PT95980B

PT95980B - Processo para preparacao de um meio para armazenamento e suspensao de celulas em especial de eritrocitos

Info

Publication number: PT95980B
Application number: PT95980A
Authority: PT
Inventors: Karl Fickenscher
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1989-11-24
Filing date: 1990-11-23
Publication date: 1998-04-30
Also published as: YU222890A; JP3003945B2; DE3938907A1; DE3938907C2; EP0431385A1; YU47648B; JPH03209301A; US5554527A; PT95980A; CA2030757C; AU6690590A; CA2030757A1; AU648999B2

Description

A presente in/enção refere-se a um meio para conservação, armazenamento e suspensão de células, em especial de eritrócitos, que para além de outras substâncias já conhecidas dos especialistas, como por exemplo electrólitos e açúcares, contenha um agente formador de quelatos para iões metálicos polivalentes.

Para a preparação de reagentes destinados à determinação de certos parâmetros (p.e. determinação do complemento) são necessários eritrocitos isolados de sangue total anti-coagulado, e estabilizados.

Io âmbito das terapêuticas com componentes sanguíneas são preparados concentrados de eritrocitos a partir de sangue total (conservas de sangue) por meio de separação do plasma. Esses concentrados têm actualmente múltiplas utilizações terapêuticas, por exemplo em casos de anemia, ou sempre que haja uma indicação para a administração de eritrocitos. A fim de acertar os concentrados âe eritrocitos a uma viscosidade fisiologicamente tolerável, tem de ser-lhes adicionada uma solução de diluição, com a qual podem também podem ser adicionadas substâncias para aumentar a sua capacidade de armazenamento .

Para a suspensão e armazenamento de células, em especial de eritrocitos, são adequados diversos meios. Assim é descrita, por exemplo, na ul 81/02239 uma solução que contém adenina, manitol, glucose ou fructose e oloreto de sódio. Ha WO 86/00809 é descrita uma solução que contém adenina, manitol, glucose, citrato de potássio e cloreto de amónia. 17a WO 87/04072 é descrita uma solução que pode conter L-aminoácidos ou os seus derivados, ácidos gordos ou seus derivados, pro dutos intermediários da glicélise, tais como fosfoenol-piruvato e seus análogos, nucleosidos tais como aâenosina ou guanosina, monofosfato de adenosina e seus derivados, amónia, glicogênio, acetil-Oo-A e seus derivados, alantoina, 4-etil-oxaloacetato, fenil-etil-biguanida e seus análogos, quereetina, sulfato de cobalto, sulfato de niquel, cloreto de magnésio, cloreto de manganês, bem como diversos inibidores da di-fosfo-glicerato-fosfatase, como aditivos aos componentes padrão anticoagulante, álcool glicosídeo, glucose e cloreto de sódio.

Ha WQ 89/02274 ê descrita uma solução que contêm glucose, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, sulfato de magnésio, fosfato de sódio, citrato de sódio e bicarbonato de sódio. Ha HS-PS 4 267 269 é descrita uma solução que, para além de adenina, contém álcool glicosídeo manitol, glucose ou fructose e cloreto de sódio» A US-PS 4 704 352 descreve uma solução que para a estabilização de células sanguíneas apresenta um pH inferior a 7.0, bem coiao adenina, manitol, dextrose, cio reto de sódio e L—aseorbato—2—fosfato. A U3-P.3 4 769 318 descreve a estabilização e activação de sangue antes da transfusão, por meio de um derivado de fosfoenol-piruvato, tal como adenina, um sacárido (sacarose, maltose, galactose ou manitol)

I

Γ·.

ácido cítrico ou o seu sódica (também SP 0 275 198). A EP 0 099 315 descreve uma solução tamoonada com fosfato, que contêm adenina, glucose, sacarose e cloreto de sódio, á EP 0 100 419 descreve uma solução tamponada eom fosfato que contém adenina e/ou guanosina, um álcool glicosídeo (sorbitol ou xilitol), glucose 0 ufructose, cloreto de sódio, bem como agentes coloidais. A EP 0 301 250 descreve uma solução tamponada com fosfai to que contêm adenina e/ou guanosina, um álcool glicosídeo i (sorbitol, manitol ou xilitol, glucose ou fructose, cloreto jj de sódio e agentes coloidais (ver também BE-A 37 22 984). A J DE 3 220 232 descreve um processo e uma solução para estabilii zação de plaquetas sanguíneas acravés da utilização de iodo' -acetamida, um ácido imino-acético, e um agente bacteriostátiJ co. A DE-À-3 225 308 descreve uma solução que contém adenina ou guanosina, um álcool glicosídeo (sorbitol ou xilitol), glucose ou fructose. Para além disso, Heaton et al. (British Jour nal of Haematology 57, 467-478, 1984) descreve uma solução (AD30L(A)), composta essencialmente de adenina, manitol, dextrose e cloreto de sódio para a estabilização de eritroeitos.

' Xgualmente conhecido ê o efeito estabilizador do amaciador dietil-hexil-ftalato, que ê tóxico para o ser humano (Horowitz B. et al., Vox Sang. 48, 150-155» 1985).

Acravés da adição de tais soluções de susi pensão aos concentrados de eritrocitos conseguiu-se, é certo,

I melhorar a taxa de sobrevivência e portanto a capacidade de í armazenamento dos eritrocitos, mas essas melhorias foram dema1 .

í siado reduzidas para satisfazer as elevadas exigências, p.e.

í os tempos de ensaio mínimos de um meio de diagnóstico. Hão foi ; igualmente possível preparar dessa forma um reagente pronto a i utilizar, pois a concentração de eritrocitos acertada, bem com J as propriedades dos eritrocitos, modificam-se durante o armazenamento ♦

Assim, a presente invenção tinha como objectivo melhorar a taxa de sobrevivência e portanto a capacidade de armazenamento das células, ou seja a taxa de hemólis

- 3 j dos eritrocitos.

A presente invenção refere-se a um meio para suspender, conservar e armazenar células biologicamente activas ou componentes celulares, em especial eritrocitos, ’ contendo esse meio, para além de outras substâncias conheci! das dos especialistas, como por exemplo anti-coagulantes» eleί ctrélitos, açúcares e alcoóis glicosídeos, ua agente formador de quelatos para iões metálicos polivalentes» numa solução aquosa tamponada. Surpreendentemente, descobriu-se que as células, em especial os eritrocitos» apresentam uma taxa de sobrevivência muito aumentada e uma taxa de bemálise muito dimii nuida quando são armazenados numa tal solução.

i

Os agentes formadores de quelatos para iões metálicos polivalentes são compostos conhecidos dos especialistas. Ls preferência são utilizados agentes formadores de quelatos para iões metálicos bivalentes, e muito especialmente dá-se preferência à utilização de tetra-acetato de etilenodiamina (SDfA), etilenoglicol-bis-aminoetiléter-tetraace| tato (3GTA) ou ácido oxãlico, utilizando com a máxima preferência EGTA.

Os agentes formadores de quelatos são utiI ;i lizados em concentrações de 0 a 100 mmol/1, de preferência j 0,1 a 50 mmol/1 e em especial de 2 -10 mmol/1.

i [ Oomo electrélitos podem considerar-se em

I especial sais de sódio, potãssio e magnésio, sob a forma de

P cloretos, sulfatos ou citratos.

íi i Oomo açúcares são utilizados de preferência sacarose e fructose, e como aleoóiis sacarídeos manitol glucose e sorbitol.

- 4 Oomo outros aditivos poetem considerar—se, entre outros, agentes eoloidais, dando-se preferência à gelatina ou poligelina.

Oomo anticoagulantes são preferidos a heparina e o citrato* A estabilidade pode ainda ser aumentada através da adição de um antibiótico inócuo para as células, como nor exemplo Hathon (R8hm & Haas) ou cloranfenicol.

Os meios a que se refere a presente inven ção podem ainda conter outros compostos conhecidos dos especialistas, da classe dos nucleósidos (p.e. adenosina ou guano sina), da classe das bases purínicas (p.e. adenina) ou compo£ tos intermediários e substratos de glicólise. Outros aditivos que são utilizados nos meios já conhecidos, podem também ser combinados com os meios a que se refere a presente invenção.

As propriedades vantajosas de ume. tal solução podem ainda ser melhoradas se fór adicionado trifosfato de adenosina (ΑΪΨ) e/ou como segundo composto tampão um sal de sódio do ãcido fosfórico.

Compostos tampão são todos os compostos tampão fisiologicamente toleráveis, utilisando-se de preferên cia HEPES ou um fosfato hidrossolãvel«

Bã-se uma especial preferência aos meios de acordo com os exemplos 2 e 5·

Uma solução típica utilizável compõe-se, por exemplo, da seguinte forma! por litro de solução, dissolvidos em água destilada, 0-100 mmol de glucose, 33-200 mmol de cloreto de sódio, 0-50 mmol de cloreto de potássio, 0-10 mmol de cloreto de magnésio, 2-100 mmol de HEPES, 0-110 mmol de fosfato de Ha, 0,1-50 mmol de etilenodiamino-tetraacetato (EDTA), etilenoglicol-bis-aainoetiláter-tôtraaoetato (ΕΟΪΑ

- 5 ι\ ou ácido oxálico, de preferência ώίχϊΑ, 0 — 20 GGG unidades de heparina» 0 a 5 ê âe gelatina, O a 50 mol de ASP e O a 1 § Sei K&thon ou cloranfenicol, pH 5*0 - 3.0, de preferência S,5 s

7,5 em muito especialmente 6,8 em caso de utilização de Sathon e 7.4 ea caso de utilização de cloranfenicol« Se perferência a solução tem uaa composição tal, que seja aproximadamente isotónica.

Para a aplicação de tais soluções prepara-se normalmente um sangue total de origem humana ou animal, estabilizado com citarto ou heparina. O sangue total ê centri fugado elimina-se o plasma, incluindo a camada limítrofe dos ¹ eritroeitos· Sa seguida, os eritrocitos são lavados por duas | vezes na solução tampão sem AA?. Por fim, os eritrocitos lavaI dos são incorporados no tampão completo de modo a obter a conj cenbração desejada a 2-8° ou utilizados de imediato.

í Gs seguintes exemplos destinam-se a ilusί trar a presente invenção, sem no entanto a limitarem de qualquer forma.

!

KiQfixPbú 1 ! Processo para preparação de uma suspensão de eritrocitos para • fins diagnósticos ' Aa condições assépticas, colher 300 ml de ί sangue de ovelha para ua recipiente contendo já citrato como ! agente anti-coagulante. Para separação do plasma, centrifugar o sangue total a 1GGG x g durante 15 minutos. Piltrar o plasma incluindo a camada limítrofe do bolo celular por aspiração, e i retomar os eritrocitos no mesmo volume (relativamente ao volu| me de pellet de eritrocitos) de tampao de lavagem (meio de esi tabillsação de acordo coa o exemplo 3, sea ESSA» A2P e hepari! na), e misturar. Am se_ouida centrifugar as células como acima indicado, e repetir de novo o processo de lavagem. Para acerto a» 6 — da concentração correcta de eritrocitos, reesuspendê-los no mesmo volume de mero de estabilização de acordo com o exemplo 3, e determinar a extinção de uma diluição IslOO era tampão de estabilização, a 573 nm» â partir desse valor, calcular a diluição desejada, a diluir os eritrocitos para concentração desejada. Em seguida transferir porções da suspensão de eritrocitos · Verificou-se que as suspensões preparadas desta forma podem ser armazenadas durante 2 anos a 2-S°C, sem que se verifique qualquer hemólise relevante ou qualquer perca da sua utilidade como meio de diagnóstico (febela 1).

Tabela lí

Período de armazenamento Hemólise dos eritrocitos

Tempo de lise nc ensaio do complemento, para un plasma normal (seg)

0	0	45
1 mês	0	44
6 meses	0	44
12 meses	0	45
13 meses	1	42
24 meses	3	45

£-AS,-BLO 2

Processo para preparação da solução de suspensão

Pesar SO mmol de glucose, 150 mmol de cloreto de sódio, 10 amol de cloreto de potássio, 0,5 mmol de cio· reto de magnésio, 10 mmol de ΕΞΡΞ3, 10 mmol de EDTA, 1 g de gelatina e 2 mmol de ATP, © dissolver em 900 s»l de ãgua destilada. Em seguida, juntar 19 000 unidades de heparina, bem como 0,% de Kathon. Depois de acertar a pS 6,8, completar som água destilada até perfazer 1 litro. Em seguida esterilizar a solução por meio de filtração sob pressão, através de um filtro de membrana com uma dimensão dos poros de 0,2 um.

Processo para preparaçao de uma solução de suspensão modificada

Pesar 89 -.'.biol d© glucose» 150 mmol de cio* ! reto de sódio, 10 nmol de cloreto ds potássio, 0,5 muôl de cio reto de magnésio, 10 mmol de H3FE8; 40 -aaol de HalIgaO^, 2 amol ! de EGTa, 1 g de gelatina e 2 mmol de AJEP, e dissolver ea 900 i ml de água destilada. Depois adicionar 10 000 unidades de he*

I parina bem como 0,5 g de EatDon. Depois de acertar a pH 6,8 | completar com água destilada até perfazer 1 litro» Sm seguida esterilizar a solução por meio de filtração sob pressão, atra* vás de um filtro de membrana com uma dimensão dos poros de 0,2 : um» i

] i A Eigura 1 representa a evolução temporal ! da hemálise durante 2 anos, a 4°G, ea comparação com soluções preparadas de acordo cora os actuais conhecimentos técnicos (80 mmol A de glucose, 150 aaol/l de EaOl, 10 mmol A de HhPhS, 10 mmol A de KOI, 0,5 mmol A de adenina, 0,1% de gelatina) (x-x); de acordo som os aetuais conhecimentos técnicos em com 0 agente formador de çuelatos EDTA (+-+)5 com a solução de ?cordo com o exemplo 2 (*~*); bem como com a solução de acordo com 0 exemplo 3 (□-□).

ί EdlhlPLO 4 !

¹ í Aealizsção da determinação de actividade dc 04 com a suspensão de eritrocitos

Preparaçao do reagente: Histurar 0,5 b! da suspensão de eritrocitos com 5 ml de uma solução conáenâo anticorpos contra eritrocitos, e aquecer a 37^o» 0 reagente está assim pronto a ser utilizado» Aealização da determinação1 A lo ul de amostra juntar 100 ul de um plasma com deficiência de 04» ripetar ea seguida 1 ml de reagente, e determinar que decorre atá a lise dos eritrocitos provocar uma redução da ex- 8 tinção a 573 m de 0,1 unidade. A comparação do período de tem ; po obtido coa os valores de ua curva de calibração anterionaen te obtida por processo análogo fornece o teor de 04 activo funcional.

A Eigura 2 representa a dependência do tem po de lise dos eritrocitos estabilizados da actividade de 04 na amostra.

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EXE- ELO 5 í Realização da determinação da actividade do complemento total _t com a suspensão de eritrocitos ; Preparação do reagente: .íisturar 0,5 al da suspensão de eritrocitos coa 5 ml d© uma solução contendo anticorpos contra eritrocitos, e acuecer a 37°G. 0 reagente está assim pronto a ser utilizado. Realização da determinação: A 100 ul da amostra juntar 1 al de reagente coa o aumílio de uaa pipeta, e determinar o teapo que decorre atê a lise dos eritrocitos x^rovocar uaa redução da extinção a $7S nm de 0,1 unidade. A comparação do período de tempo assiu obtido com os valo! res de uaa curva d© calibração anteriormente obtida por preces|j so análogo com diluições d© uma pool de plasma com solução sah lina isotónica, fornece o teor de actividade do complemento.

!

ι A Figura 5 representa o tempo de lise dos eritrocitos estabilizados, ea função da actividade do complemento total na amostra.

Claims

Processo para preparação de um meio para suspender, conservar e armazenar células ou componentes celulares biologicamente activos, em especial eritrocitos, caracte rizado por se dissolver numa solução aquosa tamponada um agente formador de quelatos para iões metálicos polivalentes.

- 2ê Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ô meio conter adicionalmente ou ATP, ou um fosfato hidrossolúvel ou ambos.

«MT t

Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por o meio conter para alem disso» pelo menos um dos seguintes compostosí heparina, iões de potássio» gelatina» gelatina quimicamente modificada e BEPES.

- Proeessõ de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 ou 3» caracterizado por o agente formador de quelatos ser EDTA, EG-TÀ ou ácido oxalacetico»

Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 4# caracterizado por a suspensão de células ou componentes celulares biologicamente activos pronta a utili zar, conter por litro O-1OQ mmol de glucose ou fructose, 20-200 mmol de cloreto de sódio, 0-50 mmol de cloreto de potássio, 0-100 mmol de cloreto de magnésio, 2-100 mmol de HEPES, 0—100 mmol de fosfato de sódio, 0*1—50 mmol do agente formador de quelatos, 0-20 000 unidade de heparina, 0-5 g de gelatina ou poligelatina, 0-50 - mmol de &ÉP e 0*1 g de Eathon ou cloranfenicol, e por o pH se situar entre 5 e 9» de preferência entr 6*5 e 7*5,·

Processo para suspender, conservar e armazenar células ou componentes celulares biologicamente activos, em especial eritrocitos, caracterizado por se utilizar um meio preparado de acordo com uma das reivindicações 1 a 5* ,

À requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 24 de Novembro de 1989, sob o n° p 59 58 907.3 .

Lisboa, 25 de Novembro de 1990