DE69333497T2

DE69333497T2 - Antikrebs-therapeutische zusammensetzungen die molke-proteinkonzentrat enthalten

Info

Publication number: DE69333497T2
Application number: DE1993633497
Authority: DE
Inventors: Phil Gold; Gustavo Bounous
Original assignee: Immunotec Research Corp
Current assignee: 2458781 CANADA INC., VAUDREUIL, QUEBEC, CA
Priority date: 1992-08-13
Filing date: 1993-08-05
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2013-08-06
Also published as: TW380051B; CN1088095A; NZ254704A; IL106576A; KR100297610B1; KR950702837A; JP2008115194A; DE69333497D1; WO1994004168A1; EP0655925A1; CZ295849B6; ATE265217T1; AU687356B2; CA2142277C; ZA935918B; JPH08500108A; CA2142277A1; AU4693793A; CZ28395A3; JP4115515B2

Description

Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass das undenaturiertes Molke-Proteinkonzentrat einen verstärkten immunologischen Effekt ausübt. Insbesondere betrifft diese Erfindung den Effekt bei der oralen Verabreichung des undenaturierten Molke-Proteinkonzentrats (WPC) auf die Abwehrkraft des Wirts gegenüber der Entwicklung von chemisch-induziertem Krebs und ebenfalls die Wirkung dieser oralen Verabreichung auf die Inhibierung von Krebs.
In den US-Anmeldungen SN 298,971 und SN 417,246 und ebenfalls in Bounous et al "Dietary Whey Protein Inhibits the Development of Dimethyl-hydrazine induced Malignancy" (1) haben wir Experimente beschrieben, die zeigen, dass eine kontinuierliche Gabe von WPC in einer Diät die Entwicklung (Anzahl und Größe von Tumoren) im Darm einer Maus über einen Zeitraum von 24 Wochen einer Dimethylhydrazinbehandlung (DMH) inhibiert. Dieser Antitumoreffekt könnte durch die erhöhte Abwehrkraft von Targetzellen gegenüber den Karzinogenen und/oder direkten Inhibitoreffekt von WPC auf die Krebszellen verursacht werden. Eine darauffolgende Serie von Experimenten (2), wo die Tiere mit einer Purina-Diät für die ersten 20 Wochen der DMH gefüttert wurden, und dann auf eine WPC-Diät für die verbliebenen acht Wochen der DMH-Behandlung übergegangen wurde, hat einen gewissen Inhibitoreffekt der WPC-Fütterung auf die Krebszellen nahegelegt.
Erst kürzlich (3) hat eine Gruppe von französischen Wissenschaftlern in vitro einen direkten Inhibitoreffekt von WPC auf humane Krebszellen bestätigt. Tatsächlich ist in ähnlichen in vitro Studien mit humanen Brustkrebszellen gezeigt worden, dass das Rinderserumalbumin (BSA) der Faktor ist, der eine Inhibierung der Krebszellenreplikation (4) ausübt.
Wir haben ebenfalls gezeigt, dass diese Aktivität von WPC insbesondere von den Glutamylcysteingruppen (Substrat für die GSH-Synthese), die in der BSA-Fraktion von WPC (US-Seriennummer 563,794) vorhanden ist, abhängig ist. Interessanterweise ist festgestellt worden, dass die Einführung des Cysteinfreisetzungssystems Ozothiazolin-4-carboxylat (OTZ) (Ozothiazolidin-4-carboxylat), während in normalen Zellen die Glutathion-Gehalte (GSH) erhöht werden, zu einer Rückkopplungsinhibierung des GSH-Zyklus in humanen Tumorzellen führt (5). Dieser differenzielle Effekt von OTZ wurde kürzlich in vivo bestätigt (6). Der zuvor beschriebene direkte Inhibitoreffekt von WPC (3) und insbesondere von BSA (4) konnte deshalb durch die Freisetzung während der Inkubation eines starken Cysteinfreisetzungssystems, wie Glutamylcystein, erklärt werden. Wir sind deshalb zu den folgenden Schlussfolgerungen gelangt:

1) BSA ist die Proteinfraktion von WPC, von der wir festgestellt haben, dass sie primär für die GSH-beschleunigende Aktivität von WPC verantwortlich ist. Diese Aktivität, von der wir glauben, dass sie die Basis für den immunverstärkenden und antikarzinogenen Effekt von WPC ist, ist spezifisch von den Glutamylcysteingruppen (Substrat für die GSH-Synthese), die in der BSA-Fraktion von WPC vorhanden sind, abhängig.
2) Das Molekulargewicht von BSA beträgt 66.267 und ist damit ganz unterschiedlich vom MW des Antikrebsfaktors, der von Villadsen (MW 500-20.000) patentiert ist (7).
3) Unsere früheren Feststellungen (1,2) konnten wie folgt erklärt werden: Während der DMH-Behandlung schützt die WPC-Verabreichung durch einen Anstieg von zellulärem GSH die Targetzellen gegen die Wirkungen des Karzinogens. Außerdem konnte eine erhöhte Verfügbarkeit des Substrats für die GSH-Synthese die Replikation der gebildeten Krebszellen inhibieren.
4) Wir haben nun die Wichtigkeit eines hohen Gehalts an Serumalbumin (BSA) in der WPC bei der zur Verfügungstellung eines Substrats für die GSH-Synthese etabliert. Wir können daraus schließen, dass diätisches Molke-Protein-Konzentrat in undenaturierter Form, das ≥ 10 % BSA enthält, einen Antitumoreffekt ausübt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 erläutert den Leberglutathiongehalt in männlichen Mäusen C57BL/6NIA die undenaturiertes Molkeprotein (U-Lacp), denaturiertes Molkeprotein (D-Lacp), Casein, Eiweißprotein oder eine Purina-Diät als Gegenstücke verfüttert bekamen, in einem Alter von 10 Wochen, 27, 20 und 21 Monaten.
2 erläutet den Herzglutathiongehalt von männlichen Mäusen C57BL/6NIA, die undenaturiertes Molkeprotein (U-Lacp), denaturiertes Molkeprotein (D-Lacp), Casein, Eiweißprotein oder eine Purina-Diät als Gegenstücke verfüttert bekamen, in einem Alter von 10 Wochen, 17, 20 und 21 Monaten.
3 erläutert den Effekt verschiedener Quellen von Molkeproteinkonzentrat und Casein (20 g/ 100 g Diät) auf die Milz-PFC-Reaktion auf 5 × 10⁶ SRBC in Mäusen.
Detaillierte Beschreibung
Definitionen

(a) Molkeprotein Molkeproteine sind eine Gruppe von Milchproteinen, die im "Milchserum" oder in der Molke nach der Fällung der Caseine bei einem pH von 4,6 und 20°C löslich bleiben. Die Hauptmolkeproteine in der Kuhmilch sind beta-Lactoglobulin (βL), alpha-Lactalbumin (αL), Immunglobulin und Serumalbumin (SA). Das Produkt der industriellen Abtrennung dieser Proteinmischung von der Molke wird "Molkeproteinkonzentrat" (WPC) oder -Isolat bezeichnet. Das WPC, das in den meisten unserer frühen Experimente verwendet wurde, stammt aus der Rindermilch (Lacprodan-80 von "Danmark Protein A.S."). Die Verwendung in diesem undenaturierten Zustand wird als U-Lacp angegeben, und der denaturierte Zustand davon wird als D-Lacp angegeben. Das Lactalbumin (L) ist der Ausdruck, der traditionell dafür verwendet wird, das WPC zu definieren.
(b) C = Casein;
(c) SRBC = rote Blutzellen vom Schaf;
(d) PFC = Plaquebildende Zellen (Milz); die zahlenmäßige Ermittlung von PFC in der Milz wird dafür verwendet, um die humorale Immunantwort gegenüber einer SRBC-Injektion festzustellen;
(e) GSH = Glutathion (L-gamma-Glutamyl-L-cysteinylglycin);
(f) DMH = 1,2-Dimethylhydrazin;
(g) Die getesteten definierten Diätpläne variierten nur im Hinblick auf den Proteintyp;
(h) Molke von Rindermilch enthält etwa 6 g pro Liter Protein, das meiste davon sind Lactose, Mineralien und wasserlösliche Vitamine.

Diätpläne, die in diesen Studien verwendet wurden: Tabelle 3 nimmt Bezug darauf
Die Diätpläne werden auf folgende Weise hergestellt: 20 g ausgewähltes reines Protein, 56 g des Produkts 80056, proteinfreies Diätpulver, das Maissirup, Maisöl, Tapiocastärke, Vitamine und Mineralien (Mead-Johnson Co., Inc., U.S.A.), 18 g Maisstärke, 2 g Weizenkleie enthält; 0,05 g Nutramigen-vit-Eisenvormischung (Bristol-Myers, Ontario, Canada), 2,65 g KCl; 0,84 g NaCl. Die Kohlenhydrat- und Lipidkomponenten unserer Diätpläne waren die gleichen. Die einzige Variable in den verschiedenen, gereinigten Diätplänen war der Proteintyp (20 g Protein/100 g Diät). Bei dieser Konzentration im Diätplan zeigten alle verschiedenen, getesteten Proteine den täglichen Bedarf an essentiellen Aminosäuren für die wachsende Maus (8). Die Vitamine und Mineralien waren in jedem Satz von Experimenten die gleichen, und sie wurden in der Menge hinzugefügt, die notwendig ist, um den täglichen Bedarf für die wachsende Maus (9, 10) darzustellen. Die Tabelle 1 unten zeigt die Variation bei den vorgeschlagenen Vitaminerfordernissen für die Mausdiätpläne und ihre Gehalte in einigen unserer Zusammensetzungen. Somit waren alle in unseren Experimenten verwendeten Diätzu sammensetzungen so ausgestaltet, dass sie eine adäquate Ernährung zur Verfügung stellen, was durch das normale Körperwachstum, das Serumprotein (9) und durch die Abwesenheit von Haarverlust, Dermatitis, Katarakt, Ataxie, Fettleber, etc. gezeigt wurde. Die letztgenannten Symptome waren natürlich bei sehr alten Mäusen vorhanden, und sie sind im Zusammenhang mit dem Alterungsprozess zu sehen.
Tabelle 1
Immunisierung für die Plaqueassays
Die diätgefütterten Mäuse wurden durch intravenöse Injektion von 5 × 10⁶ gewaschenen roten Blutzellen von Schafen, die wöchentlich vom Institut Armand-Frappier, Laval des Rapides, Quebec, Canada, erhalten wurden, immunisiert.
Assay mit Plaque-bildenden Zellen (PFC)
Die Methode, die angewendet wurde, um die IgM-Plaque-bildenden Zellen zu untersuchen, war im Wesentlichen diejenige, die von Cunningham und Szenberg (11) beschrieben wird, mit bestimmten geringfügigen Modifikationen. Es wurden Milzzellensuspensionen hergestellt, indem die Milz durch ein 50-mesh rostfreies Stahlsieb vorsichtig gedrückt wurde, und die Zellen in einer ausgewogenen Salzlösung (BSS), die mit 10 % Hitze inaktiviertem Kalbsserum (Grand Island Biological Company, Montreal, Quebec, Canada) ergänzt war, gesammelt wurden. Die Milzzellen wurden gewaschen und mit 15 ml BSS aufgefüllt. Die roten Blutzellen vom Schaf wurden zweimal gewaschen und auf eine 20 %-Konzentration gebracht. Serum vom Guineaschwein (Grand Island Biological Company, Montreal, Quebec, Canada) als Komplementquelle wurde zu 1/15 mit BSS verdünnt. Alle Vorratslösungen wurden bis zu ihrer Verwendung auf Eiswasser gehalten. Der Test bestand aus dem Vermischen von 0,05 ml Milzzellen, 0,15 ml roten Blutzellen vom Schaf und 0,75 ml der Komplementlösung in einem Teströhrchen bei 37°C. Die gesamte Mischung wurde sofort entnommen und in Objektträgerkammern eingesetzt, mit warmem Paraffinwachs verschlossen und bei 37°C für 45 – 60 Min. inkubiert. Die Anzahl der Plaque-bildenden Zellen wurde gezählt, und ihre Gesamtzahl pro Milz wurde geschätzt, indem die Anzahl der Plaque-bildenden Zellen in jeder Probe (0,05 ml Milzzellen) mit 300 multipliziert wurde. Die Werte werden als Gesamtorgan, weniger als pro 10⁶ Milzzellen, ausgedrückt, weil dieses genauer den funktionellen Status der Milz an sich wiedergibt.
Es wurden Mäuse auf die Antwort auf Plaque-bildende Zellen gegenüber roten Blutzellen vom Schaf normalerweise am 5. Tag nach der Immunisierung, wenn die Antwort sich auf ihrem Höchstpunkt zeigte, oder in einer kinetischen Studie, an den Tagen 3, 4, 5 und 6 nach der Immunisierung untersucht.
Statistik
Die mittleren Werte für die Plaque-bildenden Zellen wurden in den Diätgruppen unter Anwendung von entweder dem Student-Test, wenn zwei Gruppen zu vergleichen waren, oder der Varianzanalyse (ANOVA), für mehr als zwei Gruppen verglichen. Wegen der Heterogenität der Varianzen in den Gruppen wurde die Einstellung nach Brown und Forsythe angewendet.
Glutathiongehalt in der Milz
Neunzig mg Mäusemilz wurden unter Verwendung einer Waage Mettler PM-300 ausgewogen, und die Proben variierten mit 90 mg um weniger als 5 mg (5 %). Die Proben wurden dann in 5-Sulfosalicyclsäure (5 % G/V) homogenisiert. Die Homogenate wurden für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 × g zentrifugiert. Der Assay wurde unter Verwendung der Überstände am gleichen Tag nach den Methoden von Anderson (12) durchgeführt. Die Werte sind als μMol pro g/nasses Gewebe ausgedrückt.
Glutathionassay des Gewebes
Neunzig mg Mäuseherz oder -leber wurden in 5-Sulfosalicylsäure (5 % G/G) homogenisiert. Die Homogenate wurden für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 × g zentrifugiert. Der Assay wurde unter Verwendung der Überstände am gleichen Tage nach der Methode von Anderson (12) durchgeführt. Die Werte sind als μMol/g nasses Gewebe ausgedrückt.
Nach drei Monaten der jeweiligen Diät, die bei einem Alter von 17 Monaten angefangen hatte, wurde festgestellt, dass der GSH-Gehalt höher in der Leber und im Herz von U-Lacp (undenaturierts Molkeprotein Lacprodan-80) gefütterten Mäusen im Vergleich zu den D-Lacp (denaturiertes Molkeprotein Lacprotan-80), Casein, Eiweißprotein oder Purina-Diät gefütterten Gegenstücke (1 und 2) war. Die GSH-Werte im Herz und in der Leber der Mäuse, die mit Purina-Laborfutter gefüttert wurden, waren ähnlich bei einem Alter von 10 Wochen, 17, 20, 21 Monaten. Die U-Lacp-Diät scheint den GSH-Gehalt oberhalb der "normalen" Werte nach 3 und 4 Monaten kontinuierlicher Fütterung (1 & 2) zu erhöhen.
Außerdem, nach drei Wochen, der U-Lacp-Diät, ist der GSH-Gehalt in der Milz während der Antigen verursachten klonalen Ausdehnung der Lymphocyten in jungen erwachsenen C3H/HeN-Mäusen im Vergleich zu einem Abfall in den mit D-Lacp gefütterten Kontrollen, den Casein- oder Eiweißprotein-Diäten, erhöht. In alten C57BL/6NIA-Mäusen führte die Langzeitverfütterung von U-Lacp zu einem moderaten, allerdings anhaltenen Anstieg der GSH-Gehalte in der Leber und im Herz (1 und 2). Die GSH-verstärkende Aktivität von WPC ist auf seine undenaturierte Form (Ulacp) beschränkt.
Tabelle 2
Diese Eigenschaft ist nicht nur auf den hohen Cysteingehalt des WPC zurückzuführen, weil eine andere Proteinquelle mit ähnlichem Cysteingehalt (Eiweiß) (siehe Tabelle 2) diese biologische Aktivität nicht zeigt. Diese Eigenschaft von U-Lacp hängt nicht spezifisch von seiner Eigenschaft als Nahrungsmit tel ab, was durch das Körpergewicht, Serumproteine und den Nahrungsverbrauch zu bewerten ist, sondern scheint von der primären, sekundären und tertiären Struktur des Proteins in seiner nativen Form abzuhängen.
Eine der zuvor diskutierten Methoden zur Erhöhung der intrazellulären Werte der Glutathionkonzentration sind entweder toxisch (13) oder gefährlich, was mit den Risiken zusammenhängt, die mit der Anfangsphase der Glutathiondepletion (14, 15) zusammenhängen. Die Methoden unter Beteiligung von gamma-Glutamylcystein (16), Athiazolidin (17) oder Glutathionestern (18) (U.S. Patent # 4,784,685) bieten eine interessante Möglichkeit für eine kurzzeitige Intervention. Allerdings ist ihre Langzeiteffektivität bei der Erzeugung einer verzögerten Erhöhung von zellulären Glutathion noch nicht gezeigt worden, und die mögliche Toxizität ihrer Langzeitanwendung ist bisher auch noch nicht bewiesen worden. Tatsächlich ist festgestellt worden, dass Glutathion und Glutathiondisulfid positiv in den am meisten verwendeten Kurzzeittests auf Karzinogenizität und Mutagenizität (13) sind. Relevant für unsere Erfindung sind neuere Daten, die spezifisch zeigen, dass ein Mangel an GSH-Vorläufer, Cystein, und nicht ein Abfall der biosynthetischen Enzymaktivitäten für die GSH-Defizienz, die bei älteren Tieren bemerkt wird, verantwortlich ist (19). In ähnlicher Weise scheint der Abfall von cytosolischen GSH in der Leber von chronisch Ethanol gefütterten Ratten nicht durch eine Beschränkung der Kapazität der gamma-Glutamylcysteinsynthetase-Aktivität (20) verursacht zu werden.
Die Daten in den 1 und 2 zeigen, dass die Konzentration von Leber- und Harzglutathion in den Purina gefütterten Mauskontrollen sehr konstant über eine bestimmte Zeit bleibt. Andererseits wurde eine moderate, allerdings anhaltende Erhö hung von GSH im Gewebe bei den Mäusen vermerkt, die das Nahrungsmittel äquivalente Molkeprotein (U-Lacp) verfüttert bekamen. Nur winzige Mengen Glutathion und keine break-down-Produkte, die ohne Weiteres dem Glutathion zuzuschreiben sind, wurden im Urin ausgeschieden (21). Die Größenordnung der Veränderung der zellulären Glutathionkonzentration, die erreicht werden kann, kann ziemlich eingeschränkt sein, was vielleicht die kritische Wichtigkeit dieses Moleküls und gleichzeitig die vorhandene enge Regulationskontrolle reflektiert. Das Glutathion selbst dient als negative Rückkopplung auf die synthetischen GSH-Enzyme, das offenbar die Zellkapazität einschränkt, wobei sich die GSH-Konzentration erhöht (22). Die Glutathionreduktase hält das GSH in seiner vornehmlichen reduzierten Form (≥ 90 %). Dieses dient sowohl zur Aufrechterhaltung dieses funktionellen Zustands und ebenfalls zur Steuerung der zellulären Konzentration, weil reduziertes Glutathion (GSH) nicht die Membran durchqueren kann, während die oxidierte Form (GSSG) durchströmen kann und dieses auch tut, was zu einem niedrigen Gesamtglutathion führt. Außer diesen Enzymen ist gamma-Glutamyltranspeptidase (GGT) im GSH-Metabolismus wichtig. GGT dient als Rettungsweg für Glutymyleinheiten an der Zellmembran, wobei sie zurück in das Cytosol geleitet werden, um in der GSH-Synthese verwendet zu werden. Eine erhöhte Aktivität dieses Enzyms ist mit einer erhöhten GSH-Konzentration bei einer Anzahl von Zelllinien und malignen Geweben (23, 24) assoziiert.
Es ist vorteilhaft, Vitamin B₁ (Thiamin) in eine Diät einzuschließen, die zu erhöhtem GSH führt. Thiamin ist bei der Transketolasereaktion der Pentosephosphatnebenreaktion unter Herstellung von NADPH (GSSG wird zurück zu GSH durch NAPPH reduziert; GSH-Reduktase) beteiligt.
Vitamin B₂ (Riboflavin) ist ebenfalls eine vorteilhafte Zugabe. Flavinmononucleotid (FMN) und Flavinadenindinucleotide (FAD) werden nacheinander aus Riboflavin synthetisiert und sind bei der GSH-Reduktase beteiligt.
Einige Milchmaterialen, insbesondere solche von Neuseeland, sind arm an Selen. Selen ist in der GSH-Peroxidase enthalten. Säuger, die Selen defizient sind, haben eine beträchtlich verringerte Peroxidaseaktivität. Deswegen erfordert die Glutathionbildung, die für ihren Antikrebseffekt vorteilhaft ist, einen adäquaten Gehalt von Selen.
Wenn wir einen Dosisgehalt von 60 g undenaturiertes Molkeprotein als tägliche Aufnahme annehmen, sind die empfohlenen Werte für Vitamin B₁, Vitamin B₂ und Selen wie folgt:

Vitamin B₁ 1,5 – 2,0 mg
Vitamin B₂ 1,7 – 2,2 mg
Selen/Methionin 40 μg – 60 μg

Die Effekte einer geringen Erhöhung von zellulärem GSH sind größer als erwartet. Beispielsweise gibt es viele Berichte von humanen und murinen Tumorzelllinien, die in vitro für die Resistenz gegenüber einer Vielzahl von chemotherapeutischen Mitteln gewählt werden. In einer Anzahl dieser Zelllinien ist das zelluläre GSH konsistent um das 2-fache im Vergleich zur Arzneimittel empfindlichen Elternzelllinie erhöht, trotz der Tatsache, dass das Niveau der Nahrungsmittelbeständigkeit oftmals viel größer ist, z. B. soviel wie das 30-fache (24, 25, 26). In diesen Zelllinien stellt die zelluläre GSH-Depletion durch selektive Inhibierung der Synthese die Nahrungsmittelempfind lichkeit gegenüber den resistenten Zellen wieder her. Dieses ist nur effektiv, wenn die GSH-Depletion über den gesamten Arzneimittelbehandlungszeitraum erhalten bleibt.
Die Tatsache, dass das zelluläre GSH sehr eng reguliert ist, dass eine 2-fache Erhöhung maximal sein kann und dass der Effekt von kleinen Erhöhungen von GSH durch. eine Vielzahl von GSH-verwendenden Enzymen (z. B. Glutathionperoxidase, Glutathion-S-transferase) amplifiziert werden kann, verleiht der reproduzierbaren Änderung der GSH-Konzentration, die bei Tieren beobachtet wird, die die molkereiche Diät verfüttert bekommen haben, wahrscheinlich biologische Wichtigkeit. Die chronische Natur dieser Vergrößerung kann signifikant zu diesem Effekt beitragen.
Unsere Feststellungen zeigen, dass bei Mäusen, die eine Caseindiät verfüttert bekommen haben, die Anzahl und Größe von DMH-induzierten Darmkarzinomen um einen Faktor von 0,3 und 0,4 im Vergleich zu den mit Purina gefütterten Kontrollen (Tabelle 3, unten) reduziert waren. Allerdings waren bei Mäusen, die die Molkeproteindiät mit ähnlicher Nahrungsmitteleffizienz bekommen haben, die Anzahl und Größe von DMH-induzierten Darmkarzinomen um das Vierfache im Vergleich zu den Purinagefütterten Kontrollen (Tabelle 3, unten) reduziert. DMH-induzierte Darmtumore scheinen ähnlich zu denen zu sein, die bei Menschen gefunden werden, sofern der Typ der Läsionen und die Eigenschaften der chemotherapeutischen Antwort betroffen sind (27, 28).
Die Überlegenheit des Antikrebseffekts von Molkeprotein im Vergleich zu Casein ist in unserer früheren Studie (1) berichtet worden. Etwa 80 % der Proteine in Rindermilch sind Caseine, und die verbleibenden 20 % sind Molkeproteine (29, 30).
Außerdem variiert, unter Anwendung des traditionellen Verfahrens zur Herstellung von Casein, die Menge an Molkeprotein, die zusammen mit dem Casein ausfällt, von etwa 40 bis 60 % der Gesamtmenge an Molkeprotein, die in der Milch vorhanden ist (31). Deshalb ist es vorstellbar, dass der geringe Antikrebseffekt, der mit Casein gesehen wird, auf die relativ geringe Menge (gegenüber den Caseinen) von Molkeprotein, die damit zusammen ausfällt, zurückzuführen ist. Es ist aus den oben beschriebenen Studien ersichtlich, dass die Antitumoraktivität der Milchprodukte in der Proteinfraktion liegt und insbesondere, wie unsere Erfindung zeigt, in der Molkeproteinkomponente von Milch.
Die vorteilhafte Wirkung dieser WPC-Diätergänzung wird insoweit verstärkt, dass sie einen Ersatz für einen Teil oder der gesamten Proteinaufnahme von anderen Quellen des Patienten darstellt.
Überlebensstudien: Die biologische Aktivität ist von der undenaturierten Konformation von WPC abhängig
(a) Überleben von alten Mäusen während eines begrenzten Zeitraums:
Unsere Studie zeigt, dass die mittlere Überlebenszeit über einen begrenzten Beobachtungszeitraum von 6 – 7 Monaten, der endete, als 55 % der männlichen C57BL/6N1A-Mäuse tot waren, um etwa 30 % bei den Mäusen erhöht ist, beginnend mit der undenaturierten Molkeproteindiät (U-Lacp) am Anfang der Vergreisung (im Alter von 21 Monaten) im Vergleich mit den "Kontrollen", die das Nahrungsäquivalent der Purina-Mausnahrung verfüttert bekommen haben. Die Überlebungskurve der mit Purina gefütter ten Mäuse war ähnlich der der mit der Caseindiät gefütterten Mäuse. Allerdings wurden in den folgenden vier Monaten die Mäuse der undenaturierten Molkeproteindiät auf eine denaturierte Molkeproteinkonzentratdiät (D-Lacp) gesetzt. Während dieses Zeitraums wurde die Zeit des Todes der verbliebenen mit der Molkeproteindiät gefütterten Mäuse ähnlich derjenigen der Caseindiät oder der mit Purina gefütterten Gegenstücke. In der Studie bestätigten wiederholte Bioassays der PFC-Bildung die Korrelation zwischen der Wirtsimmunverstärkung und dem undenaturierten Zustand von WPC in der Diät, was in 3 gezeigt ist. Im zweiten Teil der Studie, als der Unterschied zwischen den Überlebenskurven anfing kleiner zu werden, war keine immunverstärkende Eigenschaft von WPC zu verzeichnen, obwohl seine Ernährungsqualität erhalten war (D-Lacp). Über die gesamte Studie wurde keine signifikante Differenz zwischen den Gruppen im Hinblick auf die Kalorienaufnahme und das Körpergewicht verzeichnet. Da die Langlebigkeit primär vom Genom des Individuums abhängig ist, ist es unwahrscheinlich, dass eine verzögerte Mortalität über einen begrenzten Zeitraum eine beeinflusste Gesamtlanglebigkeit haben würde.
Tabelle 3 Effekt von Diätmilchprotein auf das Tierwachstum und die Tumorentwicklung in A/J-Mäusen, die mit dem Karzinogen 1,2-Dimethylhydrazin behandelt sind.

ANOVA: gerade Linie(n) verbinden die Mittel, die nicht signifikant unterschiedlich sind (p<0,05).
Gruppe: Molke Pur/Molke Pur/Casein Casein
Anzahl der Tumore
Tumorbereich

Allerdings, zumindest bezogen auf den immunverstärkenden Effekt der Diät, konnte diese Studie als cross-over in einer Richtung von dem Test (U-Lapc) zu den Kontroll(D-Lacp)-Diäten betrachtet werden, was zeigt, dass die biologische Aktivität von WPC auf das Überleben von alten Mäusen von seinem undenaturierten Zustand abhängt, was direkt mit dem PFC-Assay, der in unserer Studie verwendet wird, (wie in der 3 und in Tabelle 11 erläutert) korreliert.
(b) Kurz- und Langzeitüberleben von Mäusen mit DMH-induziertem Darmkrebs:
Bei DMH-behandelten Mäusen haben wir einen Unterschied zwischen der Mortalität am 28. Wochenendpunkt und der Überlebenszeit zum Ende des Experiments in Bezug auf den Typ des Diätproteins festgestellt. Während der ersten sieben Monate der Studie starben keine Mäuse, die mit undenaturiertem Molkeprotein (U-Lacp) gefüttert worden waren, im Vergleich zu einer Mortalität von 33 %, die gegen Ende dieses Zeitraums bei den Casein- und Purina-Gruppen beobachtet wurden. Während des letzteren Zeitraums schien das D-Lacp keinen günstigen Effekt auf das Überleben im Vergleich zur Caseindiät zu haben (Tabelle 4, unten).
Über die Studie wurden wiederholte Bioassays von Milz-PFC durchgeführt, um die physiologischen Effekte der Diäten auf die Immunfunktion, was zuvor berichtet wurde und die Stabilität dieser Effekte zu dokumentieren. Der immunverstärkende Effekt der U-Lacp-Diät wurde konsistent für die ersten sieben Monate der Studien bestätigt; allerdings, in den folgenden vier Monaten (D-Lacp), war der zuvor beobachtete immunverstärkende Effekt bei den Mäusen, die die U-Lacp-Diät bekamen, nicht mehr vorhanden. Die Werte für die PFC-Antwort in Bezug auf entweder die U-Lacp-Diät oder die D-Lacp-Diät waren konsistent mit denjenigen, die in 3 gezeigt sind. Diese Studie bestätigt daher die Hypothese, dass die biologische Aktivität von WPC auf das Überleben von tumortragenden Mäusen von seinem undenaturierten Zustand abhängig ist, was direkt mit dem in unserer Studie verwendeten PFC-Assay korreliert.
Tabelle 11 Indirekte Anzeichen für die Denaturierung von Molkeproteinkonzentration
Effekt bei drei Wochen Diätbehandlung:

PROMOD und SAPRO gegen D-LACP. und SIGMA denaturiert P<,05
U-LACP. gegen PROMOD und SAPRO P<,01

Tabelle 4
Das Experiment, das sich auf oben bezieht und in den Tabellen 3 und 4 zusammengefasst ist, verwendete Lacprodan 80 als Quelle für undenaturiertes WPC:
Wir ziehen nun vor, ein Molkeproteinkonzentrat (WPC) in undenaturierter Form zu verwenden, das aus Milch, die auf die mildeste Weise nach akzeptierten Sicherheitsstandards im Hinblick auf die bakterielle Kontamination behandelt wurde, hergestellt wurde. Der außerordentlich hohe Löslichindex zeigte, dass die vorhandenen Proteine im Wesentlichen undenaturiert sind, was somit die Milde des Ultrafiltrationsprozesses zeigt [31]. Obwohl die Proteine, die in den Konzentraten von den anderen untersuchten kommerziell erhältlichen Quellen enthalten waren, meistens in undenaturierter Form vorlagen, was durch die relativ hohe Löslichkeit der Konzentrate angezeigt wird, lag der Gehalt an Serumalbumin und Immunglobulinen in diesen Mischungen unterhalb des Aktivitätsgrades [31]. Diese sehr wärmelabilen Proteine werden denaturiert, dann gefällt und teilweise von der Molke getrennt, wenn Hochpasteurisierungstemperaturen angewendet werden.
Unsere Studien zeigten ebenfalls, dass die Verabreichung von S-(n-Butyl)homocysteinsulfoximin, das Milzglutathion halb reduziert, signifikant die humorale Immunantwort von mit Molkeprotein gefütterten Mäusen reduziert. Dieses wurde als weiterer Beweis für die wichtige Rolle von Glutathion bei der immunverstärkenden Wirkung von Diätmolkeprotein genommen (32).
Die Gewebeglutathionkonzentration kann durch Verabreichung von gamma-Glutamylcystein erhöht werden. Intrazelluläres Glutathion erhöhte sich in der Niere um etwa 50 %, 40 – 60 Minuten nach subkutaner (s.c.) Injektion bei Mäusen, wobei 2 Stunden später zu den Kontrollwerten zurückgekehrt wurde (33). Das verabreichte gamma-Glutamylcystein wird intakt in die Zellen transportiert und dient als Substrat für die Glutathionsynthetase (33).
Die Fortschritte bei der Aminosäuresequenzierung von Nahrungsmittelproteinen hat es uns ermöglicht, das Auftreten von Glu tamylcysteingruppen im Molkeprotein und die mögliche Relation zur Glutathionbeschleunigung zu untersuchen. Tatsächlich enthält Molkeproteinkonzentrat von Rindermilch wesentliche Mengen an Glutamylcysteingruppen, nicht wie das Casein, das nicht das Gewebeglutathion erhöht, wenn es an Mäuse gegeben wird (35). Die Glutamylcysteingruppen befinden sich primär in der Serumalbuminfraktion (sechs Gruppen/Molekül). Die Glutamylcysteingruppen sind außerordentlich selten beim Tier und in essbaren Pflanzenproteinen. Die intensive Auswertung aller verfügbaren Daten der Aminosäuresequentierung von essbaren Proteinen hat ergeben, dass die Gly-Cys-Gruppe mit einer Disulfidbindung tatsächlich auf einige des Molkeproteins beschränkt ist und auf die ovomucoide Fraktion von Eiweiß, die zwei dieser Gruppe in einem 30.000 Mol-gew. Molekül enthält (31).
Unsere neueren Daten (31) zeigen weiterhin an, dass die humorale Immunantwort am höchsten bei Mäusen, die mit einem Diätmolkeproteinkonzentrat, das die höchste Löslichkeit (undenaturierte Konformation) und, noch wichtiger, eine größere relative Konzentration des wärmelabilen Rinderserumalbumins (≥10 %) und Immunglobulinen zeigt, ist. Außerdem zeigen die Mäuse, die diesen Typ Molkeproteinkonzentrat bekamen, höhere Werte an Gewebe GSH. Die Glutamylcysteingruppe (selten in Nahrungsmittelprotein) und die spezifische intramolekulare Bindung im Bezug auf die undenaturierte Konformation des Moleküls sollen die Schlüsselfaktoren bei der Glutathion beschleunigenden Aktivität der Proteinmischung sein.
Kürzlich durchgeführte Experimente in Japan [36] zeigten, dass Milzzellen von männlichen BALB/c-Mäusen, die mit 25 g unseres undenaturierten Molkeproteinkonzentrats (WPC) (für das der Markenname "Immunocal" verwendet worden ist) pro 100 g Diät für 4 Wochen gefüttert wurden, eine erhöhte Immunantwort auf SRBC in vitro und einen hohen Gehalt an L3T4+Zellen (12,58 × 106 ± 1,36) aufwiesen, im Vergleich zu Mäusen, die mit einer Isokaloriediät mit 25 g reinem Casein / 100 g Diät (3,69× 10⁶ ± 0,50) gefüttert wurden. In ähnlicher Weise betrug das L3T4+/LYt-2+-Verhältnis der Milz 1,36 ± 0,07 und mit undenaturiertem WPC gefütterten Mäusen 0,55 ± 0,07 in den mit Casein gefütterten Kontrollen (P<0,001). Andererseits können die relativ hohen Konzentrationen des wärmeempfindlichen Serumalbumins und der Immunglobuline, die aus dem geringen Grad an Pasteurisierung in der Milch in unserem WPC entsteht, genauer das Muster der Rohmilch wiedergeben. Diese Daten können die Hypothese unterstützen, das die wärmelabilen Gly-Cys enthaltenden Proteine, wie das Serumalbumin, in der undenaturierten Konformation die kritischen Elemente für die biologische Aktivität des Molkeproteinkonzentrats sind.
Geeignetes Rindermolkeproteinkonzentrat (WPC) ist vom "Service de recherche sur les aliments du Ministere de l'agriculture du Quebec" in St. Hyacinthe, Quebec, Canada, mit den folgenden Eigenschaften hergestellt worden: Gehalt an reinem Protein 75 % (der Rest ist hauptsächlich Lactose, etwas Fett und Feuchtigkeit); Löslichkeitsindex: (pH 4,6); 99,5 %. Die Proteinzusammensetzung als Gesamtmolkeprotein, gemessen durch Polyacrylamidgelelektrophorese (31) betrug: beta-Lactoglobulin 59,1 ± 4,0; alpha-Lactalbumin: 6,6 ± 0,7; Serumalbumin: 9,7 ± 1,0; Immunglobulin 24,6 ± 2,6 (Mittel ± SD). Der Löslichkeitsindex sollte bevorzugt über 99 % liegen.
Das Serumalbumin von etwa 10 % des Gesamtmolkeproteins betrug beinahe das 2-fache des entsprechenden Werts, der in anderen kommerziell erhältlichen Molkeproteinkonzentraten, die untersucht worden sind, gefunden wurde. Es wird angenommen, dass ein Serumalbumin-Gehalt ≥ 10 % hoch vorteilhaft für die Verbesserung des Immunsystems ist.
Das Serumalbumin umfasst eine wesentliche Menge an Glutamylcystein, das ein Substrat für die Glutathion Synthese im Körper ist. Die Rolle von Glutathion ist im Einzelnen im dem Artikel "The Biological Activity of Undenatured Dietary Whey Proteins: Role of Glutathione", Clin. Invest Med 14: 296 – 309, 1991 (31), der hier mit in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist, diskutiert.
Immunglobulin im Bereich von etwa 25 bis 30 % Gesamtmolkeprotein ist ebenfalls wichtig. Die Pasteurisierung bei 72°C für 13 Sekunden führt zu einem Immunglobulingehalt von 28 ± 2 %. Wir haben festgestellt, dass es möglich ist, einen Serumalbumin-Gehalt in der Höhe von 14 ± 1 % mit Milch, die bei 72°C für 13 Sekunden pasteurisiert ist, zu erreichen.
Bei der bakteriologischen Analyse wurden keine Staphylokokken, Salmonellen, B-Cereus oder E.coli weder in dem WPC, das vom "Service de recherche sur les aliments du Ministere de l'agriculture du Quebec" hergestellt wurde, noch in der Probe, die bei 72°C für 13 Sekunden pasteurisiert wurde, isoliert. Andere Proben wurden durch Erhitzen der Milch auf 63°C für 13 Minuten mit guten Ergebnissen hergestellt.
30 ml heparinisiertes Blut wurde verwendet, um den Glutathiongehalt von phosphatgepufferter Salzlösung mit einkernigem Blut, die so eingestellt war, dass 10⁷ Zellen pro Röhrchen vorhanden waren, zu bestimmen. Nach der Zentrifugation werden 900 ml Wasser in das Pellet gegeben, um die Zellen zu lysieren. Zu jedem Aliquot wird eine 30 %ige Sulfsalicylsäure bis zu einer Endkonzentration von 3 % in 1 ml gegeben. Nach 15 Minuten Inkubation wurden die Proben zentrifugiert, und der klare Überstand wird für den biochemischen Assay nach der Methode von Anderson [37] verwendet. Die Werte werden als Nanomol (nMol) pro GSH/10⁷ Zellen ausgedrückt. Die Blutlymphocyten-Unterpopulationen können durch Fließcytometrie bestimmt werden.
Das Gesamtserumprotein, einschließlich die Albumine und die Immunglobuline können nach der Biuret-Methode bestimmt werden. Die Werte von Immunglobulin A (IgA), Immunglobulin G (IgG) und Immunglobulin M (IgM) können durch Immunnephlometrie gemessen werden.
Die Gegenwart von Glutamylcysteingruppen in der Serumalbumin-Komponente des Molkeproteinkonzentrats kann ein Schlüsselfaktor bei der Glutathion beschleunigenden und immunverstärkenden Aktivität der Proteinmischung des undenaturierten WPC sein. Unsere Laborstudien zeigen, dass Molkeproteinkonzentrate von anderen Quellen keine signifikanten biologischen Aktivitäten hervorbrachten, obwohl sie einen ähnlichen Nährwert zeigten. Die Serumalbumin-Konzentration in Prozent in diesen Produkten beträgt (als Mittel ± SD) jeweils: 4 ± 1 in Promod (Ross Laboratories), 4 ± 1 in Alacen 855 (New Zealand Dairy), 4,8 ± 1 in Lacprodan – 80 (hergestellt von 1989 von Danmark Protein), 4 ± 0,1 in Sapro (Sapro, Montreal), 4 ± 1 in Savorpro – 75 (Golden Cheese, CA, USA), 5 ± 1 in Bioisolate (Lesueur, Isolates, Minneapolis) [8] und 4,3 ± 1 in Promix (Dumex, Quebec). In ähnlicher Weise betrug der Gehalt des anderen wärmelabilen Proteins, Immunoglobulin, die Hälfte des Werts des undenaturierten WPC, das in dieser Studie verwendet wurde.
Die Ergebnisse zeigen, dass undenaturierte Molkeproteine durch Bereitstellung einer spezifischen Quelle für die Glutathionergänzung in den Immunocyten ein Adjuvans gegenüber anderen Formen der Therapie darstellen könnten.
Historisch gesehen und bis heute wurden Bakterien und Spuren in der Milch durch eine thermische Behandlung (Pasteurisierung) herabgesetzt. Um effektiv zu sein, ergab diese Methode unweigerlich eine Denaturierung und somit eine nachfolgende Fällung und Verlust der geronnenen Milch in substantieller Menge der am meisten wärmelabilen und wahrscheinlich biologisch aktiven Fraktionen des Serumalbumins und des Immunglobulins.
Unser Ziel besteht darin, ein Molkeproteinkonzentrat (w.p.c.), das die Proteine in einer Menge und Konformation so nahe wie möglich an der Rohmilch enthält und mit akzeptierten Sicherheitsstandards des Bakteriengehalts kompatibel ist, zu erhalten. Bis heute haben wir den niedrigsten, annehmbaren Grad an Hitzebehandlung der Milch genutzt, um das wärmelabile Molkeprotein zu erhalten.
Eine Alternative zur Hitzebehandlung ist eine Methode auf der Basis der Membranmikrofiltration. Unter Verwendung von Bactocatch (Alfa Laval Ltd. Scarborough, Ontario) können wir durch eine spezielle Membranmikrofiltration der entrahmten Milch, deren Bakteriengehalt auf weniger als 0,5 % der ursprünglichen anfänglichen Werte reduziert ist, ein Permeat erhalten.
Dieses Permeat wird dann mit Rennin behandelt, und die Proteine im Molkeüberstand werden nach einer sanften Prozedur eingeengt, um das gewünschte, undenaturierte Molkeproteinkonzentrat zu erhalten. Das Membranmikrofiltrationskonzept ist eine Alternative zur Hitzebehandlung der Milch als ein geeigneter Weg, die hitzelabilen Molkeproteine zu erhalten, obwohl die Techniken und die Gerätschaften noch verbessert werden müssen.
Die Tabellen 5 und 6 erläutern schematisch ein Verfahren zur Herstellung von verbessertem undenaturierten WPC, das den Markennamen Immunocal erhalten hat. Tabelle 7 ist ein Vergleichsschema, das die Eigenschaften von Immunocal im Vergleich zu den WPC-Quellen zeigt und ebenfalls die Folgen einer Diätbehandlung für 3 Wochen zeigt.
Wir haben als Ergebnis unserer Arbeit geschlossen, dass das undenaturierte Molkeproteinkonzentrat (WPC) für die Prophylaxe von Krebs, wie chemisch induzierter Krebs, typischerweise Darmkrebs, der durch Karzinogene, wie Dimethylhydrazin, beschleunigt wird, wertvoll ist. Es ist ebenfalls für die Behandlung von Patienten mit Krebszellen, wie chemisch induzierten Krebszellen, geeignet, um die Replikation dieser Zellen zu inhibieren. Eine geeignete Dosis für Menschen liegt in einem Bereich von etwa 8 bis 40 g täglich und bevorzugt 20 bis 40 g täglich. Es ist insbesondere vorteilhaft, 30 bis 40 g täglich zu verabreichen. Es ist etabliert worden, dass es insbesondere vorteilhaft ist, das WPC mit einem Serumalbumin in einer Konzentration von mindestens 10 % ± 1 zu verwenden. Das Serumalbumin sollte mindestens 9 % und insbesondere bevorzugt mindestens 9,5 % betragen.
Wie die veröffentlichte Literatur zeigt, sind Tumore des Darms, die durch Dimethylhydrazin in Experimenten mit Mäusen induziert werden, ähnlich dem Krebs des Darms bei Menschen im Hinblick auf den Typ der Läsion und der Antwort auf die Chemotherapie (27, 28).
Die Entdeckung, dass das Granulocyten/Lymphocyten-Verhältnis (G/L) bei terminalen Krebsfällen erhöht ist und mit der Krankheit des Patienten korreliert (38) hat ein Interesse auf die Faktoren, die diesen wichtigen Parameter beeinflussen könnten, hervorgerufen.
TABELLE 5 Schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung von WPC, das wir AS-Immunogen nennen
TABELLE 6
Beispielsweise wurde festgestellt, dass die Granulocytendepletion unter Anwendung der extrakorporealen Zirkulation signifikant die Größe eines transplantierten Tumors in Kaninchen reduziert (39). Neuere experimentelle Studien bei Mäusen haben die Möglichkeit nahegelegt, dass der zweite Parameter der G/L-Gleichung durch Diätmittel beeinflusst sein könnte. Mäuse, die mit Molkeproteinkonzentrat gefüttert waren, das so hergestellt war, dass die wärmeempfindlichsten Moleküle der Molke erhalten blieben, wie die Serumalbumine in ihrer nativen undenaturierten Form, zeigten eine verstärkte Immunantwort (35), die teilweise durch eine verstärkte Resistenz gegenüber Pneumokokkeninfektion (40, 1) und Karzinogeninduktion von Krebs (1) manifestiert wurde.
Dieses ist das Produkt, die wir das undenaturierte WPC genannt haben. Eine erhöhte Immunreaktivität von Mäusen, die mit undenaturiertem WPC gefüttert worden waren, wurde in nativen Zellen, die in vitro übertragen worden waren (36) in einem andauernden Zustand gefunden. Das Serumalbumin enthält sechs Glutamylcysteingruppen (31) und stellt daher das spezifische Substrat für die Synthese von Glutathion (33, 34) (GSH). Diese Gruppen sind in Nahrungsproteinen extrem selten (31).
Der positive Effekt von undenaturiertem WPC in den Tierexperimenten war mit einer anhaltenden Erhöhung der Gewebeglutathionwerte assoziiert (41). Allerdings war nirgendwo diese Wirkung offensichtlicher als in den Milzzellen während der Antigen angetriebenen klonalen Expansion des Lymphocytenpools (32): Diese Experimente zeigen deutlich, dass die immunverstärkende Aktivität, das heißt, die erhöhte Lymphocytenproliferation von undenaturiertem Diät-WPC, mit der beobachteten größeren Produktion von GSH in den Lymphocyten im Vergleich zu einem tatsächlichen GSH-Abfall, der bei mit Casein gefütterten Kontrollen während eines ähnlichen Antigenangriffs verzeichnet wurde (32), zusammenhängt. GSH, ein Tripeptidthiol, das in praktisch allen Zellen gefunden wird, ist der Hauptfänger für freien radikalischen Sauerstoff (42). Insbesondere scheint der GSH-Gehalt in den Lymphocyten mit der Fähigkeit von Oxidanzien und Thiolen zu korrelieren, deren Proliferation zu modulieren (43). In diesem Sinne kann die Modulierung von intrazelllulären GSH die Immunantwort beeinflussen (44, 45).
Diese Experimente zeigen weiter, dass der Verstärkungseffekt der Diätmolkeproteine auf die Lymphocyten insbesondere offensichtlich ist, wenn der Antigenstimulus für die aktive Proliferation vorhanden ist.
Allerdings ist diese einzigartige Beziehung zwischen dem undenaturierten Diät-WPC und der Lymphocytenproduktion ebenfalls bei normalen, nicht-immunisierten Mäusen manifestiert. Nach drei Wochen Behandlung nach Diätplan waren die Milzgewichte und das Verhältnis Milzgewicht : Körpergewicht der Mäuse, die mit 20 g oder 30 g undenaturiertem WPC / 100 g Diät gefüttert worden waren, moderat höher als die entsprechenden Werte für Mäuse, die mit Nahrungs-äquivalenten Diäten gefüttert worden waren, die 20 g oder 30 g jeweils Casein, Sojaprotein oder Fischprotein / 100 g Diät (46) enthielten. Insbesondere war die Zahl der Zellen pro Milz höher bei mit undenaturiertem WPC gefütterten Mäusen im Vergleich zu den entsprechenden Werten bei Mäusen, die mit äquivalenten Mengen Casein, Weizen-, Soja- und Fischprotein gefüttert worden waren (35).
Eine detaillierte Studie hat gezeigt, dass die Anzahl an nukleierten Zellen in der Milz der Mäuse, die mit 25 % undenaturierter WPC-Diät gefüttert worden waren, signifikant höher als die entsprechenden Werte bei Mäusen, die mit einer 25 %igen Caseindiätkontrolle gefüttert worden waren. Interessanterweise waren die beobachteten Änderungen spezifisch mit der Verdoppelung der P-Zellenpopulation verbunden: Insbesondere erhöhte sich die L3T4⁺-Subpopulation um das Vierfache, während die Anzahl der B-Zellen unverändert war (36). Diese späte Feststellung ist mit anderen Studien konsistent, die zeigen, dass die Effekte von undenaturiertem WPC nicht zentral auf die Rate der primären B-Lymphocytenproduktion im Knochenmark ausgeübt werden, und dass der immunverstärkende Effekt insbesondere in der Antwort auf T-Zellen abhängige Antigene zu sehen ist (47).
Der oben beschriebene Effekt von undenaturiertem WPC auf die Lymphocyten kann den beobachteten Inhibitoreffekt dieser Form des Diätplans auf experimentelle Tumore gut erklären. Neuere Experimente zeigten, dass eine kontinuierliche Verfütterung von undenaturiertem WPC in den Diäten die Entwicklung (Anzahl und Größe) von Tumoren im Darm von Mäusen über einen Zeitraum von 24 Wochen einer Dimethylhydrazinbehandlung (DMH) inhibiert (1). Dieser Antitumoreffekt könnte durch die erhöhte Resistenz der Targetzellen gegenüber dem Karzinogen und/oder einem direkten Inhibitoreffekt von undenaturiertem Diät-WPC auf das Tumorwachstum verursacht werden. Eine nachfolgende Serie von Experimenten (2), wo die Tiere mit einer Standardlabordiät für die ersten 20 Wochen mit DMH gefüttert wurden, und nachfolgend auf die undenaturierte WPC-Diät für die verbleibenden acht Wochen der DMH-Behandlung übergegangen wurde, zeigen deutlich einen Inhibitoreffekt der undenaturierten WPC-Fütterung auf die Krebszellen.
Es ist bemerkenswert, dass der Verstärkungsdefekt von undenaturiertem WPC auf die peripheren Lymphoidgewebe von normalen Tieren nicht mit signifikanten Änderungen der Gesamtzahl der Blutlymphocyten assoziiert ist (36, 46). Die Abwesenheit einer Änderung der Gesamtzahl der zirkulierenden Lymphocyten wurde ebenfalls bei gesunden Menschen festgestellt (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.).
Die Induktion der zellulären GSH-Synthese durch die Glutamycysteingruppen von undenaturiertem WPC kann einen anderen interessanten Effekt bei Krebspatienten konstituieren. Tatsächlich wurde festgestellt, dass die Einführung des Cysteinfreisetzungssystems OTZ (Ozothiazolidin-4-carboxylat), während die GSH-Gehalte in normalen Zellen erhöht werden, zu einer Rückkopplungsinhibierung des GSH-Zyklus in humanen Tumorzellen führt (5).
Ein klinischer Test wurde in Japan von Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. durchgeführt. Das klinische Team wurde von Dr. Masakazu Adachi geleitet. Der klinische Versuch umfasste fünf Patienten, die ein fortgeschrittenes Stadium von terminalem Krebs erreicht hatten. Ein zusammenfassender Bericht ist unten als Tabelle 8 angegeben, und die Labordaten der Hämatocyten und die Glutathionwerte sind in Tabelle 9 für vier der Patienten angegeben. Der Dosisgehalt für jeden Patienten betrug 30 g pro Tag.
Wie in Tabelle 8 gezeigt ist; erhöhte sich die Lymphocytenzahl in allen Patienten während der Verabreichung des undenaturierten Molkeproteinkonzentrats. Zwei andere Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium wurden aus dem Versuch wegen Verdauungsproblemen herausgenommen. Eine frühere Untersuchung hatte berichtet, dass, wenn die Lymphocytenzahl einmal in Krebspatienten abgefallen ist, eine Wiederherstellung der Lymphocytenzahl auf einen normalen Wert nicht möglich sein kann. Der Anstieg der Lymphocytenzahl ist wichtig wegen seines Potentials, das G/L-Verhältnis zu verbessern.
Die in den Tabellen 8 und 9 gezeigten Resultate können mit gesunden Individuen verglichen werden, die (bezogen auf Tests mit 14 Individuen) normalerweise einen Glutathion-PMN-Gehalt von 0,34 ± 0,02, einen Glutathion-RBC-Gehalt von 0,066 ± 0,006, einen WBC von 6.640 ± 1700, eine Lymphocytenzahl von 2200 ± 460, ein G/L-Verhältnis von 1,85 ± 0,45 und einen Plt von 25,4 ± 3,3 aufweisen.
Tabelle 10 zeigt die bakteriologische Analyse und ebenfalls die Proteinverteilung und die Löslichkeit des undenaturiertem WPC, das in den in den Tabellen 8 und 9 beschriebenen Versuchen verwendet wurde.
Als Schlussfolgerung scheint es so zu sein, dass die Verabreichung von WPC an Krebspatienten die Anzahl der Blutlymphocyten erhöht und das G/L-Verhältnis erniedrigt. Die Lymphocytenkonzentration, sehr niedrig am Anfang, tendiert dazu, auf Normalwerte zurückzukehren. Auf der Basis einer früher beschriebenen experimentellen Evidenz (38, 39), legt der beobachtete Effekt von WPC die Inhibierung des Krebszellenwachstums nahe.
In Tests mit undenaturiertem WPC nach denen, die in den Tabellen 8 und 9 beschrieben sind, wurden die folgenden Beobachtungen gemacht:
(1) Die Patientin F hatte feste Tumore in ihrem Abdomen, die durch physikalische Untersuchung identifiziert werden konnte, und sie hatte eine Chemotherapie erhalten. Sie hatte Schwierigkeiten bei der Konsumierung des undenaturiertem WPC, und man hätte sie beinahe aus der Behandlung herausgenommen. Es wurde allerdings festgestellt, dass sich, solange sie das undenaturierte WPC einnahm, ihre Lymphocytenzahl erhöhte, und die steigende Zahl der Tumormarker zeigte sogar Zeichen der Abnahme.
(2) Die Patientin G wurde auf ein lokales Wiederauftreten des Krebses nach der Bestrahlung behandelt. Sie erhielt eine Strahlenbehandlung im November 1992. Die Verabreichung von undenaturiertem WPC fing am 4. Dezember an. Ihre Lymphocyten verbessern sich zwischen dem 3. Dezember und dem 30. Januar 1993 von 960 bis 1310. Am 3. Februar gab es kein Wiederauftreten, und ihre Lymphocyten betrugen 1370 und das G/L 3,1.
(3) Der Patient H bekam eine Strahlentherapie wegen eines lokalen Tumors. Die Verabreichung von undenaturiertem WPC begann am 16. Dezember 1992. Zu diesem Zeitpunkt waren die Testergebnisse wie folgt:
Die Ergebnisse am 24. Dezember waren:
Am 20. Januar waren die Ergebnisse:
Am 3. Februar waren die Ergebnisse:
Es wurde festgestellt, dass der Fortschritt des Patienten gut war.
(4) Der Patient "I" bekam eine Strahlenherapie auf das Mediastinum, auf das zervikale und das gesamte Gehirn. Die Verabreichung von undenaturiertem WPC begann am 1. Dezember 1992. Seine Lymphocyten erhöhten sich von 340 am 26. November auf 930 am 13. Januar. Sein G/L-Verhältnis erniedrigte sich von 12,1 auf 4,4 und das WBC erhöhte sich von 4500 auf 5100.
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(Die in ihrer Gesamtheit hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen sind).

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Claims

Verwendung eines im Wesentlichen undenaturierten Molke-Proteinkonzentrates zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Krebsbehandlung, welches Konzentrat wenigstens 9% Albuminserum enthält, in einer Menge, welche ausreicht, um die Anzahl der Lymphozyten zu erhöhen.
Verwendung eines Konzentrates zur Herstellung einer Zusammmensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Konzentrat wenigstens 9,5% Albuminserum enthält.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine solche Menge Konzentrat eingesetzt wird, um das G/L-Verhältnis eines Krebspatienten zu verringern.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für eine tägliche Abgabe einer Dosis von 8 bis 40 g des Konzentrates eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für eine tägliche Abgabe einer Dosis von 20 bis 30 g des Konzentrates eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für eine tägliche Abgabe einer Dosis von 30 bis 40 g des Konzentrates eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das undenaturierte Molke-Proteinkonzentrat im Wesentlichen alle in der Milch vorkommenden Proteine in undenaturiertem Zustand enthält.
Verwendung eines im Wesentlichen undenaturierten Molke-Proteinkonzentrates mit einem Gehalt von wenigstens 9,5% Albuminserum zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Krebsbehandlung an Patienten mit Verletzungen des Dickdarms von der Art, hervorgerufen durch Dimethylhydrazin.
Verwendung eines Proteinkonzentrates nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das undenaturierte Molke-Proteinkonzentrat Albuminserum in einer Menge von etwa 10% oder mehr enthält.
Verwendung eines Proteinkonzentrates nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Krebsbehandlung an Patienten mit Verletzungen, welche vergleichbar sind mit Verletzungen des Dickdarms, hervorgerufen durch Dimethylhydrazin.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welcher die Zusammensetzung zudem Selen enthält und zwar in Mengen von 40 bis 60 μg (berechnet als Selenmethionin), Selen pro 60g undenaturiertem Molke-Proteinkonzentrat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welcher die Zusammensetzung zudem Vitamin B₁ enthält, und zwar in Mengen von 1,5 bis 2 mg Vitamin B₁ pro 60g undenaturiertem Molke-Proteinkonzentrat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welcher die Zusammensetzung zudem Vitamin B₂ enthält, und zwar in Mengen von 1,7 bis 2,2 mg Vitamin B₂ pro 60 g undenaturiertem Molke-Proteinkonzentrat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welcher die Zusammensetzung zudem 1,5 bis 2,0 mg Vitamin B₁, 1, 7 bis 2, 2 mg Vitamin B₂ und 40 bis 60 μg (berechnet als Selenmethionin) Selen pro 60 g undenaturiertem Molke-Proteinkonzentrat enthält.
Verwendung eines im Wesentlichen undenaturierten Molke-Proteinkonzentrates nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung einer Zusammensetzung für die prophylaktische Behandlung von Dickdarmkrebs von der Art hervorgerufen durch Dimethyldrazin bei Säugetieren, welche Zusammensetzung für eine tägliche Abgabe von 8 bis 40 g des undenaturierten Molke-Proteinkonzentrates eingesetzt wird.
Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Krebspatienten, um die Anzahl der Lymphozyten zu erhöhen und das G/L-Verhältnis eines Krebspatienten zu senken, dadurch gekennzeichnet, dass sie 20 bis 40 g undenaturiertes Molke-Proteinkonzentrat, gewonnen aus Milch, und mindestens 9,5% Albuminserum sowie im Wesentlichen alle in roher Milch vorhandenen Proteine enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 16 zur Verabreichung an Krebspatienten zwecks Erhöhung der Anzahl der Lymphozyten und Senkung des G/L-Verhältnisses solcher Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass entrahmte Milch bei einer ausreichend tiefen Temperatur und während einer ausreichend kurzen Zeit pasteurisiert wird, damit im Endprodukt ein Albuminserum-Gehalt von mindestens 9,5% verbleibt und dabei im Wesentlichen frei ist von Staphylokokken, Salmonellen, B.cereus- und E.Coli-Bakterien, und dass dieses Produkt anschließend filtriert und konzentriert wird, um ein undenaturiertes Molke-Proteinkonzentrat in Pulverform abzugeben.