PT94553A

PT94553A - Processo para a preparacao de novos analogos ii de peptidos intestinais vasoactivos (vip) e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT94553A
Application number: PT94553A
Authority: PT
Inventors: David Robert Bolin
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1991-02-08
Also published as: YU126690A; IE902388A1; JPH0338600A; HU904033D0; US5141924A; EP0405242A2; NO902916D0; IL94884A0; MC2131A1; NO902916L; AU5808490A; CA2019970A1; KR910000794A; NZ234268A; EP0405242A3; IE902388L; HUT55803A; FI903296A0; ZA904897B

Description

F.HOFFMANN-LA ROCHE AG. "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS ANÁLOGOS XI DE PjSpTIDOS INTESTINAIS VASOACTIVOS (VIP)' E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM" O péptido intestinal vasoactivo (VIP) foi descoberto, isolado e purificado, pela primeira vez, a partir de intestinos de porcinos (Patente de invenção americana N° 3 879 371). 0 péptido possuía vinte e oito aminoãcidos (28) e era portador de uma extensa homologia com a secretina e com o glucagon £ Cari guist e outros., Horm. Metab. Res., 14, 28-29 (1982) J. A sequência aminoãcida de VIP ê a seguinte:

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-

Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-

Ser-Ile-Leu-Asn-NE^

Sabe-se que VIP apresenta uma ampla diversidade de actividades biológicas ao longo do tracto gastrointestinal e do sistema circulatório. Ã luz das suas semelhanças com as hor monas gastrointestinais, descobriu-se que VIP estimulava a secreção pancreãtica e biliar, a glicogenôlise hepática, a secre ção do glucagon e da insulina e, activava a libertação do bicarbonato pancreático. /*Kerrins, C. and Said, S.I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 142, 1014-1017 (1972), Domschke, S. et al., Gastroenterology, 73, 478-480 (1977) J.

Localizaram-se os neurõnios que contêm VIP por ensaios imunolõgicos de células dos sistemas endõcrino e exõcri no, dos intestinos e do músculo liso /“Polak, J.M. et al., -2

Gut, 15, 720-724 (1974) J. Descobriu-se que o VIP era um neu-roefector originando a libertação de diversas hormonas incluindo a prolactina /Frawley, L.S., et al., Neuroendocrinology, 33, 79-83 (1981) J, a tiroxina /"Ahren, B., et al., Nature, 287, 343-345 (1980) J, e a insulina e o glucagon £ Schebalin, M. , et al., Am. J. Physiology E., 232, 197-200 (1977) J. Também se descobriu que VIP estimulava a libertação de renina a partir do rim, in vivo e in vitro £ Porter, J.^·/ a^· Neuroendocri nology, 36^, 404-40 8 (1983) J. Descobriu-se qúe VIP se encontrava presente nos nervos e nas terminações nervosas que existem nas vias aéreas de diversas espécies animais e no homem £ Dey, R.D., and Said, S.I., Fed. Proc.,' 39, 1062, (1980); Said, S.I., et al., Ann. N.Y. Acad. Sciences, 221, 103-114 (1974) J. Os efeitos cardiovasculares e broncopulmonares de VIP são interessantes uma vez que se descobriu que VIP era um poderoso vasódi-latador e um potente relaxante do musculo liso, actuando nos es tratos periférico, pulmonar e vascular, ao nivel das coronárias £ Said, S.I.., et al., Clin. Res., 20, 29 (1972) J. Descobriu--se que VIP possuia um efeito vasodilatador sobre os vasos sanguíneos cerebrais £ Lee, T.J. and Berszin, I., Science, 224, 898-900 (1984) J. Estudos in vitro mostraram que o péptido intestinal vasoactivo, aplicado de modo exógeno âs artérias cerebrais, induzia a vasodilatação, o que sugere que VIP ê um possí vel transmissor para a vasodilatação cerebral. /*Lee, T. and Saito, A., Science,' 224, 898-901 (1984) J. Nos olhos, VIP também demonstrou ser um potente vasodilador^£ Nilsson, S.F.E. and Bill, A., Acta Physiol. Scand., 121, 385-392 (1984) J. VIP pode possuir efeitos reguladores no sistema imu-nológico. 0'Dorisio e outros demostraram que VIP podia modular a proliferação e migração de linfócitos £ J. Immunol., 135, -3- 792s-796s (1985) J.

Uma vez que se descobriu que VIP relaxava o musculo liso que se encontra, normialmente presente nos tecidos das vias aéreas, pode pôr-se a hipótese de que VIP possa ser um mediador exógeno do relaxamento do músculo liso brônquico [ Dey, R. D. and Said, S.I., Fed. Proc., 23_, 1062 (1980) J. Os ensaios in vitro e in vivo demostraram que VIP relaxa o músculo liso da traqueia e ê um protector contra os agentes bronccconstritores, tais como a histamina e a prostaglandina F2a /*Wasserman, M.A. et al., in Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said. ed., Ra-ven Press, N.Y., 1982, pp 177-184. Said, S.I. et al., Ann. N. Y. Acad. Sei., 221, 103-114 (1974) J. Descobriu-se que quando se ministra VIP por via intravenosa, este funciona como uma protecção contra os agentes broncoconstritores tais como a hi£> tamina, a prostaglandina F2a, leucotrienos, factor de activa-ção plaquetãria, bem como contra broncoconstrições induzidas por um antigeno (Said, S.T. e outros, supra 1982). Descobriu--se, também que, VIP inibia a secreção mucosa nos tecidos das vias respiratórias humanas, f Coles, S.J. et al., Am. Rev.Res-pir. Dis., 1^4, 531-536 (1981) J.

No homem quando administrado por infusão intravenosa a doentes asmáticos, o VIP demonstrou originar um aumento em pico na proporção do fluxo expiratório e proteger contra a bron codilatação induzida pela histamina /*Morice, A.H. and Sever, P.S., Peptides, 279-280 (1986); Morice, A. et al., The Lan-cet, II, 1225-1227 (1983) J. Os efeitos pulmonares observados por esta infusão intravenosa de VIP foram, no entanto, acompanhados por efeitos cardiovasculares secundários, especialmente hipotensão e taquicardia e ainda rubor facial. Quando ministra 4 do em doses intravenosas que não origem efeitos cardiovasculares, o VIP não conseguiu alterar a condutância especifica das vias respiratórias £ Palmer et al., Thorax, 41, 663-666 (1986) J-. Explica-se a perda de actividade devido â baixa dose administrada e, possivelmente devido à rápida degradação do composto.

Quando administrado em aerossol a seres humanos, o VIP natural mostrou-se, apenas, marginalmente eficaz na protec ção contra a broncoconstrição induzida pela histamina £ Altieri et al., Pharmacologist, 25, 123 (1983) J. Descobriu-se que VIP não possuía um efeito significativo nos parâmetros base das vias respiratórias mas que possuía em efeito protector contra a broncoconstrição induzida pela histamina quando ministrado a seres humanos por inalação /"Barnes, P.J. and Dixon, C.M.S.,

Am. Rev. Respir. Dis.,' 130, 162-166 (1984) J. Constatou-se que quando se ministrava VIP por inalação não se verificava taqui-cardia ou efeitos hipotensores em conjunto com a broncodilata-ção £Said, S.I. et al., in Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. Said, ed., Raven Press, N.Y., 1982, pp 185-191 J.

Devido ãs interessantes e potenciais actividades biológicas clínicamente úteis de VIP, esta substância tem sido alvo de diversos programas de síntese referidos, com a finalidade de se aumentarem uma ou mais das propriedades desta molécula. Takeyama e outros referiram um análogo de. VIP que possuia um ácido glutâmico substituído por ácido aspãrtico, na posição 8. Descobriu-se que este composto era menos potente do que o VIP natural. £ Chem. Pharm. Buli.,' 28, 2265-2269 (1980) J. Wendlber ger e outros divulgaram a preparação de um análogo de VIP que possuía norleucina substituída na posição 17 por metionina /Pe£ tide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295 (1980) J. Descobriu- -5 -se que o pêptido era equipotente ao VIP natural quanto à sua capacidade para deslocar o VIP radio-iodado das preparações de membrana do fígado. Turner e outros referiram que o fragmento VIP(10-28) era um antagonista de VIP /*Peptides, T_, 849-854 (1986) J. Também se referiu que o análogo substituído (4-C1-D-6 17 -Phe ,Leu )-VIP se ligava ao receptor de VIP e antagonizava a actividade de VIP £ Pandol, S. et al., Gastrointest. Liver Phy-siol., 13, G553-G557 (1986) J. P. Robberecht e outros, referiram diversos análogos de VIP com resíduos D substituídos na extremidade N do VIP natural £Peptides, £, 339-345 (1988) J. Todos estes análogos se ligaram de um modo menos robusto ao rece£ tor de VIP e mostraram uma actividade inferior à do VIP natural na activação de c-AMP. S. Tachibana e 0. Ito, referiram diversos análogos de VIP da molécula precursora £ in Peptide Chem., T. Shiba and S. Sakakibara, eds., Prot. Res. Foundation, 1988, pp. 481-486 J. Estes compostos mostraram ser broncodilatadores 1 a 3 vezes mais potentes do que VIP e possuíam uma actividade hipotensora 1 a 2 vezes superior. Musso e outros referiram também diversos análogos de. VIP com substituições nas posições 6-7, 9-13,15-17 e 19-28 / Biochemistry,' 27, 8174-8181 (1988)? Eur.

Pat. No. 88271141J. Descobriu-se que estes compostos eram tanto ou menos potentes que o VIP natural na ligação ao receptor de VIP e na resposta biológica. Para além disso, a patente de invenção norte-americana N° 4 605 641 e a patente de invenção norte-americana N° 4 734 400, refere análogos de VIP: A presente invenção compreende compostos de formula geral: X-R^R-j-R^-Ala-Rg-Rg-R^-Rg-Rg-R^Q-R^-R^- R13~R14~R15“R16_R17~Ala”R19_R20~R2l“R22~ -6- R2 3”R2 4“R25"R2 6_R2 7_R2 8”Υ em que representa His, Ala, N-CH3-Ala,D-Ala,Gly, piro-Glu,B-Ala ou foi eliminado; R2 representa Ser ou Ala; R3 representa Asp ou Ala; Rg representa Vai, Leu ou Ala; Rg representa Trp, Ala ou

Q

na qual Q =

n = 1,2; e X2 representam, cada um, independentemente um ãto mo de hidrogénio, fluor, cloro ou iodo ou um grupo OH, OCH3, ch3, cf3, no2, nh2, n(ch3)2, NHCOCH3, NHCOCgHg, ou C(CH3)3; X3 representa um átomo de hidrogénio ou de fluor R7 representa Thr ou Ala; RQ representa Asp, Glu ou Ala; R^ representa Asn ou Ala; R^q representa Tyr, ou Rg; R^^ representa Thr ou Ala; R^2 representa Arg, Lys, Orn ou Ala; R^3 representa Leu ou Ala; R^ representa Arg, Lys ou Ala; R^j. representa Lys ou Ala; R^g representa Gin ou Ala; R^7 representa Met, Nle ou Ala; Rig representa Vai ou Ala; R2Q representa Lys ou Ala; R21 rePresenta Lys ou Ala; R22 representa Tyr, ou Rg; R23 representa Leu ou Ala; R^^ representa Asn ou Ala; R^ representa Ser, Thr ou Ala; R2g representa Ile, Vai, Leu ou Ala; R^ representa Leu, Lys ou Ala; R2g representa Asn, Thr, Lys ou Ala; X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo

Em que X4 representa um grupo alquilo C^-C^ ou halogeno alquilo c1-c3 CH3S02-, CH3NHCO-, CH3OCO-, ou CHgS(0)n(CH2)2C0-, em que n = 0-2; Y representa um grupo de fór mula geral -OXg, -NHX5 ou R2g-R3Q-R31-Z; X5 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^-Cg R2g representa Gly ou Ala; R3Q representa Gly, Lys ou Ala? R31 representa Gly, Ala, Met, Cys, Cys(Acm), Thr, Ser, Phe ou -ΝΗΧ^ Z representa um grupo de formula geral -OX^ ou -NHXj.;

Pelo que o VIP que surge naturalmente é ura composto de formula geral X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Rg-Tyr-Thr-R^2-Leu-

Rl4-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-R25-R26“

Leu-R2Q-Y,

Em que X = H, -CO-alquilo C^-Cg, -CO-fenilo

Ala, Asn

R12 = Arg, Lys, Orn R14 = Arg, Lys R25 = Ser, Thr R26 = Ile, Vai R28 = Asn, Thr Y = -OXg, “NHXj. X5 = H, alquilo C^· se encontra excluidos; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico por adição de ácidos ou de bases. Dã-se preferência aos compostos em que X e um grupo de fórmula geral

na qual X^ representa um grupo alquilo C^-C^, CH^SO^, ou CH^S(0) (CH2)2C0~' e n = 1; R^ represente His, Ala, N-CH^-Ala/Gly; R2 represente Ser ou Ala; R^ represente Asp ou Ala; Rj. represente Vai, Leu ou Ala; Rg represente Phe, p-F-Phe, Ala, 1-Nal; R^ represente Thr ou Ala; Rg represente Asp, Glu ou Ala; Rg represente Asn, Ala; R represente Tyr, p-NH2~Phe, 2-Nal, Ala, O-CHg-Tyr; R^ represente Thr, Ala; R12 represente Arg, Lys, Orn ou Ala; R13 represente Leu, Ala; R14 represente Arg, Lys, Ala; R^,. represente Lys, Ala; Rlg represente Gin, Ala; R^y represente Met, Nle ou Ala; R^g represente Vai, Ala; R2g represente Lys, Ala; R^ represente Lys, Ala; R22 represente Tyr, Ala m-F-Tyr; R23 represente Leu, Ala; R24 represente Asn, Ala; R2g represente Ser, Thr ou Ala; R2g represente Ile, Vai,

Leu ou Ala; R^ represente Leu, Ala, Lys; R2g represente Asn, 9

Thr, Ala, Lys e Y represente um grupo OH, NH2 ou R29""R30~R3l”Z em que Z represente 0Xg ou NHXg em que Xg represente um átomo de hidrogénio, e R29 represente Gly, Ala; R3Q represente Gly, Lys, Ala; e R31 represente Cys(Acm, Met, Ala; destes compostos dá-se preferência aos compostos em que X repre sente um grupo de fórmula geral

O

X4 na qual X4 represente um grupo CH3; R^ representa His, N-CH3~Ala? R2 representa Ser; R3 representa um radical Asp; Rg representa Vai, Leu; Rg representa Phe, p-F-Phe;’ R? representa um radical Thr; Rg representa Asp, Glu; Rg representa Asn, R^g representa Tyr, p-NH2-Phe, 2-Nal; R^ representa Thr; R^2 representa Arg, Lys, Orn; R13 representa Leu; R14 representa Arg, Lys; R^5 representa Lys; R^g represente Gin; R^ represente Met, Nle, Ala; R^g represente Vai, Ala; R2q represente Lys; R^ represente Lys; R22 represente Tyr; R23 represente Leu; R24 represente Asn; R2g represente Ser, Thr; R2g represente um radical Ile, Vai; R^ represente um radical Leu; R2g represente Asn, Thr e Y represente um grupo OH, NH2 ou R29“R3o“R3l“Z/ em que R29 represente Gly; R3Q represente um radical Gly, Lys; R31 represente Cys(Acm), Met, Ala; e Z represente vim grupo -OH ou -NH2.

Para além disto, destes compostos, dã-se preferência aos compostos em que R^q represente Tyr, p-NH2-Phe, R^2 represente Lys, Orn; R^4 represente Arg; R^ represente Nle, -10-

Ala; R25 represente Ser; R2g represente Vai; R2g represente Thr e Y represente um grupo OH, ou NH2 pelo que se dá maior preferência aqueles em que R^2 = Lys e/ou R^7 = Nle ou aqueles em que Y representa um grupo de fórmula geral R29”R30_R3l"*Z em 3ue R2g represente Gly; R^q represente Gly, Lys; e R^ represente Cys(Acm), Met,Ala; e Z represente um grupo -OH ou NH2; pelo que se dã maior preferência aqueles em que R31 = Cys (Acm) e/ou R^2 = Lys e/ou R^y = Nle e/ou R^q = Gly ou aqueles com Rg = Leu e/ou R^2 = Orn ou aqueles com = Met e/ou Rgg = Gly e/ou R^2 = Lys e R^7 = Nle.

Da-se também preferência aos compostos referidos nas páginas anteriores em que.X represente um grupo (CHgJCO-; R^ representa um radical His ou N-CHg-Ala; R2 represente Ala ou Ser; Rg represente Asp; Rg representa um radical Vai ou Leu;

Rg representa Phe ou p-F-Phe; R7 representa Thr, Rg representa um radical Asp ou Glu; Rg representa Asn; R^q representa Tyr, 2-Nal ou p-NH2~Phe; R^ representa Thr; R^2 representa Lys ou Orn; R^3 representa Leu; R^ representa Arg; R^g representa Lys; R^g represente Gin; R^7 representa Nle ou Ala; R^g representa um radical Ala ou Vai; R2g representa Lys; R^ representa Lys; R22 representa um radical Tyr; R23 representa Leu; R24 representa Asn; R25 representa Ala, Thr ou Ser; R2g representa um radical Leu ou Vai; R27 representa Lys ou Leu; R2g representa Lys ou Thr; e Y representa um grupo NH2 ou Κ29_Κ3θ“Κ31~ζ? R29 representa Ala ou Gly; Rgg representa Ala, Gly ou Lys; R^ representa Ala, Met, Thr, Cys(Acm) ou não se encontra presente; e Z representa NH2 pelo que se dã especial preferência ao composto em que R^ = His. e/ou em que Rg represente Vai; Rg represente Phe; R1q representa um radical 2-Nal ou Tyr; R^2 re- -11- presenta Lys; representa Nle; R25 representa Ala ou Ser; e Y representa ^9^30^31-27 R^q represente Ala ou Gly e R^ representa Ala, Met ou Thr;

De acordo com o modo como aqui se utilizam os termos "alquilo C^-C3" referem-se a metilo, etilo, propilo e isopropi lo. A nomenclatura utilizada para definir os péptidos ê a que se utiliza usualmente na especialidade, em que o grupo amino na extremidade N aparece â esquerda e o grupo carboxilo na extremidade C aparece â direita. Por amoniãcidos naturais pretende-se referir os amoniãcidos que surgem naturalmente nas proteínas, isto é Gly,Ala,Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg,

Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp, e His. Por Nle pretende-se referir a norleucina. Por Orn pretende-se referir a ornitina. Por AC, pretende-se referir acetilo (CH3CO-). Quando os aminoácidos possuem formas isoméricas, é a forma L do aminoãcido a representada, salvo indicação expressamente em contrário.

Indicam-se os análogos de VIP colocando os aminoãcidos substituídos entre parêntesis rectos antes de "VIP". As derivações do aminogrupo da extremidade N, isto ê, tal como para X, antes, encontra-se indicado â esquerda das substituições entre parêntesis. Os numeros sequenciais que aparecem entre paren tesis à direita de "VIP" indicam as eliminações de amonoãcidos e as adições à numeração de sequência natural. Isto é por exem pio Ac-/^Lys , Nle , Gly J-VT2 (2-29) indica um polipiptido que possui uma sequência aminoâcida que corresponde a um VIP hu mano natural no qual o grupo acetilo foi substituído por um átomo de hidrogénio na extremidade N, a lisina foi substituída por -12 arginina na posição 12 e a norleucina tinha sido substituída por metionina na posição 17. Para alem disso, a histidina na posição 1 tinha sido eliminada e tinha-se ligado uma glicina ao grupo carboxilo da asparagina 28, designada por posição 29. Os sufixos "-0H" e "-Ní^" a seguir a "VIP" referem-se, respec tivamente, ao ácido livre e às formas de amida do polipeptido. Quando não se utiliza nenhum sufixo, interpreta-se a expressão como abrangendo ambas as formas.

Também se definem as abreviaturas seguintes: N-CH3~Ala ê N-metil-alanina p-P-Phe e p-fluoro-fenil-alanina 1- Nal ê 3(11-naftil)-alanina 2- Nal ê 3(2'-naftil)-alanina p-Ní^-Phe ê p-amino-fenil-alanina O-CH^-Tyr e O-metil-tirosina

Cys(Acm) ê S-acetoamido-metil-cistexna m-F-Tyr ê m-fluoro-tirosina B-Ala é beta-alanina

Os compostos representativos da presente invenção incluem péptidos que possuem as sequências aminoãcidas seguintes:

Ac—/’ T 12 Lys Λτΐ I7 ,Nle , Vai26,Ala28 /-VIP Ac-/' r 12 Lys ... 17 ,Nle ,Val26 ,Ala27, rThr28 / /-VIP Ac-/” T 12 Lys rNle17 ,Ala26 ,Thr28J r J-VTB Ac-/* Lys12, ,Nle17 ,Ala25 ,Val26/ rThr28 /-VIP Ac-/* Lys12 ,Nle17 ,, 24 ,Ala /Vai26, rThr28 /-VIP Ac-/* τ 12 Lys λττ I7 ,Nle ,, 23 ,Ala /Vai26, fThr28 /-VIP AC-/ T 12 Lys fNle17 ,Ala22 /Vai26, rThr28 /-VIP Ac-/ τ 12 Lys , ,Nle17 ,Ala21 /Vai26, ,Thr28 /-VIP AC-/ τ 12 Lys , ,Nle17 ,Ala20 /Vai26, rThr28 /-VIP

> 0 1 τ 12 Lys ,Nle17 ai 19 ,Ala ,Val26 28 ,Thr /-VIP Ac-/ Lys12 ,Ala17 ,Val26 /Thr28 /-VIP Ac-/ Lys12 16 /Ala ,Nle17 ,Val26 ,Thr28 /-VIP Ac-/ Lys12, /Ala15, Ατι 17 rNle T7 1 26 ,Val ,Thr28 /-VIP Ac-/ Lys·*·2, /Ala14, Mi I7 rNle Τ7 η 26 ,Val /Thr28 /-VIP Ac-/ Lys12, /Ala13, Ατι 17 rNle ,Val26 /Thr28 /-VIP Ac-/ Ala12, rNle17, „ η 26 /Thr28 /-VIP > 0 1 11 Ala , (N 1—1 ω Ατι 17 rNle /Vai26 /Thr28 /-VIP Ac-/ 10 Ala , τ 12 rLys , 17 rNle , /Vai26 ,Thr28 /-VIP

Ac-/"Ala9/Lys12,Nle17,Vai26,Thr28 /-VIP Ac-/*Ala8,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28 /-VIP Ac-/ Ala7,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28 /-VIP Ac-/" Ala6,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28/-VIP Ac-/"Ala5,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP Ac-/" Ala3/Lys12,Nle17, Vai2 6,Thr28 /-VIP Ac-/ Ala2,Lys12,Nle17,Vai2 6,Thr2 8 /-VIP

Ac-/ Ala1,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28 /-VIP 1 19 17 oc 90

Ac-/ Gly ,Lys ,Nle ,Vai ,Thr /-VIP

Ac-/ Leu5,Lys12,Nle17, Vai2 6 , Thr2 8 /-VIP

Ac-/ l-Nal6,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Ac-/ p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28 7-VIP

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17 ,Val26 ,Thr28 /-VIP

Ac-/ 2-Nal10,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Ac-/p-NH2“Phe10,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28 /-VIP

Ac-/0-CH3-TyrlQ,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Ac-/ Lys12,Nle17,m-F-Tyr22,Val26,Thr28 /-VIP

Ac-/ Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Met31 /-VIP

Ac-/ Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,Gly29'30,Cys(Acm)3l /-VIP

Ac-/ Lys12,Nle17,Vai2 6,Thr2 8, Gly2 9'3 0,Thr31 /-VIP

Ac-/,Lys12 ,Nle17,Vai26, Thr28 ,Ala29'30 ,Met31 /-VIP Ac-/Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,Ala29-31 /-VIP Ac-/-Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,Gly29,Lys39 /-VIP Ac-/" Lys12'14,Nle17,Ala19,Vai26,Thr28 /-VIP Ac-/ 2-Nal ,Lys ,Ala ,Val ,Thr /-VIP Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Ala29'30 ,Met31 7-VIP Ac-/ Glu8,Lys12/Nle17,Val26/Thr28,Gly29'30,Phe31/-VIP Ac-/ p-F-Phe ,Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ,

Cys (Acm) 31 7-vIp

Ac-/ p-F-Phe6,p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Vai26,Thr287-VIP Ac-/Lys ,Ala ,Val ,Thr ,Gly , Cys (Acm) /“VIP

Ac-/ Glu ,Lys ,Nle ,Val ,Thr ,Gly ,Met /-VIP

Ac-/ p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28 7“VIP Ac-/ p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29,3°,

Cys(Acm)31 /-VIP n /*/-n 8 7 12-, 17,19 TT,26 28 —, 29,30 .31 7

Ac-/ Glu ,Lys ,Ala ' ,Val ,Thr ,Gly ' ,Met /-VIP , 8 _ 12 ... 17 T7 ,26 28 29,30 ,, 31 , ___

Ac-/ Glu ,Lys ,Nle ,Val ,Thr ,Gly ,Ala /-VIP . 8 _ 12 17 —, 19 _7 ,26 28 29,30 M .31 7 ,7TT>

Av-/ Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ,Met /-VIP

Ac-/ p-F-Phe6 T 12 ΛΤ, 17 19 ,..26 28 29,30 ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly , Cys(Acm)31 /-VIP Ac-/ Glu8, Lys 12 17 T7 .26 ,Nle ,Val , Thr28,Gly29' 3°,Ser31/-VIP Ac-/ p-F-Phe6 ,Glu8,Lys12,Nle 17,Ala19,Vai 26,Thr28 /-VIP 1 O Glu8, Orn 12 17 T7 .26 ,Nle ,Val , Thr /-VIP Ac-/ Lys12 17 _Ί 25 _ 26 ,Nle ,Ala ,Leu _ 27,28 29,30 31 7 ,Lys ' ,Gly ' ,Thr / Ac-/ Glu8, Lys 12 ... 17 ,T .26 ,Nle ,Val , 28 29-Thr ,Ala 31 /-VIP Ac-/ Lys12 ,Ala17'19,Vai26,Thr28 /-VIP Ac-/ Glu8, Lys 12 ... 17 T7 .26 ,Nle ,Val , Thr28,Gly29, Lys 7-VIP Ac-/ p-NH2 10 _ 12 _Tl 17 -Phe ,Lys ,Nle ,Vai26,Thr28 ,Gly29'30,

Cys(Cam)31 /-VIP

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,Gly29'30,Cys(Acm)31 /-VIP

Ac-/* Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Met31 J-VIP CH3S(CH2)2CO-/'Lys12,Nle17/Val26fThr28 J-VIP(2-28) CH3SO (CH2) 2C0-/ Lys12 ,Nle17 ,Val26 ,Thr28 J-VTS (2-28)

Ac-/ N-CH^AXa1,Lys12 ,Nle17,'Vai26 ,Thr28 J-VIP Ac-/ Leu5,Orn12 ,Ala17,19,Thr25,Val26,Thr28,Gly29'30,

Cys (Acm) 31 /-VIP

Ac-/ p-F,Phe6,2-Nal10,Lys12'Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,

Met31 J-VTP

Ac-/ p-F-Phe6,Glu8,Lys12'14,Nle17 fAla19,Val26,Thr28,Gly297 30, Cys (Acm) 31 J7-vip

Os compostos preferenciais da presente invenção são os compostos seleccionados a partir do grupo que consiste em: Ac-/ p-F-Phe ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr Gly ,

Cys(Acm)31 /-VIP

Ac-/Leu5,Orn12,Ala17/19Thr25,Val26,Thr28Gly29_30,Cys(Acm) 31J-

-VIP

Ac-/ p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28,Gly29/3°,

Cys (Acm) 31 7-VIP

Ac-/ N-CH3-Ala1,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 J-VIP

Ac-/ p-F-Phe6,p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,Gly29,3°,Met31/-VIP

Ac-/ p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 J-VIP

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Met31J-VIP

Os compostos especialmente preferidos, da presente invenção são compostos seleccionados a partir do grupo que consiste em:

, 7-VIP

Ac-/ Lys12,Nle17,Ala19,Vai26,Thr28,Ala29"31 J-V IP Ac-/Lys12'Nle17,Ala19,Val26,Thr28,Gly29,Lys30 J-VIP Ac-/ Lys12,Nle17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27/28 r

Ac-/ Leu5,p-F-Phe6,Glu8,Orn12 , Ala17'19,Thr25,Vai2 6,Thr2 8 Gly2 9'3 0,Cys (Acm) 31 J-VIP Ac-/p-F-Phe6,Glu8 ,Lys12,Nle17 ,Val26,Thr28,Gly29'30,Thr31J-VIP Ac-/ Glu8fLys12/Nle17/Ala19/Val26/Thr28/Gly29/30,Thr31 J7-VIP Ac-/ Glu8/Lys12/Nle17/Ala25/Leu26/Lys27/28,Gly29/30/Thr31 J-VIP Ac-/ p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala25,Leu26,Lys27'28,Gly29,3°, Thr31 /-VIP

Ac-/ 2-Nal10,Lys12,Nle17 ,Ala19, Vai2 6,Thr28,Gly29 '30 ,Met31/-VIP Ac-/ Ala2/Glu8/Lys12/Nle17/Ala19/Val26/Thr28,Ala29”31 /-VIP

Ac-/ Ala ,Lys ,Nle ,Ala ,Leu ,Lys ' ,Gly ,Thr y-VIP Λ 12 .T1 17 19 _Ί 25 _ 26 _ 27,28 29-31 7 ___

Ac-/ Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Ala ,Leu ,Lys ' ,Ala y-VIP rr 12 W1 17 19 25 _ 26 _ 27,28 ., 29-31 7 Τ7ΤΏ

Ac-/ Lys ,Nle ,Ala ,Ala ,Leu ,Lys ,Ala y-VIP

Podem sintetizar-se facilmente os compostos representativos anteriores, de acordo com qualquer dos procedimentos convencionais para a formação de uma ligação peptidica entre aminoãcidos. Tais procedimentos convencionais incluem, por exem pio, qualquer procedimento de preparação de solução em fase liquida, que permita a condensação entre o grupo alfa-amino livre de um aminoãcido ou de um seu resíduo que possua o seu grupo carboxilico ou outros grupos reactivos protegidos e o primeiro grupo carboxilo livre de um outro aminoãcido ou de um seu resíduo, que possua o seu grupo amino ou outros grupos reactivos protegidos.

Pode efectuar-se o processo para se sintetizarem os compostos representativos, de acordo com um procedimento em que se adiciona um a um, sucessivamente cada um dos aminoãcidos, na sequência desejada, a um outro aminoãcido ou a um seu resíduo ou, de acordo com um procedimento em que se sintetizam convencionalmente em primeiro lugar, fragmentos do péptido com a se- // 17- / quência aminoãcida desejada e, depois se condensam para proporcionar o pêptido desejado.

Tais procedimentos convencionais para a síntese dos novos compostos da presente invenção incluem, por exemplo, qual quer método de síntese peptídica em fase sólida. Num tal método, pode efectuar-se a síntese dos novos compostos por incorporação sequencial dos resíduos aminoãcidos desejados um a um na cadeia de desenvolvimento do pêptido, de acordo com os princípios gerais dos métodos em fase sólida fMerrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc.‘ U5, 2149-2154 (1963); Barany e outros, The Peptides, Analysis, Synthesis e Biology, Vol. 2, Gross, E. e Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980) J.

Comum à síntese química de pêptidos e a protecção dos grupos reactivos de cadeia lateral dos diversos radicais amino-ãcidos com grupos protectores adequados que evitarão que a reac ção química ocorra nesse sítio ate o grupo protector ser finalmente eliminado. Também ê habitualmente comum a protecção do grupo alfa-amino num aminoâcido ou num fragmento enquanto essa entidalde reage no grupo carboxílico, seguindo-se a eliminação selectiva do grupo de protecção alfa-amino para permitir que tenha lugar uma subsequente reacção, nesse sítio. Embora se tenham referido os grupos protectores no que se refere ao método de síntese de fase sólida, deverá ter-se em conta que cada ami-noãcido pode ser protegido por um grupo de protecção convencionalmente utilizado para o respectivo aminoâcido de síntese em fase líquida.

Podem proteger-se os grupos alfa-amino por um grupo de protecção adequado seleccionado entre os grupos de protecção de tipo uretano aromático, tais como o benziloxicarbonilo (Z) e benziloxicarbonilo substituído, tais como o p-clorobenziloxicar -18- bonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo, p-bifenil-isopropiloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) e p-metoxibenziloxicarbonilo (Moz); grupos de protecção de tipo uretano alifático, tais como t-butiloxicarbonilo (Boc), di-isopropilmetiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, e, alilo-xicarbonilo. Dâ-se maior preferência ao Boc para a protecção alfa-amino.

Os grupos carboxilo podem ser protegidos por um grupo protector adequado seleccionado a partir de ésteres aromáticos, tais como benzilo, (OBzl) ou benzilo substituído por um alquilo. In ferior, halogéneo, nitro, tio ou tio substituído, isto i alquilo (C^-C^) inferior-tio; de ésteres alif áticos tais como alquj. lo inferior, t-butilo (Ot-bu), ciclopentilo, ciclo-hexilo (OcHx), cicloheptilo e, 9-fluorenilmetilo (Pfm). Dá-se preferência a OBzl para o ácido glutâmico (Glu). OcHx e OBzl são os preferenciais para o ácido aspãrtico (Asp).

Podem proteger-se os grupos hidroxilo com um grupo de protecção adequado seleccionado entre éteres, tais como benzilo (Bzl) ou benzilo substituído por alquilo inferior, halogéneo, tal como 2,6-diclorobenzilo (DCB), nitro, ou metoxi; t-butil (t-Bu), tetra-hidropiranilo e trifenilmetil (tritilo). Da-se preferência a Bzl para a serina (Ser) e treonina (Thr). Bzl e DCB são aqueles a que se dá maior preferência para a tirosina (Tyr).

Podem proteger-se os grupos amino de cadeia leteral por um grupo protector adequado seleccionado a partir de grupos de tipo uretano aromáticos tais como benziloxicarbonilo (Z) e benziloxicarbonilo substituído, tais como o p-clorobenziloxicar bonilo, 2-clorobenziloxicarbonilo (2-C1-Z), p-nitrobenziloxicar bonilo, p-bromobenziloxicarbonilo, p-bifenilisopropiloxicarbo^· · nilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) e p-metoxibenziloxi- carbonilo (Μοζ) ; grupos de protecção de tipo uretano alifáticos tais como t-butiloxicarbonilo (Boc), di-isopropilmetiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo e aliloxicarbonilo. Dá-se preferên-rencia a Z para a ornitina (Orn). Dã-se preferência a 2-C1-Z para a lisina (Lys).

Podem proteger-se os grupos de guanidina com um grupo de protecção adequado seleccionado entre grupos nitro, p-tolue-nossulfonilo (Tos), Z, adamantiloxicarbonilo e Boc. Dã-se preferência a Tos para a arginina (arg).

Podem proteger-se os grupos amido de cadeia lateral com xantilo (Xan). Não há nenhuma protecção preferencial para a asparagina (Asn) e para a glutamina (Gin).

Podem proteger-se os grupos imidazol com um grupo de protecção adequado seleccionado entre p-toluenossulfonilo (Tos) 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), trifenilmetilo (tritilo), 2,4-dinitrofenilo (Dnp), Boc e benziloximetilo (Bom). Dã-se preferência a Tos para a histidina (His).

Adquiriram-se todos os solventes, isopropanol (iPrOH) cloreto de metileno (CH^Cl^) e dimetilformamida (DMF) em Fisher ou Burdick & Jackson e utilizaram-se sem destilação adicional. Adquiriu-se o. ãcido trifluoroacitico em Halocarbon e utilizou--se sem purificação ulterior. Adquiriu-se a di-isopropiletilami na (DIPEA) em Pfaltz and Bauer e destilou-se a partir de CaO e anidrido antes de se utilizar. Adquiriram-se diciclo-hexilcar-bodi-imida (DCC) e di-isopropilcarbodi-imida (DIC) em Fluka e utilizou-se sem purificação adicional. Adquiriram-se hidroxiben zotriol (HBOT) e 1,2-etanoditiol (EDT) a Sigma Chemical Co. e utilizaram-se sem posterior purificação. Os aminoãcidos protegidos possuíam, geralmente, a configuração L e obtiveram-se na -20-

Chemical Dynamics Corp. ou no Bachem. Confirmou-se a pureza destes reagentes por cromatografia em camada fina, RMN e ponto de fusão, antes de se utilizarem. A resina de Benzidrilamina (BHA) era um copolimero de estireno -1% de divinilbenzeno (100--200 ou 200-400 malhas) obtido na Biomega, Bachem, Omni ou Advanced Chemtech. O teor total de azoto destas resinas encontrava-se geralmente compreendido entre 0,3 e 0,7 meg/g.

Efectuou-se esta cromatografia em camada fina (CCF) sobre placas de suporte de vidro 60 F254 (Merck) previamente cobertas com gel de silica, utilizando o solvente adequado. Efectuou-se a detecçao dos compostos extinguindo a fluorescência UV (254 nm de absorção), coloração com iodo ou por dispersão de ninidrina (para as aminas primaria e secundária).

Para se efectuar a análise da composição dos aminoáci dos, hidrolisaram-se os pêptidos em HC1 6N, contendo de 1-4 mg de fenol, a 115°C, durante 22-24 horas em tubos de hidrólise em vacuo, vedados. Efectuou-se a análise num analisador dé amiricácidos-Beckman 121M ou num sistema de análise de aminoâcidos com base numa cromatografia líquida de elevada pressão de Waters utilizando quer uma resina permutadora de catiões de Waters ou uma coluna AA511 de Pierce e detecçao com ninidrina.

Efectuou-se uma cromatografia líquida de elevada pre£ são (CLEP) num aparelho LDC que consistia num Constamametrico I e de tris bombas, um programador de solventes Gradient Master e um misturador e um espectromonitor III e um detector de UV de comprimento de onda variável. Efectuou-se a análise por CLEP em fase inversa utilizando colunas de C^g de Waters jjBondapak (0,4 x 30 cm). Efectuaram-se as separações preparativas da CLEP em 20 colunas partisil 10 ODS-3 (2 x 25 cm ou 2 x 50 cm) equipa- 21- ><- 7 âas com uma coluna prévia de C^g Waters Guard-Pak.

Prepararam-se os pêptidos, de um modo preferencial, utilizando a síntese em fase solida, de acordo com o método descrito de uma forma geral por Merrifield £ J. Amer. Chem. Soc., §5, 2149 (1963) Jt embora se possam utilizar outras sínteses químicas equivalentes, conhecidas na especialidade, conforme previamente descrito. Inicia-se a síntese em fase sólida a partir da extremidade C do pêptido que se pretende sintetizar, por acoplamento de um aminoãcido protegido em alfa, a uma resina adequada. Pode preparar-se este material inicial por ligação de um aminoãcido com o grupo alfa-amino protegido, mediante uma ligação éster a uma resina clorometilada ou hidroximetilada ou por uma ligação amida a uma resina de benzidrilamina (BHA) ou a uma resina de para-metilbenzidrilaau na (MBHA). A preparação da resina de hidrõximetilo e bem conhecida na especialidade. As resinas clorometilades encontram--se comercialmente disponíveis e, a sua preparação ê, também, bem conhecida na especialidade. Os suportes resinosos BHA e MBHA encontram-se comercialmente disponíveis e utilizam-se, geralraente, quando o pêptido desejado que se está a sintetizar possui uma amida não substituída na extremidade C. No que se refere a materiais resinosos, o termo "malha ASTM" designa as dimensões da malha. A dimensão da malha consiste num método vulgar para se medirem as partículas sólidas. Malha designa as dimensões, do crivo mais largo que retêm as partículas. 0 termo ASTM ê o grupo que normaliza as dimensões da malha do crivo que se utiliza para medir as dimensões das partículas da resina reticularmente ligada. De um modo geral, adiciona-se o primeiro aminoãcido a ser acoplado na resina BHA, como o anidrido simétrico do aminoãcido -Boc, utilizando 2-10 equivalentes dos aminoãcidos activados por equivalente azotado da resina. Após o acoplamento lava-se e seca-se a resina no vãcuo. Pode determinar-se a carga do aminoãcido na resina, por análise aminoacida de uma aliquota de resina de Boc-aminoãcido. As cargas encontram-se geralmente compreendidas entre 0,2 e 0,4 mmoles/g de resina. Podem-se aperfeiçoar quaisquer grupos aminoãcidos que não reajam, fazendo reagir a resina com anidrido acético e di-isopropiletilamina em cloreto de metileno. A seguir à adição de Boc-aminoãcido, fazem-se passar as resinas através de diversos ciclos repetitivos para se adicionarem os aminoãcidos sequencialmente. Eliminou-se o grupo de protecção do grupo alfa-amino Boc em condições de acidez. Podem utilizar-se, com esta finalidade, ãcido trifluoroacitico (TFA) em cloreto de metileno, HCl em dioxano ou misturas acidas de ãcido formico/ãcido acético. Utiliza-se, de preferência, TFA a 50% em cloreto de metileno (v/v). Também pode conter 1-5% em volume de EDTA ou de dimetil-sulfureto como um destruidor dos iões de t-butil-carbõnio. Podem também utilizar-se outros reagentes normalizados de clivagem, conhecidos na especialidade. A seguir à eliminação do grupo de protecção do grupo alfa-amino, ligaram-se, passo a passo, segundo a ordem desejada, os subsequentes aminoãcidos protegidos, para se obter uma resina peptídica intermédia, protegida. Os agentes activadores utilizados para o acoplamento dos aminoãcidos na síntese em fa se sólida dos péptidos, são bem conhecidos na especialidade.

Por exemplo, são reagentes adequados para uma tal síntese, he-xafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxi-tri-(dimetilamino)-fos -23 fõnio (ΒΟΡ), diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) e di-isopropil-carbodi-imida (DIC). Dã-se preferência a DCC e DIC. Podem uti lizar-se outros agentes activadores descritos por Barany e Merrifield (em The Peptides, Vol.2, J.Meienhofer, ed.f Acade-mic Press, 1979, pp 1-284). Podem adicionar-se as misturas de acoplamento no sentido de se optimizarem os ciclos de síntese, diversos reagentes tais como 1-hidroxibenzotriazol (HBOT), N--hidroxissuccinimida (HOSu) e 3,4-di-hidro-3-hidroxi-4-oxo--1,2,3-benzotriazina (HOOBT). Dã-se preferência a HOBT. O protocolo para um ciclo de síntese típico, foi o seguinte: QUADRO 1

Tempo

Passos Reagente 1 CH2C12 2 X 30 S 2 50% TFA/CH2C12 1 m 3 50% TFA/CH2C12 15 m 4 CH2c12 2 X 30 s 5 iPrOH 2 X 30 s 6 CH2C12 4 X 30 s 7 6% DIPEA/CH2C12 3 X 2 m 8 CH2C12 3 X 30 s 9 coupling 1 - 18 horas 10 ch2ci2 2 X 30 s 11 iPrOH 1 X 10 s 12 ch2ci2 1 X 30 s 13 DMF 2 X 30 s 14 CH2C12 3 X 30 s -24*

Mediram-se os solventes para todas as lavagens e para todos os acoplamentos em volumes de 10-40 ml/g de resina. Efectuaram-se os acoplamentos utilizando quer os anidridos simétricos, previamente preparados, dos Boc-aminoãcidos ou os de rivados de O-acil-isoureia. De um modo geral, adicionaram-se 2-10 equivalentes do aminoãcido Boc activado por equivalente da resina de amina utilizando cloreto de metileno como solvente. Ligou-se Boc-Arg(tos), Boc-Gln, Boc-Asn e Boc-His (Tos) em 20-25% de DMF/CE^C^. Ligaram-se Boc-Asn e Boc-Gln como os seus esteres activos de HBQT no sentido de se minimizar as reac ções colaterais conhecidas. . Monitorizaram-se as reacções de acoplamento de acordo com o ensaio de ninidrina de Kaiser para se determinar a extensão do que se havia realizado. Observaram-se efeitos cinéticos lentos de reacção para Boc-Arg(tos), Boc-Asn e Boc-Gln. Completaram-se quaisquer reacções de acoplamento incompletas com aminoãcidos activados recentemente preparados ou descobertos por tratamento da resina - pêptido com anidrido acético, conforme anteriormente descrito. Secaram-se no vácuo, durante diversas horas, a associação completa, péptidos-resinas.

Podem eliminar-se os grupos de bloqueio de cada um dos compostos, e pode clivar-se o pêptido a partir da resina mediante reagentes desbloqueadores e de clivagem adequados, co nhecidos na especialidade da síntese peptídica em fase sõlida e que se encontram descritos, por exemplo, em "The Peptides" (volume 2 ou 5, ver antes). Pode, por exemplo, desproteger-se, os péptidos e clivã-los a partir do suporte sólido por tratamento com um ácido forte tal como fluoreto de hidrogénio líquido (HF) ou ácido trifluorometanossulfónico (TFMSA) e, se se de- i -25 Λ·' sejar, na presença de aditivos tais como o etanoditiol ou tio-anisol como destruidores de catiões. De um modo mais específico, podem tratar-se as resinas peptídicas, por exemplo com 25--100 jul de etanoditiol, 1 ml de anisol e 9 ml de fluoreto de hidrogénio líquido, por grama de resina, a 0°C, durante 45-60 minutos, num aparelho Teflon HF (Península). De um modo alternativo, pode utilizar-se um procedimento de clivagem modificado, a dois passos, f Tamet/al., Tetrahedron Letters, 23, 2939--2940 (1982) J, em que se podia tratar a resina peptídica com 3 ml de dimetilsulfureto e 1 ml de fluoreto de hidrogénio, durante 2 horas a 0°c e evaporã-la antes do tratamento com HF a 90%. Podia, então eliminar-se os reagentes voláteis, no vácuo, a uma temperatura de banho de gelo. Pode lavar-se o resíduo com dois ou tris volumes de 30 ml (cada) de Et20 e de EtOAC e filtrar-se. Podiam extrair-se os piptidos a partir da resina, por lavagem com 4 x 20 ml de AcOH a 10% e filtrar-se. Podem liofi-lizar-se os filtrados aquosos combinados, para proporcionar um produto final bruto.

Efectuam-se, geralmente, as purificações directa-mente, no pêptido impuro por CLEP de preparação. Aplicaram-se os piptidos directamente a colunas num volume minimo de AcOH a 1% ou de TFA a 0,1%. A eluição em gradiente teve início, geralmente, a 10% do tampão B, 10%-25% de B em 10 minutos, e 25--35% de B em 3 horas (tampão A: 0,1% TFA/^O, tampão B:0,1% de TFA/CH^CN) a um débito de 0,8 ml/minuto. Efectuou-se a detec-ção UV a 220 nm. Recolheram-se as fracções a intervalos de 1,5-2,5 minutos e, examinaram-se por CLEP analítica. Agregaram--se e liofilizaram-se as fracções que se consideraram possuir -26- a pureza mais elevada.

Examinou-se a pureza dos produtos finais por CLEP analítica numa coluna de fase inversa, tal como anteriormente referido. De um modo geral iniciou-se a eluição em gradiente a 20-40% de B (tampão A:0;022% de TFA/^O, tampão B: 0,022% de TFA/CH^CN) em 15 minutos a 2,0 ml/minuto. Efectuou-se a de-tecção UV a 210 nm. Estimou-se que a pureza de todos os produtos era, aproximadamente, de 97-99%. Efectuaram-se análises de aminoãcidos de cada um dos pêptidos, individualmente, e os valores obtidos encontravam-se dentro de limites aceitáveis.

De um modo geral, submeteram-se todos os produtos finais a es-pectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido (FAB-MS). Tal como esperado, todos os produtos proporcionaram os iões M+ff de origem, dentro de limites aceitáveis.

Os novos compostos da presente invenção possuem propriedades farmacológicas valiosas. Demonstrar-se-á que são broncodilatadores potentes que não possuem efeitos cardiovasculares colaterais. Assim, sendo broncodilatadores altamente potentes, os compostos da presente invenção são agentes farmacêuticos valiosos para o tratamento de perturbações broncocans-tritivas, como por exemplo asma.

Podem combinar-se os novos compostos de fórmula geral 1 com diversos veículos farmacêuticos usuais, para se proporcionarem composições adequadas para utilização no tratamento de perturbações'broncoconstritivas tais como a asma. A dosagem desses compostos depende de diversos factores, tais como o composto particular empregue e a formulação particular. O especialista poderá determinar uma dosagem eficaz, a partir da concentração eficaz (CE^q) aqui descrita. -27

Os novos compostos de formula geral X formam sais de adição de ãcidos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, com uma diversidade de ãcidos inorgânicos e orgânicos tais como os ãcidos sulfurico, fosfórico, clorídrico, brõmico, iodi-drico, nítrico, sulfâmico, cítrico, láctico, piruvico, oxãlico, maleico, succínico, tartãrico, cinâmico e acético, trifluoro-acético, benzoico, salicílico, glucõnico, ascórbico e ãcidos semelhantes.

Podem administrar-se os actuais compostos por aplicação parenteral, por via intravenosa, por via subcutânea, por via intramuscular, por via oral ou por via intranasal. Uma via preferencial para a administração parentêrica consiste num aerossol por via oral ou numa administração intranasal.

Descrever-se-ã a presente invenção em conexão com os exemplos que se seguem e, que se proporcionam, apenas, còm fins ilustrativos.

Exemplo 1

Boc-Ala-resina de BHA

Desenvolveu-se resina de benzidrilamina, um copolies-tireno ligado reticularmente a divinilbenzeno a 1% (3,0g, 2,1 miliequivalentes (mequiv.) 100-200 malhas ASTM, Omni Biochem), em 30 ml de cloreto de metileno, filtrou-se e lavou-se utilizando os passos 7 - 8 do protocolo do quadro 1. Efectuou-se uma nova suspensão da resina em 30 ml de cloreto de metileno e, adicionou-se-lhe Boc-Ala (568 mg, 3,0 rnmole) e diciclo-he-xilcarbodi-imida (310 g, 1,5 rnmole). Agitou-se esta mistura, durante 15 horas, à temperatura ambiente, filtrou-se e, efec- tuaram-se os passos 10-14 do protocolo do quadro 1. A análise de ninidrina de Kaiser foi negativa. Aperfeiçoaram-se os grupos amino que não reagiram, tratando a resina com 1 ml de ani-drido acético em 30 ml de cloreto de metileno, durante 30 minutos, filtrou-se e lavou-se, de acordo com os passos 13-14 do protocolo. Secou-se a resina nò vácuo, durante a noite para se obterem 3,1 g de Boc-Ala-resina de BHA. Submeteu-se uma porção desta resina a análise aminoãcida o que indicou uma carga de 0,20 mmole de Ala/g.

Exemplo 2

Boc-Thr(Bzl)-resina de BHA

Trataram - se, tal como no exemplo 1, 10,0 g (7,0 me-quiv.) de resina de benzidrilamina (100-200 malhas ASTM, Omni) com excepção de se ter ligado a resina com Boc-Thr(Bzl) (3,1 g 10,0 mmole) e diciclo-hexilcarbodi-imida (1,0 g, 5,0 mmole). Secou-se a resina no vácuo para se produzirem 10,9 g de Boc--Thr(Bzl)-resina de BHA. A análise aminoãcida indicou uma carga de 0,2 mmole de Thr/g.

Exemplo 3

Boc-Ser(Bzl)-resina de BHA

Trataram-se, tal como no exemplo 1, 0,75 g (0,53 me-quiv.) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM. Omni), com excepção de se ter ligado a resina com Boc-Ser (Bzl) (222 mg, 0,75 mmole) e diciclo-hexilcarbodi-imida) (77 mg, 0,375 mmole). Secou-se a resina no vácuo, para se obter 0,80 g de u u ..,Λ 29-

Boc-Ser(Bzl)-resina de Bha. A análise aminoãcida indicou uma carga de 0,16 mmole de Ser/g.

Exemplo 4

Boc-Met-resina de BHA

Trataram-se, tal como no exemplo 1, 0,75 g (0,53 me-quiv.) de resina de henzidrilamina (malha 100-200^ ASTM, Omni), com a excepção de a resina ter sido acoplada com Boc-Met (187 mg, 0,75 mmole) e diciclo-hexilcarbodi-imida (77 mg, 0,375 mmole) . Secou-se a resina no vácuo, para se obter 0,81 g de Boc--Met-resina de BHA. A análise aminoãcida indicou uma carga de 0,19 mmole de Met/g.

Exemplo 5

Ac-/Lys12, Nle17, Vai26, Ala28 7-VIP

Submeteu-se uma porção, de 0,253 g (0,05 mmole) de resina Boc-Ala-BHA, do exemplo 1, a síntese em fase sólida, uti lizando o protocolo anteriormente referido. Efectuaram-se todos os acoplamentos utilizando equivalentes molares idênticos de amoniãcido protegido por Boc e de di-isopropilcarbodi-imida. Incorporou-se Boc-asparagina e Boc-glutamina, tal como os res-pectivos ésteres activos, pela adição de um excesso molar de 1,5 de HOBT à mistura de acoplamento. Os tempos de reacção foram, geralmente de 2-18 horas para se completar o passo de acoplamento. Efectuaram-se vinte e sete ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Leu (124 mg, 0,5 mmoles), Boc-Val (109 mg, 0,5 mmoles), Boc-Ser(Bzl) (147 mg, 0,5 mmoles), Boc-Asn -30- 7 (116 mg, 0,5 mmoles), Boc-Leu (124 ig 0,5 mmoles), Boc-Tyr(2,6--DCB) (220 mg, 0,5 mmoles), Boc-Lys(2-Cl-Z) (207 mg, 0,5 mmoles), Boc-lyç(2-C1-Z) (207 mg, 0,5 mmoles), Boc-Val (109 mg, 0,5 mmoles), Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmoles), Boc-Nle (116 mg, 0,5 mmoles), Boc-Gln (123 mg, 0,5 mmoles), Boc-Lys(2-Cl-Z)(207 mg, 0,5 mmoles), Boc-Arg(Tos) (214 mg, 0,5 mmoles), Boc-Leu (124 mg, 0,5 mmoles), Boc-Lys(2-Cl-Z) (207 mg, 0,5 mmoles), Boc-Thr (Bzl) (154 mg, 0,5 mmoles), Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0,5 mmoles, Boc-Asn (116 mg, 0,5 mmoles), Boc-Asp(OcHx) (158 mg, 0,5 mmoles), Boc-Thr(Bzl) (154 mg, 0,5 mmoles), Boc-Phe (133 mg, 0,5 mmoles), Boc-Val (108 mg, 0,5 mmoles), Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmoles), Boc-Asp(OcHx) (158 mg, 0,5 mmoles), Boc-Ser(Bzl) (148 mg, 0,5 mmoles) e Boc-His(Tos) (204 mg, 0,5 mmoles).

Fez-se então passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e fez-se reagir duas vezes com 0,5 ml de anidrido acético e 167 ml de DIPEA em 10 ml de cloreto de metileno, durante 50 minutos. Lavou-se a resina segundo os passos 10-14 e secou-se no vãcuo, obtendo-se 407 mg.

Desbloqueou-se a resina do pêptido e clivou-se por tratamento com 10 ml de Hf líquido contendo 1 ml de anisol e 100 ml de etanoditiol, durante 1 hora a 0°C. Evaporou-sea mistura reaccional por secagem no vãcuo, lavou-se com 2 x 30 ml de Et20 e extraíu-se com 3 x 30 ml de AcOH a 10%. Liofilizou--se o filtrado aquoso, para se obter 135 mg de um ρδ branco.

Purificou-se o pêptido impuro por CLEP de preparação. Aplicou-se a uma coluna Whatman Magnum-20 ODS-3 (2 x 50 cm) e eluíu-se com um gradiente linear de 25-35% de B (tampão A: 0,1% de TFA/H20, tampão B: 0,1% de TFA/CH3CN), em três ho-

A' ras a 8,0 ml/minuto. Cortou-se o pico principal por análise CLEP analítica das fracções recolhidas, agregadas e liofiliza-das para se obter 26,6 mg de um põ branco, amorfo. Este compo£ to era homogéneo analisado por CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3265,8, encontrado 3266,5.

Exemplo 6

Ac-/*Lys12,Nle17,Val26,Ala27,Thr28 7-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida uma porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina de Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 2, tal como se fez no exemplo 5, exceptuando o facto de se ter substituído, no primeiro ciclo Boc-Leu por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (399 mg), para se obter 117 mg de péptido impuro. Ã purificação por CLEP, propor cionou 32,4 mg de um põ branco, amorfo. O composto demonstrou ser homogéneo, de acordo com CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3253,7, encontrado 3253,4.

Exemplo 7

Ac-/ Lys12,Nle17,Ala26,Thr28 J-VIP

Submeteu-se uma porção de 0,254 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 2, a síntese em fase solida, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído, no segundo ciclo, Boc-Val por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desblo- -32 r queou-se o piptido de resina (399 mg) para se obterem 100 mg de piptido impuro. A purificação por CLEP, originou 29,4 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo de acordo com a CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM;MH calculado 3267,8, encontrado 3267,5.

Exemplo 8

Ac-/Lys12,Nle17,Ala25,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr (Bzl)-BHA, do exemplo 2, com a excepção de se ter substituído no terceiro ciclo Boc-Ser(Bzl) por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se o piptido da resina (394 mg), para se obter 125 mg de piptido impuro. A purificação por CLEP proporcionou 31,9 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo por CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB--EM:MH calculado 3279,8, encontrado 3279,8.

Exemplo 9

Ac-/Lys12,Nle17,Ala24,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr (Bzl)-BHA, do exemplo 2, com excepção de se ter substituído no quarto ciclo Boc-Asn por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desbloque ou-se a resina peptídica (373 mg) para se obterem 83,5 mg de piptido impuro. A purificação por CLEP proporcionou 28,7 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo em CLEP e, proporcionou uma analise aminoãcida correcta. EAB-EM:MH calculado 3252,8, encontrado 3252, 1.

Exemplo 10

Resina Boc-Thr(Bzl)-BHA

Tratou-se uma resina de benzidrilamina, um copolies-tireno ligado reticularmente a divinilbenzeno a 1% (5,0 g, 2,6 mequiv. 200-400 malhas ASTM, Vega Biochem), com 50 ml de cloreto de metileno, filtrou-se e lavou-se de acordo com os passos 7-8 do protocolo do quadro 1. Efectuou-se uma nova suspensão da resina em 60 ml de cloreto de metileno e, a isto, adicinou-se Boc-Thr(Bzl) (2,32 g, 7,5 mmole) e diciclo-hexilcarbodi-imida (774 mg, 3,75 mmole). Agitou-se esta mistura durante 4 horas, à temperatura ambiente, filtrou-se e depois executaram-se os passos 10-14 do protocolo do quadro 1. . A analise de ninidriíía de Kaiser foi negativa. Aperfeiçoaram-se os grupos que não reagiram, tratando a resina com 5 ml de anidrido acético e 5 ml de DIPEA em 50 ml de cloreto de metileno, durante 60 minutos, filtrou-se e lavou-se, seguin do os passos 13-14 do protocolo. Secou-se a resina no vácuo, durante a noite, produzindo 5,8 g de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA. Submeteu-se uma porção desta resina a análise aminoãcida o que indicou uma carga de 0,276 mmole de Thr/g.

Exemplo 11

Ac-/* Lys12,Nle17,Ala23,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza- -34- dor de pêptidos modelo 430A da Applied Biosystems, uma porção de 1/0 g (0,27mmole) de Boc-Thr(Bzl)-resina de BHA. Efectuara-ram-se os acoplamentos utilizando anidridos simétricos/ previa mente preparados a partir de aminoãcido protegido com Boc e de diciclo-hexilcarbodi-imida. Acoplaram-se por ligação dupla, de um modo usual, Boc-asparagina, Boc-glutamina e Boc-arginina (tosilo), tal como os respectivos ésteres activos de HOBT. Efeç tuaram-se vinte e sete ciclos de acoplamento, cada ciclo, com Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoleá , Boc--Ser(Bzl)) (590 mg, 2,0 mmoles), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Gln (492 mg, 2,0 mmoled, Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0'mmoles), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoles), Boc-Lys (2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmofes), Boc-Tyr (2,6^-DCB) (880 mg, 2,0 mmoles), Boc-Asn (464 mg, '2,0 mmoleá, Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Phe (530 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoles), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmoleá, e Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmoleá . Eliminou-se a resina peptídica do sintetizador e fez-se passar pelos passos 1-8 do protocolo e reagir com 1,0 ml de anidrido acético em 20 ml de DIPEA a 6%/cloreto de meti-leno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina, de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vácuo, obtendo-se 2,25 g de resina peptídica.,

Tratou-se uma porção de 1,5 g (0,18 mmole) desta re- -35 sina com 6 ml de dimetilsulfureto e 2 ml de HF líquido, durante 2 horas a 0°C. Evaporou-se a mistura reaccional e tratou-se o resíduo com 1 ml de anisol e 9 ml de HF líquido, durante 45 minutos a 0°C. Evaporou-se a mistura reaccional e lavou-se o resíduo com 2 x 30 ml de e 4 x 30 ml de EtOAc. Extraíu- -se a resina com 3 x 15 ml de AcOH a 10%e.2 x 20 ml de ^0.

Liofilizaram-se os filtrados aquosos combinados, produzindo-se 800 mg de um composto sólido branco.

Purificou-se uma porção de 400 mg (0,09 mmole) deste material por CLEP de preparação, tal como no exemplo 5, com ex- cepção de se ter levado a efeito um gradiente linear de 10-40%, em três horas. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas que se agregou e liofilizou para se obter 47,0 mg de um pó branco, amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e, proporcionou uma analise aminoãcida correcta.

Exemplo 12

Ac-/ Lys12,Nle17,Ala22,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de péptidos, modelo 43OA da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de 0,75 g (0,2 mmole) de resina Boc--Thr(Bzl)-ΒΗΆ, do exemplo 10. Efectuaram-se todos os acoplamen tos, tal como no exemplo 11, com excepção de se ter substituído Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmotes) e Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmole) por Boc-Ala e Boc-Tyr (2,6-DCB), respectivamente, nos ciclos 5 e 6. Eliminou-se a resina peptídica do sintetizador, desbloqueou-se, de acordo com os passos 1-8 do protocolo e tratou-se -36- cam anidrido acético, tal como no exemplo 11. Lavou-se a resina, de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vácuo para se obterem 1,6 g de resina peptídica.

Tratou-se uma porção de 0,8 g (0,1 mmole) desta resina, tal como no exemplo 11, para se obter, após liofilização, 400 mg de um composto sólido branco. Purificou-se o pêptido ‘im puro por CLEP de preparação, tal como no exemplo 11, exceptuan-do o facto de se ter usado um gradiente linear de 25-35%. Cortou-se o pico máximo por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 17,3 mg de um põ bran co, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo por CLEP e proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM: calculado 3203,7, encontrado 3203,8.

Exemplo 13 AC-/* Lys12 ,Nle17,Ala21,Vai2 6 ,Thr28 J-VT9

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de pêptidos, modelo 430A, da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de 0,7 g (0,19 mmole) de resina Boc--Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 10. Efectuaram-se todos os acoplamen tos , tal como no exemplo 11/ com excepção de se haver substituído Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmole) e Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmole) por Boc-Ala e Boc-Lys(2-C1-Z), respectivamente nos ciclos 5 e 7. Eliminou-se a resina peptídica do sintetizador e desblo queou-se, seguindo os passos 1-8 do protocolo, tal como no exem pio 11 e tratou-se com anidrido acético a 15%/cloreto de meti-leno, durante 15 minutos, â temperatura ambiente. Lavou-se a re sina de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vácuo, para se -37- obter 1,4 g de resina peptídica.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 750 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se por CLEP de preparação, uma porção de 250 mg deste péptido impuro, tal como no exemplo 12. Cortou--se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 20 mg de iam põ branco, amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e proporcionou uma analise aminoãcida correcta.

Exemplo 14 a /* τ 12 17 . 20 _ η 26 , 28 .*

Ac-/ Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr _/-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de peptidos, modelo 430A, da Applied Biostems, tal como no exemplo 11, uma porção de 0,7 g (0,19 mmole) de resina Boc-Thr (Bzl)-BHA, do exemplo 10. Efectuaram-se todos os acoplamentos, tal como no exemplo 11, com excepção de se haver substituído Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoleá e Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoleá por Boc-Ala e Boc-Lys (2-Cl-Z), respectivamente nos ciclos 5 e 8. Eliminou-se a resina peptídica do sintetizador e desbloqueou--se, seguindo os passos 1-8 do protocolo e tratou-se com ani-drido acético, tal como no exemplo 11. Lavou-se a resina de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vácuo para se obter 1,2 g de resina peptídica.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exemplo 11, para se obter, após liofilização, 270 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa este péptido impuro, tal como no exemplo 12. Cortou-se o pico prin- cipal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 12,4 mg de um pó branco, amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM: calculado 3238,7, encontrado, 3238,2.

Exemplo 15

Ac-/" Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28 J-VIP

Tratou-se uma resina de benzidrilamina, um copolies-tireno ligado reticularmente a divinilbenzeno a 1% (17,7 g, 2,6 mequiv. 200-400 malhas AS TM, Vega Biochem) , com 160 ml de cloreto de metileno, :£iltrou-se e lavou-se segundo os passos 7-8 do protocolo do quadro 1. Efectuou-se uma nova suspensão da re sina em 160 ml de cloreto de metileno e, a isto adicionou-se Boc-Thr(Bzl) (6,25 g, 20,2 mmoleé e diciclo-hexilcarbodi-imida (2,10 mg, 10,1 mmofes) .

Agitou-se esta mistura durante 8 horas, â temperatura ambiente, filtrou-se e depois executaram-se os passos 10-14 do protocolo do quadro 1. A análise de ninidrina de Kaiser foi negativa. Aperfeiçoaram-se os grupos amino que não reagiram, tratando a resina com 5 ml de anidrido acético e 5 ml de DIPEA em 150 ml de cloreto de metileno, durante 60 minutos, filtrou--se e lavou-se,·seguindo os passos 13-14 do protocolo. Secou--se a resina no vácuo, durante a noite, produzindo-se 18,0 g de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA. Submeteu-se uma porção desta resina a análise aminoãcida o que indicou uma carga de 0,17 mmole de Thr/g. 39-

Submeteu-se a síntese em fase sólida, resina Boc-Thr (Bzl)-BHA (18,0 g, 3,06 mmole), utilizando o protocolo anterior. Efectuaram-se todos os acoplamentos utilizando anidridos simétricos previamente formados, preparados a partir de Boc--aminoãcido e de diciclo-hexilcarbodi-imida. Acoplou-se Boc-ae paragina e Boc-glutamina assim como os respectivos ésteres acti vos de HOBT. Efectuaram-se cinco ciclos de acoplamento de um ci cio cada, com Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmotes) , Boc-Val (5,32 g, 24,5 mmo^esl , Boc-Ser(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmoles) , Boc-Asn (3,13 g, 13,5 mmotes) , e Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmotes) . Secou-se a resina no vácuo para se obter 22,9 g de resina Boc-hexapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 0,768 g (0,1 mmole) desta resina, através de vinte e dois ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Nle (185 mg, 0,8 mmole), Boc-Gln..· (108 mg, 0,44 mmole), Boc-Lys (2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmole), Boc-Arg(Tos) (342 mg, 0,8 mmole), Boc-Leu (199 mg, 0,8 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmo le), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole) e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica de acordo com os passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 1,0 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA a 6%/cloreto de metileno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina, -40- de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vácuo para se obter 1/12 g.

Tratou-se uma porção de 0,725 g (0,065 mmole) desta resina, tal como no exemplo 11, com 3 ml de dimetilsulfureto e 1 ml de HP líquido durante 2 horas a 0°C. Evaporou-se a mistura reacclonal e tratou-se a resina com 0,5 ml de anisol e 4,5 ml de HF líquido, durante 45 minutos a 0°C. Evaporou-se a mistura reaccional e lavou-se o resíduo com 1 x 1.5 ml de Et20 e 3 x 15 ml de EtOAc. Extraíu-se a resina com 3 x 20 ml de AcOH a 10%. Liofilizaram-se os filtrados aquosos combinados, produzindo-se 367 mg de um composto sólido branco.

Purificou-se este material impuro por CLEP de prepe-ração, tal como no exemplo 5, com excepçao. de se ter levado a efeito em gradiente linear de 10-40%, durante quatro horas. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas que se agregou e liofilizou para se obter 23 mg de um pó branco, amorfo. Este composto' era homogéneo em CLEP e, proporcionou uma análise aminoãcida correcta.

Exemplo 16

Ac-/Lys12,Ala17,Val26,Thr28 J-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, uma porção de 3,5 g (0,96 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 10. Efectuaram-se todos os acoplamentos utilizando anidridos simétricos previamente formados, preparados a partir de Boc-aminóaci do e de diciclo-hexilcarbodi-imida. Acoplou-se a Boc-asparagina -41- e Boc-glutamina assim como os respectivos esteres activos de HOBT. Efectuaram-se dois ciclos de acoplamento cada um dos ciclos com Boc-Leu (1/78 gf 7,7 mmole) e Boc-Val (1,68 g 1,1 romo le), para proporcionar 3,72 g de resina Boc-tripeptídica.

Acoplou-se uma porção de 3,41 g (0,88 mmole)' desta resina com um ciclo, com Boc-Ser(Bzl) (2,28 g 7,7 mmole) para se obter 3,52 g de resina Boc-tetrapeptídica.

Acoplou-se uma porção de 3,2 g (0,80 mmole) desta re sina com dois ciclos, de um ciclo cada com Boc-Asn (822 mg, 3,54 mmole) e Boc-Leu (1,6 g 6,4 mmole) para se obter 3,2 g de resina Boc-hexapeptídica.

Acoplou-se uma porção de 2,56 g (0,64 mmole) com três ciclos cada ciclo com Boc-Tyr (2,6-DCB) (2,26 g, 5,1 mmole), Boc-Lys (2-C1-Z) (2,13 g, 5,1 mmole) e Boc-Lys (2-C1-Z) (2,13 g, 5,1 mmoleá para se obter 3,2 g de resina Boc-nonapeptídica.

Acoplou-se uma porção de 2,8 g (0,56 mmole) desta resina com dois ciclos, cada ciclo com Boc-Val (978 mg, 4,5 mmole) e Boc-Ala (851 g, 4,5 mmole) para se obter 2,8 g de resina

Boc-undecapeptídica.

Acoplou-se uma porção de 0,39 g (0,078 mmole) desta resina com dezassete ciclos, cada ciclo com..Boc-Ala (118 mg, 0,62 mmole), Boc-Gln (85 mg, 0,34 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (260 mg, 0,62 mmole), Boc-Arg(Tos) (269 mg, 0,62 mmole), Boc-Leu (156 mg, 0,62 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (260 mg, 0,62 mmole), Boc--Thr(Bzl) (194 mg, 0,62 mmole), Boc-Tyr(2,6-DCB) (276 mg, 0,62 mmole), Boc-Asn (80 mg,0,34 mmole), Boc-Asp(OcHx) (198 mg, 0,62 mmole), Boc-Thr(Bzl) (194 mg, 0,62 mmole), Boc-Phe (166 mg, 0,62 mmole), Boc-Val (136 mg, '0,62 mmole), Boc-Ala (119 mg, 0,62 mmole), Boc-Asp(OcHx) (198 mg, 0/62 mmole), Boc-Ser(Bzl) (185 mg, 0,62 mmole), e Boc-His(Tos) (257 mg, 0,62 mmole). Se- -42- cou-se a resina peptídica no vãciio, para se obter 0,55 g de resina octacosapeptídica. Tratou-se uma porção de 0,275 g (0,039 mmole) desta resina com 0,5 ml de anidrido acético em 10 ml de DIPEA a 6%/cloreto de metileno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina, de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vãcuo, para se obter 0,27 g de uma resiha peptídica.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 15, para se obter, apõs liofilização, 139 mg de um composto solido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa este péptido impuro, tal como no exemplo 15. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou -se para se obter 6,6 mg de um p5 branco, amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e proporcionou uma analise aminoãcida cor-recta.

Exemplo 17

Ac-/ Lys12,Ala16,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Tratou-se uma porção de 9,5 g (3,61 mmoles) de resina de benzidrilamina, (200-400 malhas ASTM, Vega Biochem), tal como no exemplo 10, com excepção de a resina ter sido acoplada com Boc-Thr(Bzl) (3,35 g, 10,8 mmoJes) e diciclo-hexilcarbodi--imida (1,12 g, 5,42 mmofes) / durante 18 horas. Secou-se a resina no vãcuo, durante a noite, produzindo-se 9,8 g de resina Boc--Thr(Bzl)-BHA. Submeteu-se a análise aminoãcida uma porção desta resina, o que indicou uma carga de 0,17 mmole de Thr/g.

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o pro tocolo anterior, resina Boc-Thr(Bzl)-BHA (9,8 g, 1,7 mmole). Efec tuaram-se todos os acoplamentos utilizando anidridos simétricos /43- previamente formados, preparados a partir de Boc-aminoacido e de diciclo-hexilcarbodi-imida. Acoplou-se Boc-asparagina e Boc--glutamina assim como os respectivos ésteres activos de HOBT. Efectuaram-se cinco ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc--Leu (1,5 g, 6,0 mmolss), Boc-Val (1,3 g, 6,0 mmoleâ, Boc-Ser (Bzl) (1,8 g, 6,0 mmofes), Boc-Asn (773 mg, 3,3 mmoles), e Boc--Leu (1,5 g, 6,0 mmoles) . Secou-se a resina no vácuo, para se obter 12,2 g de resina Boc-hexapeptídica.

Acoplou-se uma porção de 8,2 g (1,13 mmole) desta resina com seis ciclos, cada ciclo com Boc-Tyr(2,6-DCB)(1,77 g, 4.0 mmoleâ, Boc-Lys (2-C1-Z) (1,67 g, 4,0 mmoles) e Boc-Lys(2-Cl--Z) (1,67 g, 4,0 mmoleâ, Boc-Val (876 mg, 4,0 mmoleâ, Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmoles), e Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmolss) , para se obter 10,2 g de resina Boc-decapeptídica.

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de pêptidos, modelo 430A, da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de 0,9 g (0,1 mmole) desta resina. Efectuaram-se dezasseis ciclos de acoplamento, cada cicio com Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoles), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmo-las) Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmoleâ, Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmo-leâ , Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoleâ , Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmoles), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmoleâ , Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmo]es) , Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmoleâ , Boc-Phe (530 mg, 2,0 mmoleâ, Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoleâ, Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2,0 mmoleâ, Boc-Ser (Bzl) (590 mg, 2,0 mmoleâ, e Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmoleâ . Eliminou-se a resina peptídica do sinteti-zador e seguiram-se os passos 1-8 do protocolo, e fez-se reagir com 0,6 ml de anidrido acético era 12 ml de DIPEA a 6%/cloreto *

de metileno, durante 20 minutos. Lavou-se a resina de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vácuo, para se obter 1,3 g de resina peptídica.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter,· após liofilização., 155 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se por CLEP preparatória este pêptido impuro, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter levado a efeito um gradiente linear de 20-40%. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracçÕes recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 35,2 mg de um pó branco, amorfo. Este composto era homogéneo â CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta.

Exemplo 18

Ac-/*Lys12,Ala15,Nle17,Val26,Thr28 J-VIP

Submeteu-se em fase sólida, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA do exemplo 2, com excepção. de se haver substituído no décimo terceiro ciclo, Boc-Lys(2-C1-Z) por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica para se obter 128 mg de pêp-tido impuro. A purificação, por CLEP proporcionou 35,8 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo por análise em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3238,7, encontrado 3237,9. • · · / 9 9 9 d -45-

Exemplo 19

Ac-/ Lys12,Ala14,Nle17,Val26,Thr28 J.-VTB

Submeteu-se uma porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 2, a síntese em fase solida, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído, no decimo quarto ciclo, Boc-Arg por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (368 mg) para se obter 112 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, proporcionou 24,7 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo de acordo com a CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correc-ta, FAB-EM:MH calculado 3210,7, encontrado 3210,8.

Exemplo 20

Ac-/ Lys12,Ala13,Nle17,Vai26,Thr28J-VT9

Submeteu-se uma porção de 0,255 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 2, a síntese em fase sólida, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído, no décimo quinto ciclo, Boc-Leu por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (416 mg) para se obterem 125 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, proporcionou 24,2 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo de acordo com CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3253,7, encontrado 3253,7.

Exemplo 21

Ac-/ Ala12/Nle17,Val26/Thr28 J-VIP

Submeteu-se uma porção de 0,254 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 2, a síntese em fase sólida, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído, no primeiro ciclo, Boc-Lys(2-Cl-Z) por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). Desblogueou-se a resina peptídica, para se obterem 128 mg de piptido impuro. A purificação por CLEP proporcionou 27,0 mg de ura pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo de acordo com a CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3238,7, encontrado 3238,1.

Exemplo 22

Ac-/Ala11,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 J-VIP

Tratou-se uma resina de benzidrilamina, um copolies-tireno ligado reticularmente a divinilbenzeno a 1% (25,0 g, 17,5 mequiv, 200-400 malhas ASTM, Vega Biochem), com 160 ml de cloreto de metileno, filtrou-se e lavou-se segundo os passos 7-8 do protocolo do quadro 1. Efectuou-se uma nova suspensão da resina em 160 ml de cloreto de metileno e adicionou-se Boc--Thr(Bzl) (16,2 g, 52,5 mmole) e diciclo-hexilcarbodi-imida (5,4 g, 26,2 mmole). Agitou-se esta mistura durante 6 horas, â temperatura ambiente, filtrou-se, e depois executaram-se os pas^ sos 10-14 do quadro 1. A análise de ninidrina de Kaiser foi negativa. Aperfeiçoaram-se os grupos amino que nao reagiram, tratando a resina com 5 ml de anidrido acético e 5 ml de DIPEA em 150 ml de cloreto de metileno, durante 60 minutos, filtrou-se e lavou-se, seguindo os passos 13-14 do protocolo. Secou-se a resina no vã cuo, durante a noite, produzindo-se 29,6 g de resina Boc-Thr (Bzl)-BHA. Submeteu-se uma porção desta resina a analise ami-noãcida o que indicou uma carga de 0,21 mmole de Thr/g.

Submeteu-se uma porção de 14,0 g (2,94 mmoleá desta resina a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anterior referido, tal como no exemplo 5. Efectuaram-se onze ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmotes) , Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmoles , Boc-Ser(Bzl) (6,9 g, 23,5 mmo3es) , Boc-Asn (3,0 g, 13,0 mmoleá , Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmo-leé Boc-Tyr(2,6-DCB) (10,3 g, 23,5 mmofes) , Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmoieá , Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmo-fcs) , Boc-Val (5,1 g, 23,5 rnmoleá , Boc-Ala (4,4 g, 23,5 mmoleá , e Boc-Nle (5,4 g, 23,5 mmoleá para se obterem 26 g de resina Boc-decapeptí dica.

Acoplou-se uma porção dè 17,3 g (1,96 mmole) desta resina com quatro ciclos de um ciclo cada com Boc-Gln (2,12 g, 8,6 mmoleé , Boc-Lys (2-C1-Z) (6,5 g, 15,7 mmoíss) , Boc-Arg(Tos) (6,7 g, 15,7 mmoleá . Secou-se a resina no vãcuo para se obter 19,7 g de resina Boc-hexapeptídica.

Efectuaram-se vinte ciclos de acoplamento, com uma por ção de 1,0 g (0,1 mmole) desta resina, cada um dos ciclos com Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (.212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (173 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole) , Boc-Ser(Bzl) C236 mg, 0,8 mmole) , e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptldica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/cloreto de metileiio, a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina seguindo os passos 10-14 e secou-se no vácuo, para se obter 1,2 g.

Tratou-se a resina peptldica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 600 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa uma porção de 400 mg deste peptido impuro, tal como no exemplo 11. Cor tou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhi das, agregou-se e liofilizou-se para se obter 63 mg de um pó branco, amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e proporcio nou uma análise arainoãcida correcta.

Exemplo 23

Ac-/ Ala10 ,Lys12 ,Nle17 ,Val26 ,Thr28 J-VIP

Fez-se passar através de doze ciclos de acoplamento, tuna porção de 1,0 g (0,1 mmole) de resina Boc-hexapeptídica, do exemplo 22, cada um dos ciclos com Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (.102 mg, 0,44 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (173 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez--se passar a resina peptldica pelos passos 1-8 do protocolo e -49- tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/clo-reto de metileno a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina seguindo os passos 10-14 e secou-se no vãcuo para se obter 1,1 g·

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 700 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa uma porção de 290 mg deste péptido impuro, tal como no exemplo 11, com excepção de se ter levado a efeito um gradiente linear de 20--40%. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 35,7 mg de um pó branco, amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e pro porcionou uma analise aminoãcida correcta.

Exemplo 24

Ac-/ Ala9,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 _/-VIP

Submeteu-se uma porção, de '0,68 g (0,075 mmole) de resina Boc-decapeptídica, do exemplo 17, a síntese em fase sólida, tal como no exemplo 15. Efectuaram-se dezasseis ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Gln (102 mg, 0,41 mmole) , Boc-Lys(2-C1-Z) (314 mg, '0,75 mmole), Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0,75 mmole), Boc-Leu (188 mg, 0,75 mmole), Boc-Lys(2-Cl-Z) (314 mg, 0,75 mmole), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,75 mmole), Boc--Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,75 mmole), Boc-Ala (143 mg, 0,75 mmole), Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0,75 mmole), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,75 mmole), Boc-Phe (200 mg, 0,75 mmole), Boc-yal (164 mg, 0,75 mmole), Boc-Ala (143 mg, 0,75 mmole), Boc-Asp(OcHx) (238 50 mg, 0/75 mmole) , Boc-Ser(Bzl) (233 mg, 0,75 mmole), e Boc-His (Tos) (310 mg, 0,75 mmole).

Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 1,0 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 30 minutos. Lavou--se a resina segundo os passos 10-14 e secou-se no vácuo para se obter 0,9 g.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, apSs liofilização, 336 mg de um composto solido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa este pêp-tido impuro, tal como no exemplo 11, com excepção de se ter levado a efeito um gradiente linear de 10-40%, em duas horas a 4,0 ml/minuto.

Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 11,8 mg de vim pó branco amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta.

Exemplo 25

Ac-/ Ala8 ,Lys12 ,Nle17 ,Val26 ,Thr28 /-VIP

Fez-se passar através de quatro ciclos de acoplamento, uma porção de 2,0 g (0,2 mmole) de resina Boc-hexapeptídica, do exemplo 22, em cada um dos ciclos com Boc-Lys(2-C1-Z) (664 mg, 1,6 mmole), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmole), Boc-Tyr (2,6-DCB) (705 mg, 1,6 mmole), e Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmole), para se obter 2,2 g de resina Boc-eicosapeptídica. 51^ / ;{

Fez-se passar, uma porção de 1,1 g (0,1 mmole) desta resina, através de oito ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmo le), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole).

Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 30 minutos. Lavou--se a resina segundo os passos 10-14, e secou-se no vácuo para se obter 1,1 g.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilizaçáo, 573 mg de iam composto sólido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa, este pép-tido impuro, tal como no exemplo 11, com excepção de se ter levado a efeito um gradiente linear de 10-14%. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou--se e liofilizou-se para se obter 69,0 mg de um pó branco, amor fo. Este composto era homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta.

Exemplo 26

Ac-/Ala7,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Fez-se passar, uma porção de 1,1 g (0,1 mmole) de resina Boc-eicosapeptídica do exemplo 25, através de oito ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Asp(OcHx) ( 252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), /-52-

Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc--Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmolé), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmo-le), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptxdica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina de acordo com os passos 10-14, e secou-se no vãcuo para se obter 1,1 g.

Tratou-se a resina peptxdica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 700 mg de um composto solido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa este pêp-tido impuro (400 mg), tal como no exemplo 11, com excepção de se ter levado a efeito um gradiente linear de 10-45%. Cortou--se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 29 mg de um põ branco, amorfo. Este composto era homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta.

Exemplo 27

Ac-/* Ala6,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 J-VIP

Fez-se passar, uma porção, de 1,0 g (0,1 mmole) de resina Boc-hexadecapeptxdica do exemplo 22, através de doze ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole) Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (173 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) 53- / (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez— -se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/clo-reto de metileno a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina de acordo com os passos 10-14, e secou-se no vácuo para se obter 1,3 g.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exemplo 11, para se obter, após liofilização, 531,4 mg de um composto solido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa este péptido impuro, tal como no exemplo 11. Cortou-se o pico prin cipal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 200 mg de um material semi-purificado. Purificou-se posteriormente este composto por filtração em gel, numa coluna Sephadex G-25 em AcOH a 10% para se obter 104,5 mg de um pó branco que se voltou a purificar por CLEP, para se obter 20 mg de um põ branco, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta.

Exemplo 28

Ac-/Ala5,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Fez-se passar uma porção de 3,0 g (0,3 mmole) de resina Boc-hexadecapeptídica do exemplo 22, através de doze ciclos de acoplamento cada ciclo com Boc-Lys(2-C1-Z) (996 mg, 2,4 mmo-leá , Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmoleá , Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,05 g, 2.4 mmolesl, Boc-Asn (302 mg, 1,3 mmole), Boc-Asp (OcHx) (757 mg, 2.4 mmoles), Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmoleé e Boc-Phe (637 mg, 2.4 mmofes) , para se obter 3,6 g de resina Boc-tricosapeptídica. -54

Fez-se passar uma porção de 1, 2 g (0,1 mmole) desta resina através de cinco ciclos de acoplamento cada ciclo com Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg,0,8 mmole), Boc--Asp(ocHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA a 6%/cloreto de meti-leno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina segundo os passos 10-14 e secou-se no vãcuo para se obter 1,13 g.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 600 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se por CLEP preparativa este péptido impuro, tal como no exemplo 11, com excepção de se ter levado a efeito o gradiente linear de 10-40%. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofi-lizou-se para se obter 64 mg de um pó branco, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta.

Exemplo 29

Ac-/* Ala3 ,Lys12 ,Nle17 ,Val26,Thr28 /-yip

Fez-se passar uma porção de 1,2 g (0,1 mmole) de resina Boc-tricosapeptídica, do exemplo 28, através de cinco ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc--Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole) . Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do proto- -55- / 'i colo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA a 6%/cloreto de metileno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina segundo os passos 10-14 e secou-se no vãcuo para se obter 1,2 g.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exemplo 11, para se obter, após liofilização, 700 mg de um com posto solido, branco. Purificou-se, duas vezes, por CLEP prepa rativa este péptido impuro, tal como no exemplo 11, com excep-ção de se ter levado a efeito os gradientes lineares de 10-45% e de 20-45%. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 9,6 mg de um põ branco, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma analise aminoácida correcta.

Exemplo 30

Ac-/”Ala2,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 7-VIP

Submeteu-se uma porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 2, a síntese em fase solida, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído, no vigésimo sexto ciclo, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmo le) .

Desbloqueou-se a resina peptídica (381 mg) para se obter 112 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP proporcionou 41,2 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo de acordo com a CLEP e proporcionou uma analise ami-noãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3279,8, encontrado 3279,5.

Exemplo 31

Ac-/ Ala1,Lys12/Nle17,Val26,Thr28 J-VIP

Fez-se passar uma porção de 1,2 g (0,1 mmole)' de resina Boc-tricosapeptídica, do exemplo 28, através de cinco ciclos de ligação, cada um dos ciclos com Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do pro tocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA a 6%/cloreto de metileno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina de acordo com os passos 10-14 e secou-se no vácuo para se obter lg.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exemplo 11, para se obter, após liofilização, 640 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se, o péptido impuro duas vezes, por CLEP preparativa, tal como no exemplo 11, com excepção de se ter usado os gradientes lineares de 20-50% e de 25-40%. Cortaram-se os picos principais por CLEP analítica das fracçóes recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se Obter 45 mg de um pó branco, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM: calculado 3229,7, encontrado 3228,8.

Exemplo 32

Ac-/ Gly1,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Fez-se passar através de dez ciclos de acoplamento,

•ν’" de um ciclo cada, uma porção de 4,0 g (0,4 mmole) de resina Boc-hexadecapeptídica, do exemplo 22, com Boc-Lys(2-C1-Z) (1,33 g, 3,2 mmotes) , Boc-Thr(Bzl) (990 mg, 3,2 mmole^ , Boc-Tyr(2,6--DCB) (1,41 g, 3,2 ramohs), Boc-Asn (409 mg, 1,76 mmole), Boc--Asp(ocHx) (1,02 g, 3,2 mmoles) , Boc-Thr(Bzl) (990 mg, 3,2 mmo-leá , Boc-Phe (849 mg, 3,2 mmoleé t Boc-Val (695 mg, 3,2 mmofes) , Boc-Ala (606 mg, 3,2 mmoles) , e Boc-Asp(OcHx) (1,02 mg, 3,2 mmo-, para se obter 6,0 g de resina Boc-hexacosapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 0,629 g (0,08mmole) desta resina através de dois ciclos de acoplamento, cada ciclo com, Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmole), e Boc-Gly (70 mg, 0,4 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA a 6%/cloreto de metileno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina segundo os passos 10-14 e secou-se no vácuo para se obter 546 mg.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 210 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se este pêptido impuro por CLEP preparativa tal como no exemplo 5. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou -se para se obter 24,0 mg de um pó branco, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise ami-noãcida correcta. FAB-EM:calculado 3215,7, encontrado 3215,4.

Exemplo 33

Ac-fLeu5,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Fez-se passar tuna porção de 1,0 g (0,1 mmole) de resj. Λ /' Λ /' 4* -58 na Boc-hexadecapeptídica do exemplo 22, através de vinte ciclos de acoplamento/cada ciclo com Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmo-le), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr (Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Leu (199 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA a 6%/cloreto de me tileno, durante 30 minutos. Lavou-se a resina segundo os passos 10-14 e secou-se no vãcuo para se obter 0,8 g.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 238 mg de iam composto sólido, branco. Purificou-se,duas vezes, por CLEP preparativa este pêptido impuro, tal como no exemplo 11. Cortaram-se os picos principais por CLEP analítica das fracções recolhidas, agre gou-se e liofilizou-se para se obter 17,4 mg de um -pó branco, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcio- λ nou uma analise aminoãcida correcta.

Exemplo 34

Boc-3- (1' -naf til-alamina- (Boc-l-Nal))

Dissolveram-se 1,0 g (4-, 6 mmoleá de 3-(1'-naftil)-ala nina e 512 mg (4,8 inmohs) de carbonato de sódio em 20 ml de HjO e 20 ml de dioxano. Adicionou-se, lentamente, 1,26 g (5,77 mmo-]es) de dicarbonato de di-butilo-terciário, em 5 ml de dioxano.

Deixou-se a mistura em agitação durante a noite, à temperatura ambiente. A maioria do dioxano evaporou-se no vácuo e colocou--se o resíduo em 35 ml de 1^0. Lavou-se esta solução com 3 x 25 ml de Et20, acidificou-se com ácido cítrico/^O a 10%, a pH 2 e extraíu-se com 4 x 50 ml de cloreto de metileno. Secaram-se sobre MgSO^ as camadas de metileno combinadas, filtraram-se e concentraram-se no vácuo, numa espuma oleosa. Recristalizou-se este material no seio de EtOAc/iter de petróleo a -20°C, para se obter 1,35 g (93%) de cristais brancos, p.f. 144°-146°C. £ a Jo -47,8°C (cl, EtOH). H^RMN compatível com a estrutura.

Exemplo 35

Ac-/ l-Nal6,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Tratou-se uma resina de benzidrilamina, um copolies-tireno ligado reticularmente a divinil-benzeno a 1% (30 g, 21,4 mequiv. 200-400 malhas ASTM, Vega Biochem), tal como no exemplo 22 com a excepção do facto de se terem utilizado 19,9 g de Boc-Thr(Bzl) (63,4 mmolesl e 6,6 g de diciclo-hexilcarbodi-imi da (32,1 mmoleá . Agitou-se esta mistura durante 18 horas, â tem peratura ambiente, filtrou-se, e depois executaram-se os passos 10-14 do quadro 1. A análise de ninidrina de Kaiser foi negativa. Aperfeiçoaram-se os grupos amino que não reagiram, tratando a resina com 8 ml de anidrido acético e 8 ml de DIPEA em 200 ml de cloreto de metileno, durante 60 minutos, filtrou-se e lavou--se, seguindo os passos 13-14 do protocolo. Secou-se a resina no vácuo, durante a noite, produzindo-se 34,2 g de resina Boc--Thr(Bzl)-BHA. Submeteu-se uma porção desta resina a análise 60- aminoãcida o que indicou uma carga de 0,47 mmole- de,Thr/g.

Submeteu-se uma porção de 0,75 g (0,35 mmole) desta resina Boc-Thr(Bzl)-BHA a síntese em fase solida, num sinteti-zador de piptidos, modelo 430A da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11. Efectuaram-se 21 ciclos de acoplamento, de um ciclo cada com Boc-Leu·(499 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Val (435 mg, 2.0 mmoleá , Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmoleá , Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoleá r Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmofes) , Βοσ-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmofes) , Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoles), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoles), Boc--Ala (378 mg,2,0 mmoleá, Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmo]es) , Boc-Gln (492 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmoleá, Boc--Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmoles), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmoles), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmoleá, Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmoles) , Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmoleá, e Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmoleá, para se obterem 2,59 g de resina Boc-doco-sapeptidica.

Submeteu-se uma porção de 0,74 g (0,1 mmole) desta re sina a síntese em fase sõlida, tal como no exemplo 15. Efectua ram-se seis ciclos, cada um dos ciclos com Boc-l-Nal (126 mg, 0,4 mmole), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmole), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmo le), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmole), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e fez-se reagir duas vezes com 1,0 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/clo-reto de metileno, a 6%, durante 60 minutos. Lavou-se a resina utilizando os passos 10-14 e secou-se no vãcuo para se obter 0,8 g. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, pa- -61- ra se obterem 366 mg de pêptido impuro. Purificou-se o piptido por CLEP, tal como no exemplo 5, com excepçio de se ter efectua do um gradiente linear de 27-37%, para se obter 49,6 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo de acordo com CLEP e proporcionou uma analise aminoãcida correcta. FAB-EM: MH calculado 3245,9 encontrado 3245,5.

Exemplo 36

Boc-p-Fluoro-Fenil-alanina (Boc-p-F-Phe)

Dissolveram-se 988 mg (4,91 mmole) de p-fluoro-fenil-alanina.^O e 525 mg (4,95 mmofes) de carbonato de sódio em 30 ml de dioxano/^O a 50%. Adicionou-se, lentamente, 1,3 g (5,95 mmoleê de di-carbonato de di-butilo terciário, em 3 ml de dio-xano. Deixou-se a mistura em agitação durante a noite â temperatura ambiente que se evaporou. Dissolveu-se o resíduo em 20 ml de H20, lavou-se com 3 x 20 ml de Et20, acidificou-se, para um pH 2, com HC1 0,1 N e extraíu-se com 3 x 30 ml de EtOAc. Se caram-se sobre MgS04 as camadas de EtOAc combinadas, filtraram -se e concentraram-se no vácuo obtendo-se um óleo. Cristalizou -se este material no seio de EtOAc/ hexano para se obterem 1,14 g (82%) de finas agulhas, p.f. 52°-54°C. £o(J^ +23,13° (c 1, EtOAc). Íhi RMN compatível com a estrutura. Anãl.calc. para C14H18FN04: C' 59'39? H' 6'40'* N' 4,94. Encontrado: C, 59,51; H, 6,60; N, 4,95. ...,/... -62

Λ

Exemplo 37

Ac-/ p-F-Phe6, Lys12,Nle17,Val26,Thr28 ^-VIP

Submeteu-se uma porção de 0,68 g (0,1 mmole) de resina Boc-docosapeptídica do exemplo 35, a síntese em fase solida, tal como no exemplo 15. Efectuaram-se seis ciclos cada ciclo com Boc-p-F-Phe (113 mg, 0,4 mmole), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmole)-Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmole), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmole), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e reagir, duas vezes, com 1,0 ml de anidrido acético em 15 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 60 minutos. Lavou-se a resina utilizando os passos 10-14 e secou-se no vácuo para se obter 0,7 g. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, para se obter 270 mg de péptido impuro. Purificou-se o péptido por CLEP, tal como no exemplo 5, para se obterem 84,1 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou -se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3313,8, encontrado 3313,0.

Exemplo 38

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 J-VIP

Fez-se passar uma porção de 7,48 g (1,0 mmole) de resina Boc-hexapeptídica do exemplo 15, através de dez ciclos, cada um dos ciclos com Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmoleá , Boc--Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mrnoleá , Boc-Lys (2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 63 mmoJes) , Boc-Val (869 mg, 4,0 mmole^ , Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmoleá , Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmoleá , Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmo]es> , Boc--Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmo]es) , Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmo le^ , e Boc-Leu (988 mg, 4,0 mmoleá . Secou-se a resina peptídi-ca no · vacuo para se obterem 9,6 g de resina Boc-hexadecapeptí dica.

Fez-se passar uma porção de 7,68 g (0,8 mmole) desta resina, através de um ciclo de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Lys (Fmoc) (1,5 g, 3,2 mmoles) para se obter 8,32 g de resina Boc-hexadecapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 6,24 g (0,6 mmole) desta resina, através de dois ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmo]es) e Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmole^ , para se obterem 6,28 g de resina Boc-nona-decapeptídica.

Fez-se passar, através de nove ciclos de acoplamento, uma porção de 2,09 g (0,2 mmole) desta resina, em cada um dos ciclos com Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmole), Boc.Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) {248 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmole). Fez-se pa£ sar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,25 ml de anidrido acético e 70 ml de cloreto de metileno, durante 20 minutos. Tratou-se esta resina com pi-peridina/DMF a 20% durante 20 minutos, lavou-se segundo os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo, obtendo-se 2,28 g.

Tratou-se uma porção de 0,57 g (0,05 mmole) desta resina, tal como no exemplo 11, com 6 ml de dimetilsulfureto e 2 / -64- ml de HF líquido, durante 2 horas a 0°C. Evaporou-se a mistura reaccional e tratou-se o resíduo com 1,0 ml de anisol e 9 ml de HF líquido, durante 45 minutos a 0°c. Evaporou-se a mistura reaccional e lavou-se o resíduo com 1 x 15 ml de Et2© e 3 x 15 ml de EtOAc. Extraíu-se a resina com 3 x 15 ml de AcOH a 10%. Liofilizaram-se as camadas aquosas combinadas, para se obter 250 mg de um solido branco.

Purificou-se este material impuro, por CLEP de preparação tal como no exemplo 5, exceptuando o facto de se levar a efeito um gradiente linear de 10-40%, em 4 horas. Cortou-se o pico principal por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregou-se e liofilizou-se para se obter 40,0 mg de um pó bran co, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo, de acordo com a CLEP e proporcionou uma analise aminoãcida correcta.

Exemplo 39

Boc-3-(21-naftil)-alanina (Boc-2-Nal)

Trataram-se 1*05 g (4,83 mmole) de 3-(2'-naftil)-alanina e 510 g (4,83 mmoleá de carbonato de sódio, com 1,26 g (5,77 mmolss) de dicarbonato de di-butilo terciário, tal como no exemplo 34. Após diversas fases, evaporaram-se as camadas de cloreto de metileno para originar um óleo transparente que cri£ talizou no seio de EtOAc/êter de petróleo, para se obter 1,25 g (82%) de agulhas brancas, p.f. 92°-94°c. /e(/D +43,15? (c 1, EtOH). H1 RMN compatível com a estrutura. Anal. calc. para C18H21N04 : C/ 68'56? H' 6'71'* N' 4,44. Encontrado C, 68,66; H, 7,02; N, 4,31.

Exemplo 40

Ac-/ 2-Nal10,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de pêptidos, modelo 430A da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de 0,85 g (0,4 mmole) de resina Boc--Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 35. Efectuaram-se dezassete ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoJes) , Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmo]es) , Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmo-2eá , Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmoles), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Lys ( 2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoles) , Boc--Val (435 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Gln (492 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Lys(2--Cl-Z) (830 mg, 2,0mmoleá, Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoles), Boc-Lys (2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmole!* e Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmoleá , para se obter 2,8 g de resina Boc-octadecapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 0,7 g (0,1 mmole) desta resina, através de dez ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-2-Nal (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole),Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 1 ml de anidrido acético e 15 ml de cloreto de metileno, durante 30 minutos. La- -66- / vou-se utilizando os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo, obtendo-se 0,9 g. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, para se obter 210 mg de péptido impuro. Purificou-se o péptido por CLEP tal como no exemplo 5, para se obter 46,8 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correc-ta. FAB-EM:MH calculado 3329,8, encontrado 3328,8.

Exemplo 41

Ac-/ p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 _7-VIP

Fez-se passar uma porção de 0,7 g (0,1 mmole) de resina Boc-octadecapeptídica do exemplo 40, através de dez ciclos de acoplamento cada um dos ciclos com Boc-p-NH(Z)-Phe (331 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) 9236 mg, 0,8 mmole), e Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 1,0 mlrde anidrido acético em 15 ml de DIPEA/clo-reto de metileno a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo, obten do-se 0,9 g. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, para se obter 247 mg de péptido impuro. Purificou-se o péptido por CLEP tal como no exemplo 5, para se obter 32,7 mg de um pô branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calcu- 67- lado 3294,8, encontrado 3294,1.

Exemplo 42

Boc-O-Metil-Tirosina (Boc-O-Me-Tyr)

Trataram-se 1,0 g (5,1 mmoles) de O-metil-tirosina e 1,08 g (10,2 mmo3ss) de carbonato de sódio, com 1,7 g (7,7 mmo-]es) de dicarbonato de di-butilo terciário, tal como no exemplo 34, com excepção de se terem utilizado 25 ml de I^O e 12 ml de dioxano. Após desenvolvimento gradual, evaporaram-se as camadas de cloreto de metileno para se obter um óleo claro que se cristalizou no seio de Et20/êter de petróleo para se obter 1,1 g (73%) de um sólido branco, p.f. 94°-96°C.

Exemplo 43

Ac-/ O-Me-Tyr10,Lys12,Nle17,Val26,Thr28 J-VT2

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de peptidos, modelo 430A da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de '0,85 g (0,4 mmole) de resina Boc--Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 35. Efectuaram-se treze ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmo-les) , Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmole$ , Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmofes), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmo-, Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmofes) , Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmo3eá , Boc-Val (435 mg, 2,0 mmotes) , Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmoJes) , Boc-Gln (492 mg, 2,0 mmoleá , e Boc-Lys (2-Cl-Z) -68- (830 mg, 2,0 mmofes) para se obterem 1,9 g de resina Boc-tetra-decapeptídica.

Fez-se passar esta resina através de quatro ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 15, cada um dos ciclos com Boc-Arg(Tos) (685 mg, 1,6 mraole), Boc-Leu (399 mg, 1,6 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (664 mg, 1,6 mmole) e Boc-Thr(B2l) (495 mg, 1,6 mmole), para se obterem 2,1 g de resina octadecapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 0,5 g (0,1 mmole) desta resina através de um ciclo de acoplamento, tal como no exemplo 15, com Boc-O-Met-Tyr (118 mg, 0,1 mmole) para se obter 0,5 g de resina Boc-nonadecapeptídica.

Fez-se passar esta resina através de nove ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, cada um dos ciclos com Boc--Asn (232 mg, 1,0 mmole), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmole), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmole), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmole), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmole), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole), Boc--Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmole), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmole), e Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmole). Fez-se passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 1,0 ml de anidrido acético e 15 ml de DIPEA/cloreto de me-tileno, a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo. Desbloqueou -se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, para se propor cionarem 154 mg de péptido impuro. Purificou-se o peptido por CLEP tal como no exemplo 5, para se proporcionarem 36,4 mg de um pô branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo em CLEP e proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM:MH calculado 3309,8, encontrado 3309,2. -69-

Exemplo 44

Boc-m-fluoro-DL-Tirosina(Benzil) (Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl))

Dissolveram-se 1,94 g (9,74 mmoles) de m-fluoro-DL-ti-rosina em 10,1 ml de NaOH 2N. Adicionaram-se 1,22 g (4,87 mmo-de CuS045H20 em 5 ml de H20. Aqueceu-se a mistura atê 50o--60°C, durante 10 minutos e depois arrefeceu-se em gelo. Adicio naram-se 42 ml de metanol e agitou-se vigorosamente. Enquanto se agitava, em banho de gelo, adicionaram-se, gota a gota, 2,25 g (13,1 mmoleá de brometo de benzilo. Decorridos 30 minutos, aqueceu-se a mistura até à temperatura ambiente e deixou-se em agitação durante a noite. Filtrou-se o precipitado azul de aço e lavou-se com 20 ml de H20/Me0H a 20%, 20 ml de MeOH, e 20 ml de acetona e depois secou-se no vácuo, para se obter 3,14 g. Efectuou-se uma suspensão deste material em 100 ml de EtOH/H20 a 50% e aqueceu-se atê â temperatura de refluxo. Adicionaram--se 3;62 g (9,7 mmoies) de Na2EDTÀ; H20 e diluiu-se a solução com 150 ml de Et0H/H20 a 50%. Filtrou-se a solução aquecida e arrefeceu-se o filtrado, durante 48 horas. Filtrou-se o filtra do branco, o que proporcionou 3,57 g.

Efectuou-se uma suspensão com uma porção de 3,42 g (9,7 ramole^ do solido e 2,05 g (19,3 mmo3es} de carbonato de sõ dio, em 75 ml de H20 e 25 ml de dioxano. Adicionaram-se 3,2 g (14,6 mmole^ de dicarbonato de di-butilo terciário em 3 ml de dioxano e deixou-se a mistura em agitação durante a noite. A maior parte do dioxano evaporou-se no vácuo e extr.aíu-se o resíduo com 75 ml de H O. 2 70- .-J*

Lavou-se a solução com 3 x 25 ml de Et20, acidificou -se para um pH 2, com ácido cítrico a 10% e extraíu-se com 3 x 40 ml de cloreto de metileno. Secaram-se sobre MgS04 as camadas combinadas de cloreto de metileno, filtraram-se e concentraram--se sob a forma de uma espuma oleosa. Cristalizou-se este material no seio de Et20/êter de petróleo, para se obter 1,8 g (47%) de um pó branco, p.f. 122°-122,5°C. EMN H^", compatível com a estrutura.

Exemplo 45

Ac-/ Lys12,Nle17,m-F-Tyr22,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-400, ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmole) Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmole), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmole), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmole), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmole), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmole)., Boc-m-F-Tyr(Bzl) (195 mg, 0,5 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmole), Boc-Lys(2-C1- -Z) (415 mg, 1,0 mmole), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmole), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmole), Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmole), Boc-Arg (Tos) (428 mg, 1,0 mmole), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmole), Boc--Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmole), Boc-Thr(bzl) (309 mg, 1,0 mmo le), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole), Boc-Asn (232 mg, 1,0 -71- mmole), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmole), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmole), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmole), Boc-Val (217 mg, 1.0 mmole), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmole), Boc,Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmole),e Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmole). Depois fez-se passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético e 10 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, du rante 60 minutos. Lavou-se a resina, utilizando os passos 10--14 do protocolo e secou-se no vãcuo, proporcionando, 639 mg.

Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, para se obterem 200 mg de péptido impuro. Purificou-se o péptido por CLEP, tal como no exemplo 5, para se obterem 25,6 mg de um po branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo, de acordo com CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3313,8, encontrado 3313,7.

Exemplo 46

Ac-/* Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Met31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,188 g (0,075 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-400, ASTM, Advanced ChemTech). Efectuaram-se trinta e um ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Met (187 mg, 0,75 mmole), Boc-Gly (131 mg, 0,75 mmole), Boc-Gly (131 mg, 0,75 mmole), Boc-Thr(Bzl) (232 mg, 0,75 mmole) Boc-Leu (187 mg, 0,75 mmole), Boc-Val (163 mg, 0,75 mmole), Boc-Ser(Bzl) (221 mg, 0,75 mmole), Boc-Asn (174 mg, 0,75 mmole), Boc-Leu (187 mg, 0,75 mmole), Boc-Tyr(2,6-DCB) (330 mg, 0,75 mmole), Boc-Lys(2--Cl-Z) (311 mg, 0,75 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (311 mg, 0,75 mmole) , Boc-Val (163 mg, 0,75 mmole), Boc-Ala (142 mg, 0,75 mmole) Boc-Nle (173 mg, 0,75 mmole), Boc-Gln (185 mg, 0,75 mmole), Boc -Lys(2-Cl-Z) (311 mg, 0,75 mmole), Boc-Arg(Tos) (321 mg, 0,75 mmole), Boc-Leu (187 mg, 0,75 mmole), Boc-Lys(2-Cl-Z) (311 mg, 0,75 mmole), Boc-Thr(Bzl) (232 mg, 0,75 mmole), Boc-Tyr(2.,6--DCB) (330 mg, 0,75 mmole), Boc-Asn (174 mg, 0,75 mmole), Boc--Asp(OcHx) (236 mg, 0,75 mmole), Boc-Thr(Bzl) (232 mg, 0,75 mmo le), Boc-Phe (199 mg, 0,75 mmole), Boc-Val (163 mg, 0,75 mmole) Boc-Ala (142 mg, 0,75 mmole), Boc-Asp(OcHx) (236 mg, 0,75 mmole), Boc-Ser(Bzl) (221 mg, 0,75 mmole), e Boc-His(Tos) (307 mg, 0,75 mmole). Depois fez-se passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético em 10 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 60 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vãcuo, obtendo-se 444 mg.

Desblogueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, para se obterem 177 mg de pêptido impuro. Purificou-se o pêptido por CLEP, tal como no exemplo 5, para se obter 23,5 mg de um p6 branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo, de acordo com CLEP e, proporcionou uma análise aminoãcida correcta FAB-EM:MH calculado 3541,1, encontrado 3540,1.

Exemplo 47

Ac-/ Lys12 ,Nle17,Vai26 ,Thr28,Gly29'30 ,Cys (Acm)31 /-VIP

Derivou-se uma resina de benzidrilamina, um copolies-tireno ligado reticularmente a divinilbenzeno a 1% (10,0 g, 7,0 -73- ·? mequiv, malha 200-400 ASTM, Bachem), tal como no exemplo 10, com excepção de se terem utilizado Boc-Cys(Acm) (3,4 g, 11,6 mmole$, HOBT (2,1 g, 15,8 mmoleá e diciclo-hexilcarbodi-imida (2,2 mg, 10,5 mmofes) . Agitou-se esta-'mistura durante 8 horas, â temperatura ambiente, para dar origem a uma análise de ninidri na de Kaiser, negativa. Secou-se a resina no vácuo, durante a noite, para se obter 12 g de resina Boc-Cys(Acm)-BHA. Submeteu -se uma porção desta resina a análise aminoácida, o que indicou uma carga de 0,44 mmole de Cys/g.

Submeteu-se a síntese em fase sõlida uma porção de 1,0 g (0,44 mmole) desta resina, num sintetizador de peptidos, modelo 9500 da Biosearch. Efectuaram-se todos os acoplamentos utilizando um excesso de cinco vezes os equivalentes molares idênticos dos aminoãcidos protegidos por Boc e diciclo-hexilcarbodi-imida. Acoplou-se Boc-asparagina e Boc-glutamina assim como os respectivos ésteres activos de HOBT. Efectuaram-se trin ta ciclos de acoplamento cada um dos ciclos com Boc-Gly (465 mg, 2,6 mmo£s) , Boc-Gly (465 mg, 2,6 mmofes) , Boc-Thr(Bzl) (757 mg, 2,5 mmotes) , Boc-Leu (633 mg, 2,5 mmole^l , Boc-Val (532 mg, 2.5 mmofes) , Boc-Ser(Bzl) (780 mg, 2,6 mmolesl , Boc-Asn (580 mg, 2.5 mmofes) , Boc-Leu (633 mg, 2,5 mmoJes) , Boc-Tyr(Bzl) (947 mg, 2.5 mmolss) , Boc-Lys (2-C1-Z) (1,02 g, 2,5 mmoleá , Boc-Lys(2-C1- -Z) (1,02 g, 2,5 mmotes) , Boc-Val (532 mg, 2,5 mmoled , Boc-Ala (500 mg, 2,6 mmoles) , Boc-Nle (680 mg, 2,9 mmoleá , Boc-Gln (650 mg, 2,6 mmo]es) , Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,02 g, 2,5 mmofes) , Boc-Arg (Tos) (1,13 g, 2,6 mmolei^ , Boc-Leu (633 mg, 2,5 mmoleá , Boc--Lys(2-Cl-Z) (1,02 g, 2,5 mmofes) , Boc-Thr(Bzl) (757 mg, 2,5 mmo 3es) , Boc-Tyr(Bzl) (947 mg, 2,5 mmoleá / Boc-Asn (580 mg, 2,5 mmo ]es), Boc-Asp(OcHx) (835 mg, 2,6 mmoles) , Boc-Thr(Bzl) (757 mg, -44- 2.5 mmoÊs) , Boc-Phe (780 mg, 2,9 mmoles) , Boc-Val (532 mg, 2,5 mmoleá, Boc-Ala (500 mg, 2,6 mmoleá, Boc-Asp(OcHx) (835 mg, 2.6 mmoleá , Boc-Ser(Bzl) (780 mg, 2,6 mmoleá / e Boc-His(Tos) (1,08 g, 2,6 mmoleá · Desprotegeu-se a resina peptídica e tratou-se com anidrido acético, durante 30 minutos. Secou-se a re sina no vácuo, o que proporcionou 3,2 g de resina peptídica.

Desbloqueou-se uma porção de 1,5 g desta resina pep-tídica, tal como no exemplo 11, o que proporcionou 525 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP tal como no exemplo 5, proporcionou 47 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou -se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3583,1, encontrado 3583,6.

Exemplo 48

Ac-/ Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,Gly29 7 30,Thr31 J-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem) , utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5. Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada um deles com Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmole), Boc--Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exem pio 45, com excepçãode sè haver substituído Boc-m-F-Tyr (Bzl) , no sétimo ciclo, por Boc-Tyr(2,6-DCB) (400 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (700 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando-se 200 mg de um péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, propor 75 cionou 63,8 mg de um po branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correc ta. FAB-EM:MH calc. 3511,0, encontrado 3510,1.

Exemplo 49

Ac-/Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Ala29'30,Met31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida uma porção de 0,188 g (0,075 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100--200 ASTM, Advanced ChemTech), tal como no exemplo 46, excep-tuando o facto de se haver substituído no segundo e terceiro ciclos Boc-Gly por Boc-Ala (142 mg, 0,75 mmole). Desbloqueou--se a resina peptídica (447 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 192 mg de um péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, propor cionou 10,8 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correc-ta. FAB-EM:MH calc. 3569,1, encontrado 3568,9.

Exemplo 50

Ac-/ Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Ala29"31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,25 g, (0,05 mmole) de resina Boc-Ala--BHA, do exemplo 1, exceptuando o facto de se terem efectuado, antes de se efectuarem os vinte oito ciclos do exemplo 5, três ciclos, cada um deles com Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole), Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole), e Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmole). Desblo- -76- • * queou-se a resina peptídica (431 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 117 mg de um pêptido impuro. A purificação por CLEP tal como no exemplo 5, proporcionou 28,8 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3509,0, encon trado 3508,2.

Exemplo 51

Ac-/ Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29,Lys30 J-VTB

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se dois ciclos de acoplamento, cada um deles com Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram-se vinte e'oito'ciclos de acoplamento tal como no exemplo 45, exceptuando o facto de se haver substituído no sétimo ciclo Boc-m-F-Tyr(Bzl), por Boc--Tyr (2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (873 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 272 mg, de um pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 59,0 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mo£ trou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3481,0, encontrado 3481,3.

Exemplo 52

Ac-/ Lys12/14,Nle17,Ala19,Val26,Thr28/-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o pro -77 tocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 rnrnole) de resina de benzidrilamina (malha 100--200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acopla mento como no exemplo 45, exceptuando o facto de se haver substituído no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr(Bzl), por Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole) no décimo ciclo, ter-se substituído Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole) e de se haver substituído, no decimo quinto ciclo, Boc-Arg(Tos) por Boc-Lys(2-CL-Z) (415 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (778 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 158 mg de um piptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, originou 31,7 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3239,7, encontrado 3239,9.

Exemplo 53

Ac-/ 2-Nal10,Lys12,Ala17,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento tal como no exemplo 45, exceptuando o facto de se haver substituído no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr(Bzl), por Boc--Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole), ter-se substituído, no dêci mo segundo ciclo Boc-Nle por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole) e Boc--Tyr(2,6-DCB), no nono ciclo, por Boc-2-Nal (315 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (600 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando 210 mg de um péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, obtendo-se 26,5 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo por CLEP e, proporcionou uma analise aminoacida correcta. FAB-EM:MH calc. 3287,8, encontrado 3287,5.

Exemplo 54

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Ala29'30,Met31 J-VT2

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada um deles com Boc-Met (249 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole) e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram--se vinte e oito ciclos de acoplamento tal como no exemplo 45, com a excepção de se haver substituído no sétimo ciclo, Boc-m--F-Tyr(Bzl), por Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole) e de se haver substituído no vigêssimo primeiro ciclo Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (651 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando 185 mg de um pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 22 mg, de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoacida correcta. FAB--EM:MH calc. 3583,2, encontrado 3582,5.

Exemplo 55

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29',3°,Phe31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, uma porção de -79- ¢.- 0,188 g (0,075 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100--200 Advanced ChemTech), tal como no exemplo 46, com a excep-ção de, no primeiro ciclo, se ter substituído Boc-Met, por Boc--Phe (199 mg, 0,75 mmole) e de se ter substituído, no vigêssi-mo primeiro ciclo Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (253 mg, 0,75 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, proporcionando 78 mg de um pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 8,0 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3571,0, encontrado 3569,8.

Exemplo 56

Ac-/p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19, Vai26,Thr28,Gly29'30,

Cys (Acm) 31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem)v Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada um deles com Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmole), Boc--Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exem pio 45, com a excepção de se haver substituído no sétimo ciclo-, Boc-m-F-Tyr(Bzl), por Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole) e de se haver substituído no décimo ciclo Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole)e-de sehaver substituído no vigêssimo primeiro ciclo Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole) e no vi- -80 gêssimo terceiro ciclo, ter-se substituído, Boc-Phe por Boc-p--F-Phe (142 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica 699 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando 270 mg de um pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 36,5 mg de um pó branco, amorfo. O composto mos-trou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãci-da correcta. FAB-ΕΜϊΜΗ calc. 358-8,1, encontrado 3587,7.

Exemplo 57

Ac-/p-F-Phe6,p-NH2-Phe^°jLys'1'2,Nle17,Val26,Thr2^ J-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, num sintetiza-dor de péptidos, modelo 430A da Applied Biosystems, uma porção de 0,85 g (0,4 mmole) de resina Boc-Thr(Bzl)-BHA, do exemplo 35. Efectuaram-se dezassete ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 40, para se obter 2,28 g de resina Boc-octadecapeptídi-ca.

Submeteu-se a .síntese de fase sólida, tal como no exemplo 15, uma porção de 0,57 g (0,1 mmole) desta resina e fez^ -se passar através de dez ciclos, cada ciclo com Boc-p-NH(Z)--Phe (166 mg, 0,4 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole), Boc-Asp (OcHx) (126 mg, 0,4 mmole), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmole), Boc-p-F-Phe (113 mg, 0,4 mmole), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmole), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmole), BocAsp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmole), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmole), e Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmole). Fez-se passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético e 20 ml de DlPEA/cloreto de metileno, a 6% durante 30 minutos. Lavou-se / -81- a resina, segundo oá passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo, proporcionando 603 mg. Desbloqueou-se a resina peptídi-ca, tal como no exemplo 5, para se proporcionarem 252 mg de pêptido impuro. Purificou-se o pêptido.por CLEP, tal como no exemplo 5, para se obterem 40,4 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo, de acordo com CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calculado 3312,8, encontrado 3312,6.

Exemplo 58

Ac-/" Lys12,Ala17,Val26,Thr28,Gly29'30,Cys(Acm)31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de pêptidos, modelo 9500 da Biosearch, uma porção de 1,0 g (0,44 mmole) de resina Boc-Cys(Acm)-BHA do exemplo 47. Efectua ram-se trinta ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 47, com excepção de Boc-Nle, no ciclo 14 ter sido substituída por Boc-Ala (500 mg, 2,6 mmo3e^ . Desprotegeu-se a resina peptídi-ca e tratou-se com anidrido acético, durante 30 minutos. Secou--se a resina no vácuo, para se obterem 2,4 g de resina peptídi-ca.

Desbloqueou-se, tal. coid no exemplo 11, uma porção de 1,2 g desta resina peptídica para se proporcionarem 370 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 70 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou--se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida cor recta. Fab-EM:MH calc.3542,0, encontrado 3541,7.

Exemplo 59

Ac-/” Glu8,Lys12/14,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Met31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, .Bachem). Efectuaram-se três ciclos de acoplamento cada um deles com Boc-Met (249 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole) e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole)* Efectuaram-se · vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com a excepçio de se haver substituído no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr (Bzl), por Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole) e de se haver substituído no décimo quinto ciclo Boc-Arg(Tos) por Boc-Lys(2--Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído no vigêssi-mo primeiro ciclo Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (814 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 200 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 20,6 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EMjMH calc. 3527,1, encontrado 3526,7.

Exemplo 60

Ac-/* p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Ala19,Vai26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma

Zm 83- ί porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepçió de se haver substituído no sétimo ciclo Boc-m-F-Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6--DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído no décimo ciclo Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído no décimo nono ciclo Boc-Tyr(2,6-DBC) por Boc-p-NH(Z)-Phe (208 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, obtendo-se 138 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 23,1 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo por CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3266,7, encontrado 3266,6.

Exemplo 61

Ac-/* p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,

Giy29,30,Cys(Acm)31 /-viP

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo'5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se tris ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram--se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepçao de se haver substituído no sétimo ciclo Boc-m-F--Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no vigéssimo primeiro ciclo, Boc-Asp(OcHx) por Boc- -84- -Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole) e de ter substituído no vigéssi-mo terceiro ciclo Boc-Phe por Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (900 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando 225 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 20,5 mg de um po bran co, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcio nou uma análise aminoâcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3616,1, encontrado 3615,6.

Exemplo 62

Ac-/" Glu8,Lys12,Ala17'19,Vai26,Thr28,Gly29'30,Met31/-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se três ciclos de acoplamento cada ciclo com Boc-Met (249 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excep ção de se haver substituído no sétimo ciclo Boc-m-F-Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituí do, no décimo ciclo, Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole) e de ter substituído no vigêssimo primeiro ciclo Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (736 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 240 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 38,8 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoâcida correcta. Fab-Em:MH calc. 3485,0, encontrado 3484,6.

Exemplo 63

Ac-f Glu8,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,Gly29'30,Ala31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anterior, tal como exemplo 5, uma porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina Boc-Ala do exemplo 1. Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole) , Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), e Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmole). Efectuaram vinte e sete ciclos, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído no vigêssimo ciclo, Boc-Asp (OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (167 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (380 mg), tal como no exemplo 5, o que proporcionou 115 mg de peptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 31,6 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoicida correcta. FAB-EM:MH calc. 3495,0, encontrado 3495,1.

Exemplo 64

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Vai26,Thr28,

Gly29f30,Met31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se três ciclos de acoplamento cada ciclo com Boc-Met (249 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 86- mmole) , e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole) . Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excep-ção de se ter substituído no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no décimo ciclo, Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído no vigissimo primeiro ciclo Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (800 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 200 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 20,8 mg de um ρδ branco, amorfo. O composto mos: trou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãci-da correcta. FAB-EM:MH calc. 3527,1, encontrado 3527,1.

Exemplo 65

Ac-/*p-FrPhe6 ,Lys12 ,Nle17 ,Ala19 ,Val26 ,Thr28,

Gly29'30,Cys(Acm)31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 AS TM,. Bachem) . Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram--se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepção de se ter substituído, no sétimo ciclo, Boc-m-F--Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (.440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no décimo ciclo, Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 -87- mmole) e de se ter substituído, no vigêssimo terceiro ciclo, Boc-Phe por Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (708 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 263 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 48,8 mg de um pô branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma analise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3574,1, encontrado 3573,9.

Exemplo 66

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29/30,Ser31 J-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anterior, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,313 g (0,05 mmole) de resina Boc-Ser(Bzl) do exemplo 3. Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), e Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmole). Efectuaram-se vinte e sete ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído, no vigêssimo ciclo, Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (167 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (511 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 148 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, proporcionou 56,7 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma analise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3511,0, encontrado 3510,3.

Exemplo 67

Ac-/ p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o -88- protocolo anteriormente referido,, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de aco plamento, tal como no exemplo 45, com excepção de se ter substituído, no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr(Bzl) por Βοσ-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no décimo ciclo, Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole)e de seter substituído, no vigêssimo primeiro ciclo, Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no vigêssimo terceiro ciclo, Boc-Phe por Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou--se a resina peptídica (700 mg), tal como no exemplo 5, obtendo -se 230 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 52,5 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3299,8, encontrado 3299,6.

Exemplo 68

Ac-/ Glu8,Orn12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP

Fez-se passar uma porção de 5,5 g (0,6 mmole) de resina Boc-dodecapeptidica, do exemplo 22, através de quatro ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Gln (655 mg, 2,66 mmo-]eá , Boc-Lys(2-C1-Z) (2,01 g, 4,84 mmoJes) , Boc-Arg(Tos) (2,07 g, 4,84 mmoies) , e Boc-Leu (1,21 g, 4,84 mmole$ . Secou-se a resina no vácuo, para se obter 6,12 g de resina Boc-hexadecapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 2,0 g (0,2 mmole) desta resina através de doze ciclos de acoplamento cada um dos ciclos com Boc-Orn(Fmoc) (182 mg, 0,4 mmole), Boc-Thr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmole), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmole), Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmole), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmole), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmole), e Boc--His(Bom) (150 mg, 0,4 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo anteriormente referido e tratou--se com 0,5 ml de anidrido acético e 38,4 ml de DlPEA em 30 ml de cloreto de metileno, durante 90 minutos. Lavou-se a resina seguindo os passos 10-14 e, secou-se no vãcuo para se obter 2,4 g.

Tratou-se, duas vezes, uma porção de 1,2 g (0,1 mmole) desta resina com piperidina/DMF a 20%, durante, respectiva-mente, 1 minuto e 20 minutos e lavou-se seguindo os passos 10--14. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, para se obter 420 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 63,1 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo por CLEP e proporcionou uma analise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3295,8, encontrado 3295,6.

Exemplo 69 - rr 12 17 25 T 26 T 27,28 29,30 _ 31 7 TTT„

Ac-/ Lys ,Nle ,Ala ,Leu ,Lys ' ,Gly ,Thr y.-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmole), Boc--Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efec- tuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepção de se ter substituído no primeiro e tercei ro ciclos Boc-Leu por Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmole). No terceiro ciclo substituiu-se Boc-Val por Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmole), e Boc-Ser(Bzl), no quarto ciclo, por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole) e, de se ter substituído no sétimo ciclo Boc-m-F-Tyr (Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (700 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 140 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 31,0 mg, de um põ branco, amorfo. O com posto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma analise aminoácida corxecta. FAB-EM:MH calc. 3551,1, encontrado 3550,8.

Exemplo 70

Ac-/* Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Ala29·31 ./-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o protocolo anterior, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,251 g (0,05 mmole) de resina Boc-Ala do exemplo 1. Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole) , Boc-Ala (95 mg,0,5 mmole), e Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmole). Efectuaram-se vinte e sete ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído, no viges simo ciclo, Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (167 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (399 mg), tal como no exemplo 5, o que proporcionou 63,1 mg, de piptido impuro. A purificação por CLEP tal como no exemplo 5, proporcionou 19,0 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e pro- -91- porcionou uma 'analise aminoãcida correcta, FAB-EM:MH calc. 3523,0, encontrado 3522,5.

Exemplo 71

Ac-/’ Lys12,Ala17'19,Val26,Thr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, .utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepção de se ter substituído, no sétimo ciclo Boc-m-F-Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6--DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no décimo ciclo Boc-Val e no décimo segundo ciclo Βοσ-Nle por Boc-Ala (189 mg, 1,0. mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, o que proporcionou 200 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 52,4 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo por CLEP e proporcionou uma analise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3225,7, encontrado 3226,0.

Exemplo 72

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28.,Gly29,Lys30 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se dois ciclos de acoplamento, cada um deles com Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmole), e Boc--Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepçao de se ter subs tituído no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no vigessimo primeiro ciclo Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (870 mg), tal como no exemplo 5, o que proporcionou 206 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 65,7 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo por CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3495,0, encontrado 3494,6.

Exemplo 73

Ac-/p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Vai26,Thr28,

Gly29'30 ,Cys (Acm) 31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, tuna porção de 0,25 g (0,05 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Advanced ChemTech). Efectuaram-se quatro ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Cys(Acm) (146 mg, 0,5 mmole), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole) e Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmole). Efectuaram-se vinte e sete ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, com excep-ção de se ter substituído, no décimo oitavo ciclo, Boc-Tyr(2,6--DCB) por Boc-p-NH(Z)-Phe (207 mg, 0,05 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, o que proporcionou ν' -93-294 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 20,1 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM:MH calc. 3583,1, encontrado 3582,8.

Exemplo 7 4 ,Thr28,Gly29'30 f _ 8 _ 12 ... 17 . 26

Ac-/ Glu ,Lys ,Nle ,Val

Cys (Acm) 31 _/-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g, (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmole), Boc--Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepção de se ter substituído, no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído, no vigêssimo primeiro ciclo, Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina pe£ tídica, tal como no exemplo 5, obtendo-se 450 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 108 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM:MH calc. 3598,2, encontrado 3598,0.

Exemplo 75

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,lfet31 J-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o protocolo anterior, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,269g (0,05 mmole).de resina Boc-Met do exemplo 4. Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada um deles com Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmo le), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), e Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmo le). Efectuaram-se vinte e sete ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, excepto o facto de se ter substituído, no vigêssi mo ciclo, Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu(Bzl) (167 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (906 mg), tal como no exemplo 5, o que proporcionou 128 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 24,2 mg de um pó branco, amorfo. Tratou-se uma porção de 21,2 mg deste material com 0,9 ml deβ-mercaptoetanol em 2,1 ml de I^O, a 37°C, durante 48 horas. Voltou então a purificar-se este material por CLEP tal como no exemplo 5, o que proporcionou 13,1 mg de um pô branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3550,1, encontrado 3550,0.

Exemplo 76 CH3S(CH2)2CO-/ Lys12,Nle17,Val26,Thr28 /-VIP(2-28)

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetiza-dor de peptidos, modelo 430A, da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de 0,85 g (0,4 mmole) de resina Boc-Thr (Bzl) -BHA, do exemplo 35. Efectuaram-se vinte e seis ciclos de acopla- -95.- mento, cada ciclo com Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoles!, Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mrnoleá , Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmole^ , Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoles), Boc-Tyr (2,6-DBC) (880 mg, 2,0 mmole^ , Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoles), Boc--Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmoles), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoleá , Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmolss) , Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmoles) , Boc--Gln (492 mg,' 2,0 mmoleé , Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmole^ , Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmoles) , Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmoles), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmole$ ,Boc-Tyr (2,6-DBC) (880 mg, 2,0 mmmoks) , Boc-Asn (232 mg, 2,0 mmoles! , Boc-Asp(OcHx) (631 mg, 2,0 mmoles), Boc-Thr (Bzl) (618 mg, 2,0 mmole^, Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmolss) , Boc-Val (435 mg, 2,0 mmoifes) , Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmoks) , Boc-Asp (OcHx) (631 mg, 2,0 mmoles), e Boc-Ser(Bzl) (591 mg, 2,0 mmoleá , para se obterem 2,8 g de resina Boc-heptacosapeptídica.

Fez-se passar, através dos passos 1-8 do protocolo, uma porção de 0,7 g (0,1 mmole) desta resina, e tratou-se com 128 mg (1,06 mmole) de ácido 3-(metiltio)-propiõnico e 110 mg (0,53 mmole) de diciclo-hexilcarbodi-imida em 20 ml de cloreto de metileno, durante 2 horas. Lavou-se a resina utilizando os passos 10-14 e secou-se no vácuo. Desblogueou-se a resina pep-tídica (588 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 245 mg de peptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 28,8 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou -se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoácida cor-recta. FAB-EM:MH calc. 3218,8, encontrado 3218,5.

Exemplo 77 CH3SO(CH2)2CO-/'Lys12,Nle17,Val26,Thr28 .7-νΐΡ(2-28)

Dissolveram-se 20,0 mg (6,2 mmole) de CH3S(CH2)2C0--/Lysl2,Nle17,Vai26,Thr28 7-VIP(2-28), do exemplo 76, em 2,0 ml de AcOH a 1%. Adicionaram-se 764 ^il de uma solução com uma diluição (H20) de 1:100 de H202 a 30%. Agitou-se esta solução â temperatura ambiente durante 5 horas e depois liofilizou-se. Purificou-se o péptido por CLEP, tal como no exemplo 5, para se obter 14,6 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou--se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM:MH calculado 3234,8, encontrado 3234,6.

Exemplo 78

Ac-f N-CH3-Ala1,Lys12 ,Nle17 ,Val26 -, Thr28 /-VIP

Fez-se passar uma porção de 2,0 g (0,16 mmole) de resina Boc-hexacosapeptídica do exemplo 32, através de dois ciclos de acoplamento, cada um dos ciclos com Boc-Ser(Bzl) (378 mg, 1,28 mmole), e Boc-N-CH3-Ala (260 mg, 1,28 mmole). Fez-se passar metade desta resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético e 15 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 3,5 horas. Lavou-se a resina, utilizando os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo, proporcionando, 0,8 g.

Tratou-se a resina peptídica com HF, tal como no exem pio 11, para se obter, após liofilização, 484 mg de um composto sólido, branco. Purificou-se, por CLEP de preparação este pêp-tido impuro, tal como no exemplo 5. Cortaram-se os picos prih- -97- cipais por CLEP analítica das fracções recolhidas, agregaram--se e liofilizaram-se para proporcionar 22,5 mg de um põ branco, amorfo. Este composto mostrou-se homogéneo na CLEP e propor cionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM: calculados3243,8, encontrados 3243,1.

Exemplo 79 -

Resina Boc-Cys(Acm)-BHA

Trataram-se 5,0 g (3,5 mequiv.) de resina de benzidri lamina (malha 100-200, ASTM, Omni) tal como no exemplo 1, com excepção de se ter ligado a resina com Boc-Cys(Acm) (1,46 g, . 5,0 mmolsá e diciclo-hexilcarbodi-imida (516 mg, 2,5 mrnoles) . Secou-se a resina no vácuo, para se obter 5,8 g de resina Boc--Cys(Acm)-BHA. A análise aminoãcida indicou uma carga de 0,19 mmole de Cys/g.

Exemplo 80

Ac-/· Leu5,Orn12,Ala17'19,Thr25,Val26,Thr28,

Gly29'30,Cys (Acm) 31 y-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o protocolo anterior, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,263 g (0,05 mmole) de resina Boc-Cys(acm)-BHA, do exemplo 79. Efectua-ram-se três ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), e Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmole). Efectuaram-se vinte e sete ciclos de acopla mento, tal como no exemplo 5, com excepção de se ter substituído no terceiro ciclo, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Thr(Bzl)(154 mg, 0,5 mmole), de se ter substituído no nono ciclo Boc-Val por Boc-Nle f -98-e no décimo primeiro ciclo por Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole), ter--se substituído Boc-Lys(2-C1-Z), no décimo sexto ciclo por Boc--Orn(Z) (183 mg, 0,5 mmole) e com excepção de se ter substituído no vigissimo terceiro ciclo Boc-Val por Boc-Leu (124 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (489 mg), tal como no exemplo 5, o que proporcionou 126 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 6,7 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3528,0, encontrado 3527,4.

Exemplo 81

Ac-/ p-F-Phe6,2-Nal10,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,

Gly ,Met y-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se três ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Met (249 mg, '1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram-se vinte e oito ciclos de acoplamento, -tal como no exemplo 45, com excepção de se ter substituído, no sétimo ciclo, Boc-m-F-Tyr (Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter subjs tituído, no décimo nono ciclo, Boc-Tyr(2,6-DBC) por Boc-2-Nal (157 mg, 0,5 mmole) e de se ter substituído, no vigêssimo terceiro ciclo, Boc-Phe por Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (756 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 280 mg de péptido impuro. A purificação por CLEP tal como no exemplo 5f proporcionou 32,2 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma analise aminoacida correcta. FAB-EM:MH calc. 3593,1, encontrado 3593,1.

Exemplo 82

Ac-/ p-F-Phe6,Glu8,Lys12 714,Nle17,Ala19,Vai26, Thr28,Gly29,30,Cys(Acm)31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se tris ciclos de acoplamento, cada ciclo com Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole), e Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmole). Efectuaram -se vinte e oito ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45, com excepção de se ter substituído, no sétimo ciclo, Boc-m-F--Tyr(Bzl) por Boc-Tyr(2,6-DBC) (440 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído no décimo ciclo Boc-Val por Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído no décimo quinto ciclo Boc-Arg (Tos) por Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmole) e de se ter subi» tituído no vigessimo primeiro ciclo Boc-Asp(OcHx) por Boc-Glu (Bzl) (337 mg, 1,0 mmole) e de se ter substituído no vigessimo terceiro ciclo Boc-Phe por Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmole). Desbloqueou-se a resina peptídica (800 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando 100 mg de pêptido impuro. A purificação por CLEP, tal como no exemplo 5, proporcionou 33,1 mg de um põ bran co, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcio /100- nou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM;MH calc. 3560,1, encontrado 3559,8.

Exemplo 83 . rr 12 ... 17 _. 19 „ .26 28 ... 29-31 , „ΤΏ

Ac-/ Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Ala y-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, nunu sintetizador de péptidos, modelo 430A, da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de 1,1 g (0,3 ramole) de resina de benzi-drilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e um ciclos de acoplamento individuais, para se obter 1,8 g de resina Boc-heneicosapeptídica.

Submeteu-se uma porção de 1,2 g (0,2 mmole) desta resina a quatro ciclos de acoplamento individuais, tal como antes, para se obter 1,3 g de resina Boc-pentacosapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 0,65 g (0,1 mmole) desta resina por seis ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, cada um dos ciclos com Boc-Phe (530 mg, 2,0 iranodes) , Boc-Val (652 mg, 3,0 mmole^ , Boc-Ala (568 mg, 3,0 mmole^ , Boc-Asp(OcHx) (946 mg, 3,0 mmoles) , Boc-Ser(Bzl) (886 mg, 3,0 mmo3eá , e Boc--His(Tos) (1,23 g, 3,0 mmoiles) . Fez-se passar a resina peptídi-ca através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 1,0 ml de anidrido acético e 30 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 25 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo.

Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, obtendo-se 180 mg de pêptido impuro. Purificou-se o pê|> tido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve-se 46,9 mg de um pó branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, / -101- ---.. . Λβ» proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM:MH calc.' 3481/0, encontrado 3480,8.

Exemplo 84 - Γτ 12 ... 17 _. 19 .. .26 _. 28 29 _ 30 -

Ac-/ Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ,Lys y-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetizador de piptidos modelo 430A, da Applied Biosystems, tal como no exem pio 11, uma porção de 0,7 g (0,31. mmole) de resina de benzidri-lamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e quatro ciclos de acoplamento individuais, para se obter 1,8 g de resina Boc-tetracosapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 0,6 g (0,1 mmole) desta resina por seis ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, cada ciclo com Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmole), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmole), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmole), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmole), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmole), e Boc-His(Tos) (328, 0,8 mmole). Fez-se passar a resina peptídica através dos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético e 20 ml de DIPEA/cloreto de metileno, a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou--se no vácuo.

Desbloqueou-se a resina peptídica (0,61 g), tal como no exemplo 5, o que proporcionou 180 mg de piptido impuro. Puri ficou-se o péptido por CLEP tal como no exemplo 5 e obteve-se 43,6 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM: :MH calc. 3453,0, encontrado 3452,8. -102- /

Exemplo 85

Ac-/* N-Me-Ala1,Lys12/Nle17fAla19fVal26fThr28 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, num sintetizador de peptidos modelo 430A, Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, uma porção de 0,375 g (0,3 mmole) de resina de benzidrila-mina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se vinte e seis ciclos de acoplamento individuais, para proporcionar 1,8 g de resina Boc-hexacosapeptídica.

Fez-se passar uma porção de 0,6 g (0,1 mmole) desta resina por dois ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 5, cada ciclo com Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmole) e Boc-N-Me-Ala (81 g, 0,4 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com BOP (442 mg, 1,0 mmole) áci do acético (55 jul, 1,0 mmole) e DIPEA (523 ^il, 3,0 mmoleá em 20 ml de DMF, durante 6 horas e depois com 1,0> ml de anidrido acético em 20 ml de DlPEA/cloreto de metileno, a 6%, durante 30 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo, obtendo-se 0,54 g.

Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, o que proporcionou 220 mg de pêptido impuro. Purificou-se o piptido por CLEP, tal como no exemplo 5 o que proporcionou 27,0 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3215,7, encontrado 3215,6. » » m / . . . -103-

Exemplo 86

Ac-/*Lys12,Nle17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27'28 J-VIP

Tratou-se uma porção de 10,0 g de resina de p-metil--benzildrilamina (malha 200-400, ASTM,Biomega) com Dic (6,72 ml, 43 mmoleá , HOBT (4,0 g, 29 mmoleá e com ácido p-/" R,S-flf-1- (9H--fluoreno-9-9-il) -metoxiformamido-2,4-dimetoxibenzil J-fenoxi--acético (10,36 g, 19,2 mmoles, NovaBiochem) . Lavou-se a resina com cloreto de metileno, metanol e cloreto de metileno e secou--se no vácuo para se obter 15,1 g de resina Fmoc-Tm-MBHA.

Submeteu-se a síntese em fase sólida, uma porção de 0,34 g (0,22 mmole) desta resina ..Foifrc-Tm-MBHA, num sintetiza-dor de piptidos, modelo 431A, Applied Biosystems, tal como no exemplo 11, exceptuando o facto de se terem utilizado os protocolos químicos Fmoc /”* see Barany e outros,The Peptides, Analy-sis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. e Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980) J. Efectuaram-se vinte ciclos de acoplamento individuais, para se obter 1,06 g de resina Fmoc--eicosapeptídica.

Submeteu-se uma porção de 0,53 g (0,11 mmole) desta resina a oito ciclos de acoplamento individuais, tal como referido antes, para se obterem'0,58 g de uma resina octacosapeptídi ca. Tratou-se a resina peptídica com 0,5 ml de anidrido acético em 20 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 60 minutos e secou-se no vácuo para se obterem 489 mg.

Tratou-se esta resina peptídica com 5 ml de TFA, contendo 50 jil de 1,2-etanoditiol, 50 ^al de dimetilssulfureto e 150 ul de anisol, durante 2 horas, â temperatura ambiente. Filtrou- -.104 -se a resina e lavou-se com 2 x 1 ml de TFA. Verteram-se os fil trados combinados em 200 ml de ET2O e, arrefeceram-se até -20°C, durante 4 horas. Filtrou-se o precipitado, lavou-se com 2x 20 ml de Et20, extraíu-se com 2 x 20 ml de AcOH a 10% e liofilizou-se. Purificou-se o péptido por CLEP tal como no exemplo 5, para se obterem 35,7 mg de um pó branco, amorfo. O composto demonstrou ser homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoãcida cor recta. FAB-EM:MH calculada 3307,9, encontrado 3308,1.

Exemplo 87

Ac-/ leu5,p-F-Phe6,Glu8,Orn12,Ala17'19,Thr25, Val26,Thr28,Gly29'30,Cys(Acm)31 J7-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o pro tocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se trinta e um ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45. Desbloqueou-se a resina peptídica (936 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 300 mg de péptido impuro. Purificou-se o péptido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve--se 37,2 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3560,0, encontrado 3560,2.

Exemplo 88

Ac-/p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,

Gly2 9'30,Thr31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o pro -105- tocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 iranole) de resina de benzidrilamina (malha 100--200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se trinta e um ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45. Desbloqueou-se a resina peptí-dica (940 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 320 mg de pép tido impuro. Purificou-se o pêptido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve-se 70,8 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoã-cida correcta. FAB-EM; MH calc. 3543,0, encontrado 3543,1'·.

Exemplo 89

Ac-/ Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Vai26,Thr28,

Gly2 9'30, Thr31 J-VTB

Submeteu-se a síntese em fase solida, utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se trinta e um ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45. Desbloqueou-se a resina peptídica (1,0 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando 335 mg de pêptido impuro. Purificou-se o péptido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve-se 83,0 mg de um põ branco, amorfo. O com posto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoâcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3497,1, encontrado 3496,7. ,* -106

Exemplo 90

Ac-/* Glu8,Lys12,Nle17/Ala25,Leu28,Lys27'28 Gly2 9'3 0,Thr31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida,utilizando o protocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se trinta e um ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45. Desblogueou-se a resina peptídica (1,0 g), tal como no exemplo 5, obtendo-se 313 mg de pêptido impuro. Purificou-se o peptido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve-se 66,4 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3565,1, encontrado 3564,6.

Exemplo 91

Ac-/*p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala25,Leu26,

Lys27,28,Gly29/30,Thr31 J-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, utilizando o pro tocolo anteriormente referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se trinta e um ciclos de acoplamento, tal como no exemplo 45. Desbloqueou-se a resina peptídica (940 mg), tal como no exemplo 5, obtendo-se 324 mg de peptido impuro. Purificou-se o peptido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve-se 65,6 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3583,1, encontrado 3583,2.

Exemplo 92

Ac-/ 2-Nal10,Lys12,Nle17,Ala19,Vai26,Thr28,

Gly29/30,Met31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida,· utilizando o protocolo anteriormenre referido, tal como no exemplo 5, uma porção de 0,4 g (0,1 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 100-200 ASTM, Bachem). Efectuaram-se trinta e um ciclos de acopla mento, tal como no exemplo 45. Desbloqueou-se a resina peptídica (960 mg), tal como no exemplo 5, proporcionando 390 mg de pipti-do impuro. Purificou-se o peptido por CLEP, tal como no exemplo 5 o que proporcionou 45,1 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoã-cida correcta. FAB-EM:MH calc. 3547,1, encontrado 3546,9.

Exemplo 93

Ac-/Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19 ,Val26,Thr28,

Ala29"31 7-VIP.

Submeteu-se a síntese em fase sólida, num sintetizador de pêptidos, modelo 431A, da Applied Biosystems, uma porção de 0,3 g (0,2 mmole) de resina de benzidrilamina, tal como no exemplo 11, exceptuando o facto de se terem utilizado os protocolos químicos FmocCver exemplo 86). Acoplou-se a resina, no primeiro ciclo, com ácido p-/R,S-ô(-l-(9H-fluoreno-9-il)-metoxiformamido--2,4-dimetoxibenzil /-fenoxiacetico (NovaBiochem), seguindo-se--lhe vinte e nove ciclos de acoplamento individuais, para se produzirem 1,73 g de resina Boc-nonacosapeptídica. -108- •w t J y

Cf

Submeteu-se uma porção de 0,8 g (0,1 mmole) desta resina a dois ciclos de acoplamento individuais, tal como se referiu antes, para se produzirem 0,9 g de resina hentriacontape£ tídica. Tratou-se a resina peptídica com 0,5 ml de anidrido acé tico em 20 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 60 minutos e secou-se no vácuo para se obterem 0,75 g. Desbloqueou--se a resina peptídica, tal como no exemplo 86, obtendo-se 280 mg de pêptido impuro. Purificou-se o pêptido por CLEP, tal como no exemplo 5 o que proporcionou 12,4 mg de um põ branco, amorfo. 0 composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou tuna análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH cãlc. 3479,), encontrado 3478,7·.

Exemplo 94

Ac-/* Ala2,Lys12,Nle17,Ala25,Leu26,Lys27'28,

Gly2 9'3 0,Thr31 /-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida, uma porção de 666 mg (0,3 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 200-400 ASTM, Biomega), utilizando o protocolo anterior, tal como no exemplo 15.

Efectuaram-se vinte e um ciclos de acoplamento cada um deles com Boc-Thr(Bzl)(371 mg, 1,2 mmole), Boc-Gly (210 mg, 1,2 mmole), Boc-Gly (210 mg, 1,2 mmole), Boc-Lys(2-Cl-Z) (498 mg, 1,2 mmole), Boc-Lys(2-Cl-Z), (498 mg, 1,2 mmole), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmole), Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmole), Boc-Asn (307 mg, 1,32 mmole), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmole), Boc-Tyr(2,6-DBC) (528 mg, 1,2 mmole), Boc-Lys (-2-Cl-Z) (498 mg, 1,2 mmole), Boc--Lys(2-Cl-Z) (498 mg, 1,2 mmole), Boc-Val (261 mg, 1,2 mmole), / -109 Βοσ-Ala (227 mg, 1,2 mmole) , Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmole) , Boc--Gln (325 mg, 1,32 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg, 1,2 mmole), Boc-Arg(Tos) (514 mg, '1,2 mmole), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmole), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg, 1,2 mmole), e Boc-Thr(Bzl) (371 mg, 1,2 mmole),. para se produzirem '1,8 g de resina Boc-heneicosapeptídi-ca.

Acoplou-se uma porção de 1,2 g (0,2 mmole) desta resi na com oito ciclos, cada ura dos ciclos com Boc-Tyr(2,6-DBC) (352 mg, 0,8 mmole), Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmole) , Boc-Asp(OcHx) (255 mg, 0,8 mmole), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmole), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmole) , Boc-Val (174 mg, 0,8 mmole)', Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmole), e Boc-Asp(OcHx) (255 mg, 0,8 mmole), para se produzirem 1,5 g de resina Boc-nonacosapeptldica.

Acoplou-se uma porção de 0,75 g (0,1 mmole) desta resina em dois ciclos, cada um dos ciclos com Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmole), e Boc-His(Tos) (102 mg, 0,4 mmole). Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético e 15 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 60 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10--14 do protocolo e secou-se no vácuo, produzindo 0,78 g. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, obtendo-se 240 mg de pêptido impuro. Purificou-se o pêptido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve-se 31,0 mg de um põ branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e proporcionou uma análise aminoãcida correcta. FAB-EM:MH calc. 3535,1, encontrado 3534,6.

Exemplo 95 - ,-01 8 T 12 17 _Ί 19 _Ί 25 . 26

Ac-/ Glu ,Lys ,Nle fAla ,Ala ,Leu , _ 27,28 29-31 - T7TT(

Lys ' ,Ala J7-VIP

Submeteu-se a síntese em fase solida, uma porção de 0,88 g (0,4 mmole) de resina de benzidrilamina (malha 200-400 ASTM, Biomega.' ), num sintetizador de pêptidos, modelo 430A, da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11. Efectuaram-se qua-renta ciclos de acoplamento individuais para se produzirem l,88g de resina Boc-tetradecapeptídica.

Submeteu-se uma porção de 1,41 g (0,3 mmole) desta resina a nove ciclos individuais, tal como anteriormente referido, para se produzirem 1,71 g de resina Boc-tricosapeptídica.

Submeteu-se uma porção de 0,57 g (0,1 mmole) desta resina a oito ciclos individuais, tal como anteriormente referido, para se obter resina Boc-hentriacontapeptídica. Fez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético e 20 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6%, durante 60 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou-se no vácuo, produzindo-se 0,62 g. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, obtendo-se 222 mg de péptido impuro. Purificou-se o pêptido por CLEP, tal como no exemplo 5 e obteve-se 20,0 mg de um põ branco,amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EM:MH calc. 3535,1, encontrado 3534,4.

Exemplo 96

Ac/* Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27'28,

Ala29"31_7-VIP

Submeteu-se a síntese em fase sólida uma porção de ' 0,56 g (0,1 mmole) da resina Boc-tricosapeptídica do exemplo 95, num sintetizador de péptidos, modelo 430A, da Applied Biosystems, tal como no exemplo 11. Efectuaram-se oito ciclos de acoplamento individuais para se produzirem 0,59 g de resina Boc-hentria-contapeptídica. Eez-se passar a resina peptídica pelos passos 1-8 do protocolo e tratou-se com 0,5 ml de anidrido acético e 20 ml de DIPEA/cloreto de metileno a 6% durante 60 minutos. Lavou-se a resina, segundo os passos 10-14 do protocolo e secou--se no vácuo, produzindo 0,58 g. Desbloqueou-se a resina peptídica, tal como no exemplo 5, obtendo-se 233 mg de péptido impuro. Purificou-se o péptido por CLEP tal como no exemplo 5 e obte ve-se 42,1 mg de um pó branco, amorfo. O composto mostrou-se homogéneo na CLEP e, proporcionou uma análise aminoácida correcta. FAB-EMíMH calc. 3521,1, encontrado 3521,1.

Exemplo 97

Actividade Relaxante dos Análogos de VIP sobre a Traqueia

Estudou-se a actividade relaxante dos análogos de VIP num modelo, em que se utilizaram traqueias de cobaias £ Wasser-man, M.A. e outros in. Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, ed., Raven Press, N.Y. 1982, pp 177-184.7. Todos os tecidos foram recolhidos a partir de um porco da índia macho, albino com -112- o peso compreendido entre 400 e 600 gramas, anestesiado com ure tano (2g/kg,i.p.). Apôs retirar o sangue, removeu-se a traqueia e dividiu-se em quatro segmentos com a forma de anel (3 mm de espessura). Suspendeu-se cada um dos aneis por fios de aço inoxidável, de calibre 30, em 1& ml de um banho de tecidos num dispositivo revestido com uma camisa e ligaram-se por fios de seda 4-0 a um transdutor de deslocamento de força de Grass (modelo FT03C, Grass Instruments Co, Quincy, Ma) para registo isométri-co da tensão. Banhou-se o músculo liso numa solução de Krebs mo difiçada, com a seguinte composição: NaCl 120 mM; KC1 4,7- mM; CaC^, 2,5 mM, MgSO^. 7^0, 1,2 mM; NaHCO^, 25 mM? I^HPO^ mono-básico, 1,2 mM; e dextrose 10 mM. Mantiveram-se os banhos de tecido a 37°C e borbulhou-se constantemente com 95% de C>2 e 5% de C02· Registaram-se as respostas no canal 8 e no canal 4 de um registador Hewlett-Packard (modelos, respectivamente 7702B e 7754A) (Hewlett-Packard, Paramus, NJ). Colocaram-se os aneis da traqueia sob uma tensão de relaxamento de 1,5 g, que se determinou ser óptima ou estar próxima da optimização, nos ensaios preliminares. Foi necessário efectuar-se frequentes ajustamentos de tensão durante o período de estabilização, de 60 minutos, que se seguiu. Lavaram-se os tecidos com intervalos de 15 minutos.

Obteve-se, para cada tecido, a curva de resposta de concentração cumulativa, por sucessivos acréscimos de alguns P1' na concentração do banho, de VIP ou de análogos de VIP, de acordo com o método de VanRossum /*Arch. Int. Pharmacodyn., 143, 299--330 (1963) J. Obteve-se apenas uma curva de resposta ã dose cumulativa, num único tecido. Para se minimizar a variabilidade entre os tecidos, as respostas relaxantes expressaram-se como uma percentagem de resposta máxima obtida para VIP (10 M=100%) -113 que se adicionou no fim de cada ensaio de resposta à concentração. Reuniram-se as respostas obtidas a partir, de pelo menos três tecidos e determinaram-se os valores de EC,-0 por regressão linear.

Os resultados que se encontram reunidos no quadro 1 demonstram a actividade relaxante dos análogos de VIP em compara ção com VIP nativo. Os resultados que se encontram resumidos no quadro 1 demonstram que os análogos de VIP possuem potenciais, iguais ou superiores aos de VIP. /Φ— 1 ϊ'4—

QUADRO I

Actividade Relaxante de análogos de VIF sobre o músculo liso da traqueia de um porco da índia

Composto

EC 50 (nM) 10.0 7-2 2,2 V 1.2 I 0.45 0,36 0,25 0.3 / 0.58 2.8 V 0,68 0.32 I 0.55 t 0.27 I 0,33 0,24 / 0j23 0,44 0.1 ; 0.^24

VIP 1 12 17 26 28

Ac-[N-Me-Ala ,lys ,Nle ,Val ,Thr J—VIP

Ac-[ Leu5, Orn12, AI a17 ’19, Thr25, Vai26, Thr28, G1 y29 ’30, Cys (Aon)31 ]-VIP Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17JAla19,Val26,Thr28tGly29’30,Cys(Acm)31]-VIP Ac-[p-F-Phe6,p-NH -Phe^0,Lys^2,Nle^7,Val26,Thr28]-VIP

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29,30,Cys(Acm)31]-VIP 10 12 17 26 28

Ac-fp-NH^-Phe ,Lys ,Nle ,Val ,Thr ]-VIP

Ac-CGlu8,Lys12,Nle17,Val25fThr28,Gly29,30,Het31]-VIP

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28>Ala29'31]-VIP „ 12 17 19 26 28 29 ' 30

Ac-[Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ,Lys J—VIP

Ac-CN-Me-Ala^Lys^.Nle^.Ala^.Val^.Thr^J-VIP

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Ala25>l.eu26,Lys27’28]-VIP

Ac-[Leu5>p-F-Phe6>Glu8,0rn12,Ala17,19)Thr25,Val26,Thr28,Gly29,30> 31

Cys(Acm) ]-VIP

Ac-Cp-F-Phe6, G1 u8, Lys12, N1 e17, Vai26, Thr28, Gly29 ’30, Thr31 ]-VIP . γλ, 3 . 12 U 19 „ .26 28 29,30 31. „T„

Ac-CGlu ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ,Thr 3—VIP

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala25,Leu26,Lys27'28,Gly29’3°,Thr31]-VIP

Ac-Cp-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala25,Leu26,Lys27,28,Gly29,3°,Thr31]-VIP

Ac-[2-Nal10,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28,Gly29,3°,Het31]-VIP

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle,7,Ala19>Val26,Thr28,Ala29"31]-VIP

Ac-CAla2,LyS12,Nle,7,Ala25,Leu26,Lys27'28,Gly29'3°,Thr31]-VIP

Ac-CGlu8,Lys12,Nle17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27,28,Ala29"31]-VIP

Ac-[Lys12,Nle,,,Ala,9,Ala25,Leu26,Lys27'28,Ala29-31]-VIP

Exemplo 98

Actividade Broncodilatadora dos Análogos de VIP

Estabeleceu-se a actividade broncodilatadora de análogos de VIP em porcos da índia, por administração da instilação via traqueia. Nesta técnica utilizaram-se porcos da índia machos (estirpe Hartley, Charles River) com um peso compreendido entre 400 e 600 gramas. Anestesiaram-se os animais com uretano (2g/kg), intraperitonealmente, e inseriu-se uma cânula de po-lietileno na veia jugular, para administração intravenosa do fãrmaco.

Efectuou-se a traqueotomia dos animais e, administraram-se para o interior da traqueia, soluções de dosagem de água destilada ou do composto de ensaio dissolvido em água destilada, a aproximadamente tris quartos de distância da quilha, com uma pipeta. Ajustou-se a concentração da solução de dosagem de modo a fornecer iam volume constante de 100 ^il. Colocaram-se os animais em supinação, durante 1 minuto para auxiliar a libertação do fãrmaco nos pulmões. Ura minuto mais tarde, parou-se a respiração espontânea com cloreto de succinilcolina (1,2 mg/kg), que se administrou por via intravenosa e ventilaram-se os animais com um pequeno conjunto de respiração animal, modelo 680, Har-vard, a 40 movimentos respiratorios/minuto e 4,0 cm de. volume de reserva. Estimularam-se os animais com uma dose constritora máxima de histamina (50 pg/kg, i.v.) e registou-se a pressão na traqueia (em cm de água) num transdutor de pressão Statham (P 32 AA).

Determinou-se a média das alterações da pressão na tra -116- queia, para pelo menos, 3 controlos e 3 animais tratados com o fãrmaco e, calculou-se a inibição percentual. Determinou-se a potência relativa dos compostos administrados por instilação, administrando diversas doses do composto de ensaio e calculou--se a dose inibidora média (valor) IDj-q . Determinou-se IDçjq a partir de 10 g das curvas de reacção ã dose originadas por, pelo· menos, 3 doses que originaram efeitos inibidores entre 10% e 90%. 0 coeficiente de correlação para a linha de regressão de cada antagonista, foi sempre superior a 0,95.

Para a determinação de cada intervalo de tempo de inibição, de diversos compostos, variou-se o período de tempo entre a administração do composto e a estimulação com histamina. Calculou-se o intervalo de tempo de actividade, como o tempo em que a inibição decrescia para 40%.

Os resultados que se encontram resumidos no quadro II mostram a actividade broncodilatadora, in vitro, dos análogos de VIP quando comparada com a de. VIP nativo. Estes resultados demons tram que os análogos de VIP possuem actividade igual ou superior â de VIP. -117- {

QUADRO II

Actividade Broncodilatadora dos análogos de VIP em porcos da Índia

Composto ED5Q(pg) 8.5 7.3 3T0 2.0 / 2,0 V 0,30 0,28 0,17 0f82 0,58 lr5 0,014 0,09 -V 0.064

0,043 0,12 0,35 0.47 I 0,05 0,03 0,046

Claims

REIVINDICAÇÕES 1·- Processo para a preparação de compostos de fórmula geral

19~R20_R21 X-R1-R2^R3-Ala-R5-R5-R7-R8-R9-

J. na qual R1 representa os radicais His, Ala, N-CH3-Ala,D-Ala,Gly, piro-Glu, B-Ala ou é eliminado, R2 representa os radicais Ser ou Ala, representa os radicais Asp ou Ala, R^ representa os radicais Vai, Leu ou Ala, Rg representa os radicais Trp, Ala ou * V C -119- /V

em que Q representa os radicais Xi CR, -CH· (CH2)a-HCX .¾

n representa 1 ou 2; Xj e X2 representam, cada um, inde-pendentemente, um átomo de hidrogénio, flúor, cloro ou

NHCOCR^, NHCOCgHjj ou C(CHg)g > e Xg representa um átomo de hidrogénio ou de flúor, Ry representa um radical Thr ou Ala Rg representa um radical Asp, Glu ou Ala Rg representa um radical Asn ou Ala R10 representa um radical Tyr ou Rg R^2 representa um radical Thr ou Ala R12 representa um radical Arg, Lys, Orn ou Ala Rl3 representa um radical Leu ou Ala R^ representa um radical Arg, Lys ou Ala R^g representa um radical Lys ou Ala R^g representa um radical Gin ou Ala -120- R^y representa um radical Met, Nle ou Ala representa um radical Vai ou Ala R2q representa um radical Lys ou Ala ^21 rePresenta 13111 radical Lys ou Ala R22 representa um radical Tyr ou Rg Rgg representa um radical Leu ou Ala R24 representa um radical Asn ou Ala Rgg representa toa radical Ser, Thr ou Ala R2g representa um radical Ile, Vai, Leu ou Ala R27 representa um radical Leu, Lys ou Ala Rgg representa um radical Asn, Thr, Lys ou Ala X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo

em que X^ representa um grupo alquilo C^-Cg ou halogeno-alquilo Cj-Cg, CHgS02-, CHgNHCO-, CHgOCO-, GH3S(0)n (CHg^CO-, na qual n=0-2; Y representa um grupo de fórmula geral -OXg, -NHXg ou R29_R3(TR31"Z; em que Xg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^-Cg? R29 rePresenta um radical Gly ou Ala; RgQ representa um radical Gly, Lys ou Ala; Rg^ representa um radical Gly, Ala, Met, Cys, Cys (Acm), Thr, Ser, Phe ou -NHX^; e Z representa um grupo de fórmula geral -OXtj ou -NHX^; ........... pelo que péptidos intestinais vasoactivos (VIP) de ocorrência natural e um composto de fórmula geral X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Rg-Tyr-Thr-R12-Leu- R^-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-R^-R^- Leu-E28-Y. na qual X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo -CO-alquilo C^-Cg ou -CO-fenilo, Rg representa um radical Ala, Asn R^2 representa um radical Arg, Lys, Orn R^ representa um radical Arg, Lys R£tj representa um radical Ser, Thr R£g representa um grupo Ile, Vai R2g representa um radical Asn, Thr Y representa um radical -OX^, -NHX^ representa um átomo de hidrogénio, um grupo alquilo <c1-c3) são excluídos; e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, ca-racterizado pelo facto de se desproteger e cindir um polipeptido protegido e ligado a uma resina de sequência de aminoácidos corre^ pondente a partir de uma resina por tratamento com um reagente de cisão e desprotecção adequado, eventualmente na presença de adi- -122- tivos adicionais adequados como purificadores de catiões e, se desejado, de se converter em um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de X representar um grupo de fórmula geral 0 na qual representa um grupo alquilo C^-Cg, CHgSC^-, ou CH^S(0)n(CH£)2^0-» e n=l; R^ representar um radical His, Ala, N-CH^-Ala, Gly; R£ representar um radical Ser ou Ala; Rg represen tar um radical Asp ou Ala; Rg representar um radical Vai, Leu ou Ala; Rg representar Phe, p-F-Phe, 1-Nal; Ry representar um radical Thr ou Ala; Rg representar um grupo Asp, Glu ou Ala; Rg representar Asn ou Ala; R^q representar Tyr, p-N^-Phe, 2-Nal, Ala, O-CHg-Tyr; representar um grupo Thr ou Ala; R^ representar um radical Arg, Lys, Orn ou Ala; R^g representar um radical Leu ou Ala; Rj^ representar um radical Arg, Lys ou Ala; R-^ representar um grupo Lys ou Ala; R^g representar um radical Gin ou Ala; R^y representar -um radical Met, Nle ou Ala; R^g representar um radical Vai ou Ala; ^q representar um radical Lys ou Ala; Rg^ representar um radical Lys ou Ala; R22 representar um radical Tyr, Ala ou m-F-Tyr; R22 representar um radical Leu ou Ala; representar um radical Asn ou Ala; R25 representar um radical Ser, Thr ou Ala; Rgg representar um radical Ile, Vai, Leu ou Ala; -123 R-27 representar um radical Leu, Ala ou Lys; R28 representar um radical Asn, Thr, Ala ou Lys e Y representar um radical -OH, -NH^ ou ^29~^30”^31”^ em ^ue ^ representa um grupo OH ou NH2 e R2g representa um radical Gly ou Ala; Rgg representa um radical Gly, Lys ou Ala; e representa um radical Cys (Acm), Met ou Ala. 0
3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de X representar um grupo na qual representa um grupo CH^; R^ representa um radical His, N-CHg-Ala; R2 representar um radical Ser; Rg representar Asp;!^ representar um radical Vai ou Leu;Rg representar um radical Phe, p-F-Phe; Ry representar um radical Thr; Rg representar tim radical Asp ou Glu; Rg representar um radical Asn; Rgg representar um radical Tyr,

um radical Arg, Lys ou Orn; R^g representar um radical Leu; R^ representar um radical Arg ou Lys; R1S representar um radical Lys^^repre sentar um radical Gin; R^y representar um radical Met, Nle ou Ala; R^g representar um radical Vai ou Ala; R2q representar um radical Lys; R2j representar um radical Lys; R22 representar um radical Tyr; R2g representar um radical Leu; R2^ representar um radical Asn; R2g representar um radical Ser ou Thr; R2g representar um radical Ile ou Vai; R2y representar um radical Leu; Rgg representar um radical Asn ou Thr e Y representar um grupo OH, NHg ou R29"R30“ -124- “·*,*íar-3» ?> -R3I-Z, em que R29 representa um radical Gly; R^q representa um radical Gly ou Lysj R^, representa um radical Cys(Acm), Met ou Ala; e Z representa um grupo -OH ou -N^.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de R^q representar um radical Tyr ou p-N^-Phe; R·^ representar um radical Lys ou Om; R^ representar um radical Arg; Rjy representar um radical Nle ou Ala; R25 representar um radical Ser; R20 representar tom radical Vai; R2g representar um radical Thr e Y representar um grupo OH ou N^.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de R·^ representar um radical Lys.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de R·^ representar um radical Nle.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de R^ representar um radical N-CHg-Ala em que o referido composto é Ac-tN-CH^Ala1, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de R^q representar um radical p-N^-Phe em que o compo,s to é Ac-[p-NH2-Phe10, Lys12, Nle17,Vai26, Thr28]-VIP.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de Rg representar um radical p-F-Phe e R^q representar um radical p-NH2~Phe em que o referido composto é Ac-[p-F-Phe6, p-NH2-Phe10, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de Y representar um grupo ^ç^^q-R^-Z em que R2g representa um radical Gly; R^q representa um radical Gly ou Lys; e R^^ representa tom radical Cys(Acm), Met ou Ala; e Z representa 0 grupo -OH ou NH2·
11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o símbolo R^^ representar um radical Cys(Acm) .
12.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de R^2 representar um radical Lys.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de R^y representar o radical Nle.
14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de R^q representar 0 radical Gly.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de Rg representar o radical p-r-Phe e R^g repre- -126- C5* sentar o radical Ala e de o referido composto ser Ac-[p-F-Phe6, Lys12, Nle17, Ala19, Vai26, Thr28, Gly29,30, Cys(Acm)31]-VIP.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-do pelo facto de Rg representar o radical p-F-Phe> Rg representar o radical Glu, e representar o radical Ala e de o referido composto ser Ac[p-F-Phe6, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Vai26, Thr28, Gly29,30, Cys(Acm)31]-VIP.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteri-zado pelo facto de Rg representar o radical Glu e de o referido composto ser Ac[Glu8, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28, Gly29,30, Cys(Acm)31]-VIP.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracteri-zado pelo facto de Rg representar o. radical Leu.
19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteriza-do pelo facto de Rj^ representar o radical Orn.
20. - Processo de acordo com a reivindiação 19, caracteriza-do pelo facto de R^y representar o radical Ala, representar o radical Ala, R25 representar 0 radical Thr e R^q representar 5 12 0 radical Gly e de o referido composto ser Ac[Leu , Orn , Ala17,19, Thr25, Vai26, Thr28, Gly29,30, Cys(Acm)31]-VIP. -127- ί /
21. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado pelo facto de Rg^ representar Met.
22. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteri-zado pelo facto de Rgg representar Gly.
23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri-zado pelo facto de R^g representar Lys e R^y representar Nle.
24. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri-zado pelo facto de Rg representar Glu e o referido composto ser Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28, Gly29'30, Met31]-VIP.
25.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do pelo facto de X representar o grupo (CHg)CO-; Rg representar His ou N-CHg-Ala; Rg representar Ala ou Serj Rg representar Asp; R5 representar Vai ou Leu; Rg representar Phe ou p-F-Phe; Ry representar Thr, Rg representar Asp ou Glu; R^ representar Asn 5 *10 representar Tyr, 2-Nal ou p-NHg-Phe; Rgg representar Thr; Rgg representar Lys ou Orn; Rgg representar Leu; R^ representar Arg; *15 rePresentar Lys; Rgg representar Gin; Rgy representar Nle ou Ala; R^ representar Ala ou Vai; Rgg representar Lys; Rgg representar Lys; Rgg representar Tyr; R2g representar Leu; Rg^ representar Asn; Rgg representar Ala, Thr ou Ser; Rgg representar Leu ou Vai; Rgy representar Lys ou Leu; Rgg representar Lys ou Thr; -128- e Y representar um grupo NH2 ou ^29~'R30"R31"Z 5 R29 rePresentar Ala ou Gly; R^q representar Ala, Gly ou Lys; R^ representar Ala, Met, Thr, Cys(Acm) ou não estar presente; e Z representar o grupo NH„.
26.- Processo de acordo com a reivindicação 25, caracteri-zado pelo facto de R^ representar His.
27.- Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri-zado pelo facto de Rg representar Vai; Rg representar Phe; R^q representar 2-Nal ou Tyr; R^ representar Lys; R17 representar Nle; R25 representar Ala ou Ser; e Y representar ^29^30-¾^25 ^30 representar Ala ou Gly; e R^ representar Ala, Met ou Thr.
28.- Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri-zado pelo facto de 0 composto a ser sintetizado ser seleccionado entre 0 grupo constituído por: Ac-[Lys12.Nle17.Ala19,Val26.Thr28.Ala29*31]-VIP Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Vai26,Thr28,Gly29,Lys30]-VIP Ac-[Lys12,Nle17.Ala19,Ala25,Leu26,Lys27,28]-VIP Ac-[Leu5. p-F-Phe6,Glu8.Orn12.Ala17 *19,The25,Val26.Thr28. 29.30 31 Gly .Cys(Acra) ]~VIP Ac-[p-F-Phe6.Glu8,Lys12.Nle17.Val26.Thr28.Gly29,30,Thr31]-VIP Ac-[Glu8, Lys12,Nle17. Ala19, Val26. Thr28, Gly29'30. Thr3 VviP Ac-[Glu8.Lys12.Nle17.Ala25,Leu26.Lys27'28.Gly29'30,Thr31]-Vl? Ac-íp-F-Phe6.Glu8,Lys12,Nle17.Ala25.Leu26.Lys27*28.Gly29,30. Thr31]-VIP -129-
29.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar um composto preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 28 e, se desejado, uma ou mais outras substâncias terapeuti-camente activas, com um material veicular terapeuticamente inerte e de transformar a msitura obtida numa forma de administração galinica, Lisboa, 29 de Junho de 1990