PT92465B

PT92465B - Processo para a preparacao de peptidos e conjuntos para analise que os contem

Info

Publication number: PT92465B
Application number: PT92465A
Authority: PT
Inventors: Richard Julian Stuart Duncan
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1988-12-01
Filing date: 1989-11-30
Publication date: 1995-07-18
Also published as: AU4576789A; DK604589D0; EP0371817A3; GB8828097D0; DK604589A; PT92465A; AU623949B2; ZA899167B; JPH02209891A; HU896324D0; EP0371817A2; HUT55834A

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a péptidos susceptiveis de se ligarem a anticorpos específicos para o Virus (HIV) da Imunodeficiência Humana, â sua preparação e ãs suas utilizações. A seguir â descoberta do HIV, houve necessidade de se detectar a presença deste virus. Nos primeiros ensaios de pro dução do anticorpo HIV de tipo 1 (HIV -1) utilizou-se HIV--1 inactivado. Desenvolveram se agora segundos ensaios de produção de anticorpos que incorporam péptidos de sintese que correspondem aos epitopes que se identificaram no virus. Por exemplo, Gnann e outros, Science 237 , 11 de Setembro de 1387, descreve ensaios imunológicos de péptidos de sintese que fazem a distinção entre as infecçoes originadas por HIV-1 e HIV tipo 2 (HIV-2).

Os requerentes, verificaram agora que se podem efectuar ensaios imunológicos particularmente específicos para os anticorpos para HIV, nos quais se bloqueiam os grupos sulfidrilo livres. Os péptidos baseiam-se na sequência de um epitope imunodominante na glicoproteina gp41 de HIV-1 e na sequência correspondente de HIV-2.

De acordo com o anteriormente exposto, a presente invenção proporciona péptidos com um número superior

a 30 aminoácidos que são susceptíveis de ligarem a anticorpos específicos para um tipo de HIV; e que contém uma sequência de formula (I):

x₁x₂wgc (I) em que X^ e X₂ representam cada um deles um residuo aminoãcido o grupo carboxi da extremidade encontra-se;opcionalmente, sob a forma de uma amida; e no qual o grupo sulfidrilo de cada C se encontra bloqueado.

Os resíduos aminoácidos indicam-se por uma letra de código (Eur. J.Biochem. 138 , 9-37, 1984). De um modo preferencial o grupo da extremidade carboxi apresenta-se na forma de uma amida, isto é, encontra-se presente como -CONH2 de preferência a uma forma carboxi, isto é, presente como -COOH. De um modo importante, o grupo sulfidrilo de cadeia lateral ou cada grupo sulfidrilo de cadeia lateral encontra-se bloqueado. Isto evita a formação de pontes dissulfeto, evita a oxidação dos resíduos de cisteina e evita a conjugação não adequada de pêptidos a veiculos.

Os pêptidos compreendem a sequência de fórmula (I). Para os pêptidos que se ligam ao anticorpo para HIV-1, XI ê, de um modo preferencial, G e X2 é I,L ou M.

Para os pêptidos que se ligam ao anticorpo HIV-2, XI é, de um modo preferencial, N e X2 é S. Podem, no entanto, seleccionar-se outros resíduos aminoácidos, desde que o péptido seja capaz de se ligar ao anticorpo HIV, conforme desejado. Também podem proporcionar-se, de um modo característico resíduos adicionais na extremidade N e/ou na extremidade C da sequência de fórmula (I) de tal modo que os anticorpos para HIV se liguem aos pêptidos. Um prolongamento da extremidade N pode ser de mais do que 14, por exemplo, mais do que 8 ou mais do que 4, re siduos aminoácidos. Pode proporcionar-se um numero superior a 14 aminoácidos, por exemplo, superior a 8 ou superior a 6 resíduos aminoácidos, como um prolongamento da extremidade C.

A sequência da fórmula (I) deriva de uma porçáo de um epitope imuno-dominante na glicoproteína gp41 de HIV-1 e do sitio correspondente de HIV-2. Estes são os ami2

noácidos de 599 a 603 para HIV-1 e, de 593 a 597 , para HIV-2, sistema de numeração para HIV-1 está de acordo com Wain-Hobson e outros, Cell 40, 9 (1985). O sistema de numeração para HIV-2 estã de acordo com Guyader e outros, Nature 326, 662 (1986). Os aminoácidos de cada um dos lados da sequência da fórmula (I) podem, no entanto, ser deduzidos a partir da informação sequencial sobre estirpes especificas de HIV. Os peptidos preferenciais compreendem a sequência dos residuos aminoácidos de 598 a 609 de uma estirpe de HIV-1 ou dos residuos aminoãcidos correspondentes de uma estirpe de um outro tipo de HIV. Contudo, para HIV-2, os peptidos preferenciais compreendem residuos aminoácidos de 592 a 603. Pode modificar-se a sequência por substituição de um ou mais aminoácidos, o que náo afecta a capacidade do péptido para se ligar ao anticorpo desejado, isto é, ao anticorpo especifico para HIV-1 ou para HIV-2.

Podem escolher-se as substituições aminoãcidas adequadas que conservem o carácter fisico-quimico da sequência original, por exemplo, em termos de densidade de carga, hidrofilicidade/hidrofobicidade, dimensões e configuração. As substituições candidatas incluem S para T e vice-versa, E para D e vice-versa e Q para N e vice-versa. Também o re siduo 598, no caso de um péptido para HIV-1 ou o residuo 592, no caso de um péptido HIV-2, pode ser K.

Os peptidos compreendem, habitualmente pelo menos 6, por exemplo, pelo menos 9 ou, pelo menos 12, residuos aminoácidos.

Os peptidos não contem mais do que 30 residuos aminoácidos, por exemplo mais do que 25 ou mais do que 15 residuos aminoácidos. De um modo preferencial a sequência total do péptido corresponde a uma sequência natural de uma estirpe de HIV, incluindo a sequência residuos aminoácidos de 599 a 6o3, no caso de HIV-1 ou a contrapartida dos residuos no caso de outro tipo de HIV. Uma tal sequência natural pode, contudo incluir um ou mais substituições, conforme anteriormente referido. Exemplos de estirpe de HIV a partir das quais podem derivar-se as sequências peptidicas, incluem os isolatos seguintes:

HIV-1 (Z-3) : Wiley et al, PNAS USA, £L3, 5038 (1986); HIV-1 (LAV_BRU; HTLV-IIIB; HTLV-II ; WMJ~1;ARV~2): Wain-Hobson et al (1985); Ratner et a_l, Nature 313, 277 (1985); Starcich et al , Cell, 45, 637 (1986); e Sanchez-Pescador et al, Science,

227, 484 (1985); HIV-1 (LAV-ELI) e HIV-1 (LAV-MAL): Alizon et al, Cell, 46 , 36 (1986); e HIV-2_D^:

KUU

Guyader et al (1987)

Os péptidos preferenciais possuem as sequências :

HIV-1:LGLWGCSGKLIC

LGIWGCSGKLIC

LGIWGCSGKHIC

LGMWGCSGKHIC HIV-2:NSWGCAFRQVC

KYLQDQARLNSWGCAFRQVC

AIEKYLQDQARLNSWGC KNSWGCAFRQVCHTTVPWVN

RVTAIEK YLQD QARLN S WGCAFRQVC

O grupo sulfidrilo de cada resíduo de cisteina encontra-se bloqueado.

O grupo de bloqueio sulfidrilo pode ser acetamidometilo ou pode ser derivado de um mercúrio orgânico maleimida ou um agente de bloqueador de dissulfetos. O reagente de Ellman, di-tiodipiridilo, é um exemplo de agente bloqueador de dissulfetos adequado. De um modo preferencial, o grupo bloqueador deriva de uma N-etilmaleimida ou é acetamidometilo e, possui a fórmula:

Os péptidos da presente invenção sao péptidos de sintese. Podem ser preparados por sintese química. Podem empregar-se métodos de fase sólida ou de solução de sin4

tese peptidica. Por isso, pode produzir-se um péptido, segundo um processo que consiste em:

(a) condensar aminoácidos simples e/ou péptidos representativos, de dois ou mais aminoácidos, de tal maneira que os aminoácidos surjam na fórmula (I), de modo que, quando o aminoácido for a cisteina o seu grupo sulfidrilo se encontra livre ou bloqueado, de modo a obter-se um péptido de fórmula (I) em que a extremidade carboxi se encontra livre ou sob a forma de uma amida; e (b) bloquear, se necessário o grupo sulfidrilo livre do ou de cada um dos resíduos de cisteina que possuem um dito grupo no péptido resultante de fórmula.

Na sintese de fase sólida, a sequência aminoãcida do péptido desejado constroi-se sequencialmente a partir do aminoácido da extremidade C que se liga a uma resina insolúvel. Depois de se produzir o péptido desejado, efectua -se a sua clivagem, a partir da resina. Quando se emprega a sintese de fase solúvel, pode construir-se, novamente, o peptido, a partir do aminoácido da extremidade N. 0 grupo carboxi deste ãcido mantém-se bloqueado através de um grupo protector adequado, que se remove no fim da sintese.

Qualquer que seja a técnica utilizada, de fase sólida ou de fase solúvel, cada um dos aminoácidos adicionados ao sistema de reacçao possui de um modo caracteristico, um grupo -amino protegido e um grupo carboxi activado. Pode proteger-se um grupo amino com um grupo fluoren-9-il-metoxicarbonilo (Fmoc) ou t-butoxicarbonilo (Boc) . Pode activar-se um grupo carboxi como um ester de pentafluorofenilo ou de l-oxo-2-hidroxi-di-hidrobenzotriazina.

Pode efectuar-se cada passo de condensação na presença de diciclo-hexilcarbo-di-imida ou de 1-hidroxibenzotriazol. Habitualmente, também se protegem os grupos funcionais da cadeia lateral, por exemplo o grupo amino da cadeia lateral da lisina, o grupo hidroxi da cadeia lateral de uma treonina ou o grupo sulfidrilo da cadeia lateral de uma cisteina. Apõs cada um dos passos de sintese, remove-se o gru5

po de protecção pç -amino. No entanto, quaisquer grupos protectores de cadeia lateral são removidos apenas no fim da sintese embora possam conservar-se se se desejar. Contudo, no caso de um grupo sulfidrilo protegido, pode conservar-se o grupo protector, quando este é necessário para desempenhar uma função de bloqueio. Ouando se pretende um grupo bloqueador alternativo, remove-se o grupo protector.

Podem preparar-se os péptidos com grupo carboxi ou amida na extremidade C, conforme desejado. Na sintese de péptidos de fase sólida, esta decisão pode ser determinada pelo modo como o aminoácido da extremidade N se liga â resina de suporte E/ou ao modo como se cliva o peptido final da resina. Habitualmente a resina consiste num estireno e/ou num polímero de divinilbenzeno.

Pode ligar-se o aminoácido da extremidade C à resina através de uma ligação ester que pode ser clivada por um ácido forte tal como o HBr no ácido trifluoro-acêtico ou HF para proporcionar o peptido com um grupo carboxi na extremidade C. No entanto a amonolise pode proporcionar a amida correspondente.

Um método alternativo para se obter uma amida peptidica por sintese de fase sólida consiste em fazer com que o aminoácido da extremidade C do peptido se ligue à resina através de uma ligação peptidica aminobenzidrilo.

Isto pode obter-se por acoplamento com diciclo-hexil-carboxi-imida e pode clivar-se com HF, habitualmente a frio. Para a sintese de fase solúvel, se a presença de um grupo carboxi ou amida na extremidade C pode depender do modo como o grupo carboxi do aminoácido da extremidade C se encontra bloqueado e, no fim da sintese, náo bloqueado. Pode converter-se um peptido com um grupo carboxi na extremidade C num com um grupo amida na extremidade C e vice-versa.

Podem, também, preparar-se os peptidos de acordo com metodologias de ADN recombinante. Por isso, se proporciona uma sequência de ADN que codifica o peptido, Prepara-se um vector de expressão que incorpora a sequên6

cia de ADN e que é capaz de expressar o peptido quando num hospedeiro adequado. A sequência de ADN localiza-se entre os sinais de iniciação e de terminus, no vector. Também se proporcionam elementos de controlo de transcrição, em especial um pro motor para a sequência de ADN e um local de terminus de transcrição. Fornece-se a sequência de ADN na banda correcta de modo a tornar possível a expressão do peptido num hospedeiro compatível com o vector.

Pode empregar-se qualquer sistema hos pedeiro vector adequado. 0 vector pode ser um plasmido. Nestas circunstâncias, pode utilizar-se um hospedeiro bacteriano ou uma levedura. Como alternativa, o vector pode ser um vector virico. Pode utilizar-se para transfectar células de uma linha de células de mamíferos no sentido de se obter a expressão do plasmido.

Podem prover-se os peptidos com grupos sulfidrilo bloqueados, segundo uma de duas vias. Em primeiro lugar, podem utilizar-se cisteinas com grupos sulfidrilo bloqueados, num passo (a) quando se constroi o peptido a partir de precursores aminoacidos. Em segundo lugar, pode obter-se um peptido com grupo (a) sulfidrilo livres, que então se bloqueiam. Um agente bloqueador de sulfidrilos reage com a cisteína livre ou com peptido com a sequência desejada, dependendo da via.

Pode utilizar-se qualquer agente de bloqueio do grupo sulfidrilo, adequado. Exemplos destes agentes incluem a,cetamido-metanol e organomercurio, maleimida e agentes de bloqueio dissulfidico. 0 reagente de Ellman, ditipiridilo, e um exemplo de um agente adequado de bloqueio dissulfidico. No entanto, dã-se preferência a N-etilmaleimida ou acetamido-metanol,

Quando se obtem um peptido com grupo(s) sulfidrilo livres os quais se pretendem, então bloquear, reduz-se, primeiro, o peptido. Utiliza-se, de um modo caracteristico, um agente redutor poderoso tal como ditionite, 2-mercapto-etanol, ditiotreitol ou ditioeritritol. Dá-se preferencia a ditiotreitol, Quando se utiliza apenas um pequeno excesso de

agente redutor, não ê necessário separar o péptido reduzido antes de se adicionar o agente bloqueador do grupo sulfidrilo.

Numa síntese tipica, reduz-se uma solução de péptido (100-500 /*M) num tampão de PH 7, aproximadamente, com um excesso molar de aproximadamente 2 vezes, de um agente redutor tal como ditiotreitol (isto ê, 200-1000 >UM) durante, pelo menos, 20 minutos, habitualmente, durante cerca de 30 minutos. Decorrido este intervalo de tempo, adiciona-se o agente de bloqueio tal como N-etil-maleimida, para proporcionar um excesso molar de aproximadamente duas vezes sobre o sulfidrilo total que se encontra presente. Deixa-se ocorrer a reacção de bloqueio durante, pelo menos, uma hora. Pode então filtrar-se através de gel o péptido modificado, para qualquer solução tampão adequada. Como alternativa, pode reactivar-se posteriormente, o péptido modificado, com reagentes de conjugação tais como ãcido S-acetil-tioglicõlico, ester de N-hidroxi-succinimida (SATA) ou 4-(N-maleimido-metil)-ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC) antes da filtração em gel.

Pode utilizar-se um péptido da presente invenção em ensaios para anticorpos especificos para HIV-1 e/ou HIV-2. Pode utilizar-se, no ensaio, uma amostra de ensaio de qualquer fluido fisiologico adequado, como por exemplo, urina plasma, sangue, soro, semen, lágrimas, saliva ou fluido cerebro-espinal. O método de ensaio consiste em fazer contactar uma amostra de ensaio com o péptido e determinar se algum anticorpo se liga ao péptido.Com este objectivo, pode fornecer-se um conjunto de ensaio que compreende um péptido da presente invenção e meios para a determinar se qualquer anticorpo contra HIV, que pode encontrar-se presente na amostra de ensaio se liga ao péptido.

Pode empregar-se uma diversidade de formatações de ensaio. Pode utilizar-se o péptido para capturar de modo selectivo um anticorpo contra HIV-2 a partir da solução, marcar radioactiva e selectivamente tal anticorpo jã capturado ou capturã-lo e marca-lo. Para além disso, pode utilizar-se o péptido numa diversidade de formatações de ensaios homogéneos nos quais os anticorpos que reagem com o péptido

sao detectados numa solução sem separaçao de fases. Pode também, utilizar-se o péptido para detecção do antígeno HIV.

Os tipos de ensaios nos quais se utiliza o péptido para se capturarem anticorpos a partir de uma solução, envolve a imobilização do péptido sobre uma superfície sólida. Esta superfície deverá ser capaz de ser lavada de algum modo. As espécies de superfícies que se podemutilizar são polímeros de diversos tipos (moldados em recipientes de microtitulação; gotas; varetas de fixação de diversos tipos; varetas de aspiração; eléctrodos; e dispositivos ópticos), partículas (por exemplo, latex; sangue estabilizado, células bacterianas e fúngicas; esporos; ouro ou outras soluções coloidais metálicas; e coloides proteináceos; sendo o tamanho usual das partículas de 0,1 a 5 microns), as membranas (por exemplo nitrocelulose; papel; acetato de celulose; e membranas de elevada porosidade/e de área elevada de um material orgânico ou inorgânico).

A ligação do péptido às superfícies pode ser por adsorção passiva a partir de uma solução de uma composição óptima que pode incluir surfactantes, solventes, sais, caotropes; ou por ligação química activa. A ligação activa pode fazer-se através de uma diversidade de grupos funcionais reactivos ou activãveis que se podem ligar ã superficie (por exemplo agentes condensantes; esteres activos, halogenetos; anidridos; grupos amino, hidroxilo ou carboxilo; grupos sulfidrilo; grupos carbonilo; grupos diazo; grupos não saturados) . De um modo alternativo a ligação activa pode efectuar-se através de uma proteína (ela própria ligada à superficie, de um modo passivo ou através de uma ligação activa) ou através de uma protéina de transporte tal como a albumina ou a caseína, âs quais se pode ligar quimicamente o péptido, segundo qualquer um dos diversos métodos e que pode conferir vantagens devido ao ponto isoeléctrico, carga, hidrofilicidade ou outras propriedades fisico-quimicas. Pode, também, ligar-se o péptido â superficie (usualmente mas não necessariamente uma membrana) a seguir à separação electroforética de uma mistura de reacção por exemplo uma precipitação imunológica.

Após contacto (reacção) da superfície que suporta o peptido com uma amostra de ensaio e remoção do excesso de amostra, quando necessário, segundo uma diversidade de métodos (lavagem, filtração, magnetismo, acção da capilaridade), detecta-se o anticorpo capturado segundo qualquer dos meios que proporcionem um sinal detectável. Isto pode ser conseguido, por exemplo, utilizando uma molécula ou partícula marcadas, conforme anteriormente definido que reagirá com o anticorpo capturado (por exemplo uma proteína A ou uma proteína G e similares; anti-espêcies ou anti-sub-tipo de imunoglobulina; factor reumatõide; anticorpo para o peptido utilizado de uma forma competitiva ou bloqueante; ou qualquer molécula contendo o epitope do peptido incluindo, o próprio peptido e outras proteínas e péptidos derivados directamente ou indirectamente de HIV.).

sinal detectável pode ser óptico ou radioactivo ou fisico químico, obtido por marcação directa da referida molécula com, por exemplo, um corante, um marcador radioactivo, espécies electroactivas, espécies de ressonância magnética ou fluoroforo; ou indirecta por marcação da molécula ou partículas com um enzima susceptivel de proporcionar uma alteração mensurável de qualquer espécie. Como alternativa, o sinal detectável pode dever-se, por exemplo, aglutinação, efeito de difracção ou efeito birefringente que ocorre se alguma das referidas superfícies forem partículas.

Esses tipos de ensaios nos quais se utiliza o peptido para marcar um anticorpo já capturado, requer a marcação do peptido de algum modo que permita a sua detecção A marcação pode ser directa, ligando quimica ou passivamente, por exemplo, uma partícula radio de ressonância magnética, ou enzima marcado ao peptido; ou indirecta por ligação de qualquer forma de marcador a uma molécula que reage, ela própria com o peptido, por exemplo, anticorpo para o peptido, com subsequente reacção da molécula marcada com o peptido. .

A técnica quimica de ligar um marcador a um peptido pode efectuar-se directamente através de uma porção ainda presente no peptido, tal como um grupo amino ou através de um grupo inserido tal como uma maleimida. A ca10 oSSSSBs®BrseáSS2^Sas,i -

ptura do anticorpo pode efectuar-se sobre qualquer das superfícies jã mencionadas, por qualquer reagente, incluindo adsorção passiva ou activa, que originará a ligação de anticorpos específicos ou complexos imunológicos. Pode efectuar-se uma captura especial do anticorpo por anti-espécies ou anti-subtipos de imunoglobulina, factor reumatoide, proteínas A, G e similares, ou, por qualquer molécula contendo o epitope que compõe o pepetido, conforme anteriormente descrito.

Para esses ensaios, nos quais se utiliza o péptido para se obter uma medição do antigeno HIV, numa amostra, pode marcar-se o péptido de acordo com qualquer dos métodos anteriormente descritos e, utilizar-se quer numa forma de ligação competitiva de tal modo que a sua ligação por qualquer molécula especifica sobre qualquer das superfícies anteriormente exemplificadas é bloqueada pelo antigeno na amostra, quer de um modo não competitivo quando o antigeno na amostra se liga especificamente ou não especificamente a qualquer das superfícies anteriormente referidas, em vez de se ligar a uma molécula bi-ou polivalente (por exemplo um anticorpo) e se utilizam as restantes valências da molécula para capturar o péptido marcado.

Geralmente, nos ensaios homogéneos marcam-se o péptido e o anticorpo, pelo que, quando o anticorpo reage com o péptido em solução livre, os dois marcadores interferem, por exemplo para permitir a transferência não radioactivada energia capturada por um marcador para outro marcador, com detecção adequada do segundo marcador escitado ou do primeiro marcador extinto (por exemplo, por fluorimetria, ressonância magnética ou medição enzimática). A adição de antigeno ou anticorpo a uma amostra origina a restrição da interacção do par marcado e, por isso, a um nível diferente de sinal no detector .

Um ensaio adequado para detecção dos anticorpos para HIV-1 ou HIV-2 ê o ensaio imunolígico directo de intercalamento enzimático (EIA). Revestem-se recipientes de microtitulação com um péptido da presente invenção ao qual se liga um anticorpo de HIV-1 e um anticorpo de HIV-2. Adicionam11

-se simultâneamente, uma amostra de ensaio e um peptido da pre sente invenção ao qual se liga o referido anticorpo para HIV-1 e o anticorpo para HIV-2 e, ao qual se encontra ligado um enzi ma (peptido conjugado).

Qualquer anticorpo especifico se liga ao peptido que reveste o recipiente e ao peptido conjugado. De um modo caracteristico utiliza-se o mesmo peptido de fórmuma (I) em ambos os lados da sandwich. Após lavagem, detecta-se o enzima que se ligou utilizando um substrato especifico que envolve uma alteração de coloração. Um conjunto de ensaio para utilização num tal EIA, compreende:

(1) um peptido da presente invenção ao qual se liga um anticorpo para HIV-1 e um anticorpo para HIV-2, marcado com um enzima;

(2) um substrato para o enzima;

(3) meios que proporcionem uma super ficie na qual se imobiliza um peptido náo marcado, da presente invenção ao qual se liga o anticorpo para HIV-1 e o anticorpo para HIV-2; e (4) por opção, soluções de lavagem e/ou tampões.

Podem utilizar-se os péptidos da pre sente invenção, num ensaio combinado para a detecção dos anticorpos especificos para HIV-1 e HIV2. Um tal ensaio consiste em fazer contactar uma amostra de ensaio com um peptido da pre sente invençwao ao qual se liga um dos anticorpos para HIV-1 e um dos anticorpos para HIV-2 e com um popipeptido que apresenta um epitope ao qual se liga o outro anticorpo para HIV-1 e o outro anticorpo para HIV-2 e determinação da ligação de qualquer anticorpo ao peptido da presente invenção e/ou ao referido polipéptido. Podem adoptar-se quaisquer dos ensaios anteriormente definidos.

Um conjunto de ensaio adequado para utilização num ensaio combinado para detecção dos anticorpos especificos para HIV-1 e HIV-2, compreende um peptido da presente invenção ao qual se liga um dos anticorpos para HIV-1

e um dos anticorpos para HIV-2, um polipetido que apresenta um epitope ao qual se liga o outro anticorpo para HIV-1 e o outro anticorpo para HIV-2 e, meios para determinar se qualquer anticorpo contra HIV-1 ou HIV-2 que podem existir numa amostra de ensaio se liga, ao péptido da presente invenção ou ao referido polipéptido.

ensaio EIA anteriormente descrito ê adequado para ser utilizado num ensaio combinado. Revestem-se adicionalmente recipientes de microtitulação com um polipeptido que apresente um epitope ao qual se ligue o outro anticorpo para HIV-1 e o outro anticorpo para HIV-2. Adiciona-se o dito polipetido, por exemplo, o mesmo polipéptido, marcado com um enzima, simultaneamente com a amostra de ensaio e o péptido conjugado da presente invenção. O marcador enzimãtico no péptido conjugado e no polipéptido conjugado pode ser o mesmo ou diferente. Bem como componentes de (1) a (4) , conforme anteriormente descrito, pelo que um conjunto de ensaio para utilização num ensaio EIA compreende:

(5) um polipéptido que apresenta um epitope ao qual se liga o outro dos anticorpos HIV-1 e o outro dos anticorpos para HIV-2 e que é marcado com um enzima:

(6) um substrato para o enzima, se o enzima fór diferente do que marca o péptido (1); e (7) meios que proporcionem uma superficie sobre a qual se imobilize um polipéptido nao marcado que apresenta um epitope ao qual se liga o outro anticorpo para HIV-1 e o outro anticorpo para HIV-2. Quando o péptido não marcado da presente invenção e o polipéptido não marcado do componente (7) se encontram imobilizados na mesma superficie, os meios referidos em (3) e (7) são os mesmos. O polipéptido ao qual se liga o outro anticorpo para HIV-1 e o outro anticorpo para HIV-2, pode ser um polipéptido preparado por sintese quimica. De um modo alternativo, pode ser um polipéptido recombinante ,

HIV-1 provoca, em especial, dois tipos de anticorpos. Sao o anti-p24 contra proteina gag e an13

ti-gp41 contra a proteína env. Actualmente preparou-se, uma construção de fusão especifica à qual anti-p24 e anti-gp41 se ligam. Pode, por isso, utilizar-se esta protéina como o polipe ptido que apresenta um epitope ao qual se liga o anticorpo para HIV-1. A protéina possui a sequência:

20 MetAsnSerProAspThrGlyHisSerSerGlnValSerGlnAsnTyrProIleValGln pl8 p24

AsnlleGlnGlyGlnMetValHisGlnAlalleSerProArgThrLeuAsnAlaTrpVal 50 6o

LysValValGLUGluLysAlaPheSerProGluValIleProMetPheSerAlaLeuSer

80

GluGlyAlaThrProGlnAspLeuAsnThrMetLeuAsnThrValGLyGlyHisGlnAla

100

AlaMetGlnMetLeuLysGluTh.rIleAsnGluGluAlaAlaGluTrpAspArgValHis

110 120

ProValHisAlaGlyProIleAlaProGlyGlnMetArgGluProArgGlySerAspIle

130 140

AlaGlyThrThrSerThrLeuGlnGluGluIleGlyTrpMetThrAsnAsnProProIle

150 160

ProValGlyGluIleTyrLysArgTrpIlelleLeuGlyLeuAsnLysIleValArgMet

170 180

TyrSerProThrSerlleLeuAspIleArgGlnGlyProLysGluProPheArgAspTyr

190 200

ValAspArgPheTyrLysThrLeuArgAlaGluGlnAlaSerGlnGluValLysAsnTrp

210 220

MetThrGluThrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspCysLysThrlleLeuLysAla

230 240

LeuGlyProAlaAlaThrLeuGluGluMetMetThrAlaCysGlnGlyValGlyGlyPro

250 260

AsnSerProArgGlnLeuLeuSerGlylleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAla

IleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlylleLysGlnLeuGlnAla

290 300

ArglleLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCys

310 320

SerGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSer

330 340

LeuGluGlnlleTrpAsnAsnMetThrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyr

350 360

ThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsn GluGln

370

GluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPheAsnGlyAspPro

Designa-se esta proteina como DM626. A sua preparação encontra-se descrita no Pedido de Patente Europeu N, 88308170.5, dos mesmos investigadores. Pode modificar-se a sequência da proteina por substituição de um ou mais ami noácidos, inserções e/ou eliminações e/ou por uma extensão numa ou em ambas as extremidades, demonstrando que uma proteina que possua uma tal sequência modoficada ê capaz de se ligar a anti-p24 e a anti-gp41 e que existe um grau de homologia de, pelo menos, 75% entre as sequências modificadas e não modifica das.

A sequência náo modificada é basicamente uma fusão de porções de proteínas p24 e g41 de CBL-1 isolado de HIV-1 (WO 86/04423). Estas porções correspondem, respectivamente, aos aminoácidos de 121 a 356 e de 542 a 674, seguindo um sistema de numeração idêntico ao de Meusing e outros Nature, 313, 450-458 (1985). O inicio destas porções indica-se anteriormente nos aminoácidos 17 e 244, respectivamente. Os aminoácidos de 5 a 16 anteriores derivam da proteina pl8. Os aminoácidos de 1 a 4, de 241 a 243 e de 377 a 379 anteriores, derivam do vector de expressão a partir do qual se obteve a

construção de fusão e a partir de manipulação de ADN.

Para modificar-se a sequência por uma ou mais substituições aminoãcidas, inserções e/ou eliminações. Isto pode acontecer em qualquer local da sequência, mas especialmente, nas porções da sequência que não são derivadas das proteinas p24 e gp41. No caso de substituições, podem substituir-se um ou mais dos aminoácidos da sequência não modificada por um ou mais outros aminoácidos que conservem o carácter fisico-quimico da sequência, isto é, em termos de densidade de carga, hidrofilicidade/hidrofobicidade, tamanho e configuração. Por exemplo, a ser pode ser substituída por Thr e vice-versa, a glu pode ser substituída por Asp e vice-versa e Gin pode ser substituida por Asn e vice-versa. 0 residuo de Ser no aminoácido 10 pode ser substituído por Asn.

Pode, também, prolongar-se a sequência numa ou em ambas as extremidades. Isto pode não ser mais do que a provisão de um resíduo adicional Gys na extremidade carboxi. No entanto, pode prolongar-se a sequência por mais de 50 resíduos aminoácidos numa ou em ambas as extremidades. Podem, contudo, adicionar-se mais do que 40 aminoácidos, por exemplo, mais do que 20 aminoácidos, ã extremidade amino e/ou extremidade carboxi da sequência não modificada. Contudo, o aminoácido da extremidade amino, será, normalmente Met, devido ao codão de iniciação de transferência da sequência de ãcido nucleico a partir do qual se expressa a proteína. Isto passa-se, a menos que a proteína tenha sido expressa fundida nas suas extremidades amino a uma proteína veículo, e que a proteína de fusão tenha sido clivada para libertar a protei na da presente invenção.

Pode modificar-se a sequência por introdução de alterações correspondentes na sequência de ADN que codifica a proteína não modificada. Pode conseguir-se isto, de acordo com qualquer técnica adequada, incluindo restrição da sequência com uma endonuclease, inserção de ligantes, utilização de uma exonuclease e/ou de uma polimerase e técnicas de mutagenese comandada de um sitio. Pode determinar-se facilmente se a sequência de ADN modificada codifica

uma proteína modificada à qual anti-p24 e anti-gp41 sao capazes de se ligar. Efectua-se a clonagem da sequência modificada num plasmido adequado, transforma-se uma célula hospedeira com o plasmido e ensaia-se a proteina expressa quando à sua capacidade para se ligar a anti-p24 e anti-gp41. Também deve existir um grau de homologia de, pelo menos 75%, por exemplo 85% ou mais ou 90% ou mais, entre as sequências aminoácidas das proteínas modificadas ou não modificadas.

Pode conseguir-se o anticorpo especifico para um péptido da presente invenção, utilizando o referido péptido. O anticorpo pode ser policlonal ou monoclonal. Pode utilizar-se o anticorpo em ensaios de controlo de qualidade de lotes de péptido; purificação da proteina recombinante, lisatos peptidicos ou viricos; localização de epitopes; quando marcados, como um conjugado num ensaio de tipo competitivo para detecção de anticorpos; e em ensaios de detecção de antigenos.

Podem obter-se os anticorpos policlonais por injecção de um péptido da presente invenção, acoplado a um veiculo num mamífero ou noutro animal tal como um rato, uma ratazana, uma cabra ou um coelho e recuperando o anticorpo contra o péptido assim produzido. O conjugado peptido-veículo, administra-se, geralmente, como uma formulação injectável compreendendo também um diluente fisiologicamente aceitável. Podem incluir-se na formulação adjuvantes tal como o adjuvante completo de Freund (FCA) ou o adjuvante incompleto de Freund (FIA). Imunizam-se os animais durante um período de tempo adequado, sangram-se os animais a intervalos de tempo adequados para se ensaiar a actividade antipeptidica. Quando se atinge o nível de actividade adequada, sacrificam-se os animais, extraiem-se e purificam-se os anticorpos, por exemplo por precipitação com sais e cromatografia de afinidade utilizando péptidos de sintese imobilizados.

Pode preparar-se um hibridoma que produz anticorpos monoclonais, fundindo células perpétuas com células que produzem anticorpos contra um péptido da presente invenção. De um modo característico, imuniza-se um hospedeiro

animal tal como um rato, em relaçao ao péptido. Remove-se o baço do hospedeiro imunizado. Fundem-se as células esplénicas com células de uma linha celular perpétua tal como a linha celular de um mieloma, por exemplo de um rato. Deste modo, produz-se um hibridoma que segrega um anticorpo monoclonal especifico para o péptido. Pode purificar-se o anticorpo, conforme anteriormente referido. Proporcionam-se três Exemplos de Referência.

Exemplo 1 de Referência: prepação do péptido KYLQDQARLNSWGGCAFR

QVC com um grupo amida na extremidade carboxi

Sintetizou-se o péptido utilizando uma adaptação do método de Merrifield (Merrifield, JACS, 85,21492154, 1963) descrito por Houghten (Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 5131-5135, 1985. Sintetizou-se o péptido sobre uma resina de p-metilbenzidrilamina divinibenzeno. O grupo pro tector -amino de cada, uma dos . aminoácidos foi t-butoxicarbonilo (Boc). Cada ciclo de acoplamento efectuou-se conforme se segue;

1. lavagem da resina com diclorometano-10 minutos.

2. lavagem com di-isopropiletilamina a 5% em diclorometano - 2 minutos X 3.

3. lavagem com diclorometano - 1 minuto X 2 .

4. acoplamento aminoãcido, t-butoxicarbonilo, em diclorometano, di-isopropilcarbo-di-imida 0,3M - 60 minutos.

. idêntico a 3.

6. desprotecção com ácido trifluoroacético a 50% em diclorometano - 20 minutos.

7. lavagem com diclorometano - 1 minuto

X 6.

8. volta ao ponto 2.

Quando se completarem os ciclos de acoplamento, cliva-se o péptido da resina,, utilizando fluoreto de hidrogénio, durante 1 hora com um anisol de limpeza a 10%.

Obteve-se assim o peptido com um grupo amida na extremidade car boxi. Depois, lavou-se com éter, secou-se, dissolveu-se em ácido acético a 15% e liofilizou-se.

Exemplo 2 de Referência: Preparaçao dos peptidos AIEKYLQDQARLNSWGC e KNSWGCAFRQVCHTTVPWVN cada um deles com grupos amida na extremidade carboxi.

Preparou-se cada um dos peptidos conforme descrito no Exemplo 1. Por esse motivo, cada um dos pepti dos possuia um grupo amida na extremidade carboxi.

Exemplo 1: Bloqueio dos grupos sulfidrilo

Bloquearam-se os grupos sulfidrilo de cada um dos peptidos sintetizados nos Exemplos 1 e 2 de Referên cia, conforme se segue:reduziu-se uma solução de peptido (100500 ^M) em tampão HEPES 25 nM, a pH7, o, por reacção com duas vezes um excesso molar de ditiotreitol (isto ê, 200-1000 M) durante 30 minutos. No entanto, no caso do peptido AIEKYLQDQARL NSWGC, utilizou-se um excesso molar de 1 vez de ditiotreitol (100-500 yU.M) uma vez que o peptido possuia apenas um resíduo de cisteína.

Adicionou-se N-etilmaleimida para proporcionar um excesso molar de dobro sobre todos os grupos sulfidrilos presentes. Permitiu-se que ocorresse a reacção de bloqueio, durante 1 hora. Depois, filtrou-se o peptido modificado com gel numa solução tampão.

Exemplo 2; EIA intercalado directo utilizando o peptido KYLQDQARLNSWGCAFRQVC com grupos sulfidrilo bloqueados

Revestiram-se recipientes de microtitulação com o peptido, passivamente. Adicionaram-se, então amostras de soros aos recipientes preparados conjuntamente com o peptido conjugado. O enzima do peptido conjugado era a fosfatase alcalina. Após um período de incubação de 1 hora, lavaram-se os recipientes e adicionou-se substrato para o enzima. Este foi nicotinamida - adenina -dinucleotido- fosfatase (NADP) com um sistema de amplificação cíclica. Averiguou-se o anti-HIV-2 nas amostras de ensaio por comparação com um pa19

drão tomado ao longo do procedimento. Indicam-se os resultados no Quadro 1.

QUADRO 1

Amostras que se Amostras que se . „

Amostras que se sabem ser HIV-2 sabem ser HIV-1 sabem ser HlV-ve +ve +ve +ve em ensaio

115 ve em ensaio ϋ

170

Exemplo 3 de Referência: Ensaio imunolõgico para detecção de anticorpos para o virus da Imunodeficiência Humana Tipo 1+2 (HIV-1) e HIV-2) utilizando o péptido de HIV-2 KYLQDQAR1NSW

GCAFRQVC e a construção de fusão HVI-1 da sequência referida nas páginas 14-16, da presente invenção.

Revestiram-se as placas de microtitulaçao com os péptidos. Depois, adicionaram-se as amostras de soros aos recipientes preparados, conjuntamente com os peptidos conjugados. Os conjugados eram constituídos por uma mistura dos mesmos antígenos que tinham sido marcados com fosfatase alcalina. Após um período de incubação de cerca de 1 hora, lavaram-se os recipientes e, adicionou-se o substrato para o enzima. Este foi nicotinamida-adenina-dinucleotido-fosfatase (NADP) com um sistema de amplificação ciclico que origina a formação de um produto colorido. Após incubação, pôs-se termo âs reacções enzimãticas e leu-se a côr espectrofotomêtricamente. A quantidade de conjugado e, por isso, da cor,nos recipientes estava directamente relaccionada com a concentração de anticorpo para HIV na Amostra. Indicam-se os resultados nos Quadros 2, 3 e 4.

QUADRO 2

Detecção de anticorpos para HIV-1 e HIV-2 em amostras de soro (centros A, C, D e E) e amostras de Plasma (centro B) a partir de dadores europeus de sangue

Centro	N?. de amostras Ensaiadas	Nao Reactivas	Inicialmente Reactivas	Repetidamente Reactivas
A	2064	2055	9	3
B	1842	1836	6	1
C	1897	1893	4	2
D	1757	1756	1	0
E	1557	1553	4	1
TOTAIS	9117	9093	14 (0.26%)	7 (0.08%)

QUADRO 3

Amostras clinicas Europeias

A reactividade dos Soros de Pacientes com AIDS, Situações Associadas a AIDS, grupos de alto risco e com outras doenças.

Grupo Clínico

N. de Amostras Anticorpos Posi- Anticorpos Potivos a HIV-1 e 2 sitivos a HIV-1 confirmados

AIDS	117	117	117
ARC	107	107	107
Alto Risb co	304	219	219
Miscelânea⁰	15	13	13
Doenças não relacionadas com AIDS	140	1	1

a Confirmação efectuada por mancha Western e/ou, pelo menos dois imuno-ensaios alternativos.

b Pacientes em grupos de risco estabelecidos c Pacientes com situações associadas a AIDS (por exemplo, Linfadenopatia Persistente Generalizada).

d Inclui os pacientes com doenças viricas agudas, doenças de auto-imunidade e neoplasias a

Amostras do Oeste Africano

Estabeleceu-se a reactividade dos anticorpos HIV-1 e HIV-2 de Wellcozyme por ensaio de 368 Amostras do Oeste Africano. 0 ensaio de HIV-1 e HIV--2 detectou todas as amostras classificadas como positivas por ensaios imunolõgicos para o anticorpo HIV-2.

QUADRO 4

Reactividade dos Soros de Pacientes do Oeste Africano

N. de Amostras Anticorpos Positivos Anticorpos Positivos por ensaio 1+2 por Imuno-Ensaio HIV-2

386 261^a 259^b a Duas amostras proporcionaram resultados discordantes. Uma era negativa nos testes alternativos para anti-HIV-1 e anti-HIV-2, apresentou apenas p24 na Mancha Western de HIV-1, mas não se encontrou disponível qualquer resultado de mancha Western para HIV-2. A outra amostra indicou ser negativa ao ensaio anti-HIV, equivoca num ensaio anti-HIV-2 e indeterminada pelas manchas Western de HIV-1 e de HIV-2.

b Todas as amostras foram possitivas num ensaio imunolõgico anti-HIV-2. Efectuaram-se manchas Western de HIV-2, nestas amostras, 26 foram claramente positivas e 3 proporcionaram resultados indeterminados.

Claims

REIVINDICAÇÕE S

- i^aProcesso para a preparação de um peptido de atê 30 aminoácidos o qual é susceptível de ligação ao anticorpo especifico para um tipo de HIV e o qual contem uma sequência da fórmula (1) x₁x₂wgc (1) em que cada e representa um resíduo de aminoácido, o grupo carboxi terminal estã eventualmente na forma amida, e o grupo sulfidrilo de cada C estã bloqueado, caracterizado por a) se condensar aminoácidos simples e/ou péptidos preformados de dois ou mais aminoácidos na ordem necessária, em que, quando o aminoácido é cisteina, o seu grupo sulfidrilo estã livre ou bio queado;

e

b) se desejado se se converter o grupo carboxi terminal na forma amida e, se desejado, se bloquear o grupo sulfidrilo livre de ou de cada resíduo cisteina.

- 2^aProcesso para a preparação de um peptido de formula (1) como o obtido na reivindicação 1, caracterizado por:

i) se transformar uma célula hospedeira com um vector que incorpora um gene que codifica um péptido de formula (1) e que é susceptível, na célula hospedeira, de expressar o péptido;

ii) se cultivar a célula hospedeira transformado de forma que o péptido seja expresso; e iii) se recuperar o péptido.

Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o grupo carboxi terminal estã na forma de amida.

- 4^aProcesso de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o grupo sulfidrilo de cada C ser bloqueado utilizando um agente bloqueador.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o grupo bloqueador ser acetamido—metilo, ditiopiridilo ou ser derivado do reagente de Ellman, um composto de organo-mercúrio ou maleimida.

- 6<

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente bloqueador ser derivado de N-etil -maleimida.

- 7^aProcesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X^, ser G e X2 ser I, L ou M.

- 8^aProcesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X^ ser N e X2 ser S.

- 9^aProcesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido possuir um prolongamento de aminoácidos na extremidade N e/ou extremidade C.

- 10^aProcesso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o prolongamento da extremidade N ter entre 1 e 14 resíduos de aminoácidos.

- 11^aProcesso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o prolongamento da extremidade C ter entre 1 e 14 resíduos de aminoácidos.

- 12^aProcesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido obtido possuir a sequencia de aminoácidos ser a seguinte:

KYLQDQARLN SWGCAFRQVC

- 13^aProcesso de acordo com a reivindicação

1, caracterizado por se obter um peptido com a seguinte sequência de aminoácidos:

KYLQDQARLNSWGCAFRQVC em que o grupo carboxi terminal está na forma de amida e o grupo sulfidrilo de cada C está bloqueado.

- 14^aProcesso para a determinação da presença de anticorpos de HIV-1 e/ou HIV-2 no fluido do corpo caracte rizado por

a) se fazer contactar uma fase sólida, na qual se imobiliza um peptido obtido de acordo com as reivindicações anteriores, com a amostra de teste;

b) englobar meios para determinar se a amostra de teste continha qualquer dos referidos anticorpos.

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por os meios serem uma molécula ou partícula marcada.

- 16^aProcesso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a molécula ou partícula marcada ser fosfatase alcalina, proteína A, proteína G, sub-tipo de anti-espêcies ou anti-imunoglobulina, factor reumatõide, anticorpo ao peptido obtido de acordo com as reivindicações de 1 a 13, ou qualquer molécula que contenha o epítope que constitui o peptido.

- 17^aConjunto de análise adequado para determinar a presença de anticorpos HIV-1 e/ou HIV-2, caracterizado por incorporar:

a) um peptido obtido de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 13 marcado com uma enzima.

b) um substrato para a enzima.

c) meios que proporcionam uma superfície sobre a qual se imo biliza um péptido obtido de acordo com as reivindicações de 1 a 13; e

d) eventualmente, soluções e/ou tampões de lavagem.

- 18^aConjunto de análise de acordo com as reivindicações 17, caracterizado por o péptido ser um HIV-1 gag e/ou sequência env.

- 19^aConjunto de análise de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequência gag ser a sequência de HIV-1 constituída pelos aminoácidos de 121 a 356 e a sequência env ser a sequência de HIV-1 constituída pelos aminoácidos de 542 a 674.