PT94908B

PT94908B - Processo para a preparacao de derivados carboxilicos beta-lactamicos altamente purificados estaveis e hipoalergenicos

Info

Publication number: PT94908B
Application number: PT9490890A
Authority: PT
Inventors: Julio Pedro Gincalves Andrade
Original assignee: Portela & Ca Lda
Priority date: 1990-08-03
Filing date: 1990-08-03
Publication date: 1998-05-29
Also published as: PT94908A

Description

“Processo para a preparação de derivados carboxílioos p -lactâmicos altaraente purificados, estáveis e hipoalergénicos

A presente invenção refere-se a um proeesso para a preparação de derivados carboxílioos -lactâmicos altamente purificados, estáveis e hipoalergénicos.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de inibidores de -lactamas e de fórmula geral;

Rn

' COORr (I) na qual

R^ e R₂ representam, cada um, independentemente, um do do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo amida;

R^ representa um átomo de enxofre ou de oxigénio ou um grupo >S0₂;

R^_ representa um grupo >C

CH_X/ 3 ou um grupo de fórmula

0Hgeral >G»í^ etilideno; e na qual Rg representa um grupo hidroxi·* 2

R^ representa um átomo de um metal alcalino ou o radical orgânico de um éster apropriado.

Quando R^ e/ou R₂ representam um grupo amida, o referido grupo é de preferência

CH(CH₂)₃CONHHOOC

Quando R^ representa um metal alcalino este é, de preferência, potássio, sódio ou lítio. 0 significado preferido de R^ é potássio.

Quando R^ representa um radical orgânico de um éster apropriado este é, de preferência, um grupo pivaloiloximetilo,

3-ftalamida ou l-ZCet oxicarbonil) oxi,7-etilo.

A presente invenção refere-se, adicionalmente, a um processo para a preparação de novos intermediários úteis para a preparação dos compostos referidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

São conhecidos numerosos processos para a preparação de compostos inibidores de -lactamases por cultura de estirpes seleccionadas de várias espécies de Streptomyces, seguida de isolamento e purificação e, eventualmente, de derivatização química.

Assim, a Patente Britânica 1 508 977 descreve a obtenção do composto ácido 5Z, 5Q£.7-3-(2-hidroxietilideno)-7- 3/-oxo-4-oxa-l-azabiciclo/”5*2.0^/heptano^-carboxílico, com a designação comum de ácido clavulânico, a partir de culturas de St. clavuligerus ATOO 27064, NRRL 5585* 0 isolamento do composto a partir de caldos de cultura é descrito, sendo efectuado por métodos conhecidos utilizando várias técnicas como sejam extracção por dissolventes _;e adsorção em resinas permutadoras ou em carvão activado.

A Patente Britânica 1 571 888 descreve um processo melhorado para a obtenção do mesmo composto utilizando também culturas de St. clavuligerus. A novidade consiste na regulação dos valores do pH para optimizar o rendimento durante a fermentação.

De acordo com a Batente Espanhola 537 157 conseguem-se títulos mais elevados nas fermentações ainda com o mesmo microrganismo St. clavuligerus NRRL 3585» por meio de adição, contínua ou intermitente, de uma fonte de carbono assimilável durante a fermentação.

No processo descrito na Pàtente Espanhola 545 854 é utilizado um organismo diferente, o Streptomyces jumonjinensis ATOC 29864, sendo ainda introduzida uma novidade que consiste numa alteração genética do organismo produtor por meio da formação de protoplastos e de transformação com vectores plasmídicos que conferem resistência a um antibiótico. Eaz-se em seguida a regeneração dos protoplastos e a selecção do melhor produtor de ácido clavulânico. As células resultantes são utilizadas da forma habitual conseguindo-se produções de ácido clavulânico superiores às das células não transformadas.

Um processo diferente é ainda descrito na Patente Japonesa 53-104· 796» segundo o qual o ácido clavulânieo é produzido por uma cultura de Streptomyces katsuranamanus T-272 PERM 5944, obtendo-se elevados rendimentos· pedido de Patente Japonesa 55-162 995 descreve ainda um outro processo de produção do ácido clavulânieo baseado na cultura da estirpe Streptomyces sp· P6621 (PERM 2804).

Outras inovações referem-se a processos de isolamento e purificação.

Deste modo, a Patente Britânica 1 94-5 565 descreve a remoção de impurezas do ácido clavulânieo por reacção com uma solução aquosa de um sal de lítio.

A Patente Espanhola 537 15θ descreve um processo para melhorar a extracção do ácido clavulânieo que consiste na adição de um coadjuvante de filtração e também na eliminação de impurezas por desproteinização a pH 4 com acetona.

Na Patente Espanhola 537 159 descreve-se uma alteração do processo de extracção que envolve a passagem do caldo por uma resina de permuta iénica.

A purificação do ácido clavulânieo por intermédio do respectivo sal de lítio é também descrita na Patente Espanhola 537 160, cujo processo envolve a cristalização com o 2-etil-hexanoato de lítio num dissolvente orgânico.

A importância dos processos de purificação do ácido clavulânieo, bem como de outros inibidores de j$ -lactamases aparentados, resulta da reduzida estabilidade destes compostos e da possibilidade de serem acompanhados por produtos —β 5 parasitas muito difíceis de separar e que podem ser causa de degradação dos produtos principais ou de reacções alérgicas nos pacientes tratados.

Nos processos utilizados até agora para a preparação dos compostos de fórmula geral I, o produto final não é obtido, em geral, eom uma pureza final que permita a sua utilização em medicamentos ou então é necessário efectuar processos de isolamento a partir dos caldos de cultura dos micror ganismos produtores por meio de uma série de operações extremamente longas, não se conseguindo, mesmo assim, obter com bom rendimento em escala industrial um produto final com um grau de pureza suficiente para garantir uma elevada estabilidade e a ausência de reacções alérgicas. Segundo um processo típico, por exemplo, o composto obtido da fermentação ê previamente esterificado, por exemplo, com um grupo benzilo, reacção que é efectuada à temperatura ambiente durante cerca de 2 horas, de forma a permitir a sua purificação por cromatografia em coluna, aproveitando o facto de a esterificação da função carboxilo alterar a polaridade e a capacidade da molécula em estabelecer ligações de hidrogénio, o que facilita a sua separação das restantes impurezas. Porém, não sendo estes tipos de ésteres utilizáveis na terapêutica, mas sim os sais ou ésteres de estrutura completamente diferente, torna-se necessário proceder à sua hidrólise por hidrogenação catalítica, seguida de morosa evaporação do dissolvente, ambas, pelo menos, à temperatura ambiente, donde resultam, além da provável inquinação do produto com os catalisadores

e da agressividade do processo para com moléculas tão frágeis, elevados custos de produção.

Subsistia deste modo a necessidade de um processo que permitisse a preparação dos compostos de fórmula geral I utilizando técnicas de isolamento e purificação de modo a evitar a degradação dos produtos e de execução simples e económica.

SUMÃRIO da invenção objectivo da presente invenção é um processo para a preparação de compostos de fórmula geral I altamente purificados, estáveis e hipoalergênicos por meio de uma série de operações simples e efectuadas em condições suaves, o qual compreende uma filtração, atarvés de uma membrana, de um caldo de cultura dum microrganismo produtor, a extracção com um dissolvente, a formação de um éster de sililo e a hidrólise deste sob condições suaves. 0 éster de sililo referido constitui um novo composto intermédio que permite efectuar uma purificação por cromatografia em coluna em escala preparativa em condições suaves. 0 processo para a preparação deste novo composto intermédio é também um outro objectivo da presente invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de compostos de fórmula geral I, anteriormente apresentada, sob uma forma altamente purificada e isenta de

impurezas de peso molecular superior a 1000, tais como, substâncias de natureza polipeptídica, potencialmente alergizantes além de destabilizadoras deste tipo de compostos.

Em consequência os compostos de fórmula geral I são obtidos sob uma forma estável e hipoalergénica.

processo da presente invenção é caracterizado por uma sequência simples de reacções unitárias que pode ser efectuada a partir de uma cultura de um microrganismo produtor, por exemplo, de uma estirpe mutante de alto rendimento de uma espécie de um Streptomyces produtor, como seja St. clavuligerus« St. jumonjinensis. St. katsuranamanus ou de microrganismos semelhantes que produzem um composto de fórmula geral

R,

R, _/ ^/R3\

R,

COOH na qual

R^, S£, R^ e R^ têm os significados definidos anteriormente. Os compostos de fórmula geral II são, geralmente, obtidos por cultura dos microrganismos referidos sob condições apropriadas, de preferência por fermentação submersa com arejamento num meio nutriente que contém uma fonte de carbono, uma fônte de azoto e sais inorgânicos apropriados. Os compostos de fórmula geral II podem ser segregados pelo microrganismo produtor para o meio de cultura ou podem ser conservados, em parte

ou totalmente, no interior da célula, devendo neste caso proceder-se, no fim da fermentação, a uma operação de desintegração celular com o fim de libertar o composto de fórmula geral II para o meio de cultura.

No caso de culturas dos microrganismos referidos anteriormente os compostos de fórmula geral II são, em geral, segregados para o meio de cultura.

caldo de cultura proveniente da fermentação é em primeiro lugar, filtrado usando um agente de filtração, por exemplo, Oelaton EW-80 (Aldrieh, Gat. No. 24,334-5), a fim de separar as células ou, no caso de ter havido desintegração celular, os resíduos das células e outros sólidos eventualmente presentes no meio de cultura. Em seguida procede-se, de preferência, a uma fase de purificação que pode ser efeetuada, por exemplo, tratamento com carvão activado seguido de filtração. Pode efectuar-se, em seguida, uma nova filtração com um agente de filtração como, por exemplo, Celaton PW-80.

caldo de fermentação purificado ê, em seguida, filtrado através de um filtro esterilizante e despirogenizante, por exemplo, um filtro Milipore esterilizante e despirogenizante (firma Milipore)· Obtém-se deste modo uma solução aquosa que contém um composto de fórmula geral

R.

COOH

na qual R^, R₂, R^ e R^ possuem os significados anteriormente definidos, ou um seu sal·

Esta solução aquosa.é, em seguida, filtrada através de uma membrana de polímeros sintéticos de ultrafiltração molecular selectiva com um limiar de corte correspondente a um peso molecular de 1000. Esta membrana pode ser, por exemplo, do tipo Diaflo UM-O.5, UM-2, UM-10 ou PM-10. Em geral esta membrana deve ser constituída por polímeros sintéticos quimicamente inertes que permitam a ultrafiltração selectiva em corrente contínua e com um débito elevado de moléculas de peso molecular inferior a 1000, retendo as de peso superior.

A filtração através de uma membrana de ultrafiltração ê efectuada a baixa temperatura, de preferência entre 3°0 e a temperatura ambiente e de modo especialmente preferido entre 5°0 ©

15°C, © ©ob uma pressão de azoto inferior a 10 atmosferas. Obtéra-se deste modo uma solução aquosa de um composto de fórmula geral II isenta de impurezas de peso molecular superior a 1000, tais como substâncias de natureza polipeptídica, em geral dotadas de elevado poder alergizante e aceleradoras da degradação dos compostos de fórmula geral II e dos seus sais.

Em seguida a solução aquosa do composto de fórmula geral II isenta de impurezas de peso molecular superior a 1000 é acidificada e é extraída com um dissolvente orgânico imiscível com a água. A acidificação é efectuada, de preferência, por adição de um ácido mineral como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido nítrico, até atingir um

valor de pH inferior a 4, de preferência, um valor de pH entre 1,0 e 2,0· 0 disslvente orgânico imiscível com a água pode ser um éter, como o éter dietílieo, o éter diisopropílico ou o tetra-hidrofurano, ou um éster, como o acetato de etilo ou o acetato de butilo. De preferência usa-se o éter dietílico isento de peróxidos.

Obtém-se, deste modo, uma solução num dissolvente orgânico imiscível com a água de um composto de fórmula geral II purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 tais como substâncias de natureza polipeptídica (com elevado poder alergizante e aceleradoras da degradação dos compostos de fórmula geral I).

A esta solução química adiciona-se uma quantidade conveniente de trietilamina dilúída. De preferência esta adição é efectuada com uma solução orgânica de um composto de fórmula geral II arrefecida a uma temperatura entre 0 e 10°0, de preferência, entre 1 e 3°0· A trietilamina pode ser diluída num dissolvente orgânico apropriado, de preferência, no mesmo dissolvente utilizado na solução do composto de fórmula geral II, A concentração da solução de trietilamina pode ser, por exemplo, 1M.

Obtêm-se, deste modo, uma solução de um sal de trietilamónio do composto de fórmula geral II. 0 referido sal de trietilamónio corresponde à fórmula geral:

Rn

f⁴ H CH CH —Λ ^f/

V 'COO* +N-CH CH (ΣΣΣ)

CH Cr na qual

R-p R2» R^ e R^ possuem os significados definidos anteriormente·

Ê possível adicionar, simultaneamente ou após a adição da trietilamina diluída, uma solução num solvente orgânico de uma amina terciária aromática como, por exemplo, N,N-dimetilanilina. Rovamente 0 dissolvente \ usado pode ser o mesmo utilizado na solução do composto de fórmula geral II·

A solução do sal de trietilamónio de um composto de fórmula geral III num dissolvente orgânico imiscível com a água adiciona-se, em seguida, um derivado reactivo de dimetilsilano, de preferência, diclorodimetilsilano, e deixa-se reagir sob condições adequadas· A adição do derivado reactivo de dimetilsilano pode ser efectuada em solução, de preferência, no mesmo dissolvente em que se encontra dissolvido 0 sal de trietilamónio. A temperatura para a reacção é, de modo adequado, uma temperatura baixa, de preferência entre 0 e 5°C, de modo especialmente preferido entre 1 e 3°C.

Obtém-se deste modo um diéster de sililo de fórmula geral (IV)

na qual R^, Rg, R^ e R^ possuem os significados definidos anteriormente em solução num dissolvente orgânico imiscível com a água sob a forma purificada e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 tais como substâncias de natureza polipeptídica (com elevado risco alergizante).

A solução obtida, após reacção com o derivado dé dimetilsilano, pode ser purificada por cromatografia em coluna antes de prosseguir o processo, opcionalmente, após'concentração. A cromatografia em coluna é, de preferência, efectuada através de gel de sílica utilizando um dissolvente imiscível com a água como, por exemplo, o ciclo-hexano. Para eluição pode utilizar-se um dissolvente orgânico, de preferência um éster como, por exemplo, o acetato de etilo. Por meio deste passo de purificação suplementar obtem-se um composto de fórmula geral IV sob uma forma altamente purificada e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000.

Em seguida efectua-se a hidrólise do diéster de sililo de fórmula geral IV por acção de um sal de uma amina apropriada do ácido 2-etil-hexanoico, por exemplo do 2-etil-hexanoato de trietilamina. Em seguida ou simultaneamente efectua-se uma extraeção aquosa, para o que basta que o sal de amina do ácido 2-etil-hexanóico seja adicionado dissolvido em água. A tempera- 13 tura adequada para a operação de hidrólise e a extracção aquosa é de 0 a 10°0, de preferência de 5°C· Esta hidrólise é efectuada em condições extremamente suaves. Por separação de fases obtém-se uma solução aquosa de um composto de fórmula geral II altamente purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 tais como substâncias de natureza polipeptídica (com elevado risco alergizante).

Esta solução aquosa do composto de fórmula geral II é acidificada por adição de um ácido mineral diluído, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido nítrico, sendo preferível o ácido clorídrico. A adição do ácido mineral diluído é efectuada até se obter uma acidificação adequada, por exemplo, até um valor de pH inferior a 4, de preferência, até ao valor de pH 2,0. e conveniente continuar a trabalhar a uma temperatura reduzida, de preferência a uma temperatura entre 0 e 10°0, de modo especialmente preferido entre 1 e 5°0·

A solução aquosa acidificada do composto de fórmula geral II é extraída com um dissolvente orgânico imiscível com a água. 0 dissolvente orgânico imiscível com a água pode ser um éter, como o éter dietílico, o éter diisopropílico ou o tetra-hidrofurano, ou um éster, como o acetato de etilo, ou o acetato de butilo. De preferência usa-se o éter dietílico isento de peróxidos.

Obtém-se, deste modo, uma solução num dissolvente orgânico imiscível com a água de um composto de fórmula geral II altamente purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 tais como substâncias de natureza polipeptídica

(com elevado risco alergizante)·

A esta solução adiciona-se uma quantidade aproximadamente equimolecular de uma amina terciária de fórmula geral NRgRrjRg na qual Rg, R? e Rg são iguais ou diferentes e representam grupos alquilo inferior, de preferência metilo, etilo ou propilo.

de fórmula geral

Obtem-se deste modo um composto

Rr

Rn

Z^r^r, 'CQÍ

H Rg (V) f/ ⁺N—R η \ ^R 8 na qual

R^, Rg, R^ e R^ possuem os significados definidos anteriormente e Rg, R? e Ηθ representam grupos alquilo inferior, de preferência metilo, etilo ou propilo· composto de fórmula geral V é transformado num composto de fórmula geral I altamente purificado, estável e hipoalergénico por uma das seguintes duas alternativas processuais:

a) Quando R^ representa um átomo de um metal alcalino e 0 composto de fórmula geral I se pode representar pela fórmula geral

na qual

R₂, Ej e R^ possuem os significados definidos anteriormente, e M⁺ representa um catião de um metal alcalino, por exemplo, potássio, sódio ou lítio, faz-se reagir o composto de fórmula geral V anterior com o respectivo sal alcalino do ácido 2-etil-hexanóico no seio de um dissolvente ou de uma mistura de dissolventes orgânicos dipolares, cristalizando o sal do metal alcalino respectivo. São dissolventes adequados, por exemplo, álcoois, de preferência, o metanol, o etanol ou o isopropanol, ou as suas misturas.

b) Quando R^ representa um radical orgânico e o composto de fórmula geral I pode ser representado pela fórmula geral

CGOR , (Ib) na qual

R^, R₂, R₃ e R^ possuem os significados definidos anteriormente e Rg representa um radical orgânico como, por exemplo, pivaloiloximetilo, 3-ftalida ou 1-/(etoxicarbonil)oxi J^-etilo, faz-se reagir o composto de fórmula geral V anterior com um composto de fórmula geral (VI)

Sg possui o significado àntêtibrmente dèfinidb e X significa um grupo eliminável (leaving group) adêqbado, tal como cloro bromo ou iodo, no seio de um dissolvente aprótico dipolar a baixa temperatura, de onde se provoca a cristalização do respectivo éster de fórmula geral lb. 0 dissolvente aprótico bipolar pode ser, por exemplo, a dimetilformamida. A temperatura deve ser de preferência de 0 a 35°0, de modo especialmente preferido a temperatura ambiente.

processo anteriormente descrito com base na sequência reaccional correspondente também pode ser utilizado para o isolamento e a purificação de soluções de compostos de fórmula geral I, sendo nesse caso aplicado a uma solução aquosa de um composto de fórmula geral I em lugar de se partir do caldo de cultura conforme referido. Esta aplicação constitui igualmente um objecto da presente invenção.

Ê ainda um objecto da presente invenção o processo para a preparação de novos compostos intermédios de fórmula geral IV conforme descrito anteriormente e o processo para a purificação de compostos de fórmula geral I caracterizado pelo facto de se preparar um composto intermédio de fórmula geral IV, de se submeter a cromatografia em coluna este composto intermédio e de se hidrolisar o referido composto intermédio conforme descrito em condições suaves.

Tendo a presente invenção sido descrita, em geral, por meio de descrição das operações que caracterizam o processo, apresentam-se em seguida exemplos de execução com o intuito ^r- 17 de elucidar o processo meramente a título ilustrativo e sem limitar o âmbito da invenção. 0 especialista na matéria saberá facilmente ajustar as condições operativas e praticar adaptações das circunstâncias sem sair do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1

Fermentação

1. Produção do inóculo

Preparou-se um inoculo por cultura de um mutante de alto rendimento de Streptomyces clavuligerus em 200 ml de um meio estéril, cujo pH foi ajustado a 7»0, constituído por:

Extracto de malte 10 g

Hidrolisado de proteína 8 g

Hidrolisado de levedura 2 g

Glicerol 20 g

Agua q. b. para 1 1

A cultura foi mantida a 26°0 durante 80 h sob agitação e em condições aeróbicas especialmente favorecidas por um fluxo de ar estéril difundido no meio através de umaplaca de vidro poroso.

F 18

2. Obtenção do caldo de cultura inóculo foi utilizado na proporção de 5»5# para inocular balões esterilizados de 5 1 com 1000 ml de um meio estéril ajustado a pH 7,0 constituído por:

óleo vegetal	1
Bagaço de soja hidrolisado	1,5
Fosfato de sódio e potássio	0,5'
Hidrolisado de levedura	0,05
Agua q. b.	para 1 1

A cultura foi mantida a 26°0 com controlo da actividade inibidora de ^3 -laetamase durante 84 h em condições aeróbicas.

No fim deste período a concentração do ácido clavulânico atingiu cerca de 650 yjg/ml no caldo de cultura.

Exemplo 2

Extracção e purificação

1· Filtração e purificação molecular

1.1. A 5 1 do caldo de cultura produzido de acordo com o Exemplo 1 adicionaram-se sob agitação 150 g de Oelaton FW 80. Filtrou-se sob pressão de azoto lavando o filtro com água destilada. Juntaram-se as lavagens ao filtrado.

1.2. Ao filtrado anterior adicionaram-se 150 g de carvão activado, com agitação, e filtrou-se novamente sob pressão de azoto, lavando o filtro com água destilada que se juntou ao filtrado.

1.3. Ao filtrado anterior juntaram-se 150 g de Celaton FW 80 com agitação. Filtrou-se sob pressão de azoto lavando 0 filtro oom água destilada que se juntou ao filtrado.

1.4. Filtrou-se novamente 0 filtrado anterior desta vez através de um filtro Milipore esterilizante e despirogenizante.

1.5· 0 líquido anterior esterilizado e despirogenizado foi submetido, finalmente, a ultrafiltração molecular selectiva em corrente contínua por filtro Amicon, utilizando uma membrana Diaflo .selectiva de P.M. - 1000, com agitação e sob pressão de azoto.

Obtiveram-se 4800 ml de filtrado com um título de 609 jLig/ml de ácido clavulânico.

2. Extracção

2.1. Os 4800 ml de filtrado foram arrefecidos entre 0 e 3°0, acidificados com ácido clorídrico a 10% até pH 2,0 e extraídos com 1000 ml de éter dietílico isento de peréxidos (por tratamento prévio com uma solução aquosa de ácido sulfúrico e sulfato ferroso).

2.2. Juntaram-se as soluções etéreas e desidrataram-se sobre sulfato de sódio anidro. Filtrou-se e lavou-se 0 filtro

Λ 20 com 200 ml de êter .etílico.

2.3. Obtiveram-se 1650 ml de solução etérea com um título de 1595 /tg/ml de ácido elavulânico (num total de 2633 δ correspondentes a 13,2 mmoles).

Exemplo 3

Preparação do éster de dimetilsililo do ácido elavulânico

À solução etérea obtida de acordo com o Exemplo 2 arrefecida a uma temperatura entre 1 e 3°C adicionou-se uma mistura de 13,2 ml de uma solução IE de trietilamina em éter dietílico com 13,2 ml de uma solução IE de dimetilanilina em éter dietílico (num total de 26,4 ml).

Agitou-se a uma temperatura de 1 a 3°0 durante 15 minutos e em seguida adicionaram-se 13,2 ml de uma solução molar de diclorodimetilsilano em êter dietílico.

Concentrou-se a solução etérea no vácuo a 5°0 até atingir um volume de 100 ml.

Duma parte aliquota (5 ml) da solução etérea concentrada isolou-se o diéster de dimetilsililo por cromatografia preparativa em camada fina sobre gel de sílica (fase móvel: isopropanol/metanol 18:4-2) com revelação à luz U.V. a 254- nm. 0 diéster obtido apresenta-se sob uma forma isenta de impurezas de peso molecular superior a 1000.

Análise para ^10^22^10¾^^9-

Calculado: 0: 4-7,57#; H: 4-,88#; 0: 35,20#; E: 6,16#;

Det erminado: 4-7,4-9 5,01

34,78

6,09 c

Exemplo 4

Purificação do éster silânico

Os restantes 95 ml da solução etérea concentrada do Exemplo 3 continham o diêster de dimetilsililo do ácido clavulânico foram concentrados até à secura no vácuo a 5°0 e o resíduo foi retomado com acetato de etilo·

Esta solução foi purificada por cromatografia em coluna de gel de silica em ciclo-hexano, usando acetato de etilo como eluente.

Secolheu-se a fracção que continha o diêster de dimetilsililo do ácido clavulânieo puro e isento de substâncias de peso molecular superior a 1000.

Exemplo 5

Preparação de uma solução etérea de ácido clavulânieo puro e Isento de substâncias de peso molecular superior a 1000

1. Hidrólise do diêster de dimetilsililo e formação de um sal de amina terciária do ácido clavulânieo.

A solução do diêster de dimetilsilo do ácido clavulânieo puro em acetato de etilo obtida de acordo com o Exemplo 4, adicionaram-se 52,8 ml de uma solução aquosa 0,25 N de etil-hexanoato de trietilamónio à temperatura de 5°C.

Agitou-se durante 15 minutos a 5°C θ separou-se a fase aquosa.

Lavou-se a fase orgânica com 10 + 5 ml de água destilada e reuniram-se as fases aquosas.

Lavou-se a fase aquosa com 3 x 20 ml de éter dietílico. 2. Extracto etéreo de ácido clavulânico puro a partir da fase aquosa.

A solução aquosa do sal de trietilamónio do ácido clavulânico num total de 57 ml com um título de 35,96 mg/ml de ácido clavulânico (num total de 2,050 g correspondentes a 10,3 mmoles de ácido clavulânico )foi acidificada até pH 2,0 com ácido clorídrico a 10% â temperatura de 5°0 θ extraída com 50 + 20 + 20 ml de éter dietílico isento de peréxidos à mesma temperatura de 5°0.

Reuniram-se as fases etéreas e secaram-se sobre sulfato de sódio anidro.

Exemplo 6

Preparação do sal potâssico puro do ácido clavulânico isento de substâncias de peso molecular superior a 1000

Adicionaram-se à solução etérea do ácido clavulânico obtida de acordo com o Exemplo 5, 20,6 ml de uma solução 0,5 N de etil-hexanoato de potássio e 0,5 N de trietilamina numa mistura de isopropanol/metanol a 5°0·

Agitou-se durante 25 min a 5°θ· Pormou-se um precipitado que se separou por filtração no vácuo e se lavou no filtro com isopropanol, secando-se finalmente no vácuo.

Rendimento: 1,9 g correspondentes a 0,008 M de sal potâssico do ácido clavulânico.

-23 Identificação: espectro no IV idêntico ao de uma amostra de sal potássico de ácido clavulânico autêntico·

Exemplo 7

Preparação do éster ftalidico do ácido clavulânico isento de substâncias de peso molecular superior a 1000

Num balão de 25 ml, dissolveram-se 1,5 g (6,3 mmolès)*de clavulanato de potássio obtido de acordo com o Exemplo 6 em 15 ml de dimetilformamida juntando 0,96 g (7 mmoles) de cloridrato de trietilamina e 1,49 g (7 mmoles) de bromoftalida·

Agitou-se dtirante 5 horas a 30°0· Arrefeceu-se a mistura reaccional e deixou-se cair gota a gota sobre água gelada a que previamente se tinha adicionado cloreto de sódio puro. Manteve-se com agitação de um dia para o outro a uma temperatura entre 0 e 3°C.

Eiltrou-se, lavou-se no filtro com água gelada e secou-se no vácuo.

Rendimento: 1,85 g, correspondente a 88,6% do teórico, do éster ftalidico do ácido clavulânico.

Análise para °16^H13⁰7^N

Calculado: C: 58,01%; H: 3,96%; 0: 33,81%; N: 4,23%

Determinado: 58,57 3,90 34,05 4,21

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de compostos altamente purificados, estáveis e hipoalergénicos de fórmula geral na qual

Rj e R£ representam, cada um, independentemente, de hidrogénio ou um grupo amida;

R^ representa um átomo de enxofre ou de oxigénio grupo um átomo ou um

R^ representa um grupo

CH~

CH₃ ou um grupo de fór-25c mula geral ^C=R^ na qual representa um grupo hidroxietilideno; e

R^ representa um átomo de um metal alcalino ou o radical orgânico de um éster apropriado, caracterizado pelo facto (a) de se cultivar uma espécie apropriada de Streptomyces para se obter um composto de fórmula geral na qual

R^, R₂, R₃ e R^ têm os significados definidos antes;

(b)de se ultracentrifugar o composto resultante em solução aquosa, de se acidificar e de se extrair a solução purificada com um dissolvente orgânico imiscível com a água para se obter uma solução orgânica imiscível com a ãgua de um composto purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral II citada antes;

(c) de se adicionar ã solução orgânica obtida em (b) uma quantidade conveniente de trietilamina diluída, a uma temperatura baixa e na presença de uma amina terciária aromática para se obter, em solução, um sal de trietilamónio de fórmula geral .R.

R-, /

Z\

Ή CH_oCH₃C00-^xN-CH₉CH₃ ^CE2^CH3 (in:

na qual

Rj, R-2» R3 ^e R4 têm os significados definidos antes, de se transformai este sal, mediante reacção com um derivado reactivo de dimetilsilano no seio de um dissolvente orgânico apropriado e a uma temperatura baixa, num composto purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral ch₃ na qual

Rp R2, R₃ e R^ têm os significados definidos antes, de se submeter o composto resultante de fórmula geral IV, em solução, a uma cromatografia em coluna para se obter o mesmo composto altamente purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 e de se bidrolisar depois este composto para se obter um outro altamente purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral II citada antes;

(d) de se fazer reagir o composto final obtido em (c), em solução num dissolvente orgânico imiscível com a água, com uma amina terciária de fórmula geral ^NR6^R7^R8 na qual

Ry e Rg representam grupos alquilo inferior, para se obter um composto altamente purificado de fórmula geral (V)

COO-+N-R

Re na qual

Rp Rg, Rg, Rp Rg,Ry e Rg têm os significados definidos antes, e de se fazer reagir depois este composto (i) para a preparação de compostos altamente purificados de fórmula geral

Rn

0' (Ia)

COO- M+ z

28na qual

Rj, R₂, R₃ e R^ têm os significados definidos antes, e

M⁺ representa um catiao de um metal alcalino, com um sal alcalino do ácido 2-etil-hexanóico, ou (ii) para a preparação de compostos altamente purificados de fórmula geral na qual

Rj, R_2> R₃ e R^ têm os significados definidos antes, e Rg representa um radical orgânico, com um composto de fórmula geral

Rq X (VI) na qual

Rç representa um radicla orgânico, e

X representa um grupo eliminável apropriado tal como um átomo de cloro, bromo ou iodo.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se submeter, após fermentação, o caldo de cultura de uma espécie de Streptomyces a filtrações sucessivas, separan-29do as células ou os resíduos celulares,inicialmente com um agente de filtração, depois com carvão activado e novamente com um agente de filtração para se obter um caldo de fermentação purificado.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se escolher a espécie de Streptomyces no grupo constituído por St. clavuligerus, St. jumonjinensis ou St.katsuranamanus .
4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se esterilizar e despirogenar, mediante filtração, o caldo de fermentação purificado para se obter um composto purificado de fórmula geral II em solução aquosa.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se submeter, utilizando uma membrana de um polímero sintético, o composto de fórmula geral II, em solução aquosa, a uma ultrafiltração molecular selectiva em corrente contínua e com um débito elevado das moléculas de peso molecular inferior a 1000 retendo as de peso molecular superior tais como substâncias de natureza polipeptídica, potencialmente alergizantes além de desta bilizadoras deste tipo de compostos, para se obter um composto purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a

1000 de fórmula geral II.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se utilizar uma membrana de ultrafiltração constituída por polímeros sintéticos quimicamente inertes.
7. - Processo de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracte rizado pelo facto de se realizar a ultrafiltração a uma temperatura compreendida entre 5 e 15°C e a uma pressão inferior a 10 atmosferas.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se extrair a solução aquosa do composto purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral II com um dissolvente orgânico imiscível com a água a um pH compreendido entre 1 e 2, para se obter uma solução orgânica imiscível com a água do mesmo composto.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se acidificar o meio com um ácido diluído a uma temperatura compreendida entre 0° e 5°C.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se adicionar a uma solução orgânica de um composto purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral II, arrefecida a uma temperatura compreendida entre 1 e 3°C, uma solução de trietilamina, para se obter uma solu ,-31- ção orgânica de um composto de fórmula geral III purificado e isen to de impurezas de peso molecular superior a 1000.
11.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos intermédios novos altamente purificados e isentos de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral

R„ R,

R,

R,

—p CK, 1 i (IV) J \T Λ. % p. H COO-Si-OOC ' CH₃

na qual

Rj, R2, Rç$ e têm os significados definidos antes, caracterizado pelo facto de se fazer reagir uma solução orgânica de um composto purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral III citada antes com um derivado reactivo de dimetilsilano e de se submeter a solução orgânica do composto resultante a uma cromatografia em coluna.
12.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar como derivado reactivo de dimetilsilano o diclorodimetilsilano.
13. - Processo de acordo com as reivindicações 11 e 12, caracterizado pelo facto de se realizar a reacção no seio de um dissolvente orgânico imiscível com a água e a uma temperatura compreendida entre 0° e 5°C.
14. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se realizar a cromatografia em coluna através de gel de sílica utilizando um solvente imiscível com a água.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se hidrolisar um composto altamente purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral IV, em condições suaves, mediante a adição à solução orgânica do referido composto de uma solução aquosa de um sal de uma amina apropriada do ãcido 2-etil-hexanóico a uma temperatura compreendida entre 0 e 5°C, para se obter um composto altamente purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral II.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de se utilizar como amina a trietilamina.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um composto altamente purificado e isento de impurezas de peso molecular superior a 1000 de fórmula geral V com um sal alcalino do ácido 2-etil-hexanóico no seio de um dissolvente ou de uma mistura de dissolventes orgânicos dipolares a baixa temperatura para se obterem directamente os sais cristalinos de fórmula geral Ia.
18.- Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de se prepararem compostos de fórmula geral Ia na qual M representa um ião de um metal alcalino escolhido entre iões de potássio, sódio ou lítio.
19.- Processo de acordo com as reivindicações 17 e 18, caracterizado pelo facto de se realizar a reacção a uma temperatura compreendida entre 0° e 5°C durante menos de 15 minutos e em condições não agressivas para este tipo de moléculas.
20.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um composto de fórmula geral V com um composto de fórmula geral VI no seio de um dissolvente aprótico dipolar a uma temperatura baixa para se obterem compostos cristalinos de fórmula geral lb.
21.- Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de se realizar a reacção a uma temperatura compreendida entre -5° e +10°C durante um período de 30 minutos a

3 horas.
22. - Processo de acordo com as reivindicações 20 e 21, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos que comportam um grupo pivaloiloximetilo, 3-ftalida ou 1-[(etoxicarbonil) oxi]-etilo representado pelo símbolo R^.
23. - Processo de acordo com as reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo facto de se isolarem, do meio reaccional, a uma temperatura compreendida entre 1 e 15°C, os compostos resultantes mediante a adição de água.
24. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizarem reagentes comportando um grupo amino de fórmula representado pelos símbolos ou R2,