PT94782A

PT94782A - Processo para a preparacao de sais de acido n5,n10-metilen-5,6,7,8-tetrahidrofolico

Info

Publication number: PT94782A
Application number: PT94782A
Authority: PT
Inventors: Fabrizio Marazza; Attilio Melera; Nando Toderi; Rene Viterbo
Original assignee: Sapec Fine Chemicals
Priority date: 1989-07-21
Filing date: 1990-07-20
Publication date: 1991-04-18
Also published as: NO903211D0; EP0409125A1; CA2021042A1; BR9003527A; AU619124B2; DE59010025D1; IE902656A1; EP0409125B1; FI903692A0; ATE132498T1; AU5905990A; JPH03128380A; ES2083983T3; NO903211L

Description

-3-

A presente invenção refere-se a 5 10 sais do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico, processo para a sua preparação, bem como seu emprego para a preparação de um medicamento para influenciar sinergisticaménte um composto para combater o câncer e/ou para evitar a toxicidade de um composto que combate o câncer e/ou para proteger células humanas e/ou animais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

C 1 A O ácido N -metilen-5,6,7,8-—tetrahidrofólico da fórmula II (abreviado com CHg-THP) é a espécie química, que actua como co-factor na inibição do enzima timidilatsintetase (abreviada com TS) com 5-fluorouracila (abreviada com 5-FU) e/ou com um dos pré-estágios (prodrug), como por exemplo, Floxuridlne, Tegafur. A 5-FU ou um dos pré--estágios são transformados metabolicamente em 5F-desoxiurudi-nemonofosfato (abreviado com 5F-dUMP), o qual está ligado co-valente e irreversivelmente ao TS na presença do C^-THF, sendo formado um complexo ternário, o qual é descrito como 5F-dUMP/TS/CH2-THF. A 5-FU e seus pré-estágios são apli^ cados em grande escala como agente quimioterápico no tratamento do cólon, do carcinoma retal e pancreático, tal como também em outras formas de câncer, como por exemplo, câncer da mama e câncer do estômago. Para aumentar a citotoxicidade para as células do tumor, tem que ser obtida a maior cota de inibição do TS. Isto exige uma providência adequada daquelas células com 5-FU (ou com um de seus pré-estágios) e com o co-factor CHgTHF. Enquanto a 5-FU (ou seus pré-estágios) são compostos exógemos, os quais podem ser administrados aos pacientes em qualquer

\

-4- quantidade desejada, o Cí^-THF tem sua origem, normalmente, na decomposição de folato endógena via um número de transformações metabólicas. No entanto, a quantidade de Cí^-THF formada por este processo, pode não ser suficiente para uma inibição eficiente e completa de TS.

Por isso, desenvolveu-se como hábito, empregar protocolos de tratamento clínico, nos quais o folinato de cálcio (abreviado com CaF), um precursor metabólico de CHg-THF, é posto à disposição de um paciente em altas doses com 5-FU. Veja R.J. DeLap, The Yale Journal of Biology and,Medicine, 61, 23 (1988). Estas altas doses de CaF resultam em efeitos colaterais, como por exemplo, diarreia e estomati-te; veja G. Marini et al. Oncology 44, 336 (1987). Até agora, não pôde ser obtido o cuidado de um paciente com quantidades adequadas de CE^-THF, isto é, a própria espécie formadora do complexo ternário, pois não havia à disposição nenhum processo em grande escala técnica para a preparação de um composto suficientemente puro, bem hidrossolúvel e estável.

ESTADO DE TÉCNICA

Foi descrita por diversos autores a preparação em pequena escala técnica de CHg-THF como ácido livre; veja R. L. Blakley, Biochem. Journal, 72, 707 (1959); M.J. Osborn, P.T. Talbert, F.M. Huennekens, J. Am. Chem. Soc. 82, 4921 (1960); R.G. Kallen, W.P. Jenks, J. Biol. Chem. 241, 5851 (1966); P.R. Farina, L.J. Farina, S.J. Benkovic, J.Am. Chem. Soc. 95^, 5409 (1973); R.P. Leary, Y. Gaumont, R.L. Kisliuk Biochem. Biophys. Res. Comm. 56, 484 (1974); R.L. Kisliuk, D. Strumpf, Y. Gaumont, R.P. Leary, L. Palnte, J. Med. Chem. 20, 1531 (1977); M. Poe, L.M. Jackman, S.T. Benkovic, Biochemistry

18, 5527 (1979) e R. Kalbermatten, W, Staedeli, J.H. Bieri, M. Viscontini, Helv, Chim, Acta 6£, 2627 (1981). C. Zarow, A.M. Pellino, P.V. Darve-berg, Prep. Biochem. 12, 281 (1983) descrevem um processo de preparação "em grande escala técnica" , o qual abrange um estágio de redução enzimático.

Em todos os casos, no entanto, o produto não pode ser isolado de outro modo senão na forma lio-filizada ou como um pó amorfo (veja C.M. Tatum Jr., P.A. Ben-kovic, S.T. Bencovik, R. Potts, Biochemistry 16, 1903 /1977.7) e em uma pureza não superior a 80%, o que torna este produto inútil para o emprego terapêutico no homem.

Foram descritos dois processos de síntese, para obter Cf^-THF como ácido livre.

PRIMEIRO PROCESSO O ácido 5,6,7,8-tetrahidrofólico

da fórmula IV

COQH

C00H (IV) -6-

V - -ν ί·' -Vj. V Η ** χ>·

é reagido com um excesso de formaldeído ènr sólução aquosa, com um valor do pH de 7. Veja, para isso, M. Poe, L.J. Jackman, S. T. Benkovic, Biochemistry IjB, 5527 (1979); R. Kalbermatten, W. Staedeli, J.H. Bieri, M. Viscontini, Helv. Chim. Acta 64, 2627 (1981); C. Zarow, A.M. Pellino, p.V. Danenberg, Prep. Biochem. 12, 381 (1983). Este processo só ê adequado para a preparação de quantidades de miligramas de ácido livre da fórmula II

0 i -IL-i- H H H 11

O

(II)

COOH -K

•H H

COOH e, devido à instabilidade inerente do CH2-THF em solução aquosa com pH 7, conduz a um produto com pouca pureza (inferior a 80¾); veja R.G. Kallen, W.P. Jenks, J. Biol. Chem. 241, 5851 (1966). -7-

-'ν; SEGUNDO PROCESSO"

O ácido ΙΓ*, N^-metenil-5,6,7,8-tetrahidrofólico na forma do cloreto da fórmula V

é reduzido em um solvente anidro com NaBH^. CH2-THF como ácido livre da fórmula II mencionada acima, é isolado como um corpo sólido amorfo com uma pureza de 75 até 80%; ver para isso, P. R. Farina, L.J. Farina, S.J. Benkovic, J. Am. Chem. Soc. 95, 5409 11973); C.M. Tatum Jr., P.A. Benkovic, S.T. Benkovic, R. Potts, Biochemistry 1£, 1903 (1977). A Ct^-THF na forma do ácido livre é praticamente insolúvel na água e como tal, é inadequada para preparados farmacêuticos parenterais.

Foram encontrados, agora, totalmente surpreendentemente, processos, que são adequados para a produção em grande escala técnica, para a preparação de novos sais de CHg-THF hidrossolúveis estáveis e terapêuticamente aceitáveis, os quais $ão suficientemente puros para serem administrados a um paciente. -8-

A presente invenção é caracteriza-da pelas características nas reivindicações independentes. Formas de execução preferidas são definidas nas reivindicações independentes.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Na tabela I são reunidos alguns dos compostos preferidos de acordo com a invenção.

H

N 0

H COQ*

3a R = H (bskannt)

Na+>Fyridinium '5c R = [H0(CH2 )2^^3]4

3d R = { 3e R = 3f R = 3g R = 3h R *= |T R n R '31 R 3>n R HQ(CH2)2]3NH} + HO(CH2)2NH(CH3)2]' (CH3) 3CNH3] * k(L)-Lysin ]+ {Lj-Arginin ] + 1/2 Ca2+ 1/2 Mg2+

Na+ K' 3n R ^ I>i +

Na tabela II é representada esquematicamente a preparação de alguns compostos preferidos de acordo com a invenção. -10-

TABELA II

Η—Η Η—Η C00"Ó^+ou (φ) Η + 3b

HjO"1

V C00H Η Η Η COOH ΙΩτ 1 R*-MHa ou j he+ “OH (método A) R- H I 'Kl· H· H-

-H -H •H ou

He* COO" ou fie+ 3 c-h,(?-n Ι.ΜοΟΗ

2, (V Ϋ

H COO' I - Kl —j— H H- H· H H COO'

lV f:00 (RWHí22 CoOOU (Ma1), (método B) 3 c-h, t-n + (Coo-^ Hex + 3lk 5 „10 R- N ,N -Metileno-5,6,7,8-tetra-hidropteroilo χ\'

Os diferentes sais de acordo com a invenção, podem ser preparados ou directamente a partir do composto da fórmula 3a (método A) ou por meio da reacção de um sal de metal alcalino-terroso, por exemplo, o sal de cálcio da fórmula 3jL, com o sal do ácido oxálico do catião ou da amina correspondente (método B). A pureza HPLC do sal de CHg-THF obtido por este processo, varia entre 83,8 e 92,4%; a "impure-za" principal desta preparação constitui-se do ácido (6RS)-N --metil-5,6,7,8-tetrahidrofólico bem conhecido e terapêuticamente valioso, de modo que a quantidade total de folatos reduzidos na preparação importa, em média, em 95%.

MÉTODO A O composto da fórmula 3a foi preparado por meio da reacção do composto da fórmula V num solvente tal como por exemplo, DMSO (dimetilsulfóxido) na presença de uma base tal como por exemplo, piridina, com a respectiva quantidade de NaBH^, obtendo-se o composto da fórmula 3b, o qual é ulteriormente dissolvido em uma solução de KOH fria; o composto da fórmula 3a é obtido por meio da acidificação. O composto da fórmula 3a é reagido sucessivamente com uma base farmacêuticamente aceitável, tal como por exemplo, etanolamina, trietanolamina, 2-dimetilamino-etanol, terc.-butilamina ou com ácidos aminocarboxílicos, tais como por exemplo, lisina, arginina, sendo formados sais hidros-solúveis. 0 composto da fórmula 3a também pode ser reagido com catiões, tais como por exemplo, Ca , Mg , Li , Na , K , sendo formados os sais hidrossolúveis correspondentes, os quais 12-

são isolados pelas precipitações da solução aquosa por meio da adição de um solvente orgânico, tal como por exemplo, eta-nol, acetona, Veja tabela II.

MÉTODO B

Os sais de metal alcalino-terroso, por exemplo, o composto da fórmula 3i, os quais foram obtidos por meio do método A, foram reagidos com o sal do ácido oxáli-co da amina escolhida ou do aminoácido correspondente ou do catião correspondente. Condicionado pela precipitação do oxa-lato de metal alcalino-terroso insolúvel na água, o sal proveniente correspondente permanece em solução e só é precipitado pela adição de um solvente hidrossolúvel orgânico, tal como por exemplo, etanol, acetona. Veja tabela II.

MÉTODO C

Verificou-se, agora, um outro terceiro processo, o qual é adequado para a produção em grande escala técnica, para a preparação de sais de metais alcali-no-terrosos de ácido N ,N -raetilen-5,6,7,8Ttetrahidrofólico.

Com o terceiro processo de acordo com a invenção, obtêm-se os sais de metal alcalino-terroso em grande rendimento e em alta pureza. Além disso, neste processo de acordo com a invenção, trabalha-se em meio aquoso, o que

simplifica consideravelmente o isolamento dos sais de metal alcalino-terrosos desejados.

Neste processo de acordo com a invenção, introduz-se previamente uma solução aquosa de um sal hidrossolúvel do ácido 5,6,7,8-tetrahidrofólico e reage-se o mesmo, depois, com formaldeído. Em seguida, acrescenta-se uma solução aquosa de um sal de metal alcalino-terroso, sendo que precipita o sal de metal alcalino-terroso correspondente. 0 sal de cálcio e o sal de magné- * 5 10 sio do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico são preferidos . 0 ácido 5,6,7,8-tetrahidrofólico pode ser preparado, por exemplo, de acordo com os dados de E. Khalifa, A.N. Ganguly, J.H. Bieri e M. Viscontini, Helv. Ch. Acta (1980), õjJ, 2554.

Os sais de acordo com a invenção podem ser empregados para a preparação de um medicamento para influenciar sinergisticamente um composto que combate o câncer e/ou para reduzir a toxicidade de um composto que combate câncer e/ou para proteger células humanas e/ou animais. Um tal medicamento contém, usualmente, pelo menos, um sal activo numa quantidade de 1 mg até 500 mg, especialmente de 5 mg até 150 mg por unidade de dosagem. O medicamento apresenta-se, de preferência, na forma de um preparado farmacêutico parenteral e/ou oral.

Os exemplos abaixo servem para ilustrar a invenção. São descritos igualmente resultantes cli nicos e aplicações terapêuticas destes compostos. 14-

EXEMPLO 1 5 10

Preparação do ácido (6RS)-N ,N --metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3a.

Em uma solução de 24,6 g do composto da fórmula V (preparado de acordo com C. Temple. R.D. Elliot J.D. Rose, J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22_, 731 /1979,7) em uma mistura de 300 ml de DMSO seco e 100 ml de piridina seca, agitada sob exclusão de oxigénio à temperatura ambiente, acrescenta-se em gotas uma solução de 2,0 g de NaSH^ em 100 ml de DMSO durante uma hora. Em seguida, esta mistura é diluída com dois litros de acetona durante 20 minutos. Depois de outra agitação da mistura durante uma hora a uma temperatura de +42C, o sal da fórmula 3b misturado precipitado é recolhido por meio de filtração e lavado três vezes com acetona fresca. Após a secagem sob baixa pressão, são isolados 16,17 g de composto bruto da fórmula 3b. A análise HPLC mostra, que este produto era puro em 87,1%. 0 produto mencionado acima é acrescentado a 420 ml de água desgaseifiçada e é agitada sob exclusão de oxigénio a uma temperatura de +42C. Em seguida, acrescenta-se em gotas KOH frio a 0,5M na suspensão agitada, até observar-se uma dissolução completa. O valor do pH da solução assim obtida importa em 7,5 e o ácido livre da fórmula 3a é precipitado por meio do acréscimo em gotas de HC1 IN frio, até que o valor do pH da solução sobrenadante alcance um valor de 3,95. Depois de outra agitação a +42C durante 10 minutos,recolhe-se o ácido livre da fórmula 3a por meio de filtração, lava-se uma vez com água fria, bem como uma vez com acetona e ".-. * 'ί ι'1 Ν uma vez eom éter dietílico isento de peróxido.

Após a secagem sob pressão reduzida, são isolados 11,36 g do composto amorfo da fórmula 3a.

Análise HPLC: 86,5% de pureza / 7,6% de N5-metil-THF.

Este produto não é purificado ulte-riormente, mas sim, transformado em diferentes sais, como é descrito mais abaixo. EXEMPLO 2

Preparação do sal de etanolamina 5 10 do ácido (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3c (método A).

Em uma solução de 11,36 g do composto da fórmula 3ja, dissolvido em 170 ml de DMSO seco e agitado à temperatura ambiente sob exclusão de oxigénio, acrescenta--se gotas uma solução de 3,0 ml de etanolamina (2 equivalentes) eml50 ml de DMSO. íJm seguida, a mistura é libertada, por filtração, de uma leve turvação e é acrescentada vagarosamente a 600 ml de acetato de etilo agitado. Depois de outra agitação durante 20 minutos à temperatura ambiente, o produto precipitado é recolhido por filtração e lavado duas vezes com acetato de etilo e uma vez com éter dietílico. Após a secagem sob baixa pressão, são isolados 14,22 g do composto da fórmula 3c.

Análise HPLC: 88,3% de pureza /7,1% de N5-metil-THF.

UV (c = 20 mg/1 em tampão de fosfato a 0,1 H em pH de 7,3)= 293 nm (£= 43000)λ . = 247 max ' mm max η» A_. /A . =3,9. ' min ' * +10,4Q (C = 1 em tampão de fosfato 0,1 M em pH de 7,3). RMN (220 MHz / em DMSO-piridina 9:1) : 2 dupletos características (J = 4 Hz) em 5,05 ppM (1H)/ 3,85 ppM (1H) para os protões de metileno C-ll. EXEMPLO 3

Preparação do sal de trietanolami-na do ácido (6RS )-N^ ,N^-metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3d (método A).

Em uma solução de 4,35 g do composto da fórmula 3ja em 50 ml de DMSO seco, agitada à temperatura ambiente sob argónio, acrescenta-se às gotas uma solução de 2,84 g de trietanolamina (2 equivalentes) em 14 ml de DMSO.

Após a filtração de uma pequena quantidade de precipitado branco, a solução é acrescentada às gotas a uma mistura agitada de 220 ml de etanol e 110 ml de éter dietílico. A suspensão é agitada durante mais 30 minutos a uma temperatura de +4âC. O corpo sólido é recolhido por meio de filtração, lavado uma vez com etanol/éter dietílico 2:1 e uma vez com éter dietílico e seca sob baixa pressão, sendo obtidos 4,88 g do composto da fórmula 3d. -17-

Análise HPLCí 90,3% de pureza / 5,8% de N5-metil-THF. UV (c = 20 mg/1 era tampão de fos- fato 0,1 M era pH de 7,3): 246 nm Am /A. =4,9. max mm ' λ max “ 295 <6 = 37800- mm = +11,7S (c = 1 em tampão de fosfato 0,1 M em pH de 7,3). RMN (220 MHz / em D2)/NaOD) 2 du-pletos caracterlsticos (J = 4 Hz) em 5,03 ppM (1H) / 3,90 ppM (1H) para os prótons de metileno C-ll. EXEMPLO 4

Preparação do sal de 2- dimetilami-noetanol do ácido (6RS)-N^,N10-metilen-5,6,7,8-tetrahidrofóli-co da fórmula 3e (método A).

Em uma solução de 4,0 g do composto da fórmula _3a em ml de DMS0 seco, agitada à temperatura ambiente sob exclusão de oxigénio, acrescanta-se em gotas uma solução de 1,76 ml de 2-dimetilaminoetanol (e equivalentes) em 13 ml de DMSO. Após a filtração de uma pequena quantidade de precipitado, a solução é acrescentada em gotas a uma mistura agitada de 200 ml de etanol e 100 ml de éter dietílico a uma temperatura de +42C. Após a agitação durante outros 30 minutos na mesma temperatura, o corpo sólido é recolhido por meio de filtração e lavado uma vez com metanol-éter dietílico 251 e uma “'wy·-- 18-

>7 -- Vi *

- λ' δ Cl ^ ,.· vez com éter dietílico. Após a secagem sob pressão reduzida, são isolados 3,93 g do composto da fórmula 3e.

Análise HPLCí 91% de pureza/5,7% de N -metil-THF. UV (c = 20 mg/1 em tampão de fosfa to 0,1 M em pH de 7,3) ^ max = 295 nm (έ= 312000 >*min 246 nm A /A . =4,5, max' mm ' +12,13 (c=l emttampão de fosfato 0,1 M em pH de 7,3). RMN (220 MHz / em D20/Na0D): 2 du-pletos característicos (J = 4 Hz) em 5,03 ppM (1H) / 3,90 ppM (1H) para os prótons de metileno C-ll. EXEMPLO 5

Preparação do sal de terc.-butil- 5 10 amina do ácido (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3jE (método A).

Em uma solução de 4,3 g do compos to da fórmula 3a em 60 ml de DMSO seco, agitada à temperatura ambiente soh argón, acrescenta-se em gotas uma solução de 1,97 ml de terc.-butilamina (2 equivalentes) em 17 ml de DMSO. Após poucos minutos de agitação, forma-se um precipitado espesso. A mistura é agitada mais a uma temperatura de +183C durante uma -19-

hora. 0 produto é isolado por meio de repetida centrifugação a 3500 rotações/min (rpm), sendo que o produto é suspenso pre viamente em uma mistura de 100 ml de etanol e 50 ml de éter dietílico e depois, em éter dietílico puro.

Após a secagem sob baixa pressão, isolaram-se 4,63 g do composto da fórmula 3f.

Análise HPLC: 89% de pureza/7,1% de N5-metil-THF. UV (c = 20 mg/1 em tampão de fosfa to 0,1 M em pH de 7,3) mm λ max = 295 (6= 32700)λ 246 nm A /A . =4,5. max mm fosfato 0,1 M em pH de 7,3). paiem tampão de RMN (220 MHz/ em DgO/NaOD): 2 du-pletos característicos (j = 4 Hz) em 5,03 ppM (lH)/3,90 ppm (1H) para os prójtonsade tnetileno C-ll. EXEMPLO 6

Preparação do sal (L)-lisina do C -I Π. ácido (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula (método A).

Em uma solução de 4,05 g do composto da fórmula 3a em 55 ml de DMSO seco, agitada à temperatura ambiente sob argón, acrescenta-se em gotas uma solução de 2,60 g de (L)-lisina (2 equivalentes) em 15 ml de DMSO. Após a agitação durante alguns minutos, forma-se um precipitado espesso. A mistura é agitada, além disso, a uma temperatura de +18SC, durante uma hora. O produto foi isolado por centrifugação repetida a 3500 rpm, sendo que o produto foi suspenso anteriormen-te em uma mistura de 100 ml de etanol e 50 ml de éter dietíli-co e em seguida, em éter dietílico puro.

Após a secagem sob baixa pressão, são isolados 5,03 g do composto da fórmula 3g.

Análise HPLC: 90% de pureza/6,1% de N -metil-THF UV (c = 20 mg/1 em tampão de fosfa- to 0,1 M em pH de 7,3): nm, A /A . =4,4. * max mm ' fosfato 0,1 M em pH de >max * 295 “ (€,=29500 )Amin = 246 Cof.7d= +11,59 (c=l em tampão de RMN (220 MHz/em D20/NaOD): 2 duple-tos característicos (J = 4 Hz) em 5,03 ppM (lH)/3,90 ppm (1H) para os prótons de metileno C-ll. EXEMPLO 7

Preparação do sal de (L)-arígini- c í n na do ácido (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3h (método A), 0 sal de (L)-arginina da fórmula 3h foi preparado de modo é maneira análogos, como descrito no Exemplo 6. EXEMPLO 8

Preparação do sal de cálcio do áci C 1(] do (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3i (método A). 1,0 g do composto bruto da fórmula 3b é acrescentado em pequenas quantidades a uma mistura de 16 ml de água desgaseifiçada e uma gota de NaOH IN e agitado vigorosamente a uma temperatura de +42C. Durante a adição, o valor do pH da mistura é mantido em aproximadamente 9,0 por meio da adição eventual de NaOH 1H. Depois, acrescenta-se 0,92 ml de uma solução de cloreto de cálcio 2M à mistura. Depois da agitação durante 10 minutos, a solução é libertada de um precipitado insolúvel por meio da filtração. Finalmente, a mistura é diluída às gotas com 20 ml de acetona sob agitação a uma temperatura de +42C, obtendo-se um precipitado amarelado, o qual foi isolado por meio da filtração e foi lavado uma vez com éter absoluto e uma vez com acetona e foi secado sob baixa pressão. 22-

Deste modo e maneira, são isolados 673 mg do sal de cálcio de fórmula 31..

Análise HPLC: 91% de pureza/6% de N^-metil-THP, UV (c = 20 mg/1 em tampão de fosfato 0,1 M em pH de 7,3): \ v = 296 nm (£ = 28900) λ. = 245 nm Λπιηχ mm

Amax^Amin = 3,68. /^7d=+12,6S (c = 1 em NaOH 0,01 N).

Teor HgO (segundo Karl Pischer): 8,9%.

Análise elementar para CHg-THF.

Ca x 3,5 E^O

Valor exp.

Valor calculado % c 43,02 % H 5,05 % N 17,56 % Ca 7,18 43,27 4,84 17,57 6,99 EXEMPLO 9

Preparação do sal de magnésio do - . 5 10 acido (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3k (método A). 1,0 g do composto bruto da fórmula 3b é acrescentado em pequenas porções a uma mistura de 16 ml de água desgaseifiçada e uma gota de NaOH IN e vigorosamente agitado a uma temperatura de 140C. Durante a adição, o valor do pH da mistura é mantida em aproximadamente 9,0 por meio da adição eventual de NaOH IN. Em seguida, acrescenta-se 0,92 ml de uma solução de cloreto de magnésio 2M à mistura. Após a agitação durante 10 minutos, a solução é libertada de um pequeno precipitado insolúvel por meio da filtração. A mistura é diluída às gotas com 20 ml de acetona, sendo que a mistura é agitada a uma temperatura de +42C. Foi obtido um precipitado amarelado, o qual foi isolado por meio de filtração e lavado uma vez com HgO, uma vez com etanol e uma vez com acetona e foi secado sob baixa pressão. Deste modo e maneira, são isolados 537 mg do sal de magnésio da fórmula 3k.

Análise HPLC: 92,4% de pureza/3,4%

UV (c = 20 mg/1 em tampão de fosfato 0,1 M em pH de 7,3): mm = 296 nm (£= 27600)}. #244 nm, A max

« 3,68 /^7D=+12,1S (c = 1 em NaOH 0,1 N).

Teor de H20 (segundo Karl Fischer): 8,9%.

Análise elementar * para CHg-THF.Mg x 5 H20

Valor calculado Valor exp % c 42,17 42,26 % H 5,49 5,51 % N 17,21 16,30 % Mg 4,27 5,02. Amostra secada ao ar: 15,8% de H20 = pentahidrato. EXEMPLO 10

Preparação do sal de sódio do

C *J A ácido {6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 31 (método B). 1,0 g de sal de cálcio da fórmula 3i é acrescentado a 15 ml de uma solução de 0,133 M de oxalato de sódio em H^O e agitada a uma tempetatura de +4QC sob exclusão de oxigénio. Depois de 30 minutos de agitação na mesma temperatura, o oxalato de cálcio precipitado é removido da mistura por meio de centrifugação e é obtida uma solução sobrenadan-te límpida, a qual foi diluída vagarosamente com 75 ml de acetona, a uma temperatura de +4ôc. O precipitado obtido foi isolado por meio de filtração, lavado uma vez com acetona fresca e secado sob baixa pressão, para fornecer 737 mg do composto da fómrula 51 como um pó amarelo.

Análise HPLC: 88,6% de pureza/4,5% de N5-metil-THF. UV (c = 20 mg/1 em tampão de fos fato 0,1 M em pH de 7,3): λ max - 296 nm (6=29600)λ . =245 nm ' mi n mm A max

= 4,00. ΰ*7d=+12»5s <c = 1 em NaOH 0,01 N) EXEMPLO 11

Preparação do sal terc.-butilami- 5 10 na do ácido (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahifólico da fór mula 3f[ (método B). 1,0 g de sal de cálcio da fórmula 3i é acrescentado a 15 ml de uma solução 0,133 M do sal do ácido oxálico de terc.-butilamina e agitada a uma temperatura de +4SC sob argônio. Depois de 30 minutos de agitação na mesma temperatura , o precipitado do oxalato de cálcio é removido por meio de centrifugação e a solução sobrenadante límpida obtida é diluida vagarosamente com 75 ml de acetona sob agitação, a uma temperatura de +4ôC. 0 precipitado obtido foi isolado por meio de filtração, lavado uma vez com acetona fresca e secado sob pressão reduzida, para fornecer 965 mg do composto da fórmula 3i como um pó amarelado.

de N5-metil-THF

Análise HPLC; 87,2¾ de pureza/5,15á /butros dados analíticos, ver Exemplo 57.

EXEMPLO 12

Preparação do sal de magnésio do 5 10 ácido (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3k (método C). 65 g do ácido 5,6,7,8-tetrahidro-fólico são suspensos em 400 ml de água e o valor do pH foi levado para um valor de 9,0 por meio da adição de amoníaco concentrado, sendo obtida uma solução límpida. Depois, gotejam-se 13 ml de uma solução de formaldeído aquosa a 36% e deixa-se a mistura em repouso durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Após a adição de uma solução de 50 g de MgCl2.6H20 em 50 ml de água, agita-se a mistura assim obtida durante 30 minutos à temperatura ambiente e deixa-se a mesma em repouso, depois, durante 2 horas. Depois o produto desejado é filtrado sob sucção e lavado uma vez com água e uma vez com etanol. Após a secagem em baixa pressão a 50SC, isolam- ->5 10 se 27 g do sal de magnésio do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8--tetrahidrofólico puro.

Análise HPLC: 98,8% de pureza. UV (c = 20 mg/1 em NaOH 0,01 N): 71 „=296 nm (ê =30200 )/*. = 245 nm max mm 4,82. A /A . max mxn /^7d=+9 ,4° (c=l em NaOH 0,01 N).

EXEMPLO 13

Preparação do sal de cálcio do aci- 5 10 do (6RS)-N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula 3i (método C). 190 g de acido 5,6,7,8-tetrahidro-fólico são suspensos em 1250 ml de água. Depois são acrescentados 90 ml de amoníaco concentrado e 50 ml de piridina, obtendo--se um valor do pH de 8,5.

Após a adição de 40 ml de solução de formaldeído aquosa a 3656, a mistura é filtrada através de uma camada de carvão activo e celite.

Na solução límpida obtida colocam-se sob agitação 200 ml de uma solução de cloreto de cálcio a 30% e ajusta-se o valor do pH para um valor de 9,0 mediante adição de amoníaco concentrado.

Depois resfria-se para uma temperatura de +52C e deixa-se a mistura em repouso durante 2 horas.

Em seguida, filtra-se a lava-se o produto obtido uma vez com água e uma vez com etanol. Após a secagem sob baixa pressão a uma temperatura de 502C, isolam-se 180 g do sal de cálcio do 5 10 ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico puro.

Análise HPLC: 96 ,556 de pureza/0 ,6/6 de N -metil-THF. UV (c = 20 mg/1 em NaOH 0,01 N): >max=296 nm <£=26400)^=245 nm A /A . =4,87. max mm ' 28-

[c<]ό=+1Έ,3° (c 3 1/NaOH 0,01 N). ς i λ

Sais do ácido (6R)- e (6S)-N,N - metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico de acordo com os exemplos 2 -- 11 são obtidos do mesmo modo e maneira, quando se partem, em cada caso, dos ácidos (6R) e (6S) livres.

Estabilidade dos compostos das fórmulas 3c, 3d, 3e, e 3f em tampão de fosfato 0,1 M;

Oma solução de 0,1% era tampão de fosfato 0,1 M/pH 9,0 de cada um dos elementos compostos do título , foi analisada por meio de HPLC nos tempos 0, 60, 120, 300 minutos, sendo efectuadas, em cada caso, injecções de 2,5 microlitros. A recuperação porcentual no tempo x (R ) foi obti-da mediante a fórmula abaixo: R„ - (B/A) . 100, em que

X A representa a superfície do pico de CHg-THF integrada no tempo 0 e B representa a superfície do pico integrada no tem- po x.

Tempo R (3c) X 11,111 R (3d) X 1' ™" Rx (22> Rx(3f> 0 100 100 1Q0 100 60 96,7 95,7 97,6 97,0 120 93,3 92,1 94,2 94,3 300 85,1 - 88,3 87,5 -29-

Preparados farmacêuticos para injecções a) Ampolas com líquidos

Os compostos dos Exemplos 2 até 13, em uma quantidade de 5-150 mg, foram dissolvidos em um tampão farmacêuticamente aceitável, tal como por exemplo, tampão de fosfato 0,1 M, de modo que a solução tinha um valor do pH de 9,0. A solução é filtrada até a esterilidade e enchida em ampolas de vidro escuras, as quais foram vedadas sob condições estéreis.

EXEMPLO

Um composto dos Exemplos 2-13: 5 - 150 mg;

Solução de tampão, ajustada para pH 9,0: 1 - 50 ml. b) Preparados liofilizados

Os compostos dos Exemplos 2 até 13, em uma quantidade de 50-250 mg, foram dissolvidos ou num tampão farmacêuticamente aceitável, tal como por exemplo, tampão de fosfato 0,1 M ou numa solução de cloreto de sódio fisio- -30-

lógiea. A solução foi filtrada até a esterilidade, enchida em tubinhos de ensaio e liofilizada da maneira conhecida pelo técnico. Se necessário, o pó liofilizado pode ser reconstituído pela adição de água estéril antes da administração. v--'·

EXEMPLO

Om composto dos Exemplos 2 - 13; 50 - 250 mg ou solução tampão ou solução de cloreto de sódio fisiológica; 3 - 20 ml.

Liofilização da solução estéril.

Preparados farmacêuticos para a aplicação oral

Como um exemplo de um preparado oral, são descritas formulações para comprimidos revestidos en-tericamente, onde está claro, de que podem ser preparadas de modo e maneira análogos outras formas orais, tais como por exemplo, cápsulas revestidas enterieamente.

Comprimidos revestidos entericamente

Os comprimidos revestidos entericamente, os quais podem conter 5-30 mg de um dos componentes dos Exemplos 2-13, são preparados da maneira conhecida per se ' .<·ιίν\ no estado da técnica, sendo que o revestimento entero é efee-tuado de acordo com &Remington Pharmaceutical Sciences”, páginas 1614, 151 edição, 1975 e "Theory and Practice of Industrial ΡΙ^η^ογ’1, Lackman, 21 edição 1976. Liberman, Caning, páginas 116, 371, 470 -

EXEMPLO

Composto dos exemplos 1-13; 5 até 30 mg

Lactose USP: 150 até 125 mg Amido NF: 35 até 30 mg

Estearato de magnésio NF: 3 mg

Eudragit NF: 4 mg Talco NF 4 mg

Polietilenoglicol 6000 NF. 0,4 mg

Resultados clínicos e aplicações 5 10 terapêuticos de sais de ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahi- drofólico. Como exemplos das aplicações tera- pêuticas possíveis dos compostos descritos, apresentam-se os seguintes resulta clínicos:

Sexo: Idade: Diagnóstico: Tratamento: femenino 19 sarcoma osteogêneo com queixas de respiração e de deglutição.

Foi administrado 5-fluorouracila endovenoso (300-750 mg/semana) em combinação com sal de S 10 cálcio do ácido N ,N -raetilen-5,6,7,8-tetra-hidrofólico administrado por via endovenosa (100 mg/semana).

Resultado clínico depois de 5 semanas do tratamento - redução visível do volume do tumor - desaparecimento das queixas de respiração e de deglutição.

PACIENTE B

Sexo: masculino

Idade: 52

Diagnóstico: tumor retal com metástases no fígado

Tratamento: 5-fluorouracila administrada por via endovenosa (300 mg/semana) em combinação com sal de cálcio 5 10 do ácido N rN -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico administrado por via endovenosa (100 mg/semana).

Resultado clínico depois de 5 semana de tratamento: - necrose do tumor e separação do tecido necrótico - aumento de peso do paciente. -33-

;. 5 30 Ν

Verifica-se, que um tratamento anterior do paciente com quantidades equivalentes de 5-fluoro-uracila e Leucovorin Calcium não forneceu nenhuma melhora comparável do estado clínico.

PACIENTE C

Sexo: femenino

Idade: 53

Diagnóstico: carcinoma de mama esquerda

Tratamento: 5-fluorouracila administrada por via endovenosa (2 x 500 mg/semana) durante 3 semanas e em seguida (2 x 250 mg/semana) durante 2 semanas em combinação com sal do cálcio do 5 10 ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofóli-co administrado por via endovenosa (administração de 100 mg/5-fluorouracila).

Resultado clínico depois de 8 semanas: - praticamente o tumor não é mais visível ou apalpável - cicatrizes fibróticas em vias de cura.

As aplicações terapêuticas possíveis não se limitam ao tratamento dos tumores citados acima com sais do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico em combinação com 5-fluorouracila, mas sim, também incluem trata-mentos de outras espécies de tumores com sais do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico em combinação com 5-fluoroura-cila ou com outros quimioterápicos, tais como por exemplo, Flo-xuridin (FUDR), Methotrexat, Cisplatin, Adriamycin, Vincristin e outros

Claims

REIVINDICAÇÕES; lã. - Processo para a preparaçao 5 10 de sais do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico das fórmulas Ia e Ib o CO<\ 11 1 Λ· N · 11 11 11 ·· 11 II COO COO®!*1 H 1 N -- U u u u H Π ( eb2 :oo R Ib na forma da mistura (6RS)-diastereoisomérica ou na forma dos (6R) ou (ts) diastereómeros individuais, em que R representa um catião orgânico e/ou inorgânico polivalente, e R represen ta um catião orgânico e/ou inorgânico mono-valente, em que R1 2 e R podem ser iguais ou diferentes e A representa um radical da fórmula

caracterrzado pelo facto de se introduzir previamente o acido 5 10 N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula II jiv O

I H COOHO H H (II) M----H Η · — H COOH na forma da mistura (6RS)-diastereoisómera ou na forma dos (6R) ou (S)-diastereoisómeros e depois reagir com uma base orgânica cv , *» ν5*' ?. ; :\ e/ou inorgânica ou com um sal de um catião inorgânico. .21. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se tratar de sais aceitáveis farmacêutica e/ou terapêuticamente. 3ã. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo facto dos catiões inorgânicos serem catiões de metal alcalino ou de metal alca- 4* x j. 24- 24* lino-terroso, de preferência. Li , Na , K , Ca , Mg 4â. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo facto dos catiões orgânicos serem escolhidos do grupo constituído de etanolamina trietanolamina, 2-dimetilaminoetanol, terc.-butilamina, de um ácido aminocarboxílico básico, tal como por exemplo, lisina, especialmente, (L)-lisina ou arginina, especialmente (L)-argi-nina. 5ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se efectuar a reac-ção em, pelo menos, ura solvente, de preferência, escolhido de dimetilsulfóxido, dimetilformamida, Ν,Ν-dimetilacetamida, N--metilpirrolidona e água. 6ã. - Processo para a preparação de sais, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se preparar ura sal de metal alcalino-terroso da fórmula III 38- * χ

(III) na qual R' representa um catião de metal alcalino-terroso, de preferên-2+ 2-t- cxa. Ca , Mg , de acordo com o processo, das reivindicações,

1 e 5 e depois fazer reagir com um sal do ácido oxálico correspondente, sendo que o oxalato de metal alcalino-terroso precipita e onde se forma simultaneamente o sal orgâniêo correspondente do composto da fórmula I, depois se separar o oxalato de metal alcalino-terroso precipitado e depois de precipitar da solução o sal desejado da fórmula I por meio da adição de, pelo menos, um solvente orgânico miscível com água, por exemplo , acetona, metanol ou etanol.
71. - Processo para a preparação de sais de metal alcalino-terroso do ácido Ν'* ,N^®-metilen-5,6, 7,8-tetrahidrofólico da fórmula 1’ •Jt * *

/ Μ - ..1 •— Μ

•—κ - Η

ο COCK Ο Η - Ν •Η Η — Η Ν ✓* (X) V' 1 ^ χ·*\» /Ή"' "Η-Η Ω S COO^ na forma da mistura (6RS)-diastereoisómera ou na forma dos (6R)- ou (6S)-diastereoisómeros individuais, em que R* representa um catião de metal alcalino-terroso, de preferência, 2+ 2+ Ca ou Mg , caracterizado pelo facto de se introduzir pre-viamente uma solução aquosa de um sal hidrossolúvel do ácido 5,6,7,8-tetrahidrofólico da fórmula IV '4 j ο11 H r^""'

, CO0H Ο H I Jl-M--Η (ΐνι ι< -Η Η -—Η Γ.οοη e depois se reagir cora formaldeído e era seguida, se acrescentar uma solução aquosa de um sal de metal alcalino-terroso, sendo que precipita, o sal de metal alcalino-terroso correspondente da fórmula I1. 8â. - Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de acrescentar antes da adição do formaldeído, ainda uma base hidrossolóvel, aromática, contendo azoto, a qual é especialmente escolhida do grupo constituído da piridina e de piridinas substituídas, por exemplo, picolinas, lutidinas, etilpiridinas, sendo preferida a piridina. , 9i* - Processo de acordo com uma das reivindicações 7, e 9, caracterizado pelo facto de se pre- -41- «* s '*

parar o sal do ácido 5,6,7,8-tetrahidrofóiibo hidrossolúvel mediante reacção do ácido livre na água com um composto, escolhido do grupo constituído de hidróxidos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalino, bicarbonatos de metal alcalino, amoníaco e bases orgânicas contendo azoto, tais como por exemplo, piridina, trietilamina, trietanolamina.
101. - Processo, de acordo com uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo facto de se ajustar, após a adição da solução do sal de metal alcalino--terroso, o valor do pH para um valor na faixa de 8,5 até 9,5 especialmente 9,0, de preferência, pela adição de uma solução de amoníaco aquosa. lll. - Processo de acordo com uma das reivindicações 7 até 10, caracterizado pelo facto de se efectuar a reacção a uma temperatura na faixa de 1Q2C até 30QC de preferência, à temperatura ambiente. 12i. - Processo de acordo com uma das reivindicações 7, até 11, carácterizado pelo facto de se 5 10 preparar o sal de magnésio do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8--tetrahidrofólico mediante reacção à temperatura ambiente, do ácido 5,6,7,8-tetrahidrofólico na água com um composto, escolhido do grupo constituído de hidróxidos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalino, bicarbonatos de metal alcalino, amoníaco e bases orgânicas, contendo azoto, tais como, por exemplo, piridina, trietilamina, trietanolamina, depois se reage a solução salina assim preparada com formaldeído e, em seguida, se acrescenta uma solução aquosa de um sal de magné- 5 τη sio, sendo que o sal de magnésio do ácido N ,N -metilen-5,6,7, 8-tetrahidrofólico precipita. «*i ^í> -»
131. - Processo de acordo com uma das reivindicações 7 até 12, caracterizado pelo facto de se preparar o sal de cálcio do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8--tetrahidrofólico mediante reacção à temperatura ambiente, do ácido 5,6,7,8-tetrahidrofólico na água com um composto, escolhido do grupo constituído de hidróxidos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalino, bicarbonatos de metal alcalino, amoníaco e bases orgânicas, contendo nitrogénio, tais como, por exemplo, piridina, trietilamina, trietanolamina, depois se acrescenta à solução salina assim preparada uma base hidros-sulúvel, aromática, contendo nitrogénio, a qual é èspecialmen-teescolhida do grupo constituído de piridina e de piridánas substituídas, por exemplo, picolinas, lutidinas, etilpiridinas, sendo preferida a piridina, depois se reage a solução salina assim preparada com formaldeído e, em seguida, se acrescenta uma solução aquosa de um sal de cálcio, sendo que o sal de cál-cio do ácido N ,N -metilen-5,6,7,8-tetrahidrofólico precipita.
141. - Processo para a preparação de um medicamento para influenciar sinergisticamente um composto que combate o cancro e/ou para reduzir a toxicidade de um composto que combate o cancro e/ou para proteger células humanas e/ou animais, caracterizado pelo facto de conter como, pelo menos, um composto activo, pelo menos um sal de acordo com uma das reivindicações 1 até 4, de preferência, em uma quantidade de 3 mg até 500 mg, especialmente de 5 mg até 150 mg por unanimidade de dosagem e de que se apresente, de preferência, na forma de um preparado farmacêutico parenteral e/ou oral. -43-
151. - Aplicação, dé acordo com uma das reivindicações 16 até 17, caracterizado pelo facto de que o medicamento se apresenta na forma de um preparado farmacêutico parenteral e/ou oral. Lisboa, 20 de Julho de 1990

i. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficiai da Prapriedasie industrial RUA VICTCfl c©f©@n, 10-A, 1.* 1200 1.1600¾ -