PT94223B - Metodo para o tratamento de processos patologicos associados ao intestino, catabolicos e defesas enfraquecidas do hospedeiro, utilizando glutamina - Google Patents

Description

MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE PROCESSOS PATOLÓGICOS ASSOCIADOS AO INTESTINO, CATABÓLICOS E DEFESAS ENFRAQUECIDAS DO HOSPEDEIRO, UTILIZANDO GLUTAMINA

MEMÓRIA DESCRIΠVA

Resumo

O invento relaciona-se coro um método para o tratamento de processos patológicos associados ao intestino, catabólicos, incluindo atrofia da. mucosa intestinal e do pancreas e permeabilidade aumentada do intestino, diminuição das defesas do hospedeiro e função imunitária comprometida, e para promover a recuperação da transplantação de medula óssea num animal, que compreende a administração a. um animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz da glutamina ou de um seu análogo.

A referida admínistração parentérica é geralmente feita a uma taxa de 0,2 a 3,0 gramas por quilograma, do peso corporal por dia. de GLN ou de um seu análogo funcional que retenha. as caraterísticas da Gl_N.

Este invento obteve fundos de subvenção para investigação do National Institutes of Health, Trauma Center Grant No.

61129327-05, e do United States Department of the Army, Contract·

No. DAMD-17-81-C-1201, o gue proporciona ao United States Government certos direitos sobre o invento.

Referencia Cruzada Ao Requerimento Afim

É esta uma continuação-em-parte do Requerimento Série No. 306.530, registado ém 12 de Setembro, 1386, que é uma continuação-em-parte do Requerimento Série No. 775.214, registado em 12 de Setembro, 1985 (agora abandonado).

Fundamentos Do Invento

Campo do Invento presente invento relaciona-se com um método para o tratamento de processos patológicos associados ao intestino, catabólicos, que incluem atrofia da mucosa intestinal e do pancreas e outras perturbações associadas a permeabilidade aumentada do intestino, enfraquecimento das defesas do hospedeiro, e função imunitária comprometida. 0 invento relaciona-se ainda com um método para promover a recuperação em indivíduos submetidos a transplantação da medula óssea.

Descrição da Técnica Fundamental

Os processos catabólicos (disfunções) relacionam-se com as situações fisiológicas em que ocorre a degradação de uma estrutura anatómica. Essas condições afectam tipicamente não apenas o músculo esquelético, mas também o revestimento do intestino. A actividade cat-abólica originando lesão dos tecidos segue-se frequentemente a cirurgia, sepsis, queimaduras, quimioterapia do cancro, terapêutica/lesão por radiações, ou terapêutica com glicocorticoides, frequentemente em associação com uma ingestão alimentar inadequada. Essas lesões, doenças, e tratamentos estão também na origem da função imunitária comprometida.

problemas c on t r i buem

Em doentes submetidos a transplantação da medula óssea,

- t por exemplo, os regimes de radiação e/ou quimioterapia pré- e pós-transplante, associados a uma frequente ocorrência de doença ✓ enxerto-versus-hospedeiro, estão na origem de graves catabólicos e nutritivos. São muitos os factores que para uma necessidade de nutrição parentérica total CTPN) nestes doent-es, incluindo a mucosite oral e esofágica, diarreia, náusea, vómitos, xerostomia e disfunção do sentido do gosto (Cunningham et al , , Câncer 59; 1515-1519)) . Embora se pense que a TNF' é necessária e benéfica nos doentes submetidos a transplantação da medula óssea, ensaios com infusão i.v. de fórmulas especializadas com elevado teor em amino ácidos de cadeia ramificada CBCAA) durante o primeiro més após a transplantação não melhoraram o balanço azótico CLenssen et al . , J. Parent. Ent·. Nutr. 11:112-119 <: 1987) ) .

Uma resposta catabólica, lesão do tracto gastrointestinal e função imunitária comprometida originadas pelas várias causas indicadas anteriormente podem constituir uma causa impoi— tante de morte e de incapacidade. Estes quadros clínicos encontram—se frequentemente associados a metabolismo anormal do amino ácido não essenc ial, -.glutamina CGLN). A GLN pode ser sintetizada até certo ponto pela maior parte dos tecidos. Ao contrário da maior parte dos amino ácidos, a GLN tem duas metades amina; um grupo alfa-amino e um grupo amida. A presença do grupo amida permite à GLN remover a amónia dos tecidos periféricos do organismo e transportar azoto para os orgãos viscerais. Além disso, é comum que os tecidos que removem a GLN da circulação utilizem o esqueleto de carbono como fonte de energia.

A glutaminase e a glutamina sintetase são os dois principais enzimas envolvidos na regulação do metabolismo da GLN. A glutaminase catalisa a hidrólise da GLN em glutamato e amónia,

*. I»enquanto que a glut-amiriá sintetase catalisa a sintese da GLN a partir do'glutamato e da amónia. Embora a maior parte dos tecidos possua ambos estes enzimas, usualmente um é mais activo que o outro, dependendo do tecido em particular.

células células hema topo i é t- i c as, 1i nf oc i tos, tumorais. Caracter isti cament e,

A síntese e transporte da GLN ocorre principalmente no músculo esquelético e no cérebro. Por seu lado, a GLN é consumida por células de replicação tais como fibroblastos, epitélio intestinal, e estas células possuem elevados níveis de actividade da glutaminase e baixos níveis da GLN intracelular. Este facto pode ter significado clinico para doentes apresentando grandes feridas, inflamação associada com infecção, ou uma disfunção gastrointestinal que impede uma alimentação entérica normal visto a proliferação desejável dos tipos celulares nestas condições poder depender da disponibi1 idade de níveis suficientes da GLN.

No t-ract-o intestinal, a GLN é usada como um combustível respiratório. A administração entérica da GLN resulta numa libertação aumentada da GLN luminal pela mucosa intestinal acompanhada por uma diminuição simultânea na libertação da GLN a partir da circulação. Assim, o consumo da GLN pelo intestino é equilibrado entre.estas duas fontes de GLN.

A maior parte da GLN libertada pelo t-ract-o gastrointestinal ocorre por meio das células epiteliais que revestem as vilosidades do intestino delgado, 0 metabolismo da GLN gue ocorre no intestino delgado proporciona uma fonte principal de energia para, o intestino e produz precursores para a ureiagenese e para a gluconeogenese hepáticas pelo processamento de azoto e carbono a partir de outros tecidos.

6aske r ν i 11 e et al f

(1960)) fez desce·, ( 6'’-it·. -J . Exp , Pat-hol , , 61 132 a concentracSo da GLN do plasma até niveis impossíveis de detectar por infusão de gluta.minase purificada em

J macacos rhesus, saguins, coelhos, e ratinhos, resultando em vómitos, diarreia, atrofia das vilosidades, ulcerações da mucosa, e necrose intestinal.

Martin et al., (Patente dos E.U.A. No. 2.263.617) apresenta uma composição contendo GLN gue é usada como um desintoxicante, em vez de ser usada como um suplemento dietético. Na patente, a GLN é combinada sinergíst-i camente com outros aminoácidos a fim de actuar directamente sobre uma toxina para inibir qualquer efeito prejudicial.

Em Shive et al,, (Patente dos E.U.A. No. 2.666.693), são apresentadas composições contendo GLN para o tratamento das ulceras pép t i c as.

Outra evidência do potencial efeito protector da GLN foi indicada por Dkabe et al . , Digestive Disea.se, 2066 (1375), que verificou que a GLN podia proteger contra as ulcerações g á s t r i c a s i n d u z i d a s η o ser h u ir>. a no. Estes e f e i t o s n ã o f o r a m observados quando a GLN foi administrada por meio de tubos para alimentação até ao intestino, evitando desse modo a exposição directa da mucosa gástrica à GLN. Isto indica que os efeitos da GLN sobre a ulceração gástrica foram locais e não secundários a nutrição sistémica alterada.

amino ácido Gl_N não essencial não se encontra presente em soluções a1imentares parentéricas padrão sendo contudo um combustive 1 oxidativo preferid>: meuller, H.G., Adv. Enzyml.

para o intestino delgado <Win-53.:201-237 <1982)) e apresenta efeitos tróficos sobre a mucosa intestinal de roedores alimentados intravenosamente <i.v.)<Hwang, 37:56-58 <1986)! 0 Dwyer, S.T.

(1387)). Este requer i'mento de 6LN dur an te doenças per i gosas,

T. L . et· al . , Surgi cal For um et al. , Clin. Res. 35 ί 363A visceral pode ser ainda maior quando se sabe que o metabolismo da GLN pelo intest ino delgado está aumentado <Souba et- al . , Surgery, 94(2):342 (1383). Embora se saiba que a 6LN é rápidamente consumida pelo pancreas e parece estar concentrada na porção exócrina da glandula (Cassano, G.B. et al., J. Neurochemistry 12:851-855 <1965)), não foi referido efeito da GLN administrada exógenamente sobre o pancreas exócrino de animais intactos.

Presentemente, as necessidades nutritivas de doentes gue são incapazes de se alimentar a si próprios a.dequadamente são satisfeitas mediante a administração de dietas entéricas ou parentéricas. As dietas entéricas são usualmente administradas usando tubos de pequeno calibre que são colocados através do nariz nas regiões gástrica ou duodenal, ou por meio de implantação cirúrgica tal como, por exemplo, nas gastromias ou jeunostomias. Estas fórmulas entéricas que se encontram actualmente disponíveis podem ser divididas em quatro categorias básicas:

elementa res, po1i mér icas, Estas rórmuias contêm Gi_.r4. v'os p¹ r esen tes nas d i et*as necessidades dietéticas de modulares, e amino ácidos alterados. Contudo os niveis de agentes nutritientèricas, baseiam se gera 1 mente nas um individuo normal e nSo nas necessidades de um doente sofrendo Ótx¹ Ufilci C͹ oenca cat-aból ica.

As fórmulas elementares requerem uma acção digestiva mínima e são compostas principa1 mente por pequenos péptidos e/ou amino ácidos, ol igossacáridos da glucose, óleo vegetal ou triglicéridos de cadeia média.

Nas fórmulas poliméricas, agentes nutritivos complexos tais como, por exemplo, proteína da soja, lactalbumina, ou caseína são utilizados çomo^.utna fonte de proteína; maltodextrinas ou xaropes de milho sólidos como uma fonte de hidrato de carbono; e óleos vegetais ou gordura do leite como uma fonte de gordura.

As dietas moóulares podem ser produzidas combinando proteína, hidrato de carbono, ou gordura com uma fórmula monomérica ou polimérica a fim de satisfazer as necessidades nutritivas especia. is.

As fórmulas que são compostas por composições de amino ácidos alterados são usadas principalmente para doentes com erros genéticos do metabolismo do azoto ou com perturbações adquiridas da acumulação do azoto, sendo frequentemente o seu objectivo 1imi tar a ingestão pelo doente de certos amino ác idos que possam ser prejudicia is.

As dietas parentéricas são usualmente administradas intravenosamente (i.v.). Estes fluidos i.v. são soluções estéreis compostas por produtos químicos simples tais como, por exemplo, açucares, amino ácidos, e electrólitos, que podem ser fácilmente ass imi1ados.

A expressão nutrição parentérica total” (TF‘N) é usada para descrever fórmulas para utilização em doentes que obtêm a totalidade das suas necessidades dietéticas i.v. As fórmulas para nutrição parentérica total, ao contrário das fórmulas entéricas, não contém geralmente GLN. A ausência de GLN das fórmulas parentéricas deve-se, em parte, á preocupação existente em relação á ambiente, e á resultante geração

Existiu também preocupação àcerca sua instabi1 idade à temperatura de amón ia e de ac i do g 1 u tam ico.

da geração de tox i c i oa.de do efeito, estas va 1 o res de F’H

ácido glutâmico a partir de GLN devido à potencial é>.eido g 1 u tám ico c omo um neurotransm i sso r . Com preocupações não parecem ser justificadas com os das soluções nutritivas entéricas e parentèricas.

A ΓΡΝ resulta em atrofia das vilosidades, um fenómeno que é geralmente reversível quando se recomeça a alimentação por ✓ via oral. Como as fórmulas ΓΕΝ não têm GLN, as necessidades do organismo deste amino ácido devem ser satisfeitas a partir de vias sintéticas nos tecidos do organismo.

Em doentes com doenças graves, o catabolismo proteico liquido associa-se a reservas diminuídas de GLN do múculo e a GLN pias m á t i c o reduzi d o ( A s k a naz i et a 1 . , Ann . Surg. 1 '32 ! 7 8 ( 13 8 0 ) ;

Askanazi et ai,, Ann. Surg, 191:455 (1980): e a um presumível intestinal de GLN (Souba et a 1. , Arch

Surg . , 120 : t-8 ( 1 388) ; Souba ai . , Surger y , 94(2) 842 (1388)). £ também sabido que os glícocorticoides aumentam o consumo de GLN pelo intestino delgado (Souba et al. , 8urgical Forum, 84:74 (1383)).

A TF‘N está associada a peso pancreâtico reduzido e a secreção exócrina pancreática diminuída para além de atrofia da

m u c o s a. g a s t r o i n t e s t í	nal (Hughes,	C . A . et a 1	. , Clin. Sc ience
53:323-335 (1380);	·-! l* h n s π ι L.	. R. et al.,	G a s t r o e n t e r o 1 o g y
•58 : 1 1 77-1 183 ( 1375 ) ;	•J o h π s c* η ι ί—	.R. et al . ,	Am. J. Physiol.
233:E524-E549 (1377)	; Towne, J.B.	et a1., Am.	J. Surg. 128:714-

-718 (1978)). Os animais aos quais se administraram suficientes agentes nutritivos i.v. para manter o crescimento corporal, desenvolvem um nível de atrofia pancreática semelhante ao gue ocorre durante a fome (Johnson, L.. R . et a 1 . , (1975), supra) . A

etiologia da atrofia pancreática é mal compreendida e pode ser secundária a vários factores que normalmente acompanham a íngestaão oral de agnetes nutritivos incluindo! (1) a ausência de substratos luminais (Clark, R.M., C1in, Sei. 50:139 (1976));

falta de aminas na dieta (Seidel, E.R. et a1

Ía .T

Rhy s i o 1

249:G434-433 (1935)),' (3) ausência de fibras fermentáveis (Jacobs, L.R. et al . , Am. J . Physiol. 246:6373-6335 (1934)); (4) alterações nos processos neurohumora. i s (Johnson, L.R., Phys iοIogy of the Gastrointestinal Tract, 2d Ed., pp. 301-319, Raven Press, NY (19-37)) ou (5) altefações nas secreções pancreaticobi1iares (Fine, H. et a 1 . , Am. J. Physiol , , 245: 63-53-6353 (19-93)). Adicionalmente ou alternativamente, a atrofia pancreática pode ser influenciada pela ausência de agentes nutritivos específicos em soluções alimentares parentéricas disponíveis (Wilmore, W.W. et a 1 . , Surger y 104(5) ί 917—923 (19-38)).

Nenhum dos estudos anteriores demonstrou que o colapso do músculo esquelético, a atrofia das vilosidades intestinais e do pancreas, o colapso da parede intestinal levando c- permeabilidade aumentada, função imunitária, comprometida., ou outras disfunções catabólicas que ocorrem durante a ΓΡΝ podiam ser evitados por meio de administração de elevados niveis de GLN.

u m á r i o d ο I nve n t o

No invento, um animal apresentando, ou em risco de apresentar, processos patológicos associados ao catabólicos (disfunção catabólica) incluindo atrofia da. mucosa intestinal e doí pancreas, aumento da permeabi 1 idade intestinal, —diminui cão das defesas do hospedeiro e compromisso da função imunitária, associados ά ter&péuíica por irradiação ou quimioterapia do cancro ou alimentação intravenosa, ou a tratamento com transplantação da medula óssea, recebe uma quantidade

terapêuticamente eficaz de GLN. Esta quantidade de GLN é superior à geralmente encontrada na dieta de indivíduos normais. Este nível aumentado de GLN é necessário para compensar uma maior necessidade de GLN que ocorre durante certas disfunções catabòlicas. Na ausência de uma fonte exógena, a GLN será obtida através do colapso do, tecitio muscular durante essa situação catabólica. 0 declínio das concentrações de GLN no plasma apesar da libertação acelerada de GLN a partir do músculo durante a disfunção catabólica indica, deficiência sistémica da GLN. Apesar da libertação acelerada'da GLN a partir do músculo, as necessidades das células da mucosa intestinal excedem o fornecimento. Isto, por seu lado, predispõe á atrofia das vilosidades intestinais, e ao colapso da barreira constituída pela parede intestina. 1 . A perda desta barreira, juntamente com a função imunitária comprometida associada ao intestino assim como a outros tecidos linfoides, constituem factores que predispõem á infecção. Para além da lesão intestinal, ocorre atrofia pancreática, em condic ões seme1hantes.

Assim, o presente invento proporciona um método para o tratamento de processos patológicos associados ao intestino, catabólicos, incluindo atrofia da mucosa intestinal e do pâncreas, aumento da permeabi1 idade do intestino, defesas do hospedeiro diminuídas e função imunitária comprometida e para promover a recuperação da transplantação da medula óssea, num animal, compreeiidendo o método a administração ao animal de uma quantida de terapêuticamente eficaz de GLN ou de análogos funcionais da GLN.

fornecimento de GLN exógeno a um doente sob stress leva a que ele suporte melhor os requerimentos metabólicos do intestino delgado· e do sistema imunitário e faz diminuir a taxa de catabolismo proteico sistémico. 0 fornecimento de GLN a

1 doentes submetidos a transplantação da medula óssea é especialmente benéfico para a. melhoria da lesão gastrointestinal e da função· imunitária comprometida consequente à radiação/quimioterapia, doença enxer to-versus hospedeiro, e TF'N. 0 fornecimento de GLN a doentes com doença inflamatória do intestino é também benéfico. , : ' é concebível que a eficácia terapêutica dos glicocorticoides na doença inflamatória do intestino se relacione não apenas com as suas propriedades anti-inflamatórias, mas também comi o seu papel relacionado com o aumento do metabolismo do substrato no interior dos ent-eroci tos que revestem interiormente o intestino. A administração da GLN exógena ao proporcionar ainda mais substrato para os ent-eroc i tos contribui também para a prevenção da deplecção do plasma e do músculo esquelético. De uni modo semelhante, a 6L.N pode promover a sobrevivência do intestino delgado transplantado ou apoiar o metabolismo do intestino em crianças com imaturidade intestinal.

Des c r i ç ão Das F i gur as

A Figura 1 indica um registo do equilíbrio do azoto como uma função da ingestão de azoto.

A F i gu r uma representação gráfica dos dados obtidos no Exemplo 5 ao comparar o nível total da cadeia ramificada de amino ácidos (BCAA) io sangue arterial com a taxa de administração de BCAA. õs dados representam média. ± SEM

Os dados

SOD P é? O:

animais que receberam solução salina não são incluídos

A Figura 3 é uma representação gráfica dos dados obtidos no Exemplo 5 comparando a relação entre o fluxo de BCAA (quarto posterior) e a infusão de BCAA.

Α Figura 4 é uma representação gráfica dos dados obtidos no Exemplo 5 comparando o fluxo de E-'CAA (quartos posteriores) seis horas após a operação e o aumento da concentracão do nivel de BCAA no sangue arterial.

A Figura -5 é uma, representação gráfica dos dados obtidos no Exemplo 5 comparando o fluxo de azoto (quarto posterior) e o fluxo de Ε-ΌΑΑ (quarto posterior.) seis (6) horas após a operação.

j

A Figura. 6 é uma representação gráfica dos dados obtidos no Exemplo 5 comparando o fluxo de azoto (quarto posterior) seis (6.) horas após a operação e a alteração do azoto do amino ácido intracelular medida 24 horas após a operação.

A Figura 7 é uma representação gráfica de dados que demonstram o efeito de dose elevada de ΓΡΝ GLN sobre o balanço do azoto cumulativo após transplantação de medula óssea alogènica.

Descrição Breve ua. s Apresentações Preferidas

Os inventores imaginaram um novo método para o tratamento de processos patológicos associados ao intestino, catabólicos, (disfunções catabólicas) incluindo atrofia da mucosa intestinal e panereática, aumento da permeabi1 idade intestinal, diminuição das defesas do hospedeiro e função imunitária comprometida. 0 presente invento compreende a administração a um animal atingido por, ou que venha provávelmente a. desenvolver, um dos quadros patológicos anter iormente ref er* idos , de uma. quantidade tere.péuticamente eficaz de GLN ou de um seu análogo funcional. Esta quantidade t-erapéut i camente eficaz é superior à que se encontra, presente numa, dieta normal . A ingestão dietét ica normal para o ser humano é de cerca de 2 a 4 g/dia.

Uma disfunção cat-abólica é uma situação que induz uma esposta cat-abólica nítida am

que ocorre a degradação de uma estrutura anatómica. A administração dietética de GLN parece satisfazer as necessidades bioquímicas destas situações catabólicas de modo a não ser necessário que o organismo sintetize GLN ou gue obtenha GLN a partir do,colapso do músculo esquelético.

F'retende-sé que o presente invento seja utilizado em todas as disfunções catabólicas em que exista uma necessidade aumentada de GLN. Estas disfunções catabólicas podem estar associadas ou a. orgãos e células do tracto gastrointestinal ou a outros sistemas de células e orgãos. A atrofia das vilosidades do intestino delgado durante a administração de uma dieta parentérica não ocorre usualmente directamente devido à actividade catabólica sobre os enteroc i tos, mas é devida sim, á falta, de GLN na d i e ta dos doen tes.

A exp r essão en té r ica. p r s t dum ι η i s t r aç ão oe age n t-es nu c- r 11 i vos aiimentar entre o estômago* e o anus.

nde indicar um método de ct essa porção do canal

c-1 vo.

w expressão perent-ér ica a.gen tes nu t r i t i vos a essa indica, um método de adminisregião fora do tracto digesAs disfunções catabólicas parentéricas gue apresentam necessioades aumentaoas oe GLN ocorrem em mui tos estaoos c 1 inico.

incluindo a < privação cal· è? ρ s i s , o u rante o u a.

?guir a. cirurgia, e ·_ι i

Γ =í 1=1 í aoetes náo conc-rolaoa .

us animais nos quais u invento se mostra ef icaz são* os habituaImente classifiçados como mamíferos, incluindo o ser humano*.

A expressão permeabilidade patológica do intestino indica um aumento da permeabilidade do intestino associado ao quadro patológico. Essa permeabilidade do intestino, detectável por vários meios tais como, por exemplo, a absorção e a excreção urinária de lactulose introduzida intragâstricamente, encontra-se associada à admi nistração ·. tie agentes quimioterapêuticos do cancro, com TPN, e a outras lesões ou quadros patológicos.

f

Na expressão tratamento inclui-se prevenção, melhoria, ou cura de um sintóma ou grupo de sintomas constituindo um quad r o pa to1ôg ico.

A expressão atrofia pancreática indica perda de tecido pancreático, ou da função pancreática.

A expressão função imunitária comprometida indica uma redução na função imunológica que pode ser medida in vi tro ou in vivo. Essas funções incluem, mas não se limitam a, proliferação de linfócitos em resposta a um antigénio ou a um mitogénio, respostas de anticorpos, respostas imunitárias mediadas por células tais como hipersensibi1 idade atrasada. Várias formas de função imunitária comprometida, todas elas abrangidas pela, expressão, podem conduzir a diminuição das defesas do hospedeiro em relação a uma série de agentes patogénicos tais como microorgan i smos pa togéni c os.

A função imunitária comprometida constitui uma consequência bem conhecida do tratamento com drogas quimioterapéuticas, e é também uma consequência de certas formas de traumatismo físico, queimaduras, má nutrição, diabetes e outros quadros pa. to 1 óg i c os .

A expressão ''diminuição das defesas do hospedeiro indica ura aumento da susceptibi1 idade à infecção por uma serie de microorganismos patogénicos, incluindo, mas não se limitando a, bactérias, virus e fungos. Essa diminuição ocorre a seguir ao colapso da barreira constituída pela parede do intestino, permitindo a passagem de agentes, patogénicos normalmente evitada a partir do lume do intestino através da barreira constituída pela mucosa. Essa diminuição pode resultar da função imunitária comprometida, em que as células do sistema imunitário midas na sua capacidade'para responder às estruturas associadas aos agentes patogénicos. A diminuição das defesas do hospedeiro também resulta de função anormal de outras células incluindo diminuição da guimiotaxia, matar dos leucócitos, função alterada dos macrófagos, e de outros mecanismos inatos relativos à resistência do hospedeiro, gue são bem conhecidosnesta técnica (ver fjims, C.A., The Pathogenesis of Infectious Disease <2nd Edition), 1952, Academic Press, N.Y., gue é agui incorporado como referência).

são supriantigénicas fagocitose e capacidade de

A necessidade de GLN em meio de cultura de tecidos para uma grande variedade de tipos técnica (Freshney, CULTURE QF a sobrevivência ou crescimento de de células é bem conhecida nesta ANIMAL CELLS, A Manual of Basic íechnigue, Alan R. Liss, Inc., New York, 1983), gue é agui incorporado como referência), é bem sabido, por exemplo, gue a proliferação e a diferenciação dos linfocitos in vi tro depende grandemente de concentrações aumentadas de GLN no meio. Pode-se demonstrar gue a insuficiência de GLN i n v i vo, por exemplo a seguir a TPN a gue não se tenha, adicionado GLN, leva a uma supressão da função 1infocitária. Esta perda de função ou é evitada em parte, ou é parcialmente restaurada, pela adição de GLN à. fórmula, de TF'N.

Α expressão substancialmente associada a'' quando aplicada a disfunções ou sintomas para os quais o método do invento é eficaz, significa as disfunções em que a necessidade bioquímica de GLN ocorre durante ou depois da disfunção, estando c om ela r e1 a c i onada.

A administração de GLN pode ser feita tanto por via entérica como por viaf parentérica.

Exemplos de rnéios de administração parentérica de GLN são constituídos pela utilização de tubos de pequeno calibre através do· nariz para as regiões gástrica ou duodenal , ou através de implantação cirúrgica tal como, por exemplo, na gastrostomia o u n a. j e j u π o s t o m i a .

ma;

=? I ι 'Λ ‘-¹

Exemplos de vias de administração parentérica incluem, se limitam a, injecção subcutânea, intramuscular ou absorção nasofar i ngea , mucosa ou tra.nsdermi ca . Na ma.ior par te do*s casos, a olím é aommistrada i . v . Na aoministrsção i.v., a. quantidade de GLN terapéuticamente eficaz, sob uma forma, liquida, é administrada directamente a partir de um reservatório a partir do qual o tubo se liga a uma. agulha que é colocada numa ve ia. g r a nde do doen te .

Independentemente da via de administração utilizada, a GLN pode ser administrada, quer isoladamente quer como um suplemento dietético. Guando usada como um suplemento dietético, a GLN pode ser misturada com uma dieta entérica ou parentérica anterior à administração ao doente. é também possivel administrar a GLN sem a misturar directamente com os outros componentes de uma d i e ta c umo, po r e.xemp 1 o , na a 11 men ta ç ão i.v. em que a GLN não é adicionada directamente ao principal frasco i.v., mas em vez disso é adicionada a um reservatório comum usando um frasco piggy-back.

São contemplados como equivalentes análogos funcionais, derivados, produtos de substituição, isómeros, ou homólogos de

GLN que retém as

São preferidos os carac ter? i'sti cas da. GLN análogos capazes de fornecer um grupo amina e de serem metabolizados no ciclo de Krebs. Os mais preferidos são os compostos que possuem o residuo de amino ãcido numa extremidade da cadeia de carbono e uma metade amina na outra extremidade da cadeia de carbono.

As variações da dose terapêuticamente eficaz para a administração de GLN são as que são suficientemente grandes para evitar o catabolismo ou atrofia dos tecidos do organismo a fim de manter a. homeosta.se metabólica. Numa dieta entérica GLN deve ser administrada numa taxa superior ou igual a 0,3 gramas por quiloEssas taxas de administração grama do peso corporal por dia, variar entre gramas por quilograma peso corporal por dia, de preferência 0,3 a 1,5 gramas por quilograma do peso corporal por dia, e com maior preferência 0,4 a 1,0 gramas por quilograma do peso corporal por dia. A taxa de administração para GLN quando administrada i.v. deverá ser superior a ou igual a 0,1 grama por quilograma do peso corporal por dia. Essas ta.xas oe administracão podsni var iar entre Q, 2 e 3, O grama por quilograma do peso corporal por dia, de preferência entre 0,3 e χ., 5 granias pop quilograma do peso corporal por dia, com maior nerència enti por dia.

:,0 gramas por quilograma do peso corpoDe acordo com o método do invento, GLN pode ser administrada por simples modificação das fórmulas dietéticas existentes a fim de conterem a concentração apropriada de GLN. Com a

maior preferência, a GLN permanece numa forma seca tal como, por exemplo, um pó liofílizado estéril que é hidratado assépticamente na altura da administração e misturado numa concentração apropriada com os outros componentes da composicSo dietética. Alterna ti vamente , a GLN pode ser pré-misturada com os outros componentes de uma fórmula seca que é rehidratada assépticamente na altura da administração, ou é armazenada sob a forma de um concentrado congeladd o qual é descongelado e misturado na concentração apropriada na altura da utilização.

J

A utilização de GLN pelo método de acordo com o invento é idealmente apropriada para a preparação de composições. Estas composições podem compreender GLN, dipeptidos contendo GLN, sais de GLN, quer isoladamente quer em combinação com outros produtos químicos. Ffstes outros produtos químicos podem ser veículos farmacêuticamente aceitáveis, assim como outras substâncias activas da dieta tais como, por exemplo, amino ácidos livres, hidrolisados da proteína, ou óleos.

soluções, Podem ser

As preparações para administração parentérica incluem suspensões, e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis, usados veículos ou revestimentos oclusivos a. fim de

aumentar a. permeabi1 idade da pele e facilitar a absorção cutánea.

L^! invento tsmoèm se elsciona com um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo os componentes do invento, sendo o medicamento usado para o tratamento da disfunção ca.ta.bólica, patologias associadas ao intestino incluindo atrofia da

ÍH ou panareeΐ>, permeabi 1 idade aumentada oo intestino, diminui Ç eí, C* G 3. 'l? G G Γ · ' 1 d C C‘ Γί í p* ΐ ’ Ο Π) 3 t· 1 '3. c? P* 3 t * 3 P^l i' Ο Γ»»^:

G3 Π’ΐθΟ 14 i 3. ô£'Z’'x?c, .

sas do hospedeiro e função imunitáver a recuperação após implantação

‘'áUi

Ο invento também se relaciona com composições ricas em GLN para evitar ou melhorar as disfunções catabólicas. As composições que são ricas em GLN contêm GLN em níveis que são terapêuticamente eficazes e que são superiores aos que estão presentes na dieta normal.

, *

Podem ser usados 'recipientes contendo a composição do invento a fim de fa.crlitar a administração de GLN de acordo com o método do invento. Estes recipientes são criados de modo a conterem, por exemplo, a dosagem diária de GLN a ser administrada ao doente.

São especialmente úteis recipientes administração i.v. de GLN isoladamente ou em outros amino ácidos. Esses recipientes podem receptáculo para a composição liquida contendo condutor do liquido capaz de ligação a uma agulh adaptados para combinação c om compreender um

GLN, e um meio meio condutor do líquido pode ser qualquer um capaz de conduzir a composição líquida do receptáculo á agulha tal como, por exemplo, um tubo de plástico.

A agulha ligada ao meio condutor pode ou ser inserida direetamente num vaso sanguíneo ou cateter i.v. do recipiente humano ou pode ser inserida num reservatório a fim de permitir a. sua mistura com uma outra solução antes de ser administrada ao

A Ρ ϊ ‘ 6? S fc? ϊ i t- Ç ã O êi ί Ϊ t- ir? ϊ* Ϊ Γ ò c? zz *_ Γ' S V t? fc? FO 9 í=? 1 ‘ cí 1 O p F & zz c? Π t· fc? invento. Podemos obter uma compreensão mais detalhada tendo como referência os exemplos específicos que se seguem que são aqui proporcionados com fins apenas de ilustração e que não pretendem ser limitativos a não ser que especificado de um modo diferente.

Exemplo 1 exerc i tados e sstudados em re 1 a ç --^,-1 ” fémeas não estavam grávidas mantidos de acordo com as

Tratamento· Animal e Processos Operatórios

Vinte e dois cães sem raca definida, pesando· entre 20 e 40 kg, foram obtidos numa quinta onde tinham sido regularmente arasitas. Todos os animais

Enquanto no canil, os animais foram regras do Committee on Animais at Karvard Medicai School ê do Committee on Care and Ose of laborat-ory Animais of the Institute for Laboratory Animal Resources, the National Research Counci1 (DHEW Rubiication #NIH 78-23, reviewed 1978). Os animais foram mantidos em casotas individuais com uma temperatura constante de 20°C com 24 horas de exposição à luz. Foram exercitados durante duas horas todas as manhãs, sendo-lhes fornecida áqua ad libitum, e administrada uma única ração diária, entre as 13:00 e as 15:00 horas, de Agway Respond 2000 Dry Dog Chow^ (contém pelo menos 25% de proteína, 10% de gordura, e as restantes calorias são constituídas por hidratos de carbono). Foi permitido que os cães se ac1imatassem às condições da casota durante cinco a sete dias, período durante o qual foram treinados para repousarem tranquilamente numa estrutura de Pavlov. No dia antes de se obterem as amostras basais, todo o

17:00 horas. Após um j&j um rninusendo· cão ter obteve-se alimento foi removido do canil às durante a noite, fez-se o cão andar durante pelo menos 20 tos, em seguida foi colocado numa estrutura de Pavlov, canulada uma veia de uma pata dianteira. Depois do repousado na estrutura durante pelo menos 20 minutos, uma amostra de sangue venoso para determinação de amino ácido. A seguir a. uma indução rápida de anestesia com tiopental de sódio intravenoso (Abbott· Laboratories, 5 mg/kg de peso corporal), foi obtida uma biópsia, do músculo vastus lateralis pelo método de

Bergstrom et al,, Journal of Applied Physiology 35:593-597 (1374?. 0 animal foi então retirado da estrutura sendo obtida uma amostra de 5 ml de sangue arterial a partir da artéria fentoral por punção percutãnea.

Deixou-se o animal recuperar da biópsia durante um período mínimo de dois dias·;, 'antes do processo operativo padrão. Um dia antes da cirurgia, removeu-se de novo todo o alimento do canil ás 17:00 horas.' Às 7:00 horas da manhã, fez-se o cão andar durante 20 minutos sendo então levado para a sala de operações onde foi anestesiado com pentobarbital de sódio i.v. (Abbott·

Laboratoríes, 30 mg/kg do peso corporal). Foi colocado um tubo endotraguea1, e o animal foi deixado respirar expontâneamente uma mistura de oxigénio e de ar ambiente. 0 cão foi colocado numa mesa operatória em posição supina, sendo colocada uma cânula por punção percutãnea na veia jugular externa e directamente na veia cava superior. Depois de anotar o tempo de início, a solução da oi administrada por R meio desta infusão c ons t a n te (fo omfoa (E.R. Squibb, Princeton, NY; SUO mg) e Keflin’

Indianapolis, IN; 1 grama) foram administrados i.v. A urinária foi cateterizada, a amostra inicial de urina foi nada, e o catéter foi ligado a um saco para urina fechado para recolha durante 24 horas. 0 abdómen e os flancos do cão foram rapados, e a pele foi lavada com sabão e ãgua e preparada com uma de iodo povidona (Clinipad Corporation, Guilford,

IMED, San Oiego, CA) a. 4 ml/hr/kh R cânula por infusão F’en i c i 1 i na G (Eli Lilly, bexiga e 1 i m i solução prep. CT). 0 cão foi envolvido com lençóis estéreis abdominal foi abordada por uma incisão infra-umbi1ical cavidade ve r t i c a. 1 nas fémeas e por uma incisão paramediana direita nos machos intestino foi retraído i π c i s ã ο η o r e t r ο ρ e r i t o n profunda direita. e a isoladas por dissecção para o aodomen superior, e fez se uma eu exposto. A artéria ilíaca. circumflexa veia. e a artéria sagradas médias foram penetrante e brusca. Um catéter preparado especialmente consistindo num segmento de 6 cm de tubo de polietileno (2,08 mm 00) revestido» com silastic e ligado a um catéter de polietileno· com 2,8 mm 00 foi inserido 5 cm crãnianamente na aorta por uma artéria ilíaca circumflexa profunda direita.. Um catéter semelhante foi inserido na artéria sagrada mediana, sendo a sua extremidade colocada aproximadamente a 1 cm da proximidade da bi f ur çacão ' da aorta, mas distai em relação à artéria mesentéríca inferior. Um terceiro catéter foi inserido na veia cava inferior pa'la veia ilíaca circumflexa profunda direita e em posição distai em relação à veia renal. Todos os catétsres foram fixados e exteriorizados por meio de estocadas no flanco. 0 abdómen foi então fechado e o animal foi voltado para o seu lado esquerdo. 0s catéteres exteriores foram cortados com comprimentos apropriados, tamponados com agulhas com a ponta partida ligadas a orifícios de injecção intermitente CJelco^’, Critikon, Inc, Tampa, FL), lavados com solução salina, cheios com heparina (1.000 unidades/ml), e enterrados subcutâneamente. Os orifícios de injecção foram colocados numa posição elevada no flanco do animal sob a pele e bastante próximos da coluna vertebral. Isto permitiu acesso à aorta e veia, cava por punção percutãnea dos orifícios de injecção dos cateteres. Foram administradas mais duas doses de Keflin' (1 grama) 8 e 24 horas após a operação por meio do c a té ter ve no s o.

A seguir ao processo operatório, o animal foi colocado de lado, e a temperatura corporal foi mantida com lampadas de calor e cobertores durante a recuperação da anestesia. Aproximadamente cinco horas após o inicio colocado na estrutura de Pavlov, e da infusão, o animal foi fez-se a infusão de uma solução de ácido para.-amino hipúrico (F'AH, 0,5% p/v em solução· salina) a uma taxa de 0,75 ml/minuto com uma bomba de Harvard para a aorta distai através de catéter na artéria sagrada mediana. Após 40 minutos de infusão de corante, foram obtidas amostras arterial e venosa simultâneas para medição das concentrações de amino ãcido e de PAH. Foram retirados três grupos de amostras com intervalos de 10 minutos durante um periodo de 20 minutos. Os catéteres foram entSo lavados, cheios com heparina, e o animal foi mantido numa linga de Pavlov. Vinte e três horas a seguir ao inicio da experiência, foram repetidos os estudos do fluxo no quarto posterior. Após, 24 •'.horas, foi terminada a colheita de urina. 0 animal recebeu tiopental i.v., tal como foi préviamente descrito,' e realizou-se a biópsia do músculo vastus lateral is na pata que não tinha sido anteriormente submetida a biópsia. A infusão i.v. foi terminada, e o animal foi colocado numa gaiola metabólica durante as 24 horas seguintes sendo-lhe oferecida água ad libitum e nenhum alimento.

Exemp1ο

Soluções Para Infusão

Todos os animais receberam uma infusão à taxa de 4 ml/hr/kg. Cinco animais de/controlo receberam 0,3% de solução salina. A outros animais administrou-se solução de amino ácidos

R comercializada (FreAnfine III , American McGaw) com duas concentrações diferentes destinadas a fornecer aproximadamente 0,312 (N=2) ou 0,624 (N=6) grámas de azoto/24 hr/kg do peso corporal. A dose mais elevada foi destinada a fornecer o equivalente a 4 gramas de proteina/24 hr/kg do peso corporal. Três animais receberam uma solução contendo GLN a 0,312 gramas de azoto/24 hr/kg. Um grupo final <N=6) recebeu uma mistura igual de GLN e de R

FreAmine , proporcionando azoto a 0,624 gramas/24 hr/kg. As soluções de GLN foram realizadas dissolvendo L-GLN (Sigma, St. Louis, M0) em água destilada para formar uma solução 0,157 M que foi então ajustada para pH 6,3 com hidróxido de sódio. Esta solução foi esterilizada por filtração através de uma membrana 0,22 uM e armazenada a 4°C durante menos de 24 horas. Na manhãa da utilização, as soluções foram formuladas nas concentrações requeridas em sacos de 2 litros (American McGaW) e mantidas a 4°C até â utilização. Foi recolhida uma amostra de 10 ml de cada saco no fim da infusão e armazenada a -20°C para análise do conteúdo de azoto. Uma amostra adicional de 10 ml foi ajustada para pH 4,75 tal como é descrito mais abaixo e foi armazenada congelada para análise do conteúdo de GLN.

Exemp1ο 3

Preparação e Análise de Amostras

Amostras de sangue total e de plasma foram desprot-ei nizadas combinando-as com volumfes iguais de ácido perclórico a 10% (p/v) arrefecido pelo gelo sendo então centrifugadas a 3.000 rpm a 4°C durante 20 mini/tos. Uma porção alíquota de 2 ml do produto flutuante foi tamponada com 0,2 ml de tampão acetato de sódio 0,2M <pH 4,30), ajustáda para pH 4,75-4,90 com hidróxido de potássio 5N, e levada a um volume final de 4 ml com água destilada . A amostra foi armazenada a -20°C para posterior análise do lote das concentrações de GLN e de glutamato, usando um ensaio microfluorométrico enzimático modificado a partir do método de Lund (In,¹ Bergmeyer (ed. ) Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 4, Academic Press, 1974, pp. 1719-1722.)

Durante o processo de biópsia do músculo, iniciou-se um relógio de interrupção imediatamente quando o tecido foi removido. Pez-se a dissecção do músculo livre de gordura e de tecido conjuntivo que foi dividido em duas porções desiguais. Ambas as amostras foram pesadas pelo menos quatro vezes durante os dois minutos seguintes, e foram registados o peso e o tempo a seguir à biópsia. 0 peso real húmido do múculo no tempo zero foi calculado a partir da regressão linear mais apropriada do peso registado em relação ao tempo. A amostra mais pequena (aproximadamente 15 mg) foi seca até um peso constante num forno a 30°, e o peso dos sólidos sem gordura, secos, foi obtido após extracção em éter de petróleo. Esta amostra foi então digerida em 250 ul de ácido cítrico IN, e o conteúdo de cloreto foi medido por trituração com nitrato de prata usando um titulador semi-automático (Radiometer, Copenhagen). 0 cloreto do plasma foi também determinado e a água intra- e extracelular foi calculada pelo método de Bergstrom et

et 1 . , supra.. Α segunda, amostra de músculo (aproximadamente 100 mg) foi homogenizada em 0,5 ml de ãcido perclórico arrefecido pelo gelo (10% p/v) com um Homogenizador Polytron (Brinkman, Westbury, NY). 0 homogenato foi centrífugado e o produto flutuante foi preparado para análise enzimática de GLN e de glutamato.

, t

No início deste estudo, as concentrações de GLN e de glutamato plasmátícos e intracelulares foram determinaoas por meio de um método enzimático préviamente descrito (Huhlbacher et al . , American Journal ' of Physiology 247 ' E75-E83 (1384)). As concentrações dos outros amino ácidos foram determinadas por cromatografia liquida de elevada performance (HPLC) automática após derivatização da pré-coluna com o-ftalaldeido. fodos os amino ácidos habi tua 1 mente encontrados nas proteinas foram quantificados exceptuando GLN, glutamato, prolina, cisteina, e 1isina. 4 medida que o estudo foi progredindo, foram desenvolvidas técnicas para a medição de GLN-glutamato usando HPLC. As amostras medidas pelas duas técnicas lenzimatica e HPLC) propor — cíonaram concentrações de glutamina-glutamato comparáveis; assim, apenes se utilizou análise por HPLC na ultima parte do estudo. A concentração de PAH nas amostras arteriais e venosas foi determinada espectrofotométricamente seguindo desproteinização com 5% de ácido tricloroacético (Nuhlbacher et al . , supra).

A urina excretaoa durante as colhida no sistema colector urinário recipientes acidificados, refrigerados. aliquotas congeladas a -20 °C para análi azoto da solução de infusão e da urina lote peio método macro-ííjeldahi (Pete Clinicai Chemiistry, Vol. II, Williams horas de infusão foi fechado e armazenada em Foram armazenadas porções se do lote. C conteúdo de foi determinado no mesmo rs et al, , Quanti ta tive ã Wilkins, Baiti more, ND,

Ί ~

Os cálculos estatísticos foram realizados num Computador IBM 4341 utilizando uma embalagem estatística padrão Mmitab, The Pennsy 1 vania State University, State College, PA,. 1933). Os resultados são expressos como mêdiaiSEM. Foram usados apropriadamente testes-t de Student aos pares ou não aos pares. A análise da vsriãnc ia Toi usaoa para ¹ ítú 1tiplas comparações oe grupo . A análise de regressão foi realizada usando métodos de quadrados menores. Devido ao pequeno tamanho da amostra nos grupos que receberam 0,312 gramas de azoto/24 hrs/kg, a maior parte das comparações estatísticas foram apenas realizadas entre os outros grupos.

fluxo sanguíneo do quarto posterior foi calculado tal como foi anteriormente descrito CMuhlbacher et al , , supra), e a taxa, foi expressa por kg do peso corporal para ter em conta a variação do tamanho dos animais. As taxas de fluxo dos amino ácidos foram calculadas conto o produto do fluxo do sangue e das diferenças de concentração arterial-venosa. Foram recolhidos três conjuntos de amostras, sendo o fluxo calculado para cada conjunto, e foi determinada a. média dos três valores (Muhlbachêr et al . , supra) . 0 azoto total do amino ácido no sangue total, plasma e água intracelular foi calculado tomando· em consideração o conteúdo de azoto de cada amino ácido e somando a<

c oncen t r a ç ões

Exemplo 4

Concentrações de Amino Ácido Plasmát-ici e Intracelular

C ΟΠC fc?íí t·Γ<?.Ç Ô£?3 Ót? Sfttíno «2*.CÍCiO ρ 1 fSSrilfz· t- i c o for&n) medidas pre operatórlamente ,e* 24 horas a seguir a operação padrão. Nos animais tratados com solução salina, o conteúdo total de azoto do plasma 'não se alterou pelo processo operatório (Quadro I). A concentracão de GLN permaneceu constante, mas as de

BCAA subiram, aumentando 'a soma, para 5bli3 umol/1 (p·*. (?, 01 ) . Nos N/24 hr/kg, houve uma tendência azoto do plasma que foi estatís^ grupo que recebeu a mistura de tração de GLN no plasma tambêr elevados em todos os animais < ác ido.

oas suas concentrações de 326±21 animais recebendo 0,624 gramas de para a subida na concentração do :·icamente significativa apenas no amino ácidos mais GLN. A concen> subiu neste grupo. BCAAs foram lUe receberam infusões de amino η cvncentraçSo de azoto no museu ic* esgusièti co durante a infusão salina (Quadro II). Esta diminuição no total do amino ácido foi reflectida primáriamente por uma

Q c? '3 C t? U azoto queda na QLN de 21,4S±3,21 umol/1 ãgua intracelular para 15,S6±3,8Q (p<0,05). Embora, a soma, das concentrações de amino ácidos não essenciais diminua, a soma dos amino ácidos essenciais totais no í * cíaO r va tó r ΐ ο ΐ n t r ac e 1 u 1 a r p e r m a 11 e c e u i n a 11 e r a d o . N ã o se v e r i f i c o u qualquer alteração no azoto intracelular ou GLN em animais que receberam 0,624 g de azoto do amino ácido/24 hr/kg (Quadro II). Houve uma tendência ascendente na concentracão intracelular de 6 la A com ini usão das cargas· mais elevadas, de amino ácido, embora só se tenha atingido significáncia estatística nos animais que receberam a mistura de aminoácidos e GLN. Não se verificou uma alteração significativa nas concentrações totais de amino ácidos essenciais ou não essenciais nestes dois grupos a seguir à iperação. Em contraste com os animais que receberam a. dose mais

c ι nc an 1 ma i s que receberam infusão

Ulit

0,312 3 N/24 hr/kg não mantiveram consistentemente a reserva de azoto intracelular do músculo esquelético, iindependentemente oa solução infundida. A QLN intracelular caiu em três dos animais, P e r m a n e c eu i π a. 11 e r a d a n u m, e a u m e n t o u n u m < d a d o s não ι n d i c a d o s ) .

Assim, o fornecimento de amino ãcido a. 0,624 g N/24 hr/kg sob a forma de uma. mistura de amino ácidos com ou sem 6LN, manteve a reserva de ami/ιο ácido intracelular do múculo esquelético. Uma diminuição da reserva intracelular, que foi caracterizada por uma diminuição da GLN intracelular, ocorreu consistentemente nos animais que receberam solução salina e foi variável nos animais que receberam a dose mais baixa de amino ácidos fluxo de amino ácido no quarto posteri· calculado como a soma do fluxo de azoto dos amino ácidos individuais, apresentou uma média, de

19,05±4,06 umo1 N/mi n/kg quando medido

C9 ás 6 horas após a operação nos animais recebendo solução salina. E s t e v a. 1 o r foi si g η i f i c a. t i v a. m e 1i1 e s u per i o r a. o d a. s t a. x a. s de e f 1 u x o de -7,7v±6,9 e -6,6001,18 umol N/min/kg observado nos dois grupos de animais que receberam 0,624 g de amino ácidos/24 hr/kg (õuadro III). Contudo, o efluxo de GL.N do quarto posterior permaneceu inalterado entre estes três grupos. Pelo contrário, foram libei’mas

ta.dos BCAAs nos	C Γ ÔC OÍZ/O Γ	·?* fíl ‘“{fçVzj	so 1 u	ção sa 1 in·
fura.ro f ixadus em	cif})DOS OS 3 ‘'UPOS	de an ima1s	que	receberam
mais ele v a. d a s de	·.“> fi) 1 ΠΟ <9. C x COS . r“f	a 1 teração	dos	BCAAs no
póster ior parece	estar relacionêda	com a. ta.x	a. de	a. dm i n i s t r

SC A A,‘ o quarto posterior demonstrou libertação de SC A A no grupo tratado com solução salina, equilíbrio com a solução contendo amino ácidos mais GLN, e maior fixação no grupo que recebeu a '/'-•□e roais sleva.ua de BCAh. Nos l inço animais que receberam v, BlZ

1-/24 nr / f^s. μ , na.c verificou uma alteração significativa no

efluxo* de azoto no quarto posterior tratados com solução salina. οοπtudo, em comparação com os cães verificou-se uma considerável vai'iação nestes dados de fluxo, e o número de animais estudados foi pequeno. õs estudos do fluxo de amino ácido no quarto posterior 24 horas a seguir á operação não demonstraram quaisquer diferenças entre os grupos (Quadro III).

>

A excreção _r d e azoto* infusão com solução salina foi seis animais gue receberiam a do nos cinco animais que receberam de 0,432+0,22 g N/24 hr/kg. Nos e mais elevada de mistura comercial de amino ácidos, a fixação medida de azoto foi de 0,632+0,:)01 g N/24 hr/kg, e o valor médio da excreção de azoto foi de 0,6S‘4±0, 031 (Quadro* IV). Nos seis animais que receberam a solução* formada metade por solução comercial de amino ácido e me tade p*_*r GlN, a i ng estão f o*i co*rr}paí^lá*vel , mas a exc reçãc* foi superior, apresentando um valo.' médio* de 0,775±0,013 g N/24 hr/kg (p<0,05). 0 balanço* do azoto* nestes dois grupos foi significativamence menus negativo oo* que nos animais que receberam solução* salina, apresentando* um valor médio* de -0,052+0,031 e de -0,140+0,022 g N/24 hr/kg, respectivamente. Nos cinco animais que receberam apr o* x i me. de. mente u, 812 g N/ 24 hr/kg, a excreção* media de azoto teve um valor intermediár ic* entre o* observado nos controlos

c o* m solução* salina e nos animais que receberam a maior quantidade de azoto* na infusão, fomadotraram que o* oaianço do* azo* que a quantidade de azoto Quando se combinou 6LN com sem GL.N, os orai cos sobre Quando* somados em conjunto, dos amino* ácidos comerciais vel pelo azoto* retido* quand· s em conjunto, estes estudos demonsto se aproximou do equilíbrio* ã medida administrado aumentava (Figura 1). uma. s*_* I uça.o* c o*me r c i a 1 de am i no* á c i do* o oaianço de azoto foram aditivos. *_* a.Z‘-*to* retido em resposta ã infusão* o*u oe Gl.N isoladamente foi responsa o* as- soluções foram combinadas.

Estes estudos revelam que o stress operatório em cães estimula um nítido colapso proteico nos músculos esqueléticos, como é evidenciado pelo balanço negativo de azoto e pelo efluxo ausentado de arsino ácido do quarto posterior em associação com uma queda na reserva de amino ácido livre intracelular do músculo esquelético. Estudos prévios depionstraram que o consumo proteico não se relaciona com o jejum “ou com a anestesia, mas que constitui uma •esposta clara io st rei operatório (Kapadia et al,,

Surgi cal Fórum 33;13-21 (1382)). A libertação de amino ácidos do quarto posterior 6 horas/ após a operação no grupo tratado com solução salina foi aproximadamente & a 8 vezes superior à observada em cães cataterizados crónicamente, pós-absorcão, estudados em condiçSes basais (Nulhbacner et al . , American Journal of Phy s i o 1og y 247:E75-E33 (1384)). Esta taxa da libertação do azoto no quarto posterior não pode ser atribuída a deplecção da reserva de amino ácido livre intracelular e deve assim reflectir proteolise nítida do músculo esquelético.

fornecimento de amino ácidos no periodo perioperatório evitou a. perda. de azoto, manteve ou aumentou as concentrações de amino ácido plasmático, e diminuiu a queda da. reserva de amino ãcido livre intracelular do músculo esquelético. Estes efeitos parecem estar relacionados com a quantidade de azoto do amino to ta. 1 idade diminuídas mais elevadas de amino ácido, as quais mantiveram

ác i	do admini	s t r ado·	po r
do	organi smo	e no	qua
c om	as doses	mais	ele

ta.mbém e,s reserva.':: á c i dos. Es tes r esu1tados 11· a. 1 . , Munais o f intracelulares de GLN e de diferem dos achados urgier y 131; 488 (1380) , outros amino referidos por que dese r e veu

u.m declínio nas concentrações i intracelulares de GLN e de outros amino ácidos em doentes após substituição da anca que não pode ser invertido pela infusão de de.xtrose e oe amino a.cidos. resultados obtidos usando o método do invento indicam que este

achado anterior pode estar relacionado com a quantidade de amino ácidos administrados por infusão e/ou a falta de GLN do produto administrado por infusão. A infusão de baixas concentrações de amino ácidos (0,312 3 H/24 hr/kg), quer como GLN isoladamente quer como FreAmine^', não conseguiu manter a reserva de amino ácido intracelular em trés -d®s cinco animais estudados. Peio contrário, a infusão com taxa mais elevada de amino ácido estabilizou ou aumentou a reserva intracelular. Assim, parece que uma quantidade adequeada de azoto administrado pode manter pós operatórlamente a reserva de amino ácido intracelular do músculo esque1 et i co.

A alteração na reserva de amino· ácido livre intracelular em animais com infusões salinas, amplamente atribuível a uma queda rápida na GLN, foi evitada quando se administrou qauntidade adequada de? azoto, fal ocorreu quando GLn não estava presente na solução comercial. Õ mecanismo pelo qual a GLN intracelular foi mantida, nestas circunstâncias não é claro, embora pareça provável que o substrato de GLN para a s nação pelos bCAríS. γ*όγ razões GLN foi semelhante em todos o mtese de GLN derivou da transami não explicadas, o efluxo puro ds s grupos. A libertação no quarto posterior de GLN não foi acelerada pelos BCAAs ou atenuada pelo fornecimento de GLN na solução de amino ácido. ús resultados neste modelo pós operatório diferem dos efeitos referidos dos

E^:(. Ηπ s em seres h u m a π o s antebraço a seguir à normais, nos quais a fixação de BGAA no administração de leucina oralmente foi ac e I er a da de GLN (Aok i ef a 1 . , -J o u r n a 1 o f

Clιni ca 1 nvest. i ga t i or

1522(1351 )

N/24 hr/ 3 ío 3. ΠΊ ó *_* 3

E m b o r a e x i	stissem acen
soluções de	amino ácido
g, o efluxo	de az ofο ηo
os grupos	de animais

uadas diferenças na adfnimstraõas á taxa qua r tο ρos teri o r f ο ι

Isto ocorreu mesmo compos ição de 0,524 g c Offtpa r áve I apesar da )

quantidade de amino ácidos essenciais e de BCAAs na solução equi 1 ibrada ser duas vezes superior ã solução contendo GLN. Assim, neste modelo experimental de stress operatório, a suplementarão de GLN de uma fórmula equilibrada de amino ácido foi pelo menos tão eficaz como uma concentração duas vezes superior de fórmula equilibrada padr,ão para a diminuição da 'perda no quarto posterior.

Nos cães que receberam solução salina, os BCAAs foram

libertados do músculo ^esquelético. As taxas quantitativas de transferência calculadas a partir destes dados sugerem que deve ter ocorrido uma fixação acentuada de BCAAs nos orgãos viscerais, com maior preferência no fígado, durante o período inicial do pós operatório. 0 fornecimento de BCAAs parece ter contrabalançado esta translocaçâo, talvez tanto por ter ido ao encontro das necessidades viscerais como por ter invertido o efiuxo do músculo esquelético. Também existiu uma realcão quantitativa entre o equilíbrio do azoto no quarto posterior e a preservação da reserva do azoto intracelular. Guando as reservas intracelulares foram mantidas, o quarto posterior apresentava-se próximo· do equilíbrio do azoto; quando se administrou solução salina, as concentrações na reserva intracelular apresentaram uma acentuada deplecção e houve uma acentuada perda de azoto· no quarto posterior. Embora, a relação entre a proteolise do músculo esquelético a concentração d • Oe aZoc-o na reserva de amino ácido livre seja desconhec ida., estes dados sugerem que o equilíbrio do azoto η!ús c u 1 o e s que 1 é t i c · a concentração de está relacionado com acido incraceluiar e que a GLN pode oesemp*enhar um papel essen equ i 1 í c> r i o bombos tá 11 c o no o r gan i smo .

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Fluxo Azoto Quanto Posterior (Media+SEM: umol/min /kg3

Solução de .Infusão	Azoto Amino Acido	BCAA	Azoto Amino Acido	BCAA
Total	(XN	Tptal	GLN
	-19.05+	-2.69+	-1.41+	-3.50+	-1.71+	0.49+
	4.06*	1.07 “	0.26**	12.10	0.70	1.51
(0.	,624 -7.70+	-1.93+	1.62+	-8.42+	-1.24+	2.08+
çp H/24 hr/kg)	5.90 ~	0.59	0.86	2.90	0.44	1.53
	-6.52+	-1.19+	0.28+	-3.03+	-0.16+	0.09+
(0.624 gm N/24 hr/feg) 1.81	0.46	0.15	3.75	0.82	0.22
• p< 0.05;	solução salina diferente de todos animais	recebendo	0.624g
*· p< 0.01;	solução salina	c. amino	ácidos +	glutamina <;amino ácidos

libertação f ixação

) f

Equilíbrio <16 Azoto (Media+SEM)

Ingestão Azoto Projectada

Solução (cp N/24 hr/kq) N

5

0.312 2

0.312 3

0.624 6

0.624 6

Azoto gr/24 hr/kg

Ingestão

Media	Excreção	Equilibrio
0	0.492+0.022*	-0.492+0.002**
0.304+0.002	0.637+0.056	-0.332+0.058
0.323j0.003	0.709+0.085	-0.386+0.086
0.632+0.001	0.684+0.031	-0.052+0.031
0.635+0.004	0.775+0.019	-0.140+0.022

**« p< 0.05; .solução p< 0.05; solução Freamine III Metade do azoto salina 0.624 gH/24hr^/kg amino ácidos 0.624 amino acidos+glutamii salina 0.624 g N/24hr/kg amino ácidos+glutamina 0.624 aminoáeidos fornecido por FreAmine e metade por glutamina

)

7)

Exemplo 5

Fixação de PCAA e Concentrações de Amino Ácido Livre no Músculo

Ba lanço Azoto Músculko Pós-Operatório Fredizivel

A fim de investigada eficácia da infusão de BCAA para reduzir o catabolismo do músculo esquelético e de toda a proteina r

do organismo, fórmulas de amino ácido contendo concentrações variáveis de BCAA foram administradas pré-operat-ór iamente neste

J estudo a três grupos de cães submetidos a laparotomia e dissecção retroperitoneal padrão. A um quarto grupo administrou-se apenas solução salina. Usando técnicas de fluxo no quarto posterior, taxas de permuta, de azoto do amino ãcido individuais e totais foram medidas e utilizadas para avaliar o catabolismo proteico do músculo esquelético. Concentrações de amino ácido livre intracelular foram medidas em amostras de biópsia, muscular percutãnea. 0 trabalho incide sobre os efeitos das soluções de amino ãcido i.v. contendo concentrações variáveis de BCAAs sobre a. regulação metabolismo do amino ãcido do músculo esquelético sequindo processo cirúrgico padrão no cão. Ao medir o fluxo de amino ãcido no quarto posterior e as concentrações de amino ácido livre no plasma e no músculo esquelético durante as primeiras 24 horas a. seguir à operação, foi possível avaliar a resposta anticatabólica do um infusão de BCAAs e ou t ros am i noã c i do:

A. Matériais e Métodos

Preparação de Animais e Sequência de Estudo

Vinte e sete cães sem raça definida machos e fémeas não g ra v i cas f or am oo 11 cos numa qu ι n ta onde 11 nnam s i do c ono i c i onado» estudados quanto pesavam entre 18 e 40 ui lonramas e f oram siojados οι-frante pelo menos uma semanas antes )

- . -,'9 do estudo na instalações para tratamento de animais da Harvard

Medicai School. Todos os processos estavam de acordo com as regras do Committee on Animais at Harvard Medicai School e do

Commiitee on Care and Use of Laboratory Animais of the Institute for Laboratory Animal Resources, the National Research Counci1,

supra.. Os animais foram ’ mantidos em casotas individuais com exposição á luz durante 24 horas e foram exercitados todas asmanhãs. Forneceu-se água ad libitum e forneceu-se uma única ração diária de comida para cão Fro-Pet Respond 2000 (Syracuse, New York, pelo menos 25% de proteína em peso) entre a 1:00 e as 3:00 da tarde. Os animais foram treinados para repousarem t·rangui lamente numa linga de Pavlov antes do estudo.

Foi removido todo o alimento das casotas âs 5:00 horas da. tarde na noite anterior aos estudos basais ou operacSo. Os estudos basais foram realizados âs 8:00 da manhã depois do animal ter feito exercício e ser colocado na linga. Estes estudos consistiram numa colheita de uma amostra de sangue de uma veia canulada de uma pata. anterior para a determinação de amino ácido )

plasmático e numa biópsia por meio de agulha percutánea do músculo vast-us lateral is realizada, sob anestesia com tiopental de sódio (Abbott·, North Chicago, Illinois, 5 mg/kg do peso corporal, IV) para. quantificar os amino ácidos intracelulares. Após a. oiopsia, comi o* cão ainda anescesiado, obteve se uma amostra de 5 mi de sa ugue arterial por punção pe r c u t ã nea o a artéria f t?fiiovs 1 para anái ise oos amino ac idos do sangue total .

3ti i m a. is τ o r a m d e i x a d o s r e c u pera. r r ea. 1 i za r em ou t r os es tu*los . As 7 : 00 duran t e t rês dia a da manhã no dia da operação, de n*c*vo após uma. no*i te de jejum, o animal f oi exerc i ta o*_* e levado para a saia oe o*pera.cóas onoe foi anesc-ex,iado com sódio ?ntobarbital ¹ tf cago, Illinois, 30 mg./kg do •so corporal por meio de uma cânula na pata dianteira

Fo i colocado uni tubo endotrsqueal e deixou-se o animal respirar expontãneamente uma mistura do ar ambiente e oxigénio· fornec ίου a •5L/min. 0 cão foi colocado numa mesa operatória na posição supina e foi colocado um catéter 16-Fr percutâneamente na veia cava superior pela veia jugular externa. Após anotação do tempo do inicio, foi começada urna’ i-nufusão ou de solução salina ou da solução de amino ãcido, apropriada por este catéter central por meio de uma bomba. IMEO (San Diego, Cal i fornia. Foi administrada cefalotin (Lilly, Indianaç-ol is, Indiana, 1 grama, IV) imediatamente antes da operação ficar completa. A bexiga urinária foi cateterízada e, após eliminação da urina residual, foi iniciada uma colheita de drenagem fechada no começo da infusão que se prolongou durante 24 horas. A urina foi também recolhida durante um segundo periodo de 24 horas, com o animal numa casota metabólica após a infusão IV ter terminado.

ΰ abdómen e os flancos do cão» foram rapados, lavados com sabão e ãgua, e preparados com uma solução de iodo providona. d a n i ma I f o* i env ο· 1 ν i do c om pa nos es te r i 1 izados, e o abdómen foi penetrado por meio de um incisão na linha mediana infra-umbi1ical nas fêmeas e por meio de uma incisão paramediana direita nos machos. 0 intestino foi retraído para o lado, e o retroperitoneu foi exposto para completa dissecção em redor da aorta distai e veia cava inferior. A artéria, ilíaca circumflexa profunda direita e a. veia assim como a artéria ilíaca interna direita foram isoladas. As duas artérias foram canuladas com ca.téteres preparados especia1 mente consistindo em segmentos de 6 cm de tubo de polietileno (2,08 mm 0. D. ') 1 igados a tubos de polietileno· com 2,8 mm O.D. Um catéter arterial foi colocado· a 6 cm de proximidade da aorta pela artéria ilíaca circumflexa e o outro catéter foi colocado· a í cm de proximidade da bifurcação da aorta, mas· distai em relação à artéria mesentêrica caudal, pela artéria ilíaca interna. Um terceiro· catéter foi inserido· na veia cava inferior pela, veia ilíaca circumflexa profunda e colocado em distai em relação a veia renal . Todos os cateteres foram f i xados e exteriorizados através de estocadas no flanco direito, abdómen foi encerrado camadas e o animal foi voltado para

IJ seu lado equerdo. Os catéteres exteriorizados foram cortados com c ompr i mentos apropr i ados , ,tampⁱons.dus c om agu 1 hias c or tadas , coroados com orifícios de injecção intermitente (Jelco, Critikon, z

i amp a, F 1 o r i o a ) , 1 a v ados c om solução salina, cheios c om hep*a r í na (10QuU/ml>, e enterrados subcutâneamente. Os orifícios de injecj cão foram colocados numa posição elevada nos flancos permitindo um fácil acesso ao sangue arterial (aórtico) e venoso (veia cava) por punção percutânea.

Seguindo estes processos, que geralmente levaram duas horas, o animal foi colocado de lado e a temperatura corporal foi mantida com cobertores durante a recuperação da anestesia. Cinco horas após o início da infusão e operação o animal foi colocado na linga óe Pavlov sendo feita, uma infusão com uma solução* de 0,5% de para-amino-hipura.to (PAH) a uma taxa de 0,7 ml/minuto com uma bomba. de Harvard no* catéter aórtico* distai. Após 40 minutos de uma infusão* de corante, foram obtidos três conjuntos de amostras arteriais e venosas simultâneas com 10 minutos de intervalo para medição das concentrações de amino ácido e de PAH. Os catéteres foram então lavados e cheios co*m beparina. 0 animal foi mantido na linga sob vigilância constante até os estudos do fluxo no quarto posterior serem repetidos 24 horas após o início *a a ΐ η τ usa o . iv es t e p»c*r c· o, foi t- e r minada uma primeira c o 1 he i c de urina das 24 hora.;·, e repetiu-se uma. biópsia percutânea do memoro posterior na pata não préviamente submetida a biópsia, de novo sob curta anestesia geral. A infusão foi então terminada, e o animal toí colocado numa casota metabólica oursnte um segundo período de 24 horas.

)

3ο1u ç ões De Inf usão

ιn f usáo de >das as soluções á taxa de 4 i»lZi»inuto/kg. Cinco animais de controlo receberam 0,5% de solução > Ο. X X í !

a. As soluções de amino acido (Quadro V) contendo BCCAs com âC1003 f ó r muI a

NcGaw, i- rés c onc en c- rações d i 7 e r e i-es < 11 x*, cc/.·, ou 44 % dos ami no totais) foram preparados adicionando amino ácidos a uma de ami no ácido padrão a 3,5%, f-reArnine III (American

Irvine, Califórnia). As taxas totais de infusão de BCAA foram de 0,46, 0,32, e 1,34 gramas/24 horas/kg respectivamente. As três soluções de amino ácido eram isoazot-adas, proporcionado aproximadamente 0,624 gramas de azoto/24 horas/kg, com uma relação constante entre vai ina e leucina e isoleucina C1 ; 1 ,-38 ; 1,05 > . Nove animais receoeram uma sedução a 11% oe E*CAA gue foi preparada dissoI vendo uma mistura oe ammu ác idos essenc iais (NEAAl em 2,13% de FreAmine III para formar uma solução gue proporcionou 0,624 gramas de azoto/24 horas/kg. Fm seis animais, NEAA consistiu apenas em L-GLN e em três, NEAA consistiu numa mistura de

NEAA encontrados na FreAmine III (alsnina, arginina, histidina, ser ma, e prolina) nas mesmas relações gue em FreAmine III mimais receberam 4,25% de FreAmine III isoladamente <22% BCAA). 8s últimos sete animais receberam 2,13% de FreAmine III suplementado com suficiente BCAA para formar uma solução a 44%. Esta fórmula final foi tornada isoazotada adiciobe i · nando NEAA c o mo·

-GLN xsoiadamente <n--4) ou uma mistura do NEAA encontrado em FreAmine III <n=3). iodas as soluções foram esterilizada;'· por passagem através de um filtro 0,22 uN (Nillipore, ftiliis, NA) e armazenados durante a noite a 4°C antes da administração. Orna amostra de cada soluçSo de 10 ml foi retirada no fim do período de infusão e armazenada a -20°C para análise do azoto P e I o rn ê t o d o m a c r o - K j e 1 d a hl.

- 43 Preparação e Análise De Amostras De Sangue, Tecido

De Urina

Amostras do sangue t-ota.l e do plasma foram desprot-einizadas por adição de um volume igual de ácido perclórico (PCA) at 10% sendo então centr i f ugacias a 7.000 rpm a 4°C durante 20 minutos. Uma porção aliquota de 2 ml do produto flutuante foi r

tamponada com 0,3 ml de tampão acetato de sódio 0,2M (pH = 4,90), sendo o pH ajustado para 4,75-4,90 com hidróxido de potássio 5N, levada a um volume final de 4 ml com água destilada, sendo centrifugada de novo. 0 produto flutuante resultante foi armazenado a. -20°C para posterior análise do lote.

Durante o processo de biópsia do músculo, ligou-se um relógio para cronometragem na altura da remoção do tecido. 0 músculo foi dissecado livre de gordura e de tecido conjuntivo e dividido em duas porções desiguais. Foram registados múltiplos pesos de cada amostra com intervalos de 15 segundos durante um no tempo = 0 foi

minuto, e	o	peso h	úmido do mús	: c u1 o inicial
calculados	a	par ti r	d Ο Γ -dõ1	linear mais
registado	em	relação	3.0 t-OfifPO . A	amostra mais

damente 15-20 mg) foi seca até um peso constante num forno a 90°C, e o peso dos sólidos sem gordura foi obtido após extraccSo em éter de petróleo. A amostra foi então embebida em 250 ml de ácido nítrico IN, e o conteúdo de cloreto foi medido por titulação com nitrato de prata usando um titulador semi-automático (Radiometer, Copenhagen) . Poi também determinado o cloreto do plasma por um método semelhante. Foi então calculada a ãgua intracelular e extracelular usando a técnica do cloreto, tal como foi anteriormente descrito. A segunda amostra, de músculo (apro.ximadamente 30—100 mg) foi pesada, e homogenizada em 0,5 ml de PCA arrefecido pelo gelo usando um homogenizador Polytron (Brinkmann, Westbury, New York). 0 produto da h o m og e n i z a ç ã o f o i c e n + r i f u g a d o, e o produto flutuante foi preparado para análise por adição de tampão e por ajustamento do pH para 4,75-4,90 tal como foi descrito para as amostras de sangue e de plasma.

As concentrações da 6LN e do glutamato do sangue total, plasma e intracelular do -muculó foram determinadas por um método microfluorométrico enzimático modificado a partir do método de Lund (supra), ou por cromatografia liquida de elevada performance (HPLC) automática após derivatização da pré-coluna com o-ftalaide ido (Smit-h et al . , J . L i g. Ch r orna tog . 8:1783-1795 (1985)). As duas técnicas proporcionaram resultados comparáveis. Outros amino ácidos com excepção da prolina, cistina, e lisina foram determinados com um método de HPLC semelhante. A concentração de PAH no sangue arterial e venoso foi determinada espectrométricamente seguindo desproteinização com 5% de ácido tr i c 1 oroacét· i co (Muhlbacher et al . , Am. J. Physiol. '247: E75-E83 (1984)).

A urina excr rec o 1 h i d a nuni s i s t ema pientes acidifiçados, aiiguotas congeladas a relação ao azoto pelo Quantitativa Clinicai

W i 11 i anis ( 1932 ) . Orna minutos a. 2.000 rpm e c rsat·inina no fechnion

a. Cá1 culos e Ana 11se etada durante as 24 horas da infusão foi de drenagem fechado e armazenada em recirefrigerados. Foram armazenadas porções -20⁰C para posterior análise do lote em método macro-Kjeldahl (Peters et- al . , In.‘ Chemistry, Vol. II, 518-538, Williams & outra porção foi centrifugada durante 10 congelada, para análise posterior da ureia e í Auto-analyzer <farrytown, New York).

'S Estatísticas fluxo sanguíneo do quarto posterior foi calculado tal como foi anteriormente descrito (Muhlfoacher , F., et· a 1 . , supra > .

As taxas de fluxo para os amino ácidos individuais foram calculadas como o produto do fluxo sanguíneo e da diferença oa

concentração arteriovenosa. Foram registados três grupos de amostras em cada ponto do tempo, sendo o fluxo calculado para cada grupo, e determinou-se a média dos três valores. 0 fluxo de azoto do amino ãcido total assim como as concentrações do azoto plasmático, do sangue total, e intracelular, foram calculados _r' t como a soma mil imolar dos ^grupos de azoto de todos os amino ácidos medidos. As concentrações do amino ácido intracelular t

livre do múculo esquelético foram expressas por litro da água intracelular.

Os cálculos estatisticos foram realizados usando um modelo estatístico padrão CMinitab, the PennsyIvania State University, State College, PA, 1983). Os resultados são expressos como média ± SEM. Foram usados de um modo apropriado testes-t de Student. Foi usada, para comparações de grupo múltiplas, a análise da variância. A análise da regressão foi realizada usando o método dos quadrados mais pequenos.

Resultados

Todos os animais sobreviveram ao processo operatório exceptuando um cão que morreu pouco tempo depois da administração pent-obarbital de sódio, antes do inicio da infusão i.v. Este animal não foi incluído no estudo. A perda de sangue durante o processo foi uniformemente mínima. Todos os catéteres para amostras se encontravam desobstruídos nos pontos do tempo 6- e 24-horas, com excepção de um cateter venoso no ponto do tempo 24-horas num animal no grupo BCAA a 22%.

fluxo sanguíneo no quarto posterior às 6 horas foi de

36,1±8,3 ml/minuto/kg no grupo de controlo salino e não foi afectado pelo· tratamento (11% BCAA, 33,3±4,9; 22% BCAA, 42,4±8,S;

44% BCAA, 28,7±3,S,' diferenças não s igni f i cat i vas ) . 0 fluxo às 24

horas mostrava-se inalterado C57,9±10,2; 38,6±8,2; 54,9±6,6;

49,7±13,2, respectivamente). A tendência para taxas de fluxo mais elevadas e para variabilidade aumentada às 24 horas pode ser à atribuível a uma maior actividade motora dos animais a seguir recuperação da anestesia.

1. Excreção Do Azoto Urinário e Balanço Do Azoto

A seguir à operação, o volume de urina excretada foi

J comparável nos quatro grupos de tratamento, embora os cães que receberam apenas solução salina tivessem apresentado tendência para escretar um menor volume de urina (Quadro VI). A excreção de azoto urinário apresentou um valor médio de 0,492±0,20 gramas/24 horas/kg no grupo que recebeu solução salina. Os animais tratados com amino ácido excretaram 35-65% mais azoto do que o grupo que recebeu solução salina, principalmente sob a forma de ureia. Os cães que receberam infusão com solução de BCAA excretaram significativamente menos azoto da ureia e menos azoto total do que os grupos com 11% ou 44% de E:CAA. A excreção de creatinina e de amónia foi comparável em todos os grupos.

azoto da ureia sanguínea e a creatinina plasmática foram medidos antes e 24 horas a seguir à operação em animais seleccionados de todos os grupos. Estai concentrações eram normais em todos os animais antes da operação e desceram ligeiramente ou não se alteraram pósoperatóriamente. Assim, a taxa excreção urinária da ureia foi de de semelhante à taxa de produção ureia,' a produção de^- ureia mais elevada observada nos animais que receberam as soluções com 11% e 44% de BCAA relacionou-se significativamente (p<0,05) com o azoto extra proporcionado pela adição de BCAA ou NEAA á mistura equilibrada de amino ácido.

balanço de azoto foi menos negativo com a administrada amino ácido; aproximadamente -50% do azoto dc .no ácido administrado por infusão s z o t o fui i g u a 1 eni t o d o s foi retido. Porque a administração de us ani ma. is que receberam am i no á c i dos ,

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as alterações na excreção de azoto já discutidas foram reflectídas nc

Di? Ϊ Vl Ç D (Quadro VI). Assim, os animais que receberam a solução de amino ácido equilibrada a 22% atingiram uma retenção de azotó significativamente maior do que os cães que receberam soluções contendo 11% ou 44% de VCAA.

J

2. Concentrações Pe Amino Ácido no Sangue Total

Nos animais tratados com solução salina, o azoto amino ácido do sangue total caiu ás 6 horas após a operação, regressou aos do mas pré-operatórios normais pelas 24 horas (Quadro VII). Esta hipoaminoacidémia foi atribuída em grande parte a uma diminuição na concentração dos amino ácidos não essenciais (glutamina, alanina, arginina, serina, e asparagina), embora. também tivessem ocorrido diminuições signi f i cati vas nalguns amino ácidos essenciais (treonina e tirosina). Pelo contrário, os animais que receberam infusões com amino ácido mantiveram as concentrações do azoto do amino ácido no sangue total ás· 6 horas após a operação. Estes níveis aumentaram acima dos níveis do controlo pré-operatório às 24 horas (p<0,05).

As concentrações de amino ácidos específicos no sangue dos animais que receberam infusões com amino ácido reflectiram as composições das soluções que constituiram as infusões. Por exemplo, as concentrações de E.'CAA estavam relacionadas com a taxa de aommistração de BCAA tanto ás 5 com às 24 horas (Figura 2) . Em geral, as concentrações de GLN no sangue total ás 6 horas eram inferiores aos níveis pré-operatórios (Quadro VII). A excepcão foi o grupo que recebeu solução de BCAA a 11% enriquecida com — 45! ^—

GLN, no qual se manteve a concentração de GLN no sangue. Nestes animais, GLN compreendia mais de metade do azoto não essencial e contribuía em mais de 40% para a totalidade de amino ácidos administrados. Às 24 horas os animais que receberam infusões contendo GLN apresentaram tendência para ter concentrações de GLN no sangue total mais ei.evadsâ ou normais.

· Amino Ãcidos Livres Intracelulares Do» Museu lo

Esqueléti co»

Nos animais tratados com solução salina, o azoto do amino ãcido livre intracelular caiu significativamente às 24 horas após a operação em comparação com os niveis preparativos (Quadro VIII). Esta alteração contribuiu em grande parte < E-5%>) para a queda acentuada de GLN intracelular, que compreendeu uma porção importante da reserva de amino ácido livre intracelular total. Nos animais que receberam infusões de amino ácido, o azoto intracelular ficou mantido, apesar da. ds ida de GLN nos animais q»_se rec ebe r am solução de BCAA a 11' sem bLN. A GLN intracelular teve tendência para aumentar nos animais que receberam soluções enriquecidas com GLN e as concentrações de BCAA aumentaram de acordo com a taxa de infusão de BCAA.

4. Fluxo De Aminoácído no Quadro Posterior

Nos animais tratados com solução salina houve uma nítida libertação de azoto do amino ácido a partir do quarto posterior as· G horas após a operação (Quadro IX) . Este ef lu.xo aumentado de amino ácido· reflectiu libertação acelerada de quase todos os amino ácidos medidos, incluindo o E.'GAA. Nesta altura, o glutamato e o aspar tato» eram os únicos amino ácidos que mantinham equilibrio nc» quarto posterior. Às 24 horas após a operação, a taxa de libertação de azoto do amino ácido no quarto posterior tinha ‘diminuído e, embora altamente variáveis, as diferenças a r ter i o—venosas para, quase todos os amino ácidos não se podiam distinguir de zero. 0 efiuxo de GLN persistiu nesta altura.

Em todos os grupos de animais que receberam infusões de amino ácido, o efiuxo de aZdí-o do amino ácido no quarto posterior às G horas foi semelhante e foi significativamente inferior ao

Λ dos animais tratados com solução salina (p<Q,05). 0 efiuxo tanto da GLN como da alsnina ás G horas teve tendência para ser mais baixo nos animais que receberam amino ácidos do que nos controlos que receberam solução salina. Enquanto que BCAAs eram libertados às G horas nos animais que receberam infusão de solução salina, estes amino ácidos foram fixados nos cães que receberam infusões de amino ácido. A libertação no quarto posterior de BCAA foi relacionada com a taxa de administração de BCAA (Figura 3) e com as concentrações totais de BCAA (Figura 4).

Ás 24 horas, o efiuxo de azoto do amino ácido no quarto posterior foi semelhante em todos os grupos de infusão com amino a eido e na.o se a 1 te r ou em relação às G ho r as. ãs z4 horas, a permuta de BCAA no quarto posterior era ligeiramente positiva, fendo tendência para ser mais elevada nos grupos com 22% e 44% de BCAA. Nesta altura, a. libretacão de BCAA não se relacionou com as concentrações de sangue e com a taxa de administração de BCAA.

Relações Entre Infusão com BCAA, Libertação De BCAA

No Quadro Posterior, e Libertação De Azoto Do Amino

Ácido no Quarto Posterior

Nos cães que receberam infusão com solução salina a libertação de BCAA no quarto posterior estava associado a efiuxo de amino ácido acelerado. Nos animais que receberam infusões com amino ácidos, o balanço de azoto no quarto posterior correlacionava-se com a libertação de BCAA (Figura 5). Os controlos que receberam solução salina não foram incluídos nesta análise pelo facto de não estarem a receber azoto; a inclusão de animais de controlo teria resultado numa linha de regressão com um declive positivo. A correlação foi mantida mesmo quando o fluxo de BCAA não foi ijncluddo na soma do fluxo de azoto de amino ácido no quarto posterior (p<0,02, r = 0,49). Assim, o fluxo de azoto exclusivo do fluxo de BCAA relacionou-se também com a libertação de BCAA. 0 fluxo de azoto não se correlacionou com a concentração total de BÍAA no sangue ou com a taxa de administração de BCAA. Nenhuma destas correlações existiu às 24 horas.

A libertação de azoto do amino ácido no quarto posterior às 6 horas também se correlacionou com alterações na reserva de azoto de amino ácido livre intracelular (Figura 6). As alterações na GLN intracelular relacionaram-se intimamente com as alterações na reserva de azoto do amino ácido livre total (p<0,00í, r = 0,90) e, assim, alterações na reserva de GLN também se relacionaram significativamente com o efluxo de azoto no quarto posterior (ρ<0,05; r = 0,66.). Estas relações matemáticas foram mantidas quando o efluxo de azoto do amino ácido no quarto posterior foi corrigido em relação a alterações na reserva de azoto intracelular. Como as medições do fluxo e da reserva foram feitas em tempos diferentes, fizemos esta, correcção ao presumir duas taxas diferentes de alteração na reserva, de amino ácido intracelular. Primeiro, foi presumido que a. alteração na reserva intracelular ocorreu nas primeiras 6 horas pós operatórias. Alternativamente, foi presumido que a alteração ocorreu com uma taxa constante durante 24 horas. Nenhuma correcção alterou a relação entre a alteração na reserva de azoto intracelular e o refluxo de azoto do amino ácido.

A libertação de BCAA não foi relacionada com libertação aumentada de GLN no quarto posterior às 6 ou às 24 horas. A libertação de BCAA também não se relacionou com as alterações que ocorreram na reserva de amino ácido livre intracelular do músculo esquelético (r = 0,11, não significativo). Pode-se predizer o fluxo de azoto no quarto posterior podendo ser tomada em consideração a. maior parte da vaftabi1 idade dos dados quando se utilizaram tanto o fluxo de, BCAA às 5 horas como a alteração na reserva de azoto do amino ácido livre. A relação foi:

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22, p<0,05, r = 0,-95

U1SCUSÍ

Uma laparotomia padrão em cães anestesiados revelou a capacidade de iniciar muitas das respostas catabólicas observadas em seres humanos em situações clinicas criticas. 0 catabolismo proteico orgânico total, tal corno é medido pela excreção, está aumentado. Os animais de controlo que receberam solução salina excretaram aprox ima.damente 12-15 gramas de azoto nas primeiras 24 eração. Estudos anteriores neste modelo tinham balanço do azoto se mantém negativo durante a.o processo operatório apesar da ingestão de et al., Surg. Forum 55:19-21 (1352)). Pelo

ΓίΟΓά» c*. SÍQ'-·'! Γ o O demonstrado que o Ires oi as a segui r a 1i men tos (Kapad i a contrário, animais em que se iimulou a operação alimentados aos es atingiram o equilíbrio do azoto no primeiro dia após

operação. Consistente com e cor.tr ibuindo para a perda aumentada de azoto urinário, a libertação no quarto posterior total do amino ácido ás 6 horas a seguir à operação do azoto foi 6 a 8 de controlo após uma Outras alterações nos vezes superior ao observado nos animais noite de jejum CNúhlbacker et ai . , supra) cães tratados com soluçãosalina, tais como diminuição nas concentrações do amino ácido no sangue e no músculo esquelético, são semelhantes às alterações referidas durante situações cat-abólicas em seres humanoa (Askanazi et- al . , Ann, Surg. 132i 78-85 (1380)). Assim, o modeló canino apresenta respostas pós operatórias que são semelhantes às alterações em seres humanos muito doentes sendo assim apropriado para examinar os efeitos de amino ácidos exógenos sobre o metabolismo do azoto e permuta de amino ácido no músculo esquelético.

Nos animais tratados com solução salina, a libertação no quarto posterior de azoto do amino ácido foi acentuadamente aumentada às 6 horas após a operação. Este facto foi associado a uma nítida libertação no músculo esquelético de todo os BCAAs. Ao mesmo tempo, as concentrações de BCAA no sangue total mantiveram-se inalteradas, indicando que o consumo de BCAA nos orgãos viscerais era grosseiramente equivalente à taxa acelerada de libertação do músculo esquelético. Nos animais que receberam amino ácidos, a libertação de amino ácido total no quarto posterior foi atenuada, mantendo-se a reserva de azoto no sangue total e no músculo esquelético, convertendo-se o quarto posterior de orqão de libertação de BCAA em orgão de fixação. A fixação de BCAA, e mais especificamente de leucina, não se associou a um aumento da libertação de GLN do músculo esquelético.

Este estudo demonstra que a libertação de amino ácido d o m ús c u1o esque1è11c o assim, o turnover liquido da proteína muscular, pode ser partir de duas mediç Ões

c. -τ» independentes. Estas são a taxa de fluxo de BCAA através da vascular do músculo esquelético e a concentração de azoto na reserva de amino ácido livre no músculo esquelético. Como GLN é o amino ãcido mais abundante na reserva livre, as alterações na sua concentração determinam amplamente as alterações na reserva total. Com efeito, as alterações noa GLN livre podem prever o balanço de azoto muscular assim como as alterações nos amino áci dos 1 i v res to ta i s

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QUADRO VII: perfil amino acido sangue total (pMOL/L) MEDIA + SEM)

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0.17 1.02	0.13 1.02	0.27 1.09	0.24 1.05	0.36 1.20	0.36 1.09	0.32 1.09	0.27 1.05	0.33 1.11	0.22 1.10	0.29 1.11	0.15 1.04
0.06 1.03	0.04 1.02	0.30 1.02	0.06 1.04	0.07 1.01	0.13 1.01	0.04 1.03	0.06 ♦.04	0.08 1.01	0.12 1.01	0.06 1.01	0.09 1.01
1.20 1.23	1.11 1.17	1.36 1.30	1.62 1.18	2.24 1.27	2.25 1.21	1.59 1.23	1.70 1.26	2.57 1.48	2.29 1.42	1.98 1.30	1.43 1.09
0.11 1.02	0.14 1.05	0.11 1.03	0.17 1.02	0.12 1.03	0.16 1.01	0.09 1.02	0.14 1.02	0.13 1.02	0.16 1.01	0.10 1.01	0.15 1.01
0.19 1.01	0.21 1.04	0.20 1.01	0.37 1.05	0.20 1.04	0.32 1.04	0.22 1.03	0.37 1.07	0.21 1.03	0.80 1.04	0.22 1.01	1.01 1.06
0.09 1.003	0.11 1.02	0.09 1.01	0.17 1.03	0.11 1.03	0.17 1.02	0.10 1.02	0.17 1.03	0.11 1.02	0.27 1.03	0.10 1.003	0.29 1.02
0.16 1.01	0.28 1.12	0.16 1.01	0.23 1.05	0.18 1.05	0.21 1.03	0.16 1.02	0.26 1.04	0.17 1.02	0.42 1.05	0.17 1.001	0.44 1.01
0.44 1.02	0.59 1.17	0.42 1.02	0.77 1.13	0.50 1.12	0.69 1.16	0.47 1.07	0.80 1.14	0.49 1.0?	1.49 1.11	0.X8 ; .01	1.75 * 07
69.8 52.8 118.5 1 18.4	63.5 17.0	68.3 14.4	96.4 15.2	82.8 15.9	65.2 110.3	62.5 19.6	83.6 17.0	85.9 18.9	75.9 111.8	70.8 15-4

QUADRO IX: FLUXO AMINO ACIDO QUARTO POSTERIOR (pMOL/MIN/KG. MEDIA+SEM) salina. 11%BCAA ’ itl BCAA_àíteçaa

	«*	2**	CLN	HEAA~	6»	24·	CLN	KIAA
6*	2*’		24·	6*	24*	6’	24·
CLN	-2.6»	-1.71	-1.19	-0.16	-2.10	-1.92	-1.92	-1.24	-0.73	+0.74	-2.00	-4.13
41.07	4.70	4.46	4.82	4.62	41.72	:.60	4.44	4.60	41.76	4.32	11.45
	-2.19	-0.72	-0.92	-0.73	-1.08	-0.95	0.98	-2.55	-0.97	-1.99	-1.17	-1.49
ALA	4.52	41.26	4.23	4.*4	4.28	4.25	:.84	4.84	4.22	4.98	4.09	1.67
CLY	-1.36	-0.56	-0.66	-0.26	-0.66	♦0.47	0.05	-0.89	-0.44	-0.78	-0.39	-0.25
4.36	41.05	4.20	4.31	4.19	4.72	.40	4.53	4.14	4.39	4.21	1.25
AXC	-0.63	♦0.12	-0.29	-0.09	-0.13	♦0.28	0.28	-0.26	-0.11	-0.28	-0.13	+0.02
4.1*	4.72	4.13	4.25	4.07	4.11	:.38	4.22	4.24	4.24	40.06	1.16
SER	-0.49	+0.09	-0.11	♦0.11	-0.14	+0.37	0.50	+0.65	-0.14	-0.13	-0.22	+0.16
4.11	4.49	4.26	4.23	4.07	4. 29	:.*5	4.50	4.10	4.22	4.11	1.06
ASP	*0.0«	+0.19	-0.01	+0.02	-0.00	-0.03	•0.02	+0.00	♦0.03	-0.24	+0.01	-0.09
4.0*	4.12	4.01	4.05	4.01	4.Π	:.04	4.08	1.03	4.21	4.03	i.ii
A5N	-0.22	-0.14	-0.07	-0.14	-0.11	-0.38	•0.15	-0.12	-0.C7	-0.32	-0.08	-0.12
♦0.9	4.11	4.04	1.04	4.04	4.29	:.09	4.13	4.05	1.13	4.05	1.05
CLU	♦0.10	+0.21	♦0.06	♦0.08	+0.06	+0.17	>-0.11	+0.23	+0.16	♦0.21	-0.01	-0.10
4.16	4.11	2.07	1.02	4.07	4-09	:.06	4.13	1.04	4.15	4.03	1.09
EIS	-.44	-0.19	-0.09	+0.08	-0.03	-0.05	0.34	-0.24	-0.03	-0.25	-0.06	-0.03
2.09	4.44	2.17	4.20	4.14	4.19	:.27	1.36	1.10	1.22	1.12	1.01
TYR	-0.26	-0.0Í	-0.13	-0.11	-0.13	-0.04	•0.19	-0.14	-0.10	-0.18	-0.07	-0.06
4.09	4.40	2.02	4.04	4.04	4.06	:.06	4.05	1.01	1.09	1.03	1.0
TAU	-1.05	♦0.76	-0.23	♦0.18	-0.27	♦1.39	0.08	+0.24	-0.08	-0.48	♦0.21	-0.50
1.33	12.18	2.26	4.51	4.10	4.74	:.61	4.39	1.15	1.34	1.07	1.1
ΚΓΤ	-0.32	-0.33	-0.23	-0.59	-0.61	-2.13	-0.74	-1.66	-0.21	-1.69	-0.26	-0.56
2.09	1.33	2.11	4.28	4.40	41.08	:.41	4.66	1.06	1.35	1.16	1.21
TES	-1.06	♦0.72	-0.30	-0.27	-0.07	+1.28	♦0.19	-0.13	-0.06	+0.57	♦0.2B	-0.27
2.10	4.66	4.13	4.32	4.43	4.67	:.37	4.46	4.11	4.35	1.17	1.1
	-0.37	-0.20	-0.12	-0.19	-0.13	-0.12	-0.14	-0.13	-0.14	-0.27	-0.07	-0.16
ΡΗΣ	20.5	4.36	4-04	4.08	4.03	4.03	:.09	4.15	1.08	4.15	1.03	1.12
VAL	-0.46	+0.33	♦0.14	♦0.02	+0.31	♦0.49	♦0.62	♦1.12	+0.67	♦0.37	+1.34	+ 1.26
4.17	4.68	4.06	4.11	4.26	4.23	♦.46	41.01	1.23	4.45	1.17	1.65
ILE	-0.24	♦0.12	♦0.08	+0.06	+0.27	+0.42	♦ 0.49	♦0.39	♦0.42	♦0.51	+ .80	-0.97
4.03	4.30	4.02	4.08	4.19	4.15	:.21	4.15	4.04	4.21	4.07	1.48
UU	-0.43	♦0.04	♦0.06	-0.08	♦0.30	+0.50	♦0.51	♦0.57	♦0.61	♦0.69	♦ 1.14	<♦1.4*.
4.09	4.54	4.07	4.08	4.25	4.24	1.33	4.39	1.06	4.33	4.13	1.68
TOTAL	-1.1*	♦0.49	♦0.28	-0.03	♦0.88	♦ 1.40	♦1.64	♦2.09	♦ 1.71	♦1.57	♦ 3.28	-3.67
BCAA	4.26	±1.51	4.14	4.19	4.57	4.50	1.86	41.54	1.22	1.83	1.18	11.43
TOTAL	-19.05	-3.59	-6.52	-3.25	-7.39	-1.80	-7.70	-8.42	-2.50	-7.40	-3.27	-7.6C
	44.06	412.1	41.81	43.07	4.52	46.40	:5.90	11.90	12.50	18.70	11.62	12.91

Exemplo £ ús Efeitos da Dieta Oral Enriquecida com Glutamina sobre o Intestino Delgado após Resseccão Intestinal

Introdução crescimerito compensatório do intestino delgado após ressecção parcial envolve todas as camadas da parede intestinal, mas é dominada pela hrfrerplasia das vilosidades. A altura das vi los idades aumentadas e a profundidade da cripta são acompanhadas pela dilatação e alongamento da porção intestinal restante CWilliamson, R.C.N., N. Engl. J. Med., 238:1333-1444 (1373)). A ressecção do intestino delgado é seguida por alterações morfológicas e funcionais adaptativas. cons t· i tui um es t i mu lo impor tante

Provou-se que a ingestão oral na regulação da hiperplasia da mucosa após ressecção oral (Levine et al., Dig. Pis. 21:542-545 (1376)). Cfs elementos nutritivos no lume intestinal são importantes para a manutenção do crescimento normal da mucosa e se não se mantiver a ingestão oral após ressecção do intestino delgado, o intestino residual perde o seu peso e torna-se hipopléstico. Os doentes com um intestino curto após ressecção do intestino delgado são mantidos com alimentação parentérica,' a sua sobrevivência depende da capacidade do intestino residual para se adaptar. A utilização de dietas elementares e de alimentação parentérica permite um tempo suficiente para o desenvolvimento da adaptação intestinal e um lento regresso a ingestão oral completa (Wsser , E. , Gastroentero 1 ogy 71 ί 146— 150 (1376 ) ) .

A GLN constitui uma importante fonte calórica para os enterocitos, e a sua utilização pelo intestino parece aumentar após o stress cirúrgico (Souba, W.W., et al . , Surger y 34 ' 342 (1333)). A GLN pode servir como um factor trófico local,

- 60 promovendo o crescimento da mucosa quando se desenvolve hipoplasia intestinal.

zr·.

A finalidade do presente estudo consistiu em testar os efeitos da alimentação suplementada com GLN sobre o crescimento das células da mucosa do in-testíno delgado num sistema de modelo experimental in vivo, com ressecçâo subtotal, que proporcionou tanto um stress sistémico como um estimulo para a hiperplasia da mucosa intestinal.

J

B. Ma. te r i a i s e Mé todos

1. Preparação de Animais

Ratos Wistar machos, pesando 175-200 gramas, comprados em Charles River Breeding Laboratories, Inc., foram deixados aclimatar-se ao laboratório durante 5 dias. Proporcionou-se aos ratos livre acesso à água e foram alimentados com dieta chinesa Purina. Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais e pesados de dois em dois dias. Após aclimatação, os ratos com aumento de peso normal foram divididos ao acaso em quatro grupos.

l;

No primeiro dia do estudo, os ratos foram anestesiados com injecção intraperitonea1 (i.p.) de pentobarbital (50 mg/kg). 0 abdómen foi aberto por meio de uma incisão mediana, sendo a total idade do intestino delgado desde o ligamento de Treitz até á válvula ileocecal exteriorizada e medida duas vezes sem est-icamento por meio de um longo fio preto. Foi determinada a média das duas medições. Realizou-se então uma ressecçâo de dois terços do intestino delgado começando a 5 cm de distância do ligamento de (Surgery of the Digestive System

Springfield, Illinois, pp 32-35,

Treit-z, pelo método de Lambert of the Rat, Charles C. ihomas.

413-416 (1965)). As margens da resseccSo foram anastomosadas de extremidade a extremidade com proleno 6-0. 0 intestino foi colocado de novo na cavidade abdominal e a parede abdominal foi encerrada com proleno 2-0. 0 grupo de controlo foi submetido a uma operação simulada, sofrendo secção transversal e reanastomose do intestino delgado na porção distai, sendo medidos dois terços do comprimento local começando a 5 cm de distância do ligamento de Treitz. Os animais foram colocados separadamente em gaiolas metabólicas e, comeíando no dia a seguir á cirurgia, foram alimentados oralmente aos pares com uma dieta de controlo equilibrada (-GLN) que proportionou quantidades adequadas de hidratos de carbono, lipidos, amino ácidos, vitaminas, e sais ou uma dieta suplementada com GLN (+GLN) que era idêntica exceptuando a substituição de uma fracção de amino ácidos não essenciais por GLN. 0 conteúdo de GLN era ou 0 ou 25% dos amino ácidos, o que contrasta com a dieta normal, em que a GLN representa ~5% dos amino ácidos.

2. Preparação de Dietas Suplementadas com Glutamina

As dietas orais definidas continham 427 calorias/100 g e incluíam 0,2% (p/p) de cloreto de colina, 10% de óleo de milho, 46,9% de branco da dextrina, 23,4% de sucrose, 5% de mistura de sais, 0,5% de mistura de vitaminas. Ambas as dietas consistiam em 14% de amino ácidos, incluindo um total de 7,17% de amino ácidos essenciais e um total de 6,33% de amino ácidos não essenciais. A dieta sem GLN (-GLN) continha 0,937% de cada um dos amino ácidos alanina, asparagina, ácido aspártico, prolina e serina. A dieta enriquecida com GLN C+GLN) continha 0,237% destes amino ácidos e 3,5% de GLN. Assim, a GLN representava 25% da totalidade dos amino ácidos e 51% de amino ácidos não essenciais na dieta +GLN.

Preparação de Tecidos

Após 7 dias de alimentação, os ratos foram sacrificados. Foram abest-esiados com injecção i.p. de pentobarbi tal (50 mg/kg). 0 abdómen foi aberto e a incisão foi prolongada até à cavidade torácica. Foram colhidos cinco ml de sangue por punção «· * do ventrículo direito para^determinação do amoníaco no sangue e dos níveis de GLN no plasma. 0 intestino foi recolhido imediataf mente após a colheita de sangue. Removeu-se a totalidade do intestino delgado com separação cuidadosa do mesentério, mantendo aproximação da serosa intestinal. 0 intestino removido foi suspenso sob tensão fixa de 4,5 g, e foram marcados 9 pontos. Rara os ratos com resseccão do intestino, pontos de 5, 10 e 12,5 cm proximais da anastomose que representavam o jejuno proximal e o duodeno distai, e pontos 2, 5 e 10 cm distais da anastomose que representavam o íleo proximal residual próximo da anastomose, e pontos 5, 10 e 15 cm proximais da vãlvula ileocecal que representavam o íleo distai residual, foram marcados com alfinetes rectos feitos passar através do intestino. Os seis segmentos intestinais foram separados. Para os ratos do grupo com operação simulada, os dois segmentos proximais foram marcados a partir do 1 cm distai até ao ligamento de Treitz e medidos para cima. Os segmentos la, 2a e 3a foram lavados em solução salina gelada e embebidos em formalina tamponada a 10% durante 4 horas, sendo então transferidos para etanol a 70% para fixação. Os segmentos 1b, 2b e 3'b foram lavados em solução salina gelada, sendo os seus lumes abertos e calculados os seus pesos húmidos. Os segmentos intestinais foram transferidos para 5 ml de solução salina gelada e picados com tesouras'afiadas. Foi preparado um produto homogéneo, usando dois períodos de quinze segundos num homogenizador de Polyt-ron (Brinkman Instruments, Westbury, NY), seguindo-se sonicacão com um sonicador (Heat System Laboratories, Plainview, NY) ligado para o ponto 2 da corrente eléctrica, durante trinta segundos. Os produtos homogéneos salinos para análise de DNA e de Proteína foram a rmazeπados a 3O ®C.

4. Né todos Analíticos

Os produtos intest. ynais homogenizados foram nalisados em relação· à proteína total pelo método de Lowry. 0 DNA foi determinado de acordó com o método de Burton (5'iochem 62 ! 315-323 (1365)). Os cortes histológicos foram embebidos em parafina, corados com hematoxi1rba eosina, e examinados em microscópio óptico com uma ampliação de 40X. Foram escolhidos vinte vilosidades completas bem orientadas, altas, representativas a fim de medir a espessura da mucosa e a altura das vilosidades usando uma peça ocular para mic romet-r ia, sendo obtido um valor médio. Foi contado o número de vilosidades com o intestino colocado na linha horizontal central do campo aumentado 40 X.

C. Resultados

Durante os primeiros 5 dias, houve um aumento progressivo no consumo de alimentos de 10 g/dia para 15 g/dia e, em seguíQd., ct ingestão de ai imentos manteve se constante. Apesar oa ingestão idêntica das duas dietas nos animais alimentados aos pares, a taxa de aumento de peso nos dois grupos foi diferente no periodo imediatamente pós operatório. Nos animais de controlo, o peso corporal manteve—se constante durante os 3 dias pós operatórios e em seguida, aumentou iinearisente a uma taxa de 5 g/dia. No grupu al imentaoc* com uLN, náo houve periodo* dé af ro*uxamento, mas sim um aumento de peso imediato* e contínuo de 5 g/dia começando no* primeiro dia após a operação. Nos segundo e terceiro* dias após a operação, o peso corporal apresentou-se significativamente mais elevado no* grupo alimentado* com GLN do gue no grupo de controlo* Cp<0,05). Embora o peso corporal aumentasse subsequentemente ao após a operação (32,0 ± 2, mesmo ritmo nos animais com ambas as dietas, o maior peso corporal no grupo alimentado com GLN persistiu ao longo do oitavo dia vs. 23,7 ± 3,7 g de aumento cumulativo de peso, p<0,03). A análise do esqueleto indicou gue o aumento de peso não resultava de uma acumulação da água total do corpo (71 ± í’% em +6LN vs. 73. ± 1%'em controlos -GLN), mas gue resultava. de um efeito da GLN sobre a massa magra corporal. A r

entre a concentrarão de GLN na dieta e a alteração corporal durante os primeiros 3 dias após a operação foi estudada em animais adicionais/ Foi necessário aproximadamente 25% de amino ãcidos da dieta sob a forma de GLN para um efeito máximo de c resc imento.

relação do peso

Λ' aumente

Σ¹ ρ e GLN foi associado ac duais de jejuno e do íleo soma total do peso do tecido intestinal corporal com a dieta suplementada com aumento de peso dos segmentos resiNo terceiro dia após a operação, a era de 3,55 ± 0,15 g no grupo alimentado com GLN e 2,37 ± 0,10 g nos animais de controlo (p<0,05). No oitavo dia após a operação, os pesos intestinais tinham os valores de 3,30 ± 0,23 e 2,31 ± 0,15 g, respectivamente (p<0,05). O aumento no peso intestinal contribuiu em apenas 5% para a alteração total no peso corporal na dieta suplementada com GLN e, assim, o efeito da alimentação com GLN incluía mas não se limitava ao intestino.

A celularidade do jejuno e do íleo foi avaliada mais directamente determinando o conteúdo de DNA e por histologia que. n t i ta t i va. (Que.d i· ο X ) . Com alimentação com GLN, houve um tercei ro conteúdo de DNA no jejuno no dia e no íleo tanto no terceiro como no oitavo dia após a operação . Em comparação com animais de controlo não operados, a combinação de ressecção e de administração de uma dieta elementar aumento significativo no suplementada com GLN, nutritivamente adequada, resultou num

6S (λ aumento de 54% no conteúdo jejunal de DNA por cm no terceiro dia após a. operação, Esta hiperpiasia adequada diminuiu em cerca de metade quando a GLN na dieta foi substituída por uma mistura equilibrada de amino ácidos não essenciais. As medições histológicas da espessura da mucosa confirmaram geralmente os achados relativos ao conteúdo ‘de DNA * (Quadro X). Com a. dieta suplementada com GLN, um aumento na altura média das vilosidades no jejuno e r

íleo foi aparente no terceiro e oitavo dia. após a operação. Esta resposta limitou-se às vilosidades, sem qualquer efeito da GLN

J sobre quer a. cripta, quer a espessura da. camada muscular submuco66

Quadro X. Efeito da glutamina como um componente de uma dieta oral definida sobre os segmentos residuais de intestino após ressecçSo de 60% do intestino delgado.

Dia 3 F'ós-opç!*atór io

Dia 3 pós-operatório —GEN +6LN -GLN +GLN

DNA <,ug/cm) Je juno í leo

462±22 ^J

539±40$

370±26

387±38

460±29

554±22.f

466±35

543±23#

Al tura

V i 1 os i dade < ;jM ) 640±27

Jejuno íleo 490+27

778±28*£

568±24*

715±3S

535±37 •S6S±34i'$

74S±4S-t

F' r o f und i dade

Cr ipta<ajM )	280±14	270±13
	Jejuno
O	i 1 Espessura	274±12	280± 19
	Mus cuia r ( ajM ) Jejuno	130±8	130+11
0	í 1 eo	12 5 ±9	143±10

246±16

237±30

130±16

13S'±17

269±17

269±25

120±12

147±15

Segmentos de jejuno definidos com 3 cm foram obtidos no 32 e 32 dias pós-operatór ios, foram homogen izados, e analisados quanto ao conteúdo de DNA (Burton K. et al., Biochem J. 62:316 (1956). Em animais desta idade que não foram submetidos a ressecção, o conteúdo de DNA do jejuno é ~3S0 wg/cm. Segmentos adicionais de jejuno e íleo dos mesmos animais foram fixados em forma1ina tamponada a 10%, deshidratados com etanol, embebidos em parafina n, cortados em seccSes longitudinais de 10,u, e corados com bematoxi li na eosi na .. Nunr-eVisaio cego com lâminas codificadas, foram usadas 15 vilosidades bem orientadas e preservadas (5/lámit nas em 3 lâminas) a fim de det-erminar a altura das vilosidades, a Profunoioade das criptas, e a esp-essura Muscular com um microscò* pio equipado com uma peça ocular para micrometria. Os dados representam média ± SEM para. 9 a 12 pares. -GLN = 0% de glutamina, +6LN = 25% de glutamina. Tp<0,05, á'b'p<0,01 , +6LN vs . -GLN por

f.í ;te-t· não ac par ei:

efeito da GLN sobre a altura das vilosidades foi máxima quando GLN representava 25% do peso total de amino ácidos e assim 51% de amino ácidos não essenciais na dieta. Em concentrações mais baixas, não foi evidente um efeito consistente sobre ambos o jejuno e o íleo. Quando o conteúdo de GLN foi aumentado até 31,25% e outros amino ácidos não essenciais foram ainda diminuídos, perdeu-se o efeito trófico sobre a mucosa intestinal. Isto resulta aparentemente de uma tão vasta alteração da composição de amino ácidos da dieta para acomodar GLN gue os outros amino ácidos se tornam limitativos. 0 fornecimento de GLN como 25% da totalidade dos amino ácidos resultou num aumento modesto mas significativo nas concentrações de GLN no plasma <S00 ± 40 jri no o i a v;

676 ± 21 no dia

Não houve aumento nos niveis plasmáticos da ácido glutâmico ou da amónia. Assim, uma dieta em gue GNL represente 25% da totalidade do;

a m ino á. c i d o s 1 · a um aumento do peso pós-operatório mais r-ápido e a hiperpdaaia da mucosa intestinal sem qualquer evidên cia oe excesso de GlíM ou de acumulação de produtos finais do metabolismo do GLN tais como amónia ou ácido glutâmico.

Η Η Porque é frequentemente difícil administrar quantidades adequadas de agentes nutritivos entéricos a. doentes que requerem apoio nutritivo, especialmente quando o processo patológico subjacente se associa a. um signi f i cati vo envolvimento do tracto gastrointestinal , avaliámos os efeitos produzidos pela GLN proporcionada como um . componente de uma. dieta nutri ti vamente inadequada. Os ratos foram submetidos ao mesmo processo de r

ressecção intestinal a 60% sendo então controlados com alimentação aos pares ou dietas suplementadas com GLN que proporcionaram

J adequados amino ácidos, vitaminas, e sais equivalentes à dieta completa mas 50% menos calorias totais. Após 7 dias de dietas com restrição calórica, verificou-se um ligeiro aumento do peso corporal no grupo suplementado com GLN, mas pouca alteração no peso com outra dieta. Em vez do déficit calórico, os acentuados efeitos do GLN sobre a mucosa intestinal eram ainda evidentes (Quadro XI). No 72 dia pós operatório, o peso da mucosa húmida teve um aumento de 36% no jejuno e de 40% no íleo com a dieta

c om	GLN
DNA
te.	e:st

com a. dieta de controlo.

IJ um aumento de 43% e de 32%, confirmados por estudos histológicos quantitativos, que demonstraram aumentos consistentes na espessura da mucosa no jejuno e no íleo. Mesmo no grupo com deficiência calórica, a GLN dietática sxsrcsu os seus efeitos tróficos e crescimento da mucosa intestinal.

especia 1 mente manteve o

Quadro XI. Efeito da GLN como uni componente de uma dieta oral definida sobre os segmentos intestinais residuais após ressecçSo de 60% do intestino· delgado.

-GLN +6LN

Peso da Mucosa (mg/cm) •Je juno c -+ ·? g , X.-L.X- _t z?

i leo ,7

DNA Mucosa <,u6/cm)

Jejuno 180±l íleo 217±2

66±15* 87±22***

Espessura Mucosa (,uM) fc? J Lt i !¹?

í leo

826±6 Ϊ 788+27

1042±27t-t

325±40t

Os segmentos intestinais foram obtidos e analisados tal como· foi descrito· na legenda do Quadro X. Os dados representam média ±SEM para 10 pares de animais estudados 7 dias após ressecção parcial do· intestino. -GLN = 0% de glutamina, +GLN = 26% de GLN; tp<0,05, t;fp<0,01 , :t-ttp<0,001 , +GLN vs. -GLN por teste-t· não· 3. C* 3 P 3. Γ fc? 3 :,,3 us efeitos ia GLN são também evidentes quando a GLN e proporc ionada int ravenossmenie. Guando ra i f or am com nutrição parentérica total ( 1'NP) durante 7 dias após man t idos ressecç a o i π tes t ina 1 pa r ciai usa. nd·;

fórmula sem GLN indicada para apoiar um crescimento óptimo no

Nu c r

36:11 jejuno e permaneceu ( 1382') a a ιns1 te rada estimulo trófíco da 'ressecção compenss.ao pelas consequênc ias tracto gastrointestinaL· (Levine 67:375 <1374). A adição de GLN rato (Popp, M.B., et ai., Am. J, 1 tura. das vi los idades diminuiu no no ileo (Quadro XII). Assim, o pa r c i a1 do i ntes t i no de1 gado f o i da. remoção do alimento do lume do , G.N., et al., Gastroentero1ogy à f ó r m u 1 a T P N e m

Quadro XII

Efeito da GLN como um nutritiva parentérica intestinais residuais i n tes t i no de1gado.

componente de um fórmula total IV sobre segmentos após ressecção de 50% do

Pré-ressec ção -GLN +GLN

Dias

Após ressecção -GLN +GLN

Altura da

V11 os i dade (,ui'1 ) •Jejuno 475±15 451 ±1 íleo 400±24 419+1

53+22 53.9+35·##

72±38 4S5‘±15#

Os dados representam média ± SEM para 9 animais. GLN — O% glutamina j -fr-GLN ⁼ 25% glutamina. ##P'\O, OOl t +'_jLN vs . GLN por teste t não aos pares P 0,005#, pós ressecção vs pré ressecção por teste-t pares de #P<0,05, P<0,05 não aos vez de uma fraccão do componente de amino ácidos não essenciais (25% do total de amino ácidos), restabeleceu a resposta hiperplásti ca. pós ressecção (Quadro XII) sem GLN, a al t-ura da no jejuno e no íleo,

Em comparação com a fórmula ΓΡΝ ν’i los idade teve um aumento de 54% e de 51% respectivamente. Consistente com estes dados r eg ime revelou et a 1 . , animais, a adição do dipéptido L a 1 anil L.—glutamina a um de alimentação intravenoso num estudo humano recente melhorar o balanço pós operatório do azoto (Stehle, D., Lancet i:231 (1959).

Estas observações com dietas oral e intravenosa suplementadas com GLN são compatíveis com a hipótese do amino ãcido não essencial GLN se tornar um elemento nutritivo essencial a seguir ao stress operatório, e à ressecção intestinal.' Quando i nc 1 u i da c οιϊϊ o um c ompOnente de uma dieta or a 1 definida, egu i 1 1 brada, a GLN exerce um efeito generalizado anabólico anti-cata.bólico sobre os tecidos do organismo e evita o periodo transitório de perda de peso associado ao stress da operação. No intestino, gue e um tecido gue normalmente utiliza GLN a uma taxa elevada e gue é sabido aumentar a sua extracção de GLN em resposta ao stress, torna se evidente um efei to trófico claro da GLN sobre a mucosa. isto resulta num aumento oa resposta oe hiperplasia adaptaiiva á ressecção parcial do intestino delgado, com aumento da altura das vilosidaoes sedundário a uma população aumentada de en te ro c i to 5. Q aume n to guando o fornecimento agentes nutritivos são da celularida.de intestinal ocorre mesmo calórico è inadequado ou quando todos os a d m i n i s t r a d o s p* e 1 a via i n t r a v e η o s a .

Os mecanismos destes efeitos são desconhecidos. A GLN poderá ter efeitos reguladores sobre as vias bioquímicas específicas, servindo como um combustível ou precursor biossintético, actuando como um secretagogo, ou realizar todas estas funções. Seja qual for o mecanismo especifico, estes estudos proporcionam evidência de que a. GLN constitui um agente nutritivo necessário para apoiar o crescimento da mucosa intestinal. 0 aumento da massa uorporal magra a seguir* á ressecção intestinal indica que a GLN pode ter também efeitos anabólicos sobre o músculo ou sobre outros tecidos. Tomados em conjunto, os dados experimentais apoiam a hipótese da GL.N constituir um agente nutritivo condicionalmente essencial durante períodos de stress. A produção endógena de GLN parece ser inadequada, resultando numa descida das resultando numa

- 73 concentrações do plasma e dos tecidos e em alterações assoeiaoas da morfologia dos tecidos. 0 fornecimento de GLN exógena restaura as concentrações de GLN livre e estimula uma resposta trófica gue inclui efeitos sobre a mucosa intestinal e sobre o crescimento total.

Exemplo 7

Vi*

Preservação da Mucosa do Intestino Delgado Usando Alimentação parentérica Enriquecida com Glut-amina

A alimentação parehtferica dá origem a atrofia da mucosa do intestino delgado (Johnson, L.R., et al . , Gas t· roentero 1 og y r

68:1177-1183 <1375)). Esta resposta pode estar relacionada com uma diminuição nas secreções gastrointestinais e nas hormonas

J tróficas e também com uma relativa falta de agentes nutritivos específicos necessários para a proliferação dos enterocitos. A GLN constitui um importante combustível oxidativo para o intestino delgado mas não ss encontra presente nas soluções parentéricas padrão. A fim de determinar a influência da GLN dietética sobre o intestino delgado foi avaliada a resposta â administração de soluções parentéricas enriquecidas com várias concentrações deste amino ácido.

A. Mate r i a i s e Métodos

g) foram equipados prolongada. Physiol. 2 ga i o 1 as nte

Ratos Wistar machos condicionados <n=42, peso 210-230 submetidos a cateterização venosa jugular e foram com uma série de torniquetes que permite um infusão em animais não restringidos <Burt, M.E. et al . , J. 88:H599-603 <1980)). fodos os ratos foram alojados em tabólicas individuais e foi-lhes permitido o acesso à pa a η i m a is* de l o n c- r o 1 o r e c e b e r a m O, de infusão salina e dieta chinesa Purina para de ratos receberam alimentação i.v eram isoazotosas <0,9 g azoto/100 lOOml), e continham concentrações ciais, amino âcidos não essenciais ácido nSo essencial de cada so ratos ad Iibitum. Três grupos . Todas as soluções nutritivas ml) e isocalóricas <38Kcal/iguais de amino ácidos essene dextrose. 0 componente amino lução foi ajustado a fim de proporcionar concentrações de GLN de 0,1 ou 3 g/100 ml. As soluções pa r en té r i c as f o r am i π f und idas a uma taxa de 4 8m 1 / L4 horas. A eliminação de urina e a excreção de azoto foram medidas diáriamente. Õs animais foram sacrificados 7 dias a seguir à alimentação parentérica e obteve-se sangue para determinação das concentrações oe GLN e de amdna. Hmostras tanto de toda a espes sura dos segmentos de jejuno como da mucosa foram obtidas a partir de cortes do intestino. Todas as amostras foram pesadas, e os produtos homogéneos foram ensaiados quanto a DNA e a proteína. Foram preparados cortes histológicos parafinados com 5um de espessura. As medições da a 11ura oas vi1osidaoes intestinais, do número e da espessura da mucosa, foram realizadas numa técnica c ega .

Cj L..’ .

P\ cf 1 't-cxCf¹-¹ S & 0 í. C U zi cb. Q

U peso líguido, DNh, proteína e altura das vilosidades diminuíram em todos os ratos gue receberam alimentação i.v. em comparação com os controlos alimentados oralmente (Quadro XIII).

A concentração de GLN no plasma soluções contendo GLN. 0 peso s i gn i f i cat ivamen te em compa r ac So sem GLN. 0 peso do jejuno em tendência para aumentar com a resposta, não tenha sido estatic tanto da mucosa como de toda. a seguir à infusão de GLN com cc a. I te r a ç o e s f o r a m a c o rϊ ρ a n in a o a. s c resc i men to o a mucosa . A a. 1 Lura c mucosa aumentaram de um modo depc a quantidade de GLN administradc um balanço de azoto positivo mas aumentou a seguir à infusão de da mucosa do jejuno aumentou com ratos gue receberam soluções toda a sua espessura não teve administração de GLN embora a sticamente significativa. 0 DNA espessura do jejuno aumentou a ?ncsntrações de 2 e 3%. Estas por evidência histológica do ias vi 1 osioades e a espessura da. indente da dose em proporção com .*.. í uQus os a 11 i ma i s a.ρ r ese n t a r a. m os ratos gue receberam a solução com 2% de GLN retiveram a maior quantidade de azoto ao longo do

1-UdO .

A administração de GLN nas soluções resulta num aumento do peso da mucosa do jejuno, do conteúdo de DNA e da altura das vilosidades quando os animais são mantidos com uma alimentação i.v. Um aumento na massa da mucosa do intestino delgado pode ifielhorar a função do intestino delgado e facilitar a introdução da alimentação entérica. A GLN pode ser um agente nutritivo necessário para o suporte da mucosa que não está presente em soluções parentéricas padrão actuais.

Quadro XIII

	0 GLN	2% GLN	3% GLN	•'CHINESA''
	< 11-,10/ ·.	’ (n=ll)	(r,= 10'>	(n=i1)
GLN PLASMA (umoI/L)	5*90 , 5±42,4 j	1105, 8+98, Sá'	717,1±4S
ESPESSURA TOTAL P (nig/cm)	so,s±o,s	31,4±1,0	32,0+0,6	46,6±3,6
PESO MUCOSA (mg/cm)	17,7±0,7	20,4±1 , Í*X	20,3±1,0**	29,3+2,3
DNA JEJUNO ug/cm )	2 52 , 5'±5; 5	279,9+7,3**	303,1±19,4*	370,2+33,0
DNA MUCOSA < ug/cm>	101,7±5,9	134,0±7,1***	125,í±7,6**	171,Õ±12,7
ALT. VILOSIDADES Cum>	266,5±S,4	294,0±7,9**	306,4±9,9***	405,6+17,3
ESPESSURA MUCOSA < um >	422,6±9,7	44S,1±8,9	452,6±í1,5*	5S9,6±20,9
				*

p<0,05, **p<0,025, ***p<0,005 vs GLN

G L N = g I u t· a. m ina

Exemplo 8

Ef ei to da A1 i mentaç ão parentér ica. Enr i quec i da c om

Glutamina a Seguir a Tratamento com 5-F1uorouraci1 o tada com da mucosa

Para determinar se, a alimentação parentérica suplemenGLN era vantajosa para a preservação ou reconstituição intestinal'a seguir a. lesão, administrou-se fórmula enriquecida com GLN durante quatro dias antes, e imediatamente a r'Χ“· seguir a tratamento cbm doses progressivamente maiores de 5-fluorouracilo C5-F0), um agente quimioterapéutico que apresenta acentudada toxicidade em relação à mucosa gastrointestinal nos animais e no ser humano (Muggia et al,, 1968; Roche et al., 1970; Sounous et al . , 1977; Stanford et- al . , 1977; Shaw et al . , 1979).

A . Na teriais e Né todos

1. Preparação de Animais o s rat o s furam ρ r epa i¹ ados e a 1 o j a d o s e s s e n c i a 1 m e n t e t a 1 como foi descrito no Exemplo S e Exemplo 7 anteriormente referidos e foraíii reunidos ao acaso em grupos pai·a receberem soluções alimentares parentéricas contendo 0 ou 2 g de GLN/dl .

Lesão Gastrointestinal Induzida, por 5-FU e Infusão com GLN

Õs r a. t	J_‘S	f i' d. frt C d. t ***** È· tz? í' 1 7·** iw ’^y	tal como	foi anter i.ormí
rito e após	U ΠΊ	mínimo oe 3 noras	a segu i r	á recuperac-fc
tesia, grupu	1 z?	de a nimais r e c e b er a m	por injec	ção i.v. lõõ,

e 200 mg/kg de 5-FU. Om grupo de controlo recebeu injeccões de 0,9% de solução salina (0 mg/kg de 5-FU). Cada. grupo de dose recebeu ou 0 ou 2% de GLN. A infusão de alimentação, iniciada 4 horas após 5-FU ou solução salina, foi mantida durante 4 dias a uma taxa de 46 ml/24 horas. Estes tempos foram escolhidos porque certos estudos indicaram que a recuperação da mucosa da lesão por 5-FU se realiza neste estádio (Roche et- al , , 1370), sendo provável que os efeitos da. GLN sobre a regeneração da mucosa se ver i f i quem nesta a. 1 tura_t. *

3. Administrações de GLN antes da Indução da Lesão

Intestinal

J

A seguir à cateterização, os ratos receberam alimento com metade da eficácia durante 12 horas e alimentação com a totalidade da. eficácia (0 ou 2 g de GLN/d) durante os 3 dias subsequentes. 0 5-FU foi administrado i.p. no quarto dia da alimentação parentérica e os ratos foram sacrificados quatro dias mais tarde. Foi escolhida uma dose única de 5-FU (150 mg/kg) visto induzir mal estar geral e grave lesão intestinal sem aumento da mor tal idade. A excreção do azoto urinário foi medida diáriamente sendo calculado o balanço do azoto.

4. Amostra do fecido

Recolheram-se amostras de sangue e do tecido intestinal que foram preparadas para análise tal como foi descrito nos exemplos atras referidos. Determinou—se o valor da hemoglobina, dos glóbulos brancos e das plaquetas como medição da toxicidade hematológica geral das várias doses de 5-FU.

Nétodos Analíticos e Estatísticos

Τ ooa s as analises f o r aπt normente descrito nos Exemplos 6 realizadas tal como foi antee 7. As análises estatísticas

- .q<> -

foram realizadas usando análises de variância de duas vias c umFet r andu ambas as dietas e a duse de 5—FU. lestes t- na*_* aus pares foram usados para comparar dois grupos de tratamento com uma dose de 5-FU. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas com um valor de p<0,05.

E?. Resul tados r

1. Efeitos da Alimentação Parentérica Após Lesão j

Os animais apresentaram-se geralmente bem durante cerca de 36 horas a seguir a injecção de 5-FU, apresentando-se letárgicos após esse periodo de tempo. Cinco dos 60 animais que entraram no estudo foram excluídos por razões de ordem técnica (não-funcionamento dos cat-éteres ou insuf i c iênc ia da bomba de infusão) e 6 morreram devido ao tratamento com 5-FU (2 do grupo alimentado* com GLN e 4 do grupo* de controlo). De entre os 49 ratos que foram analisados, 23 tinham recebido 0 GLN e 26 tinham recebido 2% de GLN.

a. índices Intestinais peso, DNA e proteína do* jejuno húmido todo;

d i m i nu iram a seguir à administração de 5-FU. Contudo, todas estas medições foram significativamente mais elevadas em animais que receberam GLN eni comparação com os controlos que não receberam

GLN;

di ferenç;

) i c ons i ds r á v e 1 m ente súperior ri s e ?<a me m í c r o s c óp i c o oa arqui tectura intestinal nos ratos que receberam GLN, reflectida. nas mediçõe□a mucosa da altura, das· vilosidades (Quadros XIV e b . Keoia to 1 og i a

Enquanto que os niveis de hemoglobina se mantiveram com todas as doses de 5-FU, verificou-se um acentuado declínio nos glóbulos brancos circulantes e na contagem de plaquetas em todos os animais tratados com a... droga independentemente do regime dietético utilizado (Quadros XIV e XV).

r

2. Efeitos da Alimentação Farentérica Antes da Lesão

J

Em contraste com os ratos que receberam alimentação parentérica após 5-FU, aqui verificou-se um notável aumento da taxa de mortalidade; 6 de 12 animais no grupo GLN morreram em comparação com 2 mortes de entre 12 no grupo alimentado com GLN. A diferença foi estatisticamente significativa apenas no nivel p = 0,06 (teste exacto de Fisher).

a. índices Intestina, is

peso do jejuno e da. mucosa, húmidos foi signi f i cati vamente mais elevado nos animais alimentados com GLN, tal como aconteceu com o DNA e a. proteína da mucosa, mas a. espessura total, DNA e a. proteína não diferiram nos dois grupos (Quadros XIV e XV). A análise histológica, confirmou os achados bioquímicos com aumento oa espessura oa mucosa e da al tura das vi losidades nos animais que receberam GLN.

b. Hemato1og i a verificaram diferenças nos parâmetros gicos em qualquer que as contagens i ndependentemente dos grupos: a hemoglobina manteve-se de glóbulos brancos e de plaquetas das dietas (Quadros XIV e XV).

hema to1óenquanto ba i xaram

2· . ULN e__Am I )%' AC I GO» GO F 1 3. -?Πί3. KpÓ5 G F~U

A GLN do plasma mostrou-se eievcnda em todos os animais a. seguir à som i n i s t r a.ç S.o Ge o—FU, mesmo ^uandc* GLN n-^o estava presente na dieta. A libertação aumentada da GLN do músculo neste estado cataoól ico, combi nadai com celular idade diminuída do intestino . e possi velmente um certo grau de toxicidaoe renal induzida por -S-FM) pocíem contribuir para o aumento dos níveis de g*_N c i r c u 1 an te .

j

4. Sa1 a n ç o do Azo to h rettínçêo aumentaoa oo azoto tinha sido demonstrada em d.nimais ^ue receoeram Lz· oe GLN nas sêr ies imc iais do*s estudos. Ver 1 11 l<zírc*.π· se ai t-eraçòes semeiho.nc-es em animais *nue receberam al imsnc·acao parentèr ica. supiemsnc-a.Ga com GLN a.nc-es go tracamento c om ο^- r ú . u oa. i a nç o d i a r i o oe azo to ί o i si qci i f i c a 11 v amen i-e super lor no* grupo a.i imenlado* com oLN a. cê ao sexcc* dia oe al imen

Ct;’ a rxi·enç<·.··.o cumulativa de azoto no*s rato·» com) 4/ oe gl.N foi oe 11όό z c*-G mo oe ricota em comparaçê.O' comi Z-3õ d mg para ratos com 0% GLN <p<0,05).

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Usando análise da variância de duas vias comparando dietas e doses de 5-FU . .QLÍADRO XV índices -Intestinais e Hematologicos em An'imais que receberam TPN Após

Lesão

GLN íí GLN ' . ín-10)

Hemoglobina (g/dl)	10.6 1	0.6	11.5 4	1.5	NS**
Contagem glóbulos brancos	2.9 1	1.0	1.7 4	0.3	NS
(1CT/1)
Plaquetas (1θ’/1)	195 4	54	233 4	55	NS
Glutamina do plasma	1245 4	50	1212 4	135	NS
Peso Jejuno húmido	22.4 4	2.0	28.0 4	1.2	<0.01
(mg/cm)
DNA jejuno (pg/cm)	146 4	17	168 4	9	NS
Proteina Jejuno (mg/cm)	2.1 1	0.2	2.3 4	0.1	NS
Peso mucosa húmida	12.0 l	1.0	14.7 4	0.7	<0.05
(mg/cm)	•
DNA mucosa (pg/cm)	63 1	4	76 4	4	<0.05
Proteina mucosa (mg/cm)	0.8 1	0.1	1.1 4	0.1	<0.05
Espessura mucosa (μ)	359 4	21	416 4	16	<0.05
Altura da vilosidade	203 4	16	247 4	12	<0.05

* Usando teste t não aos pares NS = não significativo

Exemplo G

Ε. t e 1to da A11 menta ç ão Ra reπte r i c a Ε. n r1 guec i da c om

Glutamina a Seguir a Radiação, Quimioterapia, e

T r a. n s ρ 1 a n t a. ç ã o d a. N e d u 1 a ó s s e a.

t ír_st-ír? tístuuu fui raul iZtídu pa.ra determinar num ensaio

Λ clinico cego, a.o acaso, se o fornecimento de GLN na dieta a i, ι d ι ν i d u u s s u c.· r,: a t-1 o ui r r a. d i a. ç a u i- ‘atai d o o r g a η i s m o e / o u a. quimioterapia alterariã^/ o balanço de azoto, melhoraria o resultado clinico e aceleraria a. recuperação gerai .

A população do estudo incluiu doentes já inscritos em prui-uiulus de tra.nsplantações o© medula, óssea autóioga e alogèni

N a t e r i a. i s e M e t o d o s

tes fura m rec r	u ta. o os	entre os ja	inseri tos em
a t a m ento po r	i- r ansp	ι a π ta c ão oa	m e du 2 3. óssea
ni ca. Nes tes p r	otoeo 1	o s o s d o e n t e s	e 2 i s31 ve i s tè?m

íuê.Gêb C ΟΠ'ίΡ Γ cênG i G3.3 êlILTê Ο'=ϊ 1 ·-· 3 03 tO 3. ilOS Gê 3.fliÓO3 G'o XOb j com o diagnóstico de leucemia mieloide aguda <AML) em prirrteira rsniiaa-áu í tr3π =>ρ 1 3.nc·e eiogónico^ _} hML eni segunoa remissão* í trêns P^! í <5 5 *1 ’_· e ·:?. U t G -í. O ^lrí ^:-^J ? ,· 3 1 GU G í» i <? * ή I r_- j. ·_> d 1 S F’ 2 & S 1 C O 3 j 2 1 ií t Ο Γί ϊ ϊ:λ / 3. Π Ο ίϊί ί Ο

Ρ¹ ί ο. ζ.' ν I C 3 cd OL-í I Γ 3.3 i eté G I 3.3 X Π C J.U1 Π GO 1 OL-í C Οίϊΐ Í 3 Π< 1 3 1 Ο* 1 d Ο C Γ ό η ΐ C 3. <Cf1L? . Os doentes neste protocolo requerere.m alimentação parenterg / r ene. i nor nia.

dedicada 3	i nfusão.	Os doentes
normel <bi 2 i	r r ub i na.	t o t a I < 3
31-1 n i na r 1 ,· G	mg/dl),	ausêncιa de
vU nig/dí se?ni	i nsui i na.	o u a. gen t e s

nipoglicémicos orais). Apresentavam-se numa fase estável da sua doença (pur exemplo, em remissão? . us ooentes não tinham perdido mais de 20x> do peso corporal abaixo do seu peso corporal ideal .

2'. E~ s rn 3 d o £ s i- ud o /

Cs doentes foram reunidos a.o acaso em um de dois r

grupos; padrão ou ÍF‘N contendo GLN- As dietas eram isoazotosas e

C ~7

GLN/kg peso corporal/dia’ na solução experimental. 0 doente, os médicos gue realizaram a transplantação e os investigadores gue viram os doentes realizaram um ensaio cego em relação ao grupo de tratamento. Sob este esquema, as necessidades de electrolitos podem variar ao longo do tempo dependendo das condições clinicas e v md i c o pode v ar i ar o c o n t e u d o e 1 e c t r o 1 i t i c o da s o 1 u c ã o dependendo dos níveis sanguíneos e do estado clinico em consulta com os investigadores e com o Nutrition Support Service.

isocalóricas mas continham 0 GLN na fórmula padrão e 0,57 g

Us ooene-οι geriram alimento oral ad libitum ao longe

Registou-se a ingestão oral diária de calorias, proteína, gordura e hiorato oe caroono.

A administração da solução do teste cego foi iniciada ao fim de cinco dias após o dia da transplantação de medula óssea (referido como o dia 0). Após um per iodo inicial de equilíbrio de d dias, a recolha oe toda a urina e fezes começou de 24 em horas duraih ί-!..;o se f izeram recoinas nus bGhL-í 1 Γ1 uí b <Tf3S Γ eC Ofi«eÇ C’L.4 '»S PiOb j-SÍu te; 3 Ρ Γ Ua ί Γϋ3 Ο 3. ΓΗ 3 Π X-S 3 Σ-S Γ C t? I ϊ* 3 Sefii3 Ώ3 Ρ'ό’ζο t Γ 3 HSP I 3Π t-3 Ç 30 ? . ΐ 3 Γ S C Ο 1 f~t 3 S Τ Ο Γ 3 ΓΪΙ Γ ê 1 ί· 3 S ο r ΐ ’ © 5 ρ ο η d © η ο’ ο 3 ο ρ © ν* i ο d ο

Ο 3 ζο *4· *23 3 t· 3. Γ *Σ3 © 3 t Á S d ί.Ά t 3. Ρ de / ί·©ΓΠΡ*Ο dUP 3.nt© Ο A^:-f51 3 ©QUÍpâ d© enf erma--pem 90 pendurou e administrou os sacos de solucSo.

t

V-.

Fizeram-se colheitas semanais de sangue, para análise da GLN, g 1 u ta ma to, a. món ia, a m ino a c i dos , p r o* t e i na v r ea c t i va e prealbumina. Foram obtidas outras amostras de sangue pelo médico de cuidados primários para, moni tor i zação de TPN e da. função dos ι_ι r g ã ·_· s .

Os doentes foram reunidos ao acaso em grupos para r

tratamento ou controlo por investigadores farmacêuticos numa técnica não cega. Os grupos foram equilibrados para diagnóstico e j

no grupo AML na lã remissão, os grupos foram também equilibrados para tratamento (com ou sem irradiação total do corpo).

estudo foi terminado quando o doente já não necessitava de TF‘N tal como foi indicado por três dias consecutivos de i nges to. o o r a 1 a d I i o i t um que a c· i ng i a 50 % oa. s nec essidades c a 1 ó r i

cas. 0 te rc ei ro dia	,-4 -^1 C » I ·’> fe fe ·~·-J Λ*	de	ί n 5 fe 31 â o o p <?. 1	é de f i n i do c orno o fim
de ΓΝΡ. Em todos os	C o. 5 O '5 f	05	doentes forem	inc i ι j i d o ‘5 n fe. fe n fe 113 e
do resultado· final a	P fe Π 3. 3 ’	no c	aso em que receberam pelo menos 60%
O r*. 3 C 3 i Ο Ρ I fe 3 Π c í 3- 3 3 fe.	,rias e	oe	proteina da so	dução em técnica ceqa

durante o periodo de tempo durante o qual foi necessário TPN. 0 protocolo indica que os doentes devem ser afastados do estudo se se passarem 5 dias consecutivos durante os quais eles não recebem nenhuma solução administrada por técnica cega.

3. Administração Alimentar

A aaministrsção de caiorias f oi f ixada em aproxime.da mente 1,5 vezes a taxa metabólica calculada (tendo como base a a ι fu r a e o peso) . A a dm ι n i s t r a ç ão de c a 1 o r í as não* pr o t s i c as· f o* i de aproximadamente 70% de dextrose e 30% de administração· de proteina foi de l , í os minerais foram adicionados em emulsão gorda. A g/kg/dia. Os electrolitos e quantidades adequadas para manter as concentrações sanguíneas dentro dos limites do normal.

As vitaminas foram adicionadas como MVI-12 10 ml/24 horas. A solução de elementos vestigiais foi adicionada conto Lypho-med 1 ml/24 horas. A solução ΓΡΝ foi administrada num plano de trabalho das 4 da tarde às 4 da tarde pelas enfermeiras. Nos doentes gue excederam 20% do peso corporal ideal, as necessidades calórica.s e de proteína basearam-se no p'eso ideal para a idade e para o sexo.

Medi!

Toda a medicação e os fluidos não TF'N foram administrados a estes doentes na. medida em gue foram considerados necessários pelos seus médicos. Todas as drogas e fluidos administrados aos doentes foram registados.

Métodos Adicionais de Avaliação e Aspectos Finais

Os doentes foram avaliados guanto ã sua composição corporal (pré e pós-TPN), massa muscular a meio do braço (pré e pbs tratamento), força do aperto de mão (pré, dias 7 e 21, e pós-TPN), permeabi1 idade á. lactulose classificação da. gravidade da sépsis vs . hospedeiro, classificação da inflamação da mucosa (três vezes por semana), uma avaliação total do bem estar (pré e pós-TPN).

(dias 7 e 21, e pós TPN), (semanal), doença enxerto

Os aspectos finais principais avaliados incluíram! (1) balanço do azotoísemana 1 e semana 3)! (2) Excreção de 3-metil histidina e çreatinina (média de 3 valores da urina recolhida durante os dias 5-7 -da semana 1 e semana 3); (3) CRP (avaliado durante as primeiras 4-5 semanas de ÍPN); (4) Composição corporal; (5) Avaliação semanal da sépsis média; (6) Febre média semanal e média semanal da temperatura máxima diária; e (7) Grau

GVH senta na 1 méd i o .

HH US

ί.Η r.’ P e C Ç-::

τ ι r.a i s oe nienor importáncia a. va.1ιa. dos incluem: (1) Dias em unioaoe (desde o dia da transplantação, 7

O); (2) Dias desde a transplantação ate à recontaminação;

Encargos hospitalares, e carga antibiótica total; (4) Antioiótico(s) regulado(s) vezes o número de dias oe administração, isto e, dias oe antibiótico—apenas enquanto sob administração de TrN e tendo em conta apenas os antibióticos adicionados ao tratamento do doente devido a ihfeccão suspeitada ou conhecida: (5) Dias ate as contagens de leucócitos regressarem a >500 e >1.000 células/cn)''; (6) Dias desde' a transplantação até a contagem absoluta de neutrófilos regressar a >500 células/cm; (7) Permeabi I i dade à la.ctula.se, medida em duas ocasiões no final de dois períodos de estudo de balanço,’ (8) Unidades de plaquetas e de glóbulos vermelhos administrados por transfusão; (3) Dias com TF‘N até 50% de ingestão oral ou descarga,' e (10) -Sensação de bem-estar.

D gg=i<ltados os resultados ooi-ioos com dois doentes são indicados na Figura 7 e Quadro XVI. i'F‘u com dose elevada de GLN induziu uma acentuada melhoria do estado clinico dos doentes submetidos a transplantação. Este tratamento evicou o balanço de azoto pro— gressivamente negativo, fez diminuir a. gravidade da mucosite oral (grandemente induzida pela. quimioterapia), e melhorou o estado geral de saúde dos doentes tal como foi avaliado por 8 critérios clínicos indicados. Conclui-se que a GLN tem um efeito paliativo sobre a saúoe desta ciasse de pacientes gravemente doentes.

EFEITO DE TPN SUPLEMENTADO COM GLUTAMINA A SEGUIR A TRANSPLANTAÇÃO OA MEDULA ÓSSEA

ΓΡΝ

F‘ -5 o r S o

D O Se Ε1evada

GLN

.)

Balanço Azoto Cg/dia) -2,9

Dias Antibiótico^ GO

Dias em Unidade* 46

Dias ate Contaminação’' 36

Ava I i aç ào Muc os i te 2 , -5 +0,6 43

Produto do número de antibióticos regime padrão pelo número de dias e mantido coun antibiótico a d i c i ona ί s adiei ona do s ao· durante os quais o doente

Número de dias durante os quais o doente è mantido em Ambiente Protector (quartos com fluxo de ar laminar) ate se tomar a decisão clínica de os libertar (os critérios incluem CGV > í.00D, apirexia, capacidade de comer pela boca, etc . )

Número de di	3 ’3L-f Γ 3. Π t-bd O ±j PSS. IS	o doente é mantido
es te r i1izado	3 t-b? 1 h’·? Sê Γ p~ Γ Γί'ί x t-1	do contacto· físico·	C Cfí)
indivíduos	con 1i nsdo-5l/ ( usuã 1	mente um memoro da	f 3.ηΐ 11 ia.)

Isto constitui também uma decisão clínica.

EiLéUlELÀ.S-.l.Ç

Eleitos .da Alimentação Rarent-êr iça-Ε?ττ.ί3ν^ε ide £OSI^..U£t^j^sc2t.rg^ç· Fane rea*?. EXóçrino

A alimentação .parenf-èries total (TRN) está associada a atrofia intestinal e pancreática e a insuficiência pancreática exócrina. Investigações recentes demonstraram que a adição* de GLN á. alimentação i.v. atenua a atrofia intestinal associada a 7PN. Alem disso, estudos anteriores revelaram que a GLN que náo se encontra, presente em fórmulas padrão de amino ácidos, constitui um combustível oxidativo preferido para o pancreas e gue uma grande proporção de GLN administrada exógenamente é consumida pelo tecido exócrino pane reá.ti co. Contudo, o efeito das alimentações i,v, suplementadas com GLN soore o pancreas náo foi referióe uma. infusão i.v. de ou om GLN (Glutamina) ou de

do.	Este estudo*	invest igou	os efeitos
uma.	dieta com 2	g/100	mi	enr i quec í da.
uma	CÍ I sd ’.· f?. I S‘ -ír· 1Z.	o* tosa,	1 so	c a Iórica,
c omp	C* '.Ξ' I v óA & 5 Z-	ru tura	GO	pancreas ex;
r i o.
	Materiais e	Métodos

Preparação Animal co nos

Ratos Listar machos foram mantidos tal como* foi oescriExemplos 6-8. Apenas foram estudados ratos gue demonstraram aumento de peso* satisfatório enquanto mantidos sob uma. dieta í'¹ chinesa Purina padrão . Na primeira experiência (n = 32) todos os animais foram submetidos a uma ressecção de 60% do inetestino jejuno-ileal e a catet-erização pela veia jugular emquanto* que os animais numa. segunda experiência (n = 24) foram submetidos a

delgado, us animais alimentados com dieta chinesa (n = IS) , foram incluídos para servirem como referência.

ll ρ e ρ r >zⁱ c e s o* descrito no Exemplo 6.

operatório foi realizado tal como foi

Dos 63 ratos que entraram no estudo não nouve nenhum que fosse excluido dos grupos alimentados

-) d i e t a.

chinesa, enquanto que foram excluídos 13 ratos t

devido a sépsis devido ao catéter, abertura o b s t r u ç S o i n t e s t i n a 1 , m a u f u n c i on a. m e n t o d a. b o m b a

J cateter .

dos grupos 7F'N o a anasiofliose, ou ociusêo do

Protocolo do Estudo

Após cateterização com ou sem ressecção do intestino delgado, os animais foram escolhidos ao acaso para receberem ou dieta chinesa, para ratos (Chow) oral mente, uma solução alimentar parentérica padrão sem GLN (Controlo) ou uma solução enriquecida com 2% oe GLN (Glutamina) por infusão constante durante 7 dias.

As dietas i.v. proporcionaram todos os agentes nutritivos essenciais para o crescimento dos ratos (F’opp et ai . , Amer J . Cl i n , Nu t1- . 36 I 1 1 9-1 126 (1382)). As soluções foram preparadas e mantidas estéreis. As dietas parentéricas foram isocaióricas (1,13 Kcal/ml), isoazotosas (9,8 mg/ml) e diferiram uma. da. outra apencíS na cofnp*usi ca.u oe amino acidos nao essenciais.

Depois da recuperação, os ratos foram alojados individualmcnte em gaiolas metabólicas e os seus cateteres de infusão foram ligados a um dispositivo rotatório (Instech labs, Inc.) gue permitiu movimentos sem restrição durante a. infusão continua das soluções nutritivas. Nas primeiras 16 horas a seguir ã cirurgia, os animais receberam 0,9/ de solução salina normal a lcc/hora e não lhes foi permitida qualquer ingestão oral. A todos os animais se deixou livre acesso A água corrente desoe o primeiro dia após a c*p* e r a ç a o até eu f i m do* esLuoo . Nu pr im*—^ji i'<* dia apos a opera o uu os animais alimentados com ΓΡΝ receberam 24 ml oe dieta oe controlo ou da dieta enriquecida com Gi_N para permitir adaptação á infusão oe glucose. Começando no segundo dia após a opes c ont í nuand>:

quantidade;

durante - regtante estudo, foram administradas adequadas <43 mi/dia> da dieta parentôrica. Os animais alimentados com dieta, chinesa, que sempre consumiram todo o alimento que lhes foi fornecido, receberam uma quantidade de

J dieta chinesa grossei ramsnte equivalente na sua. densidade calórica a administração caiórica nas 24 horas dos ratos alimentados com TPN. Assim, animais alimentados com dieta chinesa foram deixados com 3 gramas de Dieta Chinesa para Ratos Purina durante com 16 gramas por dia as primei ras- 2e horas e em seguida

Os cateteres venosos destes animais forsm ociuidos no dia 2 após recolhida diariamente em recipientes acidificados começando no segundo dia após a operação e foram armazenadas porções aiiguotas em recipientes a.c i d i f i c a dos a -20°G. 0 volume da urina foi registado diariamente.

upe r ct ç ao.

ur i na

Preparação de Tecido e Processos Analíticos us animais τ oram pssado·» de* n-.-vo no f ím do estudo no oitavo dia após a operação, ansstss iac-os com pentobaroíta 1 (45 mg/i<9 ι.ρ.>, e fizeram-se colheitas oe sangue do coração para seringas heparinizadas. As concentrações de GbN e glutamato* do sangue total foram medidas nessas amostras cie acordo com mótooos anteriormente reíerioos usando cromatografia liquida oe elevada performance de fase reversa CSmith, R. J . et al., J, Liq. Chromatography 3 ί 1 733-1 735 ( 1305) ') .

Dopo is dos mente extirpada uma animais terem sido peque n a ρor ç áo ce sangrados pane reas imediata3 mm ) da

ideido a 2,	•S t 3 Γί! p' f : Ο í.:*	3'
paia exame	histológico	n
d i s s e c a *ci »c»	e separado	da
1infáticos	3 ó J 3. C Ο Π v3 S .	As
as por meio	d O UfifO. t-O'C	n ica

porção mediana da gianduia na junção dos segmentos esplénico gástrico, fixa»aa em solução de gluta a r m a z e n a d a a x ^u C. ate ρ r o c s s s a ί,, e π i.· c restante pancreas foi cuidadosament-e dissecado gordura isesentêrica e dos tecido;

t ressecçtíes pancrefeticas foram reaii: cega. Ds produtos pancreáticos foram pesados, diluídos (1:10, r

p/vol) em 'água destilada arrefecida pelo gelo e homogenizados durante 30. segundos com um homogenizador de tecidos Polytron. 0

J produto homogenizado foi soniçado durante 30 segundos e armazenado a 70°C até ser analisado quanto aos conteúdos de DNA, proteina e enzima. Os fígados foram extirpados, pesados, secos a 30°C durante 72 horas e foi determinado o peso seco.

Lnsaios......Bioguimiçj

Porções aliguotas de cada dia foram reunidas a fim de avaliar o balanço de azoto dia.rio» cumulativo. 0 conteúdo de az»?-to c·:». amostras oe urina ac i di f i caciaa foi determinado usan»;:·::» uma técnica macroKjeldahl. 0 conteúdo proteico dos produtos pancreáx-icos homogen i zados foi medi do peio método de Lowry (Loxry, ú . H. e t a. 1 . , J._ Ei ι o 1 . Chem. 133:265-275 (1551)) e o DNA usando uma m»odíficaçâ'o do» método de Burton (Burton, K.A.,

Β ι >o c hem

52:315-322 (1365)). uma porção de cada produto pancreático homogenizado foi diluida até uma concentração proteica de 200 Àig/ml com albumina do soro bovino a 0,01% contendo tampão e armazenada a -20°C antes da determinação das actividades enzimàticas. As actividades da amilase em amostras diluídas foram determinadas usando uma modificação do método de Bernfeld (Bernfeld, Ρ., Amylases: alfa e beta, In: Colowick SP, eds. Kaplan NO,

Methods of___Enzymology, vol. I. Academic Press, NY, 143-158 (1355)), e as actividades da tripsina foram determinadas pelo método de Hummel t. Hummel Eh C. , tan J . Βi ochem. Physiol .

f Ο 1 < 12):1393- '1393 <1959)). A act-ivaçSo do tripsinogénio

p· r oduz	ida por ιncuba.çáo	de	400.ul	oe amostra com 0,049	2.ug	de
t™ f'í t· t? I ’ O	qui nase porcina a	37 oç	durant	c? 4 hc* p s.s . As s c t i V i O-3	des	d 3
Ii pase	f o r a m m e d i d a s n u m	Ana.	I i saoo r	Kodak Ektachem 700 us	ando	O
f ii £ t 3 O G1	de taxa ponto 2	O cr	Maucfc	(Nauck , J . C:. et al .. ,	CI	ι n .
< 1 334 )	>. As actividades	enz i.	t má ti car.	s 3 o e x p r e s s a s e m υ η i «zi a	«2?f 3 z?	( 0)
de m ι c	rOrfiQlczS ’Σίθ piOGU ΪΌ Λ	ger	ado por	minuto <1 K0 - 10’ uni	G3.de	S / .
c	Histologia Fane	p z. 4-	2 C 3.

tecido pancreático foi fixado a 4°C em 2,5% de gluçaraioeioo camponado con) fo*sfa. to e pós f ixado con) 1% oe t-et-róxido de ósmio durante 2 horas à temperatura ambiente. As amostras de tecido foram então oesniorataoas com graus cada vez Fiiaib éíievauos de ai co*ul e embebidas em Araxdi Le. cortes com um fiíicron oe espessura foram cora oos oom 1.x· de azul oe toludeno para microscopia óptica. Foi utilizado um micrótono ultra LBK Nova a. fim de preparar cortes com espessura de 600—900 A para microscopia eléctrónica. Estes cortes foram corados com acetato de uranilo e citrato de chumbo, sendo então examinados num microscóP¹1 u e i e c ί- r O n i l u ue t r a n s m i s s a ·ς· 01 F b i 1 1 i ρ* s . H3 células du s o.c inos r oram f otograraoas por mi c roscopia eiec trónica sendo então* ampliadas até se obter fotografias com uma ampliação final de /17/ X t~.

Anàl

Dados

x· L 'L/fil·.-' ·ζ·. Π * xf *7? 3. ΣΓ £? ί* Γ’O P^s c». O í ’ <í^:. O pancreático, DNA e o conteúdo a ο ρ a! i c r e a s t o t a 1 e em r e 1 a ç -3 o pancreático e o conteúdo proteimg de DNA como um índice oo estes ιndices, as c ompa raçoes (

Ci -7 r

entre os grupos são feitas após correcção em relação ao peso corporal visto existir uma relação linear entre o peso corporal total e o peso húmido total do pancreas em ratos Wistar machos com pesos entre 100 e 300 gramas. As activi dades enzimaticas óo pancreas (Unidaóes/mg proteína) são expressas como o conteúdo total óa glanoula e como a'c £iviàe.de especifica (Unidades/mg DNA pancreâtico). Ds diâmetros de perfil médio dos grânulos oe r

zimogênio foram calculados de acordo com o método de Weibel (Weibel, E.P. et_a..I..,.., Principies and fechnigues of Electron

Nic r os c op y:Pio1ogic a 1 App1i c a t i ons, Vol. 3, ed. M.A. Hayat, Van Nostrand Reinhold, NY (1973)).

.)

AnáI ises de variSnc ia de duas vias f oram usadas para avaliar os efeitos da PLN e da ressecçâo intestinal (Winer, B.J., Statistical Principies in Experimental Design (2nd ed. ), Mc G rawHilí, NY (1271)). 3e a análise da variância indicar um efeito hícu i =igni τ ícai-ivo, e-t.o usados i-esi.es t não aos pares para as comparçôes planeadas pós-hoc entre animais aos guais se administrou a dista enriquecida com GLN e os seus controlos apropriados São incluídos dados a partir de animais alimentaoos com dieta chinesa a fim oe demonstrar o grau de atrofia pancreâtica nos grupL-s oe t r e. t ame n c-u, mas nee r o r a m inc luidos nas anal íses da. totalidade dos efeitos do tratamento. As diferenças foram consideradss estatisticamente significativas guando os valores da prooaoi1 idade (p) eram inferiores a 0,05.

Essu 1 tado<

Peso Corp-maj., £:alanso.gg Azoto.. A?. Glutamina jg.

G1 u tams tp_ do_F’ 1 a c- m a

As alterações no peso curporal e no balanço de azoto foram semelhantes em animais alimentados com GLN e em animais de

controlo com ou sem ressecçSo do intestino delgado (Quadro XVIII. Nos animais que foram submetidos a ressecção do intestino cel?ado, as concentrações de GLN plasmática <1143 ± 75 vs 330 ± 41, GLN vs . Controlo, p < 0,05) e glutamato pl asmático <177 ± 12’ vs .

1 9- A X ·-· f lj L Ν V	Con	trolo, p	< 0,0 5	) f 0»	ram	3	i gn i f	i c a t	i va.men tf
Γη 3.1 3 3 1 3 V 3. C 3 3 110	9 r upo»	/ • GLN em	c omp-s ra.	ção	com	£i	g r up		o· n t r ο» I o .
«So foram obser	V3.Ó3.S	quai quer	outras	dif	eren	ça	5 '5 I	gn i f	1 C 3. t- 1 '7 3.3
€? Π t- P 3 C 3 3. Π I fir 3.1 3	al ime	Pi t-3. CÍC:3 C C	mi GLN e	de	cont	ro>	1 o.
2. índices	F‘anc r	j eãti cos

húmido» pancreático médio s igni f i cat i vamente mais baixo (33-43/), rií&nos pruveina (zt· o'3./) e menos DNh i i4 -30/) em comparação c»r»m os animais ai imenf-a»i»r»s com oieta chinesa >.Lⁱua»sr»o XV111 ) .

c oín »_»s »_ on*· r ο» ι os . Ls c-a.s d ι τ erenç as foram s i g η i f i c a t i vas em relação ao peso» panereático» (ρ<.0,05) e DNA <ρ·(0,005) resp-ectiva— mente mas não» em relação á proteína. pancreática (p = 0,05).

es t e s a η ι n i a i s s. s rei a ç õ e s protein a / u Ν A e peso» ρ a n c r e a. 11 c »r» / D Ν A n a. »„» r »_> r a.»' í t s ι g i i ι τ i ·_ a c· ι v a n, e n t e »b i f e r te n c· e s i 0 u a »□ r ο λ V111 .* .

MUcf f Ο P 3. Γίι SUORícLÍOCS <?. L4ffi3. í 9-AQO 9-4 Cr ίθΓ«Π1 3 1 ΙΠ'ιβΠ vctOUa C Cu ÍÍ

F‘fc? 3 cíCiOS 1 4X« j pO? i '7) _f 3 t· I Ftí“·3.*ϊί l-utri i Πι3 1’5 3 x fcr V 3. ^;Zj Ο ρϋΓ i.'3'j 9 CIO

C C‘ fl; P 3. Γ â Ç â. o c O n ( O 3 c Ο Π t-1 ‘ O Ϊ Ci s . 0 ρ μζ ρ 3 Π (_ p 9 3. L- 1 L. O / CI '4 rA 9’ Ρ Γ C* c 3 1 t- fc--¹ »J f fcr i' tf i i t- fc-^J 3» j fcr Π ί t^} _^f P Ci fc? fc.* t- 3. 14 iti fi) 3.

SC t 3 VI CSCê

L·' 1' ο. ) i 1 Γί i a χ S '_' χ I Γ· í ·_^Η_ ' 7. ,1. ϊ J ,.0 *_ '.ΐΓ·; · ί~ Ν S.p ϊ' OS'ti Π 7,? V ΐΐ Γ:ί go enzima pane an i n-z -·. ζ z 1 i meu t ~j L uCí:’- £- λ· 1 G' Íí ?·.

; L..<0 ; 00S ) ^!.r.r B.

eram signif icat cos*, o grupo Co

reatico total	dimmuioa em	*_ ΟΠ-ρ··?·. Γ c-λ Ç	c om	C’ ’.C'
a o o c : ζ· o i e t a	o f, ί n s- a c u u a. d r	o a í /·.) . Nc·—·	ani ma
Γ r.o ç? Ci'· C Ç C» ; - O	t ripsinogénio	P-.nc re^.t ί cg	to t

c on teútio enzima tico a. I iment-ados com GLN tíCt-ividcíde especifica do tripsinogènio Cp<0,005) r

1vamente m-ais elevados no grupo Gi_N em comparação nt-roío. Não se registaram outras diferenças no ou na. actividuoe especifica entr e os ani mais de c on t r o 3. o .

an i ma is

ͱijdL!2Í22~ÍâJÍ?SílÇ£e^ d tecido pancreático sxócrino e os ilhéus de Langsrnans ti unam erc aspecto normal em todos os animais em microscopia dpnea: nas n aviai auaigusr evicênci;·. de pancreatita ou de edema -o-.: · ens r i s. . ssem pera a·'· aumento .se peso ou Oo conteúoo proteico ooseivsoo em ratos e i χmentacrcs som dieta enriquecioa com Gl.N . o diâmetro oo psrfii médio dos grânulos cie zimogêmo nos animais neo suometidos a resseesdo e - 1 i ment-atios com ff'r.j era s i gn i f i c a 11 ··'-omense ζ·ζιζ pequeno do que nce ratos alimentados com dieta chinesa <3,66 z d,do pera Gx_N, -3,30 + o, 05 para Controlos, e 4,63 o cm id para Controlos. ρήΟ,Οο o:e õNuvA de 1 via); os grupos oe Glutamina e oe Controxo não se apresentavam significativamente cuerences. eusnoo se compararam perfis oe unioades acinares isnc 1-000 oe um mooo semeihanre, em aumento na oensioaoe volume— --oe p celuia, no rimua oe qrdneios <;p zimogenio, e na area percentusi oo volume celular ocupado pelos grânulos de ziaiogémo d o; η o u—s e a c> a -. - o '· t e o m a η i m ais c o-r c on t r o i os ou

Análise oo? .G f e ι ΐ-ss de A- *taEe.p.as·_..„*. ge___tèriê? t-omc· i naaas η η ί “, = ai s a. ι imeni-sous com a uitria crn'' i c ica ll·’» muN

ao	e f 7.	r a m	suiarn	esioos a r	e s s e c c a0 00 intestino	oe1gaoo	a ρ r esen í a-
va	m	a: c e n	t r a 7	7 Sigam	1 l. a i-1 v a meu te e 1 evaoas	oe «GLN	P 1 U. ::(:! a t 1 C Cl
P		21 e	oe	g 1 u 7.· 3=: í ί a 1 u	:3,·.·.;;1; A infusão de	GLN não	: sfectou 0
ma	1 z ·· n c	i“i £;	-Ξ O O	to cumoiat	ivo enquanto que a re	ssecção	1ntesti na I
a.e	ve	urn	e f e 1	to regato	vo signi f icativo. 0	peso	pane reàtico
( P	ή . 0 A 01 >	os	conteúdos	de proteína <p<Ú,002),	e de DNA < p<0, ΑΟλ :>

τ c.· r»'.m siÇíii τ i ca7-1 ν^.ίίΐΟΓινδ mais eievaooLi em a.nimai-s qua receoeram Sl.A e c-=-.00 l's:v·; io-mi indepenoentes oa rssseccÊo i nt-est i na 1 . A. rssssccSo ini-estinai fez diminuir significativaraení-e o conteúdo psOísico -·;>.;< 7--.-..1t1 c o totai niir; rp<O_;uO&> e a ta 'a ρ ·;.τ,-_;;·,·,.. -a r· c r e 77 11 c a / D rt A i ρ < ϋ .5- .

A η 1 rn a 1 s a ' 1 ment a cai ; ·: ALA a ρ r a 3 e: 7 7. a y 7 s. 7.;· ,. p ...: ; 7 e 9 .-_ 77r, g nrc r - -' 1 c <p<A,A2r e conteúdo de iips-ãe ^a.-.e·- siqref ícativa’^:e;'.T.,;_? -,:377: eievaees a conseuoo oe amiiaae total e toca*. aa c 7 1 v 1 oa.oes enoimaoi ca.s específicas u to foram afecíados peia 7 rn usEo oe GLA . A ressecc-so intestinal teve um efeito negativo poílogo rpsO.-ouoii some o conteúdo total e sobre as actividades

- 1 ina s or; í 7 ips;; ncgcni o , ami 1 ase e lip-sse.

Em conclusão, Α'Ά supiementado com GLN atenuou signifi·. O 7- .=. V Ο m Ο Ο 7..3. pL^:!*-_U. Lie í-OS-..' PeiiL '' S 1- 1 C O 7 í4“lL’«.^! ; uAr; 7 .^!.ΖΊΊΛ·7 e

-noaua Í2é-5n5: yjp ocorrei om a/Omais gue receoeram a dieta oe .. ceai- ϊ· o i ce : c mn 7' - suoo = =7=,7 animais 73: imenfaoos com G;..A apresentavam -m 37737-77·. eigu A 77.7777: oos y- .,7777 oo tripsinogénio pancreaι· i o e> i-otai cSoa ; 3= cm.:. Iipor.e (ÃuAi ,e - nao apresentavam diferença :-,33 acmvioaoas ensimaticas sspeciiicas, em coraparação com 05 0.-=:7.7.7 :70 A Gla é a-aim om 1:-..3-7 = 77..7.:77.7= elemento nutri tivo para o uaícc eaoc7imo :0.::,777 eto 1 c o durame fEA. d efeito trdfico oa GLN

Peso Corporal Balanço de AZoto. Glutamina e Glutamato do Plasma em Ratos alimentados TPN e com dieta Chinesa

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de controlo por teste-t sem ser aos pares após ANOVA de 2 vias

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ίίό-ΌΟρΙ-Ο 11

tcccç-dcdi D vi ca -	F' -i- ‘ C , ‘ i- i cl··. *./ ' £’. * i c- u.
D ι : ner- te ς de Com	DI,ã.LD O n f é-r 2 ,o „6I eu ta r
fctOOd:	ι n viiío oemonstram gue G;_ú é um c omous 12. ve 2.
respi ι;?· ío 22. mpc	:>rta.nte para o· pancreas mas 0 pa.pel desempenhado
peias dietas ente	ancas suplementadas com 6i_N sobre a estrutura e

função do psncress é desconhecido. Cs efeitos das dietas elemenJ tares suplementadas com GLN sobre o crescimento intestinal e pancreôtico a seguir ao stress operatório foram examinados em ratos Wista.r machos <n=25, peso 195-210 g>. A seguir a uma ressscçâo intestinal de 6ú% da porção central do jejuno-íleo e

gas t r 0 = tom i a , os	r a. cs τ 0 r ::: η í e e *_ι ί ΐ ι o o s ,.·'. o a. c e. s ο ρ a. r e. r e e í_- e r e m
dista díada ou	infusão continua oe uma dieta elementar pa.drão
<Cõ;v) ou oe ma c	die ca. suplementada com GLú oe 2 g/loú mi, isoazo-
cosa, 1 soca 1 ór 1 c	A.s oietas elementares diferiam apenas na sua
fonte oe azoto ni	io essencial. A urina foi recolhida diariamente e
os bsiorços oe -.2	\ 22222'22-t--22, :.2::-22: 222 0:0 Oe 'O 22. OííOOS OU Γ Ο Π Í-S Ο Ρίί'ϊΟΟΟ Oe
escude. serem	sacrificados, o- peso corporal foi determinado e

fez-se comei ta de sangue para GLú, glutamato <GL.U> e amónia. Ci fígado, intestino e pancreas foram extirpados, pesados, ensaiados em reiaçSo ao conteúdo os DNA e oe proteína e preparados para

r --00 histológicí	20 ú íigatio e o pancreas foram também ensaiacos
-.s- rei açitn aos cc	•mteúdos de goroura e de enzima, uma parte dos
cacos e 2·. no i -.. a. oe.	como media ± sem no Quadro XX, a. seguir

OaaaCa.

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rarc í‘è r‘} a a

			rg/ΪOOg A.	Caa P .	F i g - ,do	á ÍYtfe 1 55	/2 7
			......-........-....................- -;·--		.....-----------------------------------	-..........................	—
γ -		r-es	a 1--:8	P r a te i ra.	8aaa< g .·	8;N	8a0
,' -	3 3 4	8±1	Λ 8 2,7±0,2	88+5	i 0 . 4+0 , 4	975±80	185±I2
a _ '-:	y fe -2'	9± 1	54 8,8x0,a	88x38	8, 7x0,44	1148+104	í 03 +14
Co j. -	8 54	7 ±5	5 2,2--,2	54±74	8,8+0,84	7IS±8I#	101x54
	4 ; a < 0 :	05	va CON: #;	p<0,005	ara. rasa vs	CON ou CLN	<ANcVA)

A ai±mencacao com ciei-as siemenvares fez oimmuir o res·;· em ·. ·;-··;.··;· ·?ο ss ·.·;:···:?;; a 1 i ···.. ..'.?;ss ·;·;·;· dieta chinesa. gí_N atenuou s i gn i f i ca 1i vamente a perda oo peso pancreatico, aumentou o conteúdo oe proteina pancreatica e evitou o aumento do peso humioo do fígado em comparação com o grupo CGN. .·.·.··!;; os casos oos grupos GLN e CsN foram reumoos, o peso e o õNA pane rea 11 c os foram rei ac ionados com a G;_U piasmática <p<<ú₍03) mas nSo com os niveis de GLN. Oomo o peso corporal e o oa lanço oe azoto eram semelhantes encre os grupos Gí_N e CuN, os efeitos ca.

J

GLN parecem ser específicos para a. manutenção oa massa pancreática durante o periodo pdsoperatór10. Estes achados apoiam ainda a hipótese oa GLN ser um agente nutritivo condicíonalmente essen— ι. ia. i Par c*. us ve;. ioos eacr ο ι ηt.-e — o; na, is a segui r ac* si-ress c i rur g ι z o · .

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..:.-:-.....9- ·.“ τ ' οροr·· .^!. 2 η i Li í · ί· çf ζ 3'- ‘ Τ <9. V ir-jj '--L- 9 .7 C _ _ u~, T 1 '.. ·us C .1 L ; 3 C , S i .· ^!JvS;^ri * I Ί 3.

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22.2.22122'ρ222..Α2...0_22ο t

a iscí-uí ose e um sçycar nao setabol izável qys

mente aosorv	ido o. rt	i Γ	do		t· o	gast r o intestina 1 .	ím as	per t
i · a ç £> e s g o a r. p	οι n te si· ins	1 s	ta. i	- ~.o	Γ·Ό	ooenoa ι ητ 1 arpa t-Or i	a do	ι n t
tino, a lac	tuiose é	-/ 7 I ;<	0.00.	·?. í	Γ	ves oe fenoas na	Γι’: *3 Π i C· Γ c· Γι ·': ί
morosa, germ	itinoo a	S	ex	C Í'DÇ	â O	Feio urina. .2 qy	a n í i	oaoe

ί ά: tu i ess oo um-n constitui assim una medíoa. do dsrran!;

SX-rôV6'S dS OSíTélfa G3 FaUCOSò í!1VS5vlR3i t ÍIShZ 1 OS , èlQCn S m ._ 50 ί us ís . SSO ; 1 0ã2~ i 047 < 1 97z ) i .

oo raws rorsss vrsi-ssos com S—í 1 uorourac i ϊ o tal com foi an zo r i o - fssn te C5»criw no Exemplo 3. A lactulose, 2 ml oe solução 1 S O — O 3 P i O 1 a ' ·2 3 ; n v r crnsuç áo cio iuo o

Ό U <' O · j 1- 3 O. U ..;. ** ' .. ¹ o:

ce oo sscom-go e a urina roi uoseqyentes e ι'οί congelada. A urinária foi óet-ersiinaoa enzimáticamente tal como foi recoihioa 1actu i ose o e s c r 11 o pu Zregler

·. I . Ar c h .

•urg. 123:1013-1319 (lõõõi).

Tratamento ao· uma única injecção de 5-FV revelou aumentar a permeaoi1idade do intestino á lactulose durante 24 r-oras. Este ausiento teve o seu máximo entrs as 24 e ap. 42: horas ppos o. oí aura o ce r ap i a . 2.··-ο·_;· zzo periooo oe trõs oias, animais que receuerPiíYi 2¾ s οr i quec i ·;.·:· com GOtO apresentarao permeao ι i i. da — oe , *o, ve.·:? ί· 11 ! '. ι e i gn ι ’ i c a v i vame-o ie r eouz i da em c ompar a ç a.o c op.

a n ’ m . -í p, ,s ., , m o · I ’.· a.o o s* c. o í. i · o f v P a ο ι ’ a. o oo-oo 5-ãi.i, p; excrecAo o-; iactuios oe 22 paro 17 qmeo es em raios ror exeispio, ás 4o~-/s horas >sas 24 noras estava reouzica í r a tauos com aLN.

í .onc 1 i - se que 6...-·-· ---ueai-- o intestino co susento oe ue ueaíai ί* oaoe — acuerure eeiso qu i m ico e i a- · -.e. _s. c - ,

Sspet’ft-ss eue es-,e efei te se.-e ce grsnce iííipor tsnc i -·. para e píe^enção οά iraeccáo peia. ao a- qa . ·,·:; ni-es t- i na i , e que esvi seja ρ r e i que cone* imua par? uma maio 1-.,-00-¹ ,-ec upe r e ç ao oe oosnues sueeeToeeo q ΐ·-o¹ όο·ο á .ni a c -ío oa meoi_.u ;? coaj?, i-ao lõpo tc-i ani-er iormente oeac 11 to , ne, E.aempio ã .

I

Gc2E.E.á.7L..2...E

A ôiutámina Alivia ox Efeitos iniunossupressiv»:*5 os TF‘N

Rat-os tman ai ixsntaoos 1 atê ra tc*r i a i *··.; te . quer com

I custa chinesa, irr·!, quer com fF‘N supiefi'.entado com GLN tal como foi descrito no Exemplo 2u < Materiais e Métodos, Sec . 20 . -Sete r

o i ?.'=.· a pos ι η i c ΐ o o o o r a * a. m e *n c- e , υ» <.-·. n i ma i s f or a m sa cri* i c soos sendo recolhidos o bsco, timo e gãnglios linfáticos mesentèricos.

j

Foram preparadas a partir destes orgãos suspensões celulares usando técnicas padrão* (ver Klein, immunology; The Science of

Seif-NonseIf____Siscrimination,· Li ley-lnterscience, 1982 i. As respostas proiiferativss dos 1 i nf oc ϊ to*s i n vi t r o na presença de mitogênios foram realizsdsc· usa; ido* métodos t*em conhecidos nesta i-ecmca. Em comparação com o grupo a i i men tado com dieta chinesa, 7PN ourante cara semana reouziu acentuadamente a resposta linfoci ic num vaior até Ecu- Esta supressão* foi invertida peia presença -a Gi_u nc* pa * encér i c a , c·.. tal mooo que os rafes uacaus com Ec u apresentaram resposcas 11nfoc11artas i n termeo i a — rias entre a cò*ç;.*35·· nos animais com 7EN e os rat-os ce controlo* a 1 i enc-aoos com diet-a c hi nesa .

a p-resencri ·...·,.· oEu na

s i gni f 1 ca 11 vamente 0*	GGÍ	GG GG
na ausência	g e	El h .		ϋ ·:	r 1 j. ;m c.·· 3 £;
cai une feu.	Ge-	a c r 1	i.	G	·::· Ε.··ρρρ
' C: C a ‘ ,	T. . ·	1 s c		7	' X 1 Ο X
c n 2 x c ,. Ec· q·;*	-7 G Ί	ir;	G”<	G 'ί 1	00 com
·. Λ, - i .....rc	g :.·	7 . ε?·		;u -7	Ε / 7,,A

s ·..· ΐ u c a. ·_· ρ* a ·¹ e ’ i t- e * ’ i c a. a. ι ι v i a*. a c · am i«unossupressSo produzido por fF7·! ;;s barreira mucosa ao intestino, ua i2 anterior, combina-se com a una aumentar a susc spcu. h i 1 i eacas a * Γ ,”· . ,··· s c · s c e ρ t-1 ο ι i lo-sie aument·-·. c.*-* qus snc*-am pac· intestino, me ·. ce·' i uu a * cu,/c· ic.ui *; ta r i a cc ^;m_u e sucao capar os promover <

aun oc iuaruuucs i n sereno ente c;

• <' ·' G	&	c*i- r 0s m 2. c r 00 r 9x n 1 s* -s r
S tGGiGGín		com qualquer	ou t ra	v 1
G;-G'GGG 1	ds	c . 7F‘N supiem	cnta00	c om
G G f G· G	do	nospeos 1 r 0* ρ	or meio	os

n; ec c 1 osc*

A melhor ia do- estado

•im-s ϊ ros a a - ·'-- .· .sn : ;. ae o? steduis <-£-:' ·'·.'- tanqio rd -inie ;.·?, í.m·.. r· e i e r : ee: canc conv eviaéncis c ·:· ·' r oix·rs11 vs. :· ; \ 55. ac i 1 v 1 cate ” pr a-mc speae 1 co da Geu .

Teriçç cgcc ccscacc cemp 1 etamente este ira-e-dca, ccá f'

--rêi ΐΐϋ·;· priuí c-ξρ ec i p< l·i s cás nesí-a técnica ··-.{..;£? o n-es^c· pc-ce s^r ^{; 1} <f c» .: Ϊ Σ. <.5 ·—^;-^: * '· Lr ί ί * <r». <-? : · P^: j, O ·£’. í í?. C? £r P c*. !' cs · < · C^: 1· 5' p,¹ '_-. P. P · ; f C £? '“j p· ( ' £·. Ç õ £? 3 , P. C^f ’ í Ci i

Λ çáes equivaient-es, sem afastamento da aspa ri ta c- amaice ds i . ':·. a te e =cc eaper1 menteçte icccvícc

J

Emaera este inventa tenha aiaa descrito em relsçko cons suas apresentacões espoei: ··.···' . serã. tccaaoe em c ans 1 ae r ·;·; ic sis é capaz ae outras rnooif icscdes. Este requerimento pretenae icdn-ir quaisquer variações, utilizações, au sospí-içôes das inventos segui noa, em geral, as princípios do invento e inclumoo oesvioc. ea prsssqT.y oiíscriçso aetalmaaa que se situem no a.mhiio ca. tdenie-· aaeiraai Z qual a invento pertence e que passam ser íPí 1 caees nes factos essenciais aqui anter iormente ina 1 c a d ac· cerne cr P'..·'p · i e..’ -Pue.' á s ef er -·dC Pt” ’ V 1 V’’C λ ê CP.? 3 P^; £? C: ··. dã .

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aumentar a actividade do sistema imunitário para o tratamento da função imunitária comprometida num animal, caracterizado por compreender a administração ao referido animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de GLN ou de um seu análogo funcional, derivado, produto de substituição, isómero ou homólogo que retenha as características da GLN numa quantidade superior à que se encontra presente na dieta normal do referido animal.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida função imunitária comprometida ocorrer substancialmente associada a alimentação intravenosa.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido animal ser um ser humano.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a diminuição da actividade do sistema imunitário no animal resultar do facto de ele ter sido sujeito a, ou ter sido tratado por transplantação da medula óssea.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido animal ser um ser humano.
6. 6. Método de acordo com as reivindicações 1-5, caracterizado por a referida administração parentérica ser feita a uma taxa de 0,2 a 3,0 gramas por quilograma do peso corporal por dia de GLN ou de um seu análogo funcional, derivado, produto de substituição, isómero ou homólogo que retenha as características da GLN.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida administração parentérica ser feita a uma taxa de 0,3 a 2,5 gramas por quilograma do peso corporal por dia de GLN ou de um seu análogo funcional, derivado, produto de substituição, isómero ou homólogo que retenha as características da GLN.

   J
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida administração parentérica ser feita a uma taxa de 0,4 a 2,0 gramas por quilograma do peso corporal por dia de GLN ou de um seu análogo funcional, derivado, produto de substituição, isómero ou homólogo que retenha as características da GLN.