PT94051B

PT94051B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas compreendendo 17alfa-etinil-17beta-hidroxi-18-metil-4,15-estradieno-3-ona-(gestoden)

Info

Publication number: PT94051B
Application number: PT94051A
Authority: PT
Inventors: David Henderson; Michael Baum; Anthony Adrian Colletta
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1989-05-17
Filing date: 1990-05-16
Publication date: 1996-11-29
Also published as: DE69006633T2; DE3916381A1; DK0399631T3; CA2016895A1; ES2062312T3; JPH0386826A; AU5513590A; ATE101519T1; EP0399631B1; EP0399631A1; CN1047298A; AU640139B2; IL94417A; DE69006633D1; HUT54501A; PT94051A; IE901775L; IL94417A0; IE65717B1; HU903055D0

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

N2 94 051

N°ME; schering ALTIEGESELLSCHAFT, Alemã, 170-178 Mullerstrasse, Berlin 65

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO 17 -ETINIL-17 -HIDR0XI-18-METIL-4,15-ESTRADIENO-3-0NA-(GESTODEN)

INVENTORES: Dr. David Henderson, residente na Alemanha Ocidental, Prof. Michael Baum e Dr. Anthony Adrian Colletta, residente na Inglaterra.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

Alemanha - 17 de Maio de 1989, sob o n? P 39 16 381.4.

Descrição referente à patente de invenção de SCHERING AKTIENGESELLSCHAPT, alemã, industrial e comercial, com sede em Berlin e Bergkamen (endereço postal: 170-178 Mllllerstrasse, Berlin 65), República Federal Alemã, (inventores:

Dr. David Henderson, residente na Alemanha Ocidental, Prof. Michael Baum e Dr. Anthony Adrian Colletta, residentes na Inglaterra), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕ

ES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO 17 -ETINI1-17 -HIDROXI-18-METIIi-4,15-ESTRADIENO-5-ONA-(GESTODEN).

DESCRIÇÃO

Processo para a preparação de composições fatmacêuticas que contêm gestoden ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16.

A presente invenção refere-se a uma nova utilização de gestoden (17^* -etinil-17^ -hidroxi-18-metil-4,15-estradieno-5-ona) ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 e por conseguinte a preparação de medicamentos para o tratamento de carcinomas que são inibidos

no seu crescimento pela proteina TGFB (Tumor Growth Factor B, sporn etc al., 1986, Science 235, 3. 532-534), especialmente para a preparação de medicamentos para o tratamento do carcinoma da mama.

É largamente conhecido que os derivados de trifenil-etileno, como por exemplo o tamoxifeno )-2-( 4--(1,2-difenil-l-butenil )-f enoxi )-N,N-dimetil-etilamina_)7são agentes com alta afinidade para receptores de estrogénios e actuam como antagonistas competitivos de estrogénios. Por isso estes compostos são empregues para o combate aos carcinomas da mama positivos em relação aos receptores de estrogénio (Bit.; Patterson et al., 1981 Japonese Journal of Câncer Clinics, Suppl. (November), pags. 157-183).

Foi ainda descoberto que estes compostos estimulam a sintese da proteina TGFB em células de carcinoma da mama (Lit.: Knabbe et al., 1987, Cell 48 , S. 417-428). A influência desta proteina no crescimento celular depende do tipo de célula. Por exemplo o crescimento de fibroplastos e estimulado através da proteina TGFB. Pode-se no entanto mostrar que a proteina TGFB é muito importante para a inibição do crescimento de células do carcinoma da mama, mesmo no que se refere as células que não apresentam receptores de hormonas esteroides.

Os carcinomas da mama são habitualmente de caracter policlonal, quer dizer compõem-se de uma população mista de várias células que tipicamente abrange tanto células com receptores para hormonas esteroides como cé lulas sem estes receptores (lit.: King et al., 1985, Câncer res. 45, S. 294-304} Horwitz et al., 1985, Recent Progress in Hormone Research 41. S. 249-316).

Foi admitido que a influência favorável clinicamente provada do tamoxifeno sobre as células de carcinoma da rflama reflete um efeito directo mediado através do efeito antagonista do receptor de estrogénio em ligação com um efeito adicional derivado do aumento da sintese da pro- 2 -

teína TGPB.

Até agora não se conhecem, para além do tamoxifeno e dos compostos quimicamente afins, quaisquer outros agentes que exerção uma influência favorável (isto é crescente) sobre a síntese de TGPB.

objectivo da presente invenção é indicar o emptego de um composto, o qual estimula a síntese de TGPB em carcinomas do tipo descrito mais fortemente do que o tamoxifeno ou compostos quimicamente afins bem como um processo para a preparação de uma composição farmacêutica que contêm este composto, a qual pode ser empregue como o tamoxifeno para o tratamento de tumores dependentes de estrogénios e inibíveis no seu crescimento através de TGPB.

Verificou-se que o gestoden (17 c* -etinil-17&-hidroxi-18-metil-4,15-estradieno-3-ona ) ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 surpreendentemente possui a capacidade de influenciar mais fortemente a sintese de TGPB do que o tamoxifeno. 0 gestoden ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 são os únicos gestagénios com capacidade de deter in vitro de forma significativa 0 crescimento de células de carcinoma positivas em relação a receptores de estrogénios. À capacidade de inibição de crescimento de carcinomas está ligada com uma maior síntese de TGPB.

Esta acção inesperada mlimita-se ao gestoden ou a qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16, mesmo um composto muito próximo como o levonorgestrel (L-(-)-17 tf^-etinil-l?.^ -hidroxi-18-metil-4-estreno-3-ona) não apresenta qualquer acção semelhante.

No Quadro 1 apresentam-se os resultados de mediçães com receptores marcados com isótopos radioactivos para a determinação de TGPB de células de carcinoma da mama T47D tratadas in vitro com etanol (0,1$) ou, em alternativa, com de dexametasona (9α -fluor-16tf-metil-11 ,

17,21-tri-hidroxi-l,4-pregnadieno-3,20-diona ) 10 ηΜ ou estradiol (como controlo) e com, em alternativa, 500 nM do gestagénio 3-ceto-desogestrel (17/ -etinil-175»-hidroxi-18-metilll-metileno-4-estreno-3-ona) lenovorgestrel, acetato de medroxiprogesterona (17'3 -acetoxi-64 -metil-4-pregneno-3,20-diona), R 5020 (I7o( ,21-dimetil-19-nor-4,9-pregnadieno-3,20-diona) e gestoden ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 bem como para comparação tamoxifeno ou toremifeno. 0 tratamento com as substâncias de teste mencionadas bem como a determinação de TGPB foram efectuados como se segue:

1. Tratamento das células

Mantiveram-se a 37° C células

T47D (Keydar et al., (1979) Eur. J. Câncer 15 , 659-670) em cultura isenta de soro (MEM de Eulbecco sem vermelho de fenol com adição de:

mmol/L de L-glutamina MEM-Vitamina (Sigma Chemical Co.) ug/ml de insulina (de bovino) ug/ml de transferrina (humana)

Ug/ml de fibronectina (de bovino) ug/ml de EGF (Factor de Crescimento da Epiderme (de bovino)

0,5 nmol/L de CuSO^ nmol/L de selenito de sódio.

As células foram em seguida tra tadas nesta cultura com as substâncias correspondentes durante 24 horas; as substâncias foram diluidas em etanol e as culturas foram adicionadas até se ajustar uma concentração final em todas as culturas em 0,1%. Para branco serviu uma cultura que foi tratada apenas com etanol. Em seguida os sobrenadantes das culturas foram recolhidos e após adição de 50 ug/ml de albumina dé soro de bovino (BSA) foram liofiliza- 4 -

dos e dissolvidos em cerca de 10 ml de cloreto de sódio fisiológico com tampão de fosfato (PBS). Estas soluções foram dialisadas a 4°C contra 50 nM/l de acetato de amónia por 6 vezes durante 12 horas. 0 dialisado foi novamente liofilizado.

2. Medição competitiva dos receptores por radioisotopos

Como origem dos receptores necessários à medida utilizaram-se células de carcinoma de pulmão humanas A549 (podem-se obter da ATCC). 18 a 24 horas antes do teste foram cultivadas em placas de cultura com 24 alvéolos (24 well cluster dishes) de 1,8 a 2,0 x IO³ células por alvéolo em meio MEM de Dulbeoco com soro fetal de vitela a 5/ (condições: em incubadora, 37°C, atmosfera com 5/ de CO^ ^emar, 100/ de humidade atmosférica). Em seguida as células foram lavadas com 1 ml/alvéolo de solução de tampão A (meio MEM de Dulbeoco, Hepes 25 mM, pH 7,4, 0,1/ de BSA). Os liofilisados obtidos depois da diálise em 1. foram dissolvidos em 1 a 2 ml de solução de tampão A e adicionaram-se 0,2 ml desta solução ou sua diluição às células lavadas. Em seguida foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente (5/ de CO^ em ar/) e em seguida as células foram lavadas por duas vezes com solução de tampão B gelada (Hank s buffered saline com 0,1/ de BSA). Em seguida adicionaram-se por alvéolo 0,2 ml de uma solução de 125Iodo-TGEB 50 pM (cerca de 50 000 cpm/alvéolo ) em solução de tampão A. As amostras foram novamente incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente tal como se descreve acima e em seguida lavadas por 2 vezes com 1 ml de solução de tampão B gelada. Após desintegradação das células a 37°C com 0,75 ml/alvéolo de solução de tampão C (1/ de Triton X-100, 10/ de glicerina, Hepes 2mM, pH = 7,4) a radioactividade ligada foi medida com um contador . A determinação da concentração contida em cada amostra foi efectuada por comparação com uma curva de calibração obtida com TGEB puro, tendo sido as concentrações de TGEB assim determinadas normalisadas em relação ao número das células de carcinoma da mama

T47D inseridas (cf. Quadro 1 anexo).

Quadro 1

Produção de TGPB através de células de carcinoma da mama T47D in vitro

Substâncias de ensaio ng TGPB/lO- células.24 horas etanol, 0,1 / 0,2 * * dexametasona, lOnM 0,2 estradiol, 10 nM 0,2 (gestagene, 500 nM)

3-ceto-desogestrel 0,2 levonorgestrel 0,2 acetato de medroxiprogestron 0,2 R5O2O 0,2 gestrogen 3,32 - 0,71 * * tamocifeno 1,92 ± 0,08 x * toremifeno 1,60 - 0,1 * * * Limite de detecção na amostra, x * valor médio ± desvio padrão, ng/10 células n = 4.

Uma vez que, conforme já referido, os carcinomas da mama não são apenas inibidos no seu crescimento por um aumento da síntese de TGPB nas células de carcinoma, mas são também favoravelmente influenciados através de antiestrogénios (antagonistas competitivos de estrogénios), utiliza-se para a preparação de um medicamento apropri£ do para o tratamento do carcinoma da mama como agente activo de preferência, para além do gestoden ou de qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16, adicionalmente um antiestrogénio.

As proporções em peso de ambos os componentes nestas composições pode variar entre limites amplos. Assim tanto podem ser empregues quantidades iguais de gestoden ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 e do antiestrogénio como um excesso de um dos componentes. 0 gestoden ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 e o antiestrogénio são empregues em conjunto, separados, simultaneamente e/ou escalonados no tempo (sequencial), numa proporção em peso de sensivelmente 1:50 a 50:1, de preferência de 1:30 a 30:1 e espeeialmente de 1:15 a 15:1.

De preferência os gestoden ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 e o antiestrogénio podem ser aplicados combinados numa unidade de dosagem.

gestoden ou qualquer outro esteroides com uma dupla ligação 15-16 é utilizado de acordo com a presente invenção em quantidades de 0,5 a 100 mg por dia; em geral é suficiente uma quantidade de 50 mg de gestoden ou qualquer outro esteroide com uma dupla ligação 15-16 por dia.

Como antiestrogénios podem utilizar-se tanto antagonistas competitivos de estrogenios, isto é, compostos que possuem a capacidade de desalojar os estrogénios dos receptores respectivos, como também os compostos que impedem a biossintese de estrogenios através da aromatização dos precursores não aromáticos (inibidor de aromatase).

Como antiestrogénios competitivos podem utilizar-se todos os antiestrogénios competitivos utilizáveis que preencham as condições anteriormente mencionadas. Podem possivelmente ser empregues em quantidades idênticas as dos antiestrogénios já disponíveis no mercado, isto e, a dose diaria e de cerca de 5 a 100 mg pafca o tamoxifeno ou uma quantidade biologicamente equivalente de um outro antiestrogenio. Como antiestrogénios não esteroidais podem-se citar como exemplo:

Tamoxifeno = (Ζ)-2-/~p-(1,2-difenil-l-butenil)-fenoxi7-N,N-dimetil-etilamina,

Toremifeno = (Z)-2-/”p-(l, 2-dif enil-l-w-clorobutenil )-fenox.i7N,N-àimetiletilamina,

Nafoxidina = 1 -2-/^_4- (6-metoxi-2-fenil-3,4-di-hidro-l-naftil) -fenoxi7-etil-pirrolidina, cloridrato,

Mer 25 = l-/”p-(2-dietilaminoetoxi)-fenil7-2-(p-metoxifenil)—1—feniletanol e compostos de tipo 1,1,2-trifenil-l-buteno, especialmente o l,l-bis-(3 -acetoxifenil)-2-fenil-l-buteno (J. Câncer Res. Clin. Oncol., (1986), 112, págs. 119 - 124).

Também podem ser utilizados os seguintes antiestrogénios esteroidais:

d -metoxi-17-Λ -etinil-l,3,5(lO)-estratrieno-3,17JB-diol,

16J3 -etilestradiol e ácido 11-(3,17B-di-hidroxi-l,3,5(10)-estratrieno-7 Λ-il)undecanóico-(N-butil-lí-metil )-amida (EP-A 0138 504).

Como inibidores de aromatase são apropriados todos os compostos que inibem a formação de estrogénios a partir dos seus precursores, como por exemplo a l-metil-androsta-l,4-dieno-3,17-diona descrita na publicação de Patente Alemã 3 22 285, a testolactona (l7o\ -oxa-D-homoandrosta-1,4-dieno-3,17-diona ), descrita no Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism. 49, 672 (1979). os compostos androsta-4,6-dieno-3,17-diona, acetato de androsta-4,6-dieno-17c* -ol-3-ona, androsta-1,4,6-trieno-3,17-diona,

4-androsta-19-cloro-3,17-diona,

4-androsta-3,6,17-triona descritos em Endocrinology 1973, Vol. 92, N° 3, Página 874, os esteróides 19-alcinilados descritos na publicação de Patente Alemã 31 24 780, os esteróides 10-(l,2-propadienilo )

descritos na publicação de Patente Alemã 31 24 719» os derivados androstânicos 19-tio descritos no pedidos de Patente Europeia com o número de publicação 100 566, a 4-androsta-4-01-3,17-diona e os seus esteres descritos em Endocrinology 1977, Vol. 100, N5 6, Página 1684 e na Patente US 4 235 893, as l-metil-15 c< -alquil-androsha-l,4-dieno-3,17-dionas descritas na publicação de Patente Alemã 35 39 244, os derivados 108-alcinil-4,9(ll)-estradieno descritos na publicação de Patente Alemã 36 44 358 e a 1,28-metileno-6-metileno-4-androsteno-3,17-diona descrita no pedido de Patente Europeia 0250262.

Como inibidores de aromatase não esteroidais podem referir-se por exemplo o monocloridrato de 4-( 5,6,7,8,-tetra-hidroimidzo/~l, 5qí,7-piridina-5-il )-benzonitrilo (Câncer Res., 48, P. 834-838, 198) ou

A dosagem situa-se entre 1 a

1000 mg de 1-metil-androsta-l,4-dieno-3,17-diona por dia ou doses biologicamente equivalentes de outros inibidores de aromatase.

Os gestoden ou qualquer outro esteróide com uma dupla ligação 15-16 e os compostos com acção antiestrogénica podem por exemplo, ser de aplicação tópica, subcutânea, entérica pou parenteral.

Para a aplicação antérica são de considerar em especial comprimidos, drageias, cápsulas, pilulas, suspensões ou soluções, ps quais podem ser preparados dos modos habituais com os aditivos galénicos e substâncias veiculares habituais. Para a aplicação tópica ou local são de considerar por exemplo supositórios vaginais ou sistemas transdérmicos como emplastros.

Abreviaturas utilizadas:

IS = Isento de soro

SPV-CD = soro fetal de vitela tratado com carvão dextrano PV/C = filtros de fibra de vidro/ C

As células utilizadas para as investigações que se seguem foram tratadas de duas maneiras diferentes. 0 Método 1 é o método para a selecção de células T47D e MCP, o método 2 foi utilizado para a selecção de análogos de gestooen (outros esteroides com uma dupla ligação 15-16) utilizando apenas a linha de células T47D.

Método 1: As células foram ino5 2 culadas (a lCr/balão de 25cm ) em 5 ml de meio isento de vermelho de fenol contendo 5/ de SCV-CL e foram deixadas em cultura durante 4 dias até 30 a 40/ de confluência. As monocamadas foram em seguida lavadas por duas vezes com PBS e as células foram incubadas com 5 ml/balão do meio IS contendo 2 mM de glutamina, 0,2 U/ml de insulina, lOng/ml de EGP, 5/ig/ /ml de transf errina, 2 >ig/ml de fibronectina, lnM de ácido selénico e 0,5 nM de CuSO^. Após 24 horas foram substituídos com 5 ml de meio IS fresco as substâncias experimentais em quadruplicação, sob a forma de soluções em etanol 1000X (a concentração final de etanol era de 0,1/). 36 horas mais tarde as células foram marcadas para medições de síntese de ADN.

Método 2: As células foram inoculadas como descrito anteriormente em 5 ml de meio isento de vermelho de fenol contendo SCV-CL a 5/ e foram deixadas em fixação de um dia para o outro . Este meio foi removido e substituído por 5 ml de meio IS (tal como acima) contendo as substâncias em quadruplicado e as células foram cultivadas em presença da substância durante mais 6 dias com mudanças do meio/substâncias as 48 horas e as 96 horas. Após 6 dias as células foram marcadas para medição de síntese de ADN.

Para ambos os métodos anteriormente mencionados foi empregue a seguinte técnica para marcação das células e precipitação de ADÍÍ. Nas 2 últimas horas de cultura foi adicionado H-timidina a 1 pCi/ml e as células

foram incubadas a 37°C. As monocamadas das células foram lavadas por duas vezes com PBS gelado., foram recolhidas e centrifugadas. Os agregados celulares foram ressuspensos em 1 ml de água e tratados com ultra-sons (50 V, 6 X tratamento de 10 s em gelo) até nâo serem visíveis células intactas em microscopia de contraste da fase. 600 μΐ da mistura homogénea obtida foram adicionados a 600 ul de TCA a 10% gelado e o precipitado foi deixado desenvolver-se durante 60 minutos a 4°C. 0 precipitado foi recolhido sob sucção em filtros de PV/C e foi lavado com 20 ml de TCA gelado a 5% seguido de 5 ml de metanol gelado. Os filtros foram secos durante 10 minutos e contou-se a cintilição.

Baseado em : Steroid Hormones-A Practical Approach, Ed. B. Green e R. Leske. IRL. Press Oxford 1987, pp 216-217.

Método 1:

Células T47D:

Branco de etanol	100 %	*	Tam = tamoxifeno
10 nM E2	127*18	%	• ges = gestoden
10 nm Dex	89-14
10 nM DHT	97*11
1 juM 5-ceto-Des	104*12	%
1 μΜ MPA	87*14
1 μΜ R5O2O	79*9%
1 μΜ Tam *	58*11	%
1 μΜ ges * *	56*7 % (p<0,001 em	comparação com o

branco

Células MCP-7:

Branco de etanol 100 % nM E2 158-27 % nM Dex 120-16

) nM DHT	105*19
μΜ 3-ceto-Des	91*11 %
μΜ MPA	80*16
μΜ R5O2O	84*9 %
μΜ Tam *	47*6 %
μΜ ges * *	44*9 %

(ρ^Ο,ΟΟΙ em comparação com o branco)

Método 2; Todas as experiências com células T47D (n=l6)

Branco etanol	100
1 μΜ ZK 31305	13*5 %
1 μΜ ZK 48391	24*10 $
1 μΜ ZK 37655	9*5 %
1 μΜ ZK 39393	15*4 /o
1 μΜ gestoden	16±5

ZK 31 305

ZK 48 391 ZK 37 655

ZK 39 393

17o< -cloroetinil-17j-hidroxi-4, 15-estradieno-3-ona

17-hidroxi-4,15-pregnadieno-3-ona

17o< -cloroetinil-17 -hidroxi-18-metil-il-metileno-metileno-4,15-estradieno-3-ona 17 (λ -etinil-llí3 -cloro-17 3 -hidroxi-18-metil-4,15-estradieno-3-ona

Claims

reivindicações

- IS _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de carcinomas que são inibidos no seu crescimento pela proteína TGPí3 (Tumor Growth Eactor<3), por exemplo do carcinoma da mama, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo o com posto gestoden (17σ( -etinil-170 -hidroxi-18-metil-4,15-estrodieno-5-ona) em conjunto com pelo menos um antiestrogénio, ) sendo o gestoden incorporado numa unidade de dosagem de 0,5 a 50 mg.
- 2& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antiestrogénio ser tamoxifeno incorporado numa proporção de 5 a 100 mg ou numa quantidade bioequivalente de um outro antiestrogénio.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 17 de Maio de 1989, λ soh o ns P 39 16 581.4.

Lisboa, 16 de Maio de 1990 o AUEÍiTia OíIUAL Di PBOPKIEiJADE JLSDGSTKIAZi