KR0178799B1 - 면역계 활성을 증가시키기 위한 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료약적 유효량의 글루타민 또는 유사물을 동물에게 투여함으로써 장점막위축증 및 췌장위축증, 과도한 장투과성, 숙주방어 능력의 손상 및 절충된 면역 기능을 포함한 장과 관련된 병리학적 분해 과정을 치료하는 방법 및 동물에 있어서 골수 이식 수술로 부터 회복을 촉진하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

면역계 활성을 증가시키기 위한 약학 조성물

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 미국 국방성(Department of the Army) 계약번호 DAMd-17-81-C-12001 및 국립건강 연구소 트라우마 센터 승인번호 GM 29327-05 하의 연구에 의한 것으로 본 발명에 대한 일부 권리는 미국 정부에 있다.

[관련된 출원에 대한 참고 문헌]

본 출원은 1985. 9.12 자 출원된 출원번호 제775,21호(현재 포기됨)의 일부계속 출원(CIP)인 9186. 9.12 자 출원된 제906,530호의 일부계속 출원이다.

[본 발명의 배경]

[본 발명의 분야]

본 발명은 장점막 및 췌장의 위축증을 비롯한 장과 관련된 병리학적 이화 과정을 치료하는 방법 및 창자(gut) 투과성의 과대증가, 숙주 방어기능의 손상 및 손상된 면역기능과 관련된 기타 질환의 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 골수이식 수술을 받은 개체의 회복을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

[배경기술에 관한 설명]

이화 과정(catabolic processes=기능장애)은 해부학적 구조부가 분해되는 생리학적 증상이다. 이같은 증상은 통상 골격근 뿐아니라 창자 구성 조직(lining of the gut)에 영향을 준다. 조직 손상을 초래하는 이화 작용은 종종 외과적 수술, 패혈증, 화상으로 인한 외상, 암 화학요법, 방사선 치료/외상 또는 글루코코르 티코이드 치료법에서 흔히 수반되며, 불충분한 음식을 섭취하는 것과 관련되어 있다. 이와 같은 외상, 질환 및 치료로 인해 통상적으로 면역 기능이 손상된다.

골수이식 수술을 받은 환자에 있어서, 흔히 발생되는 이식편 대 숙주반응(graft-versus-host disease)과 함께 이식 전후의 방사선 및 / 또는 화학 치료요법에 의해 이화 및 심각한 영양학적 문제점이 초래된다. 상기 환자에게 고 영양수액(Total parenteral nutrition=TPN)이 필요한지 여부는 경구 및 식도의 점막염, 설사, 오심, 구토, 구내건조증 및 이미각증과 같은 여러 오인에 따라 결정된다(Cunningam 등 Nurs. Clin. N. Amer. 18; 585-596(1983); Cheney 등 Cancer 59: 1515-1519(1987)). 비록 TPN이 골수이식 환자에게 필수적이며 유리하다고 판단되더라도, 이식 수술 이후 처음 한달동안 측쇄 아미노산(BCAA)을 특히 높은 배합율로 첨가한 정맥내 주입액을 사용하여도 질소 균형(nitrgen balance)치를 향상시키지 못했다(Lenssen 등, J. Parent, Ent. Nutr. 11:112-118(1987)).

상술된 여러가지 원인으로 인해 야기된 위장관에 손상을 주고 면역기능을 손상시키는 이화 작용은 사망 및 무력증의 주된 원인이 된다. 이와 같은 임상적인 상태는 흔히 비필수 아미노산인 글루타민(GLN)의 비정상적인 대사작용과 관련되어 있다. GLN은 대부분의 조직에서 어느정도 합성될 수 있다. 대부분의 아미노산과는 달리, GLN은 2개의 아민 잔기, 즉 알파-아미노기와 아미드기를 갖고 있다. 상기 아미드기가 존재하기 때문에 GLN은 신체의 말초조직으로부터 암모니아를 제거하고, 질소를 내장기관으로 수송하는 능력이 있다. 또한 조직들은 통상 혈액순환계로부터 GLN을 흡수하여 그 탄소 골격을 에너지원으로 이용한다.

글루타미나제 및 글루타민 합성효소(synthetase)들이 GLN 대사작용을 조절하는데 관여된 주요한 효소들이다. 글루타미나제는 GLN이 글루타메이트와 암모니아로 가수분해되는 반응을 촉매하는 반면, 글루타민 합성 효소는 글루타메이트와 암모니아로부터 GLN을 합성하는 반응을 촉매한다. 대부분의 조직들이 이들 효소를 모두 갖고 있지만, 특정 조직에 따라 통상 한 효소가 다른 효소보다 더 활성이 있다.

GLN 합성 및 방출(exportation)은 골격근 및 뇌에서 주로 발생한다. 차례로 GLN은 섬유아세포, 조혈세포, 임파구, 장의 상피세포 및 종양세포와 같은 복제성 세포에 의해 소모된다. 특징적으로 이들 세포들은 높은 글루타미나 활성도와 낮은 세포내 GLN농도를 갖고 있다. 이 사실은 큰 상처, 감염을 수반한 염증 또는 정상적인 장내영양공급(enteral feeding)을 방해하는 위장의 기능장애 현상을 나타내는 환자에게 임상적으로 매우 큰 의미가 있는데, 이는 이같은 상태에서 세포 유형을 바람직하게 증식시키기 위해서는 충분한 농도의 GLN이 입수되어야 하기 때문이다.

위장관에서, GLN은 호흡용 연료로 사용된다. GLN을 장투여하면 순환계로 부터의 GLN 흡수율은 감소되면서 동시에 장점막에 의한 루미날 GLN의 흡수율은 증가된다. 즉 장에 의한 GLN의 흡수는 상기 GLN의 2가지 제공원간에 평형이 유지된다.

위장관에 의해 흡수된 GLN의 대부분은 소장융모위의 상피세포를 경유해 흡수된다. 소장에서 GLN대사작용이 일어나 장에 대한 주요 에너지원을 제공하며, 다른 조직으로부터의 질소와 탄소를 가공함으로써 간의 우레아지네시스 및 글루코네오지네시스 반응을 위한 전구물질을 제공한다.

바스커빌 등(Brit. J. Exp. Pathol. 61:132(1980))은 리서스 원숭이, 마모세트, 토끼 및 마우스에 정제된 글루타미나제를 주입함으로써 혈장 GLN의 농도를 검출불가능한 농도로 저하시켜 구토, 설사, 융모위축증, 점막 궤양 및 장괴사등이 초래됨을 알았다.

마틴 등(미국 특허 제2,283,817호)은 영양 보충제로서 보다는 해독제로 사용되는 GLN 함유 조성물을 개시하였다. 이 특허에서 GLN은 유해한 효과를 억제하기 위해 독소상에 직접 작용하는 다른 아미노산들과 상승적으로 조합되었다.

Shive등 (미국 특허 제2,868,693호)은 위궤양 치료용 GLN-함유 조성물을 개시하였다.

또한 GLN이 보호성 효과를 갖는다는 증거가 오카베 등의 문헌[Digestive Disease, 20:66(1975)]에 개시되었는데, 그는 GLN이 인체에 있어서 아스피린에 의한 위궤양을 보호할 수 있음을 밝혀냈다. GLN을 장(intestine) 내로 튜브 주입하여 위점막이 GLN에 직접 노출되지 않게 제공했을 때에는 상기 효과는 관찰되지 않았다. 이 사실은 위궤양에 대한 GLN의 효과가 국소적이며, 변형된 전신성 영양법(altered systemic nutrition)에 의한 이차적인 것이 아님을 의미한다.

비필수 아미노산 GLN은 표준 비경구 영양수액 중에는 존재하지 않지만 바람직한 소장용 산화 연료(Windmeuller, H. G. Adv. Enzym]53: 201-237(1982))이며, 정맥내 주입시(i.v) 설치류의 장 점막 상에 영양효과를 나타낸다. (Hwang, T.L. 등, Surgical Forum 37:56-58(1986); O'Dwyer, S.T. 등, Clin Res, 35:369A (1987)). GLN의 내장 요구량은 소자에 의해 GLN 대사가 증가하는 것으로 알려져있는 질환의 경우 더 커질 수 있다(Souba 등, Surgerry, 94(2):342(1983)). 비록 GLN이 췌장에 의해 급속히 소모된다고 알려져 있고, 상기 췌장에 외분이 부에 농축되지만(Cassano, G.B. 등, J. Neurochemistry 12:851-855(1965)), 동물의 외분비 췌장상에 외인성 GLN을 투여하였을 때의 효능에 대해서는 보고된 바 없다.

현재 그스스로 적절한 영양을 섭취할 수 없는 환자의 영양학적 요구량은 장내 또는 비경구용 음식을 투여함으로써 충족시키고 있다. 장내 음식은 통상 소구경 튜브를 코를 통해 위 또는 십이지장부에 위치시키거나, 위루설치술 또는 공장루술에서 처럼 외과적 삽입술에 의해 위치시켜 그 튜브를 통해 투여된다. 현재 시판되는 이같은 장내용 제제(formulas)은 4가지 기본 부류로 나누어질 수 있다; 원소형, 중합체형, 모듈형 및 변형 아미노산, 이들 제제는 GLN을 함유하고 있다. 그러나 장내용 음식내에 존재하는 영양분 농도는 일반적으로 정상개체의 영양 필요량을 기준으로 하며, 이화성 질환으로 고통을 받는 환자의 영양 필요량에 준거한 것은 아니다.

원소형 제제는 최소의 소화 작용만 있으면 되고 주로 작은 펩티드 및/또는 아미노산, 글루코즈 올리고사카라이드와 식물성유 또는 중간사슬 길이의 트리글리세라이드로 구성되어 있다.

중합체형 제제는 단백질 공급원으로 콩단백질, 락트알부민 또는 카제인 같은 복합 영양분을 이용하며; 탄수화물 공급원으로 말토덱스트린 또는 옥수수시럽 고형분을 이용하고; 지방 공급원으로 식물성 오일 및 유지방을 사용한다.

모듈형 음식(Modular diets)은 특정 영양 요구량에 부합하도록 단백질, 탄수화물 또는 지방을 단량체 제제 또는 중합체 제제와 혼합하여 제조할 수 있다.

변형된(altered) 아미노산 조성물로 구성된 제제는, 질소대사에 대한 유전적 결함이 있는 환자 또는 후천적으로 질소 누적질환이 생긴 환자에 주로 사용되며, 유해한 특정 아미노산을 환자가 섭취하는 것을 제한시키기 위한 것이다.

비경구용 음식은 통상 정맥(iv)내로 투여된다. 이 정맥내 유체는 용이하게 흡수될 수 있는 당, 아미노산 및 전해질 같은 단순 화학물질로 구성된 멸균 용액이다.

고 영양 수액(total parenteral nutrition:TPN)이란 용어는 영양 필요량을 모두 정맥내 주사법으로 얻고 있는 환자에게 사용하기 위한 제제를 기술하기 위해 사용한다.

장내 제제와는 달리 고 영양 수액 제제는 통상 GLN을 함유하고 있지 않다. 이 고 영양 수액제제에서 GLN이 배제된 이유는 부분적으로는, GLN이 실온에서 불안정하여 암모니아와 피로글루탐산을 생산한다는 점 때문이다. 또한 신경전달물질로서 글루탐산은 독성이 있을 수 있으므로, GLN으로부터 글루탐산이 생성되는 현상에 주의해야 한다. 실제로, 이같은 사실이 장내 및 고영양 수액의 pH 값에서도 적용되는 것 같지는 않다.

TPN은 융모 위축증을 초래하며, 이 현상은 경구영양공급이 재개될 때 통상가역적으로 없어진다. TPN 제제에는 GLN이 결여되어 있으므로, 이 아미노산에 대한 신체 요구량은 신체 조직내의 합성 경로에 의해 제공되어야만 한다.

중증질환을 앓고 있는 환자에 있어서, 순 단백질 이화작용은 근육 GLN 푸울의 현저한 감소 및 혈장 GLN의 감소(Askanazi 등, Ann, surg. 192:78(1980); Askanazi 등. Ann, Surg. 191:465 (1980)), 소장의 GLN이용율의 증가와 관련되어 있다(Souba 등, Arch. Surg. 120:66(1985); Souba 등, Surgery, 94(2):342 (1983)). 글루코코르티코이드 또한 소장에 의한 GLN 소모율을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Souba등, Surgical Forum, 34:74 (1983)).

TPN은 췌장 중량 감소 및 췌장외분비 감소 뿐만 아니라 위장 점막 위축증과 관련되어 있다(Hughes, C.A. 등, Clin Science 59:329-336 (1980); Johnson, L.R. 등, Gastroenterology 68:1177-1183 (1975); Johnson. L.R. 등., Am.J. Physiol. 233: E524-E529 (1977); Towne,J.B. 등,. Am.J.Surg.126; 714-716(1973)). 신체 성장을 유지하기 위해 정맥내로 충분한 영양분을 공급받은 동물에게도 기아상태에서 발생되는 정도의 췌장 위축증이 발생한다(Johnson, L.R. 등 상기 문헌 (1975)). 췌장 위축증의 병인론에 대해서는 별로 알려져 있지 않으며, 통상 경구 영양 섭취에 수반하는 여러 가지 요인들, 즉 (1) 루미날 기질의 부재(Clark. R.M., Clin. Sci. 50:139 (1976)); (2) 음식물내 아민의 부족(Seidel, E.R. 등, Am. J. physiol. 249: G434-438 (1985); (3) 발효성 섬유의 부재(Jacobs, L.R. 등, Am. J. Physiol. 246; G378-G385 (1984)); (4) 신경체액 과정에서의 변형(Johnson, L.R., Physiology of the Gastrointestinal Tract. 2d. Ed., pp 301-319, Raven Press, NY (1987)) 또는 (5) 췌장 담낭분비에서의 변화(Fine, H, 등, AM. J. physiol. 245:G358-G363 (1983))와 같은 요인으로 인한 2차적 현상이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 췌장 위축증은 현재 시판되고 있는 비경구용 영양수액중에 특정 영양소의 부재로 인해 영향을 받을 수 있다(Wilmore, W. W. 등, surgery 104 (5): 917~923 (1988)).

종래 기술에서는 고농도의 GLN을 투여함으로써, 골격 근육의 분해, 장융모의 위축증 및 췌장 위축증, 투과성을 증가시키는 창자벽의 분해, 손상된 면역기능(compromised immune function) 또는 TPN 과정중에 발생하는 기타 이화성 기능장애를 방지할 수 있다는 사실을 개시한 바 없다.

[발명의 요약]

본 발명에서는, 암 방사선 요법 또는 화학치료법 또는 정맥내 영양 공급과 관련되어 장내 점막 위축증, 췌장 위축증, 증가된 창자 투과성, 숙주 방어 기능의 손상 및 면역 기능 손상을 포함한 창자와 관련된 이화성 병리학적 진행 형상(이화성 기능장애)을 갖거나 또는 이러한 것을 가질 위험이 있거나, 또는 골수이식에 의해 치료중인 동물에게 치료학적 유효량의 GLN을 투여한다. 이러한 GLN의 양은 건강한 개체들의 식이 요법에서 보통 요구되는 양보다 더 높다. 이러한 증가된 수준의 GLN은 특정의 이화작용(기능장애) 동안에 일어나는 GLN에 대한 더욱 높은 요구량을 만족시키기 위해서 필요한 것이다. 외부에서 GLN을 공급하지 않으며, GLN은 이와 같은 이화작용 동안에 근육 조직의 파괴에 의해 생성된다. 이화작용(기능장애)동안에 근육으로부터 GLN 방출이 촉진되었음에도 불구하고 혈장내의 GLN 농도가 감소했다는 것은 전신적인 GLN 부족을 나타낸다. 근육으로부터의 촉진된 GLN 방출에도 불구하고, 장내 점막 세포의 수요량은 공급량보다 크다. 이것은 장내 융모위축증을 야기하고, 창자벽의 차단 기능을 파괴할 수 있다. 창자뿐만 아니라 기타의 림프 조직에서의 손상된 면역 기능과 함께 이러한 차단기능의 손실은 감염을 쉽게 야기하는 중요한 인자이다. 장내 손상외에도, 유사한 조건하에서 췌장 위축증이 발생한다.

따라서, 본 발명은 동물에 있어서, 장내 점막 위축증, 췌장 위축증, 과도한 창자 투과성 증가, 손상된 숙주 방어 기능 및 손상된 면역 기능을 포함한 창자와 관련된 병리학적 이화 과정을 치료하고 골수이식 수술로부터의 회복을 촉진하는 방법을 제공하며, 이 방법은 치료학적 유효량의 GLN 또는 GLN의 기능적 유사체를 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

스트레스를 받은 환자에세 외인성 GLN을 제공하면 소장 및 면역계의 대사 요건을 더욱 잘 충족시키고 단백질의 전신적 이와작용의 속도를 감소시킨다. 골수이식 수술을 받고 있는 환자에세 GLN을 제공하는 것은, 방사선/화학요볍 때문에 생기는 위장 손상 및 면역기능손상, 이식 조직과 숙주 반응으로 인한 질환, 및 TPN를 개선하는 데에 특히 유익하다. 또한, 염정성 장(bowel) 질환이 있는 환자에게 GLN을 제공하는 것도 유익하다.

염증성 장 질환에서의 글루코코르티코이드의 치료 효과는, 창자를 구성하는 장세포내의 기질 신진대사를 증가시키는데 있어서의 이들의 역할뿐만 아니라 이들의 항염증성과 관련된다는 것을 예측할 수 있다. 외인성 GLN을 투여하면, 장세포에 더 많은 기질을 제공하므로, 혈장 및 골격근의 GLN결핍을 방지한다. 유사하게, GLN은 이식된 소장의 생존율을 증가시키거나 또는 장이 덜 발달된 유아에 있어 창자의 신진 대사를 도와준다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 질소 섭취량의 함수로서 질소 균형(balance)의 플로트를 나타낸다.

제2도는 동맥혈내의 총 측쇄 아미노산(BCAA) 농도를 BCAA 투여율과 기교하는 실시예 5에서 얻은 데이터의 그래프이다. 데이터는 평균 ±SEM을 나타낸다. 생리식염수를 투여받는 동물로부터의 데이터는 포함되지 않는다.

제3도는 BCAA 유량(체후부; hindquarter)과 BCAA 주입 사이의 관계를 비교하는 실시예 5에서 발생된 데이터의 그래프이다.

제4도는 수술후 6시간 후 BCAA 유량(체후부)와 동맥혈의 BCAA 농도 증가를 비교하는 실시예 5에서 발생된 데이터의 그래프이다.

제5도는 질소 유량(체후부)와 수술후 6시간후 BCAA 유량(체후부)를 비교하는 실시예 5에 의해 발생된 데이터의 그래프이다.

제6도는 수술후 6시간후의 질소 유량(체후부)와 수술후 24시간 후에 측정한 근육세포내 아미노산 질소의 변화를 비교하는 실시예 5에서 발생된 데이터의 그래프이다.

제7도는 동종이계의 골수 이식후 누적 질소 균형에 대해, 고용량의 GLN을 함유하는 TPN의 효과를 입증하는 데이터의 그래프이다.

[바람직한 구현예의 간단한 설명]

본 발명의 발명자들은 장내 점막 위축증, 췌장 위축증, 과도한 창자 투과성 증가, 숙주 방어 기능의 손상 및 면역 기능 손상을 포함한 창자와 관려된 병리학적 이화 과정을 치료하는 새로운 방법을 발견했다.

본 발명은 상기의 질병 상태중 한 상태를 갖고 있거나 또는 그 상태로 진전될 수 있는 동물에게 치료학적 유효량의 GLN 또는 그것의 기능적 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료학적 유효량은 보통의 식이 요법에서 존재하는 양보다 더 크다. 사람의 경우 보통의 식이 섭취량은 약 2 내지 4g/day 이다.

이화성 기능장애는, 해부학적 구조의 분해가 일어나는 순(net) 이화 작용 반응을 유도하는 상태이다. GLN을 식이 투여하면 이러한 이화작용 상태의 생화학적 요건을 만족시키므로, 인체가 GLN을 합성하거나 골격근의 파괴로부터 GLN을 얻을 필요가 없을 것이다.

본 발명은 GLN에 대한 요구량이 증가된 모든 이화성 기능장애에 사용하기 위한 것이다. 이러한 이화성 기능장애는 위장관의 기관 및 세포와 관련이 있을 수 있거나 또는 기타 세포 및 기관계와 관련이 있을 수 있다. 비경구적 식이의 투여동안 소장의 융모 위축은 장세포에서의 직접적인 이화 작용 때문에 일어나는 것이 아니라 환자의 식이에서 GLN의 결핍 때문에 일어난다.

용어 장내(enteral)은 위에서 항문사이의 소화관의 일부분에 영양물을 투여하는 방법을 나타내는 것으로 해석된다.

용어 비경구적은 소화관의 외부영역에 영양분을 투여하는 방법을 나타낸다. GLN에 대한 요구량이 증가되는 비경구적 이화성 기능장애는, 수술동안 또는 그 이후의 패혈증, 화상, 칼로리 결핍 및 비조절된 당뇨증을 포함한 수많은 임상학적 상태에서 발생한다.

본 발명이 효과를 나타내는 동물은 사람을 포함하여 포유류로서 보통 분류되는 것들이다.

용어 병리학적 창자(gut) 투과성은 질병 상태와 관련된 창자벽의 투과성의 증가를 나타낸다. 예를 들어, 위내에 도입된 락툴로스의 흡수 및 뇨배출과 같은 여러가지 방법에 의해 검출가능한 이와 같은 창자 투과성은 암화학요법제의 투여, TPN, 및 기타 외상 및 질병 상태와 관련이 있다.

용어 치료는 질병 상태를 구성하는 증상 또는 일련의 증상들의 예방, 개선 또는 치료를 의미한다.

용어 췌장 위축증은 췌장 조직 또는 췌장 기능의 손실을 의미한다.

용어 손상된 면역기능은 시험관내 또는 생체 내에서 측정될 수 있는 면역학적 기능의 감소를 나타낸다. 이와 같은 면역 기능으로는 지연된 과감작성과 같은 세포 매개 면역 반응, 항체반응, 항원 또는 유사분열 유발인자에 반응하는 임파구 증식이 있으며, 여기에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어가 의미하는 여러가지 형태의 손상된 면역 기능은 병원성 미생물과 같은 여러가지 병원체에 대한 숙주 방어 기능을 감소시킬 수 있다. 손상된 면역 기능은 화학요법제로서 치료한 후의 공지된 결과이고, 또한, 특정형태의 물리적 외상, 화상, 영양실조, 당뇨병 및 기타 질병 상태의 결과이다.

용어 숙주 방어 기능의 손상은 박테리아, 바이러스 및 진균 등을 포함한 여러가지의 병원성 미생물(이에 제한되는 것은 아님)에 의한 감염에 대한 감수성의 증가를 나타낸다. 이와 같은 손상은 창자벽의 파괴후에 일어나는데, 창자벽은 통상 병원체가 창자 루멘(lumen)으로부터 점막벽을 통해 투과하는 것을 방지한다. 이와 같은 손상은, 면역계의 세포가 병원체와 관련된 항원성 구조에 반응하는 능력이 억제된 면역기능 손상 때문에 생길 수 있다. 또한 숙주 방어 기능의 손상은, 억제된 백혈구 화학 주화성, 식작용 및 킬링(killing)을 포함한 기타세포의 비정상적인 기능, 변질된 대식 세포 기능, 및 참고문헌 [Mims, C.A., The Pathogenesis of Infectious Disease(2판), 1982, Academic Press, N.Y. 본원에 참고로 포함됨.]에서 당해 분야에 잘 알려져 있는 숙주 저항성의 기타 선천적 매커니즘의 비정상적인 기능 때문에 생긴다.

여러가지 세포유형의 생존 또는 성장을 위한 조직 배양 배지중의 GLN의 대한 요건은 참고문헌 [Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York, 1983, 본원에 참고로 포함됨.]에서 당해 분햐에 잘 알려져 있다.

예를 들어, 시험관내 임파구 증식 및 분화는 배지에서 GLN의 증가된 농도에 크게 의존한다는 것이 잘알려져 있다. 예를 들어, GLN이 첨가되지 않은 TPN에 따르는 생체내 GLN의 결핍은 임파구 기능을 억제하는 것으로 볼수 있다. 이러한 기능 손실은 TPN 제제에 GLN을 첨가함으로써, 부분적으로 방지되거나 또는 부분적으로 회복된다.

본 발명의 방법이 효과적이게 되는 기능장애 또는 증상에 대하여 적용된 용어 실제적으로 관련이 있는은, GLN에 대한 생화학적 요구가 기능장애 동안에 또는 그후에 발생하고, 또한 기능 장애에 비례하는, 기능장애를 의미한다.

GLN의 투여는 장내 및 비경구적 방법 둘다에 의해 이루어질 수 있다.

GLN의 장내투여 방법의 예는 위루설치술 또는 공장루술에서와 같이 외과적이식을 통해서, 또는 위 또는 십이지장 부위내로 코를 통해 설치한 작은구멍의 튜브를 사용하는 것이다.

비경구적 투여 경로의 예로는, 피하주사, 근육내주사, 정맥내 주사, 비-인두(nasopharyngeal)흡수, 점막흡수 또는 경피 흡수가 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 대부분의 경우에 있어서, GLN은 정맥내 투여된다. 정맥내 투여에 있어서, 액상 형태의 치료학적 유효량의 GLN은 환자의 대정맥내로 설치된 바늘에 관이 연결되어 있는 저장소로부터 직접 투여된다.

이용되는 투여경로에 상관없이, GLN은 단독으로 또는 식이 보충물로서 투여될 수 있다. 식이 보충물로서 사용되는 경우, GLN은 환자에게 투여되기 전에 기존의 장내 또는 비경구적 식이와 혼합될 수 있다. 또한, GLN이 주된 정맥내 보틀에 직접 부가되지 않고 피기-백 보틀(piggy-back bottle)을 사용하는 통상적인 저장소에 부가 되는 정맥내 공급에서와 같이 식이의 다른 성분과 직접 혼합시키지 않고도 GLN을 투여할 수도 있다.

GLN의 특성을 유지하는 GLN의 기능적 유사체, 유도체, 치환(substitution)생성물, 이성체 또는 동족체가 균등물(equivalents)로서 계획된다. 바람직한 것은 아민기를 제공할 수 있고 크렙스(krebs) 사이클에서 대사될 수 있는 유사체이다. 가장 바람직한 것은 탄소사슬의 한 말단에는 아미노산 잔기를 갖고 탄소 사슬의 다른 말단에는 아민 잔기를 갖는 화합물이다.

GLN의 투여에 대해 치료학적으로 유효한 복용량 범위는 대사 항상성을 유지하기 위한 신체 조직의 이화작용 또는 위축을 방지할 정도로 충분히 큰 범위이다. 장내 식이에 있어서 GLN은 하루에 체중 1㎏ 당 0.3g 이상의 비율로 투여된다. 이와 같은 투여 비율은 하루에 체중 1㎏당 0.3 내지 2.0g , 바람직하게는 0.3 내지 1.5g, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 1.0g 일 수 있다. 정맥내 투여되는때 GLN의 투여 비율은 하루에 체중 1㎏ 당 0.1g 이상이다.

이와 같은 투여 비율은 하루에 체중 1㎏ 당 0.2 내지 3.0g, 바람직하게는 0.3 내지 2.5g, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 2.0g일수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 기존의 식이 제제를 적당한 농도의 GLN을 함유하도록 간단히 변형함으로써 GLN을 투여할 수 있다. 가장 바람직하게, GLN은 예를 들어 투여시에 무균적으로 수화되고 식이 조성물의 기타 성분과 적당한 농도로 혼합되는 멸균 동결건조된 분말과 같은 건조 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, GLN은 투여시에 무균적으로 재수화되는 건조제제의 기타 성분과 예비혼합되거나, 또는 사용시에 해동되어 적당한 농도로 혼합되는 빙결 농축물로서 저장될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 의한 GLN의 사용은 조성물의 제조를 위해 이상적으로 적합하다. 이들 조성물은 단독으로 또는 다른 화학물질과 혼합된, GLN, GLN-함유 디펩타이드, GLN 염을 포함할 수 있다.

이들 다른 화학물질은 예컨대 유리 아미노산, 단백질 가수분해물, 또는 오일과 같은 식이의 기타 활성물질 뿐만 아니라 약학적으로 허용가능한 담체일 수 있다.

비경구적 투여를 위한 제제로는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀션이 있다. 담체 또는 폐색작용(occlusive) 드레싱이 피부투과성을 증가시키고 피부 흡수를 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 성분들을 포함하는 약제 또는 약학 조성물에 관한 것이며, 이 약제는 장내점막 위축증, 췌장 위축증, 증가된 창자 투과성, 숙주 방어 기능의 손상 및 면역 기능 손상을 포함한 창자-관련된 이화성 기능 장애 병변을 치료하고, 골수이식 수술로부터의 회복을 촉진시키기 위해 사용된다.

또한, 본 발명은 이화성 기능장애를 방지 또는 개선하기 위한 GLN-풍부 조성물에 관한 것이다. GLN이 풍부한 조성물은, 치료학적으로 유효하고 보통의 식이에서 존재하는 것보다 더욱 높은 농도의 GLN을 함유한다.

본 발명의 조성물을 함유하는 용기가, 본 발명의 방법에 따른 GLN의 투여를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 용기(container)는 예를 들어 환자에게 투여되는 하루 투약량의 GLN을 함유하도록 설계된다.

단독으로 또는 기타 아미노산과 조합하여 GLN을 정맥내 투여하기에 적합한 용기가 특히 유용한다. 이와 같은 용기는 GLN- 함유 액체 조성물의 저장소, 및 바늘에 부착할 수 있는 액체 유도 수단을 포함할 수 있다.

액체 유도 수단(liquid conducive means)은 저장소에서의 액체 조성물을 예컨대 플라스틱튜브와 같은 바늘로 운반할 수 있는 임의의 물체일 수 있다.

유도 수단에 부착된 바늘은 수용하는 사람의 정맥내 카테터 또는 혈관에 직접 삽입될 수 있거나, 또는 환자에게 투여하기 전에 다른 용액과의 혼합이 가능하도록 저장소내에 삽입될 수 있다.

상기의 설명은 본 발명을 일반적으로 설명하는 것이다. 달리 언급되지 않는한 더욱 완전한 이해는 예시의 목적만으로 본원에서 제공되는 하기의 실시예를 참고로 이루어질 수 있다. 상기 실시예는 본 발명을 여기에 제한하려는 의도는 아니다.

[실시예 1]

[동물의 보호 및 수술과정]

무게 20 내지 40㎏의 22마리의 잡종개를, 이들을 정기적으로 훈련시키고 기생충을 없애는 농장으로부터 구입했다. 모든 암캐는 임신하지 않았다. 개집안에서 동물들을, 하바드 의대의 동물 위원회의 안내서 및 실험용동물 리소스 인스티튜트의 실험용 동물보호 및 사용 위원회, 국제 연구 위원회(the National Research Council)의 안내서(DHEW Publication # NIH 78-23, 1978년 개정)에 따라 유지했다. 동물들을 24시간 광노출과 함께 20℃의 일정 온도로 각각의 개집안에서 유지했다. 이들을 매일 아침 2시간동안 훈련시키고, 지유로이 물을 주고, 오후 1시 내지 3시 사이에 애그웨이 리스폰드(Agway Respond) 2000 Dry Dog Chow먹이(25% 이상의 단백질, 10% 지방, 그 나머지 칼로리는 탄수화물로서 함유)를 하루에 한번 주었다. 5일 내지 7일 동안 개들을 개집의 새로운 환경에 익숙하게 하였으며, 이동안에 파블로프 스탠드(Pavlov stand )에서 조용히 휴식을 취하게 했다. 기초 샘플들을 얻기 하루전날, 오후 5시에 모든 음식물을 개집으로부터 제거했다. 밤새 단식시킨 후, 개를 20분 이상 동안 걷게 하고, 파블로프 스탠드에 위치시키고 앞다리 정맥을 캐뉼러화시켰다. 개가 스탠드에서 20분이상 휴식한 후, 아미노산 측정을 위해 정맥혈 샘플을 얻었다. 티오펜탈나트륨(Abbott Laboratories, 5㎎/㎏ 체중)을 정맥내 주사해 급속히 마취시킨 후, 측면 광근(vastus lateralis muscle)의 생검(biopsy)을 참고문헌[Bergstrom 등., Journal of Applied Physiology 36:693-697 (19740]의 방법에 의해 얻었다. 이어서 이 동물을 스탠드의 밖으로 꺼내고 5㎖의 동맥혈 샘플을 경피 천자(puncture)에 의해 대퇴부 동맥으로부터 얻었다.

표준 수술과정이전에 동물을 최소한 2일동안 생검으로부터 회복시켰다. 수술하기 하루전날, 오후 5시에 모든 음식물을 개집으로부터 다시 제거했다. 오전 7시에, 개를 20분 동안 걷게하고 수술장소에 위치시켜서 펜토바비탈나트륨(abbott Laboratories, 30㎎/㎏ 체중)을 정맥내 주사해 마취시켰다. 기관내튜브(endotracheal tube)을 위치시키고, 동물을 산소와 실내 공기의 혼합물하에서 자발적으로 호흡시켰다. 개를 반듯이 뒤로 누운 자세로 수술대위에 위치시키고, 경피천자에 의해 캐뉼라를 외부 경정맥에 위치시킨 후 상대정맥을 향하게 했다. 시작 시간을 기록한 후, 주입용액을 이 캐뉼라를 통해 4㎖/hr/㎏의 일정 주입량(IMED pump, San Diego, CA)으로 투여했다. Penicillin G(E. R. Squibb, Princeton, NY; 600㎎) 및 Keflin (Eli Lilly, Indianapolis, IN; 1g)을 정맥내 투여했다. 방광에 카테터를 꽂고, 초기 뇨 샘플을 버리고, 카테터를 24시간 수거를 위해 밀폐된 뇨백에 연결했다. 개의 배 및 옆구리를 면도하고, 피부를 비누 및 물로 씻고 포비돈 요오드 프리프(povidone iodine prep) 용액((Clinipad Corporation, Guilford, CT)을 도포했다. 개를 멸균시이트로 싸고, 암컷의 경우에는 수직 배꼽 아래 절개를 통해 복부 공동을 만들고 수컷의 경우에는 오른쪽 중간부(right paramedial) 절개를 통해 복부 공동을 만들었다. 창자를 상부 복부쪽으로 들어가게 하고, 노출된 후복막강을 절개했다. 오른쪽의 깊은 만곡 장골 동맥 및 정맥과, 중간의 천골 동맥을 예리하고 무딘 절개에 의해 단리했다. 실라스틱(silastic)으로 코팅되고 2.8㎜OD 폴리에틸렌 카테터에 연결된 6㎝분절의 폴리에틸렌튜브(2.08㎜OD)로 이루어진 특별하게 제조된 카테터를 오른쪽의 깊은 만곡 장골 동맥을 통해 대동맥에 6㎝ 두 개골쪽으로 삽입했다. 유사한 카테터를 중간 천골 동맥에 삽입했는데, 이것의 팁(tip)은 대동맥의 분기에 약 1㎝ 가까이 위치해 있지만 하대장간막 동맥의 원위부에 위치한다. 제3 카테터를 오른쪽의 깊은 만곡 장골정맥을 통해 하대 정맥에 삽입하고 신장 정맥의 원위부에 위치시켰다. 모든 카테터를 고정시키고 옆구리에서의 자상(stab wound)을 통해 외부와 연결되었다. 이어서 복부를 밀폐 시키고 동물을 그 왼쪽 측부로 돌려놓았다. 외부 카테터를 적절한 길이로 절단하고, 간헐적 주사포트(Jelco, Critikon, Inc, Tampa, FL)에 연결된 무딘 바늘로 메우고, 염수로서 세척하고, 헤파린(1,000유니트/㎖)으로 채우고, 그리고 피하에 찔러넣었다. 주사포트(injection poort)를 동물의 피부 아래 및 척추 근처의 옆구리에 높이 위치시켰다. 이것은 카테터의 주사포트의 경피 천자에 의해 대동맥 및 대정맥으로의 접근을 가능하게 했다. 두 개의 투여량의 Keflin(1g)을 정맥 카테터를 통해 수술후 8시간 및 24시간후에 투여했다.

수술과정후에, 동물을 그 측부로 위치시키고, 마취로부터의 회복동안에 가열램프 및 담요(blanket)를 이용해 체온을 유지했다. 주입을 시작하고 약 5시간후에, 동물을 파블로프 스탠드에 위치시키고, 파라-아미노-히푸린산의 용액(PAH, 염수중의 0.5% w/v)을 중간의 천골 동맬 카테터를 통해 원위 대동맥으로 하바드 펌프를 사용해 0.76㎖/분의 속도로 주입했다.

염료 주입후 40분후, 동시적인 동맥 및 정맥 샘플을, 아미노산 및 PAH 농도의 측정을 위해 얻었다. 3개의 샘플 셋트를 20분에 걸쳐서 10분 간격으로 수득했다. 이어서, 카테터를 세척하고, 헤파린으로 채우고, 동물을 파블로프 슬링(Pavlov sling)내에 유지했다. 실험의 개시후 23시간후, 체후부 유출 연구(hindquarter flux stndy)를 반복했다. 24시간후, 뇨의 수거를 종료했다. 동물에게 티오펜탈나트륨을 상기에 기술된 바와 같이 정맥내 투여했고, 전에 생검되지 않은 다리에서 측면 광근의 생검을 수행했다. 정맥내 주입을 종료하고, 동물을 24시간 동안 물질대사 캐이지(care)에 위치시켜서 임의로 물로 공급했지만 음식은 공급하지 않았다.

[실시예 2]

[주입용액]

모든 동물들은 4㎖/hr/㎏의 속도로 주입물을 공급받았다. 5개의 대조군 동물은 0.9% 염수를 공급받았다. 다른 동물들은 약 0.312(N=2) 또는 0.624(N=6)g의 질소/24hr/체중㎏이 이동하도록 계획된 2개의 상이한 농도에서 시판되는 아미노산 용액(FreAmine III, American McGaw)을 투여받았다. 4g 단백질/24hr/체중㎏의 등가물을 제공하기 위해 더욱 높은 투여량이 계획되었다. 3마리의 동물은 0.312g 질소/24hr/체중㎏의 속도로 GLN을 함유하는 용액을 제공 받았따. 마지막 그룹(N=6)은 0.624g 질소/24hr/㎏의 속도로 질소를 제공하는 GLN과 FreAmine의 등가의 혼합물을 제공받았다. 증류수에 L-GLN(Sigma, St. Louis, MO)를 용해시키고 수산화나트륨에 의해 pH6.8로 조절되는 0.157M 용액을 헝성함으로써 GLN 용액을 제조했다.

상기 용액을 0.22μM 멤브레인을 통해 여과시킴으로써 멸균처리하고, 24시간 이하 동안 4℃에서 보관했다. 사용하는 날 아침에 상기 용액을 2리터 백(American McGaw)중에 소정의 농도로 제제화하고 4℃로 유지한 후 사용했다.

각 백에서 10㎖ 샘플을 주입액의 바닥으로부터 취하고, 질소 함량을 분석하기 위해 -20℃에서 보관했다. 추가의 10㎖ 샘플을 후술한 바와 같이 pH 4.75로 조절하고 GLN 함량 분석을 위해 냉동 보관했다.

[실시예 3]

[샘플의 제조 및 분석]

총 혈액의 혈장 샘플을 동이 부피의 얼음 냉각된 10%(w/v) 과염소산과 혼합하여 탈단백질화한 후 20분 동안 4℃에서 3,000rpm으로 원심분리했다. 상청액의 2㎖ 양을 0.2M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.90) 0.2㎖ 로 완충시키고, 5N 수산화 칼륨을 첨가하여 pH4.75-4.90으로 조절했으며, 증류수로 최종 부피 4㎖를 맞추었다. 상기 샘플은 -20℃에서 보관한 후 런드(Lund) 방법(In: Bergmeyer(ed.) Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 4, Academic Press, 1974, pp 1719-1722)을 변형시킨 효소 미세형광 분석법을 사용하여 GLN과 글루타메이트 농도를 배치(batch)분석하였다.

근육 생검 과정중, 조직은 제거하자마자 스톱 워치(stop watch)를 작동시켰다. 근육에서 지방과 결합조직을 제거하고 2개의 동등하지 않은 부분으로 나누었다. 2개의 샘플은 2분에 걸쳐 4회 이상 중량을 재었다. 그리고, 상기 생검의 중량과 부검 시간을 기록했다. 시간 0에서의 실제 근육 습윤 중량은, 시간에 대해 플롯한 중량의 최적 피트(fit) 선형 회귀법으로부터 계산했다. 더 작은 샘플(약 15㎎)은 90℃ 오븐에서 일정 중량으로 건조시킨 후 석유 에테르 중에서 추출하여 지방이 제거된 고체의 건조 중량을 수득했다. 그 후 상기 샘플을 1N 질산 250㎕로 연마하고 반-자동 적정기(Radiometer, Coperhagen)를 사용하여 질산은으로 적정함으로써 염화물 함량을 측정했다. 혈장 염화물도 정량했으며, 세포내 및 세포외물의 양은 베르그스톰 등의 방법(전술함)으로 계산했다. 두 번째 근육 샘플(약 100㎎)을 얼음 냉각된 0.5㎖의 과염소산(10% w/v)중에서 폴리트론 균질기(뉴욕 웨스트베리, 브링크만)를 사용하여 균질화하였다. 상기 균질물을 원심 분리하여 상청액을 효소 GLN 및 글루타메이트 분석을 위해 준비했다.

본 연구의 초반에, 혈장 및 세포내 GLN 및 글루타메이트 농도를 전술한 효소법으로 측정했다(Muhlbacher et al., American Journal of Physiology 247: E75-E83 (1984)). 다른 아미노산의 농도는 O-프탈알데히드로 예비-컬럼유도화 이후에 자동화 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정했다. GLN, 글루타메이트, 프롤린,시스테인 및 리신을 제외하고 단백질내에서 공통적으로 발견되는 모든 아미노산을 정량햇다. 연구가 진행됨에 따라, HPLC를 사용한 GLN-글루타메이트 측정 기법이 발전했다. 2가지 방법(효소법과 HPLC)로 측정된 샘츨은 유사한 글루타민-글루타메이트 농도를 나타냈으며; 따라서, HPLC 분석만이 이후의 연구에 사용되었다. 동맥 및 정맥 샘플중의 PAH 농도는 5% 트리클로로아세트산으로 탈단백질화한 후 분광 광도계로 측정하였다(상기 문헌, Muhlbacher 등).

24시간의 주입과정중 배출된 뇨를 밀폐된 뇨수거 시스템 중에서 수거하고, 산성화한 냉장 용기에 보관햇다. 배치식 분석을 위해 상기 분량을 -20℃에서 동결하여 보관했다. 주입용액 및 뇨중의 질소함량은, 마크로-켈달(macro-kjeldahl) 방법으로 동일한 배치중에서 측정했다(피터스, 외., Quantitative Clinical Chemistry, Vol. II, Williams Wilkins, Baltimore, MD, 1932, pp 516-538).

표준 통계용 팩키지(Minitab, 펜실베니아, 펜실베이나 주립 대학, State college, PA, 1983)를 사용한 IBM 4341 컴퓨터로 통계적인 계산을 하였다. 결과는 평균 ±SEM으로 표시했다. 적절한 테스트로 페어(paired) 및 비-페어(unpaired) 스튜던츠(student's) t-시험을 사용했다. 분산값을 분석하여 여러 그룹의 비교시 사용했다. 최소 방격법(least squares)을 사용하여 회귀(Regression)분석을 실시했다. 0.312g의 질소/24시간/㎏을 투여받은 그룹의 샘플 사이즈가 작기 때문에, 대부분의 통계 비교는 다른 그룹간에서만 실시했다.

체후부(Hindquarter) 혈류는 전술한 바(상기 문헌, Muhlbacher 등)에 따라 계산했으며, 그 속도는 동물의 크기 차이 때문에 체중 1㎏ 당으로 표시했다. 아미노산 유속(flux rate)을 혈류량 및 동맥-정맥 농도차의 곱으로 계산했다. 3셋트의 샘플을 취하고, 각 셋트마다 유량을 계산하여 3값의 평균을 결정했다(상기 문헌, Muhlbacher 등). 전체 혈액, 혈장 및 세퍼내 물중의 총 아미노산 질소 양은, 각 아미노산의 질소함량을 계산하고 개별적인 농도를 합함으로써 계산할 수 있었다.

[실시예 4]

[혈장 및 세포내 아미노산 농도]

혈장 아미노산 농도는 수술이전과, 표준 수술이후 24시간 지났을 때 측정했다. 생리식염수-처치 동물에 있어서, 혈장중의 총 질소함량은 수술 과정중 변하지 않았다(표 1). GLN 농도는 일정하게 유지되었지만, BCAA 농도는 상승했으며, 그 농도의 합은 326±21μmol/ℓ로부터 501±9μmol/ℓ(p0.01)까지 증가했다. 0.624g N/24hr/㎏을 투여받은 동물의 경우, 혈장 질소 농도는 상승하는 경향이 있으며 이 상승 경향은 아미노산 + GLN혼합물을 투여받은 그룹에서만 통계적으로 유의성이 있었다. 이 그룹에서는 혈장 GLN 농도도 상승하였다. 아미노산을 주입받은 모든 동물에 있어서 BCAA의 농도는 상승했다.

골격근의 질소 함량은 생리식염수 주입 동안에 경감했다.(표 2). 총 아미노산 질소에 있어서 이러한 감소 현상은, GLN이 21.48±3.21μmol/ℓ 세포내물로부터 15.86±3.80μmol/ℓ(p0.05)로 감소하는 것에 의해 주로 반영된다. 비필수 아미노산의 농도 합이 감소할지라도, 세포내푸울의 총 필수아미노산의 합은 변하지 않고 유지되었다. 0.624g의 아미노산 질소/24hr/㎏을 투여받은 동물의 경우 세포내 질소 또는 GLN의 변화는 없었다(표 2). 아미노산 다량 주입으로 세포내의 BCAA's 농도가 증가하는 경향이 있지만, 통계적으로 유의성 있는 변화는 아미노산과 GLN의 혼합물을 투여한 동물에서만 나타났다. 수술 이후 상기 2그룹에서의 필수 및 비필수 아미노산의 총 농도에 유의성 있는 변화가 없었다. 고용량의 질소를 주입한 동물과는 대조적으로, 0.312g N/24hr/㎏을 주입한 5마리의 동물은 상기 주입된 용액과 상관없이 골격근 세포내 질소 푸울이 일정하게 유지되지 않았다. 상기 동물줄 세 마리는 세포내의 GLN이 감소했으며, 한 마리에서는 일정하게 유지되었고, 나머지 한 마리에서는 증가했다(데이터는 제시안함).

따라서, GLN 존재와 무관하게 아미노산 혼합물로서 0.624g N/24hr/㎏의 아미노산을 투여하면, 골격근 세포내 아미노산 푸울을 유지할 수 있었다. 세포내 GLN의 감소로 특징화되는 세포내 푸울의 감소는, 생리식염수를 투여받은 동물에서는 일정하게 발생하며 아미노산을 소량 투여받은 동물의 경우 가변적이었다.

각 아미노산의 질소 유량의 합으로 계산된, 순수한(net) 체후부 아미노산 유량은, 생리식염수를 투여한 동물에 있어서 수술후 6시간 경과시 측정했을 때 평균 -19.05±4.06μmol N/분/㎏이었다. 이것은 0.624g의 아미노산/24시간/㎏을 투여한 2그룹의 동물에 있어서 관찰된 유출 속도 -7.70±5.9 및 -6.50±1.18μmol N/분/㎏ 보다 유의성 있게 높았다(표 3). 그러나, 체후부(hindquarter)로부터의 GLN 유출량은 상기 3그룹 중에서 변화가 없었다. 대조적으로, BCAA's는 생리식염수만을 투여한 개의 경우 방출되었으나 다량의 아미노산을 투여한 2그룹의 동물에 있어서는 흡수되었다. BCAA's의 체후부 교환은 BCAA 투여속도와 관련된 것으로 나타났다; 상기 체후부는 생리식염수 처리 그룹에서는 BCAA 방출을, 아미노산 +GLN을 함유한 용액으로 처리한 그룹에서는 균형, 및 최대량의 BCAA를 투여한 그룹에 있어서 더 많은 흡수를 나타냈다. 0.312g N/24hr/㎏을 투여한 5마리 동물은, 생리식염수-처리 그룹의 개에 비해 체후부의 질소 유출에 있어서 큰 변화가 없었다. 그러나 상기의 유출 데이터 중에는 상당히 큰 편차가 있었으며, 실험 동물의 수가 적었다. 수술 24시간 후 체후부의 아미노산 유출에 대한 연구는 그룹간에 차이가 없는 것으로 나타났다(표 3).

생리식염수를 주입한 5마리 동물에 있어서 질소 배출은 0.492±0.022g N/24hr/㎏ 이었다. 시판중인 아미노산 혼합물을 최고 투여량으로 투여한 6마리 동물에 있어서, 측정된 질소 섭취량은 0.632±0.001g N/24hr/㎏ 이었고, 질소 배출량은 평균 0.684±0.031g N/24hr/㎏이었다(표 4). 시판중인 아미노산 용액 1/2과 GLN 1/2로 구성된 용액을 투여한 6마리 동물의 경우, 질소 섭취량은 유사하였지만 배출량은 증가했으며, 평균 0.775±0.019g N/24hr/㎏(p0.05)이었다. 이들 2그룹의 질소 균형은 생리식염수를 투여한 동물의 경우보다 현저하게 덜 음성적(negative)이었으며, 각각 평균 -0.052±0.031 및 -0.140±0.022g N/24hr/㎏이었다. 약 0.312g N/24hr/㎏을 투여한 5마리 동물의 경우, 평균 질소 배출량은, 생리식염수를 투여한 대조군과 다량의 질소를 주입한 동물의 평균 질소 배출량들의 중간 값이었다. 이를 고려해 볼 때 이러한 연구는 질소 투여량이 증가 할수록 질소 균형은 평형에 도달하게 됨을 나타냈다(제1도). GLN을 시판용 GLN-결핍(free) 아미노산 용액과 혼합하였을 때, 질소 균형에 대한 효과가 부가되었다. 결론적으로, 시판용 아미노산 또는 GLN의 단독 주입액에 반응하여 보유되는 질소량은, 상기 용액이 혼합되었을 때 보유되는 질소량을 설명해준다.

상기의 연구에 의하면, 세포내의 골격근 유리 아미노산 푸울이 감소된 것과 관련하여 체후부로부터의 아미노산 유출량 증가 및 음성(negative)질소 균형이 입증하듯이, 개에 있어서 수술 스트레스는 순수한 골격근 단백질 분해를 촉진한다는 것을 알았다. 종래의 연구에서는 단백질 소모가 단식이나 마취와 관련된 것이 아니라 명백하게 수술 스트레스에 대한 반응이라는 것을 입증했었다(카다피아, 외., surgical Forum 33: 19-21 (1982)). 생리식염수-처치 그룹에 있어서 수술 6시간 경과후 체후부로부터의 아미노산 방출은, 기본 환경하에서 연구된, 장기간 카테터를 꽂은 후-흡수성(absorptive) 개에서 관찰된 것의 약 6 내지 8배 였다(뮬베허, 외., American Journal of Physiology 247: E75-E83 (1984)). 이러한 체후부의 질소 배출률은 세포내 유리 아미노산 푸울(pool)의 소모에 의한 것으로 설명할 수 없으며 따라서 순수한 골격근 단백질 분해에 의한 것이어야 한다.

수술 과정중 아미노산 제공은 질소 손실을 보충하고 혈장 아미노산 농도를 유지하거나 증가시키며, 골격근 세포내 유리 아미노산 푸울의 감소를 줄인다. 이러한 효과는 아미노산 질소 주입 양과 관련된 것으로 나타났다. 아미노산을 최대량으로 투여하면 신체 전부 및 체후부의 질소 손실을 크게 감소시키며, 또한 GLN과 기타 아미노산의 세포내 푸울을 유지했다. 이러한 결과는 아스카나찌 등에 의해 보고된 발견과는 상이하며(Askanazi et al., Annals of Surgery 191: 465 (1980)), 아스카나지는 둔부 교체(replacement)이후 환자에 있어서 GLN과 기타 아미노산의 세포내 농도가 감소했으며 이는 덱스트로즈와 아미노산의 주입에 의해 회복될 수 없었다고 기술했었다. 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 결과는, 이러한 초기 발견이 주입된 아미노산의 양 및/또는 주입액중의 GLN의 결핍과 관련이 있을 것이라는 사실을 제시한다. GLN 단독이나 FreAmine으로서 저농도의 아미노산 주입액(0.312g N/24hr/㎏)은 실험한 5마리 동물중 3마리에서 세포내 아미노산 푸울을 유지할 수 없었다. 대조적으로, 다량의 아미노산 주입은, 세포내 아미노산 푸울을 안정화시키거나 증가시켰다. 따라서, 질소의 충분한 투여량은 수술 후 골격근의 세포내 아미노산 푸울을 유지할 수 있는 것으로 나타났다.

생리식염수를 주입한 동물에 있어서, GLN의 급속한 감소가 주된 원인인 세포내 유리 아미노산 푸울의 변화는, 충분한 질소량을 제공했을 대 방지된다. 이 방지 효과는 시판중인 용액중에 GLN이 존재하지 않을 때에도 발생한다. 이들 환경하에서 세포내 GLN을 유지시키는 메카니즘은 불분명하지만, GLN 합성에 대한 GLN 기질이 트랜스아민 반응을 통해 BCAA's로부터 유도될 수도 있다. 설명되지 않는 이유로, 순수한 GLN 유출량은 모든 그룹에서 유사했다. GLN의 체후부에서의 방출은, BCAA's에 의해 촉진되지 않거나 아미노산 용액중의 GLN 제공에 의해 감소되었다. 이러한 수술후 모델에 있어서의 결과는 정상 인체에 있어서의 BCAA's의 보고된 영향과는 상이하며, 정상 개체에 있어서 루신(leucine)을 경구투여한 후 BCAA 전완(forearm) 흡수량은 증가된 GLN 방출과 관련이 있었다(Aoki et al., Journal of Clinical Investigation 65: 1522 (1981)).

0.624g N/24hr/㎏의 속도로 투여된 2가지 아미노산 용액 조성물에 있어서 큰 차이가 있었지만, 체후부 질소 유출량은 2그룹의 동물에 있어서 유사했다. 이런 현상은, 균형화된 용액중의 BCAA's와 필수 아미노산 양이 GLN-함유 용액의 경우보다 2배 일지라도 가능했다. 따라서, 이러한 수술 스트레스의 실험 모델의 경우, 균형화된 아미노산 제제의 GLN 보충은 체후부 손실량을 줄이는데 있어서는 적어도 2배 농도의 표준 균형화 제제 만큼 효과적이었다.

생리식염수를 투여한 개의 경우, 골격근으로부터 BCAA's가 방출되었다. 상기 데이터로부터 계산된 정량적인 전이(transfer)률은 초기의 수술후 기간중, 내장 기관(가장 가능하게는, 간)에서 BCAA's가 현저하게 흡수되어야 한다는 것을 나타냈다. BCAA's의 제공은, 아마도 내장의 필요량을 충족시키고 골격근 유출량을 전환시킴으로써 상기 전위(translocation)를 보충할 수 있을 것으로 나타났다. 또한 체후부 질소 균형과 세포내 질소 푸울(pool)보유량 간에 정량적인 관계가 존재했다. 세포내 푸울이 유지되는 경우, 상기 체후부는 질소 평형에 가까웠으며; 생리식염수를 투여했을때, 세포내 푸울중의 아미노산 농도는 현저하게 소모되었으며, 체후부 질소의 큰 손실이 있었다. 골격근 단백질 분해와 유리 아미노산 푸울중의 질소농도간의 관계는 알려지지 않았지만, 상기 데이터는, 골격근 질소 균형이 세포내 아미노산 농도와 관련이 있으며, GLN은 신체내의 항상성 균형을 유지하는데 필수적인 역할을 할 수 있음을 나타낸다.

[실시예 5]

BCAA 흡수 및 근육 유리 아미노산 농도로 수술후 근육 질소 균형을 예측한다.

골격근 및 신체 전반의 단백질 이화작용을 경감시키는데 BCAA 주입이 유효한지를 조사하기 위해, 본 연구에서는 여러 농도의 BCAA를 함유한 아미노산 제제를 표준 개복수술 및 복막뒤의 절개 수술을 받는 3그룹의 개에게 수술전에 투여했다. 4번째 그룹은 생리식염수만 투여했다. 체후부 유출기법을 사용하여 개별적 및 전체 아미노산 질소 교환 속도를 측정하고 골격근 단백질 이화작용을 평가하는데 사용했다. 세포내 유리 아미노산 농도는 경피 근육 생검 샘플로 측정했다. 본 연구는 개에 있어서 표준화된 외과적 수술에 따른 골격근 아미노산 대사의 조절에 대한, 각종 농도의 BCAA's를 함유한 아미노산 용액을 정맥내 투여했을 때의 효과에 초점을 맞춘것이다. 수술하고 처음 24시간 동안 혈장 및 골격근 내의 유리 아미노산 농도 및 체후부 아미노산 유출량을 측정함으로써, BCAA's와 기타 아미노산의 주입에 대한 항-이화작용 반응을 평가하는 것이 가능했다.

[A. 재료 및 방법]

[1. 동물의 준비 및 시험 순서]

27마리의 수컷 및 임신중의 아닌 암컷의 잡종 개를, 기생충이 검색되고 컨디쇼닝된 상태에서 사육하는 농장으로부터 입수했다. 체중 18 내지 40㎏의 개를 골라서 실험하기 전에 적어도 1주일 동안 하버드 메디칼 스쿨 동물 보호 시설에서 사육했다. 모든 방법은 하버드 의대의 동물 위원회의 안내서 및 실험용 동물 리소스(Resources) 인스티튜트의 실험용 동물 보호 및 사용 위원회(The National Research Council, 전술함)의 안내서에 따라 실시했다. 상기 동물은 개별적인 개사육장에서 24시간 동안 광에 노출시켜 유지시키고 매일 아침에 운동을 시켰다. 물은 임의로 제공했으며 1일 1회씩 Pro-Pet Respond 2000 건조된 개 먹이(Syracuse, New York, 중량당 25% 이상의 단백질)를 오후 1:00시 내지 3:00시 사이에 제공했다. 이 동물들은 실험 이전에 파블로프 슬링(Pavlov Sling)에서 조용히 휴식을 취하게 했다.

기본 연구 또는 수술하기 전날 오후 5:00시에 개 사육장에서 모든 음식물을 제거했다. 동물들을 운동시키고 슬링에 누인 후 기본 연구는 오전 8:00시에 실시했다. 이 연구는 캐뉼러를 꽂은 앞다리 정맥으로부터 혈액 샘플을 수거하여 혈장 아미노산을 측정하고, 티오펜탈나트륨(Abbott, North Chicago, Illinois, 5㎎/㎏ 체중, IV)의 마취 하에 경피 주사로 측면 광근의 생검을 실시하여 세포내 유리 아미노산을 정량했다. 생검이후, 개가 여전히 마취상태에 있을 때, 5㎖의 동맥혈 샘플을 대퇴부동맥의 경피 천자로 취하여 전체 혈액 아미노산을 분석했다.

3일간 동물을 회복시킨 후 추가 실험을 실시했다. 수술하는 날 오전 7:00시에(하룻밤 동안 단식시킴), 동물을 운동시키고 수술실로 데려가 앞다리 캐뉼러를 통해 펜토바비탈 나트륨(Abbott, North Chicago, Illinois, 30㎎/㎏ 체중 IV)으로 마취시켰다. 기관내 튜브를 배치하고 동물이 실내 공기와 산소(5ℓ/분으로 공급)의 혼합물을 자발적으로 호흡하게 한다. 개를 수술대 위에 반듯이 뒤로 누운 자세로 위치시키고, 16-Fr 카테터를 외부 경정맥을 통해 상대정맥으로 경피적으로 배치했다. 개시 시점을 기록한 후, 생리식염수나 적당한 시험 아미노산 용액을 IMED 펌프(San Diego, California)를 사용해 이 중앙 카테터를 통해 주입했다. 세팔로틴(Lilly, Indianapolis, Indiana 1g, IV)을 수술 직전 및 완료시 투여했다. 방광에 카테터를 꽂고, 잔류한 뇨는 버린 후, 밀폐된 배액(drainage)수거를 주입 개시 시점에 시작하여 24시간 동안 실시했다. 또한 IV 주입의 종결 이후 대 사용 케이지에 있는 동물로부터, 두 번째 24시간 동안 뇨를 수거했다.

개의 복부 및 옆구리를 면도하고, 비누와 물로 씻은 후 포비돈 요오드 용액으로 소독했다. 동물을 멸균 시트로 덮고, 암컷의 경우는 배꼽 아래 중간 절개선을 통해, 수컷의 경우 오른쪽 중간부 절개선을 통해 복부에 공동부를 만들었다. 장을 한쪽으로 들어가게 하고, 원위 대동맥과 하대 정맥 주변을 완전히 절개하기 위해 복막 후강을 노출시켰다. 오른쪽의 내부 장골 동맥 뿐만 아니라 오른쪽의 깊은 만곡 장골 동맥 및 정맥을 분리했다. 상기 2개의 동맥을 2.8㎜ O.D. 폴리에틸렌튜브에 연결된 6㎝ 분절의 폴리에틸렌 튜브(2.08㎜ O.D.)로 이루어진 특별히 제조한 카테터로 캐뉼러화 시켰다. 하나의 동맥 카테터는 만곡 장골 동맥을 통해 대동맥에 6㎝ 가까이 배치하고 다른 카테터는 대동맥 분기에 1㎝ 인접하지만 내부 장골 동맥을 통해 미측 장간막 동맥의 원위부에 배치하였다. 세 번째의 카테터는 깊은 만곡 장골 정맥을 통해 하대 정맥으로 삽입했으며 신장 정맥의 원위부에 배치했다. 모든 카테터를 고정시키고, 우측 옆구리의 자상을 통해 외부와 연결되었다. 복부를 층으로 덮고 이 동물을 왼쪽 측부로 돌려놓았다. 외부의 카테터를 적당한 길이로 절단하고 무딘 바늘로 메우고, 간헐적인 주사 포트(Jelco, Critikon, Tampa, Florida)로 마개를 한 후 생리식염수로 씻어내고, 헤파린(100μU/㎖)을 채워서 피하에 찔러 넣었다.

주사 포트는, 경피 천자에 의해 동맥(대동맥) 및 정맥(대정맥) 혈관에 쉽게 접근할 수 있도록 옆구리(늑골과 장골 사이)의 윗부분에 배치된다.

통상 2시간이 소요되는 상기 과정후 동물을 그 측부로 위치시키고 마취로부터의 회복 동안에 담요로 체온을 유지시켰다. 주입액 주입 및 수술 개시 후 5시간 뒤에 상기 동물을 파블로프 슬링내에 위치시키고, 하버드 펌프를 사용하여 0.5%의 파라-아미노-히푸레이트(PAH) 용액을 원위 대동맥 카테터내로 0.7㎖/분의 속도로 주입했다. 염료 주입후 40분 뒤 부터 10분 간격으로 3세트의 동맥 및 정맥 샘플을 동시에 얻어서 아미노산 및 PAH 농도 측정에 사용했다. 이어서 카테터를 세척한 후 헤파린으로 채웠다. 상기 동물을 일정한 감시기구 하에 슬링내에 유지시키고 주입액의 주입 개시 후 24시간 후에 체후부 유츨 연구를 반복하였다. 이 시점에서, 처음의 24시간의 요(urine)의 수거가 종결되었다. 그 후 간단하게 일반적으로 마취시키고 생검이 실시되지 않은 다른 다리에서 경피 하지(hind limb)생검을 반복했다. 그 후 주사액의 주입이 종결되고, 상기 동물을 대사 작용 케이지내에서 다시 24시간 동안 위치시켰다.

[2. 주입 용액]

모든 용액은 4㎖/분/㎏의 속도로 주입되었다. 5마리의 대조군 동물에는 0/9% 생리식염수를 공급했다. 3개의 서로 다른 농도의 BCAA(전체 아미노산에 대해 11%, 22% 또는 44%)를 함유하는 아미노산 용액(표 5)은, 8.5% 표준 아미노산 제제, 프레아민 III(캘리포니아, 어빈 소재 American McGaw에서 시판)에 아미노산을 첨가하여 제조했다. BCAA 의 총 주입 속도는 각각 0.46, 0.92 및 1.84g/24 시간/㎏이었다. 3개의 아미노산 용액은 질소량이 동일한 것으로서 발린:류신:이소류신=1:1.38:1.05의 일정 비율로 약 0.624g/24시간/㎏의 질소를 공급한다. 2.13% 프레아민 III에 비필수 아미노산(NEAA)의 혼합물을 용해시켜 제조한 11% BCAA 용액(0.624g 질소/24시간/㎏을 공급하는 용액)을 9마리의 동물에게 투여했다. 또 6마리에게는 L-GLN만으로 구성된 NEAA가 주입되었으며, 3마리에게는 프레아민 III에서 발견되는 모든 NEAA(알라닌, 글리신, 아르기닌, 히스티딘, 세린 및 프롤린)의 혼합물이 프레아민 III에서와 동일한 비율로 구성된 NEAA가 주입되었다. 또 6마리의 동물에게는 4.25% 프레아민 III(22% BCAA)가 단독으로 공급되었다. 마지막으로, 7마리의 동물에게는 44% 용액을 만들기 위해 BCAA가 충분히 보충된 2.13% 프레아민 III가 공급되었다. 상기 마지막 제제는 L-GLN만 존재하는 NEAA(n=4) 또는 프레아민 III에서 발견되는 NEAA의 혼합물(n=3)을 첨가함으로써 등질소용액이 된다. 모든 용액은 0.22μM 필터(메사츄세츠, 밀리스 소재 Millipore에서 시판)를 통과시켜 멸균하고 4℃에서 밤새 보관한 후 투여에 사용했다. 주입기간 말기에 각 용액세어 10㎖ 샘플을 취하여 -20℃에서 보관하여 두었다가 마크로-켈다알 방법에 의한 질소 분석에 이용했다.

[3. 혈액, 조직, 요 샘플의 제조 및 분석]

총 혈액 및 혈장 샘플에 동일 부피의 빙냉한 10% 과염소산(PCA)을 첨가하여 탈단백질화한 후, 4℃에서 7000rpm으로 20분간 원심분리했다. 상청액의 2㎖ 부분액을 0.2M의 아세트산나트륨 완충액(pH=4.90) 0.3㎖로 완충하고 5N의 수산화칼륨으로 pH를 4.75-4.90으로 조절한 후 최종 부피가 4㎖이 되도록 증류수를 첨가하고 다시 원심분리했다. 이후에 배치 분석을 실시하기 위해 생성된 상청액을 -20℃에서 보관했다.

근육 생검 과정중, 조직을 제거하면서 스톱워치를 작동시켰다. 근육에서 지방과 결합 조직을 제거하고 2개의 동등하지 않은 부분으로 나누었다. 각 샘플의 중량은 15초 간격으로 1분간 기록했는데, 이 때 초기(0초)의 습윤근육 중량은 시간에 대해 플롯한 중량의 최적 피트 선형 회귀법으로부터 계산했다. 구 샘플중 소량의 것(약 15-20㎎)은 90℃의 오븐에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨 수 석유 에테르 중에서 추출하여 지방이 제거된 고체의 건조 중량을 얻었다. 이어서 상기 샘플을 1N 질산(250㎖)에 침지시킨 후 반자동화 적정기(코펜하겐 소재 Radiometer)를 이용하여 질산은으로 적정함으로써 염화물 함량을 측정했다. 혈장의 염화물도 유사한 방법에 의해 측정되었다. 세포내부 및 세포외부의 물의 양은 전술한 바와 같이 염화물 방법을 이용하여 계산했다. 두 번째 근육 샐픔(약 80-100㎎)은 중량을 측정한 후 폴리트론 균질기(뉴욕, 웨스트베리 소재 Brinkmann에서 입수)를 이용하여 빙냉한 PCA 0.5㎖내에서 균질화시켰다. 혈액 및 혈장 샘플에 대해 전술한 것과 같이 균질액을 원심분리한 후 상청액에 완충용액을 첨가하고 pH를 4.75-4.90으로 조절하여 상청액을 분석을 위해 준비했다.

전혈, 혈장 및 근육의 세포내 GLN 및 글루타메이트의 농도는, Lund 방법(상기 문헌)에서 변형된 효소적 미세형광분석 방법에 의해, 또는 0-프탈알데히드로 예비-컬럼 유도화 후 자동화된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(Smith 등, J. Liq. Chromatog, 8:1783-1795 (1985))로 측정했다. 상기 두 방법은 서로 필적할만한 결과를 산출했다. 프롤린, 시스틴 및 리신을 제외한 다른 아미노산은 유사한 HPLC 방법에 의해 측정했다. 동맥 및 정맥 혈과내의 PAH 농도는, 혈액을 5% 트리클로로아세트산으로 탈단백질화 시킨 후 분광 광도법에 의해 측정했다(Muhlbacher 등, Am. J. Physiol. 247: E75-E83 (184)).

용액의 주입이 진행되는 24시간 동안 분비된 요는, 밀폐된 뇨 수거 시스템중에서 수거하고, 산성화된 냉장 용기내에서 보관했다. 마크로-켈다알법에 의한 질소의 배치 분석을 위해 상기 분량을 -20℃에서 냉동 보관했다(Peters 등, In: Quantitative Clinical Chemistry. 제II권, 516-538, Williams 및 Williams (1932)). 또다른 부분은 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 냉동시켜 두었다가 나중에 테크니콘 자동 분석기(뉴욕, 테리타운 소재)상에서 우레아 및 크레아티닌의 분석에 사용했다.

[4. 계산 및 통계학적 분석]

체후부의 혈류량은 전술한 바와 같이 계산했다(Muhlbacher, F. 등, 상기 문헌). 각각의 아미노산에 대한 유속은 혈류량 및 동정맥간의 농도차의 곱으로서 계산했다. 각 시간대별로 3세트의 샘플을 취하고, 각 세트에 대한 유량을 계산한 후 3값의 평균값을 결정했다. 혈장, 전혈 및 전체 아미노산의 질소 유량 및 세포내 질소 농도를, 측정된 아미노산 전체의 질소균에 대한 합(mmole)으로써 측정했다. 골격근 세포내 유리 아미노산 농도는 세포내 물 1ℓ에 대한 값으로 표현했다.

통계학적 계산은 표준 통계용 팩키지(Minitab, 펜실베니아, 스테이트 칼리지, 펜실베니아 주립대학, 1983)를 사용하여 실시했다. 계산된 결과는 평균 ±SEM으로 표현했다. 적절한 테스트로 양측(paired) 및 단측(unpaired) 스튜던츠 t-test를 사용했다. 분산 분석은 여러 군을 비교함으로써 실시했으며 회귀 분석은 최소 제곱법을 이용하여 실시했다.

[B. 결과]

시험에 이용된 개들중 1마리는 펜토바비탈나트륨을 투여한 직후에 주사액을 정맥내로 주입하기 전에 죽었으며 그외 나머지 동물들을 수술 과정후에도 생존하였다. 죽은 동물은 본 연구에 포함시키지 않았다. 수술 과정중 손실된 혈액은 모두 최소량이었다. 모든 샘플의 카테터는 6시간애 및 24시간대에서 사용했으며 예외로 22% BCAA 군에서는 동물에게 24시간 대에 정맥 카테터 하나만을 삽입했다.

생리식염수 대조군에서 6시간대의 체후부의 혈류량은 36.1±6.8㎖/분/㎏이었으며 이는 일련의 처치에 의해 별로 영향을 받지 않았다(11% BCAA, 33.3±4.9; 22% BCAA, 42.4±8.8; 44% BCAA, 28.7±3.5; 유의성있는 차이가 없음). 각각에 대한 24시간대에서의 유량도 변화가 없었다(각각 57.9±10.2, 38.6±8.2; 54.9±6.5; 49.7±13.2). 24시간대에 있어서 유속이 높아지는 경향 및 변이성의 증가는 마취 회복 후 동물의 운동성 증가를 야기시킬 수 있다.

[1. 요질소 배설 및 질소 균형]

수술후, 배설된 요의 부피는 4개의 처치군에서 서로 비슷했으나, 다만 생리식염수만을 공급한 개에서는 요의 부피가 다소 적게 배설되었다(표 6). 생리식염수군에서 요질소 배설량의 평균치는 0.492±0.20g/24시간/㎏이었다. 아미노산으로 처리된 동물군은 생리식염수군에 비해 35-65% 과량의 질소를, 주로 우레아의 형태로 배설했다. 22% BCAA 용액이 주입된 개는, 11% 또는 44% BCAA로 처리된 군에 비해 유의성있게 적은 우레아 질소 및 총질소량을 배설했다. 크레아티닌 및 암모니아의 배설량은 모든 군에서 서로 비슷하게 나타났다.

모든 군으로부터 선택된 동물에게 수술을 실시하기 전 및 수술후 24시간 뒤에 혈액 우레아 질소 및 혈장 크레아티닌을 측정했다. 수술전에 측정된 이들 농도들은 모든 동물에서 정상이었으며 수술후에는 약간 감소하거나 또는 아무런 변화가 나타나지 않는 것도 있었다. 따라서 우레아의 요배설율은 우레아 생성률과 유사하다. 11% 및 44% BCAA용액을 투여받은 동물에서 관찰된 높은 우레아 생성은, 균형을 이루고 있는 아미노산 혼합물에 BCAA 또는 NEAA를 첨가함으로써 제공된 여분의 질소와 유의성 있게(p0.05) 관련되어 있다.

질소균형은 아미노산 투여로 인해 덜 음성적이 되었다. 즉, 주입된 아미노산 질소의 약 50는 유지되었다. 아미노산이 투여된 모든 동물에 있어서 질소의 섭취량은 동일했으므려, 이미 논의되었던 질소 배설량에 있어서의 변화는 질소 균형에 의해 반영된다(표 6). 따라서 22%로 균형된 아미노산 용액이 투여된 동물은 11% 또는 44% BCAA를 함유하는 용액이 투여된 개에 비해 유의성 있게 높은 질소량을 보유할 수 있는 것으로 나타났다.

[2. 전혈의 아미노산 농도]

생리식염수로 처치된 동물에 있어서 전혈 아미노산의 질소는 수술후 6시간대에 그 농도가 감소되었으나 수술후 24시간 대에는 수술전의 수준으로 정상 회복 되었다(표 7). 이 기간 중 필수아미노산의 일부(트레오닌 및 타이로신)가 유의성 있게 감소되긴 하지만, 상기와 같은 일시적 저아미노산 혈증 현상은 주로 비필수 아미노산(글루타민, 알라닌, 아르기닌, 세린 및 아스파라긴) 농도의 감소에 의해 야기되는 것이다. 이와는 대조적으로 아미노산 주입액이 공급된 동물은 수술후 6시간 대에는 전혈 아미노산의 질소 농도가 그대로 유지되었으며 이 농도는 수술후 24시간 대에는 수술전의 대조군 농도 이상으로 증가되었다(p0.05).

아미노산 주입액이 공급된 동물의 혈액내의 특정 아미노산의 농도는 주입된 용액의 조성을 반영하는 것이다. 예를 들어, BCAA 농도는 수술후 6시간대 및 24시간대에서의 BCAA 투여율에 관련된 것이다(제2도). 일반적으로, 수술후 6시간 대에서 전혈 GLN 농도는 수술전 농도 보다 낮게 나타났다(표 7). 그 예외는 GLN이 풍부한 11% BCAA 용액이 공급된 군이었는데, 이 군의 혈액 GLN 농도는 그대로 유지되었다. 이러한 동물에 있어서 GLN은 비필수 질소의 절반 이상을 구성하며 전달된 총 아미노산의 40% 이사을 차지하였다. GLN이 함유된 주입액을 공급받은 동물의 수술후 24시간 대의 GLN 농도는 정상 개체의 전혈 GLN 농도 보다 높은 경향을 나타내었다.

[3. 골격근 세포내의 유리 아미노산]

생리식염수로 처치된 동물에 있어서 세포내 유리 아미노산의 질소는 수술후 24시간이 경과하면 수술전의 농도와 비교하여 유의성 있게 감소되었다(표 8). 이러한 변화는 주로(65%) 세포내 총 유리 아미노산 푸울의 대부분을 차지하는 세포내 GLN이 두드러지게 감소하기 때문이다. GLN이 없는 11% BCAA용액이 공급된 동물에 있어서 비록 세포내 GLN은 감소되었지만, 아미노산 주입액이 공급된 동물에 잇어서 세포내 질소는 그대로 유지되었다. GLN이 풍부한 용액이 공급된 동물에 있어서 세포내 GLN은 증가하는 경향을 나타내었으며 BCAA 농도는BCAA 주입율에 비례하여 증가되었다.

[4. 체후부 아미노산 유량]

생리식염수 처치된 동물에 있어서, 수술후 6시간 뒤에 체후부로부터 아미노산 질소의 순수(net) 방출이 있었다(표 9). 아미노산 유출이 증가한 것은 BCAA를 비롯하여, 측정된 거의 모든 아미노산의 방출이 가속화되었음을 반영하는 것이다. 이 기간중 체후부중에서 균형을 유지하는 아미노산을 글루타메이트 및 아스파르테이트뿐이었다. 수술후 24시간 대에 체후부 아미노산 질소의 방출율은 매우 다양하게 나타나긴 했지만 감소되었으며, 거의 모든 아미노산에 대해 정동맥간의 차이는 거의 없었다. GLN 유출은 이 시점에서도 지속되었다.

아미노산 주입액이 공급된 모든 군에 있어서, 6시간 대의 체후부 아미노산 질소의 유출은 서로 유사하게 나타났으며 생리식염수로 처치된 동물에 비해 유의성 있게 낮은 것으로 나타났다(p0.05). 6시간 대의 GLN 및 알라닌 유출은 둘다 생리식염수 대조군에 비해 아미노산이 공급된 동물에 있어서 더 적은 것으로 나타났다. 생리식염수가 주입된 동물에 있어서는 6시간 대에 BCAA가 방출되는 반면 아미노산 주입액이 공급된 개에 있어서 이들 아미노산은 흡수되었다. 체후부에서의 BCAA 흡수율은 BCAA 투여율(제3도) 및 총 BCAA 농도(제4도)와 연관되어 있다.

24시간 대에, 체후부 아미노산 질소의 유출은 아미노산이 주입된 모든 군에서 유사하게 나타났으며 6시간대와 비교시 변화되지 않았다. 24시간 대에 체후부의 BCAA교환율은 약간 양성이었으며, 22% 및 44% BCAA 군의 경우에 더 높은 것으로 나타났다. 이 시점에서 BCAA 흡수율은 혈액 농도 및 BCAA 투여율과 연관이 없는 것으로 나타났다.

[5. BCAA 주입, BCAA 체후부 흡수 및 체후부 아미노산 질소 방출 사이의 관계]

생리식염수가 주입된 개에 있어서, 6시간 대의 체후부 BCAA 방출은 아미노산 유출이 가속화된 것과 관련이 있었다. 아미노산 주입액이 공급된 동물에 있어서 체후부의 질소 균형은 BCAA흡수와 상관 관계가 있다(제5도). 생리식염수 대조군에는 질소가 공급되지 않았으므로 대조군은 이러한 분석에 포함시키지 않았다. 만약, 대조군 동물을 포함시키게 되면 희귀선의 기울기는 좀더 큰 양성으로 나타날 것이다. 비록 BCAA유량을 체후부 아미노산 질소 유량의 합계에 포함시키지 않더라도 상기 상관 관계는 그대로 유지되었다(p0.02, r=0.49). 따라서 BCAA 유량이 제외된 질소 유량도 BCAA 흡수와 연관이 있는 것이다. 질소 유량은 혈액 내에 존재하는 BCAA 전체의 농도 또는 BCAA 투여율과는 무관하다. 24시간 대에는 이들 관계의 어떠한 것도 존재하지 않았다.

6시간 대에 측정된 체후부 아미노산 질소의 방출은, 세포내 유리 아미노산 질소 푸울에 있어서의 변화와 상호 연관되어 있다(제6도). 세포내 GLN에 있어서의 변화는 전체 유리 아미노산 질소 푸울에 있어서의 변화와 밀접하게 관련되어 있으며(p0.001, r=0.90) 따라서 GLN 푸울에 있어서의 변화도 체후부의 질소 유출과 유의성 있게 관련되어 있다(p0.05; r=0.66). 체후부 아미노산 질소의 유출이 세포내 질소 푸울에 있어서의 변화에 대하여 보정되었을 때 이러한 수학적 상관 관계는 그대로 유지되었다.

유량 및 푸울의 측정은 서로 다른 시간대에서 이루어진 것이므로 본 발명자들은 세포내 아미노산 푸울에 있어서의 2가지 다른 변화율을 가정함으로써 이러한 보정을 행했다. 우선, 세포내 푸울에 있어서 변화가 수술 후 처음 6시간내에 일어났다고 가정했다. 대안적으로, 24시간에 걸쳐 일정한 속도로 변화가 일어났다고 가정했다. 2가지 경우 모두 세포내 질소 푸울의 변화와 아미노산 질소 유출사이의 상관 관계가 상기 보정에 의해 변하지 않았다.

6시간 또는 24시간 대에 있어서, 체후부로부터 GLN의 방출이 증가된 것은 BCAA 흡수와는 관련이 없다. BCAA 흡수는, 또 골격근의 세포내 유리 아미노산 푸울에서 일어나는 변화와도 관련이 없다(r=0.11, 유의성 없음). 체후부의 질소 유량은 예견될 수 있는 것이며 6시간 대의 BCAA 유량 및 유리 아미노산 질소 푸울에 있어서의 변화를 이용함으로써, 체후부 질소 유량의 데이터에 있어서 변이성은 대부분 설명될 수 있다. 이러한 연관 관계는 하기 식에 의해 표시될 수 있다.

y=-9.58+0.27X1+3.02X2

상기 식에서,

y=6시간 대의 아미노산 질소 유량(μmol/분/㎏)

X1=6시간 대의 BCAA 유량(μmol/분/㎏)

X2=골격근의 세포내 유리 아미노산 질소의 변화(수술후-수술전, mmol/L/24시간)

n=22, p0.05, r=0.86

[C. 토의 사항]

마취된 개에 있어서의 표준화된 개복수술은, 심하게 아픈 사람에서 발견되는 많은 이화 반응을 야기시키는 것으로 나타났다. 질소의 뇨 배설에 의해 측정된 바와 같이 몸 전체의 단백질 이화 작용은 증가된다. 생리식염수가 공급된 대조군 동물은 수술후 처음 24시간 동안 약 12-15g의 질소를 배설했다. 이 모델에서 수행된 종래의 연구에 의하면 질소 균형은, 음식물의 섭취에도 불구하고 수술 과정후 3일 동안 음성인 것으로 나타났다(Kapadia 등, Surg, Forum 33: 19-21(1982)). 이와는 대조적으로, 쌍으로 급식되고 허위-수술된(pair-fed sham-operated) 동물은 수술 후 첫날에 질소평형에 도달했다. 수술후 6시간 대에 체후부에서 방출되는 전체 아미노산 질소의 양이 밤새 절식시킨 대조군 동물에서의 상응하는 양의 6내지 8배인 것은, 요를 통한 질소 손실의 증가와 일치한다(Muhlbacher등, 상기 문헌). 혈액 및 골격근 아미노산 농도의 감소와 같이 생리식염수로 처치된 개에 있어서의 다른 변화들은, 사람에 있어서 이화 상태 동안 보고된 변화와 유사하다(Askanazi 등, Ann. Surg. 192: 78-85(1980)). 개를 이용한 상기 모델은 심하게 아픈 사람에 있어서의 변화와 유사한 수술후의 반응을 나타내는데, 이는 질소 대사 및 골격근 아미노산 교환에 미치는 외인성 아미노산의 효과를 조사하기에 적합하다.

생리식염수로 처치된 동물에 있어서, 체후부에서의 아미노산 질소 방출은 수술 후 6시간 동안 크게 증가되었다. 이는 골격근에 있어서의 순수한 BCAA의 방출과 연관된 것이다. 동시에, 전혈의 BCAA 농도는 변하지 않았는데 이는 내장 기관에서의 BCAA 소모가 골격근에 있어서의 가속화된 방출율과 거의 동일함을 나타내는 것이다. 아미노산을 공급 받은 동물에 있어서 체후부의 전체 아미노산 방출율을 감소되었지만 전혈 및 골격근의 질소 푸울은 그대로 유지되었으며 체후부는 BCAA가 방출되는 기관으로부터 이를 흡수하는 기관으로 전환되었다. BCAA 의 흡수, 좀더 상세히 언급하자면 류신의 흡수는 골격근에 있어서 GLN의 방출이 증가된 것과는 무관하다.

이 연구는 골격근의 아미노산 방출은 입증하는 것이며 따라서 근단백질의 순수한 대사회전(turnover)은 2개의 독립적 측정(골격근 혈관층을 통한 BCAA 유속 및 골격근 유리 아미노산 푸울에서의 질소 농도)으로부터 예견할 수 있다. GLN은 유리 푸울에서 가장 풍부한 아미노산이므로 이의 농도 변화는 전체 푸울에 있어서의 큰 변화를 초래한다. 결국, 유리 GLN에 있어서의 변화는, 전체의 유리 아미노산의 변화 뿐 아니라 근육의 질소 균형을 예고하는 것이다.

[실시예 6]

[장 절제후 소장에 대한 글루타민-농후 경구 음식물의 효과]

[A. 소개]

부분 절제후 소장의 보상 생장은 장(bowel)벽의 전층에 걸쳐 이루어지지만, 융모과다 형성에 의한 것이 지배적이다. 융모높이 및 음와(crypt)깊이의 증가는 장의 잔존 조직의 팽창 및 신장을 수반한다(Williamson, R. C. N., N. Engl. J. Med., 298: 1393-1444(1978)). 소장 절제에 이어 적응하기 위한 형태 및 기능 변화가 일어난다. 경구 섭취는 장 절제후 점막과다 형성의 조절에 있어서 중요한 자극인자인 것으로 판명되었다(Levine et al., Dig. Dis 21: 542-545(1976)). 루미날(Luminal) 영양분은 정상적인 점막 성장을 유지하는데 중요하며, 소장 절제후 경구 섭취가 유지되지 않으면 남은 장관의 중량이 감소하고 형성이 부진하게 된다. 소장 절제후 장이 짧아진 환자들은 비경구 영양수액에 의해 영양 공급을 받으며, 그들의 생존은 남은 장관계의 적응능력에 달려 있다. 원소형 식이제제와 비경구 영양분을 이용함으로써, 충분한 시간 동안 장관의 적응력을 발육시키고 완전한 경구 섭취가 가능하도록 서서히 회복시킬 수 있다(Weser, E. Gasgroenterology 71; 146-150 (1976)).

GLN은 장세포의 중요한 영양 공급원료로서, 장에 의한 이것의 이용도는 외과 수술 스트레스 후에 증가하는 것으로 보인다(Souba, W. W., et al., Surgery 94: 342(1983)).

GLN은 국소 영양 인자로서 작용하여 장관 형성 부전증이 나타날 때 점막성장을 촉진시킨다.

본 연구의 목적은 부분절제를 통해 전신적 스트레스와 장내 점막형성부전증에 대한 자극을 모두 받은 생체내 실험 모델에 있어서 GLN 보충 음식물이 소장 점막 세포의 성장에 미치는 효과를 시험하는데 있었다.

[B. 재료 및 방법]

[1. 동물의 준비]

챠알스 리버 브리딩 레보러토리스, 인코오포레이티드(Charles River Breeding Laboratories, Inc.)로부터 구입한 체중 175-200g의 수컷 위스타 랫트를 5일 동안 실험실의 환경에 적응시켰다. 이들 랫트는 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하고 퓨리나(Purina Chow) 음식물을 공급하였다. 이들을 각각 별도의 케이지에 가두고 격일로 체중을 달았다. 환경에 적응된 후, 정상적으로 체중이 증가된 랫트를 무작위로 4개의 군으로 나누었다.

연구 첫째날, 랫트에 펜토바르비탈(50㎎/㎏)을 복강내(i.p/) 주사하여 마취시켰다. 중심선을 절개하여 복부를 개복하고 트레이츠 인대로부터 희맹판까지의 소장 전체를 꺼내어 늘어남이 없도록 하면서 전체 길이를 흑색의 긴 실로 2회 측정하였다. 2회 측정 결과의 평균치를 구하였다.

트레이츠 인대에서 5㎝ 떨어진 지점에서 시작하여 람버트법(Surgery of the Digestive System of the Rat, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, pp 32-35, 413-416 (1965))에 의해 소장의 2/3를 절제하였다. 절제부 가장 자리를 끝과 끝을 연결하여 6-0 프롤렌으로 봉합시켰다. 장을 복강내에 다시 집어 넣고 복벽을 2-0 프롤렌으로 봉합시켰다. 대조군에 대해서는 트레이츠 인대에서 5㎝ 떨어진 지점에서 시작하여 측정한 총길이의 2/3의 소장을 원위부에서 횡단절제한 후 다시 봉합하여 허위(sham) 수술을 실시하였다. 이들 동물을 대사케이지에 분리시켜 가두고, 수술한 날부터 시작하여 적당량의 탄수화물, 지질, 아미노산, 비타민 및 염분이 포함된 대조군용 균형 음식물(GLN 없음), 또는 비필수아미노산 일부를 GLN으로 대체한 것을 제외하고는 동일한 GLN-보강 음식물(GLN 존재)을 쌍으로 경구섭취시켰다. GLN 함량은 아미노산의 0 또는 25%이었으며, 이것은 GLN이 아미노산의 ~5% 정도 차지하는 정상 규정식과 비교되는 것이다.

[2. 글루타민-보강 음식물의 제조]

규정된 경구 음식물은 427㎈/100g을 함유하며 0.2%(w/w)의 콜린 클로라이드, 10%의 옥수수 기름, 46.9%의 덱스트린-화이트, 23.4%의 수크로스, 5%의 염 혼합물, 0.5%의 비타민 혼합물을 포함하였다. 2개의 음식물은 7.17%의 총필수아미노산과 6.83%의 총 비필수아미노산을 포함하여 14%의 아미노산으로 구성되었다. GLN이 결핍된 음식물(GLN 없음)은 알라닌, 아스파라긴, 아스파르틴산, 프롤린 및 세린을 각각 0.937% 씩 함유하였다. GLN-농후 음식물(GLN 존재)은 상기 아미노산들 0.237% 씩과 3.5%의 GLN을 함유하였다. 즉, GLN은 +GLN 음식물중에서 총 아미노산의 25%였고 비필수아미노산의 51%였다.

[3. 조직의 제조]

규정식 공급 7일 후, 랫트를 치사시켰다. 이들을 펜토바르비탈(50㎎/㎏)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 복부를 개복하고 흉강까지 절개하였다. 혈액 암모니아와 혈장 GLN 농도를 측정하기 위해 우심실 천자를 이용하여 5㎖의 혈액을 채취하였다. 혈액 채취 직후 장관을 꺼내었다. 장막에 가깝도록 유지하면서 장간막을 조심스럽게 분리하여 소장 전체를 분리해내었다. 분리된 소장을 4.5gm의 고정된 장력하에 매달아 놓고 9개의 점을 찍었다. 장관을 절제한 랫트에 있어서, 근위 공장과 원위 십이지장을 나타내는, 봉합부 근위부쪽의 5, 10 및 12.5㎝ 지점과, 봉합부에 근접해 있는 나머지 근위 회장을 나타내는, 봉합부 원위부쪽의 2, 5 및 10㎝ 지점과, 나머지 원위 회장을 나타내는, 회맹판 근위부쪽의 5, 10 및 15㎝ 지점을 장관을 통과하는 직선형 핀으로 표시하였다. 장관을 6개의 분절로 분리하였다. 허위 수술을 한 군의 랫트에서는, 트레이츠 인대 원위부쪽으로 1㎝ 떨어진 지점으로부터 인접한 2개의 분절을 표시하고 위쪽으로 측정하였다. 분절 1a, 2a 및 3a를 차가운 염수로 세정하고 10% 완충 포르말린중에 4시간 동안 담가둔 후, 고정시키기 위해 70% 에탄올로 옮겨넣었다. 분절 1b, 2b 및 3b는 차가운 염수로 세정하고, 그들의 내강(lumen)을 개방시킨 후 습윤 중량을 평량하였다. 장관 분절을 5㎖의 차가운 염수에 옮겨 넣고 예리한 가위로 잘게 썰었다. 폴리트론 균질화기(Brinkman Instruments, Westbury, NY)로 15초 동안씩 2회 균질화시켜 균질물을 얻은 후, 초음파기(Heat System Laboratories, Plainview, NY)에 의해 30초 동안 2로 고정된 파워에서 초음파처리하였다. DNA 및 단백질 분석을 위해 생리식염수 균질물을 -30℃에서 보관하였다.

[4. 분석 방법]

장관 균질물에 대하여 로우리법에 의해 총 단백질량은 분석하였다. 버튼법(Biochem 62: 315-323 (1965))에 따라 DNA를 측정하였다. 조직 단편을 파라핀에 담그고, 헤마토크실린과 에오신으로 염색시킨 후, 40X 배율의 광현미경으로 조사하였다. 잘 배향된 길고 완전한 융모 20개를 선별하여 접안경 마이크로미터로 점막 두께와 융모 길이를 측정한 후, 평균치를 구하였다. 40X 배율 현미경시야내의 중심 수평선에 있는 장관의 융모수를 계산하였다.

[C. 결과]

처음 5일 동안, 음식 소비량이 10gm/일에서 15gm/일로 점차 증가하였으며, 그 후 음식 섭취량은 일정하게 유지되었다. 쌍으로 음식물이 공급된 동물들에서 2가지의 음식물의 섭취량이 동일함에도 불구하고, 2군의 체중 증가율은 수술직후에 서로 달랐다. 대조 동물군에서는, 수술 후 처음 3일 동안은 체중이 일정하게 유지된 후에 5mg/일의 비율로 선형 증가하였다. GLN이 투여된 동물군에서는, 지체기가 없이 수술 후 첫날 부터 바로 5gm/일씩 연속해서 체중이 증가하였다. 수술 후 2일째 및 3일째에서는 대조군에 비해 GLN이 투여된 군이 체중이 유의성있게 높았다(p0.05). 비록 2개의 음식물로 인해 동물군에서 체중이 동일한 속도로 증가하였지만, 수술 후 8일 동안 GLN이 투여된 군에서 더 높은 체중이 유지되었다(32.0±2.8 대 23.7±3.7g 누적 체중증가량, p0.03). 사체 분석 결과 체중 증가는 수분의 체내 누적(71±1%(+GLN 공급군)대 73±1%(-GLN 대조군))에 의한 것이 아니라 야윈 몸체에 대한 GLN의 효과 때문인 것으로 나타났다. 수술 후 처음 3일 동안의 음식물중의 GLN 농도와 체중 변화와의 상관관계를, 다른 동물들을 이용하여 연구하였다. 최대 성장 효과를 얻는 데에는 음식물 아미노산의 약 25%가 GLN으로서 요구되었다.

25% GLN-보충된 음식물에 의한 체중 증가는 공장 및 회장의 나머지 분절들의 중량 증가와 연관이 있었다. 수술 후 3일째에, GLN 공급군에서는 소장 조직 총중량이 3.55±0.16g이었으며 대조 동물군에서는 2.97±0.10g이었다(p0.05). 수술 후 8일째에, 소장 중량은 각각 3.30±0.23g 및 2.81±0.16g이었다(p0.05). 장의 중량증가는 GLN 보충 음식물에 의한 총체중변화의 5%만 차지하는 것으로 나타났는 바, GLN 공급 효과가 장에 미치기는 하지만, 장에만 한정되는 것은 아니다.

공장과 회장의 세포질을, DNA 함량을 측정하고 조직을 정량 분석하여 보다 직접적으로 평가하였다(표 10). GLN을 공급하면, 공장의 DNA 함량은 수술 후 3일째에 현저히 증가하였으며 회장의 경우는 수술 후 3일과 8일째에 모두 DNA 함량이 현저히 증가하였다. 수술하지 않은 대조 동물군에 비해 절제 후 영양학적으로 충분한 GLN-보충 원소형 식이제제를 공급한 군의 경우에, 수술 후 3일째에 공장 DNA 함량이 1㎝당 54% 증가하였다. 이와 같은 충분한 과다형성 현상은, 음식물중의 GLN을 비필수 아미노산의 균형 혼합물로 대체하는 경우에는 거의 절반으로 감소하였다. 점막 두께의 조직학적 측정 결과는, DNA함량에 대한 조사 결과와 일반적으로 일치하였다(표 10). GLN 보충 음식물을 공급하면, 공장과 회장에서의 평균 융모길이의 증가는 수술 후 3일과 8일째에 명백했다. 이러한 반응은 융모에만 한정되는 것이며, 음와깊이 또는 점막 하부 근육층의 두께에 대해서는 GLN의 효과가 없었다.

수술 후 3일 및 8일째에 3㎝의 공장 분절을 절취하여 균질화시키고 DNA함량을 분석하였다(Burton, K., et al., Biochem. J. 62: 315(1956)). 절제를 하지 않은 동일 연령의 동물에 있어서, 공장의 DNA 함량은 -350μg/㎝이었다. 동일한 동물로부터 공장과 회장의 분절을 부가로 절취하여 10% 완충 포르말린 중에서 고정시키고, 에탄올로 탈수시킨 후 파라핀에 담그었다. 10μ의 횡단면으로 절단하고 헤마토크실린과 에오신으로 염색하였다. 부호화된 슬라이드상에서 맹검 방법으로, 배향성이 우수하고 잘 보존된 융모 15개(3개의 슬라이드로 슬라이드당 5개씩)을 사용하여 접안경 마이크로미터가 부착된 현미경으로 융모 길이, 음와 깊이 및 근육층 두께를 측정하였다. 데이터는 9 내지 12상에 대하여 평균 ±SEM으로 나타냈다.

-GLN=0% 글루타민, +GLN=25% 글루타민, p0.05, p0.01,

단측(unpaired) t- 시험에 의한 +GLN 대 -GLN.

융모 길이에 대한 GLN의 효과는, GLN이 아미노산 총 중량의 25%이고, 즉 음식물중의 비필수아미노산의 51%일 때에 최대이었다. 더 낮은 농도에서는, 공장 및 회장에 대해 일관된 효과가 나타나지 않았다. GLN 함량을 31.25%로 증가시키고 다른 비필수아미노산을 더 감소시켰을 때, 장관 점막에 대한 영양학적 효과가 감소되었다. 이것은 GLN을 수용하기 위해 음식물의 아미노산 조성이 크게 변화하여 다른 아미노산이 제한되었기 때문에 일어나는 결과이다. 총 아미노산중 25%를 GLN으로서 공급한 경우에 혈장 GLN 농도의 증가가 적당하면서도 현저하였다(800±40 대 654±48 μM(3일째) 및 751±22 대 676±21 μM(8일째)). 혈장글루타민산 또는 암모니아 농도는 증가되지 않았다. 즉, GLN이 총 아미노산의 25%인 음식물을 공급하는 경우에, 수술 후 급속하게 체중이 증가하고 장관점막이 과다 형성되었으며, GLN 과다, 또는 암모니아 또는 글루타민산과 같은 GLN 대사의 최종 산물이 누적되는 일이 없었다.

영양 공급이 필요한 환자에게 충분량의 장내 영양분을 공급하기가 어려운 경우도 종종 있기 때문에, 특히 질병의 진행 과정이 위장관과 상당히 현관되어 있는 경우, 본 발명자들은 영양학적으로 불충분한 음식물의 하나의 성분으로서 공급된 GLN의 효과를 평가하였다. 랫트의 장관 60%를 절제한 후 대조용 음식물 또는 GLN-보충 음식물을 쌍으로 투여했는데, GLN 보충 음식물은 총칼로리가 50% 적은 것을 제외하고는 완전 음식물과 동일한, 충분량의 아미노산, 비타민 및 염분류를 포함했다. 칼로리가 제한된 음식물을 7일간 공급한 후, GLN-투여군에서 체중이 약간 증가하긴 하였으나, 2개의 군에서 체중 변화는 거의 없었다. 칼로리제한에도 불구하고, 장관점막에 대한 GLN의 현저한 효과는 여전히 명백하게 나타났다(표 11). 수술 후 7일째에, 점막 습윤 중량은 대조용 군에 비해 GLN-투여군에서는 공장에서 35%, 회장에서 40% 증가하였다. 점막 DNA 함량은 각각 48% 및 32% 증가하였다.이와 같은 점막 세포질의 측정 결과는 정량적 조직 분석에 의해 확인되었으며, 이것은 공장 및 회장의 점막 두께의 일관적인 증가를 입증해 주는 것이다. 칼로리가 부족한 상태를 유지시키더라도, 음식물중의 GLN은 그것의 영양학적 효과를 나타냈으며, 장관점막의 성장을 특이적으로 뒷박침했다.

표 10의 주해 부분에서 설명한 바와 같이 장관 분절을 절취하여 분석하였다. 데이터는 장관의 부분 절제 7일 후의 10 쌍의 시험 동물에 대한 평균 ±SEM으로 나타낸다. -GLN=0% 글루타민, +GLN=25% GLN; p0.05, p0.01, p0.001,단측(unpaired) t- 시험에 의한 +GLN 대 -GLN.

GLN의 효과는 GLN을 정맥내로 공급하였을 경우에도 나타났다. 랫트를, 장관의 부분 절제 후 7일 동안 랫트의 최적 성장을 유지하도록 설계된 GLN이 없는 제제를 사용하여 고 영양 수액(TPN)으로반 유지시켰을 때(Popp. M. B., et al., Am J. Clin. Nutr. 36: 1119(1982)), 융모 길이는 공장에서는 감소하였으며 회장에서는 변함 없이 유지되었다(표 12). 즉, 소장의 부분 절제에 의한 영양적 자극 효과는, 위장관의 내강으로부터 음식물을 제거한 결과와 상쇄되었다(Levine, G.M., et al., Gastroenterology 67: 975 (1974)). 비필수아미노산 성분의 일부(총 아미노산의 25%) 대신에 TPN 제제에 GLN을 첨가함으로써 절제후의 과다 형성반응이 다시 나타났다(표 12).

데이타는 9쌍의 동물에 대한 평균 ±SEM으로 나타낸다. -GLN=0% 글루타민, +GLN=23% 글루타민. p0.05, p0.001, 단측(unpaired) t-시험에 의한 +GLN 대 -GLN. p0.05 Pp0.005, 단측 t-시험에 의한 절제후 대 절제전.

GLN이 없는 TPN 제제에 비해, 융모 길이는 공장과 회장에서 각각 54%와 31% 증가하였다. 이러한 동물 실험 결과와 마찬가지로, 최근의 인체 시험에 있어서 정맥내 음식물에 디펩티드 L-알라닐-L-글루타민을 첨가한 결과 수술 후의 질소 균형이 개선되는 것으로 나타났다(Stehle, P., et al., Lancet i: 231(1989)).

[D. 토의]

GLN-보충 경구 및 정맥내 음식물에 의한 상기 결과는 비필수아미노산인 GLN이 수술 스트레스 및 장관 절제 후에는 필수 영양소가 된다는 가정과 합치되는 것이다. 균형있는 경구 음식물의 한 성분으로서 GLN이 포함되는 경우, GLN은 신체 조직에 대하여 일반적인 동화 작용 또는 항-이화작용을 나타내며, 수술 스트레스와 관련하여 일시적으로 체중이 감소하는 현상을 방지한다. 일반적으로 높은 비율로 GLN을 이용하는 조직이며 스트레스에 반응하여 GLN 추출을 증가시키는 것으로 알려진 장관에서는, 점막에 대한 GLN의 영양학적 효과가 분명히 나타난다. 즉 이 영양학적 효과는 소장의 부분 절제에 대한 반응인 과다성장 반응을 증가시키고, 장세포 집단의 팽창에 부차적인 융모 길이를 증가시킨다. 장관 세포질의 증가는 총 칼로리 섭취량이 불충분한 경우 또는 모든 영양분이 정맥내투여되는 경우에도 일어난다. 이러한 효과의 메카니즘은 밝혀지지 않았다. GLN은 특정한 생화학적 경로에 대해 조절 효과를 가지거나, 연료 또는 생합성 전구체로서 작용하거나, 분비촉진제로서 작용하거나, 또는 이러한 모든 기능들을 수행할 수도 있다. 특정 메카니즘이 무엇이든 간에, 상기 연구 결과 GLN이 장관 점막의 성장을 지지하는데 필요한 성분이라는 것이 입증되었다. 장관 절제 후 체중이 증가하는 것은, GLN이 근육 및 기타 조직에 대해서도 동화 작용을 한다는 사실을 나타내는 것이다. 종합해볼때, 상기 실험 데이터는 GLN이 스트레스 기간중에 조건부로 필수 영양분이라는 가정을 뒷받침 해주는 것이다. GLN의 체내 생성은 불충분하고, 그 결과 혈장 및 조직중의 농도가 감소하고 조직 형태가 변화된다. 외인성 GLN의 공급은 유리 GLN의 농도를 회복시켜 장관 점막과 전체적인 성장에 대한 효과를 포함한 영양학적 반응을 자극한다.

[실시예 7]

[글라타민이 풍부한 비경구 영양수액에 의한 소장 점막의 보호]

비경구영양공급은 소장의 점막을 위축시킨다.(Johnson, L.R., Gastroenterology 68: 1177-1183 (1975)). 이 반응은 위장관 분비 및 영양호르몬의 감소는 물론 장세포 증식에 필요한 특정 영양분의 상대적 결핍과 관련이 있다. GLN은 소장에 있어 주된 산화성 연료이지만 표준 영양수액에는 포함되어 있지 않다. 음식물내 GLN의 영향을 측정하기 위해서, GLN이 다양한 농도로 함유된 영양 수액의 투여에 대한 소장의 반응을 평가하였다.

[A. 재료 및 방법]

환경에 적응시킨 수컷 위스타 랫트(n=42, wt 210-230g)의 경정맥에 카테터를 삽입하고 비구속상태의 동물에 장기 주입을 할 수 있도록 선회 기구를 장착시켰다(Burt, M.E., et al., J. Physiol. 238: H599-603 (1980)). 모든 랫트들은 개별적으로 대사 케이지에 가두고 물을 먹게 하였다. 대조 동물군에는 0.9%의 생리식염수를 주입하고 Purina 쥐먹이를 공급하였다. 3군의 랫트에게는 정맥내 영양 공급을 실시하였다. 모든 영양수액은 질소 함량(0.9g 질소/100㎖)이 동일하고 칼로리(98㎉/100㎖)가 동일하였으며 동일 농도의 필수 아미노산, 비필수아미노산 및 덱스트로스를 함유하였다. 각 수액의 비필수아미노산 성분은 GLN 농도가 0.1 또는 3g/100㎖가 되도록 조절하였다. 영양수액은 48㎖/24시간의 속도로 주입하였다. 배뇨량과 질소 배설량을 매일 측정하였다. 동물을 비경구 영양 공급 7일 후에 치사시키고, GLN과 암모니아 농도를 측정하기 위해서 혈액을 채취하였다. 정해진 장관 부위로부터 전체 두께의 공장 분절과 점막 샘플을 절취하였다. 모든 샘플을 평량하고, 균질화물에 대하여 DNA와 단백질을 분석하였다. 5μm 두께의 조직학적 파라핀 단면을 제조하였다. 공장 융모 길이, 수 및 점막 두께의 측정을 맹검 방법으로 수행하였다.

[B. 결과 및 토의]

경구 영양 공급을 한 대조군과 비교할 때, 정맥내 영양 공급을 받은 모든 랫트에서 습윤 중량, DNA, 단백질 및 융모 길이가 감소하였다(표 13), 혈장 GLN 농도는 GLN-함유 수액을 주입한 후에 증가하였다. 공장 점막 중량은 GLN이 없는 수액을 투여한 랫트와 비교할 때 유의성있게 증가하였다. 전체 두께 공장 중량은 그것의 반응이 통계적으로 유의성은 없었으나, GLN 섭취에 따라 정가하는 경향이 있엇다. 점막 및 전두께의 공장 DNA는 2 및 3%의 농도의 GLN을 주입한 후에 증가하였다. 이러한 변화는 점막 성장의 조직학적 변화를 수반한다. 융모 길이 및 점막 두께는 GLN 투여량에 비례하여 용량 의존적으로 증가한다. 모든 동물들에서 질소 균형이 양성이었으나, 2% GLN 용액을 투여한 랫트들은 시험중 내내 가장 큰 질소 함량을 유지하였다. 영양수액중에 GLN을 공급함으로 인해, 이들 동물이 정맥내 영양 공급을 계속받을 때 공장 점막 중량, DNA 함량 및 융모 길이가 증가한다. 소장의 점막 중량의 증가는 소장 기능을 개선시키고 장내 영양분의 도입을 촉진시킬수 있다. GLN은 현재의 표준 영양수액에는 존재하지 않지만 점막 생장에 필수적인 영양소이다.

[실시예 8]

[5-플루오로우라실로 치료한 후의 글루타민이 보충된 비경구 영양수액의 영향]

글루타민이 보강된 비경구 영양수액이 손상된 장점막의 유지 또는 복구에 유리한지를 판정하기 위해, 글루타민이 보강된 영양수액을 5-FU 투여전 4일 동안 미리 투여하거나, 동물 및 인체의 GI 점막에 대해 현저한 독성을 가지는 화학 치료제인 5-플루오로우라실(5-FU)의 용량을 증가시키면서 투여한 후 글루타민이 보강된 영양수액을 즉시 투여하였다(Muggia 외 다수, 1963; Roche 외 다수, 1970; Bounous 외 다수, 1977; Stanford 외 다수, 1977; Shaw 외 다수, 1979).

[A. 재료 및 방법]

[1. 동물의 준비]

랫트를 상기 실시예 6 및 실시예 7에 기재한 바대로 준비 및 사육하였고, 0 또는 2g GLN/dl를 함유한 비경구 영양수액을 실험군에 대해 무작위적으로 투여하였다.

[2. 5-FU로 유도된 GI 손상 및 글루타민 주입]

랫트에 전술한 바와 같이 카테터를 꽂았고 마취에서 깨어난 후 최소한 3시간 후에 동물군에게 복강내 주사를 통해 100, 150 또는 200㎎/㎏의 5-FU를 투여했다. 대조군에는 0/9%의 생리식염수(5-FU는 0㎎/㎏)를 투여했다. 영양수액 주입은 5-FU 또는 생리식염수의 투여로부터 4시간 후에 시작했으며, 46㎖/24 시간의 속도로 4일동안 계속하였다. 연구(Roche 외 다수, 1970)에 의하면 5-FU로 인한 손상으로부터 점막의 회복은 이단계에서 진행된다는 사실이 밝혀졌고 점막 재생에 대한 글루타민의 효과가 이단계에서 발현될 것으로 여겨지기 때문에 이 시간을 선택한 것이다.

[3. 장내 손상의 유도전 글루타민의 공급]

카테터를 꽂은 후, 랫트에세 12시간동안 반(half)-보강 영양수액을 투여했고 그후의 8일동안 완전 보강 영양수액(0 또는 2g 글루타민/dl)을 투여했다. 5-FU는 비경구적 투여일로부터 4일째에 복강내 투여하였고 그로부터 4일 후에 랫트를 치사시켰다. 5-FU의 1회분 용량(150㎎/㎏)은 사망률을 증가시키지 않고 심각한 장내손상 및 일반적인 불쾌감을 야기하기 때문에 선택되었다. 소변의 질소 배설량은 매일 측정했으며 질소 균형값을 계산했다.

[4. 조직 견본 추출]

혈액 및 장내조직을 견본 추출했으며 상기 실시예들에서 기재돈 바대로 분석 할 수 있도록 준비해 놓았다. 헤모글로빈, 백혈구 및 혈소판수는 다양한 용량의 5-FU의 일반적인 혈액학적 독성의 판정 수단으로서 측정되었다.

[5. 분석 방법 및 통계 방법]

모든 분석은 상기 실시예 6 및 7에 기재된 방식으로 수행하였다. 통계적 분석은 식이요법 및 5-FU의 용량을 비교하는 2-웨이 분산 분석법을 사용하여 수행되었다. 단측(unpaired) t테스트를 사용하여 5-FU 1회 용량에서의 2개의 처리군을 비교했다. 상기 차이는 P값이 0.05 미만일 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 나타났다.

[B. 결과]

[1. 손상 후 비경구 영양공급을 한 효과]

동물에게 5-FU를 주사하고 약 36시간동안은 동물은 일반적으로 양호한 상태이나, 그 후에는 동물들이 무기력해진다. 연구에 동원된 60마리의 동물중 5마리는 기술학상의 이유(작동되지 않는 카테터 또는 주입 펌프의 고장)로 제외시켰으며 6마리는 5-FU 처리로 인해 죽었다(글루타민 공급 군에서 2마리 및 대조군에서 4마리). 분석한 49마리의 쥐중에서, 23마리에는 글루타민을 투여하지 않았으며 나머지 26마리에는 2%의 글루타민을 투여했다.

[a. 장내 지수]

공장의 습윤중량, DNA, 및 단백질은 5-FU의 투여 후에 모두 감소했다. 그러나, 글루타민을 투여하지 않은 대조군과 비교할 때 글루타민을 투여한 동물이 상기 측정치 모두 상당히 높았다: 이 차이는 점막의 중량, DNA 및 단백질에 대한 측정치 보다도 매추 컸다(표 14 및 15). 현미경 조사를 통해 글루타민을 투여한 랫트의 장내 구조의 보존정도를 증명할 수 있었으며, 점막두께 및 융모 길이의 측정치를 반영했다(표 14 및 15).

[b. 혈액학]

5-FU의 모든 용량에서 헤모글로빈 농도가 유지되는 반면에, 사용된 식이요법에 관계없이 약물 처리된 동물은 모두 순환성 백혈구 및 혈소판 수가 상당히 감소하였다(표 14 및 15).

[2. 손상전 비경구 영양공급을 한 효과]

손상 후에 5-FU를 비경구식 영양공급한 랫트와는 대조적으로, 손상전 영양공급한 군에서는 치사율이 상당히 증가하였다: 글루타민을 투여한 군의 12마리중 2마리가 죽었고, 글루타민을 투여하지 않은 군의 12마리 중에서는 6마리가 죽었다. 이 차이는 P=0.06 수준에서만 통계적으로 유의성이 있었다(Fisher exact test).

[a. 장내 지수]

점막의 DNA 및 단백질의 경우와 마찬가지로, 공장 및 점막의 습윤중량은 글루타민을 투여한 동물군의 경우에 상당히 높았으나. DNA 및 단백질, 전체 두께면에서는 두군이 차이가 나지 않았다(표 14 및 15). 조직학 분석을 통해, 글루타민을 투여한 동물의 점막두께 및 융모길이가 증가되었다는 생화학적 발견을 확인했다.

[b. 혈액학]

혈액학 파라미터에서는 양 군사이에서 특별한 차이가 없었다: 식이요법과 무관하게 백혈구 및 혈소판수가 감소되는 반면 헤모글로빈 수는 일정했다(표 14 및 15).

[3. 5-FU 투여 후의 혈장 글루타민 및 아미노산]

글루타민이 식이에 포함되어 있지 않았을 경우에도, 5-FU 투여 후에는 모든 동물의 혈장 글루타민은 증가했다.

장내의 감소된 세포충실도( 및 어느정도는 5-FU로 유도된 신장독성)과 관련하여, 이화성 상태에서 근육으로부터 글루타민의 방출량이 증가된 것이, 혈액의 글루타민 농도가 증가한 원인이 될 것이다.

[4. 질소 균형]

연구의 초기 단계에서 2%의 글루타민을 투여한 동물은 질소 보유량이 증가 되었다. 5-FU를 투여하기 전에 글루타민이 보강된 비경구 영양수액을 투여한 동물에서도 유사한 변화가 나타났다.

매일의 질소균형은 GLN-투여 군에 있어서 투여 6일째까지는 현저히 높았다. 글루타민이 투여되지 않는 랫트의 누적 질소 보유량이 736±149㎎인 것에 비해 2%의 글루타민이 투여된 랫트의 경우에는 1106±85㎎이었다.

[실시예 9]

[방사선, 화학요법, 및 골수 이식 후에 글루타민이 보충된 비경구식 영양 수액의 효과]

이 연구는 전체 몸에 방사선 조사 및/또는 화학요법을 받는 환자에 대해 식이성 글루타민을 공급하면 질소균형을 변화시키고, 임상효과를 향상시키며 전체적 회복을 촉진시키는지늘 판정하기 위해 무작위적 맹검 임상시험을 수행하였다. 연구 대상 집단은 이미 자가 및 동종이계(allogenic) 골수 이식 프록토콜을 받은 환자를 포함한다.

[A. 재료 및 방법]

[1. 환자]

이미 자가 또는 동종이계 골수 이식 처리 프록토콜을 받은 사람들중에서 환자를 선정했다. 이 프록토콜하에 적격인 환자는 1차 완화(동종이계 이식) 단계의 급성 골수성 백혈병(AML), 2차 완화(자가 이식) 단계의 급성 골수성 백혈병, 골수 이형성 증후군, 임파종, 재생 불량성 빈혈 및 만성 골수성 백혈병(CML)을 포함한 다른 백혈병으로 진단된 환자로서 나이는 18세 내지 60세이고 성에는 무관하다. 이 플록토콜에서 환자에게는 비경구식 영약수액을 주입할 필요가 있었고, 주입을 위해 중앙 주입관을 환자에게 설치했다. 이들은 간기능이 정상(전체 빌리루빈양이 3㎎/dl 이하)이고, 신장 기능(크레아티닌이 1.2㎎/dl 이하)이며, 당뇨병은 없는 상태(인슐린 또는 경구식 저혈당제 없이 혈중 글로코즈가 200㎎/dl 이하)이었다. 환자들은 그들 질병의 안정화 상태(예, 완화 상태)에 있었다. 환자들은 그들의 이상적인 체중이하로 체중의 20% 이상이 감소되지는 않았다.

[2. 연구 계획]

환자들은 GLN을 포함한 TPN 제제 또는 표준 TPN 제제의 2개 군으로 무작위로 나누어졌다.

식이는 실험 용액내에는 0.57g 글루타민/㎏체중/일을 포함하고, 표준 제제내에는 글루타민이 포함되지 않은 점을 제외하고는 질소성 및 칼로리가 같았다. 한자, 골수이식하는 외과의사, 및 환자를 돌보는 연구자 도무 처리군과 미처리군이 어느 군인지에 대해 알지 못하는 맹검 실험이었다. 이 계획하에서, 각 개인에 대한 전해질 요구량은 임상 상태에 따라 시간이 경과하면서 달라질 수 있고 의사는 연구자와의 상담 및 영양 공급 서비스에 따른 임상상태 및 혈액농도에 따라 용액중 전해질양을 변화시킬수 있다.

환자는 그들의 주치의의 허락이 있을 경우 전체 연구동안에 경구식 영양분을 임의로 섭취했다. 매일의 경구식 칼로리, 단백질, 지방 및 탄수화물 섭취량을 기록하였다.

맹검 테스트 용액을 투여하는 것은 골수 이식한 날로부터 5일 이내에 시작했다(0일로 언급됨). 초기 평형기간인 3일후에, 다음의 7일동안 모든 소변 및 대변을 각각 24시간 동안 수집했다. 그후의 7일동안은 수집하지 않았으며, 그 다음 7일동안(즉, 이식수술후 약 3주째), 다시 수집했다. 수집은 오후 4시부터 다음 오후 4시까지 수행하는데, 용액 백을 매달고 90 간호진에 의해 투여 하는 시간에 해당한다.

혈액은 글루타민, 글루타메이트, 암모니아, 아미노산, C-반응성 단백질 및 일부민 전구체를 위해 매주 채취했다. 다른 혈액 샘플을 TPN 및 장기(organ) 기능을 모니터하기 위해 주치의들이 채취했다.

환자들은 비-맹검 연구 약사들에 의해 처리군 또는 대조군으로 무작위적으로 분류되었다. 상기 군들은 진단을 위해 균형되게 했으며 1차 완화단계인 AML군의 군들도 역시 처리(몸 전체에 대한 방사선 조사의 존재 또는 부재)에 대해 균형되게 했다.

연구는 환자에게 더 이상 고영양수액이 필요하지 않을 때 종료되었으며, 종료시점은 칼로리 요구량의 평균 50%인 임의의 경구 섭취가 연속적으로 3일인 때이다. 50% 경구 섭취의 세 번째날을 TPN의 종료일로 규정지었다. 모든 경우에서, 환자들은 TPN 필요기간 동안에 맹검 용액의 필요 칼로리 및 단백질의 최소한 60%를 투여받았을 경우에만 최종적 결과 분석중에 포함된다. 만일 환자가 맹검용액중 아무것도 투여박지 않는 채로 5일을 연속적으로 보낸다면 상기 프록토콜에서 그 환자를 실험에서 제외시켰다.

[3. 영양 섭취량]

칼로리 섭취량은 계산된 대사율(신장 및 체중에 기초한)의 1.5배로 정했다. 무단백성 칼로리 섭취량은 약 70%의 덱스트로즈 및 30%의 지방 에멀젼이었다. 단백질 섭취량은 1.5g/㎏/일이었다. 전해질 및 미네랄은 충분한 양으로 첨가하여 혈액 농도를 정상 범위내로 유지시킨다. 비타민은 MV1-12 10㎖/24시간으로 첨가했다. 미량 원소 용액은 Lypho-med 1㎖/24시간으로 첨가했다. TPN용액은 병실 간호원에 의해 오후 4시에서 오후 4시까지의 예정으로 투여했다. 이상적 체중의 20%를 초과하는 환자의 경우에, 칼로리 및 단백질 요구량은 연령 및 성별에 따른 이상적인 체중에 기초했다.

[4. 약물]

모든 약물 및 TPN이 아닌 유체물은 그 환자들의 주치의의 판단에 따라 필요한만큼 환자에게 공급했다. 환자에게 공급된 모든 약물 및 유체물은 기록되었다.

[5. 부가적 측정 방법 및 종말점]

환자들의 신체 조성(TPN 공급전 및 후), 중간팔 근육 크기(처리전 및 후), 손 쥐는 힘(TPN 공급전, 7일째 및 21일째 및 TPN 공급후), 락툴로즈 투과성(7일째, 21일째 및 TPN 공급후), 패혈 증세의 심각도(매주), 이식편 대 숙주 질병, 점막염 정도(일주일에 3회씩), 호전도의 통상적 평가치(TPN 공급 전 및 후)를 측정했다.

측정된 주 종말점으로는 하기(1) 내지 (7)을 포함한다:

(1) 질소 균형(1주째 및 3주째); (2)3-메틸 히스티딘 및 크레아티닌 배설량(1주째 및 3주째중 5 내지 7일 동안 수집한 3개의 소변수치의 평균); (3)CRP(TPN의 처음 4 내지 6주 동안의 평균); (4)신체 조성; (5) 매주의 평균적인 패혈증증세 지수; (6) 매주의 평균 발열 정도 및 매일 최고 체온에 대한 매주 평균, (7) GVH 급의 매주 평균.

측정된 부종말점으로는 하기 (1) 내지 (10)를 포함한다:

(1) 단위 날 수(이식한 시간으로부터, T=0);

(2) 이식한 날로부터 다시 오염된 날까지의 날수;

(3) 약물 복용량, 총 항생 물질 복용량;

(4) 항생제를 투여한 날수, 즉, TPN을 하는 날중에서 공지되었거나 예상된 감염에 대해 환자의 치료법에 첨가된 항생제가 투여된 날만 계수한 날인 항생제날 수;

(5) 백혈구수가 500 이상 및 1,000 이상의 세포수/㎤로 다시 돌아올 때까지의 날수;

(6) 이식후부터 호중구의 절대 수치가 500 세포수/㎤ 이상으로 다시 돌아올 때가지의 날수;

(7) 락툴로즈 투과성, 2개의 균형 연구기간 종료시에 양 경우를 측정한 것;

(8) 수혈된 혈소판 및 적혈구의 단위;

(9) 50%의 경구 섭취 또는 방출까지의 TPN의 날수; 및

(10) 호전 증세 감지.

[B. 결과]

2 환자로부터 얻은 결과는 제7도 및 표 13에 제시한다.

고용량의 글루타민을 함유한 TPN은 이식 수술을 받은 환자의 임상 상태를 현저하게 호전시켰다. 이 처리는 음설징소균형이 증가하는 것을 방지했고, 경구 점막염(화학요법에 의해 주로 유도됨)의 정도를 약화시켰고 하기 3개의 임상기준표에서 평가한 바와 같이 환자의 일반적인 건강을 향상시켰다.

글루타민이 이 부류의 매우 심각한 질병을 앓는 환자의 건강에 완화적 효과를 미치는 것으로 결론이 났다.

1. 환자가 항생제를 투여받은 날수 및 표준 식이요법에 첨가된 부가적인 항생제 수의 생성물.

2. 임상진단을 통해 환자가 이상이 없을 때까지(WBC1000; 발열증세 없음, 용이하게 입을 통해 섭취함, 등) 환자가 보호적 환경(적층 공기-유동 방)중에 유지되는 날 수

3. 오염된 개체(대개 가족 구성원)와 물리적인 접촉이 허용될 따까지 그 동안 환자가 세균이 없는 상태에 유지되는 날수. 이것도 역시 임상 진단이다.

4. 증가하는 심각도에 대해 0 내지 4의 등급으로 매긴 경구점막염의 임상 등급.

[실시예 10]

[외분비 췌장에 대한 글루타민이 보충된 비경구 영양수액의 효과]

고영양 수액(TPN)은, 장위축증, 췌장위축증 및 췌장외분비의 기능부전과 연관이 있다. 최근 연구에 따르면 정맥 수자 공급물에 글루타민을 첨가시킴으로써 TPN 관련 장내 위축증이 감소된다는 것이 증명됐다. 더구나, 종래 연구에서는 표준 아미노산 제제내에 포함되지 않은 굴루타민이 췌장을 위한 바람직한 산화성 연료이라는 것과 외부에서 투여된 글루타민의 대부분이 췌장 외분비 조직에 의해 소모된다는 점을 밝혔다. 그러나, 그루타민이 보충된 정맥 주사 공급물의 췌장에 대한 효과는 보고되지 않았다.

본 연구는 2g/100㎖의 글루타민이 보충된 음식물(글루타민) 또는 글루타민이 없고 질소와 칼로리는 동일한 식이 제제(대조군)의 정맥내 주입이, 실험랫트의 외분이 췌장의 구조 및 조성에 미치는 영향에 대해 조사 연구한 것이다.

[A. 재료 및 방법]

[1. 동물 준비]

실시예 6 내지 8에서 기재한 바와 같이 Wister 종인 수컷 랫트를 사용했다 표준 Purina 랫트 음식물(chow)의 식이요법을 유지하면서 만족할만한 체중 증가를 나타낸 랫트만 연구했다. 처음 실험(n=32)에서, 모든 동물에 대해 60% 중간 공장-회장 절제를 행한 후 경정맥에 카테터를 설치했다. 두 번째 실험(n=24)에서는 동물에게 경정맥 카테터를 설치하고 허위 소장 절제를 했다. 음식물(chow)을 투여받은 동물(n=18)을 참조군으로서 포함시켰다. 이들 수술 과정은 실시예 6에 기재한 바와 같다. 연구에 참가시킨 69마리의 랫트중에서, 음식물 투여군으로분터 제외된 랫트는 없었으나, 카테터 패혈증 때문에 TPN 군으로부터는 13마리의 랫트가 제외됐다.

[2. 연구 프록토콜]

소장의 절제와 상관없이 카테터를 꽂은 후에, 동물들에게 무작위적으로 경구성 표준 랫트 음식물(Chow), 글루타민이 제외된 표준 비경구성 영양 수액(대조군) 또는 2%의 글루타민 보충 용액(Glutamine)을 7일 동안 일정하게 정맥주입으로 투여했다.

랫트의 성장에 필수적인 모든 영양분을 상기 정맥내 식이제제로 주입했다(Popp et al. Amer. J. Clin. Nutr. 36: 1119-1128 (1982)). 상기 용액을 제조하여 멸균 상태를 유지했다. 영양 수액은 칼로리(1.13㎉/㎖), 질소함량(9.6㎎/㎖) 이 동일하고, 비필수 아미노산의 조성에 있어서만 서로 상이했다.

회복 후에, 랫트를 대사 케이지에 각각 집어 넣고 그 주입 카테터를 선회 장치(Imstech labs, Inc.)에 부착시켜 영양수액의 연속적인 주입동안에 랫트의 운동이 제한되지 않게 했다. 외과수술후 처음 16시간 동안, 동물에게 0.9% 생리식염수를 1cc/hr의 속도로 투여하고 경구적 영양섭취는 못하게 했다. 수술후 첫날부터 연구의 마지막 날까지 모든 동물은 수돗물에 자유로이 접근했다. 수술후 1일째에 TPN-제공받은 동물들은 글루코즈의 주입에 적합하도록 대조용 음식물 또는 GLN-보충된 음식물 24㎖를 공급받았다. 수술후 2일째부터 나머지 실험 기간 동안 계속해서 충분한 양(48㎖/일)의 영양 수액을 투여했다. 음식물(chow)을 제공받은 동물은 항상 그들에게 주어진 모든 음식을 다 먹었고, TPN-제공받은 렛트에게 24시간 주입된 칼로리와 칼로리 밀도에 있어서 동일한 양의 음식물을 제공받았다. 이와같이, 음식물(chow)을 제공받은 동물은 처음 24시간 동안은 퓨리나 랫트 음식물(Purina Rat Chow) 8g을 제공받았으며 그후 하루에 16gm씩 공급받았다. 상기 동물의 정맥의 카테터는 수술후 2일째에 폐색했다. 수술 후 2일째부터 시작하여 요를 산성화된 웰내에 매일 모으고, 모든 양을 -20℃에서 산성화된 용기내에 보관했다. 요의 양을 매일 기록했다.

[3. 조직 제조 및 분석 방법]

수술후 8일째 실험이 끝날 때 동물의 중량을 다시 측정하고 펜토바르비탈(45㎎/㎏ i.p.)로 마취하고, 심장으로부터 혈액을 헤파린 처리된 주사기로 뽑았다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 전에 보고된 방법에 따라 이들 샘플에 대해서 전체 혈액 GLN 및 글루타메이트 농도를 측정했다(Smith, R.J. et al., J. Liq. Chromatography 8: 1783-1795 (1985)).

피를 뽑은 후에 췌장의 작은 부분(3×3㎜)을 비장 및 위장 분절의 접합 부분의 분비선의 중간 부위로부터 절제하고, 글루타르알데히드 2.5% 완충 용액에 고정한 후 조직에 대해 처리할 때까지 4℃에서 저장했다. 췌장의 남은 부분을 주의깊게 절제하여 인접 장간막의 지방 및 임파조직으로부터 분리했다. 췌장 절제는 맹검 방법으로 수행했다. 췌장의 중량을 측정하고, 빙냉 증류수로 희석(1:10, 중량/부피)한 후 폴리트론 조직 균질기로 30초동안 균질화했다. 상기 균질물을 30초 동안 초음파 처리하여 -70℃에서 저장하고, DNA, 단백질, 및 효소 함량을 분석했다. 상기 간을 잘라내어, 중량을 측정하고, 72시간 동안 90℃에서 건조시켜서, 건조시킨 중량을 측정했다.

[4. 생화학적 분석]

매일 얻은 요의 양을, 매일의 누적 질소 균형을 평가하기 위해 모았다. 산성화된 요 샘플의 질소 함량은 매크로-켈달법을 사용하여 측정되었다. 췌장 균질물의 단백질 함량은 로우리의 방법에 의해 측정되었고(Lowry, O. H. et al, J. Biol, Chem. 193: 265-275 (1951)), 버톤의 방법을 변형시켜 DNA를 측정했다(Burton, K.A., Biochem. J. 62: 315-322 (1965)). 각각의 췌장 균질물의 일부를 단백질 농도 200μg/㎖가 되도록 0.01% 소 혈청 알부민을 함유하는 완충제로 희석시켰으며, 효소 활성의 측정에 앞서 -20℃에서 저장했다.

희석된 샘플내 아밀라제 활성은 베른펠드의 방법을 변형하여 측정했고(Bernfeld, P., Amylases: α and β, In: Colowick SP, eds. Kaplan NO, Methods of Enzymology, Vol. I. Academic Press, NY, 149-158 (1955)), 트립신 활성은 흄멜의 방법으로 측정되었다(Hummel B.C., Can J. Biochem. Physiol. 37(12): 1393-1399 (1959)). 4시간동안 37℃에서 돼지 엔테로키나아제(enterokinase) 0.0492μg와 함께 샘플 400㎕를 항온 배양하여 트립시노겐을 활성화시켰다. 리파아제(Lipase) 활성은 마우크의 2포인트 속도 방법을 이용하여 코닥 에크타쳄 700 분석기상에 측정되었다(Mauck, J.C. et al., Clin. (1984)). 효소 활성은 분(分)당 생성되는 생성물의 μmole 단위(U)로 표시된다(1KU=103 단위)

[5. 췌장 조직학]

췌장 조직을 2.5% 글루타르알데히드 인산염 완충액내에서 4℃에서 고정시키고, 2시간동안 실온에서 1% 오스뮴 테트록사이드내에 후-고정시켰다. 이후, 조직 표본을 상승하는 도수의 알콜내에서 탈수시키고 아르알다이트(Araldite)내에 넣었다. 1마이크론 두께의 절편을 광학 현미경용 1.0%의 톨루덴블루로 염색시켯다. LKB 노바 한외 마이크로톤을 이용하여 전자 현미경 검사용으로 600-800A의 두께의 절편을 제조했다. 상기 절편들을 초산 우라닐 및 구연산 납으로 염색한 후, 필립수 301-투과 전자현미경(TEM)으로 검사하였다. 아시나르(Acinar)세포를 전자현미경으로 사진을 찍은 후, 2793배 및 7127배로 최종 확대한 것으로부터 인쇄했다.

[6. 데이터 분석]

결과를 평균 ±S.E.M으로 표시한다. 췌장의 습윤중량, DNA, 및 단백질 함량은 전체 췌장 및 체중 100g에 대해 표시된다. 췌장 중량 및 단백질 함량은 또한 세포크기의 지표로서 DNA의 1㎎당으로 계산되었다. 수컷 위스타 랫트(중량 100-300g 사이)의 총 체중과 총 췌장 습윤 중량사이에 직선 관계가 존재하므로, 상기 지표에 대한 그룹들 사이의 비교는 체중에 대해 보정한 후에 비교되는 것이 이상적이다. 췌장의 효소 활성(단위/㎎ 단백질)은 총 분비선(gland) 함량 및 비(specific)활성(단위/㎎ 췌장의 DNA)으로서 표시된다. 효소원(zymogen) 과립의 평균 측면 직경은 웨이벨의 방법에 따라 측정되었다(Weibel, E.R.et al., Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. Vol. 3, ed. M.A. Hayat, Van Nostrand Reinhold, NY (1973)).

2-웨이 분산 분석은 GLN 및 장 절제의 효과를 평가하는데 사용되었다(Winer, B.J., Statistical Principles in Experimental Design (2nd ed.), McGrwHill, NY (1971)). 분산 분석이 중요한 주된 효과를 나타낸다면, GLN-보충 음식물을 제공받은 동물과 그들의 적당한 대조군 사이에 포스트-호크(post-hoc) 비교를 위해 단측(unpaired) t-시험을 이용했다. 음식물(chow)을 제공받은 동물로부터의 자료는, 처리 그룹에서 췌장의 위축 정도를 나타내기 위해서는 포함되었지만, 처리된 모든 효과의 분석에는 포함되지 않았다. 확률(P)치가 0.05 이하일 때는 상기 차이는 통계적으로 유의성이 있다고 여겨진다.

[B. 결과]

[1. 체중, 질소균형 및 혈장 글루타민 및 글루타메이트]

체중 및 질소 균형에 있어서의 변화는 소장 절제와 상관없이 GLN 투여 군과 대조군에 있어서 비슷햇다(표 17). 소장이 절제된 동물에서, 혈장 GLN(1143±75 대 890±41, GLN군 대 대조군, p0.05) 및 혈장 글루타메이트 농도(177±12 대 144±8, GLN군 대 대조군, p0.05)은 대조군과 비교할 때 GLN군쪽이 유의성있게 높다. GLN-제공받은 동물과 대조군동물 사이에 다른 큰 차이점은 관찰되지 않았다.

[2. 췌장의 지표]

TPN-게공 받은 동물은 음식물(chow)을 공급 받은 동물과 비교할 때 췌장의 평균 습윤 중량이 상당히 작았고(33-43%), 단백질(25-58%) 및 DNA(14-30%)도 상당히 작았다(표 18).

장이 절제되지 않은 동물에서, GLN 주입은 대조군과 비교할 때 체중 100g당 증가된 췌장의 중량(22%), DNA(32%) 및 단백질(24%)과 관련되어 있다.

상기 차이는 췌장 중량(p0.05) 및 DNA(p0.005)에 대하여는 각각 유의성이 있었으나, 췌장 단백질(p=0.06)에 대해서는 유의성이 없었다. 상기 동물에서 췌장의 단백질/DNA 및 췌장의 중량/DNA 비율은 유의성있는 차이가 없었다(표 18).

60% 소장 절제된 후 GLN을 공급받은 동물의 췌장은 훨씬 무거워졌으며 (14%, p0.05), 대조군과 비교할 때, 체중 100gm당의 총 췌장의 단백질이 더컸다(31%, p0.05). 비록 단백질/DNA 비율이 GLN 투여 군에서 20% 더 크긴했지만, 총 DNA 함량, 췌장 중량/DNA 및 단백질/DNA 비율은 유의성있게 다르지 않았다.

[3. 췌장의 효소]

TPN-제공받은 동물은 음식물(chow) 제공받은 동물과 비교할 때 총 췌장효소 활성이 감소했다(표 19). 장이 절제된 동물에서, 총 췌장 트립시노겐(p0.005) 및 트립시노겐 비(specific)활성(p0.005)은 대조군과 비교할 때 GLN투여군이 유의성있게 컸다. GLN-제공받은 동물과 대조군 동물사이에서 효소 함량 또는 비(specific)활성은 별다른 차이가 없었다.

[4. 췌장의 조직학 및 울트라구조]

췌장 외분비 조직 및 랑게르한스섬은 광학 현미경으로 관찰하면 모든 동물에서 정상으로 나타났다; GLN-보충된 식이성분을 제공받는 렛트에서 나타난 중량증가 또는 단백질 함량증가를 설명하는 췌장염 또느 부종의 증거는 없다. 장이 절제되지 않고 TPN-제공받은 동물에 대한 효소원(zymogen) 과립의 평균 측면 직경은 음식물(chow)을 제공받은 랫트 보다 유의성있게 작았다(GLN 투여군에 대해 3.88±0.06, 대조군에 대해 3.80±0.05, 및 대조군에 대해 4.69±0.10, 1-웨이 ANOVA로 p0.05); 상기 글루타민군 및 대조군은 유의성있는 차이가 없다. 유사하게 적응시킨 아시나르(acinar) 단위 프로파일일 비교할 때, 세포체적 밀도, 수 또는 효소원과립, 효소원 과립이 차지한 세포체적의 면적%의 증가가 대조군과 비교했을 때 GLN 투여군에서 명백히 나타났다.

[5. 조합된 시리즈로부터의 처리 효과 분석]

GLN 보충된 식이성분을 제공받거나 또는 소장 절제를 실시한 동물은 혈장 GLN(p0.02) 및 글루타메이트(p0.02) 농도가 유의성있게 증가되었다. GLN 주입은 누적적인 질소 균형에 영향을 주지 못했으나, 반면에, 장절제는 유의성있는 음성(-) 효과를 나타낸다. 췌장의 중량(p0.0001), 단백질(p0.002), 및 DNA(p0.004) 함량은 GLN을 제공받은 동물에 있어서 유의성있게 높았으며, 상기 효과는 정절제와는 독립적이다. 장 절제는 총 췌장 단백질의 평균 함량(p0.006) 및 췌장의 단백질/DNA 비율(p0.05)을 유의성있게 감소시켰다.

GLN을 제공받은 동물은 췌장의 트립시노겐(p0.02) 및 리파제 함량(p0.03)이 유의성있게 증가되었다. 상기 총 아밀라제 함량 및 모든 효소의 비(specific) 활성은 GLN 주입에 영향받지 않았다. 장 절제는 트립시노겐, 아밀라제, 및 리파제의 총 함량 및 비(specific) 활성에 심한 음성효과(p0.0001)를 가진다.

결론을 내리면, GLN 보충된 TPN은, 대조용 식이성분을 받은 동물에서 발생하는 췌장의 중량 손실(14-22%), DNA 손실(12-32%) 및 단백질 손실(24-31%)을 상당히 약화시켰다. 전반적으로, GLN 제공받은 동물은 대조군과 비교할 때 총 췌장의 트립시노겐(53%) 및 리파제(30%) 함량이 유의성있게 증가되었으나, 효소 비(specific) 활성의 차이는 없었다. 그러므로, GLN은 TPN을 공급하는 동안 췌장의 외분비 조직에 대해 중요한 영양분이다. 영양분이 정맥내로 공급되는 동안 GLN의 췌장에 대한 영양학적 효과는 중요한 임상적인 의미를 지닌다.

[실시예 11]

글루타민은 장내 원소형 식이 성분이 제공되는 동안 췌장의 위축을 방지한다.

GLN은 췌장에 대해 중요한 호흡연료라는 것이 생체외 실험에서 입증되었으나, 췌장의 구조 및 기능에 대한 GLN-보충된 장내 식이 성분의 역할은 알려져 있지 않다. 수술 스트레스후에 원소형 식이제제 및 GLN-보충된 원소형 식이 제제가 췌장 및 장의 성장에 미치는 효과를 수컷 위스타 랫트(n=25, wt 195-210g)을 사용해서 검사했다. 60%의 미드 공장-회장(midjejunolieal) 절제 및 위루설치후에 랫트는 무작위적으로 음식물(chow), 또는 표준 원소형 식이제제의 연속 주입(CON), 또는 질소량 및 칼로리가 동일한 GLN-보충된 식이제제(GLN) 2gm/100㎖을 투여받는다. 상기 원소형 제제는 비필수적인 질소원에 있어서만 다르다. 요일 매일 모아서 질소 균형을 연구기간 동안에 측정했다. 랫트를 치사시키고 체중을 측정한 후 GLN, 글루타메이트(GLU), 및 암모니아를 분석하기 위해 혈액을 수득하였다. 간, 장 및 췌장을 잘라내어, 중량을 측정하고, DNA 및 단배길 함량을 분석하고, 조직학을 위해 준비했다. 간 및 췌장은 또한 지방 및 효소 함량을 분석했다. 데이터의 일부는 하기 표(20)에서 평균 ±s.e.m으로 표시된다.

원소형 식이 제제를 공급받은 군은 음식물(chow)을 제공받은 동물에 비하여 췌장의 중량이 감소했다. GLN은 CON 군과 비교할 때 췌장 중량의 손실을 유의성있게 감소시키고, 췌장의 단백질 함량을 증가시키며, 간 습윤 중량이 증가하는 것을 방해했다. GLN군 및 CON군에서의 데이터를 모았을 때, 췌장의 중량 및 DNA는 혈장 GLU와 관련이 있었지만(p0.03), GLN 농도와는 관련이 없었다. 체중 및 질소 균형이 GLN군과 CON군 사이에서 유사하므로, GLN의 효과는 수술후의 기간동안 췌장중량의 유지에 대해 특이한 것으로 보인다. 이들 발견은 또한, GLN은 조건부로 수술스트레스를 받은 후 위장관 조직의 필수 영양분이라는 가설을 지지한다.

[실시예 12]

[글루타미-보충된 영양 수액은 5-플로올우라실에 의해 유도된 창자 벽에 대한 손상을 막는다.]

락툴로즈는 위장관에서 거의 흡수되지 않는 비-대사성 당이다. 염증성 장질환과 같은 위장관계병에서, 락툴로즈는 점막의 간극(gap)을 통해 흡수되며, 뇨로 배설된다. 따라서 뇨의 락툴로즈양은 창자 점막 배리어(barrier)를 통한 누출(leakage)의 측정수단이다(Menzies, Biochem. Soc. Trans. 550; 1042-1047 (1974)).

랫트를 상기 실시예 8에서 기재된 바와 같이 5-플루오로우라실로 처리했다. 100㎎/㎏중의 이소-오스몰(iso-osmolar) 용액 2㎖ 락툴로즈를 개비지(gavage)로 주입하고 그후 요를 24시간 동안 모아서 동결시켰다. 요의 락툴로즈를 지에글러 등의 문헌에 기술된 바와 같이 효소적으로 측정했다(Arch. Surg. 123: 1313-1319 (1988)).

5-FU를 1회 주사처리하면 24시간후 락툴로즈에 대한 창자 투과성이 증가된다는 것을 알았다. 상기 증가는 화학제 치료후 24-48시간 사이에서 최고로 높았다. 3일간에 걸쳐서, GLN-보충된 TPN을 받은 동물은 표준 TPN제제를 제공받은 동물과 비교해볼 때 창자 투과성이 유의성있게 감소되었다. 예를 들면, 5-FU 주입후 48-72시간에서, 24시간 동안의 락툴로즈 배설은 GLN-처리된 랫트에서 32μmole에서 17μmole로 감소했다.

결론적으로, GLN은 화학치료제 처리에 수반하는 창자벽 투과성 증가로부터 창자 벽을 보호한다. 상기 효과는 GI루트(route)를 통한 감염을 막는데 중요한 것으로 예견되며, 상기 실시예 9와 같이 골수 이식을 받는 환자들의 회복을 촉진하는데 기여한다.

[실시예 13)

[글루타민은 TPN의 면역억제 효과를 완화시킨다.]

랫트에 상기 실시예 10과 같이 실험 음식물(chow), TPN 또는 GLN-보충된 TPN을 공급한다(Materials and Methods, Sec. 2). 처리 개시후 7일째, 동물을 치사시키고 비장, 흉선, 및 장간막의 임파절을 수득했다. 표준 기술을 사용하여 상기 기관들로부터 세포현탁액을 제조했다(Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Wiley-Interscience, 1982 참조). 유사분열 물질이 존재할 경우, 시험관내에서의 임파구 증식 반응이 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 실시되었다. 음식물(chow) 그룹과 비교할 때, TPN을 1주일하면 임파구 반응성을 50% 만큼 현저히 감소시켰다. 이 억제현상은 비경구 용액내에 GLN이 존재하면 없어지는데, GLN 처리된 랫트는 TPN 투여 동물과 대조군인 음식물(chow)-제공받은 랫트 사이의 가운데에 존재하는 임파구 반응성을 나타낸다.

그러므로, 비경구 영양수액내에 GLN이 존재하면, GLN이 없는 TPN을 투여하는 경우에 일어나는 면역억제 상태를 유의성있게 완화시킨다. 상기 실시예 12여하는 경우에 일어나는 면역억제 상태를 유의성있게 완화시킨다. 상기 실시예 12에 기재된 바와 같이 창자 점막 배리어의 분해는 면역기능 손상과 조합되어, TPN 제제로 유지되는 동물의 감염에 대한 감수성을 증가시킨다. 감수성의 증가는 창자를 통해 들어오는 것 뿐 아니라 다른 임의의 경로에 의해 들어오는 박테리아 및 기타 미생물에 적용된다(면역 기능 손상에 의한 것). GLN-보충된 TPN은 몇 개의 독립적인 메카니즘에 의해 숙주 방어를 증진시킬 수 있다. 골수이식 수술을 받은 환자 감염 상태가 개선되는 것(상기 실시예 9 참조)은, GLN의 이러한 pro-숙주 활성에 대한 확증으로서 작용한다.

본 발명에 기술된 바와 같이, 당업자라면 본 발명의 범위와 범주에서 이탈하지 않고 과도한 실험없이, 광범위한 등가의 파라미터, 농도, 및 상태내에서 동일한 것을 실시할 수 있다.

본 발명은 특정한 실시예와 관련되어 기술되었지만, 추가의 개질 방법이 가능하다는 것을 이해할 수 있다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따라 본 발명의 임의의 변경, 용도, 또는 적용을 포함하며, 본 발명의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야내에서 공지된 또는 통상적인 실시를 이용한 변형을 할 수 있고, 특허청구범위에서 기재된 기본적인 특징을 나타내는 변경사항을 포함한다.

Claims (9)

1. 고 영양 수액(total parenteral nutrition, TPN)치료와 관련하여 글루타민을 함유하여, 면역계의 활성을 증가시키는 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 골수이식수술중 또는 골수이식치료 결과 동물의 면역계 활성이 감소된 경우에 사용되는 약학 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사람에 있어서 회복을 촉진하기 위한 약학 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비경구 투여용으로 적합한 약학 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하루에 체중 1㎏ 당 0.2 내지 3.0g의 글루타민의 비율로 투여하기에 적합한 약학 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하루에 체중 1㎏ 당 0.3 내지 2.5g의 글루타민의 비율로 투여하기에 적합한 약학 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하루에 체중 1㎏ 당 0.4 내지 2.0g의 글루타민의 비율로 투여하기에 적합한 약학 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전체 몸 방사선 조사를 받은 결과로서 동물의 면역계의 활성이 감소된 경우에 사용하는 약학 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학치료를 받은 결과로서 동물의 면역계의 활성이 감소된 경우에 사용하는 약학 조성물.