PT94574B

PT94574B - Processo para a preparacao de suspensoes de agentes tensio-activos muito concentradas e de pequena viscosidade

Info

Publication number: PT94574B
Application number: PT94574A
Authority: PT
Inventors: Bernd Disse; Eberhard Weller; Robert Becker
Original assignee: Thomae Gmbh Dr K
Priority date: 1989-07-04
Filing date: 1990-07-03
Publication date: 1997-02-28
Also published as: EP0406732B1; RU2077880C1; IL94961A0; DK0406732T3; IE902408A1; IE68448B1; KR0162642B1; ZA905182B; ES2072940T3; FI95655C; FI903341A0; IL94961A; NO180620C; PL164434B1; HU904077D0; AU5867690A; US5552161A; PT94574A; NZ234341A; NO180620B

Description

A presente invenção refere-se a suspensões de agentes tensioactivos muito concentradas e de pequena viscosidade para a terapia de substituição em doenças das vias respiratórias e ao processo para a sua preparação.

Os agentes tensioactivos consistem numa mistura com propriedades tensioactivas de fosfolípidos, lípidos neutros e proteí nas hidrofóbicas associadas e agentes tensioactivos obtidas a partir de tensioactivos pulmonares naturais isolados ; mas o agente tensioactivo pode também ser de origem sintética, sendo neste caso constituído por lípidos sintéticos e, eventualmente, proteínas recombinantes.

Reconheceu-se que a causa primária ! do síndroma de deficiência de respiração de recém-nascidos imaturos é uma falta de agente tensioactivo pulmonar (ME Ave ' ry, J. Mead, Surface Properties in Relation to Atelectasis íí and Hyaline Membrane Disease, Amer. J. Dis. Child 97, 517! -523 (1959)). A utilização de uma terapia de substituição ;

com um agente tensioactivo natural é conhecida por meio de estudos experimentais e clínicos (LMG van Golde, JJ Batenburg B Robertson, The Pulmonary Surfactant System : Biochemical Aspects and Functional Significance , Physiol. Rev. 68, 374, -455 (1988); B Robertson, B Lachmann, Experimental Eva) luation of Surfactants for Replacement Therapy, Experimental;

Lung Research 14, 279-310 (1988)). Dependendo da actividade do agente tensioactivo utilizado ou da avaliaçao dos autores instilaram-se doses individuais de 50 e 200 mg/Kg intratra- ! quealmente. 0 síndroma da falha de respiração de pacientes adultos possui determinado paralelismo com o síndroma da fa-J lha de respiração de recém-nascidos imaturos. Segundo a opi-j nião de muitos cientistas, a substituição do agente tensioactivo necessita, neste quadro de doença com elevada mortalidade, uma chance terapêutica ( B. Lachmann, Surfactant Repla cement in Acute Respiratory Failure : Animal Studies and i

First Clinicai Trials, em B, Lachmann Ed. : Surfactant Replacement Therapy in Neonatal and Adult Respiratory Distress }

Syndrome, Springer-Verlag, Berlim, 1988, páginas 212-223). j Para esta terapia de substituição, recomendam-se elevadas dosagens de até 400 mg/Kg (B. Lachmann, Surfactant Replacement in Acute Respiratory Failure : Animal Studies and First Clinicai Trials, em B. Lachmann Ed: Surfactant Replacement Therapy in Neonatal and Adult Respiratory Distress Syndrome, Springer Verlag, Berlim, 1988, páginas 212-223; RG j Spragg, p. Richmann, N. Gillard, TA Merritt, The Future for Surfactant Therapy of the Adult Respiratory Distress Syn drome em B. Lachmann Ed. : Surfactant Replacement Therapy in Neonatal and Adult Respiratory Distress Syndrome, Springer-Verlag, Berlim, 1988, páginas 203-211).

( Em todas estas aplicações, constitui i um problema o carregamento dos pulmões do paciente com eleva2

das quantidades de líquido. Enhorning indica a terapêutica de pacientes recém-nascidos com 100 mg/Kg de agente tensioactivo sob a forma de suspensão de 25 mg/ml. Isso significa ainda assim a administração de 4 ml de líquido por quilograma de peso corporal (G. Enhorning, A. Shennan, F. Possmayer, M. Dunn, CP Chen, J. Milligan, Prevention of Neonatal Respira tory Distress Syndrome by Tracheal Instillation of Surfactant : A Randomized Clinicai Trial , Pedriatics 76, 145-153 (1985)). Robertson administrou doses individuais de 200 mg/Kg de uma suspensão relativamente muito concentrada contendo 80 mg/ml ( G. Noack, p. Bergren, T. Curstedt, G. Grossmann, p. Herin, W. Mortensson, R. Nilsson, B. Robertson, Severe Neonatal Respiratory Distress Syndrome Treated with the Isolated Phospholipid Fraction of Natural Surfactant, Acta Paediatr. Scand. 76, 697 - 705 (1987). Isso significa a administração de 2,5 ml/kg. Morley utiliza as concentrações máximas de agente tensioactivo sintético ( Ten Centre Study Group. Ten Centre Trial of Artificial Surfactant (articifial lung expanding compound) in Very Premature Babies, British Med. J. 294, 991 - 996 (1987).

Neste caso, administraram-se 100 mg/ /Kg sob a forma de suspensão de cristais a 100 mg/ml. No entanto, foram necessários até 400 mg/kg durante vinte e qua tro horas. Obtiveram-se proporções relativamente favoráveis com um agente tensioactivo constituído por uma mistura tensio activa formada por fosfolipidos, lípidos neutros e proteínas nidrofóbicas associadas com um agente tensioactivo, obtidas a partir de agente tensioactivo natural isolado de pulmões de vitelo, seguidamente designadas por SF-RI 1. Administra ram-se 50 mg/kg sob a forma de suspensão contendo 40 mg/ml. Isto significa um carregamento dos pacientes com um volume de 1,2 ml/kg.

Se se transferirem as proporções para a terapia de adultos, então poder-se-ia prever uma dose de 200 mg/kg, sob a forma de suspensão com 40 mg/ml; isso significaria que a um paciente com 70 quilogramas de peso corporal se tivessem de instilar 350 ml por via intraqueal. Este cálculo mostra que é desejável escolher a concentração do

agente tensioactivo de maneira a ser o mais elevada possível.!

Este desejo é limitado pela elevada í ~ ί viscosidade das suspensões do agente tensioactivo com concen ; trações superiores a 60 mg/ml. Uma elevada viscosidade ori- , gina problemas na administração e na distribuição do agente tensioactivo e conduz ao aumento da resistência das vias res^ piratórias. Robertson atingiu 80 mg/ml, em que se separou os líquidos neutros dum agente tensioactivo obtido a partir de pulmões de porco (G. Noack, p. Bergren, T. Curstedt, G. Grossmann, P. Herin , W. Mortensson, R. Nilsson, B. Robertson Severe Neonatal Respiratory Distress Syndrome Treated with the Isolated Phospholipid Fraction of Natural Surfactant , Acta paediatr. Scand. 76, 697 - 705 (1987)). Morley utilizou 100 mg/ml de suspensão de cristalites de lípidos sintéticos (British Med. J. 294, 991 - 996 (1987)). Ele conseguiu essa elevada concentração com a condição de utilizar agente de sus pensão arrefecido em gelo.

Surpreendentemente, a Requerente desj cobriu agora que mesmo com pesos de agente tensioactivo maiores do que 60 mg/ml e armazenagem à temperatura ambiente durante várias horas, a viscosidade das suspensões fosse inferior a 30 mPas, desde que

a) a composição utilizada de agente tensioactivo-lípido/proteína contivesse um teor de ioes Ca e/ou Mg ligados maior do que 25 milimoles/mole, de preferência mais do que 40 milimoles/mole de fosfo lípidos organicamente extraíveis,

b) o agente da suspensão contivesse pelo menos 1 mili mole/litro, de preferência, 2,5 ou 3,5 milimoles/

2+ 2+ /litro de ioes Ca e /ou Mg e

c) o agente de suspensão simultaneamente contivesse pelo menos 33 milimoles/litro, de preferência, 60 a 150 milimoles/litro de cloreto de sódio.

Como agente de suspensão, utiliza-se, em geral, água. Se faltar apenas um destes factores ou se existir um destes factores em concentração inferior, então a viscosidade da suspensão assim obtida aumenta drastica mente à temperatura ambiente. Mantendo todos os três facto4

preparar-se um agente tensioactivo muito pouco viscoso de el£ vada concentração, que é também estável à temperatura ambien j te durante mais do que doze horas.

Uma suspensão de agentes tensioacti ¹vos deste tipo possui também, mesmo no caso de um muito elevado teor de agentes tensioactivos nenhum aumento da resis- i tência das vias respiratórias que possa ser perigoso e é muitíssimo apropriado para utilização na terapia de substitui ção em doenças das vias respiratórias. Uma suspensão de agen tes tensioactivos deste tipo garante a administração intraque al do agente tensioactivo em elevadas dosagens sem que se so j brecarreguem os pulmões com água ou se verifiquem apenas mui to pequenas influências negativas por exemplo, por aumento da viscosidade.

Enquanto as suspensões do agente

I tensioactivo até agora conhecidas já são muito viscosas a par tir de 60 mg de agente tensioactivo por ml, é agora possível, utilizando as suspensões preparadas de acordo com a presente invenção, empregar concentrações de 200 mg/ml. Para emprego terapêutico, são muito apropriadas, por exemplo, concentrações de agente tensioactivo de cerca de 150 mg/ml de suspensão. Suspensões de agentes tensioactivos de menores viscosi. dades, caso isso se pretenda, podem ser obtidas facilmente diluindo as suspensões de acordo com a presente invenção com agentes de suspensão de acordo com a presente invenção e de acordo com as necessidades.

carregamento eléctrico dos fosfolípidos organicamente extraíveis depois do seu isolamento a partir de lavagens de pulmões de, por exemplo, vitela ou por co, realiza-se com ioes Ca e/ou Mg , de modo que pode pre ver-se a extracção da fase aquosa com, por exemplo, clorofór 2+ mio, para se obter uma fase aquosa com excesso de ioes Ca 2+ e/ou Mg . Dependendo do tipo de processamento, obtem-se 2+ 2+ um limite superior de ioes Ca ou Mg de cerca de 70 mili2+ 2+ <

moles de Ca ou Mg /mole de fosfolípido. Se uma mistura de fosfolípidos ou de fosfolipidos/proteínas tem uma carga pe

2+ 2+ 2+ quena de Ca ou Mg como, por exemplo, 13 milimoles de Ca /

1), então esta carga pode ser carregada posteriormente em so | luçoes organicas com os ioes de Ca ou Mg que faltam.

Isto prevê-se que se faça, por exemplo, por adição de CaC^, que se dissolve em metanol. Geralmente pode dizer-se que todos os lípidos secos conhecidos carregados com iões Ca ¹2+ e/ou Mg podem processar de maneira a obter suspensões com pequenas viscodidades.

Os iões de cálcio e de magnésio são adicionados sob a forma de sais de cálcio e de magnésio solú veis. Para o efeito, utilizam-se, de preferência, cloreto j de cálcio ou cloreto de magnésio; mas também se podem utilizar para este efeito outros sais de cálcio e/ou de magnésio solúveis em água fisiológicamente aceitáveis, como, por exem pio, sulfato de cálcio ou sulfato de magnésio, nitrato de cálcio, lactato de cálcio, sorbato de cálcio, ascorbato de cálcio, gluconato de cálcio, lactogluconato de cálcio, hidro ! geno-citrato de magnésio, di-hidrogeno-glutamato de magnésio, | citrato de magnésio. >

A preparação do material com proprie dades tensioactivas utilizado como produto de partida para as suspensões de agentes tensioactivos de elevadas concentrações e pequena viscosidade realiza-se de acordo com o método descrito por Yu e col. (Lipids 18, 522 - 529 (1983)). Um des- > vio completo em relação a este método é a utilização de dis- [ solventes ou suspensões que contêm cálcio ou magnésio durante^ todo o processo.

Os pulmões de vitela são lavados comi uma solução de cloreto de sódio que contém 3 milimoles/litro ' de Ca e/ou de ioes Mg . A separaçao por centrifugação !

do agente tensioactivo realiza-se a partir de uma solução

- - 2+ que contem 6 ate 12 milimoles/litro de ioes Ca e/ou de

- 2+ ~ 2+ ioes Mg , de preferencia, de ioes de Ca . A purificação por meio de centrifugação com um gradiente de densidade com ; glucose até uma densidade compreendida entre 1,05 e l,15g/ml realiza-se de novo em presença de 3 a 8 milimoles/litro de ioes Ca e/ou de ioes Mg

A purificação compreende uma purifi6

cação por distribuição num sistema de clorofórmio/metanol/ /água de acordo com Bligh e Dyer (vide Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911 - 917 (1959)), com utilização de uma fase aquosa com 3 a 10 milimoles/litro de ioes Ca e/ou ioes

2+ - Mg , de preferencia, 6 milimoles/litro. A fase organica e em seguida concentrada até à secura em vácuo ã temperatura ambiente e o resíduo seco e finalmente moído. Como variante, e fase orgânica pode também ser liofilizada. Em todos os casos, o produto obtido é estável durante armazenagem ao longo de grandes intervalos de tempo (pelo menos três anos ã temperatura do frigorífico).

lípido seco finamente pulverizado assim obtido ê suspenso numa solução aquosa que contém as quantidades de cloreto de sodio e de sais de Ca e/ou de

2+ _

Mg de acordo com a presente invenção, por intensa agitaçao por sacudimento, até se atingir a concentração pretendida de lipidos. A suspensão assim obtida é também susceptível de ser armazenada à temperatura do frigorífico durante alguns dias e pode ser aplicada intratraquealmente de acordo com as necessidades.

agente de suspensão deve conter mais do que 1 milimole/litro, de preferência, 2,5 a 3,5 milimoles/litro de ioes Ca e/ou de ioes Mg e mais do que 33 milimoles/litro, de preferência, 75 milimoles/litro e, no máximo, 150 milimoles/litro de cloreto de sódio.

Ensaios de viscosidade com diversas composições de agentes tensioactivos.

Material e Métodos

Para a realização dos ensaios que se descrevem seguidamente, utilizou-se como material de partida um agente tensioactivo extraído a partir de lavagem de pulmões de vitelo (seguidamente designado como SF-RI 1). O processo constitui nas suas características essenciais uma modificação e optimização do processo de Yu e col. (S. Yu,

PGR Harding, N. Schmith, F. Possmayer, ” Bovine Pulmonary Surfactant : Chemical Composition and Physical Properties, Lipids 18, 522 - 529 (1983)).

As diferenças essenciais em relação a este trabalho são a utilização de dissolventes que contêm cálcio durante toda a realização do processo. A lavagem dos pulmões de vitelos realizou-se com uma solução de cloreto de sódio e regulou-se o líquido de lavagem atê possuir um teor de cálcio de 6 milimoles/litro (com CaC^)· A separação por centrifugação do agente tensioactivo realizou-se a partir de uma solução que continha 9 milimoles/litro de cálcio. A purificação por intermédio de gradientes de densidade com glu cose realizou-se na presença de 6 milimoles/litro de cálcio.

A operação mais importante consistiu em se ter realizado a purificação por distribuição no sistema de clorofórmio/metanol/água de acordo com Bligh e Dyer (Can. J. Biochem. Physi- I ol. 37, 911 - 913 (1959) igualmente com utilização de fase aquosa que continha 6 milimoles/litro de cloreto de cálcio. I í

Depois de se realizar a separação de fases, evaporou-se a fase orgânica â temperatura ambiente ' até â secura sob agitação e finalmente secou-se em vácuo.

i teor de água de acordo com o método de Karl Fischer devia ser no máximo inferior a 3Z. Por peneiração, obteve-se um material com até uma dimensão de partículas igual a cerca de 160 micrómetros.

Para a realização dos ensaios, sus- j pendeu-se este lípido seco finamente pulverizado em soluções aquosas com diferentes teores de cloreto de cálcio e de clorej to de sódio em água para injecções, mediante intensa agitação por sacudimento. A concentração das suspensões estava compre endida entre 60 e 250 mg/ml.

A viscosidade dessas suspensões foi determinada depois de se armazenarem à temperatura ambiente durante intervalos de tempo determinados com utilização de um viscosímetro capilar. Trata-se, neste caso, de um processo de medição de viscosimetria por capilaridade modificado, descrito por Weller e col. em Wiener Medizinische Wochenschrift Suppl. 33, 7-12 (1975) e por von Weller em Viskosimetrie inhomogener Flussigkeiten, Dustri Verlag, Munique, pá ginas 21 - 41.

Seguidamente, esclarece-se resumida «Λ.

J3223s»aS^^!E^2^A,

mente, esclarece-se resumidamente este método. A amostra que se encontra numa seringa para injecções é comprimida com uma velocidade definida constante através de um capilar de medição. Também se podem detectar diferenças de homogeneida · de. Sabe-se a velocidade de corte e mantém-se constante.

A calibragem realiza-se com óleos de aferição. A pressão an tes do capilar ê uma medida da viscosidade e é registada con tinuamente com um registador.

Perto do fim do intervalo de tempo de ensaio, algumas suspensões foram alteradas por aplicação de energia de ultra-sons na suspensão de vesículas (aparelho de ultra-sons Branson, micropontas, 20 watt, 2 minutos/mililitro, arrefecimento com água com gelo).

Ensaiaram-se igualmente suspensões que foram preparadas por sacudimento de soluções liofilizadas ou dispersões de vesículas. Neste caso, dispersou-se o agente tensioactivo desde que não fosse necessária a aplicação de energia de ultra-sons em água para injecções em concentra ções de cerca de 40 mg/ml ou em outros dissolventes apropria dos, como, por exemplo, tércio-butanol, em concentrações compreendidas entre cerca de 40 e 250 mg/ml. As suspensões ou as soluções foram em seguida congeladas. 0 bolo assim obtido foi desfeito e o pó resultante posteriormente processado .

Também se empregaram variantes do processo de preparação do SF-RL 1 nos ensaios. A carga de agente tensioactivo B (veja-se Tabela 1) foi preparada sem adição de cloreto de cálcio no meio de lavagem e de purificação .

A determinação do cálcio realizou-se por espectrofotometria de absorção atómica depois de se introduzir a suspensão diluída apropriada do agente tensioactivo numa chama de queima de acetileno a cerca de 3.000“ C (Zeiss FL6). A estas temperaturas, liberta-se também o cálcio ligado à matriz de proteínas e é convenientemente analisado .

A determinação da actividade relativa das suspensões de agentes tensioactivos sobre fetos de coe

lhos imaturos realizou-se em comparação com um padrão de compra. Neste caso, preparou-se a carga a ensaiar e do padrão para cada uma das doses de actividade com três dosagens (veja-se Figura 2). Com o auxílio dos critérios gerais estatísticos conhecidos (análise de covariância), verificou-se que a suspensão de elevada concentração de acordo com a presente invenção contendo ioes de Ca da dispersão de vesículas de baixa concentração em igual dosagem relativamente à sua actividade não variaram significativamente.

Resultados e Discussão dos Resultados

Na Tabela 1, indica-se o teor de cálcio de cargas representativas de SF-RI 1 :

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ΓΩ CM CM CM —I *3· <<<<<CQCOOOO

CO tensioactivo liofilizado, preparação da mistura de lipido-proteína ccmo em A.

Φ

CP d

Os resultados mostram que todas as cargas, que correspondem ao processo de produção de acordo com o previsto, contêm teores de cálcio ligado maiores do que ί 40 milimoles/mole de fosfato extraível com lípidos. A carga (B) processada sem adição de cálcio contêm, pelo contrário, apenas 13 milimoles/mole. Ela fica portanto compreendida dentro dos valores publicados para os teores de cálcio em agentes tensioactivos pulmonares extraídos que não ultrapassam 16 milimoles/mole ( MJ Weber, F. Possmayer, Calcium Interacj tions in Pulmonary Surfactant , Biochim. Biophys. Acta 796,

-91 (1984)). !

ί

Como se mostra seguidamente, estes teores de cálcio ligado são muito importantes para as proprie dades de SF-RI 1.

A Tabela 1 e a Figura 1 contêm tam- i bêm os resultados dos ensaios da viscosidade das suspensões j de agentes tensioactivos recentemente preparadas em função do tempo. Quando um agente tensioactivo (B) pobre em cálcio conhecido da literatura foi suspenso numa solução de 75 milimoles/litro de cloreto de sódio e 3 milimoles/litro de cloreto de cálcio, então, à temperatura ambiente, a viscosidade subiu rapidamente e ao fim de trinta minutos ultrapassava já 150 mPas. Isto significa que a suspensão de agente

I tensioactivo tinha assumido uma consistência de creme. Esta

I suspensão não é clinicamente utilizável para instilações intratraqueais.

Quando se suspendeu um agente tensio activo com um elevado teor de cálcio ligado (A, A' e C) numa solução que continha 3 milimoles/litro de cloreto de cálcio, ! então a viscosidade subiu também muito rapidamente. Mesmo quando se suspendeu numa solução de cloreto de sódio com 75 milimoles/litro, atingiu-se a viscosidade aproximadamente igual a 150 mPas depois de noventa minutos de armazenagem ã temperatura ambiente. A suspensão numa solução de 75 mili-í moles/litro de cloreto de sódio com mais 1 milimole/litro de cloreto de cálcio originou um aumento muito lento e atenuado da viscosidade.

Obtiveram-se resultados muito satis12

fatórios por suspensão de agente tensioactivo rico em cálcio numa solução de 75 milimoles/litro de cloreto de sódio i mais 3 milimoles/litro de cloreto de cálcio a viscosidade não ultrapassou 25 mPas depois de armazenagem durante um longo intervalo de tempo. Obtiveram-se resultados dos compa ráveis suspendendo liofilizados de agente tensioactivo ricos em cálcio numa solução de 75 milimoles/litro de cloreto ί de sódio mais 3 milimoles/litro de cloreto de cálcio (carga C). Também neste caso, a viscosidade não ultrapassou 25 mPas depois de longa armazenagem à temperatura ambiente durante dezasseis horas. Só depois de aplicação de energia de ) ultra-sons, a viscosidade subiu para 220 mPas.

i ~

A suspensão do lípido (B) pobre em C ) numa solução com elevada concentração de C nao fisiológica de 12 milimoles/litro mais 75 milimoles/litro de í N Cl originou um aumento de viscosidade prolongado e atenuado. No entanto, depois de cento e vinte minutos, atingiu-se sempre um valor de 60 mPas. Calculou-se a concentração de 12 milimoles / litro de modo que a concentração final estabelecida (soma dos teores de Ca no meio de suspensão e no lí pido) atingisse o mesmo valor que no caso da suspensão de A,

A' ou C em solução que contém 3 milimoles/litro de C^a .

Estas variantes permitem prever teores elevados de C^a no agente de suspensão mas no entanto são menos favoráveis nos seus resultados e não são previsivelmen-i te utilizáveis in vivo porque se utilizam concentrações de C^a no meio de suspensão que não são fisiologicamente eleva- j das pois podem provocar broncoconstrição. I

Surpreendentemente, os resultados mostram que para a obtenção de suspensões de agente tensioactivo de elevada concentração e não obstante pequena viscosi-

P dade são de tomar em consideração três factores. A composição de agente tensioactivo-lípido-proteína utilizada deve po£ suir elevado teor de cálcio ligado, de preferência, mais do que 25 milimoles/mole de fosfolípido extraível organicamente. 0 agente de suspensão deve conter não só NaCl mas também ’ CaCl2 dissolvidos, de preferência numa concentração de 75 miq limoles/litro e de 3 milimoles/litro respectivamente.

Os ensaios indicados na Tabela 1 í| mostram que, no caso de faltar também apenas um destes facto res, a viscosidade das suspensões à temperatura ambiente au!J mentou drasticamente ao fim de curto intervalo de tempo. Man, tendo todos estes três factores, no entanto, pode mesmo a partir de um liofilizado de vesículas preparar-se agente ten sioactivo de pequena viscosidade com elevada concentração que era estável à temperatura ambiente mais do que doze horas. Este tipo de suspensão de agente tensioactivo é apro! priado para utilizações terapêuticas. A Figura 1 mostra a variação de viscosidade de uma suspensão com 150 mg de agente

.) tensioactivo por ml em função da concentração de Ca^z ligado ao agente tensioactivo e dissolvido no agente de suspensão com e sem adição de cloreto de sódio.

A actividade respiratoriamente fisi£ lógica dos agentes tensioactivos pode investigar-se em fetos de coelhos imaturos (B. Robertson, B. Lachmann, Experimen- j tal Evaluation of Surfactants for Replacement Therapy, Experimental Lung Research 14., 279 - 310 (1988)). Apenas depois da substituição com este agente tensioactivo estes animais com os pulmões imaturos podem respirar. Por comparação directa de duas cargas sobre a capacidade dos animais é deter minada a potência relativa que é a quantidade que possui a mesma actividade. Neste modelo experimental com animais, mosj tra-se que a adição de cálcio num intervalo de concentrações I de 3 milimoles/litro ao agente de suspensão sob actividade j não tinha qualquer diferença (Figura 2). A potência relativa não foi alterada.

Na Figura 1, as curvas individuais j representam a variação da alteração da viscosidade (mPas) em ; I função do tempo expresso em minutos. As curvas individuais à seguinte série de ensaios:

representa um meio de suspensão com elevada -2+ concentração de Ca concentrado que contem 2+ milimoles de Ca , embora sem NaCl.

refere-se a um meio de suspensão de elevada 2+ concentração de Ca concentrado, que contem correspondem Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6 milimoles de NaCl, embora sem conter r, 2+ !

Ca .

refere-se a um meio de suspensão com ele+2 ' vada concentração de Ca de elevada concentraçao que contem 1 milimole de Ca e 75 milimoles de NaCl.

I refere-se a meio de suspensão com elevada +2 concentração de Ca concentrado que con- 2+ tem 3 milimoles de Ca e 75 milimoles de NaCl.

refere-se a um meio de suspensão que con- 2+ tem Ca ligado com pequena concentração i

- 2+ ¹que contem 3 milimoles de Ca e 75 milimoles de NaCl.

refere-se a um meio de suspensão com peque-2+ na concentração de Ca ligado, que contem 2+ milimoles de Ca com 75 milimoles de NaCl.

A Figura 2 mostra que a adição de cálcio num intervalo de concentrações de até 3 milimoles/litro ao meio de suspensão não tem qualquer influência sobre a actividade em fetos de coelho imaturos. A linha recta traça-i da representa as proporções na ausência de cloreto de cálcio as rectas a tracejado na presença de 3 milimoles de iões de 2+

Ca (sob a forma de CaC^) por litro; esta indicada a poten cia medida como volume de vias respiratórias que se atinge 1 a 3 Kpa de pressão de respiração em função de logaritmo da dose. | i

Os seguintes Exemplos descrevem a preparação de algumas suspensões de acordo com a presente in-j venção. j

EXEMPLO 1

Utiliza-se um agente tensioactivo que se obteve por extracção de pulmões de vitela com dissolventes orgânicos.

Consiste em cerca de 88Z de fosfolí15

pidos, 4% de colesterol, 1% de proteínas hidrofóbicas associa das ao agente tensioactivo, 0,6% de ácidos gordos livres, assim como triglicéridos e cálcio ligado. A massa molecular relativa média dos fosfolípidos é aproximadamente igual a 760 D. A substância é um pó amorfo amarelo insolúvel em agua, facilmente solúvel em dissolventes não polares como clorofór — I mio; em água, pode suspender-se facilmente por sacudimento ou por aplicação de energia ultra-sonora.

A partir de uma concentração de 5% em peso, as suspensões são visivelmente viscosas. A preparação, isolamento e processamento realiza-se de maneira seme- ί lhante ao método descrito em Lipids 18, 522 - 529 (1983) com

- 2+ introdução adicional de ioes Ca . Caso seja necessário, o teor de cálcio pode também corrigir-se ainda posteriormente na proporção pretendida, por exemplo, por adição de cloreto ~ I de cálcio dissolvido em metanol em quantidade calculada ao j agente tensioactivo dissolvido em dissolvente orgânico, por exemplo, em clorofórmio.

1,5 gramas do agente tensioactivo í peneirado, finamente pulverizado anteriormente descrito ou de um agente tensioactivo dissolvido em ciclo-hexano ou em butanol terciário obtido por liofilização são misturados com

8,5 ml de agente de suspensão, de preferência, solução de cio reto de sódio que contém 75 milimoles/litro de cloreto de sódio e 3 milimoles/litro de cloreto de cálcio, de preferência num frasco para injecções. Sacode-se agora o frasco para injecções e suspende-se dessa forma o agente tensioactivo. A suspensão é introduzida numa seringa com uma agulha para injecções de tamanho 1 (20 G) e, em seguida, é introduzida no frasco de injecções por meio de uma cânula de tamanho 18 (26 G). Por uma questão de segurança, realiza-se a contrapressão no frasco de injecção por meio de uma cânula fina; desta maneira, garante-se que a suspensão fique isenta de torrões. A aplicação da suspensão realiza-se, por exemplo, por um cateter para a veia umbilical no tubo traqueal no paciente com dificuldades respiratórias.

EXEMPLO 2

Misturam-se 2,5 gramas de agente tensioactivo peneirado, finamente pulverizado, com 7,5 ml de ! agente de suspensão (solução de cloreto de sódio) que contem j 150 milimoles/litro de cloreto de sódio e 3,5 milimoles/lií tro de cloreto de cálcio.

O processamento posterior realiza-se como se descreveu no Exemplo 1.

Claims

REIVINDICAÇÕES !

i

- 1§. Processo para a preparação de suspensões de agentes tensioactivos muito concentradas e de pequena viscosidade para a terapia de substituição em doenças das vias respiratórias, caracterizado pelo facto de

a) a proteína/lípido tensioactiva empregada possuir um teor de iões cálcio e/ou magnésio a ela ligados j maior do que 25 milimoles/mole de fosfolípido ex- j tractável por dissolventes orgânicos,

b) o meio de suspensão conter pelo menos 1 milimole/ /litro de iões cálcio e/ou magnésio e

1 7

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a proteína/lípido empregada como agente tensioactivo possuir um teor de iões cálcio e/ou magnésio ligados de 40 a 70 milimoles/mole de fosfolípido extractável por dissolvente orgânico e o meio de suspensão conter 2,5 a 3,5 milimoles/litro de iões cálcio e/ou magnésio e 60 a 150 milimoles/litro de cloreto de sódio.

- 3ã. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo facto de a água utilizada como meio de suspensão conter 75 milimoles/litro de cloreto de sódio. '

- 4ê. Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo facto de a proteína-lípido-agente tensioactivo e o meio de suspensão conterem apenas . - 2+ iões Ca e o ultimo juntamente com a quantidade necessária de cloreto de sódio.

- 5ê. - i

Processo de acordo com qualquer das ί reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se la- j var pulmões de vitelos com uma solução de cloreto de sódio, se regular o teor de cálcio ou de magnésio do líquido de lava gem de maneira a ser igual a 3 milimoles/litro, se centrifu- i gar o agente tensioactivo a partir de uma solução que contém I

6 a 12 milimoles/litro de ioes Ca ou Mg , se realizar uma primeira purificação com gradientes de densidade de glucose i _ 2+ 2+ em presença de 3 a 8 milimoles/litro de ioes Ca ou Mg , se realizar uma segunda purificação por distribuição em sistemas de dissolvente orgânico/álcool/água com utilização de ~ 2+ uma fase aquosa com 3 a 8 milimoles/litro de ioes Ca e/ou 2+

Mg , sem seguida se eliminar a fase organica e se secar o resíduo e se triturar, em que o lípido se suspende seco finamente pulverizado assim obtido numa solução aquosa que contém t,',.
2+ 2+ pelo menos 1 milimole/litro de ioes Ca e/ou Mg e pelo menos 33 milimoles/litro de cloreto de sódio.

- 6ê. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se efectuar a distribui, ção no sistema de clorofórmio/metanol/água com utilização de uma fase aquosa que contém 3 a 8 milimoles/litro de iões 2+ 2+

Ca e/ou Mg e em seguida se separar a fase organica, se secar o resíduo, se triturar e se suspender o lípido seco finamente pulverizado numa solução aquosa que contém 2,5 a
3,5 milimoles/litro de ioes Ca e/ou Mg e 60 a 150 milimo les/litro de cloreto de sódio.

- 73. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se separar a fase orgânica e se sus pender o resíduo sólido só de acordo com a necessidade numa solução aquosa que contem ioes Ca e/ou Mg e cloreto de sódio.

- 83. Processo de acordo com as reivindica ções 5 e 7, caracterizado pelo facto de se lisfilizar o agen ~ 2+ 2+ te tensioactivo carregado com ioes Ca e Mg com eliminação do dissolvente orgânico e se suspender este produto numa solução aquosa que contem os ioes Ca e/ou Mg e cloreto de sódio.

- 93. Processo de acordo com a reivindica ção 5, caracterizado por se obter suspensões de agente tensioactivo de pequena viscosidade e as suspensões com elevada viscosidade serem diluídas com um meio de suspensão de acordo com a presente invenção.

-103. Processo de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo facto de posteriormente se ~ 2+ 2+ regular o teor de ioes Ca e/ou Mg do agente tensioactivo por adição dos seus sais em solução alcoólica.