JP3113876B2 - 膵臓萎縮治療用医薬組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アメリカ合衆国公衆衛生研究所
外傷センター助成金第GM29327-05号および合衆国陸軍省
契約第DAMD-17-81-C-1201 から研究助成金を受けて成さ
れたものであり、本発明については何らかの権利が合衆
国政府に付与される。

【０００２】関連出願への参照 本出願は、1985年９月12日に出願された出願第775,214
号（現在は放棄されている）の一部継続出願である出願
第906,530号( 出願日：1986年９月12日）の一部継続出
願である。

【０００３】

【発明の属する技術分野】本発明は、腸粘膜・膵萎縮，
その他の腸管透過性増強に関連する障害を含む異化性腸
管関連疾患，宿主防衛機構障害、および免疫能低下を治
療するための医薬組成物に関する。さらに、本発明は、
骨髄移植患者の回復を促進するための医薬組成物に関す
る。

【０００４】

【従来の技術】異化作用（または機能障害）は、解剖学
的構造の分解が起る生理学的状態である。このような状
態は骨格筋だけでなく、腸管内層にも影響を及ぼすのが
特徴である。組織損傷をもたらす異化作用は、手術，敗
血症，火傷，癌化学療法，放射線療法／傷害、または糖
質コルチコイド療法に続発することが多く、しばしば不
十分な食物摂取に伴なって発現する。かかる傷害，疾
患，治療は免疫能低下にも繋がることを特徴とする。

【０００５】例えば骨髄移植を受けた患者では、移植前
後の放射線および／または化学療法は移植片対宿主疾患
の頻発と協同して異化性で重篤な栄養傷害を惹起する。
このような患者では、口腔・食道粘膜炎，下痢，悪心，
嘔吐，口腔乾燥症，味覚傷害を含む多くの要因に起因し
て中心静脈栄養法(TPN) が必要となる(Cunninhgam ら、
Nurs. Clin. N. Amer. ,18:585-596(1983)；Cheney
ら、Cancer 59:1515-1519(1987))。TPN は骨髄移植患者
では必要かつ有益と思われるが、移植後の最初の１ケ月
以内に実施した分枝鎖アミノ酸(BCAA)に富む特殊処方の
静脈内輸液を用いた治験では、窒素平衡は改善されなか
った(Lenssenら、J.Parent. Ent.Nutr. 11:112-118(198
7)) 。

【０００６】上記した様々な原因に起因する異化反応，
胃腸障害，免疫能低下は、死亡および身体傷害の主因と
なる可能性がある。これらの臨床的状態は、非必須アミ
ノ酸であるグルタミン(GLN) の代謝異常と関連すること
が多い。GLN は大部分の組織である程度合成可能であ
る。ほとんどのアミノ酸と異なり、GLN は２つのアミン
部分を有する。すなわち、αアミノ基とアミド基であ
る。アミド基を持つので、GLN は体内の未梢組織からア
ンモニアを除去し、窒素を内蔵器官に運ぶことができ
る。さらに、血中からGLN を除去する組織は炭素骨格を
エネルギー産生に利用することが多い。

【０００７】グルタミナーゼとグルタミン合成酵素は、
GLN 代謝の調節に関与する２種の主な酵素である。グル
タミナーゼはGLN のグルタミン酸塩とアンモニアへの加
水分解を触媒し、グルタミン合成酵素はグルタミン酸塩
とアンモニアからGLN の合成を触媒する。ほとんどの組
織はこれらの酵素を両方とも有するが、特定の組織によ
っては一方が他方より活性が高いのが普通である。

【０００８】GLN の合成と輸送は主として骨格筋と脳で
起こる。次に、GLN は線維芽細胞，造血細胞，リンパ
球，腸上皮，腫瘍細胞のような増殖性細胞により消費さ
れる。これらの細胞は、グルタミナーゼ活性が高く、細
胞内GLN 濃度が低いのが特徴である。この事実は、大き
な創傷，感染に伴なう炎症、通常の経腸栄養を妨げる胃
腸障害を持つ患者では臨床的に重要であると思われる。
何故なら、これらの状況下で細胞型が望ましい増殖を示
すかいなかは、充分なGLN 濃度が有るかどうかに依存す
ると思われるからである。

【０００９】胃腸においてはGLN は呼吸の燃料として用
いられる。GLＮの腸内投与は腸粘膜による内腔GLN 取込
みの増大をもらたし、同時に血中からのGLN 取込みの低
下をもたらす。したがって、腸によるGLNの消費は、こ
れら２つのGLN 供給源で平衡を保っている。

【００１０】胃腸によるGLN 取込みのほとんどは、小腸
の絨毛を覆っている上皮細胞を経由して発現する。小腸
で起こるGLN 代謝は腸の主要なエネルギー源であり、他
の組織からの窒素と炭素を処理することにより、肝での
尿素生成と糖新生のための前駆物質を産生する。

【００１１】Baskerville ら(Brit. J. Exp. Pathol.,
61:132 (1980)) は、アカゲザル，アーモセット，家
兎，マウスに精製グルタミナーゼを注入することにより
血漿中GLN を検出不能な濃度まで低下させ、嘔吐，下
痢，絨毛萎縮，粘膜潰瘍，腸壊死を惹起させた。

【００１２】Martinら（米国特許第2,283,817 号）は、
食事補助剤でなく、解毒剤として用いられるGLN 含有組
成物を開示している。この特許においては、GLN が他の
アミノ酸と相乗作用を期待して組み合わされ、毒素に直
接作用して有害作用を阻害する。

【００１３】Shive ら（米国特許第2,868,693 号）で
は、消化性潰瘍治療用のGLN 含有組成物が開示されてい
る。

【００１４】GLN の保護作用についての証拠は、さらに
Okabeら、Digestive Diseases, 20:66(1975) にも見ら
れる。Okabeらは、GLN が人のアスピリン誘発胃潰瘍を
予防することを認めている。これらの作用は、GLN をチ
ューブにより腸に投与して胃粘膜とGLN との直接の接触
を防いだ場合には認められなかった。この知見は、胃潰
瘍に対するGLN への作用は局所的であり、全身での栄養
状態の改善に伴なうものではなかったことを示してい
る。

【００１５】非必須アミノ酸であるGLN は標準的な非経
口栄養溶液中には存在しないが、小腸にとっては好まし
い酸化燃料であり(Windmeuller, H.G., Adv. Enzyml. 5
3:201-237(1982))、静脈内(i.v.)に投与された囓歯類動
物の腸粘膜に対しては滋養作用を有する(Hwang, T.L.
ら、Surgical Forum 37:56-58(1986) ; O'Dwyer,S.T.
ら、Clin. Res. 35:369A(1987)) 。この内臓でのGLN の
必要性は、小腸によるGLN代謝が増大することが知られ
ている(Soubaら、Surgery, 94(2):342 (1983)) 決定的
な疾患では、一層大きいと思われる。GLN は膵臓により
速やかに消費されることが判っており、腺の外分泌部に
集中するようであるが(Cassano, G.B.ら、J.Neurochemi
stry 12:851-855(1965)) 、無損傷の動物の膵臓外分泌
部に対する投与したGLN の影響はまだ報告されていな
い。

【００１６】現在では、十分に摂食できない患者に必要
な栄養は経腸または非経口食の投与で得られる。経腸食
は通常、鼻腔を経て胃または十二指腸領域に挿入する
か、または例えば胃瘻造設術や空腸瘻造設術におけるよ
うに外科的に植込んだ小口腔のチューブを用いて与えら
れる。現在利用可能な腸栄養処方は４種類に区分でき
る。すなわち、成分アミノ酸，ポリマーアミノ酸，モジ
ュラーアミノ酸，変質アミノ酸である。これらの処方に
はGLN が含有されている。しかしながら、これらの腸栄
養食中の栄養分の含量は一般的に健常人の必要栄養に基
づいており、異化性疾患患者の必要栄養には基づいてい
ない。

【００１７】成分処方は最低限の消化作用を必要とし、
主として小さいペプチドおよび／またはアミノ酸，ブド
ウ糖オリゴ糖類，植物油または中鎖脂肪から成る。

【００１８】ポリマー処方では、例えば大豆蛋白，ラク
トアルブミン，カゼインのような複合栄養素が蛋白源と
して、アルトデキストリンやコーンシロップ固形物が炭
水化物源として、植物油や乳脂肪が脂肪源として用いら
れている。

【００１９】モジュール食は、蛋白，炭水化物または脂
肪をモノマーあるいはポリマー処方と組み合わせること
により調製でき、特殊な栄養要求に応えることができ
る。

【００２０】変質アミノ酸組成物から成る処方は主とし
て、窒素代謝の遺伝的欠陥や窒素蓄積の後天的傷害を持
つ患者に使用される。この目的は、有害と思われるある
種のアミノ酸の取込みを制限することが多い。

【００２１】非経口食は普通静脈内投与(i.v.)される。
これらの静注液は、容易に同化できる糖類，アミノ酸，
電解質のような単純物質から成る無菌溶液である。

【００２２】“中心静脈栄養法”(TPN) という用語は、
総ての必要栄養量を静脈経路から得る患者に用いられる
処方を表わす。TPN 用の処方は経腸栄養処分と異なり、
通常はGLN を含有しない。非経口処方にGLN が存在しな
い理由は、室温でそれが不安定であること、アンモニア
とピログルタミン酸が投与後に生成されること、につい
ての懸念にもある。GLN からのグルタミン酸生成につい
ても懸念があった。その理由は、グルタミン酸が神経伝
達物質として毒性を有する可能性があるからである。実
際には、経腸および非経口栄養溶液のpH値では、それら
の懸念に充分な理由があるとは考えられない。

【００２３】TPN は絨毛萎縮をもたらすが、この現象は
一般には経口による摂食に戻れば正常化する。TPN 処方
はGLN を欠いているので、このアミノ酸に対する体内の
要求は体内組織の合成経路により満たされなければなら
ない。

【００２４】臨界的な疾患の患者では、正味の蛋白異化
は著明な筋GLN 貯蔵の減少、血漿中GLN の低下(Askanaz
iら、Ann. Surg. 192:78(1980) ; Askanaziら、Ann. S
urg., 191:465(1980)) 、そして腸GLN 利用率の増大(So
ubaら、Arch, Surg., 120:66(1985) ; Souba ら、Surge
ry, 94(2):342(1983)) と関係がある。糖質コルチコイ
ドも小腸によるGLN 消費を増大することが知られている
(Soubaら、Surgical Forum, 34:74 (1983)) 。

【００２５】TPN は、胃腸粘膜萎縮に加え膵臓重量減少
と膵外分泌低下と関係がある(Hughes, C.A. ら、Clin.
Science 59:329-336(1980) ; Johnson, L.R.ら、Gastro
enterology 68:1177-1183(1975) ; Johnson,L.R.ら、A
m. J. Physiol. 233:E524-E529(1977) ; Towne, J.B.
ら、Am. J. Surg. 126:714-716(1973)) 発育を維持する
のに充分な静脈内栄養を与えられた動物は、飢餓中に起
こる程度の膵臓萎縮を起こす(Johnson, L.R.ら、(197
5)、上記参照）。膵萎縮の病態はあまり分かっておら
ず、通常は経口栄養摂取に伴なう次のような各種要因に
続発するものと思われる。すなわち、(1) 内腔基室の不
在(Clark, R.M., Clin. Sci. 50:139(1976)) ;(2)食餌
中アミンの欠除(Seidel, E.R. ら、Am. J. Physiol. 24
9:G434-438 (1985)) ; (3) 発酵静線維の不在(Jacobs,
L.R. ら、Am. J. Physiol. 246:G378-G385(1984)) ;
(4)神経液性過程の変化(Johnson, L.R., Physiology of
the Gastrointestinal Tract, 2d Ed., pp.301-319, R
aven Press, NY(1987)) ;または(5) 膵胆汁分泌の変化
(Fine, H. ら、Am. J. Physiol. 245:G358-G363 (198
3)) 。以上の要因に加え、またはそれらに起因せず、膵
萎縮は現在利用されている非経口栄養溶液中に特定の栄
養素が無いことから影響を受けると思われる(Wilmore,
W.W.ら、Surgery 104(5):917-923(1988)) 。

【００２６】

【発明が解決しようとする課題】骨格筋の衰弱，腸絨毛
・膵臓の萎縮，透過性亢進をもたらす腸壁の衰弱，免疫
能低下、またはTPN 下に発現するその他の異化機能不全
は、高濃度はGLN の投与により防止できることを示した
従来の研究はない。

【００２７】そこで、膵臓の萎縮を治療するための医薬
組成物の提供が望まれる。

【００２８】

【課題を解決するための手段】発明の要約 本発明においては、腸粘膜・膵臓萎縮を含む異化性腸管
関連疾患（異化機能不全），腸透過性亢進，宿主防衛能
傷害，免疫能低下（各々癌放射線療法・化学療法または
静脈内栄養法に関連する）を示すか、示す危険のある動
物、または骨髄移植下の動物に治療有効量のGLN が投与
される。このGLN 量は健常人の食事に通常存在している
量より多い。この増加量のGLN は、ある種の異化機能不
全で必要とされる多量のGLN を補うのに必要である。外
からの供給源が無い場合、GLN は上記の異化傷害下の筋
組織の分解により得られると思われる。異化機能不全下
で筋肉からのGLN 放出が亢進するにも拘らず血漿中GLN
濃度が低下するのは、全身性のGLN 欠乏があることを示
している。筋肉からの GLN 放出の亢進にも拘らず、腸
粘膜細胞の需要は供給を上回っている。このため、腸絨
毛萎縮と腸壁関門の分解が起きやすくなる。この関門の
喪失は、腸管関連組織や他のリンパ様組織における免疫
能低下と共に感染の重量な素因となる。腸損傷に加え、
膵萎縮は同様の状況下でも発症する。

【００２９】したがって、本発明は、動物における腸粘
膜・膵萎縮を含む異化性腸管関連疾患，腸透過性亢進，
宿主防衛能傷害，免疫能低下を治療し、骨髄移植からの
回復を促進する方法を提供する。本法は、上記動物に治
療有効量のGLN またはGLN の機能性同族体を投与するこ
とから成る。

【００３０】ストレスを受けている患者に外因性GLN を
与えると、小腸の代謝要求と免疫系が一層良好に支持さ
れ、全身的な蛋白異化の速度が低下する。骨髄移植を受
けた患者へのGLN 投与は、放射線／化学療法，移植片対
宿主疾患、およびTPN に引続く胃腸障害や免疫能低下を
改善するのに特に有益である。炎症性腸疾患の患者への
GLN 投与も有益である。

【００３１】炎症性腸疾患における糖質コルチコイドの
治療効果は、その抗炎症作用だけでなく、腸を覆う腸細
胞内部での基質代謝を増大する作用にも関連がある。腸
細胞に対し一層多量の基質を供給することによる外因性
GLNの投与はまた、血漿および骨格筋のGLN 欠乏を予防
することにも貢献する。同様に、GLN は腸未熟の幼時に
おける移植小腸の生着を促進するか、腸代謝を補助する
と思われる。

【００３２】好適な実施態様の簡単な説明 本発明者らは、腸粘膜・膵萎縮を含む異化性腸管関連疾
患（異化機能不全），腸透過性亢進，宿主防衛機構傷
害，免疫能低下を治療する新規な方法を考案した。本発
明は、上記の疾患のいずれかに羅患しているか、それを
発症する可能性のある動物に治療有効量のGLN またはそ
の機能性同族体を投与することから成る。この治療有効
量は、通常の食事に含まれている量より大きい。ヒトで
の通常の食事からの取込み量は、ほぼ２〜４g/日であ
る。

【００３３】異化機能不全は、解剖学的構造の分解が起
こる正味の異化反応を惹起する状態である。GLN の食餌
による投与により、身体がGLN を合成する必要がない
か、骨格筋の分解によりGLN を得る必要がないように、
異化異常下での生化学的必要量を満たすようである。

【００３４】本発明は、GLN の必要性が増大している全
ての異化機能不全に用いることを意図している。このよ
うな異化機能不全は、消化管の臓器や細胞、または他の
細胞や臓器系と関連がある可能性がある。非経口食投与
中の小腸絨毛の萎縮は通常は、腸細胞に対する直接的な
異化作用に起因して発現するのではなく、むしろ患者の
食事中にGLN が欠けていることに起因する。

【００３５】“経腸”とは、胃と肛門の間の消化管の部
分に栄養を投与する方法を指す。

【００３６】“非経口”とは、消化管外の領域に栄養分
を投与する方法を指す。

【００３７】GLN 要求の増大を示す非経口的異化機能不
全は、敗血症を含む多くの臨床的異常，術中・術後，火
傷，カロリー欠乏，制御不能の糖尿病において発現す
る。

【００３８】本発明が有効な動物は通常、人を含む哺乳
類に分類される動物である。

【００３９】“病的腸透過性”とは、病的状態に伴なう
腸壁透過性の亢進を指す。例えば胃に導入したラクツロ
ースの吸収や尿中排泄等の各種手段により検出できるそ
のような腸透過性は、癌化学療法剤の投与，TPN ，その
他の損傷や病的状態と関係がある。

【００４０】“治療”とは、病的状態を構成する症状ま
たは症候群の予防，改善または治療を意味する。

【００４１】“膵臓萎縮”とは、膵臓組織または膵臓機
能の喪失を指す。

【００４２】“免疫能低下”とは、免疫学的機能の減弱
を指し、これは試験管内(in vitro)か生体内(in vivo)
で測定できる。このような機能には、光源または分裂刺
激物質に応答したリンパ球増殖，抗体反応，細胞性免疫
反応（遅発性過敏性反応等）が含まれるが、これらには
限定されない。免疫能低下の様々な形態（この用語で意
図されたもの全て）は、病原性微生物のような種々の病
原体に対する宿主防衛機能の低下をもたらす恐れがあ
る。免疫能低下は化学療法剤による治療から派生する良
く知られた結果であり、ある形態の物理的外傷，火傷，
栄養不良，糖尿病，その他の病的状態から起こる結果で
もある。

【００４３】“宿主防衛機構障害”とは、細菌，ウイル
ス，真菌を含む（但し、これらに限定されない）各種病
原微生物による感染に対する感受性の増大を表わす。こ
のような障害は腸壁関門の衰弱から発現し、通常は病原
体が粘膜関門を経由し腸内腔から進入するのを防ぐこと
を可能にする。そのような障害は免疫能低下から起こる
と思われる（この低下状態では、免疫系の細胞が有する
病原体の抗原構造に応答する能力が抑制される）。宿主
防衛機構障害は、他の細胞が有する機能の異常（白血球
遊走能、食作用，細菌作用等の低下、マクロファージ機
能の変質、その他の先天的宿主抵抗機能の異常−これら
は従来良く知られている）にも由来する(Mims, C.A., T
he Pathogenesis of Infections Diseases (2nd Editio
n), 1982, Academic Press, N.Y.; 参考のために記載し
た）。

【００４４】様々な細胞型の生存または増殖のために組
織培養の培地中にGLN が必要であることは、従来から良
く知られている(Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS,
A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., N
ew York, 1983) 、参考のため記載）。例えば、in vit
ro でのリンパ球増殖と分化は培地中の高濃度のGLN に
大いに依存していることが良く知られている。例えばGL
N が添加されていないTPN 実施後において、in vivo で
のGLN 欠乏は、リンパ球機能抑制をもたらすことが示さ
れ得る。この機能喪失は、TPN 処方へのGLN 添加により
一部防止されるか、一部回復される。

【００４５】

【発明の実施の形態】本発明の方法が有効な機能不全ま
たは症状に適用される“実質的に関係する”という用語
は、機能不全中・不全後に生化学的なGLN 要求が起こる
ような場合を指す。

【００４６】GLN の投与は経腸と非経口の両方法により
行うことができる。

【００４７】GLN の経腸投与法の具体例は、経鼻的に胃
または十二指腸領域に挿入するか、または胃瘻造設術や
空腸瘻造設術のような場合に外科的に植込んだ小径のチ
ューブの使用である。

【００４８】非経口投与法の具体例は、皮下，筋肉内ま
たは静脈内注射、および鼻咽頭，粘膜または経皮吸収を
含む が、これらには限定されない。ほとんどの症例で
はGLN は静脈内投与される。静脈内投与では、液状の治
療有効量のGLN を容器から直接投与する。すなわち、容
器からチューブが伸びており、これが注射針に接続さ
れ、この注射針が患者の大静脈に刺入されるのである。

【００４９】どの投与経路を用いるにせよ、GLN は単独
または食事補助剤として投与できる。食事補助剤として
用いられる場合、患者に投与する前にGLN を既存の経腸
または非経口食と混合できる。GLN を食餌の他の成分と
直接混合せずに投与することも可能である。例えば、GL
N を主な静注用ビンに直接添加せず、ピギーバックビン
を用いた通常の容器に添加するような静注法である。

【００５０】GLN の機能性類縁体，誘導体，置換体，異
性体，同族体等のGLN の特性を有するものは、GLN と同
等と考えられる。好適なのは、アミノ基を供与でき、ク
レブス回路で代謝可能な類縁体である。最も好適なの
は、炭素鎖の一末端にアミノ酸残基を、他の末端にアミ
ノ部分を持つ化合物である。

【００５１】GLN 投与の治療有効容量範囲は、代謝のホ
メオスタシスを維持するために体内組織の異化または萎
縮を 防止するのに充分な量である。経腸食では、GLN
は0.3g/ 体重kg/ 日以上で投与されるであろう。このよ
うな投与速度は、0.3 〜2.0g、好ましくは0.3 〜1.5g、
より好ましくは0.4 〜1.0g/ 体重kg/ 日にできるであろ
う。静脈内投与時のGLN 投与速度は0.1g/ 体重kg/ 日以
上であろう。すなわち、0.2 〜3.0 、好ましくは0.3 〜
2.5 、より好ましくは0.4 〜2.0g/ 体重kg/日であろ
う。

【００５２】本発明の方法によれば、GLN は、単に既存
の食餌処方を適切な濃度のGLN を含有するように変える
ことにより投与できると思われる。最も好適には、GLN
を無菌の乾燥凍結粉末のような乾燥形状にしておき、投
与時に無菌的に水に溶解した後に食餌組成物の他の成分
と適切な濃度で混合させる。あるいは、GLN を乾燥処方
物の他の成分と予備混合し、投与時に無菌的に水に溶解
するか；または凍結乾燥濃縮品として保存して おき、
これを使用的に溶解し、適当な濃度で混合する。

【００５３】本発明に従う方法によるGLN の使用は、理
想的には組成物の調製に適している。これらの組成物は
GLN ，GLN 含有ジペプチド，GLN 塩から成り、これらの
成分を単独、または他の化学物質と混合して用いればよ
い。このその他の化学物質とは、薬学的に許容できる担
体や、他の食餌の有効成分（例えば遊離アミノ酸，蛋白
水和物、またはオイル）でよい。

【００５４】非経口的投与用の薬剤は、無菌の水性また
は非水性溶液，懸濁液，乳濁液を含む。担体または密封
包帯は皮膚透過性を増大し、皮膚からの吸収を高めるの
に使用できる。

【００５５】本発明はさらに、本発明の成分から成る薬
剤または医薬組成物にも関する。この薬剤は、異化機能
不全，腸管関連疾患（腸粘膜・膵萎縮を含む），腸透過
性亢進，宿主防衛機構障害，免疫能低下を治療し、骨髄
移植からの回復を促進するのに用いられる。

【００５６】本発明は、異化機能不全を予防または改善
するGLN に富む組成物にも関する。GLN に富む組成物
は、治療に有効であり通常食中の量より多い濃度のGLN
を含有する。

【００５７】本発明の組成物を入れる容器は、本発明の
方法に従うGLN の投与を容易にするために用いることが
でき る。これらの容器は、例えば患者に投与されるGL
N の日用量を入れるように考えられている。

【００５８】GLN 単独で、または他のアミノ酸と併用し
て静注するのに適した容器は特に有用である。このよう
な容器は、液状のGLN 含有組成物の容器と、注射針に接
続できる液体輸送手段から成る。

【００５９】液体輸送手段は、容器中の液状組成物をプ
ラスチックチューブのような注射針に輸送できるものな
ら何でもよい。

【００６０】上記輸送手段に接続された注射針は、直接
患者の血管または静注用カテーテルに刺入できるか、ま
たは患者に投与する前に他の溶液と混合できるよう輸注
ビンに刺入できる。

【００６１】上述の開示は一般的に本発明を説明したも
のであ る。本発明をより完全に理解するには、以下の
特定の実施例を参照されたい。但し、これらの実施例は
単に例示のために設けられたものであり、特記しない限
り本発明に限定を加えるためのものではない。

【００６２】実施例１ 動物の世話と手術手順 体重20から40kgの22匹の雑種犬を農場から手に入れた。
その農場では雑種犬を規則的に運動させ、そして寄生虫
(parasites) の有無をスクリーニングしてあった。すべ
ての雌犬は妊娠していなかった。一方犬舎においては、
これらの動物をハーバート医学校の動物に関する委員会
および実験動物資源研究所の実験動物の世話と利用に関
するガイドライン、国立研究評議会（DHEW発行、#NIH 7
8-23、1978年改討）のガイドラインに従って飼養した。
これらの動物は24時間光が照射され、20℃の一定温度の
個別の犬舎に飼った。これらの動物を毎朝２時間運動さ
せ、任意量(ad libitum)の水を与え、そして（蛋白質を
少なくとも25％、脂肪 10％、かつ残りのカロリー源は
炭水化物として含む）アッグウエイ・レスポンド(Agway
Respond)2000 ドライ・ドッグ・チャウ(Dry Dog Chow:
登録商標）を食料として午後１時から３時の間に与え
た。５日から７日間、犬小屋の状態に順応させて、この
期間内においてこれらの動物をパブロフ台(Palov stan
d) に静かに休むように訓練した。基礎サンプルを入手
する前日の午後５時にすべての食物を犬小屋から除去し
た。一晩食物を断った後、犬を少なくとも20分間歩かせ
パブロフ台に乗せ、前肢静脈にカニューレを挿入した。
犬を少なくとも20分間パブロフ台で休ませた後、静脈血
サンプルをアミノ酸の定量のために採取した。チオペン
タール・ナトリウム（アボット研究所(Abbott Laborato
ries) 、5mg/kg体重）の静脈注射を用いて麻酔を急速に
誘発させた後、外側広筋の生検を、ベルグストローム(B
ergstrom) ら、Journal of Applied Physiology, vol.3
6 :pp693 〜697(1974)の方法によって得た。その後、こ
の動物を台から下引し5mｌ動脈血サンプルを、経皮的穿
刺(percutaneous puncture) により大腿動脈から採取し
た。

【００６３】標準的手術手順の前に、この動物を最低２
日間かけて生検から回復させた。外科手術の前の日に、
再びすべての食餌を午後５時に犬小屋から取り除いた。
午後７時に、犬を20分間歩かせ手術室に運び、そこでペ
ントバルビタール・ナトリウム（アボット研究所、30mg
/kg 体重）を静脈内に注射して麻酔をかけた。気管内チ
ューブを置いて、犬に酸素および部屋の空気との混合物
を自発呼吸させた。この犬を仰臥位の手術台上に置いて
カニューラを経皮的穿刺によって外頚静脈に入れ、上大
静脈内に注入した。開始時間を記録した後、注入液を4m
ｌ/hr/kgの一定の注入量(IMED ポンプ（登録商標）、カ
ルフォルニア州サンディエゴ市でこのカニューラを介し
て投入した。ペニシリンＧ(E.R. スクウィッブ(Squib
b)、プリンストン、NY; 600mg) とケフリン（登録商
標）（イーライ・リリィー(Eli Lilly)，インディアナ
ポリス，IN; 1gram)を静脈内に注入した。膀胱にカテー
テルを挿入し、初期の尿サンプルを捨て、カテーテルを
24時間採取できるように密閉尿バックに接続した。この
犬の腹部と横腹の毛をそり、皮膚を石鹸と水とで洗浄
し、ポビドンヨウ素プレップ(prep)溶液（クリニパッド
(Clinipad) Corp., ギルフォード(Guilford), CT) を用
いて支度を整え た。この犬を減菌シートで覆って、腹
腔を雌の場合垂直臍下切開し、雄の場合、右正中傍(par
amedial)切開した。腸を上腹部の方へ後退させ、露出し
た腹膜後腔を切開した。右の深位の弓状湾曲腸骨動脈お
よび静脈と中央仙骨動脈を鋭く切開して分離した。シラ
スティック(silastic)で被覆して2.8mmOD ポリエチレン
・カテーテルに接続したポリエチレン管(2.08mmOD)の6c
m の断片からなる特別に調整したカテーテルを、右の深
位の弓状湾曲腸骨動脈を介して大動脈に頭蓋から6cm 挿
入した。先端が大動脈分岐に1cm 近位にあるが、下腸間
膜動脈の遠位に位置する中間仙骨動脈を介して大動脈に
同様のカテーテルを、頭蓋から挿入した。第３番目のカ
テーテルを、右深位にあって腎静脈の遠位に位置する弓
状湾曲腸骨静脈を介して、挿入した。すべてのカテーテ
ルを、動かないようにして横腹の刺傷を介して体外に取
り出した。その後、腹部をふさぎこの動物を左側に向き
を変えた。外側のカテーテルを適宜な長さに切断し、間
欠性注射ポート(ports)(ジェルコ(Jelco: 登録商標）、
クリチコン(Critikon)社、タンパ(Tampa) FL) に接続さ
れた鋭い注射針でプラグをして、食塩水を用いて洗い流
して、ヘパリン(1,000ユニット/mｌ) で満たし皮下に外
側のカテーテルを埋め込んだ。注射ポート(injection p
orts)は、この動物の横腹上に高く、皮膚下で脊柱の近
傍に位置している。これにより、カテーテルの注射ポー
ト(injection ports) の経皮穿刺によって大 動脈およ
び大静脈への接近を容易にした。ケフリン (Keflin:登
録商標，１グラム）を、静脈カテーテルを介して手術後
８時間後と24時間後に２回さらに投与した。

【００６４】手術手順に続いて、この動物を横たえ、麻
酔からの回復の間中、熱ランプと毛布で体温を維持し
た。注入を開始して後約５時間経てから、この動物をパ
ブロフ台に置いて、p-アミノ馬尿酸溶液(PAH、食塩中0.
5 ％w/v)を、ハーバート・ポンプ(Harvard pump)を用い
て0.76m ｌ/ 分の速度で、医用仙骨動脈カテーテルを介
して遠位大動脈中に注入した。色素を注入してから40分
後、同時に動脈サンプルおよび静脈サンプルを、アミノ
酸濃度およびPAH 濃度の測定のために採取した。３組の
サンプルを20分の期間にわたって10分間隔で吸い出し
た。その後、カテーテルを水で洗浄し、ヘパリンで満た
して、この動物をパブロフ吊り包帯にくるんだ。実験開
始後23時間を経てから、後四分体流出 (hindquarter f
lux)実験を繰り返した。24時間後、尿の採取を止めた。
この動物は静脈経由でにチオペンタール・ナトリウムを
前記のように投与されて、前に生検しなかった足の外側
広筋の生検を行った。静脈内注入をやめて、この動物を
続く24時間代謝ケージの中に入れた。同ケージでは、こ
の動物に任意量の水を与えたが、食物は与えなかった。

【００６５】実施例２ 注入液 すべての動物に4mｌ/hr/kgの速度で注入した。５匹の対
照動物を0.9 ％の食塩水に入れた。他の動物 は、約0.
312 (N＝2)または0.624 (N＝6)グラムの窒素/24hr/kg体
重を与えるように予定した２つの異なった濃度の市販ア
ミノ酸溶液（フレアミン(FreAmine ＩＩＩ（登録商
標）、アメリカン・マックグロウ(AmericanMcgraw))を
与えた。高投与量は４グラム当量の蛋白質/24hr/kg体重
を与えるような意図で行った。３匹の動物を0.312 グラ
ムの窒素/24hr/kgにあるGLN を含有する溶液に入れた。
最後の群(N＝6)は、GLN とフレアミンの等量混合物に入
れ、窒素として0.624 グラム/24hr/kg与えた。GLN 溶液
を、蒸留水中でL-GLN(シグマ(Sigma) 、セント・ルイ
ス，MO) によって溶解し、0.157 モル溶液を調整し、そ
の後、水酸化ナトリウムでpH＝6.8 に調整した。この溶
液を0.22μM の膜を通して濾過によって滅菌し、４℃で
24時間未満貯蔵した。利用する際の朝に、これらの溶液
を、２リットル・バッグ中で必要とする濃度で配合し、
使用するまで４℃に維持した。注入の最後にそれぞれの
バッグから 10mｌの溶液を取り出して、窒素含有量の分
析のために−20℃で貯蔵した。さらに 10mｌのサンプル
を、前記のようにpH＝4.75に調整して、GLN 含有量の分
析のために冷凍貯蔵した。

【００６６】実施例３ サンプルの調整と分析 全ての血サンプルと血漿サンプルを氷冷10％(w/v) 過塩
素酸の等体積を配合することによって脱蛋白し、その
後、20分間40℃において3,000rpmで遠心分離した。上澄
み液のアリコート(aliquot) 2mｌを、0.2Mの酢酸ナトリ
ウム緩衝液（pH＝4.90) を用いて緩衝して、5Nの水酸化
ナトリウムを用いてpH＝4.75〜4.90に調整し、蒸留水で
最終的な体積を4mｌにした。これらのサンプルを、ルン
ド(Lund)（ベルグマイヤ(Bergmeyer) 編集、Method of
Enzymatic Analysis, 第４巻，Academic Press, 1974,
pp.1719 〜1722) の方法を変形した酵素ミクロ蛍光分析
を用いてGLN 濃度およびグルタミン酸塩濃度を後でバッ
チ分析するために−20℃に貯蔵した。

【００６７】筋肉生検手順の間、組織を除去した時、ス
トップ・ウオッチをすぐに始動させた。脂肪と結合組織
のない筋肉を切り裂いて、２片の不等量部分に分けた。
両者のサンプルの重量を、その後の２分間にわたって少
なくとも４回計り、生検に続く重量と時間とを記録し
た。実際の時間ゼロにおける筋肉の湿重量(wet weight)
を、時間に対してプロットした重量の最適直線回帰推定
から計算した。小さなサンプル（約15mg) を90℃のオー
ブンにおいて恒量に乾燥して、乾燥した脂肪のない固形
物の重量を、石油エーテル中で抽出後採取した。その
後、このサンプルを 250μｌの1N硝酸中に温浸し、塩素
含有量を半自動式滴定器（ラジオメータ (Radiomete
r)、コペンハーゲン）を用い硝酸銀で測定した。血漿の
塩素もまた定量し、細胞内水および細胞外水を、同上の
ベルグマンの方法を用いて計算した。第２番目の筋肉サ
ンプル（約100mg)を、ポリトロン(Polytron)ホモジネー
ター（ブリンクマン (Brinkman)、ウエストベリ(Westb
ury)、NY）を用い て、氷冷した0.5mｌの過塩素酸（10
％ w/v) でホモジネートした。このホモジメートを遠心
分離して、上澄み液を酵素性GLN およびグルタミン酸塩
の分析のために調整した。

【００６８】本実験の始めに、血漿濃度と細胞内GLN 濃
度とグルタミン酸塩濃度を、前に記載した酵素的方法(M
uhlbacher et al., American Jouranl of Physiology,
vol.247: E75〜E83(1984))を用いて定量した。他のアミ
ノ酸の濃度を、o-フタルアルデヒドを用いてカラム前誘
導した後、自動高速運転液体クロマトグラフィー(HPLC)
を用いて定量した。GLN ，グラタミン酸塩，プロリン，
システイン、およびリジンを除いて、蛋白質に通常見い
だされる全アミノ酸を定量した。研究が進むにつれて、
HPLCを用いてGLN-グルタミン酸塩測定のために技術を発
揮させた。２つの技術（酵素分析とHPLC）によって測定
したサンプルは、匹敵するグルタミン−グルタミン酸塩
濃度を与えた。従って、HPLC分析だけを、研究の後の箇
所で用いた。動脈中および静脈中のサンプルにおけるPA
H の濃度を５％のトリクロロ酢酸(Muhlbacher et al.,
同上）を用いて脱蛋白後、分光光度分析によりした。

【００６９】24時間の注入の間に排出された尿を、密閉
尿採取系に採出して、酸性化した冷凍容器中において貯
蔵した。アリコートを、バッチ分析のために−20℃に冷
凍した。注入溶液および尿の窒素含有量を、マクロ・キ
ェルダール法(Peters et al., Quantitative Clinical
Chemistry, vol.2, Williams & Wilkins,Baltimore,M
D,.1932 年，pp.516〜538)によって、同じバッチ内にお
いて定量した。

【００７０】統計的計算を、標準統計パッケージ(Minit
ab, Pennsylvania State University, State College,
PA, 1983) を用いてIBM 4341コンピュータで実行した。
その結果を平均±SEM で表現した。対別(paired)および
非対別(unpaired)のスチューデントのt-検定を適切なも
のとして用いた。分散の解析を多重群対照(multiplegro
up comparison) 用に用いた。回帰分析を最小２乗法を
用いて実行した。0.312 グラムの窒素/24hr/kgを摂取す
る群においてサンプルの大きさが小さいために、ほとん
どの統計的比較は他の群間に実行するだけであった。

【００７１】後四分体(hindquarter) の血流量を前記の
ように計算し(Muhlbacher et al.,同上）、流速を動物
の大きさの変動を説明するために体重(kg)当たりで表わ
した。アミノ酸の流出速度を血流量と動脈と静脈の濃度
差との積として計算した。サンプルの３つの組を抜き取
り、流出量は各々の組について計算し、３個の値の平均
を決定した(Muhlbachter et al.,同上）。全体血，血
漿，細胞内水における全アミノ酸窒素を各々のアミノ酸
の窒素含有量を考慮に入れ、合計することによって計算
した。

【００７２】実施例４ 血漿および細胞内アミノ酸濃度 血漿アミノ酸濃度を、手術前および標準的手術後24時間
経過してから測定した。食塩水で措置した動物において
は、血漿の全窒素含有量は手術手順によって変化しなか
った（表Ｉ）。GLN 濃度は一定で留まったが、BCAAの濃
度は上昇し、それらの濃度の合計は、362 ±21から501
±9 μmol/ｌ(p＜0.01）に上昇した。0.624 グラムのN/
24hr/kg を摂取する動物においては、血漿窒素濃度が上
昇する傾向にあった。このことはアミノ酸およびGLN の
混合物を摂取する群においてのみ統計的に有意であっ
た。血漿GLN 濃度はこの群においても上昇した。BCAAの
濃度はアミノ酸注入を受ける全ての動物において上昇し
た。

【００７３】骨格筋肉の窒素濃度は、食塩水の注入の間
減少した（表ＩＩ）。全アミノ酸窒素のこの減少は、GL
N が 21.48 ±3.21μmol/ｌ細胞内水から15.86 ±3.80
(p＜0.05）へ減少することにより直接的に反映されてい
る。細胞内プール(pool)における非必須アミノ酸の全量
は減少したが、細胞内プールの全必須アミノ酸の合計は
変化しなかった。0.624 グラムのアミノ酸窒素/24hr/kg
を受ける動物においては、細胞内窒素およびGLN の変化
は生じなかった（表ＩＩ）。統計的な有意性はアミノ酸
およびGLN の混合物を摂取する動物においてのみ達成さ
れるけれども、より高いアミノ酸負荷を注入すること
で、BCAAの細胞内濃度は上昇する傾向にある。手術後の
これらの２つの群においては、必須アミノ酸および非必
須アミノ酸の全濃度は有意的に変化しなかった。窒素の
高投与を受ける動物と比較して、0.312gm N/24hr/kg 注
入された５匹の動物は、注入された溶液にも拘らず、骨
格筋肉細胞内窒素プール (pool)を一貫して存続しなか
った。細胞内GLN は３匹の動物において減少し、１匹に
おいては変化せず、１匹については増加した（データは
示さない）。

【００７４】このように、GLN を有するか、またはGLN
を有しないアミノ酸混合物としてのアミノ酸を0.624gm
N/24hr/kg を与え、骨格筋細胞内アミノ酸プールを維持
した。細胞内のGLN の減少によって特徴付けられる細胞
内プールにおける減少は、食塩水を摂取する動物におい
て一貫して発生し、低投与量のアミノ酸を摂取する動物
においては変動した。個々のアミノ酸窒素流出 (flux)
の合計として計算される正味の後四分体アミノ酸の流出
(flux)は、食塩水を受け入れる物質における手術後６時
間で測定した時、平均して−19.05 ±4.06μmol N/min/
kgとなる。これは、0.624gm のアミノ酸/24hr/kgを受け
入れる２群の動物において観測される−7.70±5.9 およ
び−6.50±1.18μmol N/min/kgの流出速度よりも著しく
大きい。しかしながら、後四分体からのGLN の流出は、
３群について変化しなかった。これに対して、BCAAは、
食塩水のみ摂取する犬において放出されるが、高投与量
のアミノ酸を摂取する２つの群の動物においては吸収さ
れる。BCAAの後四分体輸血はBCAAの投与速度と関係して
いるように思える。すなわち、後四分体は、食塩水で措
置した群におけるBCAAの放出、アミノ酸およびGLN を含
有する溶液との平衡および最高のBCAA投与を受け入れる
群における摂取を証明している。0.312gm/24hr/kg を受
け入れる５匹の動物において、食塩で措置した犬に匹敵
する後四分体の窒素の流出においては著しく変化しなか
った。しかしながら、これらの流出(flux)のデータにお
いてかなりの変動があり、研究している動物の数は少な
い。手術後24時間の実験の後四分体アミノ酸流出は群間
に相違がない（表ＩＩＩ）。

【００７５】食塩水と共に浸出される５匹の動物中の窒
素排出は、0.492 ±0.22gm N / 24hr / kgであった。市
販のアミノ酸混合物の高投与量を受けた６匹の動物で
は、測定窒素摂取量は0.632 ±0.001gm N/24hr/kg であ
り、窒素排出は平均0.684 ±0.031(表ＩＶ）であった。
1/2 量の市販アミノ酸溶液と1/2 GLN からなる溶液を摂
取した６匹の動物では、窒素摂取量は排出に匹敵する
が、排出の方が多く、平均0.775 ±0.019gm N/24hr/kg
(p＜0.05）であった。これらの２グループにおける窒素
平衡は、食塩水を受けた動物において、それぞれ平均−
0.052 ±0.031 および−0.140 ±0.022gm N/24hr/kg 未
満のマイナス値であった。ほぼ0.312gm N/24hr/kg を受
けた５匹の動物では、平均窒素排出は食塩水対照で観察
された値と、大量の注入窒素を摂取した動物で観察され
た値との中間であった。総合すれば、これらの研究によ
れば、窒素平衡は、投与された窒素増加量として、平衡
に近付くことが示された（図１）。

【００７６】GLN が市販のGLN フリーのアミノ酸溶液と
混合されると、窒素平衡における効果は付加的であっ
た。合計すると、窒素は市販アミノ酸の注入に対応して
保持されるか、または溶液が混合された場合は、保持窒
素の代わりにGLN 単独が計算された。

【００７７】これらの研究によれば、犬における手術ス
トレスは、負の窒素平衡と、骨格筋肉の細胞内の遊離ア
ミノ酸プールの落ち込みと協同して後四分体からのアミ
ノ酸流出増加によって証明されるように、骨格筋肉の正
味蛋白質崩壊を促進することが示される。先行研究によ
れば、蛋白質消費は、偏食や麻酔に関係しないが、明ら
かに手術ストレスに対する応答であることが示されてい
た(Kapadia等、サージカルフォーラム33:19-21(1982))
。食塩水措置グループにおける手術後６時間の後四分
体からのアミノ酸放出量は、慣性的にカテーテル注入で
吸収させた後の、基礎的条件下で研究された犬において
観察された値のほぼ６ないし８倍であった(Mulhbacher
等、アメリカンジャーナルオブフィジオロジー247:E75-
E83 (1984))。この後四分体の窒素放出速度は、細胞内
遊離アミノ酸プールの不足によって説明することができ
ず、それ故、骨格筋の正味蛋白質分解量を表している筈
である。

【００７８】手術前の期間アミノ酸を与えると窒素の損
失を補い、血漿アミノ酸濃度を維持または増加させ、か
つ骨格筋細胞内の遊離アミノ酸プールの低下を減少させ
る。これらの効果は注入されたアミノ酸窒素の量に関係
すると思われる。アミノ酸を最大量投与したときに身体
全体、および後四半部の窒素損失が著しく減少し、また
細胞内のGLN および他のアミノ酸のプールも維持され
た。これらの結果は、Annals of Surgery 191:465 (198
0)においてAskanaziらにより報告された研究結果とは異
なっている。彼らは、hip-replacement 後において患者
の細胞内のGLN および他のアミノ酸濃度の低下は、ぶど
う糖およびアミノ酸の注入によっては戻らなかったと報
告しているのである。本発明の方法を用いて得られた結
果は、この以前の知見が注入されたアミノ酸の量および
／または注入物(infusate)中におけるGLN の欠乏に関連
していると思われることを示している。GLN のようなも
のを単独で用いた場合であり、またフレアミンFreAmine
（登録商標）を用いた場合であれ、注入したアミノ酸濃
度が低ければ(0.312gm N/24 Hr/Kg)、動物実験では3/5
が細胞内にアミノ酸プールを維持することができなかっ
た。これに対して、アミノ酸の注入速度を高くすれば、
細胞内プールを安定化または増大できた。従って、窒素
の投与量を適切に定めれば、手術後に骨格筋細胞内のア
ミノ酸プールを維持することができることと思われる。

【００７９】食塩水摂取動物における細胞内遊離アミノ
酸プールの変化はGLN の急激な減少に起因すること大で
ある。食塩を注入した動物における細胞内遊離アミノ酸
の変化は、適当量の窒素を用意することによって妨げら
れた。これは、GLN が商業的に入手できる溶液中に存在
しなかった場合ですら起こった。これら環境下で細胞内
GLN が維持されるメカニズムは、GLN 合成のGLN 基質が
アミノ酸転移を介したBCAAから派生したことによると思
われるが、明らかではない。理由は説明できないが、正
味のGLN 流出量はすべての群で同様であった。GLN の後
四分体放出はBCAAによっては促進されず、アミノ酸溶液
中にGLN 等を用意しておくことによっては減少しなかっ
た。この手術後のモデルの結果は、BCAAの健常人につい
て報告された効果とは異なっている。健常人では、ロイ
シンの経口投与に続くBCAAの上腕摂取は促進されたGLN
の開放と関係していた(Aokiらによる。Journal of Clin
ical Investigation 65:1522(1981))。

【００８０】0.624gm N/24 hr/Kgの速度で投与した２つ
のアミノ酸溶液の組成には明らかに違いはあるが、２つ
の動物群において後四分体の窒素放出は同等であった。
これは、バランスされた溶液中の必須アミノ酸およびBC
AAの量をGLN 含有溶液中のそれの２倍としたときでも、
同じであった。従って、手術ストレスの実験モデルにお
いては、バランスされたアミノ酸の処方にGLN を補充す
ることは、後四分体損失を減少させる上で、少なくと
も、標準的にバランスされた処方の少なくとも２倍の濃
度と同程度に効果的であった。

【００８１】食塩を投与した犬では、BCAAが骨格筋から
放出された。これらのデータから計算される定量的輸送
速度は、BCAAの目立った吸収は、術後の早期を通じ、特
に肝臓においてと思われるが、内臓の組織において生じ
る。BCAAを用意することでは、おそらく内蔵の必要量を
満たし、骨格筋流出を逆転させることによって、かかる
転流が補われると考えられる。後四分体の窒素平衡と細
胞内窒素プール量との間にも量的な関連がある。細胞内
プールが維持されたときには、後四分体は窒素平衡状態
に近かった。食塩を投与したときには、細胞内プールに
おけるアミノ酸濃度は明らかに枯渇し、後四分体窒素は
明らかに失われた。骨格筋のたん白質分解と遊離アミノ
酸プールにおける窒素濃度との関係は未知であるが、こ
れらのデータは、骨格筋窒素平衡が細胞内アミノ酸濃度
に関連していること、および、GLN が体内のホメオスタ
シスのバランスを維持する上で重要な役目を演じている
ことを示している。

【００８２】

【表１】

【００８３】

【表２】

【００８４】

【表３】

【００８５】

【表４】

【００８６】実施例５ BCAAの取り込みおよび筋遊離アミノ酸濃度は術後の筋肉
中の窒素平衡を予測する 骨格筋および全身の蛋白の異化作用を減らすためのBCAA
の注入の有効性を研究するために、種々の濃度のBCAAを
含むアミノ酸処方を、標準的な開腹および腹膜後の解剖
を行っている犬の３グループに対してこの研究では術前
に与えた。第４のグループは食塩水のみ与えられた。犬
の後四分体の流出技術を用いて、個々の、および全のア
ミノ酸−窒素変換率が測定され、かつ骨格筋の蛋白の異
化作用を評価するのに用いられた。細胞内の遊離アミノ
酸濃度は経皮的な筋バイオプシーサンプルにおいて測定
された。その作業は、標準化された外科的処置を行った
後に、骨格筋アミノ酸代謝過程の規制に対して種々の濃
度を変えたBCAAを含む静注アミノ酸溶液が有する効果に
焦点をあてている。後四分体のアミノ酸の流出と、術後
の最初の24時間中の血漿および骨格筋中の遊離アミノ酸
の濃度を測定することによって、BCAAおよび他のアミノ
酸の注入に対する抗異化的な応答を評価することが可能
であった。

【００８７】Ａ．材料および方法 １．動物の手配および研究の手順 27頭の雄および非妊娠の雌の雑種犬は、これらの調子が
整えられ、かつ寄生虫に対してスクリーニングを行った
牧場から得られた。これらの犬は18キログラムと40キロ
グラムとの間の体重であり、ハーヴァードメディカルス
クール動物保護施設に研究前の少なくとも１週間収容さ
れた。全ての手順は、ハーヴァードメディカルスクール
の動物委員会および既出の国立研究審議会の実験動物資
源研究所の実験動物の保護および利用に関する委員会の
ガイドラインに従った。動物は24時間露光状態の犬舎内
に個体ごとに収容され、毎朝運動させられた。水は任意
に与えられ、プロペットレスポンド200 の乾燥ドッグフ
ード（少なくとも25重量％の蛋白含有、米国ニューヨー
ク州シラキュース）の食餌は、日に１回、午後１時と３
時の間に与えられた。動物は研究前にパブロフのつり革
(sling) で完全に休めるように訓練された。

【００８８】全ての食餌は、基礎研究または施術前の
夜、午後５時に犬舎から取り除かれた。基礎研究は、動
物が運動をさせられつり革に配置された後の午後８時に
行われた。これらの研究は、血漿アミノ酸決定のため
の、カニューレが挿入された前脚の静脈からの血液サン
プルの採集と、細胞内の遊離アミノ酸を定量するために
チオペンタールナトリウム塩（米国イリノイ州北シカ
ゴ、アボット社：５mg/kg,IV) で全身麻酔された個体の
外側広筋への経皮針バイオプシーとからなる。バイオプ
シーをした後に、まだ犬が麻酔状態にある場合に、5mｌ
の動脈血サンプルが全血アミノ酸分析のための大腿部動
脈への経皮穿刺によって得られた。

【００８９】動物は、さらに研究が行われる前の３日間
で回復させられた。施術日の午前７時に、一晩断食した
後、再び動物は運動させられ、かつチオペンタールナト
リウム塩（米国イリノイ州北シカゴ、アボット社：30mg
/kg,IV) で前脚カニューレを介する麻酔処置された施術
室に連れていかれた。気管チューブが通され、動物は室
内空気と毎分５リットルで供給される酸素との混合ガス
を自発的に吸い込まさせられた。犬は仰向けの姿勢で手
術テーブルの上に載せられ、16番手針のカテーテルを経
皮的に外側の頸静脈を介して上部大静脈内に配した。開
始時刻を書き留めた後に、食塩水または適当な供試アミ
ノ酸溶液の注入はこの中心のカテーテルを介してIMEDポ
ンプ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）で開始され
た。セファロチン（米国インディアナ州インディアナポ
リス、リリー社）がこの手術の終了直前および終了時に
投与された。膀胱にはカテーテルが挿入され、残尿を廃
棄した後、閉鎖系廃液収集が上記注入の開始時に開始さ
れ、24時間行われた。静脈注射の注入終了後の代謝ケー
ジ中の動物に対する尿も第２度目の24時間の間、収集さ
れた。

【００９０】犬の腹部および脇腹は剃られ、石鹸および
水で洗浄され、ポビドンヨード溶液で準備された。動物
は滅菌した布で覆われ、雌では腹部に臍下中心線の切り
込みを介して、および雄では右側のパラメディカルな切
り込みを介して入れられた。腸の一部は片側に収縮させ
られ、末端の大動脈および下部大静脈の周囲の完全な解
剖のため、腹膜部分が露出させられた。右側の内部の腸
骨近傍の動脈と同様に、右側の曲折的な深遠部の腸骨近
傍の動脈および静脈が分離された。２本の動脈は、特別
に準備されたカテーテルでカニューレされた。このカテ
ーテルは外径2.8mm のポリエチレンチューブに連結され
たポリエチレンチューブ（外径 2.08mm）の６cmのセグ
メントからなる。一方の動脈カテーテルは上記曲折的な
腸骨近傍の動脈を介して大動脈中に約６cmの位置まで挿
入され、他方の動脈カテーテルは内部の腸骨近傍の動脈
を介して、尾部の中腸動脈までは離れているが大動脈の
分岐点まで１cmの位置まで挿入された。第３のカテーテ
ルは深部の曲折した腸骨近傍の動脈を介して下部大静脈
中に挿入され、腎臓部の動脈までは遠く位置された。全
てのカテーテルは動かないようにされ、右側の脇腹の刺
し傷を介して体外に出された。腹部は数層で重ねて閉じ
られ、動物はその左側に向けられた。外部に出されたカ
テーテルは適当な長さに切断され、短い太針で栓をさ
れ、間欠的なインジェクションポート（米国フロリダ州
タンパ、クリチコン、ジェリコ社）でキャップされ、食
塩水で洗い流され、ヘパリン(100μU/mｌ) で満たさ
れ、皮下に埋め込まれた。インジェクションポートは、
経皮突き刺しによって動脈（大動脈）血および静脈（大
静脈）血に容易にアクセスできるように脇腹の高い位置
に配された。

【００９１】概２時間を要した、これらの手順に続け
て、動物は傍らに置かれ、麻酔からの回復中、ブランケ
ットで体温が維持された。上記の注入および手術の開始
後５時間経過してから、動物はパブロフのスリングに配
され、パラ−アミノ馬尿酸塩(PAH) の０0.5 ％溶液が
ハーヴァードポンプで0.7mｌ/ 分の速度で末端の大動脈
カテーテルに注入された。色素注入の40分後、アミノ酸
およびPAH 測定のための10分間隔で動脈および静脈の同
時採取サンプルの３セットが得られた。その後、カテー
テルはヘパリンで洗浄されてから満たされた。動物は、
注入の開始後24時間、後四分体の流出研究が繰り返され
るまで一定の監視の下、スリングに保持された。この点
において、最初の24時間の尿の採集は終了し、かつ経皮
的な後脚のバイオプシーが、再び簡単な一般的な麻酔状
態下で、先にバイオプシーを受けていない後脚に対して
繰り返し行われた。注入はその後終了し、第２度目の24
時間の期間に代謝ケージ内に置かれた。

【００９２】２．注入溶液 全ての溶液は4mｌ/ 分/kg の速度で注入された。５匹の
対照動物は0.9 ％食塩水を受け入れた。３つの異なる濃
度（全アミノ酸濃度が11％，22％または44％）でBCAAを
含むアミノ酸溶液（表Ｖ）はアミノ酸を8.5 ％の標準ア
ミノ酸処方、すなわちフレアミンIII （米国カリフォル
ニア州アーヴィン、アメリカンマックグロー社）に添加
することによって調製された。全BCAAの注入速度は、そ
れぞれ0.46、0.92および84g/24時間/kg であった。３つ
全てのアミノ酸溶液は等窒素であり、約0.624g/24 時間
/kg の窒素をバリン：ロイシン：イソロイシン（１：
１．38：1.05）の一定割合で供するものである。９匹の
動物は11％の食塩水を受け入れ、窒素が0.624g/24 時間
/kg の溶液を得る。上記の食塩水は2.13％のフレアミン
III に非必須アミノ酸 (NEAA)の混合物を溶解させて得
られた。６匹の動物において、NEAAはL-GLN 単独からな
り、そのうち３つについてはフレアミンIII に見出され
た全てのNEAA（アラニン、グリシン、アルギニン、ヒス
チジン、セリンおよびプロリン）の混合物からなり、そ
の組成比もフレアミンIII と同様である。６匹の動物は
4.25％のフレアミンIII 単独(2％ BCAA)を受け入れた。
最後の７匹の動物は44％溶液を得るのに十分なBCAAで補
われた2.13％のフレアミンIII を受け入れた。この最終
処方はL-GLN 単独(n=4) としてNEAAあるいはフレアミン
III(n=3)に見出されたNEAAの混合物を添加することによ
って等窒素とされた。全ての溶液は0.2μM のフィルタ
ー（MA，ミリス、ミリポア社）に通すことによって滅菌
され、施与前に一晩４℃で保存された。各溶液のサンプ
ル10 mｌは注入時期の最後に採取され、マクロキェルダ
ール法による窒素分析のために−20℃で保存された。

【００９３】３．血液、組織および尿のサンプル調製お
よび分析 全血およびプラズマのサンプルは等量の氷冷
10％ 過塩素酸(PCA) の添加、およびその後の４℃、70
00rpm 、20分間の遠心分離操作によって脱蛋白された。
上清のアリコット2mｌは0.2M酢酸ナトリウム緩衝液 (p
H=4.90) 0.3mｌで処理され、再び遠心分離された。上記
緩衝液は５Ｎの水酸化カリウムでpH4.75〜4.90に調整さ
れ、蒸留水で最終容量の4mｌとしたものである。その結
果得られた上清はその後のバッチ分析のために-20 ℃で
保存された。

【００９４】筋バイオプシーの処理中、ストップウォッ
チの進行を組織除去の際に開始した。筋肉は脂肪および
連結した組織から切り離され、不等の２つの部分に分割
された。各サンプルの多数の重量は１分間に15秒のイン
ターバルで記録され、時間が零の初期の筋肉湿重量
は、時間に対してプロットされた重量の最も適した線型
減少から算出された。少量サンプル（約15〜20mg）は90
℃のオーブンで衡量になるまで乾燥させられ、脂肪遊離
固形物の乾燥重量は石油エーテルによる抽出後に得られ
た。サンプルはその後１Ｎの硝酸250mｌ中に浸漬され、
塩化物量はセミオートマチック滴定器（コペンハーゲ
ン、ラジオメーター）を用いた硝酸銀との滴定によって
測定された。プラズマ塩化物はまた類似の方法によって
決定された。細胞内および外の水分は前述したように塩
化物の技術を用いて算出された。第２の筋肉サンプル(
80〜100mg ）は重量測定され、ポリトロンホモジェナイ
ザー（米国ニューヨーク州ウエストバリー、ブリックマ
ン社）を用いて氷冷PCA 0.5mｌ中でホモジェネートされ
た。ホモジェネートは遠心分離され、上清は、血液およ
びプラズマサンプルに関して記述したように緩衝液の添
加およびpH4.75〜4.90へのpH調整によって分析のため調
製された。

【００９５】全血、プラズマおよび筋肉細胞内GLN およ
びグルタミン酸塩の濃度はルンド（LUND，既出）の方法
からの酵素的なマイクロ蛍光定量法によって、あるいは
プレカラムでｏーフタルアルデヒドとの誘導体化を行っ
た後の自動化された高速液体クロマトグラフィー(HPLC;
Smith et al.,J. Liq.Chromatog.8:1783-1795(1985))に
よって決定された。上記２つの技術は比較可能な結果を
出した。プロリン、シスチンおよびリジンを除く他のア
ミノ酸は類似のHPLC法で決定された。動脈血および静脈
血中のPAH の濃度は、５％のトリクロロ酢酸での脱蛋白
の後、分光光度的に決定された(Muhlbacher et al.,Am.
J.Physiol.247:E75 〜E83 (1984)。

【００９６】注入の24時間中に排出された尿は閉じられ
た排尿システム内で収集され、酸性化された冷蔵庫内に
保存された。アリコットはマクロキェルダール法による
窒素の後述のバッチ分析のために-20 ℃で冷凍保存され
た(Peters et al., In: Quantirative Clinical Chemis
isstry, Vol.11,516〜538, Williams & Williams (193
2)。他の部分は2000rpmで10分間、遠心分離され、テク
ニコン自動分析器（米国New York州テリータウン）で尿
およびクレアチニンの後述の分析のために冷凍された。

【００９７】４．計算および統計分析 後四分体は前述したように算出された（Muhlbacher,F.,
et al., 既出）。個々のアミノ酸に関する流出率は血流
の生成物および動静脈の濃度差として算出された。サン
プルの３セットは各時点ごとに線引され、その流出は各
セットごとに算出され、３つの値の意味が決定された。
プラズマ、全血および細胞内の窒素濃度と同様に全アミ
ノ酸窒素流出は、測定された全てのアミノ酸の窒素基の
総ミリモル数として算出された。骨格筋の遊離細胞内ア
ミノ酸濃度は、細胞内の水分のリットル当たりで表され
た。

【００９８】統計計算は標準統計パッケージ（ペンシル
バニア州立大学、同州立単科大学、ミニタブ）を用いて
行われた。その結果は±SEM の意味として表記された。
対および不対の学生のｔ試験は適当なものとして用いら
れた。変化の分析には複合グループ比較が用いられた。
減少分析は最少二乗法を用いて行われた。

【００９９】Ｂ．結果 静注による注入の開始前で、ペントバルビタールナトリ
ウム塩の管理後に短期間に死亡した１頭の犬を除き、全
ての動物は手術の手順にもかかわらず生き延びた。この
死亡した動物は研究に含まれなかった。手順中の失血は
均一で最少のものであった。全てのカテーテルサンプル
は、22％ BCAA グループにおける動物において開始から
時24間の時点で１つの静脈カテーテルを除いて、開始か
ら６時間および24時間の時点で特許された。

【０１００】開始から６時間の時点における後四分体の
血流は食塩水の対照グループにおいて３36.1±6.8mｌ/
分/ kgであり、処理( 11％ BCAA ，33.3±4.9;22％ BCA
A 42.4±8.8;44％ BCAA 28.7±3.5 ; 有意の差異なし）
によって影響されなかった。開始から24時間の時点にお
ける血流に変化はなかった（それぞれ57.9±10.2;38.6
±8.2 ;54.9 ±6.5;49.7±13.2) 。血流速度の上昇傾向
および開始から24時間の時点での可変性の増加傾向は、
麻酔状態からの回復後に増大する動物の動的活動に帰す
ることとしてもよい。

【０１０１】１．尿として排泄される窒素および窒素平
衡 手術後、排泄された尿の量は、食塩水のみを摂取する犬
が少ない量の尿を排泄する傾向があるが、４つの処理グ
ループにおいて比較可能であった（表VI）。食塩水グル
ープにおいては尿として排泄される窒素の平均は0.492
±0.20g/ 24時間/kgであった。アミノ酸処理された動物
は初めは尿素の形態で、食塩水グループよりも35〜65％
多い窒素を排泄した。22％ BCAA 溶液を注入された犬
は、11％BCAA グループあるいは44％BCAAグループより
も尿素窒素量および総窒素量で有意に少なく排泄した。
クレアチニンおよびアンモニアの排泄は全てのグループ
において比較可能であった。

【０１０２】血液尿素窒素および血漿クレアチニンは全
てのグループから選択された動物において手術前および
手術後24時間測定された。これらの濃度は手術前に全て
の動物において正常であり、手術後でも僅かに下がった
かあるいは変化はなかった。従って、尿素の排尿速度は
尿素生成速度に近かった。11％および44％BCAA溶液を摂
取する動物においては観察された速い尿素生成は、平衡
とされたアミノ酸混合物へのBCAAあるいはNEAAの添加に
よって提供された余分の窒素に有意に関連された(p<0.0
5)。

【０１０３】窒素平衡はアミノ酸投与と否定されなかっ
た。すなわち、注入されたアミノ酸窒素の約50％は残留
した。窒素摂取がアミノ酸を摂取している全ての動物に
おいて同様であったので、既に議論した窒素排泄におけ
る反復は窒素平衡において影響された（表VI）。従っ
て、22％平衡アミノ酸溶液を摂取している動物は、11％
または44％ BCAA を含む溶液を摂取している犬よりも窒
素保持を有意に大きく達成した。

【０１０４】２．全血アミノ酸濃度 食塩水処理動物においては、全血アミノ酸窒素は手術後
６時間の時点で減少したが、24時間までには手術前の正
常の水準に回復した（表VII ）。この一時的な低アミノ
酸血症は、ある必須アミノ酸（スレオニンおよびチロシ
ン）の有意の減少が起こるが、大部分において非必須ア
ミノ酸（グルタミン、アラニン、アルギニン、セリンお
よびアスパラギン）の濃度の減少によって説明された。
対照的に、注入されたアミノ酸を摂取している動物は手
術後６時間の時点において全血アミノ酸窒素濃度を維持
した。これらの濃度水準は 24時間まで上記手術前の対
照の濃度水準を増加させた(p<0.05)。注入されたアミノ
酸を摂取している動物の血液中の特定のアミノ酸の濃度
は注入された溶液の組成を反映した。例えば、BCAA濃度
は６時間および24時間の両時点においてBCAA投与速度に
関連した（図２）。概して、６時間の時点での全血GLN
濃度は手術前の濃度水準を下回った（表VII）。例外はG
LN を強化した11％ BCAA 溶液を摂取しているグループ
であった。この溶液は血GLN 濃度が維持されたものであ
った。これらの動物においては、GLNが非必須の窒素の
半分を越えるものを含み、窒素が引き渡された全アミノ
酸の40％を越えるとの説明であった。24時間まではGLN
含有注入液を摂取している動物は正常の全血GLN 濃度よ
りも高い傾向にあった。

【０１０５】３．骨格筋細胞内遊離アミノ酸 食塩水処理された動物においては、細胞内遊離アミノ酸
窒素が手術前の水準と比較した場合に、手術後24時間ま
では有意に減少した（表VIII）。この変化は大部分（65
％）において、全細胞内遊離アミノ酸プールの主要部分
を含む細胞内GLN 中の特徴づけられた効果によって説明
された。アミノ酸注入液を摂取している動物では、細胞
GLN がGLN 遊離11％ BCAA 溶液を摂取した動物に利用で
きるようになったが、細胞内窒素は維持された。細胞内
GLN はGLN 強化溶液を摂取している動物において増加す
る傾向があり、BCAA濃度はBCAA注入速度に比例して増加
した。

【０１０６】４．後四分体のアミノ酸流出 食塩水処理された動物においては、手術後６時間の時点
で後四分体からアミノ酸窒素の正味の放出があった（表
IX）。この増加したアミノ酸放出は、BCAAを含む、測定
された殆ど全てのアミノ酸の放出を反映し加速した。こ
の期間に、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩は後
四分体を交差しての平衡を維持したアミノ酸のみであっ
た。手術後24時間の時点において、後四分体のアミノ酸
窒素の放出速度は減少し、大いに可変であるが、殆ど全
てのアミノ酸に関する動静脈の差異は零と区別できなか
った。GLN 放出はこの時点で持続した。

【０１０７】アミノ酸注入液を摂取している全てのグル
ープの動物において、６時間の時点で後四分体のアミノ
酸窒素の放出は類似しており、食塩水処理された動物の
場合より明白に少なかった（p<0.05) 。６時間の時点で
のGLN およびアラニンの放出は食塩水の対照においてよ
りもアミノ酸を摂取している動物においての方が少ない
傾向にあった。BCAAは食塩水の注入された動物において
６時間の時点で放出されたが、これらのアミノ酸はアミ
ノ酸注入液を摂取している犬において吸収された。BCAA
の後四分体における摂取はBCAAの投与速度（図３）およ
びBCAA濃度（図４）に関連づけられた。

【０１０８】24時間の時点で、後四分体のアミノ酸窒素
の放出は、全てのアミノ酸注入グループに類似し、６時
間の場合に比較して変化がなかった。24時間の時点で、
BCAAの後四分体の交換は僅かに陽性であり、22％およ
び44％ BCAA グループにおいて高い傾向にあった。この
時点で、BCAAの摂取は血液濃度およびBCAA投与速度に関
連がなかった。

【０１０９】５．BCAA注入、BCAA後四分体の摂取および
後四分体のアミノ酸窒素の放出間の関連性 ６時間の時点での食塩水注入された犬においては、後四
分体BCAAの放出は加速されたアミノ酸放出と連動してい
た。アミノ酸注入液を摂取している動物においては、後
四分体の窒素平衡はBCAA摂取と相互に関連していた（図
５）。食塩水を摂取している対照は窒素を摂取していな
かったので、この分析には含まれなかった。対照の動物
の細胞内の含有物は、よりプラスの傾きを有する減衰線
に帰結していた。その相互依存関係はBCAA流出が後四分
体のアミノ酸窒素流出の刺激の加重に包含されなかった
としても維持された(p<0.02,r=0.49) 。従って、BCAA流
出を除いて窒素流出はまたBCAA摂取に関連していた。窒
素流出は血液中の総BCAA濃度あるいはBCAA投与速度とは
相互に関連性がなかった。これらの関係のないものは24
時間の時点においては存在しなかった。

【０１１０】６時間の時点で後四分体のアミノ酸窒素の
放出はまた細胞内の遊離アミノ酸窒素プール内での変化
を相互関連があった（図６）。細胞内のGLN での反復は
総遊離アミノ酸窒素プール内での変化と緊密に関連性が
あり(p<0.001;r=0.90)、従ってGLN プール内の変化はま
た後四分体窒素放出(p<0.05;r=0.66) と明白に関連性が
あった。これらの数学的関係は後四分体のアミノ酸窒素
の放出が細胞内の窒素プールにおける変化に関して訂正
された場合に、維持された。流出およびプールの測定は
異なる時点でなされたので、細胞内アミノ酸プールにお
ける２うの異なる変化率を仮定することによってこの訂
正がなされた。細胞内プール内の変化が手術後の最初の
６時間で発生したものと仮定した。代わりに、その変化
が24時間以上、一定の速度で発生したものと仮定した。
細胞内窒素プールの変化とアミノ酸窒素放出との間の関
係を変える訂正はなかった。

【０１１１】BCAA摂取は、６時間あるいは24時間の各点
で後四分体から離れている増加したGLN には関連性がな
かった。BCAA摂取は、また骨格筋細胞内の遊離ア ミ
ノ酸プールで発生した変化にも関連性がなかった (r=
0.11 ，不明瞭）。後四分体の窒素流出は予想されるこ
とが可能であり、そのデータの可変性の殆どは BCAAの
６時間流出と遊離アミノ酸窒素プールとが共に用いられ
た場合に、説明されることが可能であった。その関係式
は

【０１１２】y= -9.58+0.27x₁+3.02x₂

【０１１３】ここで、ｙは６時間の時点でアミノ酸窒素
流出（μmol/分/kg)であり、ｘ₁ は６時間の時点でBCAA
流出（（μmol/分/kg)であり、ｘ₂ は骨格筋細胞内の遊
離アミノ酸窒素における変化（手術の前後、 mmol/L/24
時間）であり、ｎは22 (p<0.05,r=0.86) であった。

【０１１４】Ｃ．議論 麻酔状態とされた犬における標準化された開腹術は重病
人で観察された胃化的な応答の多くを開始するために示
された。尿として排泄される窒素によって測定されたよ
うに、トータルの体プロテインの胃化作用は増えてい
る。食塩水を摂取している対照の動物は手術後の最初の
24時間内に約12〜15ｇの窒素を排泄した。このモデルで
の先の研究は、窒素平衡が食物の摂取にもかかわらず手
術手順後の３日間酸性のままであるということを示した
（Kapadia et al.,Surg.Forum 33:19-21(1982))。対照
的に、対で食餌が与えられた偽装手術（shamoperated)
がなされた動物は術後の初日に窒素平衡に達成した。増
加した尿窒素の損失と矛盾せず、かつこれに貢献するこ
とに関し、後四分体の、手術後の６時間の時点でトータ
ルのアミノ酸窒素の放出は、一晩の断食後の対照動物で
観察された場合の６〜８倍であった（Muhlbacker et a
l.,既出）。血液および骨格筋アミノ酸濃度の低下な
ど、食塩水処理された犬での他の変化は、ヒトでの異化
作用状態中に報告された反復に類似している(Askanazi
et al.,Ann.Surg.192:78-85(1980))。このように、犬科
のモデルは重病人での反復に類似している術後の応答を
示し、従って窒素代謝および骨格筋アミノ酸交換上の外
来アミノ酸の効果を調べるのに適している。

【０１１５】食塩水処理された動物においては、後四分
体の、アミノ酸窒素の放出が術後６時間、顕著に増加し
てい た。これは正味の骨格筋の全BCAAの放出と連動し
ていた。同時に、全血BCAA濃度は変化がなく、内臓器官
のBCAAの消費骨格筋の放出の加速度とおおよそ等価であ
った。アミノ酸を摂取している動物においては、後四分
体の総アミノ酸放出が弱められ、全血および骨格筋窒素
プールが維持され、後四分体はBCAA放出の器官からBCAA
摂取の器官へ変換された。BCAAおよびさらに詳しくはロ
イシン摂取は骨格筋の増加したGLN の放出と連動してい
なかった。

【０１１６】この研究は骨格筋アミノ酸放出および筋プ
ロテインの正味の変化が２つの独立した測定から予期さ
れ得るということを示している。これらは骨格筋の血管
ベッドを交差するBCAA流出の速度および骨格筋の遊離ア
ミノ酸プールにおける窒素濃度である。GLN は上記遊離
プール中で最も豊富なアミノ酸であるので、そのGLNの
濃度の変化はプール全体の変化を主として決定する。事
実、遊離のGLN における変化は全遊離アミノ酸における
変化と同様に筋肉の窒素平衡を予測する。

【０１１７】

【表５】

【０１１８】

【表６】

【０１１９】

【表７−１】

【０１２０】

【表７−２】

【０１２１】

【表８】

【０１２２】

【表９】

【０１２３】参考例１ 腸の切開手術後のグルタミンを豊富に含んだ経口食餌の
小腸への効果

【０１２４】Ａ．導入 部分的な手術後の小腸の代償的成長は、腸壁のすべての
層を含むが、柔突起増生により支配される。

【０１２５】成長する柔突起の高さと陰窩の深さは、腸
の残遺 物の拡張と伸長に影響をうける(Williamson,R.
C.N., N.Engl.J.Med.,298;ページ1393-1444(1978年))。
小腸の切開術後、適切な形態学的また機能的な変化がお
こる。経口摂取は腸の切除手術後粘膜の増生の規制に重
要な刺激になることが証明されている(Levine etal.Di
g.Dis,21: ページ542-545(1976年))。経口の栄養素は通
常の粘膜の成長を維持するのに重要であり、もし小腸の
手術後経口摂取が維持されなくては、残りの腸は、重量
を失い、形成不全になる。腸の切除手術後、腸の短い(s
hort bowel) 患者は非経口的な栄養で（生命を）維持さ
れ、その生存は残余の腸組織の 適応性に左右される。
基本的な食餌と非経口的な栄養で、腸の適応性の発達や
完全な経口摂取へのゆっくりとした回復に十分な時間が
与えられる (Weser ,E., Gastroenterology 71:ページ1
46-150(1976年))。

【０１２６】GLN は腸ほう種(enterocytes) に重要な燃
料であり、外科的な緊張のあとに、その使用が増加する
(Souba.W.W.,et al.,Surgery94: ページ342 (1983
年))。GLN は局部的な栄養素として働き、腸が増生をお
こなう時粘膜の成長をうながす。

【０１２７】本研究の目的は、組織の緊張と腸の粘膜の
増生への刺激をもたらす準総合的(subtotal)な切開術，
生体実験的モデル組織の小腸の粘膜細胞の成長に与える
GLNを含んだ栄養の効果を調べることである。

【０１２８】Ｂ．材料と方法 １．動物の準備 チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリーか
ら購入した重さ175-200 グラムの雄のウィスター(Wista
r)ネズミを５日間ラボラトリーで馴化させる。ネズミに
は、水を自由に与え、プリナ(Puriua)のチャウ(chow)を
与える。ネズミは一匹ずつかごに入れ、毎日体重を増や
してゆく。

【０１２９】馴化後、通常の体重をえたネズミを、ラン
ダムに４つのグループに分ける。

【０１３０】研究の初日には、ネズミはペントバルビタ
ール(50 mg/Kg)の腹腔内(I.P.)注射で麻酔される。腹部
を中線切開術で開き、トライツ筋の靭帯から、回盲腸部
までの小腸の全長を外へ取り出し、長い黒糸で延ばさず
に、２回測定する。２回目の測定の平均値を求める。ト
ライツ筋の靭帯へ５ｃｍの所からはじまる小腸の2/3の
切開術をランバート(Lambert) 法でおこなう (Surgery
of the Digest;ve system of the Rat,Charles C.Thom
as,Springfields Illinois, ページ32-35,413-416(1965
年))。切開術の切り口の縁を、端から端まで6-0 のプロ
レン(prolene)で吻合術を施す。腸を腹部の空胴へもど
し、腹部壁を2-0 のプロレン(prolene)で閉じる。

【０１３１】対称群(control group) は、小腸の末端装
置、すなわちトライツ筋の靭帯から５cm離れた所を起点
にして測定した合計長さの2/3 の位置の小腸を切断し、
再吻合する、見かけの手術(sham oprate) を受けた。

【０１３２】動物を、別々に代謝ケージに入れ、外科手
術後の当日から、適切な量の炭水化物，脂質，アミノ酸
類，ビタミン類と塩類を含んだバランスのとれた食餌
(-GLN)，あるいは非必須アミノ酸類の分画(fraction)の
かわりにGLN を用いた所をのぞいて同一のGLN を含んだ
食餌(+GLN)を経口的にひとつがいの動物に与え る。GL
N の含有量はアミノ酸類の０％か25％であり、アミノ酸
類の-5％を示すGLN のある通常の食餌とは対照的であ
る。

【０１３３】２．グルタミンを含む食餌の準備 決められた経口的な食餌は、100 ｇ当りの427 カロリー
で、0.2 ％(W/W) の塩化コリン，10％のトウモロコシ
油，46.9％のデキストリンホワイト(dextrin- white)，
23.4％の庶糖，５％の塩混合物および0.5 ％のビタミン
混合物を含む。両方の食餌は合計で7.17％の必須アミノ
酸類と、合計で6.83％の非必須アミノ酸類を含む14％の
アミノ酸類からできている。GLN (-GLN を含まない食
餌)は、アラニン，アスパラギン，アスパラギン酸，プ
ロリンおよびセリンを各0.937％含んでいる。GLN 豊富
な食餌(+GLN)はこれらの結果アミノ酸0.237 ％と、GLN
3.5％を含んでいる。この結果+GLNの食餌の中で、アミ
ノ酸類の合計の25％および非必須アミノ酸類の51％を示
す。

【０１３４】３．組織の準備 食餌を与えてから７日後、ネズミは犠牲となった。ネズ
ミは腹腔中のペントバルビタール(50mg/kg) を注射され
麻酔された。腹部が開かれ、切開術が胸腔部までおこな
われた。左心室に穴をあけ5mｌの血液を抜き取り、血液
中のアンモニアとプラズマGLN のレベルを測定した。血
液を抜き取った直後、腸を回収した。小腸全体が腸奨膜
に近い腸間膜と注意深く区分されて取り除かれた。取り
除かれた腸は、4.5 グラム重の固定張力をかけてつるさ
れ、９つの点に印がつけられた。腸の切開術を受けたネ
ズミでは、吻合術をした近傍の５，10，および12.5cmの
点は空腸の近傍と十二指腸の末端をあらわし、吻合術を
した所から離れた２，５，および10cmの点は、吻合術を
した所に近い残余の回腸をあらわし、回盲腸部に近い、
５，10および15ｃｍの点は回腸の末端をあらわし、これ
らの点は腸をつき通すまっすぐなピンで印がつけられ
る。腸は６つの部分に分けられる。みせかけの手術を受
けたグループのネズミでは、トライツ筋の靭帯の近傍１
cmの所から、近傍の２つの部分に印がつけられ、上方へ
向って測定される。部分１ａ，２ａおよび３ａは冷却し
た食塩水中ですすがれ、緩衝された10％のフォルマリン
液に４時間つけられ、その後固定のために70％エタノー
ル中に入れられる。部分1b，2bおよび3bは冷却した食塩
水中ですすがれ、それらの管腔が開かれ、湿重量が測ら
れる。腸の部分は５ミリリットルの冷却した食塩水中に
運ばれ、鋭利なハサミで細かく刻まれる。ポリトロン(P
olytron)ホモジェナイザー(Brinkman Instruments,West
bury,NY)上で、２回，15秒間(two fifteen seconds)ホ
モジェネートされ、ホモジェネートができあがる。その
後、３秒間、電力を２に設定し、超音波処理器(Heat Sy
stem Laboratories,Plainview,NY) で超音波処理され
る。DNA とたん白質分析用の食塩水でホモジェネートを
-30 ℃で保存した。

【０１３５】４．分析方法 腸のホモジェネートは、ローリー法(Lowry Method)で、
総たん白質として分析された。DNA は、ブルトン法(met
hod of Burton) (Biochem62: ページ315-323 (1965
年))により測定された。組織切片はパラフィンにつけら
れ、ヘマトキシリンとエオシンで着色され、40倍（40
×) の拡大率の光マイクロスコープで検査される。粘膜
の厚さと絨毛の高さを接眼マイクロメータで測定するた
めに、20個の代表的な高くて方向性のある完璧な絨毛が
選ばれ、平均値が得られる。40倍に拡大された領域の中
央の水平ラインにおかれた腸にある絨毛の数がカウント
される。

【０１３６】Ｃ．結果 最初の５日は、１日に10グラムから15グラムの食料の摂
取での漸進的増加があり、食摂取が一定であった。

【０１３７】つがいで食餌を与えられる動物で２回の食
餌を同量摂取するにもかかわらず、２つのグループでの
体重の増加の割合は手術直後の期間で異なっている。管
理された動物では、術後最初の３日間は、体重は一定で
あり、その後１日に５グラムづつの割合で直線的に増加
した。GLN を与えたグループでは、期間的なおくれはな
く、手術後の最初の日からすぐに、継続的な体重の増加
が１日５グラムの割合ではじまった手術後の２日目，３
日目には、GLN を与えたグループでは、管理されたグル
ープにくらべて、体重の増加が著しかった(P<0.05)。両
方の食餌を与えた動物ではほぼ同じ割合で体重が増加し
ていったが、GLN を与えられたグループでは体重が手術
後８日目までどんどん増加しつづけた(32.0 ±2.8 対2
3.7±3.7グラム累積体重増加，P<0.03) 。死骸を分析し
た結果体重の増加は体全体の水分の累積とは関係なく(7
1 ± 1％+GLN対73± 1％-GLN管理) ，GLN のやせた体の
質量に対する効果と関係があった。手術後最初の３日間
での食餌と体重の変化とにおいてのGLN 濃度の関係が別
の動物を使って研究された。食餌のアミノ酸類の約25％
が最大限の成長の効果をもたらすGLN として必要とされ
る。

【０１３８】25％のGLN を含んだ食餌による体重の増加
は、空腸と回腸との残余の部分の重量増加と関連があっ
た。手術後３日目では、全小腸組織の重量は、GLN を与
えられたグループでは3.55±0.16グラムであり、対照の
グループでは2.97±0.10グラムであった(P<0.05)。

【０１３９】手術後８日目では、腸の重量はそれぞれ3.
30±0.23グラム，2.81±0.16グラムになった(P<0.05 )
。GLN を含んだ食餌において、腸の重量の増加と体重
の変化全体のたった５％を占めるにすぎない。それゆ
え、腸に対してGLN の摂取の効果はあるが、その効果は
腸に限らない。

【０１４０】空腸と回腸の細胞充実性は、DNA の含有量
を測定しかつ、定量組織学により、さらに直接的に評価
(assess)された（表Ｘ）。GLN 摂取に関しては、手術
後３日目の空腸でのDNA 含有量の著しい増加があり、３
日目と８日目の回腸でのDNA含有量の著しい増加があっ
た。手術を受けず、対照動物と比較し、切開術とGLNを
含んだ適切な栄養の食餌の摂取との組合わせにより、手
術後３日目で、１ｃｍ当りの空腸のDNA 含有量は54％の
増加となった。この適切な増生は、食餌中に含まれてい
るGLN をバランスのとれた非必須アミノ酸類の混合物に
置き換えることで、半分近くに減少できた。粘膜の厚さ
の組織学的測定によって、DNA 含有量を測定した（表
Ｘ）、GLN を含んだ食餌に関して は、空腸と回腸での
絨毛の平均的な高さの増加が、手術後３日目と８日目で
明白になった。この反応は絨毛に限られていて、陰窩の
深さと準粘膜(submucosal)の筋の層の厚さは、GLN の効
果とは関係がない。

【０１４１】

【表１０】表Ｘ 60％の小腸の切除手術後決められた経
口的食餌の成分のグルタミンの残余の腸の部分に対する
効果

【０１４２】決められた３cmの空腸の部分を、手術後３
日目と８日目に採取し、DNA 含有量をホモジェネート化
し、分析する(Burton,K.,et al.Biochem.J.62:ページ31
5(1965年))。切開術を受けないこの年令の動物では、空
腸のDNA 含有量は-350μm/cmである。同じ動物の空腸と
回腸の別の部分は緩衝化された10％のフォルマリン液で
固定化され、エタノールで脱水され、パラフィン中につ
けられ、10ミクロンの長手方向部分に細かく切られ、ヘ
マトキシリンとエオシンで着色される。符号化したスラ
イドに関する盲検方式で15の方向性のはっきりした保存
性のよい絨毛（５／スライド オン ３スライド）が、
絨毛の高さと陰窩の深さおよび筋の厚さを接眼マイクロ
メータに適したマイクロスコープで測定するために使わ
れた。データは９から１２のつがいに対して平均値±SE
M を示す。-GLN＝０％グルタミン，±GLN ＝25％グルタ
ミン。^*P<0.05,^**P<0.01,+GLN V.つがいになっていない
ｔ−テストの-GLN

【０１４３】絨毛の高さへのGLN の影響は、GLN がアミ
ノ酸類の全重量の25％を示し、食餌中の非必須アミノ酸
類の51％を示した時に最大になった。より低い濃度で
は、空腸と回腸とにおいて、持続した影響は明白でなか
った。GLN の濃度が31.25 ％へ増加し、他の必須アミノ
酸類がさらに減少すると、腸の粘膜への栄養の効果はな
くなった。これは、GLN を含む食餌のアミノ酸構成が広
範囲に変化し他のアミノ酸類が制限されることに起因す
る。アミノ酸類の合計の25％の量のGLN は、適度ではあ
るが重要なプラズマGLN 濃度の増加を生じた(800±40対
654 ±48μM （３日目），751 ±22対676 ±21μM（８
日目）) 。グルタミン酸やアンモニアのプラズマレベル
ではプラズマ濃度の増加はなかった。これゆえ、GLNが
アミノ酸類全体の25％を示すGLN を含む食餌は、さらに
急激な手術後の重量増加と腸の粘膜の増生を生じる。腸
の粘膜の増生は、過剰なGLN やアンモニア，グルタミン
酸等のGLN 代謝の最終生成物の蓄積とは関係がない。

【０１４４】栄養上の支持が必要な患者に適量の経腸の
栄養素を与えるのは時には困難であるので、特に病気の
過程が胃腸の管道を含む重大なものに関係する場合、栄
養上は不適当な食餌の成分であるGLN の効果を評価し
た。ネズミが同じ60％の切開手術を受け、その後つがい
で食餌のコントロールを受け、あるいは適度のアミノ酸
類、ビタミン類そして塩類の入ったGLN を含んだ食餌つ
まり完璧な食餌であるが全カロリーが50％少ない食餌を
与えられ、GLN を含んだ食餌のグループでは体重がわず
かに増加するが、両方の食餌を与えられたグループでは
ほとんど体重の変化はなかった。カロリーの欠乏にもか
かわらず、腸の粘膜へのGLN の顕著な影響は明白であっ
た（表XI）。

【０１４５】手術後７日目に、コントロールされた食餌
にくらべてGLN を含む食餌では、空腸では粘膜の湿重量
が36％増加し、回腸では40％増加した。粘膜のDNA 含有
量はそれぞれ48％と32％増加した。これらの粘膜の細胞
充実性の測定は定量組織学研究で確証され、この測定に
より、空腸と回腸の粘膜の厚さの持続的増加が示され
た。カロリーの欠乏にもかかわらず、食餌に含まれるGL
N 栄養上の影響を与え、腸の粘膜の成長を特別に支持し
た。

【０１４６】

【表１１】表XI 60％の小腸切除手術後の、カロリーを
50％に制限された経口的な食餌の成分としてのGLN の残
りの腸の部分に与える影響

【０１４７】腸の部分は、表Ｘの説明文にあるように採
取され分析された。データは部分的な切開術の７日後に
調査された10組の動物の平均値±SEM をあらわしてい
る。-GLN＝０％グルタミン，+GLN＝25％GLN;^*P<0.05,^**
P<0.01,^***P<0.001,つがいになっていないｔ−テストで
の+GLN対-GLN

【０１４８】GLN の効果は、GLN を静脈内に投与したと
きにも表れる。ネズミに、最適な成長を維持できるGLN
含まない形で、腸の部分的な切開術後７日間まったく非
経口的な栄養(TPN) を与えつづけた時(Popp.,MB.,et a
l., Am J. Clin. Nutr. 36: 119 ページ(1982年))、絨
毛の高さは空腸内では減少し、回腸内では変化しない
（表XII)。このように、部分的な小腸の切開術の栄養上
の刺激は、GI管路の管腔から食物をのぞく結果、相殺さ
れる(Levine,G.M.,et al.,Gastroenterology 67:ページ
975(1974年))。

【０１４９】

【表１２】表XII 60％の小腸の切開術後の、IVの全非経
口的栄養処方の成分であるGLN が、残った腸の部分に与
える影響

【０１５０】データは９組の動物の平均値±SEM を表
す。-GLN＝０％グルタミン，+GLN＝23％グルタミン，^*P
<0.05 ，^**P<0.001 ，つがいになってないｔ−テストで
の+GLN対-GLN，P<0.05 Pp0.005,

【０１５１】つがいになってないｔ−テストでの切開術
前対切 開術後、非必須アミノ酸成分（全アミノ酸類の
25％）の分画のかわりにTPN 処方のものにGLN を加える
ことにより、切開術後の過増生反応が貯蔵される（表
XII ）。

【０１５２】GLN のないPTN 処方のものに比較して、絨
毛の高さは、空腸内と回腸内で54％と31％それぞれ増加
した。これらの動物のデータどうりに、最近の人類の
研究でジペプチドのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを静
脈内に栄養として与えることにより手術後の窒素バラン
スを改善することがわかった(Sthle,P.,et al., Lancet
i: ページ231（１９８９年))。

【０１５３】Ｄ．ディスカッション GLN を含んだ経口的な食餌と静脈への栄養の投与に関す
るこれらの観察は、非必須アミノ酸GLN が腸の切開術と
手術によるストレス後の必須の栄養になるという仮説と
対立する。バランスのとれた洗練された経口的食餌の成
分として含まれる時には、GLN は人体組織に一般的な同
化すなわち抗異化(anti-catabolic)の効果をもたらし、
手術によるストレスに関する体重減少の過渡期間を防
ぐ。通常GLN を高い割合で使用し、ストレスに反応して
GLN 抽出を増加させる組織がある腸では、GLN の粘膜へ
の栄養上のはっきりした効果がみられる。その結果、部
分的な小腸の切開術に対しての適切な過増生反応が増加
し、腸のうつの個体数が増加して、次に絨毛の高さが増
加する。全カロリー摂取が不適切であっても、また静脈
ルートを通じて全ての 栄養が管理されていても、腸の
細胞充実性は増加する。

【０１５４】これらの効果のメカニズムは不明である。
GLN は特定の生化学的経路に調節的影響を与えたであろ
うし、燃料としてまたは生合成の前駆体として働き、分
泌促進剤として働き、あるいはこれら全ての機能を行っ
たのであろう。以下に特別なメカニズムであってもGLN
は腸の粘膜の成長を支持するうえで必須の栄養であるこ
とは以上の研究から明らかである。腸の切開術後のやせ
た体の質量(body mass) の増加には、GLN が筋肉や他の
組織に対しての同化効果も与える可能性がある。総合す
ると、実験データは、GLN がストレスの続く期間中条件
付きで必須の栄養であるという仮説を支持している。GL
N の内部的生成は、不適切であり、プラズムと組織の濃
度の低下と、組織の形態学での関連した変化を生じる。
外因としてのGLN はフリーGLN 濃度を保存し腸の粘膜と
成長全体への影響を含む栄養上の反応をひきおこす。

【０１５５】参考例２ 濃縮グルタミン非経口栄養剤使用の小腸粘膜の保存 非経口栄養補給の結果、小腸の粘膜が萎縮する(Johnso
n, L. R., et al., Gastroenterology 68:ページ1177-1
183(1975年))。

【０１５６】この反応は、胃腸の分泌と栄養ホルモンの
減少、そして腸皮膚の増殖に必要な特定の栄養の相対的
欠如にも関連している。GLN は小腸の主な酸素燃料であ
るが、標準的経口溶剤中にはない。食餌のGLN の影響を
測定するため、このアミノ酸の濃度を変えて、濃縮した
経口溶剤を服用した場合の小腸の反応を測定した。

【０１５７】Ａ．材料と方法 条件づけされた雄のウィスタ・ネズミ(n=42,重量210-23
0g) に頚静脈カテーテル挿入を受けさせて、拘束されな
い動物に長時間注入が可能なスイベル・アセンブリ(Swi
vel assembly) を取り付けた(Burt,M.E.,et al.,J,Phys
iol.238:H599-603(1980 年))。

【０１５８】すべてのネズミを個々の代謝かごの中にい
れ、水を飲むことだけ許可した。管理された動物に、0.
9 ％食塩水を注入し、プルナ・ラット・チャウ・アド・
リビタムを与えた。３つのグループのネズミに栄養を与
えた。すべての栄養溶剤は、等窒素含有(0.9g 窒素／
100mｌ) ，等カロリー(98Kcal/100mｌ) であり、等濃度
の必須アミノ酸，非必須アミノ酸とぶどう糖を含有して
いる。各溶液の非必須アミノ酸の成分は、0.1 g/100mｌ
または３ｇ／100mｌのGLN 濃度を得るように調整した。
経口溶液を、48mｌ/24 時間の速度で注入した。尿の量
と窒素排出量とを毎日測定した。動物は、栄養注射を７
日間行った後死亡し、GLN およびアンモニア濃度を測定
するために血液を得た。腸の決められた切片から、十分
な厚みの空腸節(jejunal segments)および粘膜の標本を
得た。全てのサンプルを計量し、DNA およびたん白質に
ついて均等質の評価分析を行った。５μm の厚みの組織
パラフィン切片を準備した。空腸の柔突起の高さ、数お
よび粘膜の厚みの測定を盲検方式(blinded fashion) で
行った。

【０１５９】Ｂ．結果とディスカッション 経口的に食餌を管理して与えられている場合と比較し
て、ｉ．ｖ．栄養を受けたすべてのネズミで、湿重量，
DNA ，たん白質，そして絨毛の高さが減少した。（表XI
II）GLN を含有した溶液の注入後、プラズマ濃度は増加
した。GLN を含まない溶液を受けたネズミと比較して、
空腸の粘膜の重量は著しく増加した。統計上反応は顕著
でないのに 、全厚みの空腸の重さはGLN の摂取につれて
増加傾向になった。２％と３％の濃度でGLN を注入後、
粘膜のDNA と全厚みの空腸のDNA は増加した。これらの
変化は、粘膜成長の組織学的証明と一致していた。絨毛
の高さと粘膜の厚さは、投与されるGLN の量に比例して
投与量依存方法では増加した。動物はすべて窒素バラン
スが陽性であるが、２％のGLN 溶液を投与されたネズミ
は実験中ずっと、最大限の窒素量を保持した。非経口の
溶液でのGLN の含有は、動物ではｉ．ｖ．栄養を受けて
いる時に、空腸の粘膜の重量，DNA 含有量および絨毛の
高さを増加する。小腸の粘膜質量の増加により小腸の機
能を高め、小腸内の栄養の摂取を高めることができる。
現在、標準非経口溶液に含まれていないGLN は粘膜を支
持するのに必要な栄養素である。

【０１６０】

【表１３】表XIII

【０１６１】^*P<0.05,^**P<0.025,^***P<0.005対０GLN GLN=グルタミン

【０１６２】参考例３ 5-フルオロウラシル処理後のグルタミン強化非経口栄養
供給の効果 GLN-添加非経口栄養供給が障害後の腸粘膜の保存または
修復に有利であるか否かを決定するために、動物および
ヒトのGI粘膜に対する顕著な毒性を有する化学療法剤で
ある、5-フルオロウラシル(5-FU)(Muggia et al., 196
3; Roche et al., 1970; Bounus et al.,1977; Stanfor
d et al., 1977; Shaw et al., 1979)の投与量（ドー
ス）を増加しつつ処理する前およびその直後にGLN-強化
栄養を４日間投与した。

【０１６３】Ａ．材料および方法 １．動物の準備 ラットを準備し、本質的に前記参考例１および参考例２
に記載されたように収容し、ランダムにグループ分けし
て０または2g GLN/dl を含有する非経口栄養溶液を摂取
させた。

【０１６４】２．5-FU誘起GI障害およびGLN 注入 ラットに前記のようにカテーテル挿入し、麻酔回複後最
低３時間後、動物群は腹腔内注射により5-FUを100、150
または200mg/kg摂取させた。対照群は0.9 ％食塩水(5-
FU 0mg/kg) の注射を受けた。各投与量 群はGLN を０
％または２％摂取した。栄養注入は、46mｌ/24 の速度
で5-FUまたは食塩水の投与から４時間後に開始され、４
日間継続された。これらの時間を選んだのは、実験によ
り5-FUによる損傷からの粘膜の回復がこのステージに行
われており、粘膜の再生に対するGLN の効果はこの時期
に見られる蓋然性が高いことが示されているからであ
る。

【０１６５】３．腸障害の誘起前のGLN 給餌 カテーテル挿入後、ラットは12時間は半強栄養におよび
その後８日間全強栄養（０または2GLN/dl)を摂取させ
た。5-FUを非経口給餌の第４日目に腹腔内投与し、ラッ
トを４日後に犠牲に供した。単一の投与量の5-FU(150mg
/kg)を選択したのは、死亡率を増加せずに一般的な倦怠
感と重篤な腸障害を誘起するからである。尿窒素排出を
毎日測定し、窒素平衡を計算した。

【０１６６】４．組織サンプリング 血液および腸組織をサンプリングし、上記各実施例に記
載のように分析のために準備した。ヘモグロビン、白血
球および血小板の数を、5-FUの種々の投与量の一般的な
血液学的毒性の指標（メジャー）として決定した。

【０１６７】５．分析方法および統計的方法 分析はすべて前記参考例１および７に記載したように行
った。統計的解析は、食物および5-FU投与量の双方を比
較した分散の２方向解析を使用して行った。不対ｔテス
トを使用して２つの処理群を5-FUの１つの投与量におい
て比較した。差は、＜0.05のｐ値において統計的に有意
とみなした。

【０１６８】Ｂ．結果 １．障害後の非経口給餌効果 動物は5-FU注射後約36時間は一般に元気であり、その時
間経過後、昏睡状態になった。実験に使用した60匹中５
匹は技術的理由（カテーテルが機能しなかったり、注入
ポンプの故障）から除外され、６匹（GLN 給餌群から２
匹、対照群から４匹）は5-FU処理のために死亡した。分
析した49匹のうち、23匹はGLN を０％摂取し、26匹はGL
N を２％摂取した。

【０１６９】ａ．腸指数 空腸湿重量、DNA および蛋白はすべて5-FU投与後減少し
た。しかし、これらの指標は、GLN を摂取した動物では
無GLN 対照よりもすべて有意に高い。この差は粘膜の指
標である重量、DNA および蛋白についてはかなり大であ
った（表XIV およびXV）。顕微鏡検査により、GLN ラッ
トでは、粘膜の厚さおよ絨毛の高さの指標に反映された
腸の構造の保存が実証された（表XIV およびXV）。

【０１７０】ｂ．血液学 ヘモグロビン濃度は5-FUのすべての投与量で維持された
が、用いた食餌療法とは無関係にすべての薬物措置動物
において循環白血球カウントおよび血小板カウントの顕
著な減少があった（表XIV およびXV）。

【０１７１】２．障害前の非経口給餌の効果 5-FU使用後の非経口給餌を与えられたラットとは対照的
に、ここでは死亡率が著しく増加し、０％GLN 群の12匹
の動物中６匹が死亡したのに対してGLN 給餌群の12匹中
２匹が死亡した。この差はｐ＝0.06のレベルでのみ統計
的に有意であった（フィッシャーの精密テスト）。

【０１７２】ａ．腸指数 空腸湿重量は、粘膜DNA および蛋白と同様に、GLN 給餌
動物では有意に高いが、全厚DNA および蛋白は 前記２
つの群において差が無かった（表XIV およびXV）。組織
学的分析により、GLN 摂取動物における粘膜厚と絨毛高
さの増加に関する生化学的知見が確認された。

【０１７３】ｂ．血液学 いずれの群においても血液学的パラメータに差が検知で
きなかった。ヘモグロビンは維持されたが、白血球カウ
ントおよび血小板カウントは食餌に無関係に落ち込んだ
（表XIV およびXV）。

【０１７４】３．5-FU後の血漿GLN およびアミノ酸 血漿GLN は、食餌中にGLN が存在しないときでさえも、
5-FU投与後すべての動物において上昇した。この代謝状
態において筋肉からのGLN の放出が増加することは、腸
の細胞性が減少すること（および多分ある程度の5-FU誘
起腎毒性）と組み合わされて、循環GLN レベルの増加を
説明することができるかも知れない。

【０１７５】４．窒素平衡 実験の最初のシリーズにおいて２％GLN を摂取した動物
に窒素保持が改善されることが証明された。同様の変化
が、GLN 添加非経口栄養を5-FU措置前に 摂取した動物
に、認められた。毎日の窒素平衡は、GLN 給餌群におい
ては給餌６日目までは有意に大きかった。累積的窒素保
持は、０％GLN ラットに対する 736±149mg であったの
に比べて、２％GLNラットでは1106±85mgであった（ｐ
＜0.05）。

【０１７６】参考例４ 放射線照射、化学療法および骨髄移植後のグルタミン強
化非経口栄養の効果この実験は、全身放射線照射および
／または化学療法を受けつつある患者に食餌GLNの供給
が窒素平衡を変えるか、臨床結果を改善するか、および
全体的回復を促進するかについて、無作意抽出された盲
検臨床試験で決定するために行われた。

【０１７７】実験の人数は自己由来または同種の骨髄移
植の原簿（プロトコル）に既に登録された患者を含んで
いた。

【０１７８】Ａ．材料と方法 １．患者 患者は自己由来または同種の骨髄移植治療プロトコルに
既に登録されたものから募集した。これらのプロトコル
から選ばれる資格のある患者は18才から60才の男性もし
くは女性で、最初の寛解（同種移植組織）における急性
骨髄性白血病(AML) 、第２の寛解におけるAML(自己由来
移植組織）、骨髄性異形成症候群、リンパ腫、再生不良
性貧血および慢性骨髄性白血病(CML) を含む他の白血病
と診断されたものである。このプロトコルの患者は非経
口栄養を必要とし、注入のためにささげられた中心線を
持っていた。彼等は正常な肝機能（全ビリルビン ＜3m
g/dl）、正常な腎機能（クレアチニン ＜1.2mg/dl) 、
糖尿病の不存在（インスリンまたは経口血糖低下剤なし
に血糖 ＜200mg/dl) を持っていた。彼等は病気の安定
期（例えば、寛解）にあった。患者の体重損失は自身の
理想体重の20％以下であった。

【０１７９】２．実験仕様 患者は標準またはGLN 含有TPN の２つの群の一方にラン
ダムに分けられた。食餌は等窒素および等カロリーであ
るが、標準処方として０GLN を含有し、実験溶液では0.
57g GLN/kg体重／日を含有していた。患者、骨髄移植医
および実験者らには治療群に関しては伏せられた。この
仕様の下では、個体の電解質要求は臨床条件に応じて時
間変動することがあり、医師は、実験者およびニュトリ
ションサポートサービスと相談しながら、溶液の電解質
含有量を血中濃度と臨床状態に応じて変えてもよい。

【０１８０】担当医師が許可すれば実験期間中自由に経
口栄養を摂取した。毎日の経口カロリー、蛋白、脂肪お
よび炭水化物の摂取量を記録した。

【０１８１】盲検テスト溶液の投与は骨髄移植の日（０
日と呼称する）の後５日以内に開始された。初期平衡化
期間である３日経過後、すべての尿および便の捕集を次
の７日間に各24時間開始した。その次の７日間は捕集を
行わず、続く７日間（すなわち、移植後ほぼ３週目）に
再び開始した。捕集は午後４時から午後４時までであ
り、溶液袋が吊され90名の看護スタッフにより投与され
る時間に対応している。

【０１８２】血液を毎週抜き取り、GLN 、グルタミン酸
塩、アンモニア、アミノ酸、C-反応性蛋白およびプレア
ルブミンを検査した。他の血液サンプルはTPN および器
官機能を監視するために主治医が得た。

【０１８３】患者は、目隠しされない(unblinded) 実験
薬剤師が無作意抽出し、治療群と対照群に分けた。これ
らの群は診断に対してバランスをとり、かつ、第１の寛
解におけるAML 群内でこれらの群は治療（全身照射有り
または無し）に対してもバランスをとった。

【０１８４】カロリー要求量の平均50％である任意経口
摂取の連続３日により示されるように、患者がTPN をも
はや必要としなくなった時に実験を終了した。50％経口
摂取の３日目はTPN の終りと定義される。全ての場合
に、患者が最終の結果分析に含められるのは、TPN が必
要とされる期間の、必要とされるカロリーおよび盲検溶
液の蛋白の最低60％を摂取したときだけである。プロト
コルは、盲検溶液を全く摂取せず連続５日間が経過した
ならばその患者は実験から除外されることを要求してい
る。

【０１８５】３．栄養摂取 カロリー摂取は身長および体重に応じて評価された代謝
速度の約1.5 倍に設定した。非蛋白カロリー摂取は約70
％のデキストロースと30％の脂肪エマルジョンであっ
た。蛋白摂取は1.5g/kg/日であった。電解質 と無機質
（ミネラル）を血中濃度が正常範囲内になるように十分
量添加した。ビタミン類をMVI-12として10m ｌ/24 時間
添加した。TPN 溶液を午後４時から午後４時までのスケ
ジュールで病棟看護人により投与された。理想体重を20
％越える患者では、カロリーおよび蛋白の必要量は年齢
と性別に対する理想体重に基づいている。

【０１８６】４．薬物治療 薬物治療および非TPN 溶液はすべてこれらの患者に彼等
の医師が必要と見なす所に従って投与された。患者が摂
取した薬剤と溶液はすべて記録された。

【０１８７】５．追加の評価方法および終点 患者は、身体の組成（TPN-AML および- 後）、中腕筋塊
（治療前および後）、握力強さ（TPN-前、７日目、21日
目およびTPN-後）、ラクツロース透過性（７日目、21日
目およびTPN-後）、敗血症重篤度スコア（毎週）、移植
片宿主病、粘膜炎スコア（週３回）、安寧の全体的評価
（TPN-前および- 後）について評価された。

【０１８８】評価された主要な終点はつぎのものを含
む：(1) 窒素平衡（１週目および２週目）；(2) 3-メチ
ルヒスチジンおよびクレアチニンの分泌（１週目および
３週目の5-７日の間に捕集された３尿値の平均）；(3)
CRP(の最初の4-6 週間の平均）；(4) 身体組成；(5) 平
均週間敗血症スコア；(6) 平均週間発熱および毎日最高
温度の週平均；および(7) 平均週間GVH グレード。

【０１８９】評価された主要でない終点は次のものを含
む：(1) 単位の日（移植の時から、Ｔ＝０）；(2) 移植
から再コンタミネーションまでの日数；(3) 病院のチャ
ージ、全抗生物質チャージ；(4) 注文された抗生物質掛
ける投与された日数、すなわち抗生物質日数-TPNを与え
ている間のみ、かつ、既知または疑われた感染症にたい
する患者の治療に添加された抗生物質をカウントするの
み；(5) 白血球のカウントが＞500 および1,00細胞/cm³
に復帰するまでの日数；(6) 移植から絶対好中性球カウ
ントが＞500 細胞・cm³に復帰するまでの日数；(7) ラク
ツロース透過性、２つの平衡実験期間の終りの２つの機
会に測定；(8) 輸血された血小板および赤血球の単位；
(9) 50％経口摂取または排出までのTPN 投与日数；およ
び(10)安寧感。

【０１９０】Ｂ．結果 ２人の患者で得られた結果を図７および表XVＩに示す。
高投与量のGLN と併用するTPN は移植患者の臨床状態の
顕著な改善を誘起した。この治療は、負の窒素平衡の増
加を防止し、口粘膜炎の重篤度（主に化学療法により誘
起された）を低下させ、かつ、示された３つの臨床的判
断基準により評価（アセス）されたように患者の全体的
健康を改善した。GLN はこのクラスの重篤度の患者の健
康に一時的軽減効果を有することが結論される。

【０１９１】

【表１４】

【０１９２】１ 標準食餌療法に添加された追加の抗生
物質の数量と患者に抗生物質投与を継続した日数との
積。

【０１９３】２ 臨床的決定がなされ開放されるまで患
者が保護的環境（空気層流室）におかれる日数（判断基
準は、WBC ＞1000、発熱なし、口で食事する用意ができ
ていること、等を含む）。

【０１９４】３ 「汚染された」個体との身体的接触が
許可されるまで患者が無菌に保たれる日数。これも臨床
的決定である。

【０１９５】４ 口粘膜炎を重篤度の増加につれ０から
４のスケールで臨床的等級付け

【０１９６】実施例６ グルタミン強化非経口栄養の膵の外分泌に対する効果 全非経口栄養(TPN) は腸と膵臓の萎縮(atrophy) と膵臓
の外分泌不全とに関連する。最近の実験によれば、GLN
を静注給餌に添加するとTPN 関連腸萎縮が弱められるこ
とが実証されている。さらに、以前の実験によれば、GL
N は、標準アミノ酸処方には存在しないが、膵臓の好適
な酸化燃料であること、および多量の外から投与された
GLN は膵臓の外分泌組織により消費されることが示され
ている。しかし、GLN 添加静脈内給餌の膵臓に対する効
果は報告されていない。この実験は 2g/100mｌGLN 強化
食餌（グルタミン）か等窒素、等カロリーのGLN 抜き食
餌（対照）のいずれかの静脈内注入の実験室ラットの外
分泌膵臓の組成および構造に対する効果を調べた。

【０１９７】Ａ．材料および方法 １．動物の準備 雄ウィスターラットを参考例１-３に記載のように飼養
した。標準プリナ・ラット・チャウの食餌で飼養する間
に満足な体重増加を示したラットのみを実験した。第１
の実験（ｎ＝32）ではすべての動物が腸間膜小腸の60％
切除と頚静脈カテーテル挿入を受けたのに対して、第２
の実験の動物（ｎ＝24）は頚静脈カテーテル挿入とシャ
ム小腸切除とを受けた。チャウ飼養動物（ｎ＝18）は対
照として含めた。

【０１９８】これらの手術手順は参考例１に記載のよう
に行った。実験した69匹のラットのうち、チャウ飼養群
から除外されたラットは無かったが、TPN 群からは13匹
のラットが除外された。これはカテーテル敗血症、吻合
漏れ、腸閉塞、ポンプ機能不全またはカテーテル閉鎖の
ためである。

【０１９９】２．実験プロトコル 小腸切除をしまたはせずにカテーテル挿入した後、動物
を無作意抽出し、標準ラット・チャウを経口的に（チャ
ウ）、標準非経口栄養液をGLN 無し（対照）に、または
２％GLN 強化溶液（グルタミン）を、一定の静脈内注入
により７日間摂取させた。

【０２００】静脈内食餌はラットを飼育するのに必須の
すべての栄養を提供した(Popp et al., Amer. J. Clin.
Nutr.36:1119-1128(1982)) 。これらの溶液は調製され
無菌状態に保たれた。非経口食餌は等カロリー(1.13kca
ｌ/mｌ) 等窒素( 96mg/mｌ)であり、非必須アミノ酸の
組成のみが相異していた。

【０２０１】回復後、ラットを代謝ケージ内に個別に収
容し、カテーテルは、栄養溶液の連続注入の間無制約の
運動を可能にするスイベル装置（インステック・ラボラ
トリーズ社）に取り付けられた。外科手術後の最初の16
時間に動物は0.9 ％正常食塩水を1cc/時間の速度で摂取
したが経口摂取は無かった。すべての動物が手術後１日
目から実験の終りまで水道水への自由接近が許された。
手術後１日目にTPN使用された動物は対照またはGLN 強
化食餌 24mｌを摂取しグルコース注入に適応することを
許された。手術後２日目に始まり、実験の残りの期間中
継続して、十分な量(48mｌ/ 日）の非経口的食餌が投与
された。チャウ飼養された動物は、常に与えられた飼料
をすべて消費したが、これらの動物はカロリー濃度にお
いてTPN 飼養ラットの24時間カロリー摂取とほぼ等しい
量のチャウを与えられた。このように、チャウ飼養され
た動物は最初の24時間はプリナ・ラット・チャウ8gをそ
の後は16g/日を与えられ た。これらの動物の静脈カテ
ーテルは手術後２日目に閉鎖された。手術後２日目から
毎日尿を酸性化されたウェル内に捕集し、アリコートを
酸性化された容器内に−20℃で貯蔵した。尿の体積を毎
日記録した。

【０２０２】３．組織の準備および分析手順 動物を手術後８日目の実験の終りに再度体重測定し、ペ
ントバルビタール(45mg/kg、腹腔内）で麻酔し血液を心
臓からヘパリン化シリンジ内に抜き取った。全血GLN お
よびグルタミン酸塩濃度をこれらのサンプルについて前
記の方法に従い、逆相高速液体クロマトグラフィを使用
して測定した(Smith, R.J. et al., J,Liq. Chromatog
raphy 8:1783-1795(1985)) 。

【０２０３】放血後、膵臓の小片（３×３mm）を脾臓部
と胃部との接合においてこの腺の中央部分から直ちに切
除し、2.5 ％グルタルアルデヒド緩衝溶液中に固定し、
組織学のために処理するまで４℃で貯蔵した。膵臓の残
部は注意深く切開し、隣接する腸間膜の脂肪組織および
リンパ組織から分離した。膵臓切除は盲検様式で行っ
た。膵臓を秤量し、氷冷蒸留水に希釈（１：10、重量／
体積）し、ポリトロン組織ホモジナイザーで30秒間ホモ
ジナイズした。ホモジネートを30秒間超音波処理し、DN
A 、蛋白および酵素含有量を分析するまで−70℃で貯蔵
した。肝臓は切除し、秤量し、90℃で72時間乾燥して乾
燥重量を測定した。

【０２０４】４．生化学的評価 各日からの尿のアリコートをプールして累積的日別窒素
平衡を評価した。酸性化された尿素サンプル の窒素含
有量をマクロキェルダール技法を使用して決定した。膵
臓のホモジネートの蛋白含有量をローリー法(Lowry, O.
H. et al., J.Biol. Chem. 193: 265-275(1951))によ
り測定し、DNA をバートンの方法(Burton, K.A., Bioch
em. J. 62:315-322(1965)) の変法を使用して測定し
た。各膵臓ホモジネートの一部を蛋白濃度200 μgm/mｌ
まで0.01％牛血清アルブミン含有バッファで希釈し、酵
素活性を決定するまで−20℃で貯蔵した。希釈サンプル
のアミラーゼ活性をバーンフェルド法 (Bernfeld, P.,
Amylase: alpha and beta, In: Colowick SP, eds.
Kaplan NO.Methods od Enzymology, Vol.1. AcademicPr
ess, NY, 149-158(1955))の変法を用いて測定し、トリ
プシン活性をハメル法(Hummel B.C., Can. J. Biochem.
Physiol. 37(12):1393-1399(1959))にりより決定し
た。トリプシノーゲンの活性化はサンプル400 μl をぶ
たエンテロキナーゼ0.0492μg と37℃で４時間インキュ
ベートすることにより行われた。リパーゼ活性はコダッ
ク・エクタケム700 アナライザでモークの２点速度法
(Mauck, J.C. et al., Clin.(1984))を使用して測定し
た。酵素活性は１分間当りの生成物マイクロモルのユニ
ット(U) で表わされている（１KU＝10³ ユニット）。

【０２０５】５．膵臓の組織学 膵臓組織を４℃で2.5 ％燐酸グルタルアルデヒド・バッ
ファ中で固定し、１％四酸化オスミウム中で室温で２時
間後固定した。この組織標本をアルコール昇級列中で脱
水しアラルダイトに包埋した。光学顕微鏡検査のため、
１μ厚のセクションを1.0 トルイジンブルーで染色し
た。LKB ノバ・ウルトラミクロトームを使用して電子顕
微鏡検査用の600-800 厚のセクションを調製した。これ
らのセクションをウラニルアセテートおよび酢酸鉛で染
色し、次いでフィリップス301 透過型電子顕微鏡で検査
した。電子顕微鏡で房状細胞を撮影し、最終倍率2793×
および7127×で実用プリントに拡大した。

【０２０６】６．データ分析 結果を平均±この平均の標準誤差(s.e.m.)で表す。膵臓
の湿重量、DNA および蛋白含有量は全膵臓当りおよび体
重100g当りで表す。膵臓の重量および蛋白含有量は細胞
の大きさの指標としてDNA のmg当りでも計算した。理想
的には、これらの指標について、大きさが100 ないし30
0gの間の雄ウィスターラットで全体重と全膵臓湿重腸と
の間には線形関係が存在するので、体重に対して較正し
た後に群同士の間で比較がなされた。膵臓酵素活性（ユ
ニット/mg 蛋白）は全腺含有量としておよび比活性（ユ
ニット/mg 膵臓DNA)として表す。チモーゲン（酵素原）
顆粒の平均直径分布はウェイベル法(Weibel, E. R. et
al.,Principles and Techniques of Electron Microsco
py; Biological Applications, Vol.3, ed. M. A. Haya
t, Van Nostrand Reinhold, NY(1973)) に従って計算し
た。

【０２０７】分散の２方向分析を使用してGLN と腸切除
の効果を評価した(Winer, B. J. Statistical Principl
es in Experimental Design(2nd ed.) McGrawHill, NY
(1971))。分散分析が有意の主要効果を示したら、GLN
強化食餌を与えられた動物とそれらの適当な対照との間
の計画された事後比較のために不対ｔ検定が使用され
た。膵臓萎縮の程度を実証するためにチャウ飼養された
動物が含められているが、全体治療効果の分析には含め
られていない。差は確率(p) 値が0.05未満のときは統計
的に有意とみなされた。

【０２０８】Ｂ．結果 １．体重、窒素平衡ならびに血漿グルタミンおよびグル
タミン酸塩 体重および窒素平衡の変化は、小腸を切除しまたはしな
かった、GLN 飼養された動物および対照動物と同様であ
った（表XVII) 。小腸切除を受けた動物では、血漿GLN
濃度(1143 ±75対 890±41、GLN 対対照、ｐ＜0.05）お
よび血漿グルタミン酸塩濃度(177±12対 144±８、GLN
対対照、ｐ＜0.05) はGLN 群では対照群よりも有意に高
かった。GLN 飼養動物と対照動物との間には他には有意
の差は見られなかった。

【０２０９】２．膵臓の指標 TPN 飼養動物は、チャウ飼養動物と比べて有意に小さい
平均膵臓湿重量(33-43％）、低い蛋白含有量(25-58％）
およびDNA 含有量(14-30％）を持っていた（表XVIII)。

【０２１０】非切除動物では、GLN 注入は、対照と比べ
て体重100g当りの膵臓重量（22％）、DNA(32％）および
蛋白(24 ％）の増加と関連していた。これらの差は膵臓
重量（ｐ＜0.05) およびDNA(ｐ＜0.005)に対してはそれ
ぞれ有意であったが膵臓蛋白（ｐ＝0.06) に対しては有
意ではなかった。これらの動物では、膵臓蛋白/DNA比お
よび膵臓重量/DNA比有意な差がなかった（表XVIII)。

【０２１１】小腸60％切除を受けGLN 飼養された動物の
膵臓は対照と比べて体重100 ｇ当り全膵臓蛋白が大きか
った（31％、ｐ＜0.05）。全DNA 含有量、膵臓重量/DNA
比および蛋白/DNA比は有意の差が無かった。ただし、後
者はGLN 群では20％大きかった。

【０２１２】３．膵臓酵素 TPN 飼養された動物はチャウ飼養された動物に比べて全
膵臓酵素活性が低下していた（表XIX)。切除動物では、
全膵臓トリプシノーゲン（ｐ＜0.005)およびトリプシノ
ーゲン比活性（ｐ＜0.005)はGLN 群では対照群よりも有
意に大きかった。酵素顔料または比活性にはGLN 飼養さ
れた動物と対照動物鍍の間で他に差は無かった。

【０２１３】４．膵臓組織学および微細構造 外分泌性膵臓組織およびランゲルハンス島は光学顕微鏡
下ではすべての動物で正常に見えた。GLN 強化食餌を与
えられたラットに見られる体重または蛋白含有量の増加
を説明する膵臓炎または浮腫の証拠は無かった。非切除
TPN 飼養された動物に対するチモーゲン顆粒の平均プロ
フィル直径 (mean profile diameter)はチャウ飼養され
たラットにおけるよりも有意に小さかった（GLN に対し
て3.88±0.06、対照に対して3.80±0.05、および対照に
対して4.69±0.10、１方向ANOVA によりｐ＜0.05) 。グ
ルタミン群および対照群は有意の差が無かった。同様に
配向された房状単位のプロフィルを比較すると、細胞体
積密度、チモーゲン顆粒の数、およびチモーゲン顆粒に
より占められる細胞体積の％面積の増加が対照動物に比
べGLN 飼養された動物において明らかであった。

【０２１４】５．結合シリーズからの治療効果の分析 GLN-強化食餌を与えられた動物または小腸切除を受けた
動物は有意に血漿中のGLN(ｐ＜0.02) 濃度およびグルタ
ミン酸塩（ｐ＜0.02) 濃度が上昇していた。GLN 注入は
累積的窒素平衡に影響しなかったが腸切除は有意の負の
効果を示した。膵臓重量は（ｐ＜0.0001) 、蛋白含有量
（ｐ＜0.002)、およびDNA 含有量（ｐ＜0.0004) はGLN
を与えられた動物では有意に高く、これらの効果は腸切
除とは無関係であった。腸切除は全膵臓蛋白含有量（ｐ
＜0.006)および膵臓蛋白/DNA比（ｐ＜0.05) を有意に低
下させた。

【０２１５】GLN 飼養された動物はトリプシノーゲン含
有量（ｐ＜0.02) およびリパーゼ含有量（ｐ＜0.03) が
有意に増加している。全アミラーゼ含有量および全酵素
比活性はGLN 注入により影響されなかった。腸切除はト
リプシノーゲン、アミラーゼおよびリパーゼの全含有量
および各比活性に深甚な負の効果（ｐ＜0.0001) があっ
た。

【０２１６】結論として、GLN 添加TPN は、対照の食餌
を摂取した動物において、膵臓重量(14-22％）、DNA 含
有量 (12-32％）および蛋白(24-31％）の喪失を有意に
減少させた。全体のGLN 飼養された動物は全膵臓トリプ
シノーゲン含有量（53％）およびリパーゼ含有量（30
％）を有意に増加させたが、酵素の比活性には差が無か
った。下がって、GLN はTPN の間膵臓外分泌組織のため
の重要な栄養物である。静脈内栄養補給中の膵臓に対す
るGLN の栄養効果は臨床的に重要な意味を含むものであ
る。実施例７ 経小腸基礎食餌を与える間グルタミンは膵臓萎縮を防止
する。

【０２１７】生体外（インビトロ）実験は、GLN が膵臓
の重要な呼吸燃料であるがGLN を添加した経小腸食餌
の、膵臓の構造および機能に果す役割が未知であること
を実証している。標準的な、GLN 添加された基礎食餌
の、手術ストレスに続く膵臓および小腸の成長に対する
影響は、雄ウィスターラット(n＝25、体重195 〜210g)
で調べた。中央腸間膜小腸の60％切除および胃フィステ
ル形成の後、ラットは無作為抽出されチャウ(chow)ある
いは標準的基礎食餌の連続注入(CON) あるいは等窒素，
等カロリーの2gm/100mｌ GLN添加食餌(GLN) を受けた。
上記２つの基礎食餌は、それらの非必須窒素源のみが異
なっている。実験期間中、毎日採尿が行われ、窒素平衡
が調べられた。ラットを犠牲に供したとき、体重が調べ
られ、GLN ，グルタンミン酸塩(GLU) およびアンモニア
のために血液が採取された。肝臓，小腸および膵臓を切
り取り、それら重さを秤量し、また、これらは、そのDN
A およびタンパク質の含有量を分析し、組織研究用に準
備した。肝臓および膵臓を脂肪および酵素の含有量が分
析された。上記分析等のデータの一部は、下記の表XXに
おいて平均±sem で示される。

【０２１８】

【表１５】

【０２１９】*:P<0.05対CON; #:P<0.005 チャウ 対CON ま
たはGLN(ANOVA)

【０２２０】上記基礎食餌を与えると、チャウを与えた
動物の膵臓の重さが減少した。GLNは、膵臓の重さの減
少を顕著に弱め、膵臓のタンパク質含有量を増加させ
た。また、GLN はCON 群と比較して肝臓の湿重量の増加
を防止した。GLN 群のデータとCON 群のデータを合わせ
ると、膵臓の重量およびDNA は血漿中GLN の濃度ではな
く血漿中のGLU 濃度(p＜0.03) に関係づけられた。それ
は体重および窒素平衡がCLN 群とCON 群との間では同様
であるため、GLN の効果は手術後期間の膵臓塊に異的で
あると思われる。これらの知見は、GLN は、手術ストレ
スに続く胃腸組織のための条件的必須栄養物であるとい
う仮設をさらに裏付けるものである。

【０２２１】参考例５ グルタミン強化非経口栄養は、5-フルオロウラシルによ
り誘起される腸壁へのダメージを抑制する。

【０２２２】ラクツロースは非代謝性の糖であり、この
糖は、胃腸管経路で十分には吸収されない。炎症性腸疾
患のような胃腸の病気では、ラクツロースはその粘膜の
間隙を通って吸収され、それによってラクツロースは尿
中に排出される。従って、尿中のラクツロースの量は、
腸の粘膜障壁を通る漏出の尺度である(menzies,Bioche
m. Soc. Trans. 550:1042-1047(1974)) 。

【０２２３】ラットを、上記参考例３で述べた5-フルオ
ロウラシルで処置した。100 mg/mｌの等浸透圧液とした
ラクツロース2mｌを強制飼養によって注入し、その後24
時間にわたって採尿し、凍らせた。尿中ラクツロース
は、Ziegler 等(Arch. Surg. 123:1313-1319(1988)) に
記載のように、酵素的に決定された。

【０２２４】１回の5-FU注入による処置は、24時間にわ
たってラクツロースの腸透過性を増加することが解っ
た。この透過性の増加は処置後24時間から48時間の間に
頂点に達した。GLN に強化TPN を摂取した動物は、標準
的 TPN を与えられた動物に較べ３日間にわたって腸透
過性を顕著に減少させた。例えば、5-FUの注入後の48時
間から72時間における24時間のラクツロースの排出は、
GLN 措置ラットにおいて32から17μmoles に減少した。

【０２２５】GLN は、化学療法薬の使用に供なう透過性
の上昇から腸管壁を腸の透過性の増加を防ぐことが結論
される。この効果はGI経路を介した感染を防ぐ上で最重
要なものと期待され、また、上記参考例４に記載のよう
に、骨髄移植を受けた患者のより急速な回復におそらく
寄与している。

【０２２６】参考例６ グルタミンはTPN の免疫抑制効果を緩和する ラットには、実施例６（材料と方法，セクション２）に
記載したように実験室のチャウ，TPN あるいはGLN 添加
TPN のいずれかが与えられる。処置開始７日後、動物を
犠牲に供し、脾臓，胸腺および腸間膜リンパ節を採取し
た。標準的な技術(Klein, Immunology: The Science of
Self-Nonself Discrimination, Wiley-Interscience,
1982参照）を用いて、これらの組織から細胞懸濁液を調
製した。ミトゲンの存在による生体外でのリンパ球増殖
反応が、この分野では良く知られた方法を用いて行われ
た。チャウ群と比較すると、TPN 群は１週間で50％リン
パ球の反応性を著しく減少させた。このような抑制は、
非経口的溶液におけるGLNの存在によって逆転された。
すなわち、GLN 処置がなされたラットは、TPN 動物と対
照チャウ飼養ラットの中間のリンパ球反応性を示した。

【０２２７】従って、非経口的溶液にGLN が存在する
と、GLN の存在しないTPN によって生じる免疫抑制状態
が著しく緩和される。上記参考例５で述べたような腸粘
膜障壁の破壊は、免疫機能低下(compromised immune fu
nction) と結合してTPN を与え続けらえた動物の感染に
対する影響の受け易さを増大させる。この影響の受け易
さは、（免疫機能低下による）同様に腸管を 通って侵
入する細菌や他の微生物に対してだけでなく他の経路に
よるものい対影響の受け易さもおそらく増大させるであ
ろう。GLN の添加されたTPN は、従っていくつかの独立
した機序によって寄主防御を促進することを可能にす
る。骨髄移植を受けた患者の改善された感染状態（上記
参考例４参照）は、以上のような GLN の“寄主に有利
な(pro-host)”作用の強力な証拠を提示するものであ
る。

【０２２８】本発明は十分に述べられたので、本発明の
要旨および範囲から逸脱せずかつ過度の実験を要さず
に、広い範囲の均等のパラメータ，濃度および条件で、
同様の実施が行われ得ることは当業者にとって明らかで
あろう。

【０２２９】本発明は、その特定の実施例に関連して説
明したが、さらなる変形が可能であることは理解されよ
う。本出願は、本発明のあらゆる変形，利用あるいは改
造を範囲とするものであり、これらは一般に、本発明の
原理を伴ない、本発明の分野における公知あるいは慣用
的実施の範囲内にあるような本開示からの逸脱また、添
付された請求の範囲において示される構成要件に適用さ
れるような本開示からの逸脱を含むものである。

【０２３０】

【表１６】

【０２３１】

【表１７】

【０２３２】

【発明の効果】 動物に、正常時の食餌に含まれるより
も多い、治療有効量のグルタミンまたはグルタミンの特
徴を保持する機能性類縁体を含む医薬組成物を投与する
ことにより膵臓萎縮が改善される。

【図面の簡単な説明】

【図１】窒素取込みの関数としての窒素平衡をプロット
した図である。

【図２】動脈血中の総分鎖アミノ酸(BCAA)濃度をBCAA投
与速度と比較した実施例５のデータのグラフを示す。デ
ータは平均値±SEM を示す。生理食塩水を投与した動物
でのデータは含まれていない。

【図３】BCAA流出（後四分体）とBCAA注入との関係を示
す実施例５のデータのグラフを示す。

【図４】術後６時間目のBCAA流出（後四分体）と動脈血
中BCAA濃度の増加を比較した実施例５のデータのグラフ
を示す。

【図５】術後６時間目の窒素流出（後四分体）とBCAA流
出（後四分体）を比較した実施例５のデータのグラフを
示す。

【図６】術後６時間目の窒素流出（後四分体）と術後２
４時間目に測定した筋細胞内アミノ酸窒素の変化を比較
した実施例５のデータのグラフを示す。

【図７】同種骨髄移植後の累積窒素平衡に対する高用量
GLN-TPN の影響を証明するデータのグラフを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウイルモア，ダグラス ダブリュ. アメリカ合衆国 02146 マサチューセ ッツ州 ブルックライン ロックウッド ストリート 125 (56)参考文献 特表 昭63−501214（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/198 A61P 1/18 A61P 3/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物の正常時の食餌に含まれるより多
   い、治療有効量のグルタミンまたはグルタミンの特徴を
   保持する機能性類縁体を含むことを特徴とする動物の膵
   臓の萎縮を治療するための医薬組成物。
2. 【請求項２】 前記膵臓の萎縮は、本質的に静脈栄養供
   給に伴うものであることを特徴とする請求項１に記載の
   医薬組成物。
3. 【請求項３】 前記膵臓の萎縮は、本質的に異化機能障
   害に伴うものであることを特徴とする請求項１に記載の
   医薬組成物。
4. 【請求項４】 前記異化機能障害は、外科手術，敗血
   症，火傷，カロリー消耗，化学療法，放射線治療または
   治療されていない糖尿病の結果起きるものであることを
   特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
5. 【請求項５】 前記動物はヒトであることを特徴とする
   請求項１に記載の医薬組成物。
6. 【請求項６】 グルタミンまたはグルタミンの特徴を保
   持する機能性類縁体の非経口による投与の量が、１日
   に、体重１キログラム当たり０．２ないし３．０グラム
   の率であることを特徴とする請求項１から５のいずれか
   一項に記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 グルタミンまたはグルタミンの特徴を保
   持する機能性類縁体の非経口による前記投与の量は、１
   日に、体重の１キログラム当たり０．３ないし２．５グ
   ラムの率であることを特徴とする請求項６に記載の医薬
   組成物。
8. 【請求項８】 グルタミンまたはグルタミンの特徴を保
   持する機能性類縁体の非経口による前記投与の量は、１
   日に、体重１キログラム当たり０．４ないし２．０グラ
   ムの率であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組
   成物。