PT975810E - Método de teste de pcr de amostras de sangue combinadas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE TESTE DE PCR DE AMOSTRAS DE SANGUE COMBINADAS"

REFERENCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é uma continuação em parte do pedido N° 08/683.784, depositado em 16 de Julho de 1996, que é uma divisão do pedido N° 08/419.620, depositado em 10 de Abril de 1995.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de uma maneira genérica, a sistemas e processos para preparar e analisar amostras tomadas de doações de plasma para identificar, especificamente, as doações que estão contaminadas por vírus. Em particular, a invenção refere-se a um aparelho e processo para formar recipientes individuais, separadamente vedados e conectados que contêm amostras do mesmo plasma que está contido na doação. A invenção também se refere a um aparelho e processo para formar combinações (pools) de teste de rastreio iniciais dos recipientes e testar as combinações para a detecção da presença de um vírus de acordo com um algoritmo para identificar as doações individuais contaminadas no menor número de ciclos de testes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os programas de doação de sangue, plasma e fluido biológico são os primeiros passos essenciais no preparo de produtos farmacêuticos e sanguíneos que melhoram a qualidade de vida e que são utilizados para salvar vidas numa variedade 2 de situações traumáticas. Tais produtos são utilizados para o tratamento de transtornos imunológicos, para o tratamento da hemofilia e são também utilizados para manter e restaurar o volume sanguíneo em procedimentos cirúrgicos e outros protocolos de tratamento. As utilizações terapêuticas de sangue, plasma e fluidos biológicos exigem que as doações destes materiais seja o mais livre possível de contaminação virai. Tipicamente, a amostra para teste serológico de cada doação individual de sangue, plasma ou outro fluido é testada para detecção de vários anticorpos, que são obtidos em respostas a vírus específicos, tais como a hepatite C (HCV) e duas formas do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) . Além disso, a amostra para teste serológico pode ser testada para a detecção de antigénios designados para vírus específicos, tais como a hepatite B (HBV), bem como os anticorpos obtidos em resposta a tais vírus. Se a amostra apresentar resultado positivo no teste serológico para a presença de anticorpos ou antigénios específicos, a doação é excluída de ser adicionalmente utilizada.

Enquanto se crê que um teste de antigénio para certos vírus, por exemplo, hepatite B, esteja estreitamente correlacionado com a infectividade, os testes de anticorpos não estão. Sabe-se já há muito tempo que um dador de plasma sanguíneo pode, de facto, estar infectado com um vírus enquanto apresenta resultados serológicos negativos para anticorpos relacionados àquele vírus. Por exemplo, existe uma janela entre o tempo que um dador pode ficar infectado com um vírus e o aparecimento de anticorpos, obtidos em resposta àquele vírus no sistema do dador. 0 período de tempo entre a 3 primeira ocorrência de um vírus no sangue e a presença de anticorpos detectáveis obtidos em resposta àquele vírus é conhecido como o "período de janela". No caso do HIV, o período médio de janela é de aproximadamente 22 dias, enquanto para o HCV, o período médio de janela foi estimado em aproximadamente 98 dias. Deste modo, os testes dirigidos à detecção de anticorpos podem dar uma indicação falsa de um dador infectado se forem realizados durante o período de janela, isto é, o período entre a infecção virai e a produção de anticorpos. Além disso, embora os testes convencionais de HBV incluam testes tanto para anticorpos como para antigénios, testes por métodos mais sensíveis confirmaram a presença do vírus HBV em amostras que apresentaram resultados negativos no teste de antigénio de HVB.

Um método para testar doações que passaram os testes disponíveis de anticorpo e antigénio, a fim de melhor assegurar a sua isenção de contaminação virai incipiente, envolve testar as doações por um método de reacção em cadeia da polimerase (PCR). 0 método de PCR é um método altamente sensível para detectar a presença de sequências de ADN ou ARN específicas relacionadas a um vírus de interesse num material biológico por meio da ampliação do genoma virai. Pelo facto do teste de PCR ser dirigido para detectar a presença de um componente essencial do próprio vírus, a sua presença numa dador pode ser encontrada quase imediatamente depois da infecção. Deste modo, teoricamente, não há período de janela durante o qual um teste pode apresentar uma indicação falsa de isenção de infectividade. Uma descrição adequada da 4 metodologia e aplicação prática do teste de PCR está contida na Patente U.S. N° 5.176.995.

No entanto, o teste de PCR é muito dispendioso e uma vez que a população de dadores em geral inclui um número relativamente pequeno de dadores PCR positivos, o teste individual de cada doação não oferece uma boa relação custo-benefício nem é economicamente viável. Deste modo, é necessário um método eficiente e económico para testar grandes números de doações de sangue ou de plasma para eliminar unidades que têm uma contaminação virai acima de um nível predeterminado.

Um método de testar uma grande número de doações de plasma é combinar uma série de doações de plasma individuais. A combinação é então testada por PCR e as doações individuais que compreendem a combinação são retidas ou descartadas, dependendo do resultado do teste de PCR. Embora reduza o número de testes de PCR, e os custos associados aos mesmos, este método resulta num desperdício substancial de uma porção significativa das doações livres de vírus. Uma vez que apenas uma única doação com uma contaminação virai acima de um nível predeterminado provocará um resultado PCR positivo na combinação, as doações restantes que contribuem para a combinação podem ser individualmente PCR negativas. Este resultado á altamente provável dado que existe um número relativamente pequeno de dadores PCR positivos na população de dadores em geral. Na abordagem de combinação convencional, todas as doações compreendendo a combinação são descartadas 5 mediante um resultado positivo de PCR, incluindo aquelas doações que são individualmente PCR negativas.

Além disso, as doações de plasma são muitas vezes congeladas imediatamente depois de serem recebidas. Quando as amostras de doações individuais de plasma são necessárias para a combinação, cada doação tem de ser descongelada, uma aliquota do sangue ou plasma é removida da doação, e a doação tem de ser, então, congelada de novo para conservação. Ciclos múltiplos de congelação-descongelação podem afectar, de modo adverso, a recuperação do ARN ou ADN de interesse, bem como as proteínas contidas no plasma, afectando, deste modo, de modo adverso, a integridade do teste de PCR. Além disso, cada vez que uma aliquota das doações de plasma individuais é retirada para formar uma combinação, a doação está sujeita a contaminação, tanto do ambiente circundante como do aparelho utilizado para retirar a aliquota. Além disso, se a doação contiver um vírus, o mesmo pode contaminar outras doações. A fim de evitar a introdução de contaminantes virais numa doação que, caso contrário, é livre de vírus, o aparelho que toma a mostra tem de ser esterilizado depois de cada utilização individual ou utilizado para tomar apenas uma única aliquota de uma única doação individual e um novo aparelho para tomar amostra utilizado para tomar uma aliquota de uma doação individual subsequente. Qualquer um destes métodos envolve despesas consideráveis e é muito demorado.

Em concordância, há uma necessidade de um processo e sistema para obter amostras múltiplas de sangue ou plasma de doações individuais de tal modo que amostras específicas 6 podem ser combinadas sem contaminar as amostras restantes. E também desejável que o processo e sistema sejam capazes de formar tais combinações de uma maneira rápida e eficaz, sem contaminar um técnico de laboratório de teste clinico nem o ambiente de teste do laboratório.

Além disso, é desejável que o processo e sistema proporcionem uma forma eficaz e económica de testar as doações de sangue ou plasma para identificar apenas as doações especificamente PCR positivas no menor número possível de ciclos de teste.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Deste modo, é proporcionado, na prática desta invenção um processo económico e eficaz para preparar e testar amostras de uma multiplicidade de doações de sangue ou plasma para identificar especificamente as doações que estão infectadas com vírus, bem como sistemas e dispositivos para praticar o processo. 0 processo da presente invenção resulta nos produtos sanguíneos e plasmáticos sendo substancialmente mais seguros pelo facto de se poder testar prontamente para a detecção de contaminação por vírus no fornecimento do sangue ou plasma directamente. Testes económicos, de alta sensibilidade podem ser realizados imediatamente e as doações contaminadas podem ser identificadas, sem preocupação com um período de janela de infectividade. 7

Numa forma de realização da prática da presente invenção, o processo compreende os passos de fornecer uma doação de sangue ou plasma num recipiente de colheita. Um segmento de colheita flexível é conectado ao recipiente e é aberto para o interior do recipiente. 0 segmento de colheita é cheio com sangue ou plasma do recipiente de colheita e uma porção do segmento de colheita é vedado em ambas as extremidades. A porção vedada do segmento de colheita é removida do recipiente e, seja antes ou depois do segmento de colheita ser removido, uma pluralidade de vedações espaçadas são proporcionadas a intervalos ao longo do comprimento do segmento de colheita entre as extremidades vedadas. As porções do segmento nos intervalos entre as vedações adjacentes definem recipientes, em que cada um destes recipientes contém uma amostra de plasma ou de sangue e, em que os intervalos entre as vedações proporcionam um volume suficiente em cada um destes recipientes para o teste planeado.

Numa forma de realização mais pormenorizada da presente invenção, doações de plasma individuais são colhidas num frasco de colheita que tem um recipiente de teste ligado ao mesmo por meio de um segmento de tubo flexível. Depois de ser cheio com o plasma de um dador o frasco de plasma é inclinado de modo a transferir o plasma para o recipiente de teste e o segmento de tubo flexível, deste modo, enchendo o segmento de tubo. 0 segmento de tubo é vedado a intervalos espaçados ao longo do seu comprimento, as porções do segmento de tubo nos intervalos entre as vedações definem bolsas cada uma das quais contém uma amostra da doação do plasma. 0 segmento de 8 tubo, que foi convertido numa série de bolsas, é, então, desconectado do frasco de colheita de plasma e congelado até ser necessário para teste.

Num aspecto adicional da presente invenção, o segmento de tubo oco compreende uma série de locais em forma de Y ligados uns aos outros, incluindo um local de injecção proporcionado numa haste do Y e onde cada haste de um local em forma de Y em particular não inclui um local de injecção é conectado à base do próximo local em forma de Y na corrente por um segmento de tubo de plástico flexível. As vedações térmicas espaçadas são formadas ao longo do comprimento de cada segmento de tubo plástico flexível separando os locais em forma de Y.

Num outro aspecto da presente invenção um dispositivo para proporcionar múltiplas vedações térmicas ao longo do comprimento do segmento de tubo cheio com a doação de sangue ou plasma compreende primeiras e segundas placas de vedação opostas. Cada placa de vedação inclui uma pluralidade de porções elevadas espaçadas ao longo do seu comprimento alternando com porções recuadas. As porções elevadas e recuadas da primeira placa estão em registo com porções elevadas e recuadas correspondentes na segunda placa. As placas de vedação opostas movem-se juntas sobre um segmento de tubo plástico cheio com a doação de sangue ou plasma para formar vedações térmicas naquelas porções do segmento de tubo comprimido entre as porções elevadas e para formar câmaras definidas por porções recuadas opostas. As vedações térmicas definem uma pluralidade de bolsas individuais e sequenciais 9 entre as mesmas e cada câmara, definida por cada par de porções recuadas, é configurada para alojar uma bolsa.

Em particular, um dispositivo para proporcionar vedações térmicas múltiplas ao longo do comprimento do segmento de tubo cheio com uma doação de sangue ou plasma é configurado para ser montado sobre um aparelho de termo-vedação disponível comercialmente, como uma modificação pós-venda.

Em ainda outra forma de realização da invenção, um sistema para colher e preparar amostras de plasma para teste compreende um recipiente de colheita de plasma e um tubo plástico oco conectado ao recipiente, cada um dos quais é construído de plástico e cada um dos quais contém uma marca codificada moldada no plástico. A marca codificada é disposta ao longo do eixo principal do segmento do tubo e o código repete-se a intervalos espaçados de modo que o segmento de tubo pode ser proporcionado com uma pluralidade de vedações espaçadas ao longo do seu comprimento para, deste modo, definir bolsas entre as vedações. Os intervalos do código da marca corresponde aos intervalos das bolsas, de modo que cada bolsa conterá pelo menos um ciclo do código.

Para começar o processo de teste da presente invenção, uma primeira bolsa é removida de cada um de um grupo de segmentos de tubos correspondentes a uma pluralidade de doações de plasma separadas. Uma porção do conteúdo de cada uma destas primeiras bolsas é removida e os conteúdos formados numa combinação num recipiente. 10

Numa forma de realização exemplificativa da presente invenção, a primeira combinação é testada para detecção de uma indicação virai. Quando a primeira combinação apresenta resultados positivos para uma indicação virai, uma bolsa seguinte, ou segunda bolsa, é removida de cada um dos segmentos de tubo que foram utilizados para formar a primeira combinação. As segundas bolsas são divididas em dois subgrupos aproximadamente iguais e o conteúdo de uma das combinações do subgrupo é testada para detecção da presença de um virus especifico. Quando a combinação do subgrupo testado apresenta resultados negativos para o virus, uma outra bolsa sequencial é removida dos segmentos de tubo correspondentes para formar o subgrupo não-testado. As bolsas são divididas em dois subgrupos da próxima geração aproximadamente iguais e o conteúdo das bolsas do subgrupo é formado em combinações. Uma das combinações do subgrupo da geração seguinte é testada para detecção de uma indicação virai.

Quando o subgrupo testado apresenta resultados positivos para tal indicação virai, uma bolsa é removida dos segmentos de tubo correspondentes para formar o subgrupo testado. O processo é repetido, com cada combinação positiva sendo ainda subdividida em subgrupos sucessivamente mais pequenos, com cada um dos subgrupo sucessivos compreendendo uma fracção das amostras do subgrupo positivo anterior, até ser identificada a bolsa final correspondendo a uma doação única de plasma. 11

Numa outra forma de realização da presente invenção, um processo adicional para testar uma multiplicidade de doações de plasma para identificar, especificamente, doações com uma indicação virai positiva num único ciclo de teste de PCR inclui os passos de definir uma grelha n-dimensional que define elementos internos nas intersecções de cada uma das n-dimensões da grelha. Uma amostra de cada uma de uma série de doações de plasma é mapeada em relação a um elemento correspondente da grelha, com cada amostra sendo definida por uma notação matricial, Xrcs, onde o indice inferior do elemento matricial define indices dimensionais da grelha. Aliquotas são tomadas de cada amostra de cada uma das doações de plasma e formadas em subcombinações. Cada subcombinação inclui uma aliquota de todas as amostras de doação de plasma em que um dos indices dimensionais é fixo. As subcombinações são todas testadas ao mesmo tempo, num único ciclo de teste de PCR e a marca dimensional de cada subcombinação que apresenta resultado positivo é avaliada de acordo com uma redução pelo método dos menores, identificando, deste modo, de forma inequívoca uma amostra especificamente positiva.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Estas e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção serão mais completamente entendidas em relação à seguinte descrição pormenorizada, reivindicações apensas e desenhos associados, em que: a FIG. 1 é uma vista em perspectiva, semi-esquemática de um exemplo de um frasco de doação de plasma e recipiente 12 de amostra ligado a um segmento de tubo útil na prática da presente invenção; a FIG. 2 uma vista em perspectiva, semi-esquemática de um segmento de tubo ligado entre um frasco de doação de plasma e recipiente de amostra e dividido em bolsas de acordo com a presente invenção; a FIG. 2a é uma vista em perspectiva, semi-esquemática de um segmento de tubo ligado entre um frasco de doação de plasma e recipiente de amostra e incluindo uma série de locais em forma de Y de acordo com a presente invenção; a FIG. 3a é uma vista em plano de topo de uma porção do segmento de tubo ilustrado na FIG. 2 ilustrando pormenores adicionais das vedações que separam as bolsas; a FIG. 3b é uma vista em corte, semi-esquemática, de uma vedação do segmento de tubo; a FIG. 4 é uma vista em perspectiva, semi-esquemática de um dispositivo proporcionado de acordo com a prática da presente invenção para a vedação de um tubo em bolsas individuais; a FIG. 4a é uma vista em perspectiva, semi-esquemática das placas superiores e inferiores de um dispositivo de vedação por calor proporcionado de acordo com a prática da presente invenção para serem montadas num aparelho de termo-vedação disponível comercialmente; 13 a FIG. 5 é uma vista em perspectiva, semi-esquemática de uma placa de amostragem e tampa proporcionada de acordo com a presente invenção; a FIG. 6 é uma vista em corte parcial, semi-esquemática de uma bolsa de plasma contida num poço de amostra da placa de amostragem proporcionada de acordo com a presente invenção; a FIG. 7 é uma vista em perspectiva, semi-esquemática de um dispositivo proporcionado de acordo com a presente invenção para esmagar as bolsas de amostra e extrair as amostras de fluido contidas no mesmo num combinação; a FIG. 8 é uma vista em corte, semi-esquemática de um cilindro de esmagamento do dispositivo da FIG. 7; a FIG. 9a é uma vista em corte parcial, semi- esquemática de uma placa de tela contra a qual os pacotes contendo amostra são esmagadas; a FIG. 9b é uma vista em plano de topo, semi- esquemática de uma placa de tela apresentando canais radiais e concêntricos para fluido , para recolher o fluido da amostra dos recipientes de amostra esmagados; a FIG. 10 é uma vista em corte parcial, semi- esquemática de um êmbolo de esmagamento do dispositivo da FIG. 7; 14 a FIG. 11 é um fluxograma que representa a metodologia de teste de acordo com a invenção para determinar os dadores PCR positivos de uma combinação de doações; a FIG. 12 é um fluxograma que representa uma sequência de teste de acordo com a invenção para identificar uma única doação PCR positiva de uma combinação de 512 doações; a FIG. 13 é um fluxograma que representa uma segunda metodologia de teste de acordo com a invenção para determinar os dadores PCR positivos de uma combinação de doações; e a FIG. 14 é uma representação de uma grelha tridimensional de acordo com a invenção apresentando a definição dos índices de r, c e s.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA A presente invenção refere-se a sistemas, processos e dispositivos úteis para testar doações de sangue ou plasma para detectar aquelas doações específicas que têm uma contaminação virai acima de um nível predeterminado. Tais doações contaminadas são, então, descartadas para, deste modo, evitar a sua incorporação na corrente de matéria prima para produtos farmacêuticos ou a sua transfusão em doentes humanos. Os testes de detecção virai utilizados de acordo com a prática da presente invenção podem ser qualquer um que detecta directamente um vírus em vez dos anticorpos obtidos em resposta ao vírus. Os testes incluem testes de reacção em cadeia da polimerase (PCR) e outros testes que sejam 15 suficientemente sensíveis para directamente detectar um vírus mesmo depois da combinação de amostras de doações múltiplas.

Numa forma de realização da prática da presente invenção, é proporcionada uma pluralidade de doações de sangue ou plasma separadas. Uma mostra de sangue ou plasma é retirada de cada doação para dentro de um segmento de tubo flexível, oco correspondente. Uma pluralidade de vedações espaçadas são proporcionadas a intervalos ao longo do comprimento do segmento do tubo, de modo que as porções do segmento nos intervalos entre as vedações definam bolsas onde cada bolsa contém uma amostra de sangue ou plasma. Conforme é discutido adiante em mais detalhes, é proporcionada uma metodologia única de acordo com a presente invenção para testar amostras de plasma de bolsas depois das amostras serem formadas em combinações para, deste modo, detectar e isolar de forma eficaz e efectiva qualquer uma destas doações de sangue ou plasma que esteja contaminada por vírus.

Com referência à FIG. 1, está ilustrada uma forma de realização exemplificativa de um sistema proporcionado de acordo com a prática da presente invenção para realizar o processo de amostragem. 0 sistema inclui um recipiente 20 de doação de plasma padrão, construído de um material não-reactivo, por exemplo, cloreto de polivinilo (PVC). O recipiente 20 de doação inclui uma tampa 22 com duas conexões 23 e 24 curvas, respectivamente, ligadas à sua superfície superior. As conexões comunicam-se com o interior do frasco de doação através de orifícios proporcionados na tampa 22 para este fim. Um tubo 26 de enchimento flexível, oco, 16 construído de um material biologicamente neutro, por exemplo, plástico PVC, é ligado a uma extremidade da conexão 23 curva e ligado na outra extremidade, por exemplo, a uma agulha que é inserida num dador a fim de obter uma doação. Na forma de realização ilustrada, é também proporcionado um recipiente 28 de teste para colher uma amostra da doação para ser testada por serologia. 0 recipiente 28 de teste é, em geral, em forma de tubo de ensaio e é também construído de um material biologicamente não reactivo. 0 recipiente 28 de teste inclui um elemento 30 de tampa integrante através do qual são proporcionados orifícios com a finalidade de comunicar com o interior do recipiente de teste.

Um segmento 32 de tubo flexível, oco, construído de um material plástico biologicamente não-reactivo é conectado entre o elemento 30 de tampa do recipiente 28 de teste e a conexão 24 curva, oca da tampa do recipiente de doação de plasma. O segmento 32 de tubo é ligado ao elemento 30 de tampa de uma maneira tal que o fluido que passa através do segmento de tubo entrará no recipiente 28 de teste através de um orifício proporcionado no elemento 30 de tampa para este fim. O segmento 32 de tubo pode ser encaixado por atrito no referido orifício, por soldadura sónica ao mesmo ou, então, ligado ao orifício numa relação coaxial por meio de técnicas bem compreendidas pelos especialistas na arte.

Um segundo orifício também pode ser proporcionado no elemento 30 de tampa ao qual é ligado um tubo 34 de ventilação de uma maneira semelhante ao segmento 32 de tubo. O tubo 34 de ventilação, tipicamente, não tem mais de uma ou 17 duas polegadas de comprimento e, tipicamente, termina com um filtro 36 de exclusão de bactérias inserido, encaixado por atrito.

Numa forma de realização exemplificativa, uma doação de sangue ou plasma é retirada de um dador e colhida no recipiente 20 de doação de plasma para 0 subsequente armazenamento até ser necessária. No caso de uma doaçao de plasma, o sangue é, tipicamente, retirado de um dador e passado por um aparelho centrífugo contínuo, em que os glóbulos vermelhos do sangue são separados por centrifugação do fluido plasmático de suporte e retornados ao dador. 0 plasma é, então, colhido.

Depois que uma doação de plasma é tomada de um dador e o recipiente 20 de doação é cheio, o recipiente de doação é inclinado de modo a elevar o nível de fluido acima da conexão 24 curva ligada ao segmento 32 de tubo. O plasma entra no segmento de tubo, flui pelo segmento de tubo e enche o recipiente 28 de teste. Durante o enchimento, o ar aprisionado no interior do recipiente 28 de teste escapa pelo tubo 34 de ventilação, permitindo que o recipiente de teste seja completamente cheio. O filtro 36 de exclusão de bactérias filtra quaisquer bactérias no ar de retorno, deste modo evitando a contaminação da amostra pelo ambiente circundante. Depois que o recipiente de teste estiver cheio, deixa-se que o plasma da doação encha o segmento 32 de tubo.

Com referência agora à FIG. 2, depois que a amostra de plasma é arrastada para o segmento 32 de tubo, o segmento de 18 tubo é vedado por uma soldadura 38 a quente ou outro meio de vedação adequado, por exemplo, por soldadura sónica, num local próximo à ligação do segmento de tubo ao recipiente de doação de plasma. Uma outra vedação 40 a quente é aplicada ao segmento de tubo num local próximo à ligação do segmento de tubo ao recipiente 28 de teste. Deste modo, é proporcionado um tubo oco alongado, fechado em ambas as extremidades e contendo uma quantidade da doação de plasma. A porção cheia do segmento 32 de tubo é removida da doação de plasma e recipientes de teste, cortando-se o segmento de tubo no centro das vedações 38 e 40. O recipiente de doação de plasma separado é, então, removido para congelação e armazenamento, enquanto o recipiente de teste separado é removido para um laboratório para teste serológico. Tipicamente, os conteúdos são testados para detecção de vários anticorpos, que são obtidos em resposta a vírus específicos, tais como a hepatite C (HCV) ou o HIV-1 e HIV-2.

Vedações 42 adicionais são também proporcionadas a intervalos espaçados ao longo do comprimento do segmento de tubo, para definir bolsas sequenciais individuais e conectadas, cada uma compreendendo, adequadamente, uma porção 44 do segmento de tubo oco. Cada uma destas porções 44 contém uma quantidade específica de sangue ou plasma necessária para ser formada a geração específica de combinação. Por exemplo, para bolsas a serem formadas para teste de PCR, podem ser vedados aproximadamente 0,02 a 0,5 mL de sangue ou plasma da doação do hospedeiro. 19 0 segmento de tubo é vedado de uma maneira a proporcionar de 5 a 15 bolsas individuais e conectadas. A vedação, para definir as bolsas, pode ser feita depois que o segmento de tubo tiver sido removido de entre o recipiente de doação de plasma e o recipiente de teste serológico ou, preferencialmente, é feita enquanto o segmento de tubo ainda está conectado ao recipiente de doação de plasma, a fim de evitar a acumulação de pressão hidrostática. A vedação pode ser feita por qualquer método conhecido, por exemplo, vedação por termo-compressão (vedação a quente), por soldadura sónica ou outros, desde que o comprimento da região comprimida e vedada seja suficiente para permitir que as bolsas conectadas sejam separadas umas das outras sendo cortadas pelo centro da vedação sem violar a integridade da bolsa em nenhum dos lados, conforme indicado mais claramente nas FlGs. 3a e 3b. Uma segunda forma de realização do segmento de tubo adaptado para ser subdividido em porções de alíquotas contendo amostras de sangue ou plasma está representada na FIG. 2a, que é uma vista em perspectiva, semi-esquemática de uma forma de realização de segmento de tubo conectado entre um frasco 20 de doação de plasma e o recipiente 28 de amostra e dividido em porções contendo alíquotas de acordo com a presente invenção. O segmento 50 de tubo de colheita é conectado entre o elemento 30 de tampa do recipiente 28 de teste e a conexão 24 curva, oca da tampa do recipiente de doação de plasma. Adequadamente, o segmento 50 de tubo compreende uma pluralidade de locais 51 em forma de Y conectados uns aos outros em série por meio de segmentos 52 de tubo de plástico 20 de padrão médico, flexíveis, ocos. Os locais 51 em forma de Y são do tipo geralmente adaptados para conexão a um aparelho de perfusão intravenosa e inclui uma porção 53 de corpo cilíndrico com uma trajectória definida através do mesmo, tendo uma saída 54 numa extremidade da trajectória e um local 55 de acesso na outra extremidade. Um terminal 56 ramificado é proporcionado ao longo do corpo 53 do local em forma de Y e inclui um trajecto de fluido gue está em comunicação com o trajecto de fluido através do corpo 53.

Um local em forma de Y é conectado ao seguinte por meio de ligação por solvente de um tubo 52 plástico de padrão médico, oco, flexível, entre o terminal 54 de saída na parte inferior de um local em forma de Y ao terminal 56 ramificado do próximo local em forma de Y na série. Um tubo 57 de entrada inicial, oco, é ligado por solvente ao terminal ramificado do local em forma de Y inicial na série. Por sua vez, o tubo 57 de entrada inicial é ligado à conexão 24 curva da tampa do recipiente de doação de plasma. A ligação pode ser feita por encaixe por atrito do tubo 57 de entrada inicial à conexão 24 curva, por soldadura sónica do tubo à mesma ou, então, por encaixe do tubo numa relação coaxial com a conexão por meio de técnicas compreendidas pelos especialistas na arte. Além disso, o tubo 57 de entrada inicial pode terminar num conector 58 do tipo luer gue permitiria que os locais em forma de Y ligados em série fossem ligados de forma removível a um recipiente de doação que foi proporcionado com um conector do tipo luer correspondente na extremidade da curva 24. 21

De forma semelhante, o local em forma de Y terminal é equipado com um tubo 59 de saída terminal, oco, flexível que é ligado por solvente ao local em forma de Y terminal no seu terminal de saída. Este tubo também pode ser ligado a um conector do tipo luer padrão na sua extremidade distai.

De uma maneira semelhante àquela descrita em relação à primeira forma de realização, depois que uma doação de plasma é tomada de um dador e o recipiente 20 de doação está cheio, o recipiente de doação é inclinado de modo a elevar o nível do fluido acima da conexão 24 curva ligada ao segmento 57 do tubo de entrada. O plasma entra no segmento de tubo e flui através dos locais em forma de Y ligados em série, entrando em cada local em forma de Y através do seu terminal 56 ramificado e fluindo para dentro do próximo local em forma de Y desde o terminal 54 de saída do local em forma de Y anterior. 0 plasma é decantado até o recipiente 28 de teste estar cheio. Depois que o recipiente de testa está cheio, a doação é decantada adicionalmente até que os locais em forma de Y ligados em série compreendendo o segmento 50 de tubo também estejam cheios.

Depois que a amostra de plasma da doação é arrastada para dentro do segmento 50 de tubo, o segmento 59 de tubo de saída terminal é fechado por uma vedação ou solda 40a a calor ou outro meio de vedação adequado, por exemplo, por solda sónica num local adequado ao longo do seu comprimento próximo à conexão do segmento do tubo de saída terminal ao recipiente 28 de teste. 22 0 segmento 50 de tubo cheio é removido do recipiente de teste cortando o segmento de tubo no centro das vedações 40a. Alternativamente, se o segmento 50 de tubo terminar num conector do tipo luer, o segmento 50 de tubo é removido do recipiente 28 de teste, desconectando o luer. Uma segunda vedação 38a a calor é aplicada ao segmento 57 de tubo de entrada inicial num local ao longo do seu comprimento próximo à conexão do segmento inicial ao recipiente 20 de doação. A porção cheia do segmento 50 de tubo é removida da doação de plasma cortando o segmento 57 de entrada inicial através do centro da vedação 38a ou desconectando o conector 58 do tipo luer, se houver um. É assim proporcionado um tubo alongado, oco, articulado, fechado em ambas as extremidades e compreendendo uma pluralidade de locais em forma de Y ligados uns aos outros em série. Cada um dos locais em forma de Y ligados uns aos outros contém uma aliquota da doação de sangue ou plasma.

Conforme será descrito em mais pormenores adiante, os segmentos de tubo que conectam um terminal de saida em forma de Y anterior a um terminal ramificado em forma de Y subsequente são também proporcionados com vedações 42a a quente para definir aliquotas de amostras sequenciais, individuais e conectadas, cada um compreendendo, adequadamente, um local em forma de Y individual. Cada um destes locais em forma de Y contém uma quantidade especifica de sangue ou plasma necessária para ser formada uma geração especifica de combinação. A vedação para isolar cada local em forma de Y pode ser realizada depois que o segmento 50 de tubo tiver sido removido do recipiente de doação de plasma ou 23 pode ser realizada enquanto o segmento de tubo ainda está conectado. Preferencialmente, a vedação para isolar os locais em forma de Y é realizada enquanto o segmento 50 de tubo ainda está ligado ao recipiente de doação de plasma de modo que a redução do volume que causa um achatamento de uma porção do tubo durante o processo de vedação não provoque uma acumulação na pressão hidrostática da amostra. Quando o segmento 50 de tubo permanece conectado ao recipiente de doação de plasma, o excesso de fluido criado pela redução de volume do tubo criado pelas vedações a quente é permitido ser extraído de volta para o recipiente de doação. Deste modo, o excesso de pressão hidrostática, que pode levar a um perigoso esguicho durante a extracção da amostra, é, então aliviado de forma segura. A vedação pode ser feita por meio de qualquer método conhecido, por exemplo, vedação por termo-compressão (vedação a quente), por solda sónica ou outros, desde que o comprimento da região comprimida e vedada seja suficiente para permitir que as bolsas conectadas sejam separadas umas da outras sendo cortadas pelo centro da vedação sem violar a integridade do segmento de tubo em ambos os lados da vedação.

Com referência agora às FIGs. 3a e 3b, numa forma de realização preferida, a vedação entre as bolsas (42 da FIG. 2) e/ou locais em forma de Y (51 da FIG. 2a) inclui uma área 46 de almofada plana, incluindo uma porção 47 central estreita através da qual a vedação é cortada ou rasgada a fim de separar as bolsas conectadas. 0 corte é feito através da porção central a fim de assegurar que cada bolsa separada 24 permaneça vedada nas porções 48 de lingueta comprimidas em ambas as extremidades depois da separação. 0 comprimento da almofada de vedação pode ser maior ou menor, dependendo do método de separação elegido. A separação pode ser feita pela utilização de uma faca cirúrgica, um cortador de guilhotina, ou uma simples tesoura.

Com referência à FIG. 4, está ilustrada uma forma de realização exemplificativa de um dispositivo 60 de vedação, útil para proporcionar bolsas de tamanhos desejados específicos, incluindo meios para facilmente a separação das bolsas e identificar o seu número de sequência ao longo de um segmento. Adequadamente, o dispositivo 60 de vedação compreende a primeira e a segunda placas 61 e 62 opostas, respectivamente, cada uma incluindo uma pluralidade de porções elevadas, porções 63 de cabeça de vedação, dispostas numa relação de espaçamento sobre as superfícies opostas da placa. 0 dispositivo 60 de vedação é, preferencialmente, construído de tal modo que as porções de cabeça de vedação elevadas sejam móveis ao longo das suas respectivas placas de tal modo que o espaço de uma porção de cabeça de vedação elevada para outra possa variar. As cabeças 63 de vedação elevadas podem ser dispostas ao longo da placa de tal modo que a distância entre cabeças de vedação sucessivas possa ser feita progressivamente mais pequena de modo que a vedação é realizada ao longo do comprimento de um segmento de tubo a intervalos espaçados progressivamente mais próximos. Deste modo, podem ser formadas bolsas de amostra de tamanhos progressivamente mais pequenos e, portanto, conteúdo de volume progressivamente mais pequenos, movendo pares de 25 cabeças de vedação opostas ao longo das suas respectivas placas para uma posição desejada. A fim de formar múltiplas vedações a quente ao longo do comprimento do segmento de tubo plástico cheio com uma amostra de sangue ou plasma, o segmento de tubo é colocado no interior do dispositivo 60 de vedação entre as placas 61 e 62 de vedação superior e inferior, respectivamente. As placas opostas são postas em proximidade umas com as outras, deste modo comprimindo e vedando os segmentos de tubo. Conforme representado na FIG. 4, uma pluralidade de porções 63 de cabeças de vedação prolongadas ou elevadas ao longo do comprimento de cada placa alterna-se com porções 64 recuadas. À medida que as placas opostas movem-se juntas para formar vedações por calor sobre estas porções de um segmento de tubo plástico cheio com uma amostra de sangue ou plasma comprimida entre as porçoes 63 de cabeça de vedação elevada, sao formadas câmaras pelas porçoes 6 4 recuadas opostas . As câmaras são proporcionadas com a finalidade de acomodar aquelas porções do segmento de tubo que não serão comprimidas, mas, ao contrário, formarão as bolsas. Cada câmara definida por cada par de porções recuadas está configurada para alojar uma bolsa.

Um aquecedor 65 é configurado para aquecer cada uma das porções de cabeça de vedação da placa a fim de que as porções elevadas opostas formem uma vedação por calor sobre o segmento de tubo quando o dispositivo de vedação é fechado. O aquecedor 65 pode ser qualquer um de tipos de aquecedores conhecidos, tais como aquecedores radiantes, aquecedores por 26 indução ou resistência ou semelhantes. Preferencialmente, o aquecedor 65 é conectado directamente a cada uma das cabeças 63 de vedação elevadas para aquecer as porções elevadas sem aquecer desnecessariamente as porções recuadas. Se desejado, pode ser proporcionado um isolamento para reduzir a transferência de calor entre as porções elevadas e as porções recuadas. Numa forma de realização exemplificativa, um dispositivo 66 de arrefecimento, tais como aletas de arrefecimento ou radiador de aletas, um fluxo de ar em movimento ou uma refrigeração por dedo frio também pode ser conectado ao dispositivo 60 de vedação. O dispositivo de arrefecimento 66 é conectado directamente a cada uma da porções recuadas 64 de modo que as câmaras definidas quando as porções recuadas opostas se movem juntas são mantidas a uma baixa temperatura. Assim, as amostras de sangue ou plasma contidas nas bolsas formadas no interior da câmara durante o processo de vedação não são danificadas pelas altas temperaturas da vedação a calor. A área estreita (47 da FIG. 3b) situada aproximadamente no centro da vedação é formada por uma estrutura de aresta alongada 67 proporcionada no centro da porção 64 de cabeça de vedação prolongada das placas de vedação. À medida que o segmento de tubo é comprimido entre as cabeças de vedação superior e inferior, a aresta 67 força um entalhe sobre a superfície superior e inferior da porção de vedação. Os entalhes apertam o material plástico que compreendem o centro da vedação, tornando-o deste modo, fácil de separar. 27

Numa forma de realização da invenção, a aresta 67 pode ser dentada a fim de proporcionar perfurações dispostas numa direcção ortogonal em relação ao eixo principal dos segmentos de tubagem. As perfurações permitem gue as bolsas individuais e conectadas sejam removidas umas das outras sem o perigo inerente do corte com um objecto afiado de violar a integridade de uma bolsa cortando inadvertidamente a área contendo a amostra. As perfurações, são, preferencialmente, proporcionadas durante o processo de vedação proporcionando as cabeças de vedação com um recorte dentado. Alternativamente, as perfurações podem ser proporcionadas imediatamente depois da utilização de um gabarito ou matriz. São também proporcionados meios 68 para abrir e fechar o dispositivo 60 de vedação a fim de comprimir as placas de vedação uma contra a outra e, deste modo, formar vedações ao longo do comprimento do segmento de tubo. Tais meios são conhecidos na arte e podem, adequadamente, compreender um aparelho manual que se abre e fecha, por exemplo, um puxador de alavanca ligado a uma estrutura de suporte e que move a estrutura contra, por exemplo, uma articulação. Outras disposições adequadas podem incluir guias verticais, molas ou prensas de pistão operadas hidraulicamente ou outras prensas comuns mecânicas, eléctricas ou hidráulicas.

Com referência agora à FIG. 4a, é representada numa vista semi-esquemática, uma forma de realização especifica de um dispositivo 70 de vedação útil para proporcionar vedações a calor por termo-compressão a intervalos uniformes, espaçados, de modo a formar bolsas de tamanhos específicos 28 desejados, ou para isolar locais em forma de Y em alíquotas individuais contendo amostras. 0 dispositivo 70 de vedação adequadamente compreende placas superiores e inferiores 71 e 72, respectivamente, adaptadas para serem montadas ao longo da alavanca de pressão e banda de vedação, respectivamente, de uma máquina de vedação por impulso, comercialmente disponível, por exemplo, uma das máquinas de soldadura por impulso ALINE série-M, fabricadas e comercializadas pela ALINE Company de Santa Fé Springs, Califórnia. A forma de realização específica representada na FIG. 4a é uma cabeça de vedação a quente de duas partes a ser acoplada a uma máquina de vedação por impulso ALINE MC-15 como uma modificação pós-venda, e permite que a MC-15 produza bolsas pré-cheias de plasma para processamento adicional de acordo com o sistema e método da presente invenção. A placa 72 inferior da cabeça 70 de vedação a quente é construída de um material adequadamente rígido, resistente ao calor, por exemplo, Kevlar® laminado fabricado e comercializado pela DuPont Corporation. Na forma de realização ilustrada, a placa inferior 72 tem, preferencialmente, cerca de 15 polegadas de comprimento a fim de encaixar-se na superfície de montagem da máquina de vedação por impulso ALINE MC-15. A placa 72 inferior inclui uma fenda 73 longitudinal que é disposta centralmente e percorre todo o comprimento da placa 72 inferior. A largura da fenda 73 longitudinal tem aproximadamente 0,2 polegadas a fim de acomodar uma tubagem médica padrão, que, tipicamente, tem um diâmetro externo de aproximadamente 0,1875 (3/16) 29 polegadas, de uma forma alojada ao longo do comprimento da fenda. É proporcionada uma pluralidade de fendas 74 transversais a intervalos espaçados ao longo do comprimento da placa 72 inferior que são dispostas numa direcção ortogonal à da fenda 73 central. As fendas 74 transversais têm uma largura de aproximadamente 0,5 polegadas e ficam situadas sobre centros de 1,125 (1-1/8) polegadas. Cada fenda transversal é, portanto, separada da sua fenda contígua por um bloco residual do material da placa dividido centralmente pela fenda 73 longitudinal central que tem cerca de 0,625 (5/8) polegadas de largura.

Tanto as fendas longitudinais como as transversais 73 e 74, respectivamente, são cortadas apenas parcialmente através do material da placa 72 inferior, formando, deste modo, um leito 75 substancialmente plano que define a superfície inferior tanto das fendas longitudinais como transversais. Quando o aparelho é utilizado para formar vedações a quente, um tubo médico padrão de 0,1875 (3/16) de comprimento é alojado em posição ao longo da fenda 73 longitudinal e repousa sobre o leito 75 da placa inferior que funciona como uma superfície de suporte durante o processo de vedação a quente.

Um elemento 76 de aquecimento, por exemplo, um fio resistivo de níquel-crómio (NiCr), é proporcionado em forma de serpente, de fenda a fenda, e fica disposto no sentido do comprimento ao alongo de cada fenda transversal compreendendo 30 a placa inferior à volta do centro da fenda. Onde o elemento 76 de aquecimento atravessa o centro das fendas 74 transversais, o fio de NiCr e protegido de modo a não contactar a tubagem de plástico termo-sensível revestindo-se o fio, por exemplo, por um pedaço de fita de Teflon®. Assim, as amostras de sangue ou plasma contidas nas bolsas formadas no interior do dispositivo de vedação durante o processo de vedação não são danificadas pelas altas temperaturas da vedação a quente. A placa 71 superior tem também, aproximadamente, 15 polegadas de comprimento e é suspensa sobre a placa 72 inferior pela alavanca de pressão da máquina de vedação MC-15. A placa 71 superior é construída de um material plástico resistente ao calor, por exemplo, Lexan® ou Kevlar® moído e compreende um conjunto de dentes igualmente espaçados, geralmente rectangulares que se projectam da sua superfície inferior e estendem-se na direcção da placa inferior. Os dentes 77 têm cerca de 0,5 polegadas de comprimento e são separados sobre centros de 1,125 (1/18) polegadas. Em concordância, pode-se observar que os dentes 77 são dimensionados de modo a encaixarem-se na cavidade definida pelas fendas 74 transversais da placa 72 inferior. Cada um dos dentes 72 da placa 71 superior é posicionado de modo a ser suspenso sobre uma intersecção correspondente de uma fenda 74 transversal e a fenda 73 longitudinal da placa 72 inferior. Assim, cada dente 77 é configurado para encaixar-se dentro da cavidade assim definida quando as placas de vedação a quente são fechadas pela operação de remoção do dispositivo MC-15. 31

Depois que um segmento de tubo flexível é colocado no interior da fenda 73 longitudinal, a placa 71 superior é empurrada para entrar em contacto com a placa 72 inferior, abaixando a tampa do aparelho de vedação a quente MC-15. À medida que a tampa é abaixada, os dentes 77 da placa 71 superior entram na cavidade definida pelas fendas 74 transversais da placa 72 inferior e entram em contacto com aquela porção do segmento de tubo que fica exposta sobre o leito 75 na intersecção de cada fenda 74 transversal com a fenda 73 central longitudinal. Uma corrente é proporcionada ao fio de aquecimento resistivo de níquel-crómio, o que faz com que o material plástico do segmento de tubo amoleça. Ao mesmo tempo a placa 71 superior é comprimida sobre a placa inferior, deste modo, aplicando pressão ao material plástico sendo amolecido pelo elemento 76 de aquecimento.

Depois de vedado, o segmento de tubo é rotulado em pelo menos uma extremidade com um identificador específico que corresponde à doação de plasma original. Isto pode ser conseguido, por exemplo, colando um rótulo sobre o segmento ou imprimindo um emblema de código de barra directamente sobre o material de tubagem. Um recesso 78 preparado é adequadamente proporcionado no dispositivo 70 vedação para manter e alinhar uma etiqueta de identificação de código de barra pré-impressa. Tal etiqueta é formada de um material termo-adesivo adequado e é colada a quente ao segmento de tubo na primeira posição de vedação com a finalidade de identificação. O segmento de tubo, incluindo as bolsas contendo a amostra é, então, congelado para conservação. 32

De volta à FIG. 2, é importante ser capaz de identificar, de forma inequívoca, todas as partes do sistema que compreendem uma doação de plasma individual. Deste modo, identificadores específicos, tais como fios codificados, pontos codificados, códigos de barras ou outras estruturas codificadas com o identificador específico podem ser colocadas na estrutura física do sistema de colheita de plasma. Por exemplo, numa forma de realização, um fio codificado 37 é moldado no recipiente 20 de doação, um fio codificado 39 é moldado ao longo da borda da tampa 22 do frasco, um fio codificado 41 é moldado ao longo da lateral do recipiente 28 de teste e um fio codificado 43 é moldado nos segmentos de tubo a intervalos espaçados. O identificador específico no segmento de tubo percorre o comprimento dos segmentos de tubo e o código é repetido a fim de permitir a segmentação dos segmentos de tubo ao mesmo tempo que mantém a integridade da identificação de cada segmento assim preparado. Além disso, cada porção do sistema de doação é identificado com o mesmo código, de modo que a identidade da doação é mantida para todas as partes do sistema.

De volta agora às FIGs. 3a, 3b e 4, pode ser ainda desejável ter cada bolsa individual ao longo de um segmento identificada por um código alfabético ou numérico igual à posição da bolsa ao longo do comprimento linear do segmento de tubo original. Tal código pode ser impresso, por exemplo, na porção comprimida da almofada de vedação localizada entre bolsas adjacentes pela utilização de uma matriz para estampagem. Tal matriz para estampagem pode compreender uma parte integrante do dispositivo de vedação conforme 33 representado nas FlGs. 4 e 4a, de modo que as etapas de vedar, formar as bolsas de tamanhos variáveis e proporcionar áreas estreitas ou perfuradas para uma fácil separação, bem como números de identificação, sejam todas conseguidas num único passo eficaz. Alternativamente, o identificador alfabético ou numérico poderia compreender parte de um gabarito ou matriz de perfuração. São conhecidas matrizes de estampagem que incluem meios para avançar o carácter alfabético ou numérico para um carácter sequencial seguinte, de tal modo que as bolsas sequenciais num segmento de tubo sejam, cada uma delas, identificadas por uma sequência correspondente de caracteres alfabéticos (a, b, c,...) ou numéricos (1, 2, 3,...).

Deste modo, se uma primeira combinação de teste está a ser preparada a partir de bolsas de várias doações, pode ser realizada uma verificação de controlo de qualidade confirmando que todas as bolsas a serem combinadas de cada segmento de tubo têm o mesmo código de localização, por exemplo, número 1. Do mesmo modo, ao preparar uma segunda combinação de teste a partir de amostras das mesmas doações, uma verificação de controlo de qualidade pode ser realizada confirmando que todas as bolsas a serem combinadas de cada segmento de tubo têm, por exemplo o número 2 impresso em algum ponto sobre a porção comprimida da bolsa. A fim de realizar um teste eficaz de PCR de uma doação, a amostra de teste serológico tomada de cada doação individual no recipiente 28 de teste é testada para detecção de vários antigénios e/ou anticorpos que são designados para 34 vírus específicos. Se uma amostra apresentar resultado positivo para um ou mais testes de antigénios ou anticorpos conhecidos, a doação individual e o seu segmento de tubo correspondente são excluídos para testes adicionais e ambos podem ser descartados de uma maneira apropriada.

Os segmentos de tubo restantes, correspondentes às doações negativas de teste serológico, são divididos em grupos identificados, cada grupo compreendendo um número seleccionado de doações. Conforme será melhor descrito adiante, o número de doações por grupo é determinado pela sensibilidade dos testes específicos de alta sensibilidade, tais como um teste de PCR, a concentração antecipada do ARN ou ADN virai de interesse na amostra de plasma e a frequência antecipada de uma amostra PCR positiva que ocorre na população de dadores em geral. Por exemplo, para a detecção do vírus da hepatite C, contendo o ARN de interesse, numa população de dadores de plasmaférese repetida, é apropriado combinar amostras de entre 100 e 700 doações individuais. Para uma população em que a contaminação virai ocorre com mais frequência, podem ser apropriadas combinações menores entre 50 e 100 doações individuais.

Será agora descrita uma forma de realização de um processo para preparar uma combinação de teste de PCR de acordo com a presente invenção em relação às FIGs. 5 e 6. E proporcionada uma placa de amostragem 80, geralmente semelhante em aplicação a uma placa de titulação, mas configurada de acordo com a prática da presente invenção. A placa de amostragem 80 é configurada para conter, de uma 35 maneira geral, poços 81 de amostras semi-cilíndricos dispostos horizontalmente na placa numa disposição geralmente regular. Uma placa de amostragem adequada utilizada para praticar o método da invenção tem 64 destes poços de amostras dispostos em fila/coluna, 8x8, numa forma rectangular. É também proporcionada uma placa de cobertura 82 com aproximadamente as mesmas dimensões exteriores da placa de amostragem 80. A placa de cobertura 82 é adaptada para cobrir a superfície da placa de amostragem 80 numa união de ajuste firme. Orifícios de passagem 83 são dispostos na placa de cobertura da mesma maneira ordenada que os poços de amostras da placa de amostragem 80. Quando a cobertura 82 é colocada sobre a superfície da placa de amostragem 80, os orifícios de passagem 83 alinham-se verticalmente sobre os poços de amostra 81, permitindo, deste modo, comunicação com os poços de amostra através dos orifícios de passagem. O diâmetro dos orifícios de passagem é substancialmente mais pequeno do que a área de superfície das bolsas de amostra de teste e os poços de amostra correspondentes. No entanto, o diâmetro do orifício de passagem é grande o suficiente para permitir a passagem de uma agulha ou outro objecto semelhante a uma cânula através dos orifícios e penetrar no poços de amostra abaixo.

Conforme ilustrado em relação à FIG. 6, uma bolsa terminal 84 (primeira geração, “numero 1") é removida de cada segmento de tubo que foi identificado como pertencente a um grupo PCR particular a ser testado. Cada bolsa terminal 84 é lavada, mas não aberta, e colocada num poço de amostra 81 correspondente da placa de amostragem 80. A placa de 36 cobertura é presa sobre o topo da placa de amostragem 80 e a placa, cobertura e bolsas são descongeladas até uma temperatura apropriada.

Um volume igual entre cerca de 0,02 a 0,5 mL de plasma é removido de cada bolsa e combinado num recipiente de teste. Uma agulha 85 ou outro dispositivo semelhante a uma cânula é inserido através do orifício de passagem na placa de cobertura e no poço de amostra da placa de amostragem directamente abaixo, perfurando, deste modo, o material do tubo da parede lateral da bolsa e penetrando na amostra de plasma aí localizada. Numa forma de realização exemplificativa, a agulha é ligada a um dispositivo que proporciona um vácuo ou sucção contínua para extrair todo o sangue ou plasma contido na bolsa a fim de minimizar qualquer fuga de líquido para o tabuleiro circundante. A agulha pode ser presa num dispositivo que permite que a agulha se mova pelo orifício de passagem e parede superior da bolsa, mas que restringe o seu progresso para baixo de modo que e a agulha é impedida de tocar ou perfurar a parede inferior da bolsa, uma vez que a bolsa repousa no poço de amostra. Quando a cânula é removida depois de extrair a amostra, o material 86 da placa de cobertura à volta do orifício de passagem evita remoções acidentais da bolsa juntamente com a cânula, conforme ilustrado na FIG. 6.

Embora o método para preparar uma combinação de teste de PCR tenha sido descrito em termos de extrair manualmente uma amostra por meio da inserção de uma cânula individualmente em cada poço de amostra, o método pode ser 37 igualmente praticado utilizando um processo automatizado. A placa de amostragem contendo as bolsas em cada poço pode ser mantida de modo a permitir que um conjunto de cânulas, dispostas de uma maneira correspondente ao arranjo de orifícios de passagem na placa de cobertura, sejam pressionadas sobre a placa de amostragem, permitindo, deste modo, que todas as bolsas de amostra sejam perfuradas e as amostras extraídas das mesmas ao mesmo tempo. Alternativamente, uma cânula única ou um dispositivo de prender a cânula pode ser automatizado ou programado para perfurar e remover fluido de cada bolsa, sucessivamente. A fim de evitar a passagem de contaminação, uma cânula limpa é utilizada para remover as amostras de cada poço.

Além disso, ficará evidente para um especialista na arte que a combinação de placa de amostragem, poços de amostra, cobertura, orifícios de passagem e cânula, embora descrita em relação à extracção de fluido de amostra de um pacote de amostra, é igualmente aplicável à extracção de fluido de amostra dos recipientes de amostra do local em forma de Y da FIG. 2a. A configuração dos poços de amostra das FIGs. 5 e 6 é determinada pelo formato do recipientes contentores de fluido e apenas modificações mínimas são necessárias para os reconfigurar para os locais em forma de Y. Por exemplo, os poços de amostra podem compreender um cilindro alongado, orientado verticalmente, dentro do qual é inserido cada local em forma de Y. Um entalhe pode ser proporcionado em algum local apropriado à volta da periferia superior de cada poço de amostra que funciona como um batente dentro do qual o terminal ramificado do local em forma de Y 38 pode ser posicionado. Isto funcionaria também para orientar cada local em forma de Y e proporcionar segurança de posicionamento adicional. Da mesma maneira descrita em relação às FIGs. 5 e 6, o fluido pode ser extraído de cada local em forma de Y pela inserção de uma cânula em cada terminal de acesso do local em forma de Y e em comunicação fluida com a amostra. Quando a cânula é removida do terminal de acesso, o material da placa de cobertura que circunda cada orifício de passagem actua como um batente e evita que o local em forma de Y seja removido do poço de amostra.

Ficará ainda evidente para os especialistas na arte que esta configuração é igualmente adequada para a prática da invenção utilizando um processo automatizado. Um conjunto de cânulas pode ser disposto de uma maneira correspondente à disposição dos orifícios de passagem na placa de cobertura, permitindo, deste modo, que todos os terminais de acesso dos locais em forma de Y sejam perfurados e as amostras sejam extraídas dos mesmos ao mesmo tempo. Alternativamente, uma cânula única ou um dispositivo de prender a cânula pode ser automatizado ou programado para perfurar sucessivamente cada terminal de acesso e remover fluido de cada local em forma de Y.

Uma forma de realização adicional de um aparelho e método adequados para preparar uma combinação de teste de PCR de acordo com a presente invenção será agora descrita em relação às FIGs. 7, 8, 9a, 9b e 10. Com referência, em primeiro lugar, à FIG. 7, uma combinação de doação de plasma compreendendo fluidos extraídos de uma multiplicidade de amostras de plasma é preparada de uma série pacotes de 39 amostras de doação de plasma numa prensa hidráulica 90 alimentada a electricidade. A prensa hidráulica 90, adequadamente, compreende um cilindro 91 de esmagamento, em que os pacotes de amostras são colocados, e um pistão 92 operado hidraulicamente que esmaga os pacotes de amostra. As amostras contidas nos pacotes são extraídas do cilindro 91 de esmagamento por um gás comprimido adequado, por exemplo, ar ou azoto comprimido e colhidas num recipiente de combinação como uma combinação (pool).

Inicialmente, uma bolsa de geração (por exemplo, a bolsa #1) é removida de cada segmento de tubo que foi identificado como pertencente a um grupo particular de PCR a ser testado. Cada bolsa de geração é lavada, mas não aberta, e colocada no interior do cilindro 91 de esmagamento da prensa 90. O carregamento do cilindro de esmagamento é realizado no ambiente de um capuz de biosegurança de classe II e trajecto de fluido de ar de modo a assegurar contra uma contaminação inadvertida do ambiente circundante por um pacote que perdeu a integridade estrutural. De uma maneira a ser descrita em mais pormenor adiante, o pistão 92 de esmagamento assenta-se firmemente na garganta 91a aberta do cilindro 91 de esmagamento, de tal maneira que a contenção do conteúdo do cilindro 91 de esmagamento seja assegurada e que a combinação de cilindro 91 e pistão 92 encerre completamente os pacotes de amostras. A maneira na qual o pistão 92 de esmagamento se encaixa no cilindro 91 de esmagamento é concebida de modo a assegurar que o ambiente externo do cilindro 91 seja protegido contra contaminação por quaisquer 40 vírus nocivos que possam estar presentes em qualquer uma das amostras contidas pelos pacotes de amostras. 0 cilindro 91 de esmagamento é, em seguida, montado sobre um assento 93 do cilindro que alinha o cilindro na posição correcta sobre a prensa hidráulica 90 e permite ainda que um eixo hidráulico 94, conectado de forma operativa a um cilindro hidráulico 95, se alinhe e encaixe com o pistão 92 de esmagamento. De uma maneira que será descrita em mais pormenores adiante, o pistão 92 de esmagamento é conectado de forma removível ao eixo hidráulico 94, de tal modo que o pistão 92 possa ser elevado e abaixado por meio do funcionamento do cilindro hidráulico 95.

Depois do cilindro 91 e o pistão 92 terem sido alinhados apropriadamente sobre o assento 93 do cilindro e conectados ao cilindro hidráulico 95 através do eixo 94, uma válvula de controlo 96 é operada de modo a fazer com que o cilindro hidráulico exerça uma força sobre o eixo 94 e o pistão 92 que, por sua vez, esmaga os pacotes de amostras no interior do cilindro 91 de esmagamento. O cilindro hidráulico 95 funciona em conjunto com um motor 97 eléctrico de 240 volts CA de quatro cavalos-vapor que faz funcionar uma bomba 98 hidráulica de pistões que bombeia fluido hidráulico em conjunto com um reservatório 99 de fluido para, deste modo, fazer funcionar o cilindro 95. Cerca de 4.000 libras de força são concentradas no eixo hidráulico 94 que desenvolve uma pressão de cerca de 800 a 900 psi aplicada aos pacotes de amostras pelo pistão 92. 41

Depois dos pacotes de amostras terem sido esmagados, as amostras de doação de fluido ai contidas são extraídas do cilindro 91 de esmagamento por um gás comprimido fornecido, por exemplo, por um cilindro de ar comprimido 100 que é conectado através de um regulador de pressão 101 a uma válvula de escape 102 proporcionada no pistão 92 de esmagamento. A fim de permitir que a válvula de escape 102 funciona correctamente, o pistão 92 é primeiro elevado ligeiramente da sua posição de esmagamento totalmente estendida. O ar comprimido é ventilado para dentro do cilindro 91 através do regulador de pressão 101 até que o limiar de pressão da válvula de escape seja atingido. A válvula 102, então, abre-se permitindo que o gás comprimido pressurize o interior do cilindro que força a combinação de plasma para fora do cilindro 91 de esmagamento através de um terminal de recolha 103 proporcionado na parte inferior do cilindro. A combinação de plasma é, então, colhida num recipiente de combinação conectado ao terminal de recolha 103 por uma linha de extracção ou tubo à medida que o fluido é forçado para fora do cilindro pelo ar comprimido. 0 ar comprimido é descarregado para dentro de um capuz de segurança biológica de classe II, depois de passagem por uma armadilha de lixívia.

Com referência agora à FIG. 8, está representada uma vista parcialmente em corte, transversal de um cilindro 91 de esmagamento construído de acordo com os princípios da invenção. Adequadamente, o cilindro 91 de esmagamento compreende uma placa 105 de base geralmente circular tendo uma superfície superior e inferior e uma aba 106 42 circunferencial que se estende numa direcção ascendente a partir da superfície superior, com roscas cortadas na sua face interior. Uma parede 107 de cilindro cilíndrica, aberta em ambas as extremidades, é roscada na face exterior da sua extremidade inferior. Um encaixe ou entalhe 108 é cortado na face interior da extremidade inferior da parede 107 do cilindro de modo a definir uma aba anular 109 que é disposta paralela à superfície superior da placa 105 de base e apresenta uma face oposta à mesma. Como a parede 107 do cilindro é aparafusada à placa 107 de base, uma placa de tela 110 disposta sobre a superfície da placa 105 de base é encaixada pela aba anular 109 da parede 107 do cilindro e comprimida entre a aba anular 109 e a superfície superior da placa de base.

Com referência agora às FIGs. 9a e 9b, a placa de tela 110 é uma placa em forma de disco, geralmente circular, contra a qual os pacotes contendo amostras são forçados quando os mesmos são esmagados pelo pistão 92 de esmagamento. Conforme representado na FIG. 9b, a placa de tela 110 inclui canais para fluido compreendendo fendas 111 radiais e fendas 112 circulares concêntricas, todas com aproximadamente 1/32 polegadas de largura, que são cortados na superfície superior da placa de tela. As fendas 111 radiais são cortadas a um ângulo que se inclina na direcção do centro da placa de tela 110 onde terminam num dreno ou fossa 113 localizada axialmente que drena por um tubo de drenagem de 1/4 polegadas (melhor observado na FIG. 8) perfurado através da placa 105 de base. 43

De volta agora à FIG. 8, uma vedação é formada entre a parede 107 do cilindro e a placa de tela 110 encaixando e comprimindo uma junta circular 115, proporcionada numa pista de vedação cortada na placa 105 de base para este fim. A pista de vedação 116 fica localizado na placa de base de tal modo que a junta circular 115 fica por baixo da intersecção vertical da placa de tela 110 e a parede 107 do cilindro. Um degrau 117 é cortado na placa de base 105 e uma ranhura 118 correspondente é cortada na placa de tela, de modo que um batente é capaz de situar com precisão a placa de tela sobre a placa de base para um alinhamento apropriado com a junta circular, de tal modo que a parede 107 do cilindro se encaixará adequadamente à placa de tela e a sua intersecção encaixar-se-á adequadamente à junta circular 115.

Com referência agora à FIG. 10, está representada, numa vista parcialmente em corte, transversal de um pistão 92 de esmagamento proporcionado de acordo com os princípios da invenção. O pistão 92 de esmagamento compreende uma cabeça 120 de pistão geralmente cilíndrica, tendo uma taça 121 localizada centralmente, que se estende axialmente a projectar-se da mesma, a taça 121 tendo paredes geralmente cilíndricas e uma extremidade aberta para definir, deste modo, um encaixe 123 para receber um eixo 94 do cilindro hidráulico geralmente cilíndrico.

Um bordo anular 122 é proporcionado à volta da circunferência da taça cilíndrica 121 e circunda a entrada aberta da taça. A superfície externa do bordo 122 é chanfrado, de tal modo que a superfície chanfrada aumenta em 44 diâmetro na direcção do volume do corpo da cabeça 120 do pistão. À medida que o eixo hidráulico 94 avança para dentro do encaixe 123, um par de grampos 124 de retenção accionado por mola avança sobre a superfície chanfrada do bordo anular 122 até ser fixado em posição e prender o lado inferior do bordo anular.

Para acomodar o ajuste com o encaixe 123, cada grampo de retenção 124 inclui um dente chanfrado 125 que desliza ao longo da superfície chanfrada do anel 122 de retenção anular da cabeça do pistão, deste modo, abrindo as garras dos grampos 124 accionados por mola. À medida que o eixo hidráulico 94 continua a avançar, os dentes chanfrados 125 dos grampos de retenção 124 eventualmente avançam para além da superfície chanfrada do anel 122 de retenção anular. O accionamento por mola dos grampos de retenção força os dentes chanfrados a entrarem em contacto com a superfície externa da parede lateral da taça. Os dentes dos grampos de retenção 124 são, assim, encaixados com a superfície inferior do bordo de retenção anular 122, prendendo, deste modo, o pistão 92 de esmagamento e proporcionando meios para fazer com que o pistão se mova em ambas as direcções.

Além disso, será evidente para os especialistas na arte que os grampos 124 accionados por mola podem facilmente desencaixar do anel de retenção 122 anular por um simples aperto das extremidades dos grampos opostos aos dentes 125 de retenção chanfrados. Em concordância, será observado que a cabeça do pistão 120, a taça 121 cilíndrica montada axialmente, o anel de retenção 122 anular e os grampos de 45 retenção 124, em combinação, proporcionam meios para desconectar, de forma rápida e fácil, o eixo hidráulico 94 do pistão 92 de esmagamento. A funcionalidade de rápida desconexão permite que a combinação de pistão 92 e cilindro 91 seja facilmente removida do assento 93 do cilindro da pressão hidráulica 110 para limpeza, esterilização, reenchimento com pacotes de amostra adicionais e outros.

Conforme ilustrado na FIG. 10, o pistão 92 de esmagamento inclui ainda várias juntas circulares 126 dispostas em pistas de vedação 178 proporcionados à volta da periferia da cabeça 120 do pistão. As juntas circulares são proporcionadas com a finalidade de formar uma vedação de pressão estanque entre a superfície circunferencial exterior da cabeça 120 do pistão e a superfície circunferencial interna da parede 107 do cilindro do cilindro 91 de esmagamento. Várias juntas circulares proporcionam uma medida de segurança e estabilidade a fim de assegurar a contenção de fluido de amostra potencialmente contaminadas dentro dos limites do cilindro 91. Embora estejam representadas três juntas circulares 126 na forma de realização ilustrada da FIG. 10, será evidente que pode ser proporcionado um número maior ou menor de juntas circulares de acordo com a invenção. Tudo que é necessário é que uma vedação seja formada entre o pistão 92 de esmagamento e o cilindro 91 de esmagamento de modo a assegurar a contenção de fluido potencialmente contaminado no interior do cilindro.

De volta à FIG. 8, a parede lateral do cilindro de esmagamento inclui um degrau 130 chanfrado de 0,020 polegadas 46 que é maquinado na superfície interior da parede lateral. A primeira aproximadamente 1,0 polegada a partir do topo da parede 107 lateral do cilindro é, deste modo, maquinada para ter um diâmetro interno (Dl) de aproximadamente 0,040 polegadas maior do que o Dl da porção restante da parede 107 lateral do cilindro que se estende para baixo na direcção da placa de tela 110 e base 105. A interface entre o degrau e a porção restante da parede lateral é chanfrada, de modo a proporcionar uma transição em ângulo, relativamente suave do Dl superior ligeiramente maior para o Dl inferior ligeiramente menor. O degrau na parede 107 lateral do cilindro é proporcionado de modo que o pistão 92 de esmagamento pode ser inserido manualmente na garganta aberta do cilindro 91 de esmagamento com apenas um ligeiro contacto sendo feito entre as juntas circulares (126 da FIG. 10) e a superfície do Dl da cilindro. Uma vez que a combinação de pistão e cilindro montada manualmente esteja em posição sobre o assento do cilindro (93 da FIG. 7) o eixo hidráulico 94 avança para adaptar-se ao encaixe 123 do pistão e é estendido até que os grampos de retenção sejam fixados contra a superfície inferior do bordo 122 de retenção anual da cabeça do pistão. O eixo hidráulico 94, então, avança adicionalmente de modo a empurrar mais o pistão para dentro do cilindro, deste modo empurrando as juntas circulares para além do degrau 130 no Dl da parede do cilindro. Quando empurradas para além do degrau, as juntas circulares comprimem-se totalmente entre o Dl da parede 107 lateral do cilindro e as pistas de vedação do pistão 127, formando, deste modo, uma vedação estanque. 47

Em funcionamento, o pistão 92 de esmagamento desenvolve uma pressão de cerca de 800 a 900 psi (4.000 libras de força concentradas no eixo hidráulico) que é uma pressão suficiente para esmagar os pacotes de amostras contidos no interior do cilindro. O fluido de amostra de sangue ou plasma flui ao longo do canal proporcionado na placa de tela e para dentro da fossa central, onde é colhido e deixado que flua para fora do terminal de extracção e para dentro de um recipiente de combinação. Depois da operação de esmagamento, o cilindro hidráulico 95 é feito funcionar para elevar o pistão 92 de esmagamento a uma pequena distância (aproximadamente 1/2 a uma polegada) acima da massa de pacotes de amostras esmagadas, deste modo, criando uma câmara no interior do cilindro. Um gás pressurizado, por exemplo, ar comprimido, é forçado para dentro da câmara através da válvula de escape 102 no pistão 92. A pressurização da câmara faz com que qualquer porção do fluido de amostra de sangue ou plasma restante seja extraída para fora do cilindro através do terminal de saída 103 para dentro do recipiente de combinação.

Uma vez completa a operação de esmagamento e combinação, a linha de extracção conectada ao terminal de saída 103 é grampeada, com a finalidade de evitar que alguma porção adicional de fluido da amostra saia do cilindro. A linha de extracção é colocada num recipiente de lixívia, e o cilindro hidráulico 95 faz com que o pistão se eleve mais no cilindro, criando, deste modo, uma sucção que drena a lixívia do recipiente para dentro do cilindro. Preferencialmente, os passo de esmagamento e drenagem da lixívia são repetidos mais 48 duas vezes, a fim de assegurar que qualquer porção de fluido de "retorno" de sangue ou plasma seja totalmente extraída do cilindro 91 de esmagamento e que a lixívia teve ampla oportunidade de encher o volume interior da câmara de esmagamento, reduzindo, deste modo, qualquer contaminação virai em bruto que possa ser encontrada no interior da mesma.

Em seguida, os grampos de rápida libertação são operados e a combinação pistão/cilindro é removida da prensa hidráulica 90 para procedimentos de esterilização, por exemplo, numa autoclave. O pistão e o cilindro podem ser, subsequentemente, limpos quimicamente sendo postos de molho numa solução de lixívia a 10% durante 15 minutos seguido por um ciclo de enxaguamento de H2O, tensoactivo SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% e H20 uma vez mais, antes de serem submetidos a autoclave. Se não houver tempo suficiente para esterilização em autoclave, a limpeza química pode ser concluída como ETOH a 70% e solução de H20 esterilizada. Se for desejada esta limpeza química adicional, a mesma é realizada num capuz de biosegurança de classe II que escapa através de um filtro HEPA. Enquanto sob o capuz, o cilindro de esmagamento é carregado com um próximo grupo de pacotes de amostra a ser esmagado e o pistão 92 de esmagamento é inserido manualmente dentro da entrada aberta do cilindro 91 de esmagamento e forçado para baixo até que as juntas circulares do pistão entrem em contacto com o degrau chanfrado formado na parede lateral do cilindro. A combinação cilindro/pistão recém-recarregada está agora pronta para ser colocada sobre 0 assento 93 do cilindro da prensa 90. O cilindro hidráulico 95 é feito funcionar para fazer com que o 49 eixo hidráulico 94 abaixe sobre o pistão 92, de tal modo que a rápida libertação dos grampos encaixe o anel de retenção anular sobre o pistão. 0 processo de esmagamento, extracção e limpeza com lixívia é agora repetido.

Pelo acima mencionado, ficará evidente para os especialistas na arte que a prensa hidráulica 90 operada electricamente (o esmagador) permite a colheita das amostras de sangue ou plasma de um grande número de pacotes num período mínimo de tempo. O número de pacotes de amostras que pode ser esmagado por este aparelho é limitado, principalmente, pela escada do dispositivo e a pressão que pode ser desenvolvida pelo pistão de esmagamento contra a massas de pacotes de amostras contidas no cilindro. As 800 a 900 psi de pressão desenvolvidas pela prensa hidráulica da forma de realização ilustrada são suficientes para esmagar completamente até 64 pacotes contendo amostras do tipo descrito em relação à FIG. 2. Em concordância, combinações em larga escala compreendendo até 512 amostras podem ser formadas por 8 ciclos de funcionamento do esmagador da presente invenção. Isto proporcionaria uma redução significativa no tempo de formação de combinação em relação a um método em que 512 pacotes de amostras fossem alcançados individualmente por uma cânula para colher as amostras dos mesmos.

Além disso, ficará evidente para um especialista na arte que pode ser formada uma única combinação em larga escala, compreendendo até 512 amostras ou mais, de um aparelho esmagador feito suficientemente grande para acomodar 50 o número maior de pacotes de amostras no cilindro. A porção da prensa hidráulica também seria aumentada em tamanho para proporcionar uma maior força de esmagamento para superar a maior resistência do número acrescido de pacotes. Conforme foi mencionado acima, o tamanho da combinação só seria limitado pela escala desejada do esmagador.

Com referencia agora à FIG. 11, está ilustrado um fluxograma de uma metodologia de teste de PCR de acordo com a invenção que possibilita a identificação de uma doação especifica PCR positiva com o menor número de testes individuais. O processo começa no bloco 200 com a definição de um tamanho de combinação inicial apropriado que, por sua vez, depende de vários factores, tais como a frequência da ocorrência do vírus de interesse na população dadora em geral, a possível concentração final de ADN ou ARN virai depois da diluição na combinação, e outros.

Embora o teste de PCR seja altamente sensível e seja capaz de detectar um único virus numa amostra contaminada, um vírus tem de estar, necessariamente, presente na amostra para o teste de PCR proporcionar um resultado positivo. Se, por exemplo, uma amostra de uma doação contaminada, com uma concentração de vírus relativamente baixa, for combinada com um grande número de amostras não contaminadas, a concentração do vírus na combinação resultante pode ser tão baixa que há uma probabilidade estatística de não haver vírus presente numa amostra tomada da combinação para o teste de PCR. Tais 51 combinações podem, de facto, apresentar um resultado falso negativo para a contaminação virai.

Por exemplo, se uma amostra de 0,02 mL foi preparada de uma doação de plasma contaminada com vírus a uma concentração de 500 vírus por mL de amostra, a amostra de 0,02 mL compreenderia, em média, 10 vírus. Se esta amostra contaminada de 0,02 mL fosse combinada com aproximadamente 500 outras amostras de 0,02 mL de doações não contaminadas, a combinação de 10 mL resultante compreenderia vírus a uma concentração de 1 por mL. Em concordância, se uma amostra de 1 mL fosse tomada da combinação para o teste de PCR, há uma probabilidade estatística significativa de que a amostra para PCR não conterá vírus.

Tais baixas concentrações de contaminação por vírus apresentam uma ameaça pequena para produtos feitos de plasma, uma vez que se encontram disponíveis vários métodos para inactivar os vírus presentes em doações de concentração tão baixa. Estes métodos de inactivação virai incluem a utilização de solvente/detergente ou aquecimento acima de 60 °C durante um período de tempo apropriado, ou outros. Estes métodos, em geral, são descritos como sendo capazes de reduzir a concentração de vírus por um número de "unidades logarítmicas" (log). Por exemplo, o método de solvente detergente é capaz de reduzir a contaminação virai da hepatite C em pelo menos 107 por mL ou "7 unidades logarítmicas". Deste modo, os produtos de plasma, tais como factor VIII, factor IX ou complexo protrombina podem ser preparados a partir de doações de plasmas tratadas 52 rotineiramente, por exemplo, pelo método solvente detergente depois de ter tido um resultado negativo em teste de PCR.

Para os produtos sanguíneos, rotineiramente transferidos directamente para um recipiente, permanece algum pequeno risco de contaminação virai a uma baixa concentração, depois que estas doações apresentaram resultados negativos no teste de PCR.

Na forma de realização ilustrada em relação à FIG. 11, são avaliados os factores discutidos acima, tais como a frequência da ocorrência dos vírus de interesse na população dadora e a provável concentração do vírus depois da diluição. É concebida uma combinação para teste de PCR de primeiro nível apropriadamente dimensionada que minimiza a probabilidade estatística de que vírus presentes em baixas concentrações não serão detectados. A combinação é preparada no bloco 201 combinando os conteúdos de bolsas terminais de secções de tubo identificadas, da maneira descrita acima. No bloco 202 é realizado um teste de PCR no primeiro nível da combinação de PCR. O bloco 203 representa um ponto de decisão na metodologia da invenção que depende dos resultados do teste de PCR realizado no bloco 202. No caso de um resultado negativo, presume-se que todas as doações correspondentes a amostras utilizadas para compor o primeiro nível da combinação de PCR sejam livres de contaminação virai e libertadas para processamento adicional no preparo de 53 produtos farmacêuticos. Deste modo, a metodologia sai ao receber um resultado negativo de teste de PCR.

Quando o teste de PCR dá uma indicação positiva, isto indica que um contaminante virai se encontra presente em uma ou mais de uma das doações que compõem a combinação de primeiro nivel de PCR original. No bloco 204, uma bolsa de amostra adicional, a bolsa adjacente àquela que foi primeiro removida, é tomada dos segmentos de tubo que correspondem a doações compreendendo a combinação de primeiro nível de PCR original. Estas bolsas de amostras adicionais são divididas em dois subgrupos aproximadamente iguais, aqui designados A e B por razões de clareza.

Estes subgrupos são, então, combinados separadamente utilizando uma cânula separada, limpa, para formar cada combinação de subgrupo da mesma maneira descrita acima, e apenas uma das combinações de subgrupo é testada por PCR, conforme indicado no bloco 205. Para os fins da invenção, é irrelevante qual dos dois subgrupos é testado. No bloco 205, o subgrupo A é identificado como o subgrupo a ser testado, mas o subgrupo B poderia, do mesmo modo, ser designado sem perturbar a metodologia da invenção.

No bloco 206, é tomada uma decisão dependendo do resultado do teste de PCR da combinação do subgrupo A. No caso do subgrupo da combinação A ter resultado negativo para uma indicação virai por PCR, não são realizados testes adicionais nas amostras das doações que compreendiam o subgrupo A. Ao contrario, conforme indicado no bloco 207, as 54 próximas bolsas de amostras em sequência são tomadas dos segmentos de tubo que compreendiam o subgrupo B que são, então, por sua vez, divididas em dois subgrupos aproximadamente iguais A' e B'. Cada subgrupo neste passo compreende, aproximadamente, a metade do número de amostras compreendidas no subgrupo imediatamente anterior. Os conteúdos das bolsas de amostra do subgrupo são, uma vez mais, combinados separadamente da mesma maneira descrita acima. No caso do subgrupo A ter resultado PCR positivo, indicando que pelo menos uma das suas doações componentes estava contaminada por vírus, o outro subgrupo não-testado (subgrupo B na exemplo da FIG. 11) é agora testado por PCR no bloco 108 para confirmar que não é também PCR positivo. O subgrupo A torna-se agora o subgrupo adicionalmente subdividido em dois subgrupos aproximadamente iguais (A' e B'), conforme indicado no bloco 209.

No bloco 210, o teste de PCR é realizado apenas num dos subgrupos da combinação A' ou B', definidos no passo anterior 207 ou 209. O método agora repete e retorna ao bloco 206, em que o passo de decisão é aplicado aos resultados do teste de PCR realizado no bloco 210. Uma vez mais, se o resultado do teste de PCR for negativo para o subgrupo testado, o grupo não testado seria adicionalmente subdividido em dois subgrupos aproximadamente iguais, cada um compreendendo aproximadamente metade das amostras do subgrupo anterior. Se o subgrupo testado apresentasse um resultado PCR positivo, o subgrupo testado seria adicionalmente subdividido em dois subgrupos aproximadamente iguais, cada um dos quais compreenderia metade das amostras do subgrupo anterior. Neste 55 caso, o grupo não testado uma vez mais seria testado por PCR a fim de confirmar que também não era PCR positivo. A metodologia de teste continua a repetir dos bloco 206 até o bloco 210 até que o teste seja determinado como completo. O término do teste é definido quando uma divisão de subgrupo resulta na criação de dois subgrupos, cada um contendo apenas uma bolsa de amostra correspondente a uma única doação. Uma das amostras é testada por PCR no bloco 210 e, se o resultado for negativo, a outra amostra é identificada como pertencente a uma doação de plasma contaminada por virus. Se as amostras testadas tiverem resultados positivos, a amostra restante é, então, também testada por PCR a fim de confirmar que também não era PCR positivo.

Mediante o término de todos os testes, a metodologia da invenção termina no bloco 211. Deve ficar claro a partir do fluxograma da FIG. 11 que a metodologia de teste da invenção apenas exige que dois testes de PCR sejam realizados em cada nível de teste quando a combinação inicialmente testada apresenta resultado positivo: Um teste inicial para um dos dois subgrupos e um teste subsequente para confirmar que a combinação correspondente não testada inicialmente é, de facto, negativa. A metodologia de teste exige apenas um único teste de PCR em cada nível de teste quando a combinação testada inicialmente é negativa. A aplicação do sistema e método para testes de amostras da invenção será agora descrito com um tamanho de combinação 56 de teste de PCR específico, conforme representado na FIG. 12. Na FIG. 12, as bolsas terminais de 512 doações individuais foram formadas numa combinação de teste de PCR inicial em 212. Por razões de ilustração, será considerado que apenas uma das 512 amostras foi tomada de uma doação que estava contaminada por um vírus de interesse. 0 segmento de tubo representado na FIG. 12 que compreende 10 bolsas individuais e conectadas representa os segmentos de tubo originalmente conectados e tomados do recipiente de doação de plasma contaminado. A combinação de 512 amostras iniciais é testada por PCR e, por causa da presença da amostra contaminada, dá uma indicação virai positiva. No passo 213, duas combinações de 256 doações (256A e 256B) são preparadas a partir das bolsas sequenciais seguintes dos segmentos que compõem a combinação positiva anterior. A combinação 256B é agora testada por PCR e, conforme representado na FIG. 12, dá uma indicação virai negativa, indicando, deste modo, que a combinação 256A contém uma amostra da doação contaminada.

No passo 214, duas combinações de 128 doações são preparadas a partir das bolsas sequenciais seguintes dos segmentos que compunham a combinação 256A. Assim, de acordo com a invenção, a combinação 256A foi subdividida sem ter sido testada por PCR. No passo 203, sabe-se agora que a combinação 128A inclui uma bolsa de amostra da doação contaminada. A combinação 128B é, então, subdividida em duas combinações de 64 doações (64A e 64 B) pela remoção da bolsa 57 sequencial seguinte daqueles segmentos de tubo cujas bolsas anteriores compunham a combinação 128B. A seguir, a combinação 64B é testada por PCR e, no exemplo da FIG. 12, dá uma indicação virai positiva. Neste caso, o teste de PCR é realizado na combinação 64A a fim de verificar que é, de facto, negativa e que não há amostras contaminadas adicionais presentes para além daquelas na combinação 64B. No passo 216, a combinação 64B é adicionalmente subdividida em duas combinações de 32 doações, 32A e 32B, pela remoção da bolsa sequencial seguinte dos segmentos de tubo utilizados para compor a combinação 64B anterior. A combinação 32B é testada por PCR, dá uma indicação virai negativa, conforme indicado, e a combinação 32a é, portanto, adicionalmente subdividida em duas combinações de 16 doações, 16Α e 16B. Uma vez mais, as combinações de 16 doações são preparadas pela remoção da bolsa de amostra sequencial seguinte dos segmentos de tubo que compuseram a combinação positiva anterior, 32A.

No passo 217, a combinação 16B é testada por PCR e dá uma indicação virai positiva. Deste modo, a combinação 16A é testada por PCR a fim de confirmar que é negativa e que todas as amostras contaminadas estão presentes na combinação 16B.

Em 218, a combinação 16B é subdividida em duas combinações de 8 doações, 8A e 8B, pela remoção da bolsa de amostra sequencial seguinte dos segmentos de tubo que compuseram a combinação positiva anterior, 16B. A combinação 8B é, então testada por PCR e, conforme ilustrado, dá uma 58 indicação virai negativa, indicando que a combinação 8A contém uma amostra de uma doação contaminada. A combinação 8A é, então, adicionalmente subdividida em duas combinações de 4 doações, 4A e 4B, no passo 219. 0 teste de PCR é realizado na combinação 4B que dá uma indicação negativa, indicando, deste modo, que a combinação 4A contém uma amostra de uma doação contaminada. A combinação 4A é, então, subdividida, em 220, nas combinações 2A e 2B da mesma maneira descrita acima. Depois do teste de PCR, a combinação 2A dá uma indicação virai negativa indicando que uma das duas amostras que compreendem o grupo 2B foi tomada de um segmento de tubo de uma doação contaminada correspondente.

No passo 221, as doações individuais são testadas pela remoção da bolsa final dos segmentos de tubo que compuseram o grupo 2B. As doações individuais finais são testadas por PCR a fim de identificar a doação positiva especifica, que é, então, removida do armazenamento e descartada de forma apropriada. As 511 doações restantes livres de virus são retidas para processamento adicional no preparo de produtos farmacêuticos.

No exemplo acima, uma única doação contaminada foi especificamente identificada de um grupo de 512 destas doações, por meio da realização de apenas 13 testes de PCR separados, incluindo o teste de PCR primário na combinação de 512 doações originais. O método da invenção possibilita omitir um teste de PCR numa subcombinação em particular, desde que a subcombinação testada correspondente dê uma indicação virai negativa. Omitindo, deste modo, certos testes 59 de PCR, o método da invenção reduz o número de testes de PCR que têm de ser realizados a fim de identificar uma doação positiva especifica, sem sacrificar a resolução da metodologia de teste de PCR. Por meio do método da invenção, todas as doações positivas serão identificadas, mas sem exigir que todas as doações sejam testadas. A partir da forma de realização exemplificativa da FIG. 12, ficará claro que qualquer um dos subgrupos sucessivamente menores podem ser testados por PCR e que a posição arbitrária da amostra positiva pode variar. Deste modo, se uma amostra da doação positiva estivesse presente em cada subcombinação inicialmente testada, 18 testes seriam necessários para identificar especificamente a doação positiva (um teste inicial que dá uma indicação positiva e um teste adicional para assegurar que a subcombinação correspondente é negativa) .

Da mesma maneira, se cada subcombinação testada inicialmente der uma indicação negativa, 10 testes seriam necessários para identificar a doação positiva. Na prática, os resultados de testes positivos e negativos nas subcombinações tenderiam a distribuir-se igualmente, assim, 14 teste em média seriam necessários para identificar uma doação especificamente positiva de uma combinação de doação inicial para 512 unidades.

Assim sendo, é evidente pelo acima declarado que o sistema e método da presente invenção, incluindo o fornecimento de segmentos de tubo compreendendo bolsas 60 individuais e conectadas, cada uma contendo uma amostra de uma doação de plasma, são vantajosos em proporcionar uma multiplicidade de combinações de teste de PCR. Ao contrário da preparação de combinação convencional, na qual uma sequência de combinações iniciais e subsequentes são formadas de uma única amostra de cada doação ao mesmo tempo, a presente invenção possibilita a formação de combinação de teste imediatamente antes do teste. Esta maneira de formação de combinação "no momento exacto" permite a construção de combinações de testes de bolsas individuais apenas quando necessário. A possibilidade de contaminação é eliminada, uma vez que as combinações são construídas em momentos diferentes, cada uma a partir de bolsas de amostras vedadas. Além disso, as bolsas de amostras permanecem congeladas até serem necessárias para desenvolver uma combinação de teste. São evitados os ciclos múltiplos de congelação-descongelação, que podem afectar, de forma adversa, a recuperação do ADN ou ARN de interesse, assegurando, deste modo, a integridade do teste de PCR.

Embora o método acima descrito seja eficaz para a identificação de uma doação virai positiva com o menor número possível de testes de PCR relativamente dispendiosos, são também proporcionados outros métodos para a identificação de doações virais positivas de acordo com a prática da presente invenção. Em particular, um destes métodos têm a propriedade de serem capaz de identificar doações positivas individuais com dois a três ciclos de teste de PCR, reduzindo, deste modo, de forma significativa, a quantidade de tempo e as 61 despesas necessárias para rastrear um grande número de doações.

Por exemplo, no método acima descrito, uma vez que uma subcombinação em particular tenha sido identificada como contendo uma doação positiva, um técnico tem de identificar aquelas doações que contribuíram com amostras para formar aquela subcombinação em particular. Estas doações, então, têm de ser revisitadas e um pacote de amostra adicional tem de ser colhido de cada segmento de tubo correspondente. Duas combinações da próxima geração têm, então, de ser formadas e o teste de PCR repetido. Esta colheita, formação de subgrupo de combinação e processo de teste de PCR é repetido para subcombinações de gerações cada vez mais pequenas até que o método identifique especificamente a doação contaminada por vírus.

No entanto, uma quantidade significativa de tempo é consumida em cada ciclo de teste de PCR (colheita, formação de combinação de subgrupo e teste de PCR). Tomando a combinação de primeira geração de 512 amostras como exemplificativa, ficará evidente que pelo menos 10 ciclos de teste de PCR serão necessários para identificar uma doação contaminada por vírus específica. Embora altamente económico, o método acima descrito pode apresentar desafios para um laboratório de teste de PCR quando o tempo é vital.

Uma metodologia para identificar especificamente doações virais positivas de sangue ou plasma no menor número 62 de ciclos de teste de PCR será agora descrita em relação às FIGs. 13 e 14.

Com referência agora à FIG. 13, está representado um fluxograma de uma metodologia de teste de PCR de acordo com a invenção, para a eficaz detecção de uma doação individual PCR positiva numa combinação com o número mínimo de ciclos de análise. Como foi o caso com o método de teste de PCR descrito anteriormente, o método da FIG. 13 supõe que o teste de PCR tenha sensibilidade suficiente para detectar a presença de uma amostra positiva numa combinação de tamanho apropriado. Apenas por razões de ilustração, a agrupamento inicial foi seleccionado para representar 512 doações de sangue ou plasma. Será entendido pelos especialistas na arte que o tamanho do agrupamento inicial pode ser maior ou menor dependendo do marcador de genoma a ser avaliado, a sensibilidade do procedimento de teste de PCR utilizado, o valor de expectativa da concentração do marcador de genoma numa alíquota de amostra e o tamanho da alíquota de amostra. 0 método começa no bloco 301 definindo uma matriz ou grelha de amostra N-dimensional. A matriz pode ser de qualquer tamanho e compreender qualquer número de dimensões de 2 a N, mas, preferencialmente, é uma matriz tridimensional regular, organizada como um quadrado.

Um exemplo deste tipo de matriz está representado na FIG. 14, que é uma ilustração gráfica de uma matriz quadrada, caracterizada por índices tridimensionais; fila, coluna e camada (r,c,s). Na matriz exemplificativa da FIG. 14 há 3 63 filas, 3 colunas e 3 camadas, definindo, deste modo, 33, ou 27 elementos. Na forma de realização exemplificativa, uma fila é considerada como compreendendo todos os elementos definidos tomando uma secção vertical imaginária através da matriz regular quadrada. Na forma de realização da FIG. 14, os elementos que compreendem, por exemplo, a fila 3 da matriz são identificados pela letra r3 nas suas faces de fila.

Do mesmo modo, uma coluna compreende todos os elementos da matriz definidos tomando uma segunda secção vertical imaginária através da matriz, numa direcção ortogonal à direcção de uma fila. Na forma de realização exemplificativa da FIG. 14, os elementos que compreendem, por exemplo, a coluna 1 têm a letra Ci nas suas faces de coluna. Uma camada é definida como todos os elementos que compreendem uma secção horizontal tomada através da matriz exemplificativa da FIG. 14. Da mesma maneira que para a fila e coluna, a definição dos elementos que compreendem a camada 1 são identificados com a letra si nas suas faces de camada.

Portanto, pode-se observar que cada um dos 27 elementos na matriz da FIG. 14 pertencem especif icamente a 1 de 3 filas, 1 de 3 colunas e 1 de 3 camadas. Matematicamente, isto pode ser expresso pela relação Xrcs, onde X indica um elemento e rcs é um índice dimensional, onde cada um dos índices pode tomar um valor de 1 a 3. 0 elemento específico Xn3 pode ser identificado como aquele elemento na intersecção da fila 1, coluna 1 e camada 1. 64

Pelo acima declarado, ficará evidente que, embora a matriz exemplificativa da FIG. 14 seja uma matriz 3x3x3, os princípios de definição de matriz e formação de elemento mantém-se para matrizes com um número muito maior de filas, colunas e camadas. Em particular, uma matriz de 8 filas, 8 colunas, 8 camadas ainda pode ser representada matematicamente como Xrcs, onde rc e s podem agora tomar os valores de 1 a 8. Deste modo, uma matriz tridimensional 8x8 x 8 é capaz de acomodar identificadores para 512 elementos.

De volta agora ao fluxograma do método da FIG. 13, seguindo a definição de uma matriz de amostra N-dimensional, amostras específicas de doações de sangue ou plasma são mapeadas para cada um dos elementos definidos pela matriz. Numa matriz tridimensional 8x8x8, uma amostra de cada uma das 512 doações individuais está associada a um elemento de matriz e identificado por um indicador de Xrcs correspondentes, específico.

Em seguida, uma alíquota é tomada de cada amostra, e é formada uma multiplicidade de combinações de subgrupos menores. Cada combinação menor compreende as alíquotas de todas as amostras (Xrcs) em que 1 dos índices dimensionais é fixo. Em outras palavras, de acordo com a matriz exemplif icativa acima descrita, todas as amostras (Xrcs) que têm r=l, independentemente do valor de coluna ou camada, são formadas numa combinação menor; do mesmo modo para r=2, r=3...r=N; do mesmo modo para c=l, independentemente do valor da fila ou camada, c=2,...c=N; do mesmo modo para s=l, independentemente do valor da fila ou camada, s=2...s=N. Cada 65 combinação menor assim representa cada fila, coluna, camada ou outro índice dimensional, de tal modo que se uma matriz N-dimensional for definida, haverá N-dimensões vezes o (número total de amostras)1/n de cominações menores. Para a matriz tridimensional 8x8x8 contendo 512 amostras, haverá 24 combinações de subgrupos menores (combinações de 8 filas, combinações de 8 colunas e combinações de 8 camadas). A criação de combinações menores, de acordo com a invenção, pode ser vista como sendo similar ao método matemático de reduzir uma determinante pelo método de menores. De maneiras idêntica, cada amostra será entendida como sendo representada em combinações menores N, 1 para cada dimensão da matriz.

Para além de formar as combinações menores, uma alíquota de cada amostra, ou uma alíquota de cada uma das combinações menores, é combinada para formar uma combinação principal única que contém uma amostra de todas as 512 doações que compreendem o espaço da presente invenção. Depois de todas as combinações terem sido formadas, quaisquer amostras restantes e combinações menores e a combinação principal podem ser recongeladas e armazenadas até o momento em que for desejado o teste de PCR.

Quando o teste de PCR for desejado, um teste de PCR é primeiro realizado na combinação principal que representa uma alíquota de cada amostra que compreende a matriz. Se os resultados do teste da combinação principal forem negativos, pelo menos ao nível de sensibilidade do teste de PCR, não há doações virais positivas representadas pelas amostras que formam a matriz. As doações de sangue ou plasma que 66 contribuíram para as amostras da matriz podem ser liberadas para utilização adicional. No entanto, se o teste de PCR da combinação principal for positivo para um marcador de genoma em particular, um segundo ciclo de teste de PCR tem início, em 300, no qual cada uma das combinações menores são agora testadas.

De uma maneira similar à descrita acima, as combinações principais seleccionadas de tal modo que a probabilidade estatística das mesmas têm mais de uma amostra positiva na combinação principal (as 512 amostras) é pequena, preferencialmente inferior ala 2%. Isto pode ser realizado pela avaliação da frequência de ocorrência dos vírus de interesse na população dadora em geral a um nível de confiança de 98% a 99%. Por exemplo, se for determinado que apenas 1 dador de uma população de dadores em geral de 1.000 estiver contaminado com o vírus de interesse a um nível de confiança de 98%, há uma probabilidade de 2% de ser encontrado mais de 1 dador contaminado nos próximos 1.000 dadores a serem avaliados. Isto assegura que o algoritmo, de um modo geral, será capaz de identificar a unidade reactiva única numa combinação de tamanho aproximado no ciclo de teste de PCR. De acordo com a invenção, dada uma única amostra positiva na matriz, 3 das combinações menores conterão uma alíquota da doação positiva, 1 em cada dimensão. Na forma de realização exemplificativa (a matriz de 512 amostras) há 8 combinações de fila menores, 8 combinações de coluna menores e 8 combinações de camada menores. Se a combinação principal apresentar um resultado positivo, então a combinação de 1 fila, 1 coluna e 1 camada apresentarão resultado positivo 67 durante o segundo ciclo de teste de PCR conforme ilustrado em 307. A intersecção do indice de elemento de fila, coluna e camada identifica de forma inequívoca a doação reactiva, conforme ilustrado em 309.

Como exemplo, se a amostra reactiva tiver sido mapeada no elemento de matriz Xm, a combinação menor da fila 1 dará um resultado de teste de PCR positivo, enquanto a fila 2 e subsequentes combinações menores de fila darão um resultado negativo. Além disso, a combinação menor da coluna 1 dará uma resultado de teste positivo, enquanto a coluna 2 e subsequentes combinações menores de coluna darão um resultado negativo. Do mesmo modo, as combinações da camada 1 e 2 darão um resultado negativo, a combinação da camada 3 dará um resultado positivo e as subsequentes combinações menores de camada darão resultado negativo. As 3 combinações menores positivas (fila 1, coluna 1 e camada 3) têm apenas um único elemento em comum, X113. Deste modo, a doação positiva é identificada especificamente como representada pela amostra mapeada no elemento Xm.

Se houver mais de uma doação reactiva na matriz, as doações reactivas ainda podem ser identificadas de forma inequívoca pelo método da invenção, por não mais do que um ciclo de teste de PCR adicional. Se for observado que mais de 1 combinação menor de um índice dimensional único dá um resultado de teste positivo, enquanto apenas uma combinação menor que representa cada um dos índices dimensionais dá um resultado de teste positivo, a mais de 1 doação positiva pode ser identificada de forma inequívoca avaliando-se 68 matematicamente os resultados de teste sem a necessidade de uma terceiro ciclo de teste de PCR.

Por exemplo, se uma combinação menor de fila 1, e nenhuma outra, apresentar um resultado positivo; uma combinação menor de coluna 1 e nenhuma outra, apresentar resultado positivo; e uma combinação menor de camada 1 e combinação menor de camada 3 ambas apresentarem resultados positivos, só há duas doações positivas que compreendem a matriz e estas podem ser identificadas de forma inequívoca como Xin e X113. Nenhum teste adicional é necessário para chegar a este resultado.

Se, por outro lado, observa-se que combinações menores múltiplas apresentam resultado positivo e a sua identidade muda ao longo de índices bi-dimensional conforme ilustrado em 310, ficará evidente que haverá z elementos identificados como potencialmente mapeados a uma doação positiva, onde z é 0 número real de doações positivas que compreende a grelha.

Por exemplo, se a combinação menor da fila 1 e nenhuma outra, apresentar resultado positivo; as combinações menores da coluna 1 e 3 apresentarem resultados positivos; e as combinações menores da camada 1 e 3 apresentarem resultados positivos, isto sugere que os elementos candidatos a potencialmente positivos são Xm, X113, Xm e X133. Uma vez que há um múltiplo em apenas dois dos índices dimensionais (coluna e camada) e para elementos candidatos, será observado que há apenas duas doações reais positivas que compreendem a matriz. Nestas circunstâncias, todas as 4 doações podem ser 69 identificadas arbitrariamente como sendo positivas e descartadas ou, alternativamente, uma alíquota pode ser tomada de cada um dos 4 elementos candidatos e serem individualmente testadas por PCR durante o terceiro ciclo de teste de PCR em 311, a fim de identificar especificamente que 2 das 4 compreendem as doações positivas reais.

Da mesma maneira, é matematicamente evidente que se houverem mais de 2 doações positivas na matriz e os seus identificadores variam em mais de duas dimensões, haverá, no máximo, zn elementos candidatos potencialmente positivos identificados, onde z é o número real de doações positivas e onde n é o número de dimensões que variam. Nesta circunstância, são tomadas aliquotas de todos os elementos suspeitos na matriz e testados directamente.

Assim, pode-se observar que o método da invenção permite a identificação inequívoca das doações que são reactivas para um marcador de genoma em particular num único ciclo de teste de PCR para uma combinação principal inicialmente positiva, em 2 ciclos de teste de PCR para todas as matrizes que contêm uma única doação reactiva ou uma multiplicidade de doações reactivas que variam ao longo de um único indice dimensional e em 3 ciclos de teste de PCR para qualquer outra situação.

Em concordância, a prática da presente invenção resulta no fornecimento de sangue e produtos de sangue e plasma preparados da mesma, sendo substancialmente mais seguro pelo facto de ser o mais livre possível de contaminação virai. Com 70 vantagem, testes económicos, de alta sensibilidade são prontamente realizados, directamente, para detecção da presença de um vírus. Deste modo, são evitadas as indicações falsas de contaminação por vírus habitualmente associadas a teste de anticorpos durante o período de janela de infectividade. Além disso, a presente invenção permite a utilização económica de testes de alta sensibilidade que são capazes de detectar a presença de um único vírus na amostra de teste, deste modo, auxiliando a assegurar a liberdade do fornecimento de sangue de contaminação virai incipiente.

Os especialistas na arte entenderão que os exemplos e descrições acima mencionados de várias formas de realização preferidas da presente invenção são meramente ilustrativos da invenção como um todo e que variações em formato, tamanho e número de vários componentes da presente invenção, bem como tipos de testes implementados, podem ser realizados dentro do âmbito da invenção. Por exemplo, ficará evidente para um especialista na arte que o comprimento das bolsas individuais e conectadas, e, portanto, o seu teor volumétrico, pode ser aumentado progressivamente ao longo do comprimento do segmento de tubo. À medida que subcombinações de teste sucessivas são formadas de um número cada vez menor de amostras, o volume de plasma que compreende a combinação necessariamente diminui. Deve ser entendido que a fim de manter um volume suficiente de plasma em cada subcombinação sucessiva, bolsas de amostras sucessivas podem conter um volume maior a fim de acomodar um volume de combinação final desejado. A fim de acomodar combinações que variam em tamanho de cerca de 1 mL a cerca de 10 mL, ficará claro que os 71 volumes de bolsas de amostra sucessivas aumentarão de cerca de 0,02 mL para cerca de 0,5 mL, em passos progressivos. Numa forma de realização exemplificativa, o volume da bolsa é de 0,02 mL na primeira bolsa a ser utilizada na combinação maior e é de 0,2 mL na bolsa final.

Ficará também claro para os especialistas na arte que o sistema da invenção não está limitado ao recipiente de recolha de plasma exemplificativo e um segmento de tubo associado. Bolsas de sangue ou outros recipientes de fluidos biológicos podem ser utilizados com igual facilidade e segmentos de tubo adequados podem ser ligados às mesmas tanto antes da colheita do fluido como depois da colheita do fluido estar completa. Tudo que é necessário é que as quantidades de amostra de fluidos biológicos sejam transferidas para um segmento de tubo que é, então, formado em bolsas de acordo com a prática da invenção.

Em concordância, a presente invenção não está limitada às formas de realização especificas aqui descritas, mas é definida pelo âmbito das reivindicações apensas.

Lisboa, 22 de Dezembro de 2008

Claims (19)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificar especificamente doações de fluido biológico que apresentam resultado virai positivo, o método compreendendo: proporcionar uma multiplicidade de doações de fluidos biológicos; definir uma matriz n-dimensional, em que n é um número inteiro, a matriz compreendendo ainda uma multiplicidade de elementos internos, cada elemento definido por uma intersecção das n-dimensões da matriz, cada elemento individual identificado por uma respectiva notação matricial, a notação matricial compreendendo um índice para cada dimensão do arranjo; tomar uma amostra de cada uma das doações de fluido biológico; mapear cada amostra em relação a uma amostra em particular respectiva de cada elemento da matriz, cada amostra individual identificada pela sua notação matricial respectiva do elemento correspondente; tomar alíquotas de cada amostra, o número de alíquotas tomado de cada amostra definido pelo número de dimensões que caracteriza a matriz; formar subcombinações das alíquotas de cada amostra, cada subcombinação contendo uma alíquota de todas as amostras identificadas por uma notação matricial em que um índice dimensional é fixo, cada subcombinação 2 respectiva identificada pelo referido indice dimensional fixo; testar cada subcombinação por meio de um teste de PCR para detecção de indicação virai; determinar os respectivos índices dimensionais das subcombinações que dão uma indicação virai positiva; e combinar os referidos índices dimensionais numa notação matricial, deste modo identificando de modo inequívoco um elemento único de matriz definido pela notação matricial, deste modo, identificando de forma inequívoca uma amostra virai especificamente positiva.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a matriz é uma matriz regular e cada uma das n-dimensões da referida matriz é caracterizada por um número inteiro, igual, de elementos.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a matriz regular compreende uma matriz tridimensional, a matriz adicionalmente subdividida em filas, colunas e camadas e, em que cada elemento é caracterizado por uma notação matricial, Xrcs, onde os índices dimensionais r, c e s, respectivamente, identificam elementos que compreendem uma fila, uma coluna e uma camada da matriz.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o passo de formação de subcombinações compreende ainda: 3 formar subcombinações das amostras identificadas por índices r idênticos, mas índices c e s diferentes; formar subcombinações das amostras identificadas por índices c idênticos, mas índices r e s diferentes; formar subcombinações das amostras identificadas por índices s idênticos, mas índices r e c diferentes; avaliar cada uma das subcombinações de r, c e s para detecção de uma indicação virai positiva dada por teste de PCR.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo ainda os passos de: determinar o índice numérico inteiro de cada subcombinação r que deu uma indicação virai positiva; determinar o índice numérico inteiro de cada subcombinação c que deu uma indicação virai positiva; e determinar o índice numérico inteiro de cada subcombinação s que deu uma indicação virai positiva;

6. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo ainda o passo de substituir os índices numéricos inteiros de cada subcombinação r, c e s que deram uma indicação virai positiva para os índices dimensionais r, c e s da notação matricial, deste modo, identificando um elemento de matriz específico pela referida notação matricial, identificando assim especificamente a amostra virai positiva correspondente. 4

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a matriz tridimensional compreende uma matriz regular 8x8x8, os indices dimensionais r, c e s, cada um tomando valores numéricos inteiros de 1 a 8.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que três alíquotas são tomadas de cada amostra respectiva das doações de fluido biológico.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, compreendendo ainda os passos de: formar subcombinações de oito filas, cada fila especificamente identificada por um número inteiro de 1 a 8, cada fila formada de 64 alíquotas de amostras; formar subcombinações de oito colunas, cada coluna especificamente identificada por um número inteiro de 1 a 8, cada fila formada de 64 alíquotas de amostras; e formar subcombinações de oito camadas, cada camada especificamente identificada por um número inteiro de 1 a 8, cada camada formada de 64 alíquotas de amostras.

10. Método para identificar especificamente doações de fluido biológico que apresentam resultado virai positivo, o método compreendendo: proporcionar uma multiplicidade de doações de fluidos biológicos; 5 definir uma matriz n-dimensional, em que n é um número inteiro, a matriz compreendendo ainda uma multiplicidade de elementos internos, cada elemento definido por uma intersecção das n-dimensões da matriz, cada elemento individual identificado por uma respectiva notação matricial Xliiin, em que o índice inferior da notação matricial define os índices dimensionais do arranjo; tomar N alíquotas de cada amostra de cada uma das doações de fluido biológico, o número de alíquotas tomadas de cada amostra definido pelo número de índices dimensionais compreendendo o arranjo; formar subcombinações das alíquotas de cada amostra, cada subcombinação compreendendo uma alíquota de todas as amostras identificadas por uma notação matricial na qual um índice dimensional é fixo; testar cada subcombinação por meio de teste de PCR para indicação virai; e e avaliar as marcas dimensionais de cada subcombinação que deu uma indicação virai positiva no primeiro teste de PCR, de acordo com uma redução pelo método dos menores, a avaliação identificando um elemento específico definido pela marca dimensional de cada subcombinação positiva se apenas uma única subcombinação que representa cada índice dimensional der uma indicação virai positiva, identificando assim de forma inequívoca, uma amostra virai positiva. 6

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a matriz é uma matriz regula, tridimensional, a matriz ainda dividida em filas, colunas e camadas e, em que cada elemento é caracterizado por uma notação matricial XrCsf onde os índices dimensionais r, c e s, respectivamente, identificam elementos que compreendem uma fila, uma coluna e uma camada da matriz.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a avaliação das marcas dimensionais identifica uma multiplicidade de elementos definidos pela marca dimensional de cada subcombinação positiva, se mais de uma subcombinação de um único índice dimensional der uma indicação virai positiva enquanto apenas uma subcombinação que representa cada um dos índices dimensionais restantes dá uma indicação virai positivo, identificando assim de forma inequívoca mais de uma amostra virai positiva específica.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a avaliação das marcas dimensionais identifica zn elementos candidatos virais positivos se subcombinações múltiplas que representam cada índice dimensional dão uma indicação virai positiva, onde z representa o número real de amostras virais positivas e onde n representa o número de dimensões que têm subcombinações positivas múltiplas.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, compreendendo ainda o passo de tomar uma alíquota adicional de cada 7 amostra identificada para cada um dos elementos candidatos virais positivos zn: testar as alíquotas por meio de um segundo teste de PCR para detecção de indicação virai; e identificar de forma inequívoca todas as amostras virais positivas.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o passo de formação de subcombinações compreende ainda: formar subcombinações das amostras identificadas por índices r idênticos, mas índices c e s diferentes; formar subcombinações das amostras identificadas por índices c idênticos, mas índices r e s diferentes; formar subcombinações das amostras identificadas por índices s idênticos, mas índices r e c diferentes; avaliar cada uma das subcombinações de r, c e s para detecção de uma indicação virai positiva dada por teste de PCR.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda os passos de: determinar o índice numérico inteiro de cada subcombinação r que deu uma indicação virai positiva; determinar o índice numérico inteiro de cada subcombinação c que deu uma indicação virai positiva; e 8 determinar o índice numérico inteiro de cada subcombinação s que deu uma indicação virai positiva;

17. Método de acordo com a reivindicação 16, compreendendo ainda o passo de substituir os índices numéricos inteiros de cada subcombinação r, c e s que deram uma indicação virai positiva para os índices dimensionais r, c e s da notação matricial, deste modo, identificando um elemento de matriz específico pela referida notação matricial, identificando assim especificamente a amostra virai positiva correspondente.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a matriz tridimensional compreende uma matriz regular 8x8x8, os índices dimensionais r, c e s, cada um tomando valores numéricos inteiros de 1 a 8.

19. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda os passos de: formar subcombinações de oito filas, cada fila especificamente identificada por um número inteiro de 1 a 8, cada subcombinação de fila formada de 64 alíquotas de amostras; formar subcombinações de oito colunas, cada subcombinação de coluna especificamente identificada por um número inteiro de 1 a 8, cada subcombinação de fila formada de 64 alíquotas de amostras; e formar subcombinações de oito camadas, cada camada especificamente identificada por um número inteiro de 9 1 a 8, cada subcombinação de camada formada de 64 alíquotas de amostras. Lisboa, 22 de Dezembro de 2008 1/16

2/16

3/16 éZg.ZA

4/16

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10/16 FIG.8

11/16 FIG.9 a ΙΊ,'., I f 113 111 110 7 I eJd FIG.9b 111

12/16 FIG. 10

102 13/16 FIG. 11

212 14/16 Λ A 213 214 215 216 217 218 219 220 221

Ϊ iII

FIG. 12

15/16 FIG. 13 •301 Definir matriz de amostra N-dimensional ΙΖ“302 Mapear amostras em cada elemento xrcs t ^303o ,*-3Q3b 1 ,-303c ,*-304 Formação de combinação principal ,*-305 Formação de subcombinações de todas as amostras identificadas por Formação de subcombi nações de todas as amostras identificadas por Formação de subcombi nações de todas as amostras identificadas por X1CSX2CSXIVÍCS xns xr2s * xrNs xrci xrc2xrcN Combinação principal Se L------ | 1 1 para teste de PCR posfvo J^1nR 1 1 1 Teste de PCR das 1 __1 1 1 Fim subcombinações r,c,s I Determinar ID de combinações r positivas T Determinar ID de combinações c positivas >307 Determinar ID de combinações s positivas Se > 1 índice tiver > 1 subcombinação positiva Se nenhum índice tiver > 1 subcombinação positiva Se apenas 1 índice tiver > 1 subcombinação positiva Testar individualmente todas as amostras candidatas Z"3U9" Determinar ID de Doações positivas Fim xris 16/16 FIG. 14 XI CS X2CS X3CS