HU220214B - Eljárás patológiás bél-permeabilitás és legyengült immunfunkciók kezelésére alkalmas, glutamintartalmú gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás patológiás bélpermeabilitás és legyengült immunfunkciók kezelésére, továbbá csontvelő-átültetéses beteg felépülésének gyorsítására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

A lebontási folyamatok (zavarok) azok a fiziológiai folyamatok, amelyekben valamely anatómiai szerkezet roncsolódik. Az ilyen folyamatok általában nemcsak a vázizomzatban, hanem a bélbarázdákban is lejátszódhatnak. A szövetroncsolódással járó lebontási folyamatok gyakran jelentkeznek sebészeti beavatkozás, szepszis, égési sérülés, rákkemoterápia, sugárterápia vagy sérülés, valamint glükokortikoid terápia, továbbá a nem elegendő táplálékfelvétel következményeként. Ezek a sérülések, betegségek és kezelések gyakran társulnak legyengült immunfunkciókkal is.

A csontvelő-átültetéses betegeknél például az átültetést megelőző és követő sugárkezelés és/vagy kemoterápia a gyakran jelentkező transzplantátum/gazda betegségekkel társulva mind lebontási, mind súlyos táplálékfelvételi következményekkel járhatnak. Különböző körülmények szükségessé tehetik a teljes parenterális táplálást (totál parenteral nutrition, TPN), amelyekre példaként említhető az orális és nyelőcsövi nyálkahártya-gyulladás, a hasmenés, az émelygés, hányás, a száj kiszáradása és az ízérzékelés rendellenessége (Cunningham és munkatársai: Nurs. Clin. N. Amer. 18, 585-596 (1983); Cheney és munkatársai: Cancer 59, 1515-1519(1987)]. Bár a szakvélemények szerint a TPN hasznos és szükséges a csontvelő-átültetéses betegeknél, a nagy mennyiségű elágazó szénláncú aminosavat (branched-chain amino acids, BCAA) tartalmazó különleges készítményekkel végzett iv. infúziók az átültetést követő első hónapban nem javítják a nitrogénegyensúlyt [Lenssen és munkatársai: J. Parent. Ént. Nutr. 11, 112-118 (1987)].

A fent felsorolt okok által kiváltott lebontási válasz, a gasztrointesztinális traktus sérülése és a veszélyeztetett immuníunkciók képezik az elhalálozás és a további betegségek fő okát. Ezek a klinikai állapotok gyakran társulnak egy nem esszenciális aminosav, a glutamin (GLN) abnormális metabolizmusával. A legtöbb szövet képes a GLN bizonyos mennyiségben történő előállítására. A többi aminosavtól eltérően, a GLN két amincsoportot tartalmaz, egy alfa-aminocsoportot, és egy amidcsoportot. Az amidcsoport lehetővé teszi, hogy a GLN eltávolítsa az ammóniát a perifériás szövetekből, és a zsigerszervekhez szállítsa a nitrogént. Emellett, a szövetek általában kivonják a GLN-t a keringésből, és szénvázát energiaforrásként alkalmazzák.

A GLN metabolizmusának szabályozásában részt vevő két fő enzim a glutamináz és a glutaminszintetáz. A glutamináz katalizálja a GLN-nek glutamáttá és ammóniává történő hidrolízisét, míg a glutaminszintetáz a GLN-nek glutamátból és ammóniából történő szintézisét katalizálja. Bár a legtöbb szövetben mindkét enzim megtalálható, az egyik általában sokkal aktívabb, mint a másik, ami az adott szövettől függ.

A GLN szintézisét elsősorban a vázizmok és az agy végzi. A GLN felhasználása ezzel szemben a szaporodó sejtekben történik, amelyekre példaként említhető a fibroblaszt, a vérképző sejtek, a limfociták, a bélhám- és a tumoros sejtek. Jellemzően, ezek a sejtek magas szintű glutaminázaktivitást és alacsony szintű intracelluláris GLN-t mutatnak. Ez a tény klinikai jelentőségű lehet olyan betegeknél, akik nagyméretű sebekkel, fertőzéssel összefüggő gyulladással vagy olyan gasztrointesztinális zavarokkal rendelkeznek, amelyek kizárják a szokásos enterális táplálkozást, mivel a különböző sejttípusok megfelelő szaporodása ilyen körülmények között a megfelelő szintű GLN hozzáférhetőségétől függhet.

A gasztrointesztinális traktusban a GLN-t légzési energiaforrásként alkalmazzák. A GLN enterális adagolása esetén nő a luminális GLN-nek a felvétele a bélnyálkahártyában, és ezzel egyidejűleg csökken a GLN-nek a keringésből történő felvétele. Ez azt jelenti, hogy a bél GLN-fogyasztása ki van egyensúlyozva a két GLN-forrás között.

A gasztrointesztinális traktus által felvett legtöbb GLN a vékonybélbolyhok epiteliális sejtjei által jelenik meg. A GLN metabolizmusa a vékonybélben játszódik le, és biztosítja a bél fő energiaforrását, és a máj karbamidtermeléséhez és cukor-újratermeléséhez szükséges prekurzorokat termel más szövetekből származó nitrogén és szén felhasználásával.

Baskerville és munkatársai (Brit. J. Exp. Pathol. 61, 132 (1980)] a plazma-GLN koncentrációját a kimutathatósági határ alá csökkentették tisztított glutamináz rhesus majmokba, fehér selyemmajmokba, nyulakba és egerekbe történő befecskendezésével, amelynek eredményeként hányás, hasmenés, a bélboly hók sorvadása, nyálkahártyafekély és bélüszkösödés jelentkezett.

A 2 283 817 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás GLN-t tartalmazó készítményt ismertet, amely detoxikálószerként alkalmazható, azonban, táplálékkiegészítőként történő felhasználását nem említi. Az ismertetett megoldás szerint a GLN-t más aminosavakkal kombinálva szinergetikus keveréket képeznek, amely közvetlenül hat a toxinra, és így csökkenti a kárositóhatást.

A 2 868 693 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás GLN-tartalmú készítményt ismertet a gyomorfekély kezelésére.

A GLN potenciális védőhatásának további példáit ismerteti Okabe és munkatársai: Digestive Disease, 20, 66 (1975), amely szerint a GLN védőhatással rendelkezik humán betegekben az aszpirin által kiváltott fekélyek vonatkozásában. Ez a hatás nem figyelhető meg, ha a GLN-t csövön keresztül közvetlenül a bélbe juttatják, ezért a védőhatást a GLN a gyomornyálkahártyán keresztül fejti ki. Ez arra utal, hogy a GLN-nek a gyomorfekélyre gyakorolt hatása lokális, és nem másodlagos a megváltoztatott szisztémás táplálás vonatkozásában.

A nem esszenciális GLN nincs jelen a parenterális tápláláshoz alkalmazott standard oldatokban, ennek ellenére a vékonybél által preferált oxidációs üzemanyagot jelenti [Windmüller H. G.: Adv. Enzyml. 53, 201 -237 (1982)], és patkányfélékben intravénásán adagolva táplálja a bélnyálkahártya szövetét (Hwang T. L. és munkatársai: Surgical Fórum 37, 56-58 (1986); O’Dwyer S. T. és munkatársai: Clin. Rés. 35, 369A (1987)]. Ez a zsigeri GLN-igény kritikus betegségek során még foko2

HU 220 214 Β zódhat, ha a vékonybélben nő a GLN metabolizmusa [Souba és munkatársai: Surgery 94(2), 342 (1983)]. Bár ismert, hogy a GLN-t a hasnyálmirigy gyorsan felhasználja, és a tapasztalatok szerint a mirigy külső elválasztású részében tárolja [Cassano G. B. és munkatársai: J. Neurochemistry 12, 851-855 (1965)], a kívülről adagolt GLN-nek egészséges állatok külső elválasztású hasnyálmirigyére gyakorolt hatását nem vizsgálták.

Az önálló táplálkozásra képtelen betegek táplálékigényét pillanatnyilag enterális vagy parenterális diéta adagolásával elégítik ki. Az enterális diétát általában keskeny furatú csövön keresztül adagolják, amit az orron keresztül a gyomor- vagy nyombélszakaszba vezetnek, vagy sebészeti beültetéssel például gyomor- vagy éhbélsipolyt képeznek. A jelenleg alkalmazott enterális készítmények négy osztályba sorolhatók: elementáris, polimer, moduláris és megváltoztatott aminosavak. Ezek a készítmények GLN-t tartalmaznak. Az enterális diétában található tápanyagok mennyiségét azonban általában az egészséges egyed táplálékigénye alapján, és nem a lebontási zavarokkal küszködő beteg igényei alapján határozzák meg.

Az elementáris készítmények minimális emésztési aktivitást igényelnek, és főként kisméretű peptidekból és/vagy aminosavakból, glükóz-oligoszacharidokból és növényi olajokból vagy közepes láncú trigliceridekből állnak.

A polimer készítményekben komplex tápanyagokat, így például szójababfehéijét laktalbumint vagy kazeint használnak fehérjeforrásként, maltodextrint vagy szilárd kukoricaszirupot alkalmaznak szénhidrátforrásként, és növényi olajokat vagy tejzsírt alkalmaznak zsírforrásként.

A moduláris diétában fehéijét, szénhidrátot vagy zsírt monomer vagy polimer készítménnyel kombinálnak, és így különleges táplálkozási igényeket elégítenek ki.

A megváltoztatott aminosavakból előállított készítményeket főként olyan betegeknél alkalmazzák, ahol genetikailag sérült a nitrogén metabolizmusa, vagy károsodott a nitrogénfelhalmozás, vagyis ahol bizonyos aminosavak felvétele korlátozva van, ami súlyos károsodásokat okozhat.

A parenterális diétát általában intravénásán adagolják. Ezek az i. folyadékok egyszerű vegyszerekből, például cukorból, aminosavból, és elektrolitokból összeállított steril oldatok, amelyek könnyen felszívódnak.

A teljes parenterális táplálék (TPN) kifejezés olyan készítményt jelent, amit olyan betegnek adnak, akinek a teljes táplálékigényét iv. úton kell kielégítenie. A TPNkészítmények az enterális készítményektől eltérően általában nem tartalmaznak GLN-t. A parenterális készítmények GLN-hiánya részben annak a következménye, hogy a GLN szobahőmérsékleten instabil, és ammónia és a piroglutámsav képződése közben bomlik. Figyelembe veszik továbbá azt is, hogy a GLN-ből könnyen képződik glutámsav, ami neurotranszmitterként gyakran toxikus. Ezek a feltételezések azonban nem érvényesek az enterális és parenterális oldatok pH-értékén.

A TPN gyakran a bolyhok sorvadásához vezet, ami az orális táplálkozás visszaállítása esetén gyakran reverzibilis. Mivel a TPN-készítményekből hiányzik a GLN, a szervezet ilyen irányú igényét úgy elégíti ki, hogy ezt az aminosavat a szövetekben szintetizálja.

A kritikus betegségekben szenvedő betegekben a nettó fehérjelebontás jelentős mértékben csökkent izom- és plazma-GLN-szinttel társul (Askanazi és munkatársai: Ann. Surg. 192, 78 (1980); Askanazi és munkatársai: Ann. Surg. 191,465 (1980)], és kismértékben növekszik az intesztinális GLN-felhasználás [Souba és munkatársai: Arch. Surg. 120, 66 (1985); Souba és munkatársai: Surgery, 94(2), 342 (1983)]. Ismert továbbá, hogy a glükokortikoidok növelik a vékonybél GLN-felhasználását [Souba és munkatársai: Surgical Fórum, 34, 74 (1983)].

TPN esetében csökken a hasnyálmirigy tömege és a hasnyálmirigy külső elválasztása, és elsorvad a gasztrointesztinális nyálkahártya [Hughes C. A. és munkatársai: Clin. Science, 59, 329-336 (1980)]; Johnson L. R. és munkatársai: Gastroenterology, 68, 1177-1183 (1975); Johnson L. R. és munkatársai: Am. J. Physiol. 233, E524-E529 (1977); Towne J. B. és munkatársai: Am. J. Surg. 126, 714-716 (1973)]. A testi fejlődés fenntartása érdekében intravénásán megfelelő tápanyagokkal táplált állatokban ugyanolyan mértékű hasnyálmirigy-sorvadás fejlődik ki, mint éhezés esetén (Johnson L. R. és munkatársai idézett műve). A hasnyálmirigy-sorvadás kóroka kevésbé ismert, és feltételezhető, hogy az orális táplálékfelvétellel társult különböző faktorokkal van összefüggésben, ilyenek például 1. luminális szubsztrátumok távolléte [Clark R. M.: Clin. Sci. 50, 139 (1976)]; 2. diétás aminok hiánya [Seidel E. R. és munkatársai: Am. J. Physiol. 249, 6434-G438 (1985)]; 3. lebontható rostok távolléte [Jacobs L. R. és munkatársai: Am. J. Physiol. 246, G378-G385 (1984)]; 4. neurohumorális folyamatok megváltozása [Johnson L. R.: Physiology of the Gastrointestinal Tract, 2. kiadás, 301-319, Raven Press, New York, USA (1987)] vagy 5. a pankreátikobiliáris kiválasztás megváltozása [Fine H. és munkatársai: Am. J. Physiol. 245, G358-G363 (1983)]. Emellett vagy ettől függetlenül, a hasnyálmirigy-sorvadás befolyásolható különböző tápanyagokkal, amelyek általában megtalálhatók a parenterális tápoldatokban [Wilmore W. W. és munkatársai: Surgery 104(5), 917-923 (1988)].

Felismertük, hogy a glutamin a normáltáplálékban jelen lévő mennyiségen felül adagolva növeli a szervezetnek a patológiás mikroorganizmusok által okozott fertőzésekkel szembeni ellenálló képességét. A kórokozó mikroorganizmusok fertőzésével szembeni fokozott rezisztencia pontos mechanizmusa még nem ismert, de vizsgálataink igazolták, hogy a normál táplálékon felül adagolt glutamin fokozza a bélnek azon képességét, hogy megakadályozza a kórokozó mikroorganizmusoknak a bélfalon keresztül történő áthatolását, valamint növeli a limfoid és mieloid eredetű sejtek, így a makrofágok számát és aktivitását [lásd az eredeti leírás 94. oldalán a XVI. táblázatot, valamint Zeigler és munkatársai: Annals of Internál Medicine 116(10), 821-829 (1992)].

HU 220 214 Β

A fenti felismerésre alapítva olyan készítmény előállítását igényeljük, amely glutamint tartalmaz, és fokozza a szervezet fertőzéssel szembeni ellenálló képességét.

A technika állása szerint a glutamin nem minősül esszenciális aminosavnak, és ezért a táplálékkal történő felvételét nem tartották fontosnak. Az előzetes vizsgálatok igazolták, hogy a glutamin, amely a vázizomszövetek egyik fő komponense, csökkenti a szövetek, így a vázizmok lebontását (Wilmore: Surgery 104, 917-923 (1988), Souba: Arch. Surg. 20, 66-70 (1985) és Souba: Thesis in Harvard Medical Library (1984)].

Nem ismert azonban, hogy a glutamin adagolása a bélfal permeabilitásának csökkentésével, valamint a limfoid és mieloid eredetű sejtek szaporodásának stimulálásával növeli a kórokozó mikroorganizmusok által okozott fertőzésekkel szembeni ellenálló képességet.

Az ismert tanulmányok nem utalnak arra, hogy a simaizomzat romlása, a bélbolyhok és a hasnyálmirigy sorvadása, a bélfalnak fokozott permeabilitást eredményező romlása, a veszélyeztetett immunfunkciók, és a TPN során jelentkező más lebontási zavarok nagy mennyiségű GLN adagolásával megelőzhetők.

A találmány értelmében a patológiás bélpermeabilitás és legyengült immunfunkciók kezelésére és megelőzésére, amelyek rákos betegeknél sugárterápia vagy kemoterápia, vagy intravénás táplálás következtében alakultak ki, valamint csontátültetés esetén terápiásán hatékony mennyiségben GLN-t adagolunk. A GLN-t nagyobb mennyiségben alkalmazzuk, mint az egészséges szervezet táplálékában található mennyiség. A GLN megnövelt szintje kompenzálja a bizonyos lebontási zavarok esetén jelentkező fokozott GLN-igényt. Az exogén források hiánya esetén a GLN az izomszövet lebontásából származik. Az a tény, hogy a lebontási zavarok során az izomszövet fokozott GLN-leadása ellenére csökken a plazma GLN-koncentrációja, szisztemikus GLN-hiányra utal. Az izomszövet fokozott GLN-leadása ellenére a bélnyálkahártyasejtek nem kapnak elegendő ellátást. Ez viszont a bélbolyhok sorvadásához és a bélválaszfalak elgyengüléséhez vezet. A bél védőrétegének elvesztése az ehhez kapcsolódó legyengült immunfunkciókkal együtt a bél- és más limfoid szövetekben fokozza a fertőzés veszélyét.

A találmány szerinti megoldás tehát lehetővé teszi a patológiás bélpermeabilitás és legyengült immunfunkciók kezelését, valamint a csontvelő-átültetéses beteg felépülésének gyorsítását oly módon, hogy terápiásán hatékony mennyiségben GLN-t vagy ennek funkcionális analógját adagoljuk.

A betegek exogén GLN-nel történő ellátása jobban kielégíti a vékonybél és az immunrendszer metabolikus igényeit, és csökkenti az általános fehérjelebontás mértékét. A csontvelő-átültetéses betegek GLN-nel történő ellátása különösen előnyös, mivel enyhíti a sugár- és kemoterápia, a transzplantátum/gazda betegség és a TPN következtében kialakuló gasztrointesztinális sérüléseket, és erősíti a legyengült immunfunkciókat. A GLN adagolása előnyös továbbá a gyulladásos bélbetegség esetén is.

Feltételezhető, hogy a glükokortikoidoknak a gyulladásos bélbetegségben kifejtett terápiás hatékonysága nemcsak gyulladásgátló tulajdonságainak következménye, hanem annak is tulajdonítható, hogy a bél enterocita barázdáiban fokozza a szubsztrátum lebontását. Exogén GLN adagolásával növeljük az enterociták szubsztrátumellátottságát, ami hozzájárul ahhoz, hogy megelőzzük a GLN kiürülését a plazmából és a vázizomzatból. Emellett a GLN elősegíti az átültetett vékonybél beilleszkedését, és megkönnyíti a fejletlen bélrendszerrel rendelkező csecsemő bélműködését.

A leíráshoz csatolt ábrák rövid ismertetése:

Az 1. ábra a nitrogénszintet ábrázolja a nitrogénfelvétel függvényében.

A 2. ábrában az 5. példában felvett adatok grafikonját adjuk meg, amellyel összehasonlítjuk az elágazó szénláncú aminosavak (BCAA) artériás vérben mérhető szintjét a BCAA adagolási mértékével. A megadott adatok az átlagértéket és a ± szórást adják meg. A sóoldattal kezelt állatoknál felvett adatokat nem ábrázoljuk.

A 3. ábra az 5. példa szerint meghatározott adatok grafikus ábrázolása, amelyben a BCAA-keringést (hátsó fertály) a BCAA-infúzióhoz viszonyítjuk.

A 4. ábra az 5. példában meghatározott adatok grafikus ábrázolása, amelyben a műtét után 6 órával mérhető BCAA-keringést, (hátsó fertály) az artériás vér BCAAkoncentrációjának növekedéséhez viszonyítjuk.

Az 5. ábra az 5. példában meghatározott adatok grafikus ábrázolása, amelyben a nitrogénkeringést (hátsó fertály) a műtét után 6 órával mérhető BCAA-keringéshez (hátsó fertály) viszonyítjuk.

A 6. ábra az 5. példában megadott adatok grafikus ábrázolása, amelyben a műtét után 6 órával mérhető nitrogénkeringést (hátsó fertály) az izmok intracelluláris aminosavszintjének nitrogéntartalmában 24 órával az operáció után bekövetkező változásához viszonyítjuk.

A 7. ábra a nagy dózisú GLN TPN hatását mutatja az allogén csontvelő-átültetés után mérhető kumulatív nitrogénegyensúlyra.

A találmány szerinti megoldás lebontásos, béllel összefüggő patológiás folyamatok (lebontási zavarok), így bélnyálkahártya- és hasnyálmirigy-gyulladás, fokozott bélpermeabilitás, legyengült védekezés és legyengült immunfunkció kezelésére alkalmas. A találmány értelmében az ilyen betegségekben szenvedő vagy ilyen betegségekkel fenyegetett egyedeknek terápiásán hatékony mennyiségben GLN-t adagolunk. A terápiásán hatékony mennyiség nagyobb mint a szokásos táplálékban található mennyiség. Embereknél a szokásos táplálékkal felvett mennyiség naponta mintegy 2-4 g.

A lebontási zavar olyan folyamat, amely valamely anatómiai szerkezet degenerálódása következtében lebontási választ vált ki. A GLN táplálékkal történő adagolása kielégíti az ilyen lebontási folyamatok biokémiai igényét, és így nincs szükség arra, hogy a szervezet GLN-t szintetizáljon vagy nyerjen ki a vázizmok gyengítésével.

A találmány szerinti megoldás minden olyan lebontási zavar esetén alkalmazható, amely fokozott GLNigénnyel jár együtt. Ezek a lebontási zavarok jelentkezhetnek a gasztrointesztinális traktus szerveiben és sejtjeiben, valamint más szervekben és sejtekben is. A vé4

HU 220 214 Β konybélbolyhoknak a parenterális táplálás során jelentkező sorvadása általában nem közvetlenül az enterociták lebontási aktivitásának következménye, hanem a táplálék GLN-hiányának eredménye.

Az „enterális” kifejezés azt jelenti, hogy a táplálékot a tápcsatorna gyomor és végbélnyílás közötti szakaszába adagoljuk.

A „parenterális” kifejezés azt jelenti, hogy a táplálékot az emésztőtraktuson kívüli szakaszba adagoljuk.

Fokozott GLN-igénnyel járó parenterális lebontási zavar különböző klinikai állapotoknál jelentkezhet, példaként említhető a szepszis, a sebészeti beavatkozás, az égési sérülések, a kalóriahiány és a szabályozatlan diabétesz.

A találmány szerinti megoldás alkalmazható embereknél és emlősállatoknál.

A patológiás bélpermeabilitás kifejezés azt jelenti, hogy a bélfal permeabilitása az említett betegségek következtében megnőtt. A bél permeabilitása különböző eszközökkel kimutatható, példaként említhető a gyomorba bejuttatott laktulóz felszívódásának és vizelettel történő kiválasztódásának mérése. A bélpermeabilitás káros növekedését kiválthatja például a rákos betegek kemoterápiája, a TPN, valamint más fertőzések és betegségek.

A kezelés alatt a betegséggel együtt járó egy vagy több szimptóma megelőzését, javítását vagy gyógyítását értjük.

A hasnyálmirigy-sorvadás alatt a hasnyálmirigyszövetek elvesztését vagy a hasnyálmirigy funkciójának kimaradását értjük.

A „legyengült immunfunkció” kifejezés az immunológiai folyamatok csökkenését jelenti, amely in vitro vagy in vivő módszerekkel követhető. Az ilyen funkciókra példaként említhető a limfocitáknak valamely antigénnel vagy mitogénnel kiváltott elszaporodása, az antitestválasz, és a sejtek által közvetített immunválasz, így a késleltetett hiperérzékenység. A legyengült immunfunkciók egyes változatai csökkenthetik a szervezetnek különböző patogénekkel, így patogén mikroorganizmusokkal szembeni ellenálló képességét.

A legyengült immunfunkció a kemoterápiás szereknek jól ismert következménye, de eredményezheti fizikai trauma, égés, alultápláltság, diabétesz és más betegség is.

A legyengült védekezés különböző fertőzésekkel, így patogén mikroorganizmusokkal, például baktériumokkal, vírusokkal vagy gombákkal kiváltott fertőzésekkel szembeni fokozott érzékenységet jelent. Ennek kiváltó oka lehet a bélfal védőrétegének gyengülése, ami lehetővé teszi, hogy a bélüregben található patogének áthatoljanak a nyálkahártya védőrétegén. Ez a gyengülés származhat veszélyeztetett immunfunkciókból, amelyekben az immunrendszer sejtjei akadályozva vannak abban, hogy válaszoljanak a patogén által kiváltott antigénszerkezetekre. A legyengült védekezés származhat továbbá más sejtek abnormális viselkedéséből, amelyre példaként említhető az elnyomott leukocitakemotaxisz, a falósejtműködés és -pusztulás, a megváltozott makrofágfunkció és a szervezet védekezésének más ösztönös mechanizmusai, amelyek szakember számára ismertek [Mims C. A.: The Pathogenesis of Infectious Disease, 2. kiadás, Academic Press, New York, USA (1982)].

Ismert továbbá, hogy nagyszámú sejttípus életben maradásához vagy növekedéséhez szükség van arra, hogy a szövet tenyésztésére alkalmazott közegben GLN jelen legyen [Freshney: Culture of Animál Cells, A Manual of Basic Technique, Alán R. Liss Inc. New York, USA (1983)]. így például a limfociták szaporodása és differenciálódása in vitro körülmények között erősen függ a GLN megnövelt koncentrációjától. Az in vivő GLN-hiány például egy GLN nélküli TPN következtében, a limfocitafunkciók csökkenéséhez vezethet. Ez a csökkenés részben megelőzhető, illetve részben javítható akkor, ha a TPN-készítményhez GLN-t adagolunk.

A „lényegében összefüggő” kifejezést olyan zavarokra vagy szimptómákra alkalmazzuk, amelyekre a találmány szerinti megoldás alkalmazható, vagyis a zavar során vagy után fokozódik a biokémiai GLN-igény.

A GLN adagolását végezhetjük enterálisan vagy parenterálisan. Az enterális adagolásra példaként említhető a keskeny furatú cső alkalmazása, amelyet az orron keresztül a gyomor- vagy nyombélszakaszba vezetünk, vagy sebészeti úton, például gyomorsipoly vagy éhbélsipoly kialakításával beültetünk. A parenterális adagolás megvalósítható például szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás injekcióval, valamint az orr-garat rendszeren keresztül, a nyálkahártyán keresztül vagy transzdermális abszorpcióval. A legtöbb esetben a GLN-t intravénásán adagoljuk. Az intravénás adagoláshoz a GLN terápiásán hatékony mennyiségét folyadék formájában közvetlenül adagoljuk egy tartályból, amit egy vezetékkel a beteg vénájába vezetett tűhöz csatlakoztatunk.

Az alkalmazott adagolási módszertől függetlenül a GLN adagolható önmagában vagy táplálék kiegészítéseként. Ez utóbbi esetben, a GLN az adagolás előtt a meglévő enterális vagy parenterális diétához keverhető. Lehetséges az is, hogy a GLN-t összekeverés nélkül adagoljuk, amelynek során például a GLN-t nem adagoljuk az iv. tápoldat tartályához, hanem egy szokásos kettős tartályból külön adagoljuk.

A GLN-nel azonos módon alkalmazhatók azok a funkcionális analógok, származékok, szubsztituált származékok, izomerek és homológok, amelyek megtartják a GLN jellemzőit. Előnyösek azok az analógok, amelyek képesek egy amincsoport leadására és lebonthatók a Krebs-ciklusban. Különösen előnyösek azok a vegyületek, amelyek az aminosavmaradékot a szénlánc egyik végén hordozzák, míg a másik végen egy amincsoport található.

A GLN terápiásán hatékony dózisa az a mennyiség, ami biztonságosan megakadályozza a szövetek lebontását és sorvadását, és így fenntartja a metabolikus homeosztázist. Az enterális diétában az GLN-t legalább 0,3 g/kg testtömeg napi dózisban adagoljuk. Az előnyös dózis ezen belül általában 0,3-2,0 g/kg, előnyösen 0,3-1,5 g/kg, elsősorban 0,4-1,0 g/kg naponta. Az intravénásán adagolt GLN dózisa naponta legalább

HU 220 214 Β

0,1 g/kg testtömeg, ezen belül általában 0,2-3,0 g/kg, előnyösen 0,3-2,5 g/kg, különösen előnyösen 0,4-2,0 g/kg testtömeg.

A találmány szerinti megoldás értelében a GLN adagolható a meglévő diétás készítmény egyszerű módosításával, amikor is megfelelő mennyiségben GLN-t adunk a készítményhez. Előnyösen úgy járunk el, hogy a GLN-t száraz formában, például steril liofilizált por formájában tároljuk, és adagoláskor aszeptikusán hidratáljuk és megfelelő koncentrációban a diétás készítmény más komponenseivel keveijük. Eljárhatunk úgy is, hogy a GLN-t előre elkeveijük a többi komponensből készített száraz készítménnyel, amit az adagoláskor aszeptikusán rehidratálunk, vagy fagyasztott koncentrátum formájában tárolunk, és adagoláskor megolvasztunk és megfelelő koncentrációban keverünk.

A GLN találmány szerinti alkalmazása előnyösen megvalósítható megfelelő készítmények formájában. Ezek a készítmények hatóanyagként GLN-t, GLN-t tartalmazó dipeptidet vagy GLN-sót tartalmaznak önmagában vagy más vegyi anyagokkal keverve. Ez utóbbiakra példaként említhetők a gyógyszerészeti hordozóanyagok, valamint a diéta egyéb hatóanyagai, például szabad aminosavak, fehéijehidrolizátumok vagy olajok.

Parenterális adagoláshoz alkalmazható készítményekre példaként említhető a steril vizes vagy nemvizes oldat, szuszpenzió és emulzió. Megfelelő hordozóanyagokkal és abszorbeáló anyagokkal növelhető a bőr permeabilitása, ami lehetővé teszi a szubkután felszívódást.

A találmány kiteljed minden olyan GLN-tartalmú készítmény előállítására, amely felhasználható a lebontási zavarok megelőzésére vagy enyhítésére. Ezek a készítmények a GLN-t terápiásán hatékony mennyiségben tartalmazzák, ami nagyobb, mint a szokásos táplálékban található mennyiség.

A találmány szerint előállított készítményt tartalmazó edények felhasználhatók a GLN adagolásának megvalósítására. Ezek az edények általában úgy vannak kialakítva, hogy például a beteg kezelésére szükséges napi GLN-dózist tartalmazzák.

Különösen előnyösek azok az edények, amelyek alkalmasak a GLN, valamint ennek más aminosavakkal képzett kombinációjának iv. adagolására. Ezek az edények előnyösen egy, a folyékony GLN-tartalmú készítmény tárolására alkalmas tartályból, valamint a folyadék elvezetésére alkalmas és a tűhöz csatlakoztatott vezetékből állnak.

A folyadék elvezetésére minden olyan vezeték alkalmazható, amely a tartályban lévő folyékony készítményt a tűhöz vezeti, példaként említhetők a műanyag csövek.

A vezetékhez csatlakoztatott tűt közvetlenül a vérerekbe juttatjuk, vagy intravénás katéterhez csatlakoztatjuk, vagy egy olyan tartályhoz kapcsoljuk, amelyben a készítményt az adagolás előtt egy másik oldattal keverjük.

A találmány szerinti megoldást közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

1. példa

A vizsgálati állatok kezelése és előkészítése

Vizsgálati állatként 22 darab keverékkutyát alkalmazunk, amelyek testtömege 20-40 kg, amelyek állandó ellenőrzés alatt állnak, parazitamentesek és a nőstény állatok nem terhesek. A kennelben elhelyezett állatokat a kísérleti és laboratóriumi állatokra vonatkozó előírásoknak megfelelően tartjuk. Az állatokat egyedi ketrecekben helyezzük el, és 20 °C hőmérsékleten tartjuk 24 órás megvilágítás mellett. Az állatokat minden reggel két órán keresztül sétáltatjuk, tetszés szerinti mennyiségű vízzel látjuk el, és 1-3 óra között naponta egyszer Agway Respond 2000 Dry Dog Chow kutyatáppal (összetétel: legalább 25 tömeg% fehérje, 10 tömeg% zsír és a maradék kalória szénhidrát formájában) etetjük. A kutyákat 5-7 napon keresztül szoktatjuk a vizsgálati körülményekhez, amelynek során az állatokat Pavlovhelyzetben trenírozzuk. A legelső mintavételt megelőző napon 5 órakor eltávolítjuk a maradék tápot. A kutyákat éjszakára megkötjük, majd legalább 20 percen keresztül sétáltatjuk, ezután Pavlov-helyzetben megkötjük, és az első láb vénájába kanült vezetünk. A kutyákat legalább 20 percen keresztül ebben a helyzetben hagyjuk, majd a vénából vérmintát veszünk az aminosav-összetétel meghatározásához. Az állatokat intravénás nátrium-tiopentállal (Abbott Laboratories, 5 mg/kg testtömeg) elaltatjuk, majd a széles laterális izmon próbakimetszést végzünk Bergstrom és munkatársai módszerével [Journal of Applied Physiology, 36, 693-697 (1974)]. Az állatokat ezután elengedjük ebből a helyzetből, és a combi artériából perkután 5 ml artériás vért veszünk.

Az állatokat a próbakimetszés után legalább 2 napon keresztül pihentetjük az alapvető beavatkozás előtt. Egy nappal a sebészeti beavatkozás előtt ismét eltávolítjuk a maradék táplálékot. Reggel 7 órakor a kutyákat 20 percen keresztül sétáltatjuk, majd a műtőasztalra helyezzük, és 30 mg/kg testtömeg iv. nátriumpentobarbitállal (Abbott Laboratories) elaltatjuk. Behelyezünk egy endotracheális csövet, és az állatokat oxigén és szobai levegő keverékével hagyjuk spontán lélegezni. Az állatokat hanyatt fektetjük, és perkután pungálással egy kanült vezetünk a külső nyaki vénába, és a kanült a felső vénakáva felé irányítjuk. A vizsgálat kezdetekor ezen a kanülön keresztlü állandó infúzió formájában (IMED szivattyú, San Diego, Califomia, USA) 4 ml/óra/kg áramlási sebességgel adagoljuk az infúziós oldatot. Intravénásán penicillin G-t (E. R. Squibb, Princeton, New York, USA; 600 mg) és Keflint (Eli Lilly, Indianapolis, Indiana, USA; 1 g) adagolunk. A húgyhólyagba katétert vezetünk, az induló vizeletmintát eldobjuk, és a katétert a vizelet 24 órán keresztül történő összegyűjtésére alkalmas zárt tartályhoz csatlakoztatjuk. Az állatok hasát és lágyékát leborotváljuk, és a bőrt szappannal és vízzel, majd povidon-jód preparatív oldattal (Clinipad Corporation, Guilford, USA) lemossuk. Az állatokat steril lappal letakaijuk, és a hasüreget nőstényeknél egy függőleges köldök alatti bemetszéssel, és hímeknél egy jobb középvonali bemetszéssel felnyitjuk. A belet visszahúzzuk a felső hasüregbe, és a feltárt retroperitóneumot bemetszük. A jobb mély körív

HU 220 214 Β alakú csípőartériát és -vénát, valamint a középső keresztcsonti artériát éles és tompa szétvágással izoláljuk. Egy speciális katétert, amely egy 6 cm-es, szilasztikkal bevont polietilénszegmenst (2,08 mm átmérő) és ehhez kapcsolódó 2,8 mm átmérőjű polietilénkatétert tartalmaz, 6 cm mélyen koponyairányban az aortába vezetünk, a jobb mély kör alakú csípőartérián keresztül. Egy hasonló katétert vezetünk be a középső keresztcsonti artériába, és csúcsát az aorta kettéágazásától mintegy 1 cm-re proximálisan, de az alsó bélfodor-artériától disztálisan helyezzük el. Egy harmadik katétert viszünk be az alsó vénakávába a jobb mély kör alakú csípővénán keresztül, és a vesevéna felé irányítjuk. A katétereket rögzítjük, és szúrt seben keresztül a lágyékon kívülre vezetjük. A hasüreget ezután lezárjuk, és az állatokat bal oldalukra fordítjuk. A külső katétereket megfelelő hosszúságúra vágjuk, és egy időszakos injekciós adagolóhoz (Jelco, Critikon Inc., Tampa, Florida, USA) csatlakoztatott tompa tűvel bedugaszoljuk, sóoldattal elárasztjuk, és heparinnal (1000 egység/ml) feltöltjük, majd a bőr alá süllyesztjük. Az injekciós adagolót az állat bőre alatt a lágyék magasságában és a gerincoszlop környékén rögzítjük. Ez lehetővé teszi az aortába és a vénakávába történő bejutást a katéter injekciós adagolásának perkután felszúrásával. Két további dózis Keflint (lg) adagolunk 8 és 24 órával a műtét után a vénás katéteren keresztül.

A műtét után az állatokat oldalra fektetjük, és a testhőmérsékletet melegítőlámpákkal és takarókkal az altatás befejeződéséig fenntartjuk. Mintegy 5 órával az infúzió megindítása után az állatokat Pavlov-helyzetbe helyezzük, és para-amino-hippursav-oldatot (PAH, 0,5 vegyes % sóoldatban) vezetünk be 0,76 ml/perc áramlási sebességgel egy Harvard-szivattyún keresztül a középső keresztcsonti artéria katéterébe, és így a disztális aortába. 40 perccel a színezőinfúzió után egyidejűleg artériás és vénás mintát veszünk, és mérjük az aminosav- és PAH-koncentrációt. Három mintát veszünk 10 perces időközökben 20 perces periódus alatt. A katétereket ezután átmossuk, heparinnal feltöltjük, és az állatokat Pavlov-hevederben tartjuk. 23 órával a kísérlet megindítása után a hátsó fertályi keringésvizsgálatot megismételjük. 24 óra elteltével befejezzük a vizelet összegyűjtését. Az állatoknak iv. nátrium-tiopentált adunk a fent leírt módon, és biopsziát veszünk a korábban érintetlen, széles laterális lábizomból. Az iv. infúziót leállítjuk, és az állatokat a következő 24 órára a ketrecekbe helyezzük, ahol tetszés szerinti mennyiségű vizet kapnak, de megvonjuk a táplálékot.

2. példa

Infúziós oldatok

Minden állat 4 ml/óra/kg infúziót kap. 5 kontrollállatnak 0,9 tömeg% sóoldatot adunk. A többi állatnak kereskedelmi forgalomban kapható aminosavoldatot (FreAmine III, American McGaw, USA) adunk két különböző koncentrációban, amellyel mintegy 0,312 g (N=2), illetve 0,624 g (N=6) nitrogénellátást biztosítunk 24 órára és 1 kg testtömegre vonatkoztatva. A magasabb dózis, fehérjére vonatkoztatva napi 4 g/kg testtömegdózissal ekvivalens. Három állatnak 0,312 g/kg napi nitrogénfelvételnek megfelelő mennyiségű GLN-t tartalmazó oldatot adunk. Az utolsó csoport (N=6) GLN és FreAmine elegyet kap, amellyel 0,624 g/kg napi nitrogénellátást biztosítunk. A GLN-oldat előállításához L-GLN-t (Sigma, St. Louis, USA) desztillált vízben oldunk 0,157 mol/l koncentrációban és nátriumhidroxiddal pH = 6,8 értékre állítjuk. Az oldatot 0,22 pm-es membránon sterilre szüljük, és 4 °C hőmérsékleten legfeljebb 24 órán keresztül tároljuk. Az alkalmazás reggelén az oldatot egy kétliteres edényben (American McGaw) a kívánt koncentrációra hígítjuk, és felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tartjuk. Az infúzió végén minden tartályból 10 ml-es mintát veszünk, és a nitrogéntartalom meghatározásáig -20 °C hőmérsékleten tároljuk. Egy további 10 ml-es mintát pH =4,75 értékre állítunk (lásd később), és a GLN-tartalom meghatározásáig fagyasztva tároljuk.

3. példa

A minták előkészítése és analízise

A teljes vér- és plazmamintát fehérjementesítjük, ehhez azonos térfogatú jéghideg 10 vegyes %-os perklórsavval elegyítjük, majd 3000 fordulat/perc értéken 4 °C hőmérsékleten 20 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszó 2 ml-es részletét 0,2 ml 0,2 mol/l nátrium-acetát-pufferrel (pH=4,90) pufferoljuk, majd 5 n káliumhidroxiddal pH=4,75 -4,90 értékre állítjuk, és desztillált vízzel 4 ml térfogatra töltjük. A mintákat -20 °C hőmérsékleten tároljuk a GLN- és glutamátkoncentráció meghatározásáig, amit Lund módszerének [Bergmeyer: Methods of Enzymatic Analysis, 4. kötet, Academic Press, 1719-1722 (1974)] módosításával enzimatikus mikrofluorométerrel végzünk.

A izombiopszia során megindítunk egy stopperórát a szövet eltávolításának pillanatában. Az izmot megszabadítjuk a zsírtól és a kapcsolódó szövetektől, majd két eltérő mennyiségű porcióra osztjuk. Mindkét mintát az elkövetkezendő két percben legalább négyszer leméijük, és feljegyezzük a mért tömeget és a kimetszés óta eltelt időt. Az izom 0 időpontra vonatkozó valóságos nedves tömegét az idő függvényében ábrázolt mért tömeghez legjobban illeszkedő egyenes alapján számoljuk. A kisebb mintát (mintegy 15 mg) 90 °C-os kemencében tömegállandóságig szárítjuk, majd petroléteres extrahálás után meghatározzuk a száraz, zsírmentes szilárd anyag tömegét. Ezt a mintát ezután 250 μΐ 1 n salétromsavban emésztjük, és a kloridtartalmat ezüst-nitráttal titrálva méijük egy félautomata titrátorban (Radiometer, Koppenhága, Dánia). Meghatározzuk továbbá a plazma kloridtartalmát, és Bergstrom idézett műve szerint az intracelluláris és extracelluláris víztartalmat. A második izommintát (mintegy 100 mg) 0,5 ml 10 vegyes %-os jéghideg perklórsavban homogenizáljuk egy Polytron Homogenizer (Brinkman, Westbury, New York, USA) segítségével. A homogenizátumot centrifugáljuk, és a felülúszót előkészítjük az enzimatikus GLN- és glutamátanalízishez.

A vizsgálat kezdetén a plazma- és intracelluláris GLN- és glutamátkoncentrációt enzimatikus módon a

HU 220 214 Β fent ismertetett eljárással [Muhlbacher és munkatársai: American Journal of Physiology, 247, E75-E83 (1984)] határozzuk meg. A többi aminosav mennyiségét automatizált HPLC segítségével mérjük előzetes o-ftálaldehid derivatizálás után. A fehérjékben található valamennyi aminosav mennyiségét meghatározzuk a GLN, glutamát, prolin, cisztein és lizin kivételével. A vizsgálatok előrehaladásával a GLN-glutamát HPLC segítségével történő méréséhez szükséges technikát is kifejlesztettük. A két módszerrel (enzimatikus és HPLC) mért minták összehasonlítható glutamin-glutamát koncentrációkat eredményeznek, ezért a vizsgálatok későbbi szakaszában csak a HPLC-analrzist alkalmazzuk. Az artériás és vénás minták PAH-koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg 5 tömeg% triklór-ecetsawal végzett fehérjementesítés (Muhlbacher és munkatársai idézett közleménye) után.

A 24 órás infúzió során összegyűlt vizeletet egy zárt gyűjtőrendszerben fogjuk fel, és megsavanyított hűtött tárolóban tároljuk. Az analitikai vizsgálatokhoz szükséges aliquot részt -20 °C hőmérsékleten tároljuk. Az infúziós oldat és a vizelet nitrogéntartalmát egy tételben macro-Kjeldahl-módszerrel [Peters és munkatársai: Quantitative Clinical Chemistry, II. kötet, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, USA, 516-538 (1932)] határozzuk meg. A statisztikai számításokat IBM 4341 számítógépen végezzük standard statisztikai csomag [Minitab, The Pennsylvania State University, State College, Pennsylvania, USA (1983)] felhasználásával. A kapott eredményeket átlagérték± szórás értékben fejezzük ki. Szükség esetén páros és páratlan Student t-tesztet végzünk. A különböző csoportok összehasonlításához szórásnégyzet-analízist végzünk. Regressziós analízist végzünk a legkisebb négyzetek módszerével. A 0,312 g/kg napi nitrogéndózist kapott csoport mintáinak kis mérete miatt a legtöbb statisztikai összehasonlítást csak a többi csoport között végeztük el.

A hátsó fertály véráramlását a fent leírt módon (Muhlbacher és munkatársai idézett műve) számoljuk, és a kapott értéket a testtömegre vonatkoztatjuk, hogy a különböző méretű állatokat összehasonlíthassuk. Az aminosaváramlás sebességét a véráramlás és az artériás/vénás koncentráció különbségéből számoljuk. Három készletmintát veszünk, az áramlást készletenként külön számoljuk, és meghatározzuk a három érték átlagát (Muhlbacher és munkatársai idézett közleménye). A teljes vérplazma és intracelluláris víz összaminosavnitrogéntartalmának meghatározásához figyelembe vesszük az egyes aminosavak nitrogéntartalmát, és az egyedi koncentrációkat összeadjuk.

4. példa

Plazma- és intracelluláris aminosavkoncentrációk

A plazma-aminosav koncentrációt az operáció előtt és 24 órával az operáció után mérjük. A sóoldattal kezelt állatokban a plazma össz-nitrogéntartalma változatlan marad a műtét során (I. táblázat). A GLN-koncentráció állandó értéken marad, de a BCAA-koncentráció megnő, a koncentrációk összege 326±21 pmol/l értékről 501 ±9 pmol/l értékre (p<0,01) nő. A 0,624 g/kg napi nitrogéndózissal kezelt állatokban növekvő tendenciát mutat a plazma nitrogénkoncentrációja, ami csak az aminosav- és GLN-eleggyel kezelt állatoknál volt statisztikailag szignifikáns. Ebben a csoportban a plazmaGLN koncentrációja is megnőtt. A BCAA-koncentráció minden aminosavinfüzióval kezelt állatban megnő.

A vázizom nitrogénkoncentrációja csökken a sóoldat infúziója során (II. táblázat). Az összaminosav-nitrogén tartalom csökkenése elsősorban abban jelentkezik, hogy az intracelluláris víz GLN-tartalma 21,48±3,21 mol/1 értékről 15,86±3,80 mol/1 értékre (p<0,05) csökken. Bár a nem esszenciális aminosavak koncentrációja csökken, az ossz esszenciális aminosavkoncentráció az intracelluláris részben változatlan marad. Nem változik az intracelluláris nitrogén- vagy GLN-tartalom a 0,624 g/kg napi nitrogénnel kezelt állatoknál (II. táblázat). Növekvő tendenciát mutat a BCAA intracelluláris koncentrációja a nagyobb aminosavtartalmú infúzióval kezelt állatoknál, de ez csak az aminosav és GLN eleggyel kezelt állatoknál volt statisztikailag szignifikáns. Ebben a két csoportban az operációt követően nincs kimutatható változás az esszenciális és nem esszenciális aminosavak összkoncentrációjában. A magasabb dózisú nitrogént kapó állatokkal ellentétben a 0,312 g/kg napi nitrogéndózissal kezelt öt államál nem maradt változatlan a vázizom intracelluláris nitrogéntartalma, ami független volt az infúzióhoz használt oldattól. Az intracelluláris GLN-koncentráció három államál csökken, egynél változatlan marad és egynél növekszik (az adatok nincsenek megadva).

Ez azt jelenti, hogy 0,624 g/kg napi nitrogénadagolás esetén, amit GLN-nel kiegészített vagy GLN nélküli aminosaveleggyel végzünk, változatlan marad a vázizom intracelluláris aminosavtartalma. Az intracelluláris tartalom csökkenése, ami az intracelluláris GLN-tartalom zuhanásában jelentkezik, következetesen a sóoldattal kezelt állatokban jelentkezik, és esetenként előfordul az alacsony dózisú aminosawal kezelt állatoknál.

A nettó hátsó fertályi aminosavkeringést az egyes aminosavak nitrogénáramlása összege alapján számoljuk, a kapott átlagérték -19,05 ±4,06 pmol/perc/kg 6 órával az operáció után a sóoldattal kezelt állatoknál. Ez lényegesen nagyobb, mint a 0,624 g/kg napi aminosavdózissal kezelt állatok két csoportjánál kapott -7,70±5,9 pmol/perc/kg és -6,50±l,18 pmol/perc/kg érték (III. táblázat). A hátsó fertály GLN-iirítése azonban mindhárom csoportnál változatlan maradt. Ezzel ellentétben BCAA szabadul fel a sóoldattal kezelt állatoknál, míg BCAA-felvétel mutatható ki a nagyobb dózisú aminosawal kezelt állatok két csoportjában. A BCAA hátsó fertályi változása feltehetően a BCAA-adagolás arányával van összefüggésben, mivel a hátsó fertály BCAA-felszabadulást mutat ki a sóoldattal kezelt csoportnál, egyensúlyt mutat az aminosav+GLN elegygyel kezelt állatoknál, és növekvő felvételt mutat a nagy mennyiségű BCAA-dózissal kezelt csoportnál. A 0,312 g/kg napi nitrogéndózissal kezelt öt állatnál a sóoldattal kezelt kutyákhoz viszonyítva nem mutatható ki szignifikáns változás a hátsó fertályi nitrogénkiürülésben. Jelentős változás van azonban a keringési ada8

HU 220 214 Β tokban, és a vizsgált állatok száma kicsi volt. Az operációt követő 24 óra elteltével végzett hátsó fertályt aminosaváramlási vizsgálatok nem mutatnak ki különbséget a két csoport között (III. táblázat).

A sóoldattal kezelt öt állat nitrogénkiválasztása 0,492+0,22 g/kg naponta. A nagy dózisú kereskedelmi aminosaveleggyel kezelt hat állat nitrogénfelvétele 0,632+0,001 g/kg és nitrogénkiválasztása átlagban 0,684+0,031 g/kg naponta (IV. táblázat). Az azonos arányú kereskedelmi aminosavoldat és GLN-eleggyel kezelt hat állatnál a nitrogénfelvétel összehasonlítható, de a kiválasztás nagyobb, átlagértéke 0,775+0,019 g/kg (p<0,05). Ennél a két csoportnál a nitrogénegyensúly lényegesen kisebb negatív szám, mint a sóoldattal kezelt állatoknál, átlagértéke -0,052+0,031 g/kg, és -0,140+0,022 g/kg. A mintegy 0,312 g/kg aminosavval kezelt Öt állatnál az átlagos nitrogénkiválasztás a sóoldattal kezelt kontrollcsoportnál és a nagy mennyiségű aminosavval kezelt állatoknál kapott értékek közé esik. Összesítve a vizsgálatok igazolják, hogy a nitrogénegyensúly egyensúlyi helyzetet közelít meg az adagolt nitrogén mennyiségének növelésével (1. ábra). A GLN és a kereskedelmi GLN-mentes aminosavoldat elegye additív hatást fejt ki a nitrogénegyensúlyra. Összeadva a kereskedelmi aminosav vagy GLN infúziója után visszatartott nitrogén megfelel az elegy adagolása esetén visszatartott nitrogénnek.

A vizsgálatok igazolják, hogy a műtéti stressz kutyákban stimulálja a vázizomfehéijék nettó gyengülését, amit a negatív nitrogénegyensúly és az intracelluláris vázizom szabad aminosavmennyiség csökkenésével párosulva a hátsó fertály aminosavkiválasztásának növekedése mutat. A korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a fehérjeveszteség nincs összefüggésben a lekötözéssel vagy altatással, hanem egyértelműen a műtéti stressz eredménye [Kapadia és munkatársai: Surgical Fórum, 33, 19-21 (1982)]. A sóoldattal kezelt csoportnál a 6 órával a műtét után a hátsó fertályból felszabaduló aminosav mennyisége mintegy 6-8-szor nagyobb, mint az alapkörülmények között vizsgált, és krónikusan katéterezett kutyáknál (Muhlbacher és munkatársai: American Journal of Physiology 247, E75-E83 (1984)]. Az ilyen arányú hátsó fertályi nitrogénfelszabadulás nem magyarázható az intracelluláris szabad aminosavtartalom csökkenésével, ezért a nettó vázizom proteolízisét tükrözi vissza.

A műtét korai periódusában adott aminosavellátás kiegyenlíti a nitrogénveszteséget, fenntartja vagy növeli a plazma-aminosavkoncentrációt, és enyhíti a vázizom intracelluláris szabad aminosavtartalmának csökkenését. Ezek a hatások összefüggésben vannak az adagolt aminosav nitrogéntartalmával. A teljes testre és a hátsó fertályra vonatkoztatott nitrogénveszteség jelentős mértékben csökken a nagy aminosavdózis esetén, ami változatlanul tartja a GLN és más aminosavak intracelluláris koncentrációját is. Ezek az eredmények eltérnek az Askanazi és munkatársai által megadott eredményektől (Askanazi és munkatársai: Annals of Surgery 191, 465 (1980)], amelyek szerint csípőpótlás után csökken a GLN és más aminosavak intracelluláris koncentrációja, ami dextróz- és aminosavinfűzióval nem állítható vissza. Az ismertetett vizsgálatban kapott eredmények alapján feltételezhető, hogy ez a korábbi tapasztalat az adagolt aminosavak mennyiségével és/vagy a GLN hiányával vannak összefüggésben. Ha akár a GLN-t, akár a FreAmine-t alacsony koncentrációban (0,132 g/kg napi dózis) adagoljuk, akkor az öt vizsgált állat közül háromnál elmarad az intracelluláris aminosavtartalom szinten tartása. Ezzel ellentétben, a nagy mennyiségű aminosavinfüzió stabilizálja vagy növeli az intracelluláris tartalmat. Ez alapján feltételezhető, hogy megfelelő mennyiségű nitrogén adagolásával műtét után is megtartható a vázizom intracelluláris aminosavtartalma.

Az intracelluláris szabad aminosavtartalomnak a sóoldattal kezelt állatoknál megfigyelhető változása nagymértékben a GLN-tartalom gyors csökkenésének tulajdonítható, ami kivédhető megfelelő nitrogénadagolással. Ez akkor is bekövetkezik, ha GLN nincs jelen a kereskedelmileg kapható oldatban. Nem ismert az a mechanizmus, amely a fenti körülmények között fenntartja az intracelluláris GLN-tartalmat, de feltehető, hogy a BCAA-ból transzaminálással a GLN-szintézishez szükséges GLN-szubsztrátum képződik. Ki nem derített okokból a nettó GLN-kiválasztás minden csoportnál hasonló. A hátsó fertály GLN-kiválasztását nem gyorsítja a BCAA és nem gyengíti az aminosav és GLN elegy adagolása. Ebben a posztoperatív modellben kapott eredmények eltérnek a BCAA egészséges humán egyedre gyakorolt hatásától, amikor is a leucin orális adagolása után az alsó karba adagolt BCAA fokozott GLNfelszabadulással társul [Aoki és munkatársai: Journal of Clinical Investigation 65, 1522 (1981)].

Bár jelentős eltérések vannak a 0,624 g/kg napi dózisban adagolt két aminosavoldat összetételében, a hátsó fertályi nitrogénkiválasztás mindkét állatcsoportban összehasonlítható. Ez annak ellenére bekövetkezik, hogy az esszenciális aminosavak és a BCAA mennyisége a kiegyensúlyozott oldatban kétszer akkora, mint a GLN-tartalmú oldatban. A műtéti stressz fenti kísérleti modelljében tehát a hátsó fertályi veszteség csökkentésében egy kiegyensúlyozott aminosavkészítmény GLN-nel történő kiegészítése legalább olyan hatékony, mint az eredeti kiegyensúlyozott készítmény kétszeres mennyisége.

A sóoldattal kezelt kutyákban BCAA szabadul fel a vázizomzatból. Az adatok alapján számolt kvantitatív átviteli arányok szerint jelentős BCAA-felvétel következik be a zsigeri szervekben, elsősorban a májban a korai posztoperatív periódusban. BCAA adagolásával ez a transzlokáció kiegyenlíthető, amelynek során feltehetően kielégítjük a zsigeri igényeket, és egyidejűleg visszaállítjuk a vázizom kiválasztását. Kvantitatív összefüggés is kimutatható a hátsó fertályi nitrogénegyensúly és az intracelluláris nitrogéntartalom megvédése között. Az intracelluláris nitrogéntartalom fenntartása esetén a hátsó fertályban kiegyenlítődik a nitrogén; sóoldat adagolása esetén az intracelluláris aminosavtartalom jelentősen csökken a hátsó fertályi nitrogénveszteséggel együtt. Bár a vázizom-proteolízis és a szabad aminosav9

HU 220 214 Β tartalom nitrogénkoncentrációja közötti összefüggés is- koncentrációval, és hogy a GLN lényeges szerepet játszmeretlen, az adatok azt sugallják, hogy a vázizom nitro- hat a test homeosztatikus egyensúlyának fenntartásában, génegyensúlya összefügg az intracelluláris aminosavI. táblázat

Plazma aminosavkoncentrációja (átlag± szórás)

	Műtét előtt	24 órával műtét után
Infúziós oldat	Össznitrogén (mmol/1)	GLN*** (pmol/l)	BCAA összege (pmol/l)	Össznitrogén (mmol/1)	GLN*** (pmol/l)	BCAA összege (pmol/l)
Sóoldat	4,51 ±0,37	845+99	326+21	4,56+0,29	74+60	501 ±9*
Aminosav (0,624 g/kg	4,84+0,58	829+87	339+31	5,57+0,61	631 ±75	767+99**
Aminosav+glutamin (0,624 g/kg)	3,86+0,29	643+36	297+31	5,92 ±0,49*	1042+88**	592+82*

* p< 0,01, a műtét előtti értékkel párosított t-teszttcl összehasonlítva. ** p< 0,001.

*** GLN=glutamin, BCCA=elágazó láncú aminosavak.

II. táblázat

Izmok aminosavas koncentrációja (átlag±szórás) (az intracelluláris vízre vonatkoztatva mmol/1 értékben kifejezve)

	Műtét előtt	24 órával a műtét után
Infúziós oldat	Nitro- gén	GLN	BCAA	EAA***	NEAA	Nitrogén	GLN	BCAA	EAA	NEAA
Sóoldat	69,8± 8,5	21,48+ 3,21	0,437+ 0,017	1,81 + 0,23	40,92 ± 4,38	52,8± 8,4**	15,86+ 3,80*	0,591 ± 0,0165	1,90+ 0,32	31,50+ 4,70**
Aminosav (0,624 g/kg)	65.2 ± 10.3	18,69+ 3,74	0,471± 0,074	2,24+ 0,29	39,00+ 6,10	62,5 ± 9,6	18,20+ 3,75	0,795+ 0,144	2,77+ 0,36	36,70 ± 5,40
Aminosav + glutamin (0,624 g/kg)	63,5 ± 7,0	19,85+ 3,17	0,442± 0,022	1,99+ 0,29	37,50+ 3,82	68,3 ± 4,4	21,65+ 2,08	0,773+ 0,125	2,72 ± 0,22	39,74± 2,34

* p<0,05, a műtét előtti értékkel párosított t-tcszttcl összehasonlítva. **p<0,01.

*** EAA=esszenciális aminosavak, NEAA=nem esszenciális aminosavak.

III. táblázat

Hátsó fertályt nitrogénáramkör (átlag± szórás; pmol/perc/kg)

	6 óra	24 óra
Összaminosav	Összaminosav
Infúziós oldat	Nitrogén	GLN	BCAA	Nitrogén	GLN	BCAA
Sóoldat	-19,05 ±4,06	-2,69+1,07	-1,41+0,26	-3,50+12,10	-1,71+0,70	0,49+1,51
Aminosav (0,624 g/kg)	-7,70+5,90	-1,93+0,59	1,62+0,86	-8,42+2,90	-1,24+0,44	2,08+1,53
Aminosav+glutamin (0,624 g/kg)	-6,52+ 1,81	-1,19+0,46	0,28+0,15	-3,03+3,75	-0,16+0,82	0,09+0,22

*p< a sóoldat eltér a 0,624 g/kg dózissal kezelt állatoktól.

** p< sóoldat<aminosav+glutamin<aminosav.

- = leadás.

+ = felvétel.

HU 220 214 Β

IV. táblázat Nitrogénegyensúly (átlag ± szórás)

	------Nitrogén g/24 óra/kg------
Infúziós oldat	Tervezett nitrogénfelvétel (g/24 óra/kg)	N	Mért felvétel	Kiválasztás	Balansz
Sóoldat	0	5	0	0,492+0,022*	-0,492+0,002**
Aminosav***	0,312	2	0,304+0,002	0,637+0,056	-0,332+0,058
Glutamin	0,312	3	0,323+0,003	0,709+0,085	-0,386+0,086
Aminosav***	0,624	6	0,632+0,001	0,684+0,031	-0,052+0,031
Aminosav Plus****	0,624	6	0,635+0,004	0,775+0,019	-0,140+0,022

* p<0,05, sóoldat<0,624 g/24 óra/kg aminosav<0,624 aminosav+glutamin. ** p<0,05, sóoldat<0,624 g/24 óra/kg aminosav+glutamin<0,624 aminosav.

*** FreAmine III.

**** A nitrogén egyik fele FreAmine, a másik fele glutamin.

5. példa

A BCAA-felvétel és az izmok szabad aminosavkoncentrációja meghatározza a posztoperatív izom-nitrogénegyensúlyt

A BCAA-infüziónak a vázizom és az egész test fe- 25 héqelebontás csökkentésére gyakorolt hatásának vizsgálatához különböző koncentrációjú BCAA-t tartalmazó aminosavkészítményeket adunk a műtét előtt a három csoportra osztott kutyáknak, amelyeken szokásos hasfelnyitást és hashártya mögötti bemetszést végez- 30 tünk. Egy negyedik csoportnak sóoldatot adagoltunk.

A hátsó fertály keringésmódszerével meghatározzuk az egyedi, és az összaminosav-nitrogén cserét, és felhasználjuk a vázizomfehéije-lebontás becsléséhez. Az intracelluláris szabad aminosavkoncentrációt perkután izom- 35 biopszia-mintán mérjük. A kísérlet során a különböző koncentrációjú BCAA-t tartalmazó iv. aminosavoldatoknak a vázizom aminosavlebontásának szabályozására gyakorolt hatását vizsgáljuk, amely a szokásos sebészeti beavatkozások után jelentkezik. A hátsó fertályt aminosaváramlás és a plazma és vázizom szabad aminosavkoncentrációjának a műtétet követő első 24 órán keresztül történő mérésével lehetővé vált a BCCA-t és más aminosavakat tartalmazó infuziólebontás elleni hatásának vizsgálata.

A) Anyagok és módszerek

1. Az állatok előkészítése és a vizsgálatok sorrendje

A vizsgálatot 27 darab 18-40 kg testtömegű hím és nem terhes nőstény keverékkutyán végezzük, amelyeket legalább egy héten keresztül szoktatunk a kísérleti körülményekhez, és a kísérleti és laboratóriumi állatokra vonatkozó előírások szerint tartunk. Az állatokat egyedi ketrecekben helyezzük el 24 órás megvilágítás mellett, és reggelenként sétáltatjuk. Vizet tetszés szerinti mennyiségben, táplálékot naponta egyszer Pro-Pet Respond 2000 száraz kutyatáp (Syreacuse, New York, USA) formájában, amely legalább 25 tömeg% fehérjét tartalmaz, és amelyet 1-3 óra között adunk. Az állatokat hozzászoktatjuk ahhoz, hogy több órán keresztül elviseljék a Pavlov-hevedert.

A kiindulási vizsgálatok vagy a műtét előtti nap 5 órakor eltávolítjuk a maradék táplálékot, a kiindulási vizsgálatokat reggel 8 órakor végezzük, majd az állatokat megsétáltatjuk, és a hevederbe helyezzük. A vizsgálatok során vérmintát veszünk a kanülált elsőláb-vénából, amelyből meghatározzuk a plazma aminosavtartalmát, és nátrium-tiopentál altatás (Abbott, Észak-Chicago, USA, 5 mg/kg testtömeg, iv.) mellett perkután tűszerű biopsziát veszünk a széles laterális izomból, amelyből meghatározzuk az intracelluláris szabad aminosavakat. A biopszia után az altatás alatt lévő kutyákból 5 ml artériás vérmintát veszünk a combi véna perkután pungálásával, és meghatározzuk a vér összaminosav-tartalmát.

A további vizsgálatok előtt az állatokat 3 napon keresztül pihentetjük. A műtét előtti napon egy éjszakára megkötjük az állatokat, majd reggel 7 órakor megsétáltatjuk, és a műtőbe visszük, ahol nátrium-pentobarbitállal (Abbott, Észak-Chicago, USA, 30 mg/kg testtö40 meg, iv.) az első lábba vezetett kanülön keresztül elaltatjuk. Bevezetünk egy endotracheális csövet, és az állatokat szobai levegő és oxigén elegyével 5 1/perc mennyiségben hagyjuk spontán lélegezni. Az állatokat a műtőasztalra helyezzük, hanyatt fektetjük, és egy 16-Fr katé45 tért vezetünk be perkután a felső vénakávába a külső nyaki vénán keresztül. A kezdeti időpont lejegyzése után a központi katéteren keresztül egy IMED-szivattyú (San Diego, Califomia, USA) segítségével megindítjuk a sóoldat vagy a megfelelő vizsgált aminosavoldat infu50 zióját. Cefalotint (Lilly, Indianapolis, Indiana, USA, 1 gramm, iv.) adagolunk közvetlenül a műtét előtt és a műtét befejezése után. A húgyhólyagba katétert vezetünk, és a maradék vizelet eldobása után zárt rendszerben összegyűjtjük a vizeletet az infúzió megindításától 55 számított 24 órán keresztül. Az iv. infúzió befejezése után a lebontási ketrecbe helyezett állatoktól egy második 24 órás periódusban is összegyűjtjük a vizeletet.

Az állatok hasát és lágyékát leborotváljuk, szappannal és vízzel, majd povidon-jodid-oldattal mossuk. Az 60 állatokat sterilen letakarjuk, és a hasüreget nőstények11

HU 220 214 Β nél egy köldök alatti középvonali bemetszéssel, és hímeknél egy jobb középvonali bemetszéssel felnyitjuk. A beleket oldalra húzzuk, és a retroperitoneumot feltárva teljesen kimetszük a disztális aortát, és a felső vénakávát. Izoláljuk továbbá a jobb mély körív alakú csípőartériát és vénát, valamint a jobb belső csípőartériát. A két artériát egy speciális katéterrel látjuk el, amely egy 6 cm-es polietilénszegmenst (2,08 mm átmérő) és ehhez kapcsolódó 2,8 mm átmérőjű polietiléncsövet tartalmaz. Az egyik artériás katétert 6 cm proximális helyzetben az aortába vezetjük a körív alakú csípőartérián keresztül, a másik katétert az aorta-kettéágazástól 1 cm-re proximálisan, de a farokvégi bélfodor-artériától disztálisan helyezzük el a belső csípőartérián keresztül. Egy harmadik katétert vezetünk be a felső vénakávába a mély körív alakú csípővénán keresztül, és a vesevénához képest disztálisan helyezzük el. A katétereket rögzítjük, és szúrt seben keresztül a jobb lágyéknál kivezetjük. A hasüreget lezárjuk, és az állatokat bal oldalukra fordítjuk. A kivezetett katétereket megfelelő hosszúságra vágjuk, tompa tűvel ledugaszoljuk, időszakos injekciós adagolóhoz (Jelco, Critikon, Tampa, Florida, USA) csatlakoztatjuk, sóoldattal átmossuk, heparinnal (100 pegység/ml) feltöltjük, és a bőr alá süllyesztjük. Az injekciós adagolókat a lágyékban magasan rögzítjük, és így lehetővé tesszük az artériás és vénás vér perkután beszúrással végzett könnyű eltávolítását.

A fenti művelet után, ami általában 2 órát igényel, az állatokat oldalra fordítjuk, és a testhőmérsékletet takaróval szabályozzuk az altatás fennmaradó idejében. 5 órával az infúzió és a műtét megkezdése után az állatokat Pavlov-hevederbe helyezzük, és 0,5 tömeg% para-amino-hippurát- (PAH-) oldatot vezetünk be infúzió formájában 0,7 ml/perc áramlási sebességgel egy Harvard-szivattyú segítségével a disztális aortakatéteren keresztül. 40 perces színezőinfúzió után három sorozat artériás és vénás vérmintát veszünk 10 perces intervallumokban az aminosav- és a PAH-koncentráció meghatározásához. A katétereket ezután átmossuk, és heparinnal feltöltjük. Az állatokat a hevederben tartjuk állandó megfigyelés mellett, míg a hátsó fertályi áramlási vizsgálatot 24 órával az infúzió megkezdése után megismételjük. Ekkor befejezzük az első 24 órás vizeletgyűjtési szakaszt, és egy második perkután hátsóvégtag-biopsziát végzünk azon a lábon, amely korábban érintetlen maradt, ismét rövid általános altatás közben. Az infúziót ezután befejezzük, és az állatokat egy második 24 órás periódusra lebontási ketrecekbe helyezzük.

2. Infúziós oldatok

Az oldatokat 4 ml/perc/kg sebességgel adagoljuk. Öt kontrollállatnak 0,9 tömeg% sóoldatot adunk. Három különböző koncentrációban (az összaminosavra vonatkoztatva 11 tömeg%, 22 tömeg% és 44 tömeg%) BCAA-t tartalmazó aminosavoldatot (V. táblázat) állítunk elő egy 8,5 tömeg%-os standard aminosav-összetételű FreAmine III készítményből (American McGaw, Irvine, Califomia, USA) kiindulva. Az össz-BCAAinfüzió aránya 0,46,0,92 és 1,84 g/kg naponta. A három aminosavkészítmény nitrogénre nézve azonos, és mintegy 0,624 g/kg napi nitrogéndózist biztosít, ahol a valin/leucin/izoleucin aránya 1:1,38:1,05. Kilenc állatnak 11 tömeg%-os BC AA-oldatot adagolunk, amelynek előállításához nem esszenciális aminosavak (NEAA) elegyét 2,13 tömeg%-os FreAmine III oldatban oldva 0,624 g/kg napi nitrogénellátást biztosító oldatot készítünk. Hat állatnak L-GLN-t tartalmazó NEAA-készítményt, és három állatnak a FreAmine III készítményben található összes NEAA (alanin, glicin, arginin, hisztidin, szerin és prolin) azonos arányú elegyét tartalmazó NEAA-készítményt adagolunk. Hat állatnak 4,25 tömeg% FreAmine III készítményt adagolunk (22 tömeg% BCAA). A maradék hét állatnak 44 tömeg%-os oldathoz szükséges mennyiségű BCAA-val kiegészített 2,13 tömeg%-os FreAmine III készítményt adagolunk. Ez utóbbi készítmény nitrogéntartalmát L-GLN adagolásával (n=4) vagy a FreAmine III készítményben található NEAA-k adagolásával (n=3) kiegyenlítjük. Az oldatokat 0,22 pm-es szűrőn (Millipore, Millis, USA) sterilre szűtjük, és 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül a felhasználás előtt tároljuk. Minden oldatból 10 ml-es mintát veszünk az infúziós periódus végén, és a nitrogéntartalom macro-Kjeldahl-módszerrel történő meghatározásáig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

3. Vér-, szövet- és vizeletminták előkészítése és analízise

A vér- és plazmamintákat azonos térfogatú jéghideg 10 tömeg%-os perklórsav (PCA) hozzáadásával fehéijementesítjük, majd 4 °C hőmérsékleten 7000 fordulat/perc értéken 20 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszó 2 ml-es aliquot részét 0,3 ml 0,2 mol/1 nátrium-acetát-pufferrel (pH=4,90) pufferoljuk, 5n kálium-hidroxid-oldattal pH=4,75-4,90 értékre állítjuk, desztillált vízzel 4 ml-re töltjük, és ismét centrifugáljuk. A kapott felülúszót -20 °C hőmérsékleten tároljuk a vizsgálatokig.

Az izombiopszia során megindítunk egy stopperórát a szövet eltávolításának időpontjában. Az izomról eltávolítjuk a zsírt és a kötőszövetet, majd két különböző méretű részre osztjuk. A minták tömegét 1 percen keresztül 25 másodperces intervallumokban mérjük, és az izom kezdeti nedves tömegét az idő függvényében felvett mért adatokhoz legjobban illeszkedő egyenes 0 időpontra történő kiteijesztése alapján számoljuk. A kisebbik mintát (mintegy 15-20 mg) 90 °C hőmérsékletű kályhában tömegállandóságig szárítjuk, és a száraz, zsírmentes, szilárd anyag tömegét petroléterben végzett extrahálás után mérjük. A mintát ezután 250 ml 1 n salétromsavban duzzasztjuk, és a kloridtartalmat ezüstnitráttal történő titrálással egy félautomata titrátorban (Radiometer, Koppenhága, Dánia) mérjük. A plazma kloridtartalmát hasonló módon határozzuk meg. Az intracelluláris és extracelluláris víztartalmat ezután a fent ismertetett kloridtechnikával számoljuk. A második izommintát (mintegy 80-100 mg) lemérjük, és 0,5 ml jéghideg PCA-oldatban egy politron homogenizátorban (Brinkman, Westbury, New York, USA) homogenizáljuk. A homogenizátumot centrifugáljuk, és a felülúszót puffer hozzáadásával és pH =4,75 -4,90 értékre történő

HU 220 214 Β állításával a vér- és plazmamintánál leírt módon előkészítjük az analízishez.

A teljes vér, plazma és izom intracelluláris GLN- és glutamátkoncentrációt enzimatikus mikrofluorometriás módszerrel határozzuk meg Lund módszerének módosított változatával vagy o-ftálaldehiddel végzett derivatizálás után automatikus HPLC-módszerrel mérjük [Smith és munkatársai: J. Liq. Chromatoq. 8,1783-1795 (1985)]. A két módszerrel összehasonlítható eredményeket kapunk. A többi aminosavat a prolin, cisztein és lizin kivételével hasonló HPLC-módszerrel határozzuk meg. A PAH artériás és vénás vérben található koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg 5 tömeg%-os triklór-ecetsavval végzett fehéijementesítés után [Muhlbacher és munkatársai: Am. J. Physiol. 247, E75-E83 (1984)].

A 24 órás infúzió során kiválasztott vizeletet egy zárt vizeletgyűjtő rendszerben gyűjtjük, és savanyított, hűtött edényekben tároljuk. Az aliquot részeket -20 °C hőmérsékleten tároljuk a nitrogén későbbi macro-Kjeldahl-módszerrel [Peters és munkatársai: Quantitative Clinical Chemistry, II. kötet, 516-538, Williams and Williams (1932)] történő meghatározásához. Egy másik részletet 10 percen keresztül 2000 fordulat/perc értéken centrifugálunk, és fagyasztva tároljuk a karbamid- és kreatinintartalom Technicon Auto-analizátorral (Tanytown, New York, USA) történő meghatározásáig.

4. Számítások és statisztikai analízis

A hátsó fertályi vérkeringést a fent leírt módon (Muhlbacher F. és munkatársai idézett műve) számoljuk. Az egyedi aminosavakra vonatkoztatott áramlást a vérkeringés és az artériás/vénás koncentráció különbsége alapján számoljuk. Alkalmanként három mintát veszünk, mindhárom mintában meghatározzuk a keringést, és a három értéket átlagoljuk. A teljes aminosavnitrogén keringést a plazmára és a vérre vonatkoztatva, valamint az intracelluláris nitrogénkoncentrációt a mért aminosavakban található nitrogéntartalom mmol menynyiségben kifejezett összege alapján számoljuk. A vázizom szabad intracelluláris aminosavkoncentrációját az intracelluláris vízre vonatkoztatva fejezzük ki. A statisztikai számításokat standard statisztikai csomag (Minitab, Pennsylvania State University, State Collage, USA) segítségével végezzük. Az eredményeket átlagérték±szórás egységben fejezzük ki. Kívánt esetben párosított és páratlan Student t-tesztet végzünk. A szórásanalízist többszörös csoport-összehasonlítással végezzük. A regressziós analízist a legkisebb négyzetek segítségével hajtjuk végre.

B) Mérési eredmények

A műtéti beavatkozást valamennyi állat túlélte egy kivételével, amely a nátrium-pentobarbitál beadása után röviddel az iv. infúzió megindítása előtt elpusztult. Ezt az állatot nem számítottuk bele a további vizsgálatokba. A beavatkozás során a vérveszteség egységesen minimális volt. Valamennyi mintakatéter nyitott volt a 6. és 24. órában egy vénás katéter kivételével a 24. órában a 22 tömeg% BCAA-csoportban.

A hátsó fertályi véráramlás a 6. órában 36,1 ±6,8 ml/ /perc/kg a sóoldattal kezelt kontrollcsoportban és nem befolyásolta a kezelés (11 tömeg% BCAA, 33,3±4,9, 22 tömeg% BCAA, 44,4±8,8, 44 tömeg% BCAA, 28,7±3,5, ahol a különbség nem szignifikáns). A 24. órában mért áramlás változatlan (57,9± 10,2, 38,6±8,2, 54,9±6,5,49,7± 13,2). A magasabb áramlási adatok felé irányuló tendencia és a 24. órában mért nagyobb változékonyság az állatoknál az altatásból történő felébredés után tapasztalható nagyobb motoros aktivitásnak tulajdonítható.

1. Vizelet-nitrogénkiválasztás és -nitrogénegyensúly

A műtét után a kiválasztott vizelet térfogata összehasonlítható mind a négy kezelt csoportban, bár a sóoldattal kezelt állatok valamivel kevesebb vizeletet választanak ki (VI. táblázat). A vizelet nitrogénkiválasztása átlagban 0,492 ±0,20 g/kg naponta a sóoldattal kezelt csoportban. Az aminosavval kezelt állatok 35-65%-kal több nitrogént választanak ki, mint a sóoldattal kezelt csoport, amely elsősorban karbamid formájában jelentkezik. A 22 tömeg% BCAA-oldattal kezelt állatok lényegesen kevesebb karbamid-nitrogént és kisebb össznitrogén-tartalmat mutatnak, mint all vagy 44 tömeg% BCAA-oldattal kezelt csoport. A kreatinin és az ammónia kiválasztása minden csoportban összehasonlítható.

A vér karbamid-nitrogén szintjét és a plazma kreatininszintjét a műtét előtt és 24 órával a műtét után minden csoportból kiválasztott állatokon végezzük. A mért koncentrációk a normális szintet képviselik minden államál a műtét előtt, és legfeljebb enyhe csökkenést mutatnak a műtét után. Ez azt jelenti, hogy a karbamid vizeleten keresztül történő kiválasztódása hasonló arányú, mint a karbamid termelése, a 11 és 44 tömeg% BCAA-oldattal kezelt állatoknál megfigyelhető nagyobb karbamidtermelés szignifikáns összefüggést (p<0,05) mutat a BCAA- és NEAA-adagolással bevitt extranitrogénnel.

A nitrogénegyensúly aminosavadagolás esetén kevésbé negatív, a bevitt aminosav-nitrogénnek mintegy 50%-a felszívódik. A nitrogénfelvétel minden aminosavval kezelt állatnál azonos volt, ezért a nitrogénkiválasztás említett megváltozása visszatükröződik a nitrogénegyensúlyban (VI. táblázat). A 22 tömeg% kiegyensúlyozott aminosavoldattal kezelt állatok ezért lényegesen több nitrogénabszorpciót mutatnak, mint all vagy 44 tömeg% BCAA-oldattal kezelt állatok.

2. Teljes véraminosav-koncentráció

A sóoldattal kezelt állatoknál a teljes véraminosavnitrogén tartalom 6 órával a műtét után leesett, majd 24 órával a műtét után az eredeti, műtét előtti szintre visszatért (VII. táblázat). Ez az átmeneti aminosavhiány nagyrészt a nem esszenciális aminosavak (glutamin, alanin, arginin, szerin és aszparagin) koncentrációjának csökkenésével magyarázható, bár néhány esszenciális aminosav (treonin és tirozin) koncentrációja is szignifikáns mértékben lecsökken. Ezzel ellentétben, az aminosavinfüzióval kezelt állatoknál a teljes véraminosavnitrogén koncentráció a műtét utáni 6. órában változatlan marad. Ez a szint 24 órával a műtét után a műtétet megelőző kontrollérték fölé emelkedik (p<0,05).

Az aminosavinfúzióval kezelt állatoknál a vér egyes aminosavtartalma az infúziós oldat összetételéhez igazo13

HU 220 214 Β dik. így például a BCAA-koncentráció összefüggést mutat a BCAA adagolásának arányával mind a 6., mind a 24. órában (2. ábra). Általában, a teljes vér-GLN-koncentráció a 6. órában alacsonyabb, mint a műtét előtt (VII. táblázat). A kivételt a GLN-nel kiegészített 11 tömeg% BCAA-oldattal kezelt állatok csoportja képezi, amelyekben a vér GLN-koncentrációja változatlan marad. Ezeknél az állatoknál a GLN tartalmazza a nem esszenciális nitrogéntartalomnak több mint felét, és a teljes aminosavtartalomnak több mint 40%-át. A GLN-tartalmú infúzióval kezelt állatoknál a 24. órában a normálist meghaladó teljes vér-GLN-koncentráció mérhető.

3. Vázizom intracelluláris szabad aminosavtartalma

A sóoldattal kezelt állatoknál az intracelluláris szabad aminosav nitrogéntartalma a 24. órában lényegesen lecsökken a műtét előtti szinthez viszonyítva (VIII. táblázat). Ez a változás nagyrészt (65%) az intracelluláris GLN-tartalom csökkenésének tudható be, amely az ossz intracelluláris szabad aminosavtartalom fő komponensét jelenti. Az aminosavinfuzióval kezelt állatoknál az intracelluláris nitrogéntartalom változatlan marad, bár a GLN-mentes 11 tömeg% BCAA-oldattal kezelt állatoknál az intracelluláris GLN-tartalom csökken. Az intracelluláris GLN-szint növekedést mutat a GLN-nel dúsított oldattal kezelt állatoknál, és a BCAA-koncentráció a BCAA-infüzióval azonos mértékben növekszik.

4. Hátsó fertályi aminosavkeringés

A sóoldattal kezelt állatoknál hátsó fertályi aminosav-nitrogén felszabadulás mutatható ki a műtét utáni 6. órában (IX. táblázat). Ez a fokozott aminosavkiválasztás jelentkezik szinte valamennyi mért aminosavnál, így BCAA-nál. Ebben az időpontban egyedül a glutamát- és az aszpartátbalansz marad változatlan a hátsó fertályban. A 24. órában a hátsó fertályi aminosav-nitrogén kiválasztás mértéke lecsökken, és az artériás/vénás különbség szinte valamennyi aminosavnál megközelíti a nullát, bár nagy változékonyságot mutat. A GLNkiválasztás ebben az időpontban változatlan marad.

Az aminosavinfüzióval kezelt állatok valamennyi csoportjánál a hátsó fertályi aminosav-nitrogén kiválasztás a 6. órában azonos volt, és értéke lényegesen kisebb, mint a sóoldattal kezelt állatoknál (p<0,05). A 6. órában a GLN-kiválasztás és az alaninkiválasztás az aminosawal kezelt állatoknál kisebb értéket mutat, mint a sóoldattal kezelt kontrollcsoportnál. Míg a BCAA a sóoldattal kezelt állatoknál a 6. órában válik ki, ezek az aminosavak nem válnak ki az aminosavinfüzióval kezelt állatoknál. A BCAA hátsó fertályi felvétele összefüggést mutat a BCAA-adagolás mértékével (3. ábra) és a teljes BCAA-koncentrációval (4. ábra).

A 24. órában a hátsó fertályi aminosav-nitrogén kiválasztás minden aminosavinfuzióval kezelt csoportnál azonos, és változatlan a 6. órában mért értékhez képest. A 24. órában a BCAA hátsó fertályi kiválasztása enyhén pozitív, és valamivel magasabb értéket mutat a 22 tömeg% és a 44 tömeg% BCAA-oldattal kezelt csoportnál. Ebben az időpontban a BCAA-felvétel nincs összefüggésben a vérkoncentrációval és a BCAA-adagolás mértékével.

5. A BCAA-infúzió, a hátsó fertályi BCAA-felvétel és a hátsó fertályi aminosav-nitrogén felszabadítás közötti összefüggés

A sóoldattal kezelt kutyáknál a 6. órában a hátsó fertályi BCAA-kiválasztás összefüggésben van a gyorsított aminosavkiválasztással. Az aminosavinfüzióval kezelt állatoknál a hátsó fertályi nitrogénegyensúly összhangban van a BCAA-felvétellel (5. ábra). Az analízisben nem vesszük figyelembe a sóoldattal kezelt kontrollcsoportot, mivel ezek nem kaptak nitrogént, és ezek figyelembevétele befolyásolná a regressziós egyenes meredekségét. Az összhang megmarad akkor is, ha a BCAA-keringést nem számítjuk bele a hátsó fertályi aminosav-nitrogén áramlásba (p<0,02, r=0,49). Ez azt jelenti, hogy a BCAA-áramlástól független nitrogénáramlás is összefüggést mutat a BCAA-felvétellel. A nitrogénáramlás nincs összhangban a vér össz-BCAA koncentrációjával, és a BCAA adagolásának mértékével. A fenti összefüggések a 24. órában nem érvényesek.

A 6. órában mérhető hátsó fertályi aminosav-nitrogén felszabadítás összhangban van az intracelluláris szabad aminosav-nitrogén tartalom változásával is (6. ábra). Az intracelluláris GLN-tartalom megváltozása szoros összefüggést mutat az ossz szabad aminosav-nitrogén tartalommal (p<0,001, r=0,90), és így a GLNszint megváltozása szintén szignifikáns összefüggést mutat a hátsó fertályi nitrogénkiválasztással (p<0,05, r=0,66). Ez a matematikai összefüggés érvényes akkor is, ha a hátsó fertályi aminosav-nitrogén elválasztást az intracelluláris nitrogéntartalom megváltozása figyelembevételével korrigáljuk. Mivel az elválasztási arányokat és a koncentrációértékeket különböző időpontokban határoztuk meg, a korrekció során abból indulunk ki, hogy az intracelluláris aminosavtartalom változásában két különböző arány érvényesül. Először feltételezzük, hogy az intracelluláris mennyiség megváltozása a műtétet követő első 6 órában jelentkezik. A második esetben abból indulunk ki, hogy a változás állandó értéket mutat 24 órán keresztül. Egyik korrekció sem változtatja meg az intracelluláris nitrogéntartalom megváltozása és az aminosav-nitrogén kiválasztás közötti összefüggést.

A BCAA-felvétel nem mutat összefüggést a 6. vagy 24. órában a fokozott hátsó fertályi GLN-kiválasztással. A BCAA-felvétel független továbbá a vázizom intracelluláris szabad aminosavtartalmának megváltozásától is (r=0,l 1, nem szignifikáns). A hátsó fertályi nitrogénáramlás előre kiszámítható, és a változók figyelembe vehetők a 6 órás BCAA-keringés és a szabad aminosavnitrogén tartalom megváltozása vonatkozásában is. Az összefüggés az alábbi egyenlettel fejezhető ki:

y=-9,58+0,27x₁+3,02x₂, ahol y az aminosav-nitrogén áramlást mutatja a 6. órában (pmol/perc/kg),

X! a BCAA-áramlást mutatja a 6. órában (pmol/perc/kg), x₂ a vázizom intracelluláris szabad aminosav-nitrogén tartalmának változását mutatja a műtét előtt és a műtét után (mmol/l/nap), n=22, p=0,05, r=0,86.

HU 220 214 Β

C) Az adatok kiértékelése

Az elaltatott kutyákon végzett egységes hasműtét kiváltja a kritikus betegségben szenvedő humán betegeknél megfigyelhető legtöbb lebontási reakciót. A szervezet össz-fehérjelebontása, mint ezt a vizelet nitrogén- 5 kiválasztása igazolja, fokozódik. A sóoldattal kezelt kontrollállatok mintegy 12-15 g nitrogént választanak ki a műtétet követő első 24 órán belül. A fenti modellel végzett előzetes tanulmányok szerint a nitrogénegyensúly a műtétet követő 3 napon keresztül negatív marad a táplálékfelvételtől függetlenül [Kapadia és munkatársai: Surg. Fórum 33, 19-21 (1982)]. Ezzel ellentétben, a színlelt műtéten átesett, és párosán etetett állatok nitrogénkiegyensúlyozást mutatnak a műtétet követő első napon. A vizeleten keresztül bekövetkezett fokozott nit- 15 rogénveszteséggel összhangban és azzal együttműködve a hátsó fertályi össz-aminosav-nitrogén kiválasztás a műtét utáni 6. órában 6-8-szor nagyobb, mint a kontrollállatoknál egy éjszakán keresztül történő megkötés után mért érték (Muhlbacher és munkatársai idézett 20 műve). A sóoldattal kezelt állatoknál megfigyelhetők egyéb változások, így a vér és vázizom aminosavkoncentráció-csökkenése, összhangban van az embereknél bekövetkező lebontási folyamatok során megfigyelhetők változásokkal [Askanazi és munkatársai: Ann. 25 Surg. 192, 78-85 (1980)]. így az alkalmazott modell olyan műtét utáni válaszokat ad, amelyek azonosak a kritikus betegségben szenvedő humán betegnél bekövetkező változásokkal, és ezért az exogén aminosavaknak a nitrogénlebontásra és a vázizom aminosavváltozására gyakorolt hatásvizsgálatára alkalmas.

A sóoldattal kezelt állatoknál a hátsó fertályi aminosav-nitrogén felszabadulás lényegesen növekszik a műtétet követő 6 órában. Ez az össz-vázizom-BCAAfelszabadulással összhangban történik. Ugyanakkor a teljes vér-BCAA-koncentráció változatlan marad, ami arra utal, hogy a zsigeri szervek BCAA-fogyasztása durván azonos a vázizom gyorsított felszabadításával. 10 Az aminosawal kezelt állatoknál a hátsó fertályi összaminosav-felszabadulás kisebb mértékű, az összvér- és -vázizom-nitrogén-tartalom változatlan marad, a hátsó fertály a BCAA-felszabadító szervről áttért felvételt biztosító szervre. A BCAA felvétele, és ezen belül a leucin felvétele nincs összefüggésben a GLN vázizomban bekövetkező fokozott felszabadulásával.

A vizsgálatok igazolják, hogy a vázizom aminosavfelszabadulása és ezáltal az izomfehérjék teljes átalakulása két független vizsgálat alapján megjósolható. Ez a két vizsgálat a BCAA áramlásának aránya a vázizomzat ereiben, és a nitrogén koncentrációja a vázizom szabad aminosavtartalmában. Mivel a GLN nagy feleslegben van jelen a szabad aminosavtartalomban, koncentrációjának megváltozása nagymértékben befolyásolja az összmennyiség változását. A gyakorlatban a szabad mennyiség megváltozása meghatározza az izom nitrogénegyensúlyát és az ossz szabad aminosavtartalom megváltozását.

K táblázat

Infúziós oldatok összetétele (g/kg napi dózis)

	Esszenciális aminosavak	Nem esszenciális aminosavak
Oldat
	BCAA*	egyéb	GLUTAMIN	egyéb	össznitrogén
Sóoldat	5	0	0	0	0	0
11% BCAA* +glutamin	6	0,46	0,54	1,64	1,04	0,62
11% BCAA*+NEAA**	3	0,46	0,54	0	2,77	0,62
22% BCAA**=SAA***	6	0,92	1,09	0	2,07	0,62
44% BCAA*+glutamin	4	1,84	0,54	0,82	1,04	0,62
44% BCAA*+NEAA**	3	1,84	0,54	0	1,90	0,62

* BCAA= elágazó szénláncú aminosavak (valin, leucin, izoleucin).

** NEAA= nem esszenciális aminosavak a FreAmine III (American McGraw, USA) készítményben (alanin, arginin, glicin, hisztidin, prolin szerin). *** SAA=Standard aminosav-összetétel FreAmine III formájában.

HU 220 214 B

VI. táblázat órás vizelet térfogata és összetétele

VI 3 N 8 ‘ée > 'b ω c ·* 1 '3 1 ε <	0,037±0,005	0,049±0,004	0,045±0,005	0,041 ±0,003
	CM		CM	CM
C S	,00	,00	00‘	,00
G U)	©	©	©	©
	-H	-H	-H	-H
5 3	o	cn		c-
cn	cn	cn	cn
<3	©	©	©	©
>	©	©	©	©
bú			*
•él	* cn		* cn	t|-
©	©	©	©
ε «	©	©*	©*	©*
-P É	-H	-H	-H	-H
flS w	Os		cn
<5 3	©	©	©	©
	tT	Ό	v©	c-
£	©	©	©	©
N			*
2	*		«
5	<M	CM	cn
	©	©	©	©
•e	©	©	©'	©'
G «*!	-H	-H		-H
Só 3	CM	©	cn	©
P	O	\©	v->	©
Ő	Tt	Τ·Η_|	©	CM
z	© !	© 1	© 1	© 1
, ’bű .§ él	« CM	CM	* » cn
gj “	©	©	©	©
s«	©	©'	o”	©*
	-H	-tí	-H	-H
N 3	CM	©	V“)	0Ί
O>	00	00	CM
Öss ivál	0,4	©*	0,6	CC ©*
^4
o		•n		m
		©	©	©
>		©	©	©
<2 on		©	©	©
-ll	©	-H o	-H CM	7±
		CM	cn	CM
Nitr		0,6	0,6	0,6
	CM
a “	o’	6,9	v>	00*
ώ á	-H	-H	-H	-H
-& ε	00	νγ	CM	©,
E-	cn	r->*	xt	•*r
	rt-		©
z	<n	©
2
2		<	<	<
?2		<	<	<
	υ	υ	o
<3	<υ	cq	n	(0
G	.£			O
	rt		CM	Tt
	tZ)		CM	Tt

ΚΊ q

©

V o, £

© o

V

CL £

© 8 £ í o -O

9*

Q

Ό

N

Vi

-H bű rt

O ε

£.

:© >

rt

Vi

O

C3 *·!>

>

<D

H

44% BCAA	NEAA	24“	558,0 33/3	359,1 ±34,9	420,7 ±16	261,9, ±9,3	226,6 ±18	r- n ΓΊ -H	38,4 ±4,4
©	607,0 ±23/4	362,6 ±49,1	376,7 ±28,2	229,2 ±15,0	198,2 ±8,9	24,6 ±2,8	26,3 ±1,0
PRE	961.5 40.5	372,0 ±103	243,3 ±51,4	191,2 ±1,8	153,6 ±14,1	27,4 ±4,1	55,6 ±2,8
GLN	o CM	1040 ±44	240,3 ±9,7	255,4 ±18,2	101,5 ±5,6	143,2 ±11,9	21,7 ±1,0	47,6 ±3,3
© \O	723,6 ±44,2	242,2 ±29,6	330,1 ±88	184,9 ±8,8	135,5 ±7,9	Ό C-* CM -H	o
PRE	961,0 ±130	407,0 ±55	247,0 ±32,9	185,2 ±17,4	130,6 ±6,3	39,1 ±12,2	54,1 ±4,7
22% BCAA		o Tj- CM	648,7 38,3	366,0 ±43	559 ±51	323,8 ±19,3	223,9 ±12,1	24,6 ±1,3	l> cn -H
o \O	493,6 29,7	327,7 ±38,8	521,9 ±33,3	254,8 ±8,3	162,4 ±11,0	18,9 ±1,8	σ> n ci <2 c-ι +1
PRE	693,0 ±77	379,0 ±62	381,0 ±67	208,9 ±19,7	126,2 ±7,9	s© CM -H	37,9 ±6,8
11% BCAA	NEAA	o rt- CM	679,9 ±55,2	481,0 ±152	595,0 ±89	296,2 ±41,2	293,6 ±36,9	22,3 ±3,9	47,6 ±8,0
o ©	626,0 ±20,6	364,0 ±101	509,5 ±34,4	229,8 ±33,1	222,5 ±22,2	23,4 ±4,1	33,1 ±4,6
PRE	808 ±111	344,1 ±81	194,3 ±38,7	171,1 ±29,6	118,0 ±24,8	27,1 ±3,8	54,1 ±8,7
GLN	© Tj- CM	1108 ±110	290,9 ±14,8	469,0 ±60	265,9 ±23,ll	179,3 ±11,7	30,6 ±3,4	50,4 ±3,9
o Ό	754 ±57	270,7 ±35,1	419,0 ±63	221,5 ’ ±18,2	142,3 ±5,7	25,9 ±2,8	© cn Ή
PRE	764,0 ±63	429,0 ±38,8	439,0 ±57	262,1 ±39,3	166,7 ±22,9	30,3 ±3,7	48,0 ±3,0
Sóoldat		o rt· CM	764,0 ±64	325,0 ±54	239,9 ±16,1	© S © l; -h	140,4 ±8,4	29,3 ±4,2	54,7 ±2,6
© s©	545,0 ±53	257,9 ±13,4	212,0 ±14,5	152,5 ±7,9	96,8 ±8,1	r-' Ll -H	26,7 ±2,6
PRE	724,0 ±55	431,9 ±42,6	414,0 ±90	241,1 ±27	131,4 ±9,3	29,8 ±3,3	r- n σ/ 5 cn Ή
	GLN	ALA	GLY	ARG	SER	ASP	ASN

HU 220 214 B

VII. táblázat (folytatás)

44% BCAA

NEAA

o

50,8 ±7,4

Ά r-.

Ώ, r-l oo

412,5 ±32

43,3 ±3,7

204,1 ±18

Os pH

805,1 ±16

325,9 ±10

524,8 ±19

630,5 ±49,6

© © so -H

© Ό

66,4 ±8,8

113,9 ±2,5

Sí

444,9 ±11,6

22,8 ±6,3

185,7 ±9,9

58,8 ±3,9

513,1 ±16,7

211,7 ±8,6

341,2 ±13,7

1044,0 ±31,2

5,37 ±0,10

PRE

72,6 ±9,6

92,0 ±1,6

62,5 ±6,6

343,3 ±31,6

35,0 ±13,2

208,4 ±8,2

37,2 ±1,3

155,1 ±11,3

57,1 ±3,3

121,3 ±1,6

333,7 ±12,2

4,76 ±0,24

GLN

24°

59,5 ±4,0

103,1 ±1,6

45,9 ±4,6

295,5 ±22,6

32,4 ±4,8

224,4 ±10,7

73,8 ±4,9

634,8 ±24,4

257,2 ±18,7

420,4 ±15,9

314,4 ±42,3

5,92 ±0,18

o sO

68,3 ±3,9

119,9 ±11,2

52,8 ±5,2

340,4 ±48,7

™ r2 ϊ -H

254,9 ±34,4

63,5 ±7,3

446,7 ±42,4

177,0 ±15,4

280,6 ±21,4

904,4 ±168,8

5,07 ±0,21

PRE

62,0 ±2,8

104,2 ±5,8

63,3 ±6,4

317,8 ±17,4

33,7 ±6,6

227,7 ±38,8

43,1 ±2,5

128,2 ±8,2

rt rn * £ -H

95,1 ±7,1

266,4 ±15,8

4,93 ±0,28

22% BCAA

o Tt fN

55,7 ±2,5

136,7 ±11,7

69,2 ±2,6

430 ±49

95,4 ±9,1

347,1 ±31,1

103,1 ±4,5

301,5 ±21,3

175,6 ±8,9

263,4 ±16,7

830,0 ±45

6,31 ±0,19

o

51,74 ±3,2

121,2 ±15,6

54,2 ±2,6

327,7 ±38

52,0 ±14

239,7 ±15,6

SO 3 ±

304,1 ±26,4

137,2 ±16,8

196,2 ±24,6

637,0 ±67

5,08 ±0,17

PRE

51,2 ±4,3

100,3 ±7,1

65,7 ±5,8

248,9 ±32,7

23,5 ±6,7

253,5 ±29,4

45,5 ±3,4

137,6 ±17,3

49,6 ±6,7

100,3 ±15,4

299,1 ±38,4

4,71 ±0,31

11% BCAA

NEAA

24»

63,6 ±4,9

133,1 ±11,9

s/Ί “Η

459 ±65

33,1 ±6,8

277,0 ±67

82,5 ±4,4

271,0 ±10,2

121,6 ±4,4

179,6 ±5,8

562,1 ±9,2

5,94 ±0,64

o sO

75,8 ±11,4

116,8 ±6,6

45,1 ±0,1

401,3 ±45,9

20,7 ±8,4

245,2 ±15,9

66,3 ±7,0

203,9 ±18,0

ο rt ο Os -H

140,7 ±16,3

434,6 ±35,7

5,08 ±0,31

PRE

64,0 ±10,7

88,2 ±6,0

52,1 ±5,7

317,5 ±45,1

25,7 ±3,0

241,9 ±24,5

41,9 ±3,1

135,2 ±16,8

45,4 ±7,1

99,0 ±19,0

279,6 ±15,0

4,40 ±0,50

GLN

24»

66,9 ±2,6

133,9 ±10,0

63,9 ±4,9

474 ±62

54,3 ±9,5

304,3 ±35,9

89,7 ±5,7

250,5 ±22,9

112,6 ±9,5

166,6 ±15,8

534,7 ±51,0

6,69 ±0,44

o sO

67,1 ±5,0

115,9 ±10,0

53,3 ±5,0

467,0 ±58

33,9 ±6,2

204,6 ±30,5

74,2 ±5,8

223,1 ±32,0

97,3 ±14,1

153,2 ±29,7

475,6 ±48,1

5,06 ±0,20

PRE

44,1 ±4,3

105,1 ±14,3

91,3 ±24,6

346,0 ±73

42,2 ±10,2

264,0 ±64

45,9 ±5,4

165,9 ±24,5

1 55,9 ±5,8

105,2 ±5,6

322,31 ±30,9

5,27 ±0,38

Sóoldat

o 'T Csl

P -H

122,0 ±10,1

66,2 ±4,8

441,3 ±29,5

40,8 ±2,6

281,7 ±28,7

69,3 ±4,7

210,3 ±13,9

85,7 ±4,2

153,2 ±7,3

449,3 ±24,8

4,87 ±0,20

0 Ό

68,0 ±4,1

108,0 ±11,9

os, 2; £ ±

411,0 ±46

so 2 ±

160,5 ±28,4

52,9 ±4,6

143,4 ±8,4

54,4 ±3,8

96,2 ±7,1

294,0 ±17,6

3,82 ±0,08

PRE

65,8 ±4,7

109,8 ±8,3

oo rí p -H

264,3 ±39,3

12,3 ±0,9

239,0 ±29

44,7 ±4,1

149,5 ±11,3

53,1 ±5,0

102,7 ±7,4

305,3 ±23

4,72 ±34

GLN

HIS

TYR

TAU

MET

THR

PHE

VAL

ILE

LEU

Össz- BCAA

Össz- nitro- gén

HU 220 214 Β

Vili. táblázat

Vázizom aminosav-összetétele (mmol/1, átlagiszórás)

Sóoldat

11% BCAA

22% BCAA

44% BCAA

GLN

NEAA

GLN

NEAA

PRE

POST

PRE

POST

PRE

POST

PRE

POST

PRE

POST

PRE

POST

GLN

21,48 ±3,21

15,86 ±3,80

19,85 ±3,17

21,78 ±2,01

30,25 ±1,63

21,04 ±1,92

18,69 ±3,74

18,15 ±3,76

24,83 ±2,72

26,20 ±3,86

22,55 ±3,57

21,66 ±2,27

ALA

5,35 ±0,55

5,58 ±0,88

4,81 ±0,44

5,62 ±0,39

5,59 ±0,23

8,11 ±2,35

4,71 ±0,46

4,69 ±0,79

5,16 ±0,95

7,55 ±0,89

4,45 ±0,27

4,01 ±1,67

GLY

2,85 ±0,31

2,28 ±0,51

4,30 ±0,65

3,22 ±0,42

3,67 ±0,37

3,63 ±0,25

4,06 ±0,74

4,52 ±1,15

3,70 ±0,31

2,87 ±0,17

4,08 ±0,63

2,33 ±0,82

ARG

1,17 ±0,24

0,73 ±0,08

0,91 ±0,21

0,78 ±0,03

1,45 ±0,41

2,06 ±0,51

1,21 ±0,14

1,14 ±0,15

1,06 ±0,20

0,59 ±0,13

1,10 ±0,39

0,95 ±0,35

SER

1,42 ±0,16

1,10 ±0,19

1,42 ±0,26

1,65 ±0,13

1,52 ±0,09

2,33 ±0,22

2,10 ±0,60

1,38 ±0,22

1,69 ±0,12

1,63 ±0,21

1,72 ±0,32

L34 ±0,57

ASP

0,93 ±0,20

1,04 ±0,13

0,50 ±0,19

0,80 ±0,21

1,63 ±0,16

1,95 ±0,41

0,85 ±0,52

0,62 ±0,15

1,15 ±0,12

2,86 ±0,34

1,29 ±0,31

1,69 ±0,76

ASN

0,43 ±0,05

0,50 ±0,07

0,51 ±0,07

0,67 ±0,08

0,53 ±0,04

0,43 ±0,06

0,43 ±0,09

0,45 ±0,08

0,86 ±0,15

0,60 ±0,18

0,42 ±0,09

0,36 ±0,09

GLU

6,30 ±0,86

3,91 ±0,30

4,48 ±0,98

4,38 ±0,84

11,23 ±0,75

9,08 ±1,25

5,96 ±0,83

4,97 ±1,30

10,29 ±0,83

9,28 ±1,03

9,00 ±2,08

8,98 ±1,98

HIS

0,81 ±0,28

0,39 ±0,02

0,45 ±0,12

0,59 ±0,11

0,69 ±0,01

0,96 ±0,14

0,79 ±0,18

0,50 ±0,03

0,79 ±0,14

0,62 ±0,08

0,71 ±0,18

0,46 ±0,23

TYR

0,17 ±0,02

0,13 ±0,02

0,27 ±0,09

0,24 ±0,05

0,36 ±0,20

0,36 ±0,09

0,32 ±0,09

0,27 ±0,05

0,33 ±0,11

0,22 ±0,10

0,29 ±0,11

0,15 ±0,04

MET

0,06 ±0,03

0,04 ±0,02

0,30 ±0,02

0,06 ±0,04

0,07 ±0,01

0,13 ±0,01

0,04 ±0,03

0,06 ±0,04

0,08 ±0,01

0,12 ±0,01

0,06 ±0,01

0,09 ±0,01

THR

1,20 ±0,23

1,11 ±0,17

1,36 ±0,30

1,62 ±0,18

2,24 ±0,27

2,25 ±0,21

1,59 ±0,23

1,70 ±0,26

2,57 ±0,48

2,29 ±0,42

1,98 ±0,30

1,43 ±0,09

PHE

0,11 ±0,02

0,14 ±0,05

0,11 ±0,03

0,17 ±0,02

0,12 ±0,03

0,16 ±0,01

0,09 ±0,02

0,14 ±0,02

0,13 ±0,02

0,16 ±0,01

0,10 ±0,01

0,15 ±0,01

VAL

0,19 ±0,01

0,21 ±0,04

0,20 ±0,01

0,37 ±0,05

0,20 ±0,04

0,32 ±0,04

0,22 ±0,03

0,37 ±0,07

0,21 ±0,03

0,80 ±0,04

0,22 ±0,01

1,01 ±0,06

ILE

0,09 ±0,003

o,n ±0,02

0,09 ±0,01

0,17 ±0,03

0,11 ±0,03

0,17 ±0,02

0,10 ±0,02

0,17 ±0,03

0,11 ±0,02

0.27 ±0,03

0,10 ±0,003

0,29 ±0,02

LEU

0,16 ±0,01

0,28 ±0,12

0,16 ±0,01

0,23 ±0,05

0,18 ±0,05

0,21 ±0,03

0,16 ±0,02

0,26 ±0,04

0,17 ±0,02

0,42 ±0,05

0,17 ±0,001

0,44 ±0,01

Össz- BCAA

0,44 ±0,02

0,59 ±0,17

0,42 ±0,02

0,77 ±0,13

0,50 ±0,12

0,69 ±0,16

0,47 ±0,07

0,80 ±0,14

0,49 ±0,07

1,49 ±0,11

0,48 ±0,01

1,75 ±0,07

Össz- nitro- gén

69,8 ±8,5

52,8 ±8,4

63,5 ±7,0

68,3 ±4,4

96,4 ±5,2

82,8 ±6,9

65,2 ±10,3

62,5 ±9,6

83,6 ±7,0

85,9 ±8,9

75,6 ±11,8

70,8 ±8,4

HU 220 214 Β

IX. táblázat

Hátsó fertályi aminosaváramlás (pmol/perc/kg, átlag ± szórás)

Sóoldat

11% BCAA

22% BCAA

44% BCAA

GLN

NEAA

GLN

NEAA

6°

24°

6“

24°

6°

24°

6»

24°

6°

24“

6°

24°

GLN

-2,69

-1,71

-1,19

-0,16

-2,10

-1,82

-1,82

-1,24

-0,73

+0,74

-2,00

-4,13

±,107

±0,70

±0,46

±0,82

±0,62

±1,72

±0,60

±0,44

±0,60

±1,76

±0,32

±1,45

ALA

-2,19

-0,72

-0,92

-0,73

-1,08

-0,95

-0,98

-2,55

-0,97

-1,99

-1,17

-1,49

±0,52

±1,26

±0,23

±0,44

±0,28

±0,25

±0,84

±0,84

±0,22

±0,98

±0,09

±0,67

GLY

-1,38

-0,56

-0,66

-0,28

+0,86

+0,47

-0,05

-0,89

-0,44

-0,78

-0,39

-0,25

±0,36

±1,05

±0,20

±0,31

±0,19

±0,72

±0,40

±0,53

±0,14

±0,39

±0,21

±0,25

ARG

-0,83

+0,12

-0,29

-0,09

-0,13

+0,28

-0,28

-0,26

-0,11

-0,28

-0,13

+0,02

±0,14

±0,72

±0,13

±0,25

±0,07

±0,18

±0,38

±0,22

±0,24

±0,24

±0,06

±0,16

SER

-0,49

±0,09

-0,11

+0,11

0,14

+0,37

-0,50

+0,65

-0,14

-0,13

-0,22

+0,16

±0,11

±0,49

±0,28

±0,23

±0,07

±0,29

±0,45

±0,50

±0,10

±0,22

±0,11

±0,06

ASP

+0,04

+0,19

+0,01

-0,002

-0,00

-0,03

+0,02

+0,00

+0,03

-0,24

+0,01

-0,09

±0,04

±0,12

±0,01

±0,05

±0,01

±0,11

±0,04

±0,08

±0,03

±0,21

±0,03

±0,11

ASN

-0,22

-0,14

-0,07

-0,14

-0,11

-0,38

-0,15

-0,12

-0,07

-0,32

-0,08

-0,12

±0,9

±0,11

±0,04

±0,04

±0,04

±0,29

±0,09

±0,13

±0,05

±0,13

±0,05

±0,05

GLU

-0,10

+0,21

+0,06

+0,08

+0,06

+0,17

+0,11

+0,23

+0,16

+0,21

0,01

-0,10

±0,18

±0,11

±0,07

±0,02

±0,07

±0,09

±0,06

±0,13

±0,04

±0,15

±0,03

±0,09

HIS

-0,44

-0,19

-0,09

+0,08

-0,03

-0,05

-0,34

-0,24

-0,03

-0,25

0,06

0,03

±0,09

±0,44

±0,17

±0,20

±0,14

±0,19

±0,27

±0,36

±0,10

±0,22

±0,12

±0,01

TYR

-0,26

-0,08

-0,13

-0,11

-0,13

-0,04

-0,19

-0,14

-0,10

-0,18

-0,07

-0,06

±0,09

±0,40

±0,02

±0,04

±0,04

±0,08

±0,06

±0,05

±0,01

±0,09

±0,03

±0,0

TAU

1,05

+0,78

-0,23

+0,18

-0,27

+ 1,39

-0,08

+0,24

0,08

-0,48

+0,21

-0,50

±0,33

±2,18

±0,28

±0,51

±0,10

±0,74

±0,61

±0,39

±0,15

±0,34

±0,07

±0,1

MET

-0,32

-0,33

-0,23

-0,59

0,61

-2,13

-0,74

-1,66

-0,21

-1,69

0,26

-0,56

±0,09

±0,33

±0,11

±0,28

±0,40

±1,08

±0,41

±0,86

±0,06

±0,35

±0,16

±0,21

THR

-1,06

+0,72

-0,30

-0,27

-0,07

+ 1,28

+0,19

-0,13

0,06

+0,57

+0,28

+0,27

±0,10

±0,86

±0,13

±0,32

±0,43

±0,67

±0,37

±0,46

±0,11

±0,35

±0,17

±0,1

PHE

-0,37

-0,20

-0,12

-0,19

-0,13

-0,12

-0,14

-0,13

-0,14

-0,27

-0,07

-0,16

±0,5

±0,36

±0,04

±0,08

±0,03

±0,03

±0,09

±0,15

±0,08

±0,15

±0,03

±0,12

VAL

-0,46

+0,33

+0,14

+0,02

+0,31

+0,49

+0,62

+ 1,12

+0,67

+0,37

+ 1,34

+ 1,26

±0,17

±0,68

±0,08

±0,11

±0,26

±0,23

±0,46

±1,01

±0,23

±0,45

±0,17

±0,65

ILE

-0,24

+0,12

+0,08

+0,06

+0,27

+0,42

+0,49

+0,39

+0,42

+0,51

+0,80

+0,97

±0,03

±0,30

±0,02

±0,08

±0,19

±0,15

±0,21

±0,15

±0,04

±0,21

±0,07

±0,48

LEU

-0,43

+0,04

+0,06

-0,08

+0,30

+0,50

+0,51

+0,57

+0,61

+0,69

+ 1,14

+ 1,44

±0,09

±0,54

±0,07

±0,08

±0,25

±0,24

±0,33

±0,39

±0,06

±0,33

±0,13

±0,68

Ossz-

-1,14

+0,49

+0,28

0,03

+0,88

+ 1,40

+ 1,64

+2,09

+ 1,71

+ 1,57

+3,28

+3,67

BCAA

±0,26

±1,51

±0,14

±0,19

±0,57

±0,50

±0,86

±1,54

±0,22

±0,83

±0,18

±1,43

Össz- nitro- gén

-19,05 ±4,06

-3,59 ±12,1

-6,52 ±1,81

-3,25 ±3,07

-7,39 ±0,52

-1,80 ±6,40

-7,70 ±5,90

-8,42 ±1,90

-2,50 ±2,50

-7,40 ±8,70

-3,27 ±1,62

-7,60 ±2,91

HU 220 214 Β

6. példa

Glutaminnal dúsított orális diéta hatása a vékonybélre bélkimetszés után

A) Bevezetés

A vékonybél részleges kimetszést követő regenerációjában részt vesz a bélfal minden rétege, elsősorban a bolyhos hyperplasia. A bolyhok növekvő magassága és a beöblösödés növekvő mértéke a bélmaradék hígulásával és meghosszabbodásával társul [Williamson R. C. N.: N. Engl. J. Med. 298,1393-1444 (1978)]. A vékonybélkimetszést alkalmazkodó jellegű morfológiai és funkciós változások követik. A tapasztalatok szerint az orális felvétel jelentős mértékben stimulálja a hyperplasia nyálkahártya bélkimetszést követő szabályozását [Levine és munkatársai: Dig. Dis. 21, 542-545 (1976)]. A luminális tápanyagok fontos szerepet játszanak a normális nyálkahártya-növekedés fenntartásában, és ha az orális felvétel nem kielégítő a vékonybélkimetszés után, a maradék bél tömege és fejlettsége csökken. A vékonybélkimetszés következtében rövid béllel rendelkező betegek parenterális táplálásra szorulnak, és túlélésük attól függ, hogy a maradék bélrendszer milyen mértékben képes alkalmazkodni. Az elementáris diéta és a parenterális táplálás alkalmazása elegendő időt biztosít a bélrendszer alkalmazkodásához, és a teljes orális táplálkozásra történő visszatéréshez [Weser E.: Gastroenterology, 71, 146-150(1976)].

A GLN az enterociták fontos tápanyaga, és műtéti stressz után fokozódik a bélrendszerben történő felszívódása [Souba W. W. és munkatársai: Surgery, 94, 342 (1983)]. A GLN lokális táplálkozási faktorként működik, és bélfejletlenség esetén elősegíti a nyálkahártya növekedését.

A vizsgálat célja a GLN-nel kiegészített tápanyagnak a vékonybél-nyálkahártyasejtek növekedésére in vivő kísérleti modellben gyakorolt hatásának tanulmányozása, amelynek során in vivő kísérleti modellként részleges kimetszést alkalmazunk, amely általános stresszt, és a bélnyálkahártya romlását okozza.

B) Anyagok és módszerek

1. Az állatok előkészítése

175-200 g testtömegű hím Wistar-patkányokat 5 napon keresztül a laboratóriumi körülményekhez szoktatunk. A patkányoknak tetszőleges mennyiségű vizet és táplálékot adunk Purina táp formájában. Az állatokat egyedi ketrecekben tartjuk, és naponta méijük. Aklimatizálódás után a normál testtömegű állatokat véletlenszerű elosztással négy csoportra osztjuk.

A kísérlet első napján a patkányokat 50 mg/kg ip. pentobarbitál-injekcióval elaltatjuk. A hasat középvonali bemetszéssel felnyitjuk, a vékonybelet a Treitz-szalagtól a csípő vakbéli szelepig kivágjuk, és egy hosszú fekete fonal segítségével kinyújtás nélkül kétszer megmérjük. A két mérés átlagát feljegyezzük. A vékonybél kétharmados kimetszését a Treitz-szalagtól 5 cm-re disztálisan kezdve Lambert módszerével végezzük [Surgery of the Digestive System of the Rat, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, USA, pp 32-35,413-416 (1965)]. A kimetszés két végét 6-O-prolénnel összekötjük. A belet a hasüregbe visszahelyezzük, és a hasfalat 2-O-prolénnel lezárjuk. A kontrollcsoporton látszólagos műtétet végzünk, amelynek során a vékonybelet a disztális oldalon átvágjuk, és összevarrjuk. A Treitz-szalagtól disztálisan 5 cm kiinduló távolsággal az összhossz kétharmad részében. Az állatokat elkülönítve lebontási ketrecekbe helyezzük, és egy nappal a műtét után orálisan, párosítva tápláljuk egy kiegyenlített kontrolldiétával (GLN nélkül), amely elegendő mennyiségű szénhidrátot, lipidet, aminosavat, vitamint és sókat tartalmaz, valamint egy GLN-nel kiegészített diétával, amely azonos összetétel mellett a nem esszenciális aminosavak helyett GLN-t tartalmaz. A GLN-tartalom tehát 0 vagy 25 tömeg% az aminosavmennyiségre vonatkoztatva, ami eltér a szokásos diétától, amely 5% GLN-t tartalmaz.

2. Glutaminnal kiegészített diéta elkészítése

Az orális diéta energiatartalma 427 cal/100 g, összetétele 0,2 tömeg% kolin-klorid, 10 tömeg% kukoricaolaj, 46,9 tömeg% fehér dextrin, 23,4 tömeg% szacharóz, 5 tömeg% só, 0,5 tömeg% vitaminkeverék. Mindkét diéta 14 tömeg% aminosavat, ebben 7,17 tömeg% ossz esszenciális aminosavat, és 6,83 tömeg% ossz nem esszenciális aminosavat tartalmaz. A GLN-mentes diéta (-GLN) egyenként 0,937 tömeg% alanint, aszparagint, aszpartámsavat, prolint és szerint tartalmaz. A GLN-nel dúsított (+GLN) 0,237 tömeg% fenti aminosav mellett 3,5 tömeg% GLN-t tartalmaz. így a GLN az összaminosav-tartalom 25%-át és a nem esszenciális aminosavak 51%-át adja.

3. A szövetek előkészítése napos etetés után a patkányokat megöljük. 50 mg/kg ip. pentobarbitállal elaltatjuk az állatokat, a hasfalat felnyitjuk, és a bemetszést meghosszabbítjuk a mellkasüreg irányába. 5 ml vért veszünk a jobb kamra pungálásával a vér ammónia- és plazma-GLN-szintjének meghatározásához. A beleket a vér visszatartása mellett eltávolítjuk. A teljes vékonybelet eltávolítjuk a bélfodor óvatos elválasztásával, amelynek során közel tartjuk a bélsavóhártyához. Az eltávolított belet 4,5 g rögzített tenzió mellett felakasztjuk és kilenc pontot kijelölünk. A bélkimetszéses patkányoknál az összeillesztéstől mért proximális 5, 10 és 12,5 cm-es pontokat, amelyek a proximális éhbélt és a disztális nyombélt jelentik, valamint az összeillesztéstől számított disztális 2, 5 és 10 cm-es pontokat, amelyek az összeillesztéshez közel eső maradék proximális csípőbelet jelentik, valamint a csípő-vakbél szeleptől számított proximális 5, 10 és 15 cm-es pontokat, amelyek a maradék disztális csípőbelet jelentik, megjelöljük úgy, hogy egyenes gombostűt szúrunk át a bélen. A hat bélszegmenst elválasztjuk. A látszólagos műtéten átesett csoporton két proximális szegmenst jelölünk ki a Treitz-szalagtól disztálisan 1 cm távolságból felfelé mérve. Az la, 2a és 3a szegmenseket lehűtött sóoldattal átöblítjük, és 10 tömeg% pufferolt formaiinba merítjük 4 órán keresztül, majd 70%-os etanolban fixáljuk. Az lb, 2b és 3b szegmenseket lehűtött sóoldatban átöblítjük, az üreget felnyitjuk, és meghatározzuk a nedves tömeget. A bélszegmenseket 5 ml lehűtött sóoldatba visszük, és éles ollóval felvagdaljuk. A darabokat kétszer 15 másodpercen keresztül Polytron homogenizátorban (Brinkman Instru20

HU 220 214 Β ments, Westbury, New York, USA) homogenizáljuk, és ultrahangos besugárzóval (Heat System Laboratories, Plainview, New York, USA) kettes erősségen 30 percen keresztül besugározzuk. A sóoldatban felvett homogenizátumot a DNS- és fehérjeanalízishez -30 °C hőmérsékleten tároljuk.

4. Analitikai módszerek

A bélhomogenizátumot Lowry módszerével analizáljuk az össz-fehérjetartalomra. A DNS-meghatározást Burton módszerével [Biochem, 62, 315-323 (1965)] végezzük. A hisztológiás szekciókat paraffinba ágyazzuk, hematoxilinnel és eozinnal megfestjük, és fénymikroszkóp alatt 40-szeres nagyítással vizsgáljuk. A nyálkahártya-vastagság és a bélbolyhok magasságának vizsgálatához 20 reprezentatív, vékony, jól orientált teljes bolyhot választunk ki, majd szemlencse-mikrométeren vizsgáljuk, és a mért adatokból átlagértéket számolunk. A bolyhok számának meghatározásához a belet egy 40-szeres nagyítású mező központi vízszintes vonalára helyezzük.

C) Mérési eredmények

Az első öt napon progresszív módon 10 g/nap értékről 15 g/nap értékre növekedett a táplálékfelvétel, majd állandó szinten maradt. A két különböző összetételű diéta azonos mértékű fogyasztásával szemben a párosán etetett állatoknál a két csoport tömeggyarapodása különböző volt a műtétet követő közvetlen periódusban. A kontrollállatoknál a testtömeg állandó szinten maradt a műtétet követő első három napon keresztül, majd 5 g/nap mértékben folyamatosan növekedett. A GLN-nel etetett csoportban nem volt lassulás, hanem a műtétet követő első naptól kezdve azonnal és folyamatosan 2 g/nap mértékben növekedett a testtömeg. A második és harmadik napon a testtömeg lényegesen nagyobb volt a GLN-nel etetett csoportban, mint a kontrollcsoportban (p<0,05). Bár a két különböző diétával etetett állatoknál a testtömeg egymást követően azonos mértékben növekedett, a GLN-nel etetett állatok a műtétet követő nyolcadik napig nagyobb testtömeget mutatnak (32,0 ±2,8, illetve 23,7±3,7 g kumulatív növekedés p<0,03). A tetem vizsgálata igazolta, hogy a testtömeg növekedése nem az összvíztartalom felhalmozódásából származik (71 ±1% a +GLN-csoportban, illetve 73±1% a -GLN-csoportban), hanem a GLN-nek a testtömegre gyakorolt hatásának köszönhető. A tápanyag GLN-koncentrációja és a műtétet követő első három napon bekövetkező testtömegváltozás összefüggését külön állatokon tanulmányozzuk. A táplálékban lévő aminosavmennyiségnek mintegy 25%-át GLN formájában kell adagolni a maximális fejlődéshez.

A 25% GLN-nel kiegészített diétával elérhető testtömeg-növekedés az éhbél- és nyombélmaradék szegmensei tömegének növekedésével társul. A műtétet követő harmadik napon az összvékonybélszövet tömege 3,55±0,16 g a GLN-nel etetett csoportban, és 2,97±0,10 g a kontrollcsoportban (p<0,05). A műtétet követő nyolcadik napon a béltömeg 3,30±0,23, illetve 2,81 ±0,16 g (p<0,05). A béltömeg növekedése a testtömeg összváltozásának mintegy 5%-át teszi ki a GLN-nel kiegészített diéta esetén, ami azt jelenti, hogy a GLN hatása kiterjed, de nem korlátozódik a bélrendszerre. Az éhbél és nyombél sejtszerkezetét közelebbről a DNS-tartalom meghatározásával és kvantitatív szövettani vizsgálattal vizsgáljuk (X. táblázat). A GLN-nel kiegészített diétával etetett állatoknál nincs szignifikáns növekedés az éhbél DNS-tartalmában a harmadik napon, és a nyombél DNS-tartalmában a harmadik és nyolcadik napon. A műtét nélküli kontrollcsoporttal összehasonlítva a kimetszés és a GLN-nel kiegészített megfelelő elementáris diéta 54%-os növekedést eredményez az éhbél 1 cm-es szakaszának DNS-tartalmában a műtétet követő harmadik napon. Ez a hyperplasia közel felére csökken, ha a diétában a GLN helyett nem esszenciális aminosavak kiegyensúlyozott elegyét alkalmazzuk. A nyálkahártya vastagságának szövettani vizsgálata általában igazolja a DNS-tartalommal kapcsolatos tapasztalatokat (X. táblázat). A GLN-nel kiegészített diéta esetén az éhbél és nyombél bolyhainak átlagos magassága azonos mértékben növekedett a műtétet követő harmadik és nyolcadik napon. Ez a hatás a bolyhokra korlátozódik, és a GLN nem befolyásolja a beöblösödés mélységét vagy a nyálkahártya alatti izomréteg vastagságát.

X. táblázat

A glutamin hatása a maradék bélszegmensekre

	Műtét utáni 3. nap	Műtét utáni 8. nap,
-GLN	+GLN	GLN	+GLN
DNS (pg/cm)
éhbél	462±22	539±40*	370±26	387±38
nyombél	460±29	554±22*	456±35	543±23*
Bolyhok magassága (μΜ)
éhbél	640±27	778±28**	715±35	868±34**
nyombél	490±27	568±24*	585±37	748±45
Beöblösödés mélysége (pm)
éhbél	280±14	270±13	246±16	269±17
nyombél	274±12	280±19	287±30	269±25

HU 220 214 Β

X. táblázat (folytatás)

	Műtét utáni 3. nap	Műtét utáni 8. nap,
-GLN	+GLN	-GLN	+GLN
Izomréteg vasstagsága (μΜ)
éhbél	130+8	130+11	130+15	120+12
nyombél	125+9	143+10	138+17	147+15

Az éhbél 3 cm-es szegmenseit a műtét utáni 3. és 8. napon eltávolítjuk, homogenizáljuk, és meghatározzuk DNS-tartalmát [Burton K. és munkatársai: Biochem. J.

62, 315 (1956)]. Az azonos korú, de kimetszés nélküli 15 állatoknál az éhbél DNS-tartalma 350 pg/cm. Ugyanezen állatoktól származó további éhbél- és nyombélszegmenseket 10 tömeg%-os pufferolt formaiinban fixálunk, etanollal vízmentesítjük, normál paraffinba beágyazzuk, 10 pm-es hosszanti szakaszokra hasítjuk, és 20 hematoxilinnal és eozinnal megfestjük. A kódolt lemezeken 15 darab megfelelő orientációjú és fejlettségű bolyhot (3 lemezen egyenként 5 darab) alkalmazunk a bolyhok magasságának, a beöblösödés mélységének és az izomréteg vastagságának meghatározásához, amit 25 egy szemlencsemikrométerrel ellátott mikroszkópon végzünk. A táblázatban megadott adatok az átlagértéket±szórást mutatják 9-12 párhuzamos mérés esetén.

A -GLN jelentése 0 tömeg% glutamin, a +GLN jelentése 25 tömeg% glutamin, * p<0,05, ** p<0,01, ahol a 30 +GLN/-GLN adatokon párosítatlan t-tesztet végzünk.

A GLN-nek a bolyhok magasságára kifejtett hatása akkor maximális, ha a GLN 25 tömeg%-ban van jelen az aminosavak összmennyiségére vonatkoztatva, és így a nem esszenciális aminosavak 51%-át képezi. Alacso- 35 nyabb koncentrációknál a folyamatos hatás sem az éhbélnél, sem a nyombélnél nem egyértelmű. Ha a GLNtartalom 31,25 tömeg%-ra nő, és a többi nem esszenciális aminosavak mennyisége tovább csökken, a bélnyálkahártyára gyakorolt szövettápláló hatás elveszik. Ez 40 feltehetően abból ered, hogy a GLN tartalmának növekedése miatt a diéta aminosav-összetétele olyan mértékben megváltozott, hogy ez a többi aminosav rovására történt. Ha GLN-t az összaminosav-tartalomra vonatkoztatva 25 tömeg% mennyiségben alkalmazzuk, ak- 45 kor egy mérsékelt, de szignifikáns növekedést kapunk a plazma GLN-koncentrációjában (800+40, illetve 654+48 mmol/1 a harmadik napon, és 751+22, illetve 676+21 mmol/1 a nyolcadik napon). Nem növekszik viszont a plazma glutaminsav- vagy ammóniatartalma. 50 Ez azt jelenti, hogy az összaminosavra vonatkoztatva 25 tömeg% GLN-t tartalmazó diéta gyors műtét utáni testtömeg-gyarapodáshoz és bélnyálkahártya-hyperplasiához vezet anélkül, hogy GLN-felesleg alakulna ki, vagy a GLN lebontásának végtermékei, így az ammó- 55 nia vagy glutaminsav felhalmozódnának.

Mivel gyakran nehéz megfelelő mennyiségű enterális tápanyag adagolása olyan betegeknél, akik tápanyagkiegészítésre szorulnak, különösen akkor, ha a szóban forgó betegség jelentős mértékben érinti a gasztrointesz- 60 tinális traktust is, megvizsgáltuk azt is, hogyan hat a GLN egy táplálkozástanilag nem kielégítő diétában. A patkányoknál ugyanazt a 60%-os bélkimetszést végeztük, majd párosán etetett kontroll- vagy GLN-nel kiegészített diéta csoportra osztottuk az állatokat. A diétában kielégítő mennyiségű aminosavat, vitamint és ásványi sókat adunk, de a keverék a korábban megadott kalóriatartalomnak csak 50%-át éri el. A kalóriahiányos diéta 7. napján valamivel nagyobb volt a testtömeg a GLN-nel kiegészített csoportban, de mindkét diétánál kisebb gyarapodást értünk el. A kalóriahiány ellenére továbbra is nyilvánvaló a GLN-nek a bélnyálkahártyára gyakorolt hatása (XI. táblázat). A műtétet követő 7. napon a nyálkahártya nedves tömege 36%-kal nő az éhbélben és 40%-kal nő a nyombélben a GLN-nel kiegészített diétánál a kontrolldiétához viszonyítva. A nyálkahártya DNS-tartalma rendre 48%-kal, illetve 32%-kal nőtt. A nyálkahártya sejtszerkezetének fenti adatait kvantitatív szövettani vizsgálattal igazoltuk, amely kimutatta az éhbél és nyombél nyálkahártyájának állandó vastagodását. A táplálékkal bevitt GLN hatását a kalóriahiány ellenére is kifejtette, és kedvezően befolyásolta a bélnyálkahártya fejlődését.

XI. táblázat

A GLN-hatás 50% kalóriahiányos diétában

	-GLN	+GLN
Nyálkahártya tömege (mg/cm)
éhbél	35,2+2,9	51,7+4,5**
nyombél	32,7+2,7	48,5+3,8***
DNS-tartalom (pg/cm)
éhbél	180+12	266+15*
nyombél	217+22	287+22***
Nyálkahártya vastagsága (μΜ)
éhbél	826+61	1042+27**
nyombél	799+27	925+40*

A bélszegmenseket a X. táblázat után megadott módon készítettük elő és analizáltuk. A megadott adatok az átlagértéket+szórást jelölik tíz párhuzamos vizsgálatban a részleges bélkimetszést követő 7. napon. -GLN jelentése 0 tömeg% glutamin, +GLN jelentése 25 tömeg% glutamin, * p<0,05, ** p<0,01, *** p< 0,001, +GLN/-GLN párosítatlan t-teszttel.

A GLN hatása intravénás adagolás esetén is változatlan marad. A patkányokat teljes parenterális táplálá22

HU 220 214 Β són (TPN) tartjuk a részleges bélkimetszést követő 7 napon keresztül, amelynek során GLN-mentes készítményt adagolunk az optimális növekedés érdekében [Popp Μ. B. és munkatársai: Am. J. Clin. Nutr. 36, 1119 (1982)], a bolyhok magassága csökken az éhbélben, és változatlan marad a nyombélben (XII. táblázat). Vagyis, a részleges vékonybél-eltávolítás fejlődést stimuláló hatását kompenzálta az a tény, hogy a táplálékot eltávolítottuk a gasztrointesztinális traktus üregeiből [Levin G. M. és munkatársai: Gastroenterology, 67, 975 (1974)]. Ha a TPN-készítményhez a nem esszenciális aminosavak egy része helyett GLN-t adagolunk (25 tömeg% az összaminosav-tartalomra vonatkoztatva), fenntartható a kimetszést követő hyperplasiaválasz (XII. táblázat). A GLN-mentes TPN-készítménynyel összehasonlítva a bolyhok magassága 54%-kal, illetve 31%-kal nőtt az éhbélben, illetve nyombélben. A kísérleti állatokon nyert fenti adatokkal összhangban van az a tény, a műtét utáni nitrogénegyensúly humán betegeknél javítható, ha az intravénás tápelegyhez Lalanil-L-glutamin-dipeptidet adagolunk [Stehle P. és munkatársai: Láncét, i, 231 (1989)].

XII. táblázat

A GLN hatása TPN-ben adagolva

	Műtét előtt	Műtét utáni 7. nap
-GLN	+GLN	-GLN	+GLN
Bolyhok magassága (pm)
éhbél	478+ 15	481 + 13	383+22	588+35**
nyombél	400+24	419+13	372+38	488+16*

A táblázatban megadott adatok átlagértéket és ± szórást jelentenek 9 párhuzamos vizsgálatban. -GLN jelentése 0 tömeg% glutamin, +GLN jelentése 23 tömeg% glutamin, * p<0,05, ** p<0,001, +GLN/-GLN párosítatlan t-tesztben, p<0,0r Pp 0,005 a műtét utáni/műtét előtti párosítatlan t-tesztben.

D) Az adatok értékelése

A GLN-nel kiegészített orális és intravénás diétával kapott adatok összhangban vannak azzal a feltételezéssel, hogy a nem esszenciális GLN-aminosav esszenciális tápanyaggá válik a műtéti stressz és a bélkimetszés következtében. Egy kiegyensúlyozott, meghatározott orális diéta komponenseként adagolva a GLN egy általános anabóliás vagy lebontás elleni hatást fejt ki a testszövetekben, és megakadályozza a műtéti stresszt követő átmeneti veszteséget. A bélrendszerben, amelynek szövetei általában nagy mennyiségű GLN-t alkalmaznak, és amelyről ismert, hogy stressz hatására növeli a GLNkiválasztást, a GLN egyértelmű táplálóhatást fejt ki a nyálkahártyára. Ez a vékonybél részleges kimetszését követő adaptív hyperplasia növekedésében jelentkezik, amelynek során a fokozott enterocitapopulációhoz a bolyhok növekvő magassága társul. A bélrendszer sejtszerkezete akkor is javul, ha az össz-energiafelvétel nem elegendő, vagy a teljes táplálás intravénás úton történik.

A fenti hatások mechanizmusa ismeretlen. A GLN szabályozóhatást fejthet ki különböző biokémiai útvonalakra tápanyagként vagy bioszintetikus prekurzorként működhet, kiválasztást fokozó anyagként hathat vagy a fenti funkciók kombinálódhatnak. Az adott mechanizmustól függetlenül a kísérletek egyértelműen igazolják, hogy a GLN egy fontos tápanyag a bélnyálkahártya növekedésében. A bélkimetszést követő testtömeg-növekedés igazolja, hogy a GLN anabóliás hatást fejt ki az izomszövetekre és más szövetekre is.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a kísérleti adatok igazolják azt a feltételezést, hogy a GLN bizonyos feltételek között lényeges tápanyag a stresszes állapotok során. A GLN endogén termelése a tapasztalatok szerint nem kielégítő, eredményeként csökken a plazma- és szövetkoncentráció, és megváltozik a szövet morfológiája. Az exogén GLN-adagolás fenntartja a szabad GLN-koncentrációt, és stimulálja a táplálóhatást, vagyis a bélnyálkahártyára és az általános növekedésre gyakorolt hatást.

7. példa

A vékonybél nyálkahártyájának megvédése glutaminnal dúsított parenterális táplálással A parenterális táplálás nyálkahártya-sorvadást eredményez a vékonybélben [Johnson L. R. és munkatársai: Gastroenterology 68, 1177-1183 (1975)]. Ez a válasz összefüggésben lehet a gasztrointesztinális elválasztás és az emésztőhormonok csökkenésével, valamint az enterociták szaporodásához szükséges speciális tápanyagok viszonylagos hiányával. A GLN a vékonybél fő oxidációs tápanyaga, de nincs jelen a szokásos parenterális oldatokban. A diétás GLN-nek a vékonybélválaszra gyakorolt hatásának vizsgálatához különböző koncentrációjú fenti aminosavval dúsított parenterális oldatokat alkalmazunk.

A) Anyagok és módszerek

Megfelelő kondíciójú és 210-230 g testtömegű hím Wistar-patkányokon (n=42) katétert vezetünk a nyaki vénába, amit egy forgatható eszközzel rögzítünk. Ez utóbbi lehetővé teszi, hogy az állatoknak lekötözés nélkül, hosszú időn keresztül infúziót adjunk [Búrt, Μ. E. és munkatársai: J. Physiol. 238, H599-603 (1980)]. Az állatokat egyedi lebontási ketrecekbe helyezzük, és megfelelő mennyiségű ivóvízzel látjuk el. A kontrollállatoknak 0,9 tömeg% sóoldat-infúziót és tetszőleges mennyiségű Purina patkánytápot adunk. Három kísérleti csoport iv. táplálást kapott. A tápoldatok megfelelő mennyiségű nitrogént (0,9 g/100 ml) és tápértékét

HU 220 214 Β (98 kcal/100 ml) tartalmaznak azonos koncentrációjú esszenciális aminosavak, nem esszenciális aminosavak és dextróz mellett. A nem esszenciális aminosavak mennyiségét minden oldatban úgy állítjuk be, hogy a GLN-koncentráció 0,1 vagy 3 g/100 ml legyen. A pa- 5 renterális oldatokat 48 ml napi dózisban adagoljuk.

A vizeletkiválasztást és a nitrogénkiválasztást naponta méijük. Az állatokat a parenterális táplálás 7. napján megöljük, és vérmintát veszünk a GLN- és ammóniakoncentráció meghatározásához. A bélrendszer megfe- 10 lelő szakaszaiból teljes vastagságú éhbélszegmenseket és nyálkahártyamintákat veszünk. A mintákat lemérjük, homogenizáljuk, és mérjük a DNS- és fehérjetartalmat. A szövettani vizsgálatokhoz 5 pm vastagságú paraffinmetszeteket készítünk. Az éhbél bolyhainak ma- 15 gasságát és számát, valamint a nyálkahártya vastagságát kódolt mintákon határozzuk meg.

B) Eredmények és értékelés A nedves tömeg, a DNS-tartalom, a fehérjetartalom és a bolyhok magassága minden iv. táplálású patkány- 20 nál csökken az orális táplálású kontrollcsoporthoz viszonyítva (XIII. táblázat). A plazma GLN-koncentrációja nő a GLN-tartalmú infúziós oldat alkalmazása esetén. Az éhbél nyálkahártyájának tömege jelentős mértékben növekszik a GLN-mentes oldattal táplált patkányokhoz viszonyítva. A teljes vastagságú éhbél tömege nem mutat növekvő tendenciát a GLN-felvétellel társulva, de a válasz nem volt statisztikailag szignifikáns. A 2 tömeg% és 3 tömeg% koncentrációjú GLN-infüziót követően növekszik a nyálkahártya, valamint a teljes vastagságú éhbél DNS-tartalma. Ezekhez a változásokhoz társul a nyálkahártya szövettanilag kimutatható növekedése. A bolyhok magassága és a nyálkahártya vastagsága dózistól függő mértékben növekszik. Az állatok pozitív nitrogénbalanszot mutatnak, de a 2 tömeg% GLN-oldattal kezelt patkányok mutatják a legnagyobb nitrogénmennyiséget.

A GLN-nel kiegészített parenterális oldat alkalmazása az iv. táplálású állatoknál növeli az éhbélnyálkahártya tömegét, DNS-tartalmát és a bolyhok magasságát. A vékonybél nyálkahártyájának növekedése javítja a vékonybél funkcióit, és gyorsítja az enterális táplálás bevezetését. A GLN tehát a nyálkahártya szempontjából egy olyan fontos tápanyag, amely nincs jelen a szokásos parenterális tápoldatokban.

XIII. táblázat

	0GLN	2% GLN	3% GLN	Patkánytáp
(n=10)	(n=ll)	(n=10)	(n=ll)
Plazma-GLN (pmol/L)	890,3+42,4	1105,8+98,8*	717,1+46
Teljes vastagságú éhbél tömege WT (mg/cm)	30,6+0,8	31,4+1,0	32,0+0,6	46,6+3,6
Nyálkahártya tömege (mg/cm)	17,7+0,7	20,4+1,1**	20,3 + 1,0**	29,3+2,3
Éhbél-DNS (pg/cm)	252,8+9,5	279,9+7,3**	303,1 + 19,4*	370,2+33,0
Nyálkahártya-DNS (pg/cm)	101,7+5,9	134,0+7,1***	125,1+7,6**	171,0+12,7
Bolyhok magassága (pm)	266,5+8,4	294,0+7,9**	306,4+9,9***	405,6+17,3
Nyálkahártya vastagsága (pm)	422,6+9,7	448,1+8,9*	452,6+11,5*	589,6+20,9

* p<0,05, ** p<0,025, ·* p<0,005 vs 0% /GLN. GLN=glutamin.

8. példa

Glutaminnal dúsított parenterális oldat hatása 5fluor-uracil-kezelés után

Annak meghatározásához, hogy a GLN-nel kiegészített parenterális tápoldat előnyös hatást fejt ki a sérült bélnyálkahártya megvédésében vagy helyreállításában, GLN-nel dúsított tápoldatot adagolunk 4 napon keresztül növekvő dózisú 5-fluor-uracil (5-FU) adagolása előtt és után. Az 5-FU a gasztrointesztinális nyálkahártyára állatokban és emberben jelentős toxicitást kifejtő kemoterápiás szer [Muggia és munkatársai (1963); Roche és munkatársai (1970); Bounous és munkatársai (1977); Stanford és munkatársai (1977); Shaw és munkatársai (1979) idézett művei].

A) Anyagok és módszerek

1. Az állatok előkészítése

A kísérleti patkányokat lényegében a 6. és 7. példában leírt módon készítjük elő és helyezzük el. Az állató- 60 kát véletlenszerűen csoportokra osztjuk, és GLN-mentes vagy 2 g/dl GLN-t tartalmazó parenterális tápoldat45 tál kezeljük.

2. 5-FU-val kiváltott gasztrointesztinális sérülés és GLN-infüzió

A patkányokba a fent leírt módon katétert vezetünk, és az altatást követő legalább 3 órás szoktatás után a cso50 portokba osztott állatoknak 100, 150 vagy 200 mg/kg ip. 5-FU-injekciót adunk. A kontrollcsoportnak 0,9 tömeg%-os sóoldatot fecskendezünk be (0 mg/kg 5-FU). A dózis szerinti csoportoknak GLN-mentes vagy 2 tömeg% GLN-t tartalmazó infúziót adunk. Az infúziót 55 4 órával az 5-FU, illetve a sóoldat befecskendezése után indítjuk, és 4 napon keresztül 46 ml napi mennyiségben folytatjuk. Ezt az időtartamot aszerint választottuk meg, hogy a tapasztalatok szerint a nyálkahártya az 5-FUsérülés után ezen idő alatt áll helyre [Roche és munkatársai idézett müve (1970)], ezért a GLN-nek a nyálka24

HU 220 214 Β hártya regenerálódására gyakorolt hatását szintén ebben a periódusban kell vizsgálni.

3. GLN-adagolás a bélsérülés előtt

A katéterezést követően a patkányoknak 12 órán keresztül fele erősségű tápanyagot és az ezt követő 8 na- 5 pon keresztül GLN-mentes vagy 2 tömeg% GLN-t tartalmazó teljes erősségű tápanyagot adunk. Az 5-FU készítményt a parenterális adagolás negyedik napján ip. adagoljuk, és a patkányokat négy nappal később megöljük. Egyetlen dózis 5-FU-t (150 mg/kg) adagolunk, mi- 10 vei ez általános rossz közérzetet és súlyos bélsérülést vált ki fokozott pusztulás nélkül. A vizelet nitrogénkiválasztását naponta mérjük, és ez alapján számoljuk a nitrogénegyensúlyt.

4. Szövetmintavétel 15

A vér- és bélszövetmintákat a fenti példákban leírt módon vesszük, és készítjük elő az analízishez. Meghatározzuk a hemoglobin-, fehérvérsejt- és vérlemezkeszámot, ami a különböző dózisú 5-FU-adagolás általános hematológiás toxicitására utal. 20

5. Analitikai és statisztikai módszerek

Az analitikai vizsgálatokat a 6. és 7. példában leírt módon végezzük. A statisztikai analízist a két diétával és 5-FU-dózissal kapott változók összehasonlításával kétutas analízissel végezzük. Az azonos dózisú FU-val 25 kezelt két kísérleti csoport összehasonlításához párosítatlan t-tesztet végzünk. A kapott különbségek statisztikailag szignifikánsak a p<0,05 értéken.

B) Az eredmények értékelése

1. Parenterális táplálás hatása a sérülés után 30

Az állatok mintegy 36 órával az 5-FU-injekció után általánosan jó közérzetet mutatnak, ezután azonban letargiás állapotba kerültek. A 60 állat közül 5 állatot technikai okokból kizártunk (nem működik a katéter vagy meghibásodik az infúziós szivattyú), és 6 állat elpusztul 35 az 5-FU-kezelés hatására (2 a GLN-nel etetett csoportból és 4 a kontrollcsoportból). A 49 vizsgált állatból 23 GLN-mentes tápoldatot és 26 2 tömeg% GLN-nel kiegészített tápoldatot kap.

a) A bélrendszerre vonatkozó adatok 40

Az 5-FU adagolását követően növekszik az éhbél nedves tömege, DNS- és fehérjetartalma. Ezek az adatok azonban magasabb értéket mutatnak a GLN-nel kezelt állatoknál, mint a GLN-mentes kontrollcsoportnál, és ez a különbség jelentősen nagyobb volt a nyálkahár- 45 tya tömegénél, DNS- és fehéqetartalmánál (XIV. és XV. táblázat). A GLN-nel kezelt patkányoknál a bél szerkezetének megőrzését mikroszkopikus úton vizsgáljuk a nyálkahártya vastagságának és a bolyhok magasságának mérésével (XIV. és XV. táblázat). 50

b) Hematológia

Míg a hemoglobinszint minden 5-FU-dózisnál változatlan maradt, jelentős mértékben csökkent a keringő fehérvérsejtek és vérlemezkék száma. Ez a hatás a hatóanyaggal kezelt minden állatnál jelentkezik, az alkalmazott táplálástól függetlenül (XIV. és XV. táblázat).

2. Sérülés előtti parenterális táplálás hatása

Az 5-FU adagolását követő parenterális adagolással ellentétben jelentős mértékben nőtt a pusztulás. A GLNmentes csoportból 12 állat közül 6 elpusztult, míg a GLN-nel etetett csoportból 12 állat közül csak 2 pusztult el. Ez a különbség statisztikailag szignifikáns a p=0,06 szinten (Fisher exact test).

a) A bélrendszerre vonatkozó adatok

Az éhbél és a nyálkahártya nedves tömege jelentősen nagyobb a GLN-nel etetett állatokban, és ugyanez érvényes a nyálkahártya DNS- és fehérjetartalmára, míg a teljes vastagságú DNS- és fehéqetartalom nem mutat különbséget a két csoport között (XIV. és XV. táblázat). A szövettani analízis igazolta a nyálkahártya vastagságának növekedését, valamint a bolyhok magasságának növekedését a GLN-nel kezelt állatokban kimutató biokémiai adatokat.

b) Hematológia

Nem mutatható ki hematológiai különbség a két csoport között, a hemoglobinszint változatlan, míg a fehérvérsejt- és részecskeszám a diétától függetlenül csökken (XIV. és XV. táblázat).

3. Plazma-GLN- és aminosavtartalom 5-FU-adagolás után

A plazma-GLN-szint az 5-FU-adagolást követően minden állatban emelkedik, akkor is, ha GLN nincs jelen a diétában. Ebben a lebontási folyamatban nő az izmok GLN-felszabadítása, és ez a bélrendszer leromlott sejtszerkezetével (és az 5-FU-val kiváltott bizonyos mértékű renális toxicitással) kombinálódva növeli a keringő GLN mennyiségét.

4. Nitrogénegyensúly

Fokozott nitrogén-visszatartás figyelhető meg a 2 tömeg% GLN-nel kezelt állatoknál a vizsgálatok elején. Hasonló változás mutatható ki a GLN-nel kiegészített parenterális oldattal az 5-FU-kezelés előtt etetett állatoknál. A napi nitrogénegyensúly a táplálás első 6 napjában lényegesen nagyobb a GLN-nel etetett állatoknál. A 2 tömeg% GLN-nel kezelt csoportban a kumulatív nitrogén-visszatartás 1105±85 mg nitrogén a GLNmentes patkányoknál mérhető 736 ±149 mg értékkel szemben (p<0,05).

XIV. táblázat

A sérülés után parenterálisan táplált állatoknál mért bél- és hematológiás adatok

5-FU dózisa (mg/kg)	0	100	150	200	p érték*
Glutamintartalom	0%	2%	0%	2%	0%	2%	0%	2%
Állatok száma	7	8	4	5	6	6	6	7	Diéta	Dózis
Hemoglobin (g/dl)	13,0	12,4	12,2	12,6	11,6	13,0	12,3	12,5	NS	NS**

HU 220 214 Β

XIV. táblázat (folytatás)

5-FU dózisa (mg/kg)	0	100	150	200	p érték*
Glutamintartalom	0%	2%	0%	2%	0%	2%	0%	2%
Állatok száma	7	8	4	5	6	6	6	7	Diéta	Dózis
Fehérvérsejtek száma (ÍO’/I)	9,0	7,8	2,8	4,2	1,8	2,5	3,4	3,6	NS	<0,001
Vérlemezkék száma (ÍO’/I)	809	854	365	369	140	146	412	261	NS	0,001
Plazma glutaminszintje (pmol/l)	819	1028	1103	1050	1054	1250	1060	1016	NS	NS
Éhbél nedves tömege (mg/cm)	33,8	38,9	32,8	34,2	30,4	34,6	32,6	37,0	<0,01	<0,05
Éhbél DNStartalma (pg/cm)	232	246	193	206	184	216	178	246	<0,05	NS
Éhbél fehéijetartalma (mg/cm)	3,3	3,7	3,3	3,2	2,6	3,3	2,9	3,5	<0,05	NS
Nyálkahártya nedves tömege (mg/cm)	21,9	27,6	17,9	26,0	15,6	21,9	20,7	24,7	<0,001	<0,01
Nyálkahártya DNStartalma (pg/cm)	136	181	120	166	80	117	120	142	<0,001	<0,001
Nyálkahártya fehérjetartalma (mg/cm)	1,9	2,4	1,4	2,2	1,3	2,0	1,5	1,9	<0,01	< 0,05
Nyálkahártya vastagsága (p)	551	616	496	555	457	525	463	495	<0,05	<0,05
Bolyhok magassága (μ)	356	422	300	360	247	320	239	299	<0,05	<0,05

* kétutas analízis az adatok összehasonlításával. ** NS=nem szignifikáns.

XV. táblázat

Sérülés után TPN-nel kezelt állatoknál mért bél- és hematológiás adatok

	0% GLN (n=5)	2% GLN (n= 10)	p érték*
Hemoglobin (g/dl)	10,6+0,6	11,5+1,5	NS**
Fehérvérsejtek száma (109/l)	2,9+1,0	1,7+0,3	NS
Vérlemezkék száma (109/l)	195+54	233+55	NS
Plazma glutamintartalma	1245+50	1212+135	NS
Éhbél nedves tömege (mg/cm)	22,4+2,0	28,0+1,2	<0,01
Éhbél DNS-tartalma (pg/cm)	146+17	168+9	NS
Éhbél fehéqetartalma (mg/cm)	2,1+0,2	2,3+0,1	NS
Nyálkahártya nedves tömege (mg/cm)	12,0+1,0	14,7+0,7	<0,05
Nyálkahártya DNS-tartlama (pg/cm)	63+4	76+4	<0,05
Nyálkahártya fehérjetartalma (mg/cm)	0,8+0,1	1,1+0,1	<0,05
Nyálkahártya vastagsága (p)	359+21	416+16	<0,05
Bolyhok magassága (p)	203+16	247+12	<0,05

* párosítatlan t-teszt.

** NS=nem szignifikáns.

HU 220 214 Β

9. példa

Glutaminnal dúsított parenterális táplálás hatása sugárterápia, kemoterápia és csontvelő-átültetés után

A kísérletben véletlenszerű, kódolt klinikai vizsgálatokkal teljes testbesugárzással és/vagy kemoterápiával kezelt betegeknél megvizsgáljuk, hogy a GLN-nel kiegészített diéta milyen módon befolyásolja a nitrogénegyensúlyt, javítja a klinikai állapotot és gyorsítja az általános felépülést.

A vizsgált személyek köre kiterjed az autológ és allogén csontvelő-átültetéses betegekre.

A) Anyagok és módszerek

1. Vizsgált betegek

A vizsgált betegeket autológ vagy allogén csontvelő-átültetést kapott betegek közül válogattuk ki. A kiválasztott, mindkét nembe tartozó személyek életkora 18 és 60 év közé esik, és a diagnózis szerint az akut mielomaleukémia (AML) első felépülési fázisában (allogén átültetés), az AML második enyhülési fázisában (autológ átültetés) találhatók, illetve gerincfejlődési zavarokat, limfomát, aplaziás vérszegénységet vagy más leukémiát, így krónikus mielomaleukémiát (CML) mutatnak. Ebben az állapotban a betegek parenterális táplálást igényelnek és központi infúziós vezetékkel vannak ellátva. A betegek normális májfunkciót (összbilirubin 3 mg/dl alatt), normális vesefunkciót (kreatinin 1,2 mg/dl alatt), diabéteszmentességet (vércukor 200 mg/dl alatt inzulin vagy orális hipoglémiás szer nélkül) mutatnak. A betegség stabil fázisában (például javulási fázisban találhatók). A kiválasztott betegek az ideális testtömeghez viszonyítva legfeljebb 20%-os veszteséget mutatnak.

2. A vizsgálatok ismertetése

A betegeket véletlenszerűen két csoportra osztjuk, amely standard vagy GLN-tartalmú TPN-t kap. A diéták megfelelő mennyiségű nitrogént és kalóriát tartalmaznak, de GLN-mentes a standard készítmény, és 0,57 g/kg napi GLN-mennyiséget tartalmaz a kísérleti oldat. A kísérleti csoportokat kódolt jelzésekkel azonosítottuk. A betegek elektrolitigénye a klinikai állapottól függően időben változhat, ezért az elektrolittartalmat a vérszinttől és a klinikai állapottól függően kívánt esetben változtatjuk.

A betegek a vizsgálat időszaka alatt orális tápanyagot tetszőleges mennyiségben kapnak, ha fizikai állapotuk ezt lehetővé teszi. Jegyeztük a napi orális, kalória-, fehérje-, zsír- és szénhidrátfelvételt.

A kódolt tesztoldat adagolását a csontvelő-átültetéstől (0-dik nap) számított 5 napon belül kezdjük meg. Egy kezdeti 3 napos szoktatást periódus után következő 7 napon keresztül napi 24 órán át összegyűjtjük a vizeletet és a székletet. 7 napot kihagyva a következő 7 napon keresztül (az átültetéstől számított mintegy 3 hét) tovább folytatjuk a gyűjtést. A mintagyűjtést délután 4től másnap délután 4-ig végezzük.

Hetente meghatározzuk a vér GLN-, glutamát-, ammónia-, aminosav-, C-reaktív fehérje- és prealbumintartalmát. A TPN és más szervi funkciók ellenőrzéséhez külön vérmintát veszünk.

A betegeket véletlenszerűen vizsgálati és kontrollcsoportra osztjuk. A csoportokat kiegyensúlyozzuk a diagnózis és az első javulási fázisban lévő AML csoportban a kezelés (teljes vagy részleges besugárzás) vonatkozásában is.

A vizsgálatokat akkor kezdjük, amikor a betegek már nem igényelnek TPN-t, vagyis a tetszőleges mennyiségű orális felvétellel bevitt kalória három egymást követő napon kielégíti az energiaigény 50%-át. Az 50%-os orális felvétel harmadik napját tekintjük a TPN befejező napjának. Az utolsó szűrővizsgálaton csak azok a betegek mennek át, akik energia- és fehérjeigényük legalább 60%-át felvették a TPN-kezelés alatt. Töröljük a további vizsgálatokból azokat a betegeket, akik a kontroll szerint 5 egymást követő napon nem kapnak kódolt oldatot.

3. Tápanyagfelvétel

Az energiafelvételt mintegy másfélszeresére állítottuk a lebontási arány szerint megbecsülhető értékhez viszonyítva (magasság és tömeg alapján). A nem fehéije jellegű kalóriafelvétel mintegy 70%-a dextróz és 30%-a zsíremulzió. A fehérjefelvétel 1,5 g/kg naponta. Elektrolitot és ásványi anyagot a normál vérszint fenntartásához szükséges mennyiségben adagolunk. A vitaminokat MVI-12 formájában 10 ml napi dózisban adagolunk. Nyomelemoldatot Lyph-med formájában 1 ml napi mennyiségben adunk. A TPN-oldatot délután 4-től másnap délután 4-ig adagoljuk. Az ideális testtömeget 20%kal meghaladó betegeknek az adott kor és nem alapján megállapítható ideális testtömeghez viszonyított kalória- és fehéijeellátást adunk.

4. Gyógyszerek

A vizsgált betegeknek gyógyszereket és nem TPNfolyadékot csak az egészségi állapotuktól függő mértékben adunk. Az alkalmazott gyógyszereket és folyadékokat feljegyezzük.

5. Kiegészítő vizsgálatok

A vizsgált betegeken meghatároztuk a test felépítését (a TPN adagolása előtt és után), a felkarizmok tömegét (kezelés előtt és után), a kéz szorítási erejét (a kezelés előtt, a kezelés 7. és 21. napján, valamint a kezelés után), a laktulózpermeabilitást (a kezelés 7. és 21. napján, valamint a kezelés után), a vérmérgezés súlyosságának mértékét (hetente), a transzplantátum/gazdabetegséget, a mikozitisz mértékét (hetente háromszor), és az általános közérzetet (kezelés előtt és után).

A fő végpontok meghatározásához vizsgáltuk: 1. nitrogénegyensúly (1. és 3. hét), 2. 3-metil-hisztidin és kreatinin kiválasztása (az 1. és 3. hét 5-7. napján gyűjtött vizeletminta három párhuzamos mérésének átlagértéke), 3. CRP (a TPN adagolásának első 4-6. hetének átlaga), 4. testfelépítés, 5. átlagos heti vérmérgezési szint, 6. átlagos heti hőmérséklet és a napi maximális hőmérséklet heti átlaga, és 7. átlagos heti GVHérték.

A többi végpont meghatározásához a következő vizsgálatokat végezzük: 1. eltelt napok száma (átültetés ideje 0-dik nap), 2. átültetés és újraszennyeződés közötti napok száma, 3. kórházi költségek, össz-antibio27

HU 220 214 Β tikumköltségek, 4. alkalmazott antibiotikumok és alkalmazás hossza, amelynek során csak azokat az antibiotikumokat és kezelési napokat vesszük figyelembe, amelyek egybe esnek a TPN-kezeléssel, és amit ismert vagy várt fertőzés megelőzésére adagolunk, 5. 500-1000 sejt/cm³ leukocitaszám elérésének ideje, 6. 500 sejt/cm³ feletti abszolút neutrofilszám elérésének ideje, 7. laktulózpermeabilitás, amit két egyensúly-vizsgálati periódus végénél két párhuzamosban mérünk, 8. a transzfiizióval átvitt vérlemezkék és vörösvérsejtek mennyisége, 9. az 50%-os orális felvételig vagy kiürülésig eltelt TPN-kezelési napok száma, és 10. általános közérzet.

B) Mérési eredmények értékelése

A két betegnél felvett mérési eredményeket a 7. ábrán és a XVI. táblázatban adjuk meg. A nagy dózisú

GLN-nel kiegészített TPN jelentős javulást eredmé5 nyez az átültetéses beteg klinikai állapotában. Ez a kezelés megelőzi a fokozódó negatív nitrogénegyensúlyt, csökkenti az orális nyálkahártya-gyulladás súlyosságát (ami kemoterápiánál nagyon elterjedt), és javítja a beteg általános egészségi állapotát, mint ezt a három klini10 kai kritérium mutatja.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GLN átmeneti tüneti javulást eredményez a vizsgált súlyos betegekben.

XVI. táblázat

Glutaminnal kiegészített TPN hatása csontvelő-átültetés után

		Standard TPN	Nagy dózisú GLN
Nitrogénbalansz (g/nap)	-2,9		+0,6
Antibiotikus nap1		60	43
Napok száma2	46		39
Szennyeződés időpontja (nap3)		36	28
Nyálkahártya-gyulladás mértéke4		2,5	1,0

A szokásos előíráson felül adagolt antibiotikumok száma és az adagolási napok száma.

A vcdőkömyezetben (lamináris légáramláséi szobák) eltöltött napok száma az elbocsátási döntés napjáig (kritériuma: WBC > 1000, lázmentesség, szájon keresztül történő táplálkozás stb.).

A csíramentes környezetben eltöltött napok száma a „szennyezett” személlyel (például családtaggal) történő találkozás időpontjáig, ez is klinikai döntést igényel.

A száj nyálkahártya-gyulladásának súlyosságát 0-4 közötti skálán értékeljük.

10. példa

Glutaminnal dúsított parenterális táplálás hatása a külső elválasztáséi hasnyálmirigyre A teljes parenterális tápláláshoz (TPN) gyakran bélés hasnyálmirigy-sorvadás, valamint a hasnyálmirigy kiválasztási zavarai társulnak. Kísérleteink szerint GLN-adagolás esetén csökken a TPN által kiváltott bélsorvadás. Emellett, az előzetes vizsgálatok arra utalnak, hogy a GLN, ami nincs jelen a szokásos aminosavkészítményekben, előnyös oxidatív tápanyagot képez a hasnyálmirigy számára, és a kívülről adagolt GLN nagy mennyiségét a hasnyálmirigy külső elválasztású szövetei használják fel. A GLN-nel dúsított iv. tápoldatnak a hasnyálmirigyre gyakorolt hatása azonban még ismeretlen. A kísérletben tehát 2 g/100 ml GLNnel dúsított iv. infúziós diéta (glutamin) és GLN-mentes megfelelő nitrogéntartalmú és energiatartalmú diéta (kontroll) hatását vizsgáljuk laboratóriumi patkányok külső elválasztású hasnyálmirigyének összetételére és szerkezetére.

A) Anyagok és módszerek

1. Állatok előkészítése

A hím Wistar-patkányokat a 6-8. példában leírt módon készítjük elő. Csak azokat az állatokat vizsgáljuk, amelyek az előzetés Purina patkánytáppal végzett szoktatást periódusban megfelelő testnövekedést mutatnak.

Az első kísérletben (n=32) az állatokon 60%-os középső éhbél-nyombél kimetszést és nyakivéna-katéterezést végzünk, míg a második kísérletben (n=24) az állatokon nyakivéna-katéterezést és látszólagos vékonybélkimetszést végzünk. Referenciaként a megfelelő táppal etetett állatokat (n= 18) alkalmazzuk.

A műtétet a 6. példában leírt módon végezzük. A vizsgálatban részt vevő 69 állat közül egyetlen állatot sem zártunk ki a referenciacsoportból, míg 13 állatot kizártunk a TPN-csoportból a katéter elfertőződése, összeillesztési problémák, béldugulás, szivattyúmeghibásodás vagy katéterelzáródás miatt.

2. A vizsgálatok lefolyása

A vékonybélkimetszés nélkül vagy vékonybélkimetszés után végzett katéterezést követően az állatokat véletlenszerűen három csoportra osztjuk. Az egyik standard patkánytápot kap orálisan (tápcsoport), a másik standard parenterális tápoldatot kap GLN nélkül (kontrollcsoport) vagy 2 tömeg% GLN-nel kiegészített oldatot kap (glutamincsoport), amit iv. infúzió formájában 7 napon keresztül adagolunk.

Az iv. tápoldatok a patkányok növekedéséhez szükséges összes tápanyagot tartalmazzák [Popp és munkatársai: Amer. J. Clin. Nutr. 36, 1119-1128 (1982)]. Az oldatokat sterilen állítjuk elő és tároljuk. A parenterális diéta megfelelő mennyiségű kalóriát (1,13 kcal/ml) és

HU 220 214 Β nitrogént (9,6 mg/ml) tartalmaz, és a két típusú diéta egymástól csak a nem esszenciális aminosavak összetételében különbözik.

Felébredés után a patkányokat elkülönített lebontási ketrecekbe helyezzük, és az infúziós katétereket olyan forgó eszközhöz (Instech Labs., USA) csatlakoztatjuk, amelyek lehetővé teszik, hogy az állatok a folyamatos infúzió alatt korlátlanul mozogjanak. A műtétet követő első 16 órában az állatok 0,9 tömeg% normál sóoldatot kapnak 1 ml/óra mennyiségben, amelynek során az orális felvételt kizárjuk. Az állatoknak megfelelő mennyiségű vizet adunk a műtétet követő első naptól kezdve a vizsgálatok befejezéséig. A műtét utáni első napon a TPN-nel etetett állatoknak 24 ml kontroll- vagy GLNnel dúsított diétát adunk a glükózinfúzióhoz történő hozzászokás elősegítése érdekében. A műtét utáni második naptól kezdve és folyamatosan a vizsgálatok végéig megfelelő mennyiségű (48 ml/nap) parenterális diétát adagolunk. A táppal etetett állatoknak, amelyek a felkínált tápot teljes egészében elfogyasztják, a TPNnel táplált patkányok 24 órás kalóriafelvételével ekvivalens mennyiségű kalóriát hordozó tápot adunk. így a táppal etetett patkányoknak 8 g Purina patkánytápot adunk az első 24 órában, és napi 16 g tápot adunk a vizsgálat befejezéséig. Táppal etetett állatok vénás katéterét a műtét utáni második napon lezárjuk. A vizeletet naponta savanyított edényekbe gyűjtjük a műtét utáni második naptól kezdve, és az aliquot részeket savanyított edényekben -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A vizelet térfogatát naponta feljegyezzük.

3. Szövetpreparáció és analitikai eljárások

Az állatokat a vizsgálatok befejezése után a műtétet követő 8. napon ismét lemérjük, 45 mg/kg ip. pentobarbitállal elaltatjuk, és a szívből heparinozott fecskendővel vérmintát veszünk. A teljes vér-GLN- és -glutamát-koncentrációt ezen a mintán mérjük a fent ismertetett eljárások szerint reverz fázisú HPLC segítségével [Smith R. J. és munkatársai: J. Liq. Chromatography, 8, 1783-1795(1985)].

Kivéreztetés után a hasnyálmirigy egy kis darabját (3x3 mm) kimetszük a mirigy központi szakaszából a lép- és gasztrikus szegmensek kapcsolódásánál, pufferolt 2,5 tömeg%-os glutáraldehid-oldatban fixáljuk, és a szövettani vizsgálatokig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A hasnyálmirigy visszamaradó részét óvatosan eltávolítjuk, és elválasztjuk a kapcsolódó bélfodor zsírés nyirokszöveteitől. A hasnyálmirigymetszeteket kódoljuk. A mirigyet lemérjük, jéghideg desztillált vízben 1:10 tömeg/térfogat arányban hígítjuk, és 30 másodpercen keresztül Polytron szövethomogenizátorban homogenizáljuk. A homogenizátumot 30 másodpercen keresztül ultrahanggal besugározzuk, és a DNS-, fehéijeés enzimtartalom meghatározásáig -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A májat eltávolítjuk, lemérjük, 90 °C hőmérsékleten 72 órán keresztül szárítjuk, és meghatározzuk a száraz tömeget.

4. Biokémiai vizsgálatok

A napi vizeletminta aliquot részeit összegyűjtve meghatározzuk a kumulatív napi nitrogénegyensúlyt. A savanyított vizeletminták nitrogéntartalmát macro-Kjeldahlmódszerrel határozzuk meg. A hasnyálmirigy-homogenizátum fehéijetartalmát Lowry módszerével [Lowry Ο. H. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 193, 265-275 (1951)] és DNS-tartalmát a módosított Burton-módszerrel [Burton K. A.: Biochem. J. 62, 315 -322 (1965)] határozzuk meg. A hasnyálmirigy-homogenizátumok egyegy részletét 200 pg/ml fehérjekoncentrációig hígítjuk 0,01 tömeg% boíjú-szérumalbumint tartalmazó pufferrel, és az enzimaktivitás meghatározásáig -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A hígított minták amilázaktivitását módosított Bemfeld-módszerrel [Bemfeld P.: Amylases: Alpha and Béta, In: Colowick SP, Káplán NO, Methods of Enzymology, I. kötet, Academic Press, New York, 149-158 (1955)], a tripszinaktivitást Hűmmel módszerével [Hűmmel B. C.: Can. J. Biochem. Physiol. 37(12), 1393-1399 (1959)] határozzuk meg. A tripszinogén aktiválását 400 pl minta 0,0492 pg sertés-enterokinázzal 37 °C hőmérsékleten 4 órán keresztül végzett inkubálással végezzük. A lipázaktivitást Kodak Ektachem 700 analizátorban a Mauk-féle [Mauk J. C. és munkatársai: Clin. (1984)] kétpontos módszenei mérjük. Az enzimaktivitást a percenként előállított termék mikromóljainak egységében fejezzük ki.

5. A hasnyálmirigy szövettani vizsgálata

A hasnyálmirigyszövetet 4 °C hőmérsékleten 2,5 tömeg%-os glutáraldehid-foszfát-pufferben fixáljuk, és 2 órán keresztül szobahőmérsékleten 1 tömeg%-os ozmium-tetroxidban tartjuk. A szövetmintát ezután növekvő mennyiségű alkoholban dehidratáljuk, és aralditben beágyazzuk. Az 1 mikron vastagságú metszeteket 1,0 tömeg% toludénkék festékkel színezzük a fénymikroszkóppal végzett vizsgálathoz. Az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz LKB Nova ultra mikrotonnal 600-800 Á vastagságú metszeteket készítünk. Ezeket uranil-acetáttal és ólom-citráttal színezzük, majd Phillips 301 transzmissziós elektronmikroszkópon vizsgáljuk. Az acinusos sejteket az elektronmikroszkópban lefényképezzük, majd 2793-szorosra és 7127-szeresre nagyítjuk.

6. Az adatok analízise

A kapott mérési eredményeket átlagérték ± standard hibaegységben adjuk meg. A hasnyálmirigy nedves tömegét, DNS- és fehérjetartalmát a hasnyálmirigy teljes mennyiségére és 100 g testtömegre vonatkoztatva adjuk meg. A hasnyálmirigy tömegét és fehéijetartalmát a DNS mennyiségére is vonatkoztatjuk, ami a sejtméretre utal. A fenti adatokra vonatkozóan a csoportok közötti összehasonlítást a testtömeg alapján végzett korrekció után végezzük, mivel lineáris összefüggés van az össztesttömeg és a hasnyálmirigy nedves tömege között 100-300 g közötti testtömegű hím Wistar-patkányokban. A hasnyálmirigy enzimaktivitását (egység/mg fehérje) a teljes mirigytartalomra vonatkoztatva fejezzük ki, emellett fajlagos aktivitást (egység/mg hasnyálmirigy-DNS) számolunk. Az előenzimszemcsék átlagos átmérőjét Weibel módszerével [Weibel E. R. és munkatársai: Principles and Techniques of Electron Microscopy; Biological Applications; 3. kötet, M. A. Hayat, Van Nostrand, Reinhold, New York, USA (1973)] számoljuk.

HU 220 214 Β

A GLN és a bélkimetszés hatásának vizsgálatához a változókkal kétutas analízist végzünk [Winer B. J.: Statistical Principles in Experimental Design (2. kiadás), McGraw-Hill, New York, USA (1971)]. Ha a változók analízise egy szignifikáns fő hatást mutat, párosítatlan t-tesztet végzünk a GLN-nel dúsított diétával kezelt állatok és a megfelelő kontrollcsoport között. A táppal etetett állatok adatai lehetővé teszik a kezelt csoportnál bekövetkező hasnyálmirigy-sorvadás bemutatását, de ezeket az adatokat az általános analízishez nem használtuk fel. A különbség statisztikailag szignifikánsnak minősül, ha a valószínűség (p) értéke<0,05.

B) Az eredmények értékelése

1. Testtömeg, nitrogénegyensúly és plazma-glutamin- és -glutamát-tartalom

A testtömeg és a nitrogénegyensúly változása hasonló a GLN-nel etetett csoportban és a kontrollcsoportban a bélkimetszés nélküli állatoknál és a bélkimetszett állatoknál is (XVII. táblázat). Azok az állatok, amelyeken kimetszettük a vékonybél egy darabját, a GLNcsoport és a kontrollcsoport összehasonlításával szignifikáns növekedést mutat a plazma GLN-tartalma (1143±75, illetve 890±41, p<0,05), és a plazma glutamáttartalma (177±12, illetve 144±8, p<0,05). A GLNcsoport és a kontrollcsoport között más szignifikáns különbség nem figyelhető meg.

2. A hasnyálmirigy adatai

A TPN-nel etetett állatok esetében lényegesen kisebb a hasnyálmirigy átlagos nedves tömege (33-43%), a fehéijetartalom (25-58%) és a DNS-tartalom (14-30%), mint a táppal etetett állatoknál (XVIII. táblázat).

A bélkimetszés nélküli állatoknál a GLN-infüzió 100 g testtömegre vonatkoztatva növelte a hasnyálmirigy tömegét (22%), a DNS-tartalmat (32%) és a fehérjetartalmat (24%) a kontrollcsoporthoz viszonyítva. Ezek a különbségek szignifikánsak a hasnyálmirigy tömegére (p<0,05) és a DNS-tartalomra (p<0,005), de nem szignifikánsak a fehérjetartalomra (p=0,06). Ezeknél az állatoknál a hasnyálmirigy fehérje/DNS és hasnyálmirigy tömeg/DNS arány nem mutat szignifikáns különbséget (XVIII. táblázat).

A 60%-os vékonybélkimetszésen átesett és GLNnel etetett állatok hasnyálmirigye lényegesen nehezebb (14%, p<0,05) és 100 g-ra vonatkoztatott összhasnyálmirigy fehérjetartalma lényegesen nagyobb (31%, p<0,05), mint a kontrollcsoportnál. Az össz-DNS-tartalom, a hasnyálmirigy tömeg/DNS és fehérje/DNS arány nem mutat szignifikáns különbséget, bár ez utóbbi 20%-kal nagyobb a GLN-csoportban.

3. Hasnyálmirigyenzimek

A TPN-nel etetett állatoknál csökken az összhasnyálmirigy-enzimaktivitás a táppal etetett állatokhoz viszonyítva (XIX. táblázat). A bélkimetszett állatoknál az összhasnyálmirigy tripszinogén (p< 0,005) és tripszinogén fajlagos aktivitása (p<0,005) szignifikánsan nagyobb a GLN-csoportban, mint a kontrollcsoportban.

Az enzimtartalomban vagy fajlagos aktivitásban más különbség nem jelentkezik a GLN-csoport és a kontrollcsoport között.

4. A hasnyálmirigy szövettani vizsgálata és ultraszerkezete

A külső elválasztású hasnyálmirigyszövet és a Langerhans-szigetek normális képet mutatnak fénymikroszkóp alatt minden kísérleti állatnál, a GLN-nel etetett állatoknál nem mutatható ki hasnyálmirigy-gyulladásra vagy -ödémára utaló jel. Az előenzimszemcsék átlagos átmérője a nem kimetszett TPN-nel etetett állatoknál szignifikánsan kisebb, mint a táppal etetett állatoknál (3,88±0,06 a GLN esetében, 3,8O±O,O5 a kontrollcsoportnál, és 4,69±0,10 a másik csoportnál, p<0,05, egyutas ANOVA-analízis). A glutamin- és a kontrollcsoport nem mutat szignifikáns különbséget. A hasonló irányítottságú acináris egységek összehasonlításakor növekvő sejttérfogat-sűrűség, növekvő mennyiségű előenzimszemcse, és ezek által elfoglalt növekvő sejttérfogat mutatható ki a GLN-nel etetett állatoknál a kontrolihoz viszonyítva.

5. A kezelés hatásának analízise az egyesített sorozatban

A GLN-nel dúsított diétával etetett állatok vagy a vékonybélkimetszést elszenvedett állatok szignifikánsan megnőtt plazma-GLN- (p<0,02) és glutamát- (p<0,02) koncentrációt mutatnak. A GLN-infúzió nem befolyásolta a kumulatív nitrogénegyensúlyt, ezért a bélkimetszés szignifikáns negatív hatást mutat. A hasnyálmirigy tömege (p<0,0001), fehérjetartalma (p<0,02) és DNStartalma (p<0,004) szignifikánsan nagyobb a GLN-csoportban és ez a hatás független a bélkimetszéstől. A bélkimetszés szignifikánsan csökkenti az ossz átlagos hasnyálmirigyfehérje-tartalmat (p<0,006), és a hasnyálmirigy-fehérje/DNS arányt (p<0,05).

A GLN-csoport szignifikánsan nagyobb hasnyálmirigy-tripszinogén-tartalmat (p<0,02) és ligáztartalmat (p<0,03) mutat. Az össz-amiláztartalom és az enzimek fajlagos aktivitása nem változik a GLN-infúzió hatására. A bélkimetszés egy általános negatív hatást (p< 0,0001) vált ki a tripszinogén, amiláz és ligáz összmennyiségére és fajlagos aktivitására.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a GLN-nel kiegészített TPN szignifikánsan gyengítette a hasnyálmirigy tömegének veszteségét (14-22%), a DNS-tartalom csökkenését (12-32%) és a fehéijetartalom csökkenését (24-31%), ami a kontrolldiétával etetett állatoknál jelentkezik. Általánosságban, a GLN-csoportban szignifikánsan nő az összhasnyálmirigy-tripszinogéntartalom (53%) és ligáztartalom (30%), de nincs különbség a fajlagos enzimaktivitásban a kontrolihoz viszonyítva. A GLN ezért fontos tápanyag a hasnyálmirigy külső elválasztású szövetei számára a TPN során. A GLN-nek a hasnyálmirigyre gyakorolt hatása az iv. táplálás során fontos klinikai alkalmazási lehetőség.

HU 220 214 Β

XVII. táblázat

Testtömeg, nitrogénegyensúly, plazmaglutamin- és -glutamát-tartalom összehasonlítása

	Kimetszés nélkül	Kimetszéssel
Kontroll	Glutamin	Táp	Kontroll	Glutamin	Táp
Állatok száma	7	7	10	12	12	8
Testtömeg (g)
0. nap	197±4	193 ±4	187±2	208 ±3	209±3	197±5
8. nap	179±3	180±5	197±2	193±3	193 ±4	199±5
Kumulatív nitrogénbalansz (gm)	2,3±0,0	2,3 ±0,0	3,3±0,0	1,1 ±0,0	l,l±0,0	3,3 ±0,0
Plazmaglutamin (pmol/l)	823±68	896±63	644±26	890±41	1143±75*	545±57
Plazmaglutamát (pmol/l)	108±5	123±5	80±6	144±8	177±12*	79±2

* p< 0,05 párosítatlan t-teszt kétutas ANOVA után.

XVIII. táblázat

Hasnyálmirigyadatok és májtömeg

	Kimetszés nélkül	Kimetszéssel
Kontroll	Glutamin	Táp	Kontroll	Glutamin	Táp
Állatok száma	7	7	10	12	12	8
Hasnyálmirigy DNStartalma (g)	2,8±0,2	3,6±0,2***	4,2±0,3	3,0±0,l	3,4±0,3	4,3±0,3
Hasnyálmirigy nedves tömege
ossz (g)	555±26	680±39*	999±52	602±19	704±25***	1080±63
mg/100 pg/DNS	20±l	19±1	24±1	20±l	22±1	25±1
Hasnyálmirigy fehéqetartalma
ossz (g)	82±8	102±6	147±6	68±4	90±6***	186±13
mg/mg DNS	30±2	28±1	35±1	23±2	28±2	43 ±2
Máj nedves tömege (g)	8,16±0,16	8,40±0,28	9,2 ±0,34	9,90±0,24	10,l±0,50	8,8±0,80

* p<0,05, ***p<0,005 párosítatlan t-teszt kétutas ANOVA után.

XIX. táblázat

Hasnyálmirigy enzimaktivitása

	Kimetszés nélkül	Kimetszésscl
Kontroll	Glutamin	Táp	Kontroll	Glutamin	Táp
Állatok száma	7	7	10	9	11	3
Amiláztartalom
kU/össz hasnyálmirigy	15,0±2,0	14,5±0,5	16,7±1,5	0,35 ±0,26	l,18±0,66	18,9±4,6
kU/mg DNS	5,7±0,8	4,0±0,2	4,2±0,4	0,14±0,ll	0,39±0,22	4,4±0,5
T ripszinogéntartalom
U/össz hasnyálmirigy	374±74	496±96	611±75	139±23	283±22***	-
(U/mgDNS	137±20	132±20	140±9	50±9	87±6***	-
Lipáztartalom
kU/össz hasnyálmirigy	10,7±l,4	14,9±2,4	27,4±2,6	7,5±1,1	9,6±0,7	25,7±2,8
kU/mg DNS	19,4±2,4	22,8±4,5	30,9±2,7	12,6±1,6	13,7±0,9	26,8±2,6

***p<0,005 párosítatlan t-tetszt kétutas ANOVA után.

HU 220 214 Β

11. példa

A glutamin megakadályozza a hasnyálmirigy sorvadását az elementáris enterális diéta során In vitro vizsgálatok igazolják, hogy a GLN fontos légzési tápanyag a hasnyálmirigy számára, de a GLNnel kiegészített enterális diétának a hasnyálmirigy szerkezetére és funkciójára gyakorolt hatása ismeretlen. A standard és GLN-nel kiegészített elementáris diétának a hasnyálmirigyre és a bélnövekedésre egy műtéti stressz után kiváltott hatását 195-210 g testtömegű hím Wistar-patkányokon (n=25) vizsgáljuk. A középső éhbél 60%-os kimetszését és összeillesztését követően a patkányokat véletlenszerűen csoportokra osztjuk. Az egyik csoport szokásos patkánytápot, a másik standard elementáris diéta folyamatos infúzióját (kontroll), míg a harmadik megfelelő nitrogén- és energiaellátást biztosító és 2 g/100 ml GLN-nel kiegészített diétát (GLN-csoport) kap. Az elementáris diéta csak a nem esszenciális aminosav-összetételben tér el. A vizeletet naponta gyűjtjük, és a nitrogénegyensúlyt folyamatosan méljük. Az állatok elölése után meghatározzuk a testtömeget, és a vérmintában a GLN-, glutamát- és ammóniatartalmat. Eltávolítjuk a májat, a bélrendszert és a hasnyálmiri10 gyet, leméqük, mérjük a DNS- és fehérjetartalmat, és szövettani vizsgálatra előkészítjük. A máj- és hasnyálmirigymintán vizsgáljuk a zsírtartalmat és enzimtartalmat is. A kapott adatok egy részét átlagérték±szórás egységben a XX. táblázatban adjuk meg.

XX. táblázat

	Hasnyálmirigy mg/100 g testtömeg	Máj	Plazma (mol/1)
Kezelés	n	Tömeg (%)	DNS	Fehérje	Tömeg (g)	GLN	Glutamát
Kontroll	8	343 + 19	2,7+0,2	68+5	10,4+0,4	976+60	165+12
GLN	9	439+15*	3,3+0,3	95+9*	8,7+0,4*	1148+104	109+14
Táp	8	547+38#	2,2+0,2	94+7*	8,8+0,8*	718+61#	101+5#

* p<0,05 (a kontrolihoz viszonyítva).

# p<0,005 a tapos kontrolihoz vagy GLN-hez viszonyítva (ANOVA).

Az elementáris diéta alkalmazása a táppal etetett állatokhoz viszonyítva csökkenti a hasnyálmirigy törne- 30 gét. A GLN szignifikánsan enyhíti a hasnyálmirigy tömegének veszteségét, növeli a hasnyálmirigy fehérjetartalmát, és megakadályozza a máj nedves tömegének csökkenését a kontrollcsoporthoz viszonyítva. A GLNés a kontrollcsoport adatainak összehasonlítása szerint a hasnyálmirigy tömege és DNS-tartalma a plazma glutamáttartalmával (p<0,03) van összefüggésben, és nem a GLN-szinttel. Mivel a testtömeg és a nitrogénegyensúly hasonló a GLN- és a kontrollcsoportban, a GLN hatása specifikus a hasnyálmirigytömeg fenntartására a műtétet követő periódusban. Ezek az adatok alátámasztják azt a feltételezést, hogy a GLN esetenként fontos tápanyag a gasztrointesztinális szövetek számára a sebészeti stressz után.

12. példa

A glutaminnal dúsított parenterális táplálás csökkenti a bélfal 5-fluour-uracillal kiváltott sérülését A laktulóz egy nem lebontható cukor, amely a gasztrointesztinális traktusból nehezen szívódik fel. Gasztro- 50 intesztinális rendellenességek, így gyulladásos bélbetegség esetén a laktulóz a nyálkahártya membránnyílásain keresztül szívódik fel, ami lehetővé teszi a vizeletbe történő kiürülését. A vizeletben található laktulóz mennyisége ezért a bélnyálkahártya „hiányait” méri [Menzies: 55 Biochem. Soc. Trans. 550,1042-1047 (1974)].

Patkányokat 5-fluor-uracillal kezelünk a 8. példában leírt módon. 2 ml 100 mg/ml koncentrációjú izoozmotikus laktulózoldatot vezetünk be egy gyomorszondán keresztül, és a vizeletet a következő 24 órán kérész- 60 tül összegyűjtjük, és lefagyasztjuk. A vizelet laktulóztartalmát enzimatikusan határozzuk meg [Ziegler és munkatársai: Arch. Surg. 123,1313-1319 (1988)].

Az egyetlen 5-FU-injekcióval végzett kezelés 24 órán keresztül megnöveli a bél permeabilitását a laktulóz vonatkozásában. Ez a növekedés a kemoterápiát 35 követő 24 és 48 óra között éri el csúcspontját. Háromnapos periódus alatt az állatok GLN-nel dúsított TPN-t kapnak, ami szignifikánsan csökkenti a bél permeabilitását a standard TPN-nel etetett állatokhoz viszonyítva, így például 48-72 órával az 5-FU adagolása után a 40 24 órás laktulózkiválasztás 32 pmol értékről 17 pmol szintre csökken a GLN-nel kezelt patkányokban.

Megállapítható, hogy a GLN védi a bélfalat a kemoterápiás hatóanyagok által kiváltott permeabilitásfokozódással szemben. Ez a hatás feltételezhetően fontos 45 szerepet tölt be a gasztrointesztinális rendszeren keresztül történő fertőzések megelőzésében, és, mint ezt a 9. példában írtuk, elősegíti a csontvelő-átültetéses betegek felépülését.

13. példa

A glutamin enyhíti a TPN immunszupresszív hatását

Patkányokat laboratóriumi táppal, TPN-nel vagy GLN-nel kiegészített TPN-nel etetünk a 10. példában leírt módon (az anyagokat és módszereket lásd a 2. pontban). A kezelés megindításától számított 7. napon az állatokat elöljük, és eltávolítjuk a lépet, a csecsemőmirigyet és a bélfodor-nyirokcsomókat. Sejtszuszpenziót készítünk az eltávolított szervekből a szokásos módon [Klein: Immunology: The Science of Self-Nonself

HU 220 214 Β

Discrimination, Wiley-Interscience, (1982)]. A mitogén jelenlétében bekövetkező in vitro limfocitaszaporodási választ a szokásos módon vizsgáljuk. A táppal etetett csoporthoz viszonyítva a TPN-csoport egy hét elteltével mintegy 50%-ban csökken a limfocitaérzékenység. Ugyanez a változás következik be GLN-nel dúsított parenterális oldat alkalmazása esetén is, amikor is a GLN-nel kezelt patkányok limfocitaérzékenysége a TPN-csoport és a kontrollcsoport közé esik.

A GLN jelenléte a parenterális oldatban ezért szignifikánsan csökkenti a GLN nélküli TPN által kiválasztott immunszuppressziós állapotot. A bél nyálkahártyájának leromlása (lásd a 12. példát) a veszélyeztetett immunfunkcióval kombinálva növeli a TPN-nel etetett állatok fertőzésveszélyét. A fokozott érzékenység nemcsak azokra a baktériumokba és más mikroorganizmusokra érvényes, amelyek a bélen keresztül jutnak be a szervezetbe, hanem azokra is, amelyek bármilyen más úton a szervezetbe kerülnek (a legyengült immunfunkció miatt). A GLN-nel kiegészített TPN elősegíti a gazdaszervezet védekezését. A csontvelő-átültetéses betegnél észlelhető fokozott fertőzésállóság (lásd a 9. példát) alátámasztja a GLN-nek a fenti hatékonyságát.

A fenti ismertetés alapján szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás megvalósítása során azonos értékű paraméterek, koncentrációértékek és körülmények széles köre alkalmazható anélkül, hogy eltérnénk a találmány szerinti felismerés lényegétől.

A találmány szerinti megoldást adott körülmények között ismertettük, de nyilvánvaló, hogy további változatok is lehetségesek. A jelen bejelentés kiterjed minden olyan változatra, alkalmazásra és módosításra, amelyek általánosságban a találmány szerinti megoldás lényegétől indulnak ki.

Claims (16)

1. Eljárás glutamint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított glutamint gyógyszerészeti hordozóanyaggal és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keveijük, és a keveréket patológiás bélpermeabilitás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lényegében intravénás táplálással összefüggésben megjelenő patológiás bélpermeabilitás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lényegében lebontási zavarokkal összefüggésben jelentkező patológiás bélpermeabilitás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sebészeti beavatkozás, szepszis, égési sérülés, kalóriahiány, kemoterápia, sugárterápia vagy szabályozatlan diabétesz eredményeként jelentkező lebontási zavarok következményeként kialakuló patológiás bélpermeabilitás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán betegek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

6. Eljárás glutamint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított glutamint gyógyszerészeti hordozóanyaggal és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keveqük, és a keveréket legyengült immunfunkciók kezelésére és/vagy csontvelő-átültetéses beteg felépülésének gyorsítására alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében intravénás táplálással összefüggésben kialakult, legyengült immunfunkciók kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében lebontási zavarokkal összefüggésben kialakult legyengült immunfünkciók kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sebészeti beavatkozás, szepszis, égési sérülés, kalóriahiány, kemoterápia, sugárterápia vagy szabályozatlan diabétesz eredményeként jelentkező lebontási zavarokkal összefüggésben kialakult legyengült immunfunkciók kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán beteg kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ázzál jellemezve, hogy 0,2-3,0 g/kg testtömeg napi dózis parenterális adagolására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,3-2,5 g/kg testtömeg napi dózis parenterális adagolására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,4-2,0 g/kg testtömeg napi dózis parenterális adagolására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

14. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,2-3,0 g/kg testtömeg napi dózis parenterális adagolására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,3-2,5 g/kg testtömeg napi dózis parenterális adagolására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.

16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,4-2,0 g/kg testtömeg napi dózis parenterális adagolására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.