PT97328A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas lipossomais contendo peptidos, de longa duracao de actuacao - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESEL-LSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Paul-Gerhard Kibat e Dr. Jíirgen Kurt Sandow, residentes na República Federal Alemã), para "PROCESSO PARA A PREPARAgSO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS LIPOSSO-MAIS CONTENDO PÉPTIDOS, DE LONGA DURAgSO DE ACTUAÇ£0».

Descrição A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas lipossomais contendo péptidos, de longa duração de actua-çâo, para administração por via parentérica. As composições de acordo com a presente invenção são administradas subcutaneamen-te (s.c.) ou intramuscularmente (i.m.) e têm uma duração de ac-tuação superior a 14 dias. A invenção refere-se ainda ao processo para a preparação destas composições farmacêuticas.

Os lipossomas são partículas submicroscópicas de forma aproximadamente esférica oca. Possuem uma membrana dupla que é constituída por moléculas anfifílicas, na maior parte dos casos, de fosfolípidos e rodeia um espaço interior aquoso. Eles são feitos de um material análogo ao corpo humano, podem funcionar como veículo das mais diferentes substâncias activas e satisfazem requisitos específicos. Os ingredientes activos hidro-fílicos são encerrados na sua maior parte no volume interno a-quoso, enquanto os ingredientes activos lipofílicos na sua mai-. or parte são ligados à membrana. 1

Os lipossomas são propostos como sistema veicular para um grande número de ingredientes activos tais como, por exemplo, citostáticos, anti-infecciosos e imunomoduladores (por exemplo, Μ. B. Yatvin e P. I. Lelkes, Med. Phys. 9, (1982)). As composições farmacêuticas lipossomais utilizam-se principalmente por via parentérica, preferindo-se muitas vezes a administração por via intravenosa. 0 objectivo é, na maior dos casos, a obtenção de um efeito de depósito, a redução dos efeitos secundários ou o aumento da actividade. Depois da injec ção por via intravenosa, os lipossomas, como todos os sistemas coloidais, são absorvidos pelas células do sistema reticuloen-dotelial, são eliminados com um tempo de semiduração máximo igual a 2 dias e de preferência acumulam-se no fígado e baço (J. H. Sénior, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 3, 123 (1987)). Depois da injecção subcutânea ou intramuscular, em comparação com a injecção intravenosa, obtêm-se níveis de actuação durante mais tempo. No caso das composições lipossomais, a duração de actuação depende da libertação da substância activa a partir das vesículas e do seu transporte a partir do sítio da injecção assim como da degradação das vesículas. A libertação da substância activa assim como a degradação das vesículas são sobretudo determinadas pela composição da membrana dos lipossomas, enquanto o transporte depende do tamanho das partículas, istoé, aumenta com a diminuição dos tamanhos das partículas (Arrowsmith et al., Int. J. Pharm. 20, 347--362 (1984)). Um outro factor é a concentração de lípidos existente na composição farmacêutica (A. J. Jackson, Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 27, 293 (1980)).

Os ensaios descritos nas publicações anteriormente indicadas sobre a administração i.m. ou s.c. de substâncias veiculares lipossomais em nenhum caso mostraram uma libertação da substância activa ou uma permanência da composição farmacêutica no local de administração durante mais do que 14 dias. Antes pelo contrário, os ensaios farmacodinâmicos sobre estas composições farmacêuticas lipossomais com diferentes composições das vesículas e com diferentes ingredientes activos mos-• traram que no intervalo de tempo de 14 dias ou termina a liber- 2

tação do ingrediente activo ou os lipossomas são degradados durante este intervalo de tempo.

As composições farmacêuticas lipossomais para injec-ção s.c. ou i.m. de péptidos já foram descritas. Por exemplo, na Patente de Invenção Britânica GB-B-2 050 287 refere-se uma formulação lipossomal para a libertação de insulina durante um longo prazo. 0 Pedido de Patente de Invenção Internacional com o Número de Publicação Wo 87/04592 refere-se a um sistema veicular lipossomal para moléculas que não atravessam a membrana -no exemplo, calcitonina - o qual consiste numa mistura de SUV de pequenas dimensões que contêm a substância activa (lipossomas unilamelares, tamanho das partículas cerca de 30 - 100 nm) com MLV de grandes dimensões (vesículas multilamelares, tamanho das partículas cerca de 200 - 10000). Fukunaga et al. (Endocri-nology 115, 757 (1984)) descreve um efeito hipocalciémico prolongado de calcitonina depois da encapsulagem lipossómica da proteína. Correspondentemente aos exemplos referidos nesta publicação, em nenhum caso se conseguiu detectar uma actividade durante mais do que 14 dias.

Para péptidos como por exemplo análogos de LHRH (hormona de libertação da hormona luteinizante), descrevem-se formulações de actuação durante longos períodos de tempo à base de polímeros degradáveis (veja-se, por exemplo, as Publicações das Patentes de Invenção Europeias EP-B-0 052 510 e EP-B-0 145 240 relativamente a microcápsulas e EP-B-0 058 481 para outros sistemas de libertação controlada). A Patente de Invenção Europeia Ep-A-0 299 402 descreve formulações de longa duração de actuação de análogos de LHRH com actividade antagonista.

Enquanto nas memórias descritivas das 4 patentes de invenção acima mencionadas não se mencionam formulações lipossomais, a Patente Britânica GB-B-2 050 287 refere-se a uma composição lipossomal que contém LHRH e que, ao contrário das composições de acordo com a presente invenção contém moduladores da libertação e tem um semitempo de eliminação igual a cerca de 4 dias depois de injecção s.c..

Lipossomas como sistemas veiculares para LHRH foram - 3 -

também descritos por Schàfer et al. (Pharmazie 42, 674 (1987) e Pharmazie 42, 689 (1987)). Eles prepararam MLV a partir de misturas de lecitina de ovo e de ácido fosfatídico e investigaram a farmacocinética depois da administração i.m. a coelhos e porcos, 0 valor do semitempo de eliminação pelo local da injeoção foi no máximo igual a 20 horas. Ao fim deste tempo, deixou de poder determinar os valores dos teores de LHRH no sangue.

Surpreendentemente, a Requerente descobriu que, com as formulações lipossomais especiais mais adiante caracteriza-das, são detectáveis valores das concentrações no local da in-jecção significativos e que originam valores dos níveis de teores no sangue ou efeitos farmacológicos significativos ainda ao fim de 35 dias. A presente invenção refere-se por consequência a composições lipossomais para libertação prolongada de péptidos ca-racterizados pelo facto de os péptidos terem uma massa molecular compreendida entre cerca de 500 e cerca de 10000, os componentes fosfolipídicos da membrana dos lipossomas possuir uma temperatura de transição de fase de pelo menos 20°C e conterem principalmente ácidos gordos saturados e a actividade depois da injecção s.c. ou i.m. durar mais do que catorze dias.

As composições lipossomais de acordo com a presente invenção garantem, em virtude da sua composição especial, uma actividade durante um intervalo de tempo maior do que catorze dias. Isto significa que as preparações, por causa da sua composição especial, se mantêm mais do que catorze dias no local da aplicação sem se degradarem e que, durante este intervalo de tempo, as substâncias activas petídicas nelas encerradas se libertem em uma quantidade suficiente para garantir a acção pretendida. A actividade mantém-se, de preferência, durante vinte dias e, especialmente, durante trinta ou mais dias.

Os tamanhos médios equivalentes em volume das partículas das vesículas (lipossomas) está compreendido, de prefe-• rência, entre 600 e 10.000 nm, especialmente acima de 800 nanó- 4

metros, para minimizar a velocidade do transporte a partir do sítio da injecção. Os componentes de fosfolípidos da membrana dos lipossomas têm, de preferência, uma temperatura de transição de fase mais alta que 30°C, em especial, de pelo menos 37°C. Eles contêm predominantemente ácidos gordos saturados com um comprimento de cadeia de pelo menos catorze átomos de carbono. São fosfolípidos apropriados, por exemplo, dimiris-toil-PC (DMPC), diestearoil-PC (DSPC), dipalmitoil-PC (PC = fos fatidil-colina) ou lecitinas hidrogenadas ou parcialmente hi-drogenadas de origens naturais. Para estabilização da membrana, são apropriados, por exemplo, aditivos lipofílicos de esterói-des, como colesterol.

Os péptidos (também sob a forma dos seus sais fisio-logicamente aceitáveis) encapsulados nos lipossomas são de origem natural, sintética ou semi-sintética e possuem actividade específica no organismo. Nas considerações anteriormente feitas e seguintes, no sentido em que se emprega na presente invenção, entendem-se como péptidos tanto os compostos livres como também os sais fisiologicamente aceitáveis dos péptidos anteriormente caracterizados. Estes têm uma massa molecular compreendida entre cerca de 500 e 10. 000. São péptidos apropriados, por exemplo, os análogos de LH-RH, antagonistas da bradiquinina, insulina, vasopressina, oxitocina, calcitonina, heparina, Hirudina e os seus análogos sintéticos ou semi-sintéticos. De preferência, encapsulam-se análogos de LHRH, como, por exemplo, busere-lina, H0E 013 (Ac-D-Nal-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (alfa-L--Rha)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2, veja-se, por exemplo, a Patente de Invenção Europeia EP-A 0 263 521, correspondente ao Pedido de Patente de Invenção Norte-Americana Número 390477). No entanto, são também apropriadas, por exemplo, hirudinas, como HBW 023 (R-ADN-hirudina, de acordo com a Patente de Invenção Europeia EP-A 0 324 712, correspondente ao pedido de Patente de Invenção Norte-Americana Número 295 422), HOE 427 (= Ebira-tida, [4-dióxido de metionina, 8-D-lisina, 9-fenilamina]-alfa--MSH-(4-9)-(8-amino-octil)-amida-triacetato, compare-se com a • Patente de Invenção Europeia EP-A 0 179 332, correspondente às . Patentes de Invenção Norte-Americanas Número 4 623 715 e Número - 5 - ......nr.evniniiMunUHW*»

4 696 913) e HOE 140 (= H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic--Oic-Arg-OH* ÓCH^COOH) (compare-se com Patente de Invenção Europeia EP-A 0 370 453, correspondente ao pedido de Patente de Invenção Norte-Americana Número 374 162).

Sabe-se que os plptidos apropriados como substâncias activas são activos surante um intervalo de tempo muito curto para aplicação em organismos vivos (Banga e col., Int. J.

Pharm. 45, 15 - 50 (1988)). Eles são inactivados por enzimas ou também por reacções químicas ou são eliminados rapidamente. Mediante a encapsulagem desses péptidos com obtenção das composições lipossómicas de acordo com a presente invenção, é possível proteger as substâncias da inactivação metabólica rápida no organismo e garantir uma administração contínua durante longos intervalos de tempo da substância activa não alterada ao longo de intervalos de tempo muito compridos.

Os lipossomas são ou de tipo unilamelar ou de tipo multilamelar. Os péptidos podem encontrar-se tanto no espaço interno aquoso sob a forma de solução, como também na membrana lipossómica. A administração da substância activa é controlada especialmente através da membrana, isto é, a sua presença e, eventualmente, a do componente activo na membrana influenciam a duração da libertação da substância activa. Mediante a encapsulagem de péptidos em lipossomas de grandes dimensões, por exemplo, multilamelares, faz-se subir a duração da acção para, por exemplo, vinte dias e mais mediante a ligação da substância activa ao sistema veicular. Nas composições lipossómicas de a-cordo com a presente invenção, encontram-se ainda presentes no local da injecção lipossomas ainda depois de trinta dias. É detectável ainda uma actividade depois deste intervalo de tempo.

Por adição de veículos carregados negativamente ou positivamente, como, por exemplo, dipàlmitoil-fosfatidil-glice-rol ou estearilamina no componente da membrana, de agentes an-ti-oxidantes ou outras substâncias auxiliares com propriedades estabilizantes ou que influenciam a libertação, pode controlar--se adicionalmente a libertação da substância activa.

Os lipossomas podem preparar-se, em princípio, de a- - 6 -

oordo cora todos os métodos conhecidos, por exemplo, a partir da literatura (D, Lichtenberg, Methods of Biochemical Analysis 33, 337 (1988)). São especialmente apropriadas as tecnologias de preparação que originam lipossomas de maiores dimensões.

Os processos para a preparação de composições lipos-sómicas de acordo com a presente invenção caracterizam-se por a) ej() dissolverem-se os componentes fosfolipídicos e, eventualmente, aditivos lipofílicos num dissolvente orgânico apropriado, eliminar-se o dissolvente e desligar-se a matriz de lípido assim obtida depois da adição de uma solução aquosa do péptido para formação dos lipossomas, em que a desligação se faz a uma temperatura superior à temperatura de transformação de fase dos componentes de fosfolípidos, ou p) dissolver-se num dissolvente orgânico apropriado o componente fosfolipídico e, eventualmente, a ditivos lipofílicos, assim como o péptido, eliminar-se o dissolvente e desligar-se a matriz lipídica com meio aquoso, em que a desligação se efectua a uma temperatura superior à temperatura de transição de fase dos componentes fosfolipídicos , ou dissolver-se o componente fosfolipídico e, eventualmente os aditivos lipofílicos num dissolvente orgânico volátil e adicionar-se uma solução aquosa de péptido não miscí-vel com a fase orgânica, transformar-se 0 sistema bifá-sico assim obtido numa emulsão estável por homogeneização a uma temperatura superior à temperatura de transição de fase dos componentes fosfolipídicos e eliminar-se 0 dissolvente orgânico com formação de lipossomas e regular-se as dispersões lipossomais obtidas de acordo com os métodos o() a $ , eventualmente depois de homogeneização e de obtenção do equilíbrio, embalar-se e, eventualmente, liofilizar -se ou - 7 -

b) embalar-se em frascos apropriados num liofilizado preparado de acordo com os métodos alfa, beta ou gama a partir de li-possomas isentos de péptido e uma solução aquosa de pépti-dos, misturando o liofilizado e a solução de péptidos antes da aplicação.

Os liofilizados obtidos de acordo com o processo da presente invenção são transformados de acordo com métodos correntes , por exemplo, adição de água para injecções, de maneira a obterem-se formas de administração apropriadas para administração por via intramuscular ou subcutânea. 0 meio aquoso utilizado no processo de acordo com a presente invenção consiste em água ou numa mistura de água e um dissolvente orgânico, como, por exemplo, metanol ou etanol.

Além disso, pode ainda conter aditivos como cloreto de sódio ou tampões, por exemplo, tampão de fosfato. As soluções aquosas de péptidos podem também possuir esses aditivos. 0 processo realiza-se convenientemente procedendo da seguinte forma. Método a) «0 Dissolvem-se fosfolípidos e, eventualmente, aditivos lipo-fílicos, por exemplo, colesterol, num dissolvente orgânico, como, por exemplo, etanol, metanol, diclorometano, clorofórmio, butanol terciário. Elimina-se o dissolvente com métodos que não originem resíduos de dissolvente prejudiciais e originam uma matriz de lípido com a superfície máxima possível. Para o efeito, é especialmente apropriada a evaporação rotativa sob vácuo e a liofilização ou a combinação destes dois métodos.

Para a formação dos lipossomas, desliga-se a matriz de lípidos depois da adição de uma solução aquosa do fármaco de péptido, caso seja necessária, tamponizada. Este processo pode realizar-se a temperaturas reaccionais superiores à temperatura de transição de fase dos componentes fosfolipídicos, evidentemente abaixo de uma temperatura crítica de decomposição. Ela é facilitada por agitação do vaso e por introdução de agentes ace - 8 - leradores (por exemplo, pérola de vidro ou tiras). A dispersão dos lipossomas pode seguidamente ainda ser submetida a uma operação de homogeneização, por exemplo, com um homogeneizador Ultraturrax, homogeneizadores de alta pressão e processos análogos. Os lipossomas formados são equilibrados a temperatura elevada até que se atinja um estado estável e um inchemento óptimo. A homogeneidade da dispersão é melhorada pela separação das partículas grosseiras filtrando-se, por exemplo, através de um filtro de membrana ou de um filtro de vidro com 1 a 20 mi-crómetros de diâmetro dos poros.

Na encapsulagem não quantitativa de fármacos, em muitos casos verifica-se a necessidade de separar a parte não encapsulada. As vantagens especiais da separação de fármaco ligado e livre conseguem-se com uma filtração de fluxo cruzado, que, mediante a escolha apropriada das membranas, permite também uma separação do componente fino de lipossoma (menor do que cerca de 400 nanómetros). Para o efeito, podem utilizar-se processos de centrifugação, processos cromatográficos (cromatogra-fia em gel, com permuta de iões ou de absorção) ou a separação de péptido livre por métodos de absorção ou de digestão. A dispersão lipossomal pronta é ensaiada empregando métodos apropriados relativamente à concentração do fármaco e diluída até se obter o teor pretendido. Em seguida, são embaladas em ampolas ou frascos para injecções e armazenadas em condições apropriadas.

Todas as operações do processo se realizam em condições asséptidas para a preparação de composições farmacêuticas. p) A preparação realiza-se de maneira análoga à descrita no método C(), muito embora o péptido seja dissolvido num dissolvente orgânico juntamente com os componentes lipofílicos. Este processo é especialmente apropriado para péptidos com caracte-rísticas lipofílicas; como dissolventes, utiliza-se etanol, metanol, butanol terciário. ’&) Dissolvem-se os fosfolípidos e os aditivos lipofílicos (por - 9 -

exemplo, colesterol) num dissolvente orgânico facilmente vola-tilizável, como por exemplo, éter dietílico, éter di-isopropí-lico ou as suas misturas com diclorometano ou clorofórmio. A esta solução, adiciona-se uma solução aquosa de péptido não miscível com a fase orgânica. 0 sistema bifásico é transformado numa emulsão estável com um processo de homogeneização apropriado (Ultraturrax, ultra-sons, homogeneizador de alta pressão) a temperaturas superiores à temperatura de transformação da fase do componente de fosfolípido e inferiores a uma temperatura de decomposição crítica. Em seguida, elimina-se o dissolvente orgânico sob vácuo, à temperatura necessária. Passando por um estado intermédio metastável, na maior parte das vezes semelhante a gel, formam-se lipossomas que são libertados de impurezas o mais possível por meio de outros dissolventes.

Os lipossomas são posteriormente processados como se descreveu no método d), purificados e embalados.

Os lipossomas, que são preparados de acordo com os métodos o()— ^) e contêm aditivos em solução aquosa de substâncias crioprotectoras aos quais se adicionaram agentes criopro-tectores depois da preparação, podem ser liofilizados. A escolha dos aditivos e do processo de liofilização é feita de tal modo que os lipossomas sejam facilmente reconstituíveis antes da administração e contenham uma grande parte do fármaco de péptido sob a forma ligada. São agentes crioprotectores apropriados, por exemplo, manitol, xilitol, sorbitol, tre-halose, dextrano, polivinil-pirrolidona, albumina, hidroxietilamido e tipos de gelatina modificada. Método b)

Preparam-se lipossomas isentos de substância activa procedendo de maneira correspondente ao método a),o(, |3 ou ffe liofilizam-se como se descreveu antes. Para a preparação da dispersão de lipossomas, adiciona-se a solução do péptido ao liofilizado em condições estéreis. Esta dispersão lipossomal pode em seguida ser administrada.

Os lipossomas isentos de substância activa que são 10 preparados de acordo com o método a), p ou tfsão transformados em dispersões de vesículas de pequenas dimensões eventualmente por um processo de homogeneização apropriado. Um processo especialmente apropriado é a homogeneização sob alta pressão, por exemplo, com um microfluidizador, mas igualmente também se pode realizar um tratamento com ultrassons ou com um homogenei-zador Ultraturrax. Os pequenos lipossomas assim obtidos podem seguidamente ser submetidos a uma filtração de eliminação de germes antes de serem liofilizados como se descreveu antes. Esses lipossomas são misturados com a solução de péptido antes da administração. A dispersão assim obtida apresenta vesículas na sua maior parte de grandes dimensões.

As composições lipossomais de acordo com a presente invenção apresentam uma libertação contínua de substância acti-va que dura muito tempo. Caracterizam-se ainda pela sua elevada estabilidade durante a armazenagem. Assim, como se descreve no Exemplo 9, depois de uma armazenagem durante doze meses, ainda mais de 99% do péptido está ligado aos lipossomas e as dimensões das partículas mantêm-se inalteradas.

EXEMPLOS

Exemplo 1 À temperatura de 50°C, dissolvem-se 200 mg de antagonista de LHRH (HOE 013), 1.3^8 mg de lecitina de ovo hidrogena-da (temperatura de transição de fase cerca de 53°C) e 652 mg de colesterol em 50 ml de metanol.

Filtra-se a solução através de um filtro de membrana de 0,2 micrómetro para esterilizar e processar-se em condições assépticas de modo a obterem-se lipossomas. Elimina-se depois o dissolvente deste em vaporizador de rotação a 55°C, até se formar uma matriz de lípidos (película) fina. Mistura-se a película de lípidos sob atmosfera de azoto com 20 ml de solução esterilizada de cloreto de sódio, desliga-se da parede do vaso durante duas horas a 55°C e sacode-se a 50°C durante a noite. Filtra-se a dispersão de lipossomas assim obtida através de um 11

filtro de membrana de 5 micrómetros e dilui-se com solução de cloreto de sódio até perfazer 100 ml. Transfere-se a dispersão assim obtida para tubos de centrifugação de policarbonato e centrifuga-se a 20.000 x g durante cinco minutos a 5°C. Retira--se o sobrenadante com os antagonistas de LHRH não encapsulados e dissolvidos. Depois da adição de solução de cloreto de sódio nova, redispersam-se os lipossomas e repete-se a centrifugação cinco vezes. Em seguida, diluem-se os lipossomas até perfazerem 20 ml.

Depois de se determinar o teor de substância activa por meio de HPLC, dilui-se a dispersão de lipossomas com solução de cloreto de sódio para uma concentração final de 1,6 mg/ ml de H0E 013 e embala-se em frascos para injecções. 0 tamanho das partículas, expresso em volume, I, em média, igual a 2.300 nanómetros e a eficiência de encapsulagem é igual a 20%.

Exemplo 2

Injecta-se 2 x 1 ml de lipossomas (que correspondem à administração de uma dose de 3.200 microgramas de HOE 013) do Exemplo 1, subcutaneamente, a ratazanas do sexo feminino com cerca de 200 gramas de peso corporal. Como controlo, serve um número igual de animais de ensaio, que recebem apenas o agente dissolvente (solução de cloreto de sódio) (placebo) e um grupo de animais que se trata diariamente com solução de antagonista de LHRH (60 microgramas) (em solução de manite da 5$). Ensaia--se a supressão do estro dos animais por colheita semanal do estro. Mede-se a concentração de HOE 013 na urina no dia 35 e calcula-se a separação durante vinte e quatro horas.

Os resultados (veja-se a Tabela 1) mostram que os animais do grupo dos lipossomas, ao contrário dos dois outros grupos de controlo, depois de trinta e cinco dias ainda estão nitidamente com o estro suprimido. As taxas de excreção no dia 35 (4,5 microgramas) demonstram uma significativa eliminação do antagonismo no caso das preparações lipossómicas. A taxa de ex-. ereção está intimamente correlacionada com a concentração no \ plasma. - 12 -

TABELA 1

Supressão do Ciclo Menstrual em Ratazanas do Sexo Feminino depois de Injecção Subcutânea de Antagonista de LHRH (HOE 013) e de Placebo

Grupo Tratamento Ratazanas com supressão do ciclo Número (Dose) menstrual/Ratazanas de cada grupo

Dia da citologia Vaginal 1 7 14 21 28 35 1 Controlo 0/11 0/11 0/11 0/11 0/11 0/11 (Placebo) 2 Controlo

Injecção diária 0/11 0/11 0/11 0/11 0/11 0/11 (60 yg de HOE 013 s.c.) 3 Lipossomas (administração 0/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 única de 3200 jig de HOE 013 s.c.)

Exemplo 3

Em 15 ml de metanol, dissolvem-se 40 mg de antagonista de LHRH, HOE 013, 262 mg de dipalmitoil-fosfatidil-colina (DPPC) (temperatura de transição de fases igual a cerca de 41°C) e 138 mg de colesterol. A preparação dos lipossomas realiza-se de maneira análoga à que se descreveu no Exemplo 1, sendo, no entanto, o volume da fase aquosa para a desligação da película e completamento dos peletes de lipossomas igual a 4ml.

Exemplo 4 , Processam-se 40 mg de antagonista de LHRH, HOE 013, ’ 158,7 mg de dimiristoil-fosfatidil-colina (DMPC) (temperatura - 13 - ^•winracriHjaiwH1^

de transição de fases cerca de como se descreveu no Exemplo 3 23°c) e 41,3 mg de colesterol, para se obterem lipossomas.

Exemplo 5

Ensaiaram-se os lipossomas dos Exemplos 1, 3 e 4 relativamente à sua libertação de ingrediente activo in vitro. Para o efeito, coloca-se 1 ml de dispersão encerrada em mangueiras de diálise num recipiente com 10 ml de tampão (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, isotonizado com NaCl) e incuba-se a 37°C com agitação e sacudidelas. Troca-se a solução de tampão diariamente e analisa-se relativamente ao seu teor em HOE 013. Os resultados (veja-se a Tabela 2) mostram nítida dependência da libertação da composição da membrana dos lipossomas. TABELA 2

Dia Libertação de péptido em %

Lecitina de ovo hidrogenada/ DPPC/CH DMPC/CH CH (Exemplo 1) (Exemplo 3) (Exemplo 0 0 0 0 0,125 12,5 20,5 41 ,53 1 21 ,6 34,3 65,7 2 30,3 47,9 77,4 4 38,2 59,3 83,5 7 46,5 69,5 89,3 10 67,3 79,9 93,8 14 74,4 89,9 97,5 21 92,8 96,5 100,0 28 97,2 98,7 35 98,1 99,8 Exemplo 6

Em vez de HOE 013, processam-se 200 mg de acetato de buserelina, como se descreveu no Exemplo 1, de maneira a obte-• rem-se lipossomas. A granulometria das partículas expressa em 14 -

volume é, em média, igual a 1.800 nanómetros; a eficiência de encapsulagem é de 10,6¾.

Exemplo 7

Dissolvem-se 250 mg de lecitina de soja hidrogenada em 33,3 ml de éter di-isopropílico e 16,7 ml de diclorometano, a 40°C. Adicionam-se 4 ml de solução de 500 mg de hirudina (HBW 023) em tampão de fosfato 10 mM, pH 7,4. Homogeneiza-se a mistura em banho de ultra-sons durante um minuto. Em evaporador de rotação, elimina-se o dissolvente orgânico a 55°C. Equilibram-se os lipossomas formados durante uma hora e, em seguida, filtram-se através de um filtro de membrana de 5 micrometros. Depois de se eliminar a parte não encapsulada por centrifugação por três vezes a 8.000 x g, diluem-se os peletes lipossomais até 10 ml. A eficiência de encapsulagem é igual a 11,5¾.

Exemplo 8

Dissolvem-se 135 mg de lecitina de ovo hidrogenada em 8 ml de éter di-isopropílico e 4 ml de diclorometano a 40°C. Adicionam-se 4 ml de uma solução de 20 mg de Ebiratid (HOE 427) em tampão de acetato 10 mM, pH 3,5. Homogeneiza-se a mistura em banho de ultrassons durante um minuto. Em evaporador de rotação, elimina-se o dissolvente orgânico a 55°C. Equilibram-se os lipossomas assim formados durante uma hora e, em seguida, filtra-se através de uma membrana de 5 micrometros. Depois de se eliminar o componente não encapsulado por centrifugação por tris vezes a 16.000 x g, diluem-se os peletes lipossomais até perfazer 10 ml. A eficiência de encapsulagem é igual a 15¾.

Exemplo 9

Armazenam-se lipossomas do Exemplo 1 a 4°C durante doze meses e, em seguida, ensaiam-se relativamente à sua estabilidade em armazenagem. Por centrifugação a 16.000 rotações * por minuto, separa-se a proporção de péptido libertada a partir 15

dos lipossomas para o meio de dispersão (água) e determina-se por HPLC. Depois de doze meses de armazenagem, liberta-se 0,75$ da substância activa encapsulada, 99,25$ de HOE 013 estão ainda ligados aos lipossomas. A granulometria média expressa em volume determinada por espectroscopia de correlação fotónica é igual a 2.300 nanómetros e mantém-se inalterada em relação ao valor inicial.

Exemplo 10

Dissolvem-se 2.000 mg de uma mistura equimolar de dipalmitoil-fosfatidil-colina (DPPC), lecitina de ovo hidroge-nada ou lecitina de ovo e colesterol (CH) em metanol. Em evapo-rador de vácuo, evapora-se o dissolvente em vácuo a 55°C. Desliga-se a matriz de lípido com 20,0 ml de uma solução de 200 mg de HOE 013 em solução aquosa a 5,4$ de manite a 55°C e equilibra-se durante a noite a 50°C em banho sujeito a sacudidelas. A dispersão lipossomal formada é filtrada através de um filtro de 5 micrórnetros e arrefecida em seguida até cerca de 20°C. Separa-se a proporção não encapsulada por centrifugação a 1.000 rotaçSes por minuto durante dez horas. Repete-se a centrifugação depois da adição de solução de cloreto de sódio a 0,9$ e redispersão por duas vezes. A fracção lipossomal purificada é diluída até se obter a concentração de HOE 013 pretendida e embalada em frascos para injecção esterilizados. A eficiência de encapsulação é igual a - 61,6$ para os lipossomas de DPPC/colesterol (50 : 50$ em moles) , - 78,9$ para os lipossomas de lecitina de ovo hidratada (HPC)/ colesterol (50:50$ em moles), - 74,3$ para os lipossomas de lecitina de ovo (PC)/colesterol (50:50$ em moles).

Exemplo 11

Injectam-se subcutaneamente ratazanas do sexo femini- 16 -

no com 190 a 200 gramas de peso corporal com os jipossomas do Exemplo 10. A dose é igual a 7,2 mg de HOE 013 por animal. No momento pretendido, determina-se a inibição dos ciclos em comparação com o grupo de controlo por citologia vaginal. 0 intervalo da supressão média do estro é - 14 dias para PC/CH-lipossomas (grupo 2), - 34 dias para HPC/CH-lipossomas (grupo 3), - 48 dias para DPPC/CH-lipossomas (grupo 4). TABELA 3

Supressão dos Ciclos Menstruais em Ratazanas do Sexo Feminino após Injecção Subcutânea de 7,2 mg de HOE 013 por Animal

Grupo Ratazanas com supressão do ciclo menstrual/

Ratazanas por grupo Dia depois da injecção 0 12 3 67 89 12 1 (Con- 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 2 trolo) 0/8 0/8 0/8 1/8 8/8 6/8 8/8 8/8 8/8 3 0/7 0/7 0/7 1/7 6/7 5/7 7/7 6/7 7/7 4 1/8 1/8 2/8 5/8 7/8 8/8 7/8 6/8 7/8 Exemplo 12 14 16 21 23 28 31 34 37 41 44 48 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 8/8 8/8 7/8 7/8 7/8 6/8 6/8 3/8 2/8 2/8 0/8 7/7 7/7 7/7 6/7 5/7 5/7 5/7 4/7 5/7 3/7 3/7 4/8 3/8 2/8 1/8 2/8 3/8 4/8 0/8 0/8 0/8 0/8

Dissolvem-se 3,37 gramas de lecitina de ovo hidroge-nada e 1,63 gramas de colesterol em 100 ml de metanol e evaporam-se durante trinta minutos a 60°C em vaporizador de rotação, para obter-se uma película de lípidos. Depois da adição de pérolas de vidro, adicionam-se 100 ml de solução de manite (a 5,4%) temperatura a 60°C e desliga-se a película durante sessenta minutos por rotação do êmbolo em evaporador de rotação a 60°C.

Trata-se a dispersão de lipossomas numa máquina Nano-jet (firma Verstallen) durante quinze minutos com uma folga 10 © a temperatura de 60°C. Os lipossomas de pequenas dimensões 17 -

Claims (1)

1. formados são filtrados através de um filtro de membrana de 0,2 micrómetro, e depois de se arrefecer são embalados em frascos para injecções e em seguida liofilizados. Para reconstituição, misturam-se os liofilizados com solução de 1 mg de HOE 013 por mililitro de água para injecções e sacode-se a 60°C. A separação da parte não encapsulada realiza-se de maneira correspondente à do Exemplo 1 por centrifugação repetida. A proporção ligada aos lipossomas é igual a 28,9% de substância activa. REIVINDICAÇÕES - IS - Processo para a preparação de composições farmacêuticas lipossomais contendo péptidos libertação prolongada dos péptidos apropriadas para administração por injecção subcutânea ou intramuscular, caracterizado por: a) ©0 se dissolver o componente fosfolipídica e eventualmente aditivos lipofílicos num dissolvente orgânico apropriado, se eliminar o dissolvente e se dissolver a matriz lipídica assim obtida depois de se adicionar uma solução aquosa do péptido para a formação dos lipossomas, realizando-se a dissolução a uma temperatura mais elevada do que a temperatura de transição de fase do componente fosfolipídico ou p) se dissolver o componente fosfolipídico e eventualmen-mente os aditivos lipofílicos assim como o péptido num dissolvente orgânico apropriado e se dissolver a matriz lipídica assim obtida, com meio aquoso, sendo a dissolução realizada a uma temperatura superior à temperatura de transição de fase do componente fosfolipídico ou )£) se dissolver o componente fosfolipídico e eventualmen-• te os aditivos lipofílicos num dissolvente orgânico volátil e 18 -

   se adicionar uma solução aquosa do péptido não miscível com a fase orgânica, se transformar o sistema bifásico assim obtido numa emulsão estável por homogeneização realizada a uma tempera tura superior à temperatura de transição de fase do componente fosfolipídico e se eliminar o dissolvente orgânico com formação de lipossomas e se regular a dispersão de lipossomas obtida de acordo com as variantes do processo o(, p ou tf de maneira a ter o teor de péptido pretendido eventualmente depois da homogeneização se equilibrar, se embalar e eventualmente se liofilizar ou b) se preparar um liofilizado de lipossomas isentos de péptido de acordo com as variantes de processo , p ou tfe se embalar num recipiente apropriado, em que o liofilizado e a solução são purificados antes da aplicação, possuindo os péptidos utilizados um peso molecular compreendido entre cerca de 500 e cer ca de 10000 e em que o componente fosfolipídico da membrana de lipossomas possui uma temperatura de transferência de fase pelo menos igual a 20°C e contém principalmente ácidos gordos saturados e actividade das composições farmacêuticas depois da in-jecção s.c. ou i.m. se mantém mais que 14 dias. - 23 - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se observar uma ou mais das seguintes condições : a) o péptido é um análogo de LHRH, um antagonista de bradi-quinina, H0E 427 ou um derivado de hirudina, b) a temperatura de transição de fase do componente fosfolipídico ser superior a 30°C, c) os ácidos gordos preponderantemente saturados do componente fosfolipídico possuir um comprimento de cadeia com pelo menos 14 átomos de carbono, d) a membrana dos lipossomas contém um esteróide como aditivo , e) os lipossomas possuem um tamanho médio das partículas em - 19 -

   volume compreendido entre pelo menos 600 e 10 000 manómetros, f) a actividade das composições farmacêuticas obtidas mantém -se durante pelo menos 20 dias. _ 3a _ Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se observar uma ou mais das seguintes condições: a) o péptido é um análogo de LHRH, HOE 140, HOE 427 ou HBW 023, b) a temperatura de transição de fase do componente fosfoli-pídico I igual a pelo menos 37°C, c) os ácidos gordos preponderantemente saturados do componente fosfolipídico possuem um comprimento da cadeia com pelo menos 14 átomos de carbono, d) a membrana dos lipossomas contém um esteróide como aditivo , e) os lipossomas possuem um tamanho médio das partículas em volume compreendido entre pelo menos 600 e 10 000 manómetro, f) a actividade das composições farmacêuticas obtidas mantém-se pelo menos durante 30 dias. - 4& - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo facto de se observar uma ou mais das seguintes condições: a) 0 péptido é acetato de buserelina ou HOE 013, b) a temperatura de transição de fase é pelo menos igual a 37°C, c) 0 componente fosfolipídico é dipalmitoil-fosfatidil-coli-na (DPPC) ou lecitina hidrogenada de origem natural, d) a membrana contém colesterol como aditivo, 20 e) os lipossomas possuem um tamanho médio das partículas em volume compreendido entre pelo menos 600 e 10 000 manómetro, f) a actividade das composições farmacêuticas obtidas mantém-se pelo menos durante 30 dias. - 5â - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo facto de se adicionar ao material da membrana um veículo carregado electricamente. - 6â - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se adicionar antioxidantes e outras substâncias adicionais com propriedades estabilizantes ou que influenciam a libertação. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 12 de Abril de 1990, sob o n2 p 40 11 864.9. Lisboa, 11 de Abril de 1991

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