KR100191899B1 - 합성 펩타이드를 이용한 폐 계면활성제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체에서 면역 반응을 유발하지 않으므로 폐 계면활성제에 이용될 수 있는 합성 펩타이드 및 이를 인지질과 조합한 폐 계면활성제와 그 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 합성 펩타이드와 인지질이 조합된 약학적 조성물은 신생아 호흡불량 증후군 등의 치료제로 사용될 수 있다.

Description

합성 펩타이드를 이용한 폐 계면활성제

제1도는 본 발명의 합성 펩타이드와 인지질 혼합물의 표면 흡착능을 나타낸 것이다. PL은 인지질, SP 1 및 SP 2는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 합성 펩타이드 그리고 SP 3은 비교 펩타이드를 나타낸다.

제2도는 합성 펩타이드와 인지질 혼합물의 표면 확산능을 나타낸 것이다.

제3도는 합성 펩타이드와 인지질 혼합물의 표면 장력과 면적과의 관계를 나 타낸 것이다.

[발명의 이용분야]

본 발명은 인체에 사용이 가능한 폐 계면활성능을 지닌 합성 펩타이드 및 이를 이용한 폐 계면활성제와 그 제조 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 인체에서 면역 반응을 유발하지 않으므로 폐계면활성제에 이용될 수 있는 합성 펩타이드 및 이를 인지질과 조합한 폐 계면 활성제와 그 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 합성 펩타이드와 인지질이 조합된 약학적 조성물은 신생아 호흡불량 증후군 등의 치료제로 사용될 수 있다.

[발명의 배경]

일반적으로 모든 물질은 고체, 액체 또는 기체 상태로 구성되어 있다. 상태가 다른 두 물질이 접촉하게 되면 두 가지 상태가 함께 존재함으로 인해 계면이 형성되면서, 물리적 및 화하적 성질과 밀도가 서로 다른 두 물질이 마주하게 된다. 이 때, 계면활성제는 계면에 작용하여 계면의 성질을 바꾸므로, 상태가 다른 두 물질이 섞이어 균일한 분산 상태가 되도록 한다.

상기 계면활성제의 특성으로 인하여, 계면활성제는 여러 분야에 널리 이용되고 있다. 구체적으로 계면활성제는 의약품의 제조를 포함하여 식품, 화장품, 잉크, 페인트, 섬유, 제지 등 여러 산업 분야에 응용될 수 있어 계면활성제에 대한 연구는 그 중요성이 크다. 특히, 단백질, 인지질 및 다당류 등과 같은 생체 고분자로 이루어진 계면활성제는 생체에 사용하여도 안전하므로 사람에게 적용이 가능하여 현재 그 유용성이 주목을 받고 있다.

생체내에 존재하는 계면활성제 중의 하나인 폐 계면활성제는 액체와 기체로 이루어진 계면에 작용하는 것으로, 폐에서 호흡 작용이 원활하게 일어나도록 한다. 이와 같은 작용을 하는 폐 계면활성제가 생체내에서 제대로 합성 또는 분비되지 않아 유발되는 질환으로 신생아 호흡불량 증후군 (Respiratory Distress Syndrome, 이하 RDS라고 약칭함)이 알려져 있다. RDS는 폐 계면활성제의 결핍으로 신생아가 제대로 호흡을 할 수 없어 사망하게 되는 질환으로, 이는 신생아의 주요한 사망 원인이 된다.

신생아의 RDS에 관하여 1959년 에버리(Avery) 등에 의해 처음 보고된 이후, 본 질환의 치료 요법으로 질환의 급성기에 결핍된 계면활성제를 기도를 통해 보충하는 폐 계면활성제 보충하는 폐 계면활성제 보충요법이 지난 20여년간 사용되었다. 지금까지 폐 계면활성제 보충요법은 신생아의 사망률을 낮추는데 크게 기여하였다.

국내에서도 폐 계면활성제 보충요법의 중요성을 인식하고 많은 소아과 병원에서 시도하려 하였으나, 치료에 사용되는 폐 계면활성제를 모두 수입하여야 하고 그 가격도 비싸서 실제 이용에는 어려움이 있었다. 따라서 국내의 경우 RDS신생아의 상당수가 미리 치료도 받지 못하고 사망하는 것으로 보고되어 있다.

현재 RDS의 예방과 치료를 위해 전세계적으로 사용되는 제품으로는 천연 폐 계면활성제의 성분을 조정한 제품과 합성 인지질만을 조합하여 만든 제품이 있다. 임상적으로 사용했을 때 천연 폐 계면활성제의 성분을 조정한 제품이 신생아에 있어서 효과가 더 좋은 것으로 알려져 있다. 그러나 천연 폐 계면활성제의 경우 소 또는 돼지 등의 동물의 폐에서 직접 추출하므로 원료의 제한이 있고, 동물에서의 수율이 낮으므로 제품의 가격이 높으며, 동물 유래의 단백질을 질환이 있는 신생아에게 직접 투입하므로 면역 반응 등에 의한 부작용이 나타나는 단점이 있다. 따라서 기존의 천연 폐 계면활성제의 단점을 개선한 폐 계면활성제의 개발을 RDS의 예방과 치료와 관련하여 큰 의미가 있다.

생체내에 존재하는 폐 계면활성제는 일반적으로 인지질(phospholipid), 중성 지질 및 아포단백질(apoprotein)등의 3가지 성분으로 구성되어 있다. 먼저 인지질은 폐 표면 활성에 가장 기본적이고 중요한 역할을 하는 성분으로, 특히 폐 계면활성제를 구성하는 인지질중에서 디팔미토일포스파티딜콜린(dipamitoyl-phosphatidylcholine, DPPC) 과 포스파디딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG)등은 표면 활성을 나타내는데 중요한 작용을 한다. 중성 지질은 지방산(fattyacid), 트리아실그리세롤(triacylglycerol) 및 콜레스테롤 등으로 구성된다.

또한, 단백질 성분은 폐 계면활성제 중의 10% 정도의 구성비를 차지하고 있으나 오염된 혈청 단백질이 그 중 8% 정도를 차지하므로 순수한 폐 계면활성제 자체의 단백질은 1% 정도이다. 폐 계명활성제의 순수한 단백질 성분을 PSP(pulmonary surfactant associated protein) 또는 아포단백질 등으로 부르며 최근 1987년부터는 폐 서팩턴트 단백질은 (surfactant protein, SP)로 통일하여 부른다.

일반적으로 폐 서팩턴트 단백질은 분자량에 따라 3가지 군으로 나눌 수 있는데, 분자량이 28,000 - 35,000 Da 범위인 SP-A, 7,000 -8.000 Da 범위인 SP-B 그리고 5000 Da인 SP-C가 있다. 폐 서팩턴트 단백질 SP-A는 수용성(hydrophilic)을 나타내고 SP-B 및 SP-C는 유기용매에 녹는 소수성(hydrophobic)을 나타낸다. 또한 최근에는 4번째 단백질인 SP-D의 존재 및 그 역할에 관한 보고도 있었다.

폐 서팩턴트 단백질 SP-A는 폐 계면활성제가 표면 활성을 나타내도록 물리적인 작용을 돕는 역할보다는 폐 계면활성제가 제Ⅱ형 폐포내에 존재하는 형태인 튜브형 미엘린 (tubular myelin)의 지질 대사 (Hawgood, 1988) 과정과 폐 계면활성제의 생산, 분비, 흡수 및 폐포 방어 기전과 면역 기전에 관여한다고 보고되어 있다 (Whitsett, 1988). 실제로 임상에서 폐 계면활성제 보충요법을 실시할 때 사용하는 중요한 약제인 CLSE (calf lung surfactant extract)와 S-TA에는 SP-A가 함유되어 있지 않다. CLSE 와 S-TA 제제는 생체외에서 (in vitro) 표면활성도가 높고 임상적으로도 개선도가 좋은 약제이므로, RDS의 치료를 위한 폐 계면활성제 보충요법에 SP-A는 필요하지 않은 것으로 보인다 (Whitsett, 1988). 한편, 소수성 단백질인 SP-B와 SP-C는 폐 계면활성제가 폐포내에서 필름을 형성하고 또한 폐 계면활성제가 폐포 표면에서 흡착하는 과정을 항진시키므로 폐 계면활성제의 표면 활성 작용에 필수적인 것으로 보고되어 있다 (Tanaka, et al., 1986; Takahashi and Fujiwara, 1986; Yu and Possmeyer, 1986; Hawgood, et al., 1987).

[선행 기술]

코크란(Cochrane) 등이 캐나다와 미국 등에서 20 - 28개의 아미노산으로 이루어진 합성 펩타이드를 신생아 호흡불량 증후군의 치료제로 개발하고 1992년에 특허를 취득하였다. (캐나다 특허 5,164,369 참조). 본 발명에서는 상기 발명의 합성 펩타이드 (아미노산 서열 : R L L L L R L L L L R L L L L R L L L L R)를 비교 물질로 하여, 본 발명의 합성 펩타이드의 폐 계면활성능을 조사하였다.

이와 같은 배경에서 본 발명자들은 지금까지의 단점을 극복하는 폐 계면활성제를 개발하기 위하여, 폐의 표면 활성 작용에 필수적인 SP-B 단백질과 인지질을 이용하였다. 본 발명의 폐 계면활성제는 SP-B 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 짧은 길이의 펩타이드를 합성하여 사용하므로 면역 반응에 의한 부작용의 문제를 해결할 수 있고, 인체에 안전하므로 신생아 호흡불량 증후군 등의 치료에 사용될 수 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 인체에 사용이 가능한 폐 계면활성능을 가진 합성 펩타이드를 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 합성 펩타이드는 폐 서팩턴트 단백질 SP-B의 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 새로운 합성 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 합성 펩타이드와 인지질을 조합하여 제조하는 폐 계면활성제를 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 폐 계면활성제에는 모든 종류의 인지질이 포함될 수 있으나, 포스파티딜콜린과 포스파티딜글리세롤이 바람직하다.

본 발명의 폐 계면활성제는 인지질을 유기용매에 녹이고, 합성 펩타이드는 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에 녹여, 그 펩타이드 용액과 인지질 용액을 섞은 다음, 용매를 제거하고 다시 생리 식염수에 녹여서 제조한다.

이 때 인지질은 포스타디딜콜린과 포스파티딜글리세롤을 1 : 1에서 4 : 1(w/w) 범위의 비율로 혼합하는 것이 바람직하고, 3 : 1(w/w)의 비율은 더욱 바람직하다. 이 때 유기용매로는 클로로포름이 바람직하다.

또한, 합성 펩타이드 용액과 인지질 용액은 1 : 3에서 1 : 12(w/w) 범위의 비율로 혼합되는 것이 바람직하고, 1 : 10(w/w) 비율은 더욱 바람직하다.

본 발명은 본 발명의 폐 계면활성제를 신생아 호흡볼량 증후군의 치료제로 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

[발명의 상세한 설명]

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 신생아 호흡불량 증후군 치료에 유용한 폐 계면활성제를 개발하기 위하여, 생체내의 폐 계면활성제를 구성하는 인지질과 폐 서팩턴트 단백질인 SP-B를 이용한다. SP-B는 소수성 단백질이므로 천연에서 동물로부터 분리하는 것이 어렵고 수율도 매우 낮으므로 본 발명에서는 SP-B에 대한 합성 펩타이드를 제조하고 이를 정제하여 사용한다.

본 발명의 SP-B 펩타이드는 사람에 존재하는 SP-B 단백질의 아미노산 서열로부터 정보를 얻어 전체 서열을 포함하도록 합성할 수 있다. 그러나 사람의 SP-B 단백질은 79 - 80개의 아미노산으로 구성되어 전체 서열을 합성하는 것은 어렵고, 합성하는 비용도 많이 들므로 일부 서열을 포함하도록 합성하는 것이 유리하다. 또한 일부 서열을 포함하는 합성 펩타이드의 아미노산 길이를 적당하게 조절하면 인체내에서 합성 펩타이드에 의한 면역 반응도 유도되지 않으므로 더욱 유용하다.

구체적으로 본 발명에서 합성한 펩타이드들은 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 합성 펩타이드를 적절한 인지질과 혼합하면 표면 활성능이 있고 인체에 사용이 가능한 폐 계면활성제를 제조할 수 있다.

본 발명의 폐 계면활성제는 인지질을 유기용매에 녹이고, 합성 펩타이드는 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에 녹여, 그 펩타이드 용액과 인지질 용액을 섞은 다음, 용매를 제거하고 다시 생리 식염수에 녹여서 제조한다.

구체적으로 본 발명에서 사용한 인지질은 포스파티딜콜린 (PC)과 포스파티딜글리세롤 (PG) 등이며 그외에도 여러가지 인지질을 사용할 수 있다. 합성 펩타이드는 메리필드(Merrifield)등에 의한 방법 등으로 합성할 수 있고 합성된 펩타이드는 역상 C₁₈칼럼을 이용한 HPLC 등으로 정제한다.

인지질인 포스타티딜콜린과 포스파티딜글리세롤 등은 클로로포름 등의 유기용매에 녹여 사용한다. 이 때 포스타티딜콜린 과 포스파티딜그리세롤의 비율은 1 : 1에서 4 : 1 (w/w)의 범위로 혼합하는 것이 바람직하고, 사용하는 유기용매로는 클로로포름이 인지질을 완전히 녹이므로 바람직하다. 또한 인지질 용액에 지방산, 콜레스테롤 및 포스파티딜세린 등을 함께 첨가할 수도 있다.

합성 펩타이드는 클로로포름과 메탄올이 섞인 용매를 사용하여 녹인다. 이 때 각 펩타이드 용액과 인지질 용액은 1 : 3에서 1 : 12 범위의 비율로 혼합할 수있다. 이들 혼합물에서 용매를 제거하고 다시 인지질의 농도를 맞추면서 생리 식염수에 녹여 현탁시킨다.

본 발명의 계면활성제의 효능을 확인하기 위하여, 표면 활성능은 변형 윌헴리 플레이트(modified Wilhemly plate) 방법으로 표면 흡착능, 표면 확산능 및 표면장력과 면적과의 관계 등을 측정하여 나타낸다.

표면 흡착능은 합성 펩타이드와 인지질을 적당한 비율로 섞은 다음, 시간에 따른 표면장력의 변화로 변화로 표시한다.(제1도 참조). 인지질만을 포함하는 시료와 비교 펩타이드 (SP 3)를 포함하는 시료에 비하여 서열번호 1의 합성 펩타이드(SP 1) 및 서열번호 2의 합성 펩타이드 (SP 2)를 포함하는 시료는 표면장력을 충분히 증가시킨다. 이 때 사용한 비교 펩타이드는 코크란(Cochrane)등이 개발하여 호흡불량 증후군의 치료제를 특허를 취득한 것이다.

또한 표면 확산능은 이지질만을 포함하는 시료에서는 활성이 나타나지 않으나, SP 3 비교 펩타이드와 본 발명의 합성 펩타이드를 포함하는 시료에서는 충분한 활성을 나타낸다 (제2도 참조). 또한 표면장력과 면적과의 관계는 인지질만을 포함하는 시료와 SP 3 비교 펩타이드에서는 활성이 거의 나타나지 않으나 서열번호 1와 서열번호 2의 본 발명의 합성 펩타이드를 포함하는 시료에서는 좋은 활성을 나타낸다 (제3도 참조).

상기의 결과를 통해 볼 때, 서열번호 1의 합성 펩타이드 (SP 1) 및 서열번호 2의 합성 펩타이드 (SP 2)는 인지질과 조합될 때 높은 표면 활성능을 나타내므로 폐 계면활성제로써 신생아 호흡불량 증후군의 치료제를 사용하기에 매우 적합하다. 또한 합성 펩타이드의 길이가 짧아 인체의 면역 반응을 유발하지 않으므로 신생아에 안전하게 사용할 수 있다.

본 발명의 폐 계면활성제는 체온 상태의 액제로 제조하여 투여하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 폐 계면활성제는 거품이 생기지 않게 하면서 카테타를 사용하여 기도를 통해 체중 1kg 당 100 - 150mg을 투여한다. 이 때 환자의 체위를 변동시키면서 분할 투여하는 것이 바람지하다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 인지질과 SP-B 펩타이드의 조합

합성 SP-B 펩타이드를 적절한 인지질과 조합하여 표면 활성능을 갖는 폐 계면활성제를 제조하기 위하여, 본 발명에서 사용한 인지질인 포스파티딜콜린(PC)고 포스파티딜글리세롤 (PG)은 미국 시그마(Sigma)사에서 구입하여 사용하였다. 또한, 합성 SP-B 펩타이드는 메리필드(Merrifield)등에 의한 방법으로 제조하였다. 본 발명에서는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 합성 펩타이드 2종을 합성하였다. 합성된 펩타이드들은 역상 C₁₈칼럼을 이용한 HPLC 로 분리하였다.

다음 PC와 PG는 클로로포름 용매를 사용하여 3 : 1 (w/w)의 비율로 섞고, 합성 펩타이드는 클로로포름과 메탄올이 1 : 1 (w/w)인 용매에 녹였다. 다시 각 펩타이드 용액과 인지질 용액 1 : 10 (w/w)의 비율로 섞었다. 이렇게 섞은 혼합물을 43℃에서 10분간 정치한 후, 질소로 용매를 날려보냈다. 생리 식염수르 가하여 인지질의 농도가 4mg/ml이 되도록 맞추고 43℃에서 1시간 동안 가끔 볼텍스하면서 현탁시켰다.

[실시예 2] 표면 활성능의 측정

본 발명의 폐 계면활성제의 효능을 확인하기 위하여, 표면 활성능은 변형 윌헴리 플레이트(modified Wilhemly plate)방법으로 표면 흡착능, 표면 확산능 및 표면장력과 면적과의 관계르 측정하였다.

표면 흡착능은 둥근 테프론 디쉬(직경10㎝)에 생리 식염수를 100ml 담고, 인지질의 양이 800㎍ 되도록 준비한 시료를 해밀톤 주사기로 표면 아래에 주입한 후 시간에 따른 표면장력의 변화를 표시하였다 (제1도 참조). 그 결과, 인지질만을 포함하는 시료와 비교 펩타이드 (SP 3)를 포함하는 시료에 비하여 서열번호 1의 합성 펩타이드 (SP 1) 및 서열번호 2의 합성 펩타이드 (SP 2)를 포함하는 시료는 표면장력을 상당히 증가시켰다.

표면 확산능은 면적이 898.292㎠인 네모난 테프론 트로프에 1.9L 의 생리 식염수를 넣고 인지질 양이 800㎍ 되도록 준비한 시료를 해밀톤 주사기로 표면위에 뿌린 후 시간에 따른 표면장력의 변화를 표시하였다 (제2도 참조). 그 결과, 인지질만을 포함하는 시료를 제외하고는 모든 합성 펩타이드 시료에서 충분한 활성을 나타냈다.

표면장력과 면적과의 관계는 움직이는 막(movable barrier)을 이용하여 트로프의 면적을 최소로 272.182㎠로 압축시킨 후 다시 원래의 면적으로 감압축시키면서 표면장력의 변화를 측정하여 결과를 얻었다. 압축-감압축 속도는 분당 6㎝이고 한번 압축-감압축시키는데 시간은 738초 걸렸다 (제3도 참조). 그 결과, 인지질만을 포함하는 시료와 SP 3의 비교 펩타이드는 활성을 거의 나타내지 않았으나 서열번호 1의 합성 펩타이드(SP 1) 및 서열번호 2의 합성 펩타이드 (SP 2)를 포함하는 시료는 좋은 활성을 나타냈다.

상기의 결과를 통해, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 합성 펩타이드는 비교 펩타이드에 비하여 조합했을때 표면 활성능이 뛰어나서, 표면 흡착능, 표면 확산능 및 표면장력과 면적과의 관계 등에 있어서 모든 조건을 만족시키므로 폐 계면활성제로 사용하기에 적합하였다.

따라서 이들 합성 펩타이드는 인지질과 조합하여 시생아 호흡불량 증후군의 치료제 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 합성 펩타이드는 그의 아미노산 길이가 짧아 인체에 적용할때 면역 반응을 유발하지 않으므로 안전하다. 한편 본 발명의 폐 계면활성제는 미국에서 특허된 합성 펩타이드 (SP 3) 에 비해서도 우수한 효과를 나타낸다.

[서열표]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 17

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩타이드

서열

R M L P Q L V C R L V L R C S M D

[서열표]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 16

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩타이드

서열

R M L P Q L V C R L V L R C S M

Claims (7)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폐 계면활성능을 가진 합성 펩타이드.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폐 계면활성능을 가진 합성 펩타이드.
3. 제1항 또는 제2항의 합성 펩타이드와 인지질을 조합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 폐 계면활성제.
4. 제3항에 있어서, 인지질은 포스파티딜콜린과 포스파티딜글리세롤인 것을 특징으로 하는 폐 계면활성제.
5. 제3항에 있어서, 합성 펩타이드와 인지질을 1 : 3 에서 1 : 12 (w/w) 범위의 비율로 혼합한 것을 특징으로 하는 폐 계면활성제.
6. 제3항의 폐 계면활성제는 인지질을 유기용매에 녹이고, 제1항의 합성 펩타이드는 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에 녹인 다음, 그 펩타이드 용액과 인지질 용액을 적당한 비율로 섞고, 용매를 제거한 다음 생리 식염수에 녹여 제조하는 것을 특징으로 하는 폐 계면활성제의 제조 방법.
7. 제6항에 있어서, 인지질을 유기용매에 녹이는 것은 포스파티딜콜린 과 포스파티딜글리세롤을 1 : 1 에서 4 : 1 (w/w) 범위의 비율로 클로로포름에 녹이는 것인 폐 계면활성제의 제조 방법.