施例３ 　　ウサギ抗−フルオレセイン抗体（アフィニティー精
製した抗体）の２．４ｍｇ／ｍｌ溶液をホウ素緩衝溶液
（ｐＨ９．０）を溶媒として調製する。そのｐＨ値は最
大の抗体結合活性を保持するように選択した。電着セル
にこの溶液を充満させ、抗体が電着するバイオセンサー
電極を反対電極と共にそのセル内に浸した。電流安定装
置（ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ）に電気接続し、電極表面
における電流を一定密度５ｍＡ／ｃｍ２に維持した。電
流の方向は、正に帯電する抗体分子を引き付けるように
電極が負の正味の電荷を有するように設定した。電流は
５０分間流した。電極を抗体溶液から取り出し、撹拌す
ることなく５秒間脱イオン性の蒸留水に浸し、残った抗
体を除去する。

【００２８】次に、電極をリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７
．４）中、２．５体積％グルタルアルデヒド溶液に３０
分間浸し、抗体分子を共有結合的に架橋連結させて水不
溶性の固形物を形成させる。電極を再び脱イオン性蒸留
水に５秒間浸し、３０分間風乾する。得られた電極を調
べて、電着した抗体の層の厚さが乾燥時で約５．５μｍ
であることが判明した。

【００２９】上記のように本発明を特定の好ましい態様
、実施例を用いて説明してきたが、特許請求の範囲に記
載し、規定している本発明の範囲および思想を逸脱しな
い限り、改変および改良が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　バイオセンサー電極に生体分子を電着させ
るための装置の模式図である。

【符号の説明】

１０　　電着装置 １２　　容器 １４　　電源 １６　　正のリード線 １８　　負のリード線 ２０　　反対電極 ２２　　バイオセンサー電極 ２４　　非導電性支持体 ３０　　液

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　電着しようとする少なくとも１種の生
   体分子の溶液であって該生体分子の変性を防ぐに充分な
   範囲内に、かつ電着しようとする生体分子のすべての種
   が各々の等電点からして同じ正味の帯電性を有するよう
   な値に緩衝化された溶液を調製し、その溶液にバイオセ
   ンサー電極および反対電極を浸し、そのバイオセンサー
   電極と反対電極との間に１ボルトよりも低い可変電圧を
   適用するに当たり、該バイオセンサー電極に電着してそ
   こに沈積させようとする生体分子を移動させるに充分な
   実質的に一定の電極間電流が得られるよう電圧を選択し
   て変動させること、を特徴とする生体分子成分を有する
   バイオセンサー電極の調製方法。
2. 【請求項２】　　電着しようとする少なくとも１種のタ
   ンパク質の溶液であって該タンパク質の変性を防ぐに充
   分な範囲内に緩衝化された溶液を調製し、その溶液にバ
   イオセンサー電極および反対電極を浸し、そのバイオセ
   ンサー電極と反対電極との間に１ボルトよりも低い可変
   電圧を適用するに当たり、該バイオセンサー電極に電着
   してそこに沈積させようとするタンパク質を移動させる
   に充分な実質的に一定の電極間電流が得られるよう電圧
   を選択して経時的に電位を変動させ、そして架橋剤を用
   い、得られた電着沈積物をバイオセンサー電極に架橋す
   ることにより、水不溶性の固形物をバイオセンサー電極
   に生成せしめることを特徴とするタンパク質成分を有す
   るバイオセンサー電極の調製方法。
3. 【請求項３】　　バイオセンサー電極に電着しようとす
   るグルコースオキシダーゼの溶液を調製し、その溶液に
   バイオセンサー電極および反対電極を浸し、そのバイオ
   センサー電極と反対電極との間に１ボルトよりも低い可
   変電圧を適用するに当たり、該バイオセンサー電極に電
   着してそこに１０マイクロメーター以上の厚さの膜を沈
   積させようとするグルコースオキシダーゼを移動させる
   に充分な実質的に一定の電極間電流が得られるよう電位
   を選択して経時的に電圧を変動させること、を特徴とす
   る酵素バイオセンサーの調製方法。