JPH02209891A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（トＩＪＶ）に特異的
な抗体に結合するペプチド、その調製法及びその用途に
関する。

ＨＩ　Ｖの発見に続いて、このウィルスの存在を検出す
ることが必要となってきた。）−１１Ｖタイプ１（ＨＩ
Ｖ−１）抗体の第１世代アッセイ法では不活性化ＨｒＶ
−１が用いられていた。同定されたウィルスのエピトー
プに対応する合成ペプチドを用いた第２世代アッセイ法
が開発されている。

例えば、Ｇｎａｎｒ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ
　２３７．１１、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１９８７には、
ＨＩＶ−１感染とＨＩＶタイプ２（ＨＩＶ−２）感染と
を識別する合成ペプチドイムノアッセイ法が記載されて
いる。

本発明者らは、フリーのスルフヒドリル基をブロックし
た合成ペプチドを用いることによって特に１１１Ｖ抗体
に対して特異的なイムノアッセイな実施できることを見
出した。この合成ペプチドは、ＨＩＶ−１（７）Ｑｐ４
１糖蛋白及びＨＩ　Ｖ−２１７）ソれに対応する配列上
のイムノドミナントエピトープの配列に基づいている。

しかして、本発明によれば、ＨＩＶ型に特異的な抗体に
結合することのできる３０個までのアミノ酸からなるペ
プチドであって、下記式（Ｉ）Ｘ、Ｘ２ＷＧＣ（Ｉ） （式中、Ｘ　及び×２はそれぞれアミノ酸残基を示す） で表わされる配列を含有しその末端カルボキシ基は任意
にアミド型であってもよくＣのスルフヒドリル基はブ［
１ツクされているペプチドが提供される。

本明細書ではアミノ酸残基を１文字コード（Ｅｕｒ、　
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３８．９−３７．１９８４
）で表わす。末端のカルボキシ基は、−Ｇｏｏｆ−１の
カルボキシ型よりも−ＣＯＮＨ２のア、ミド型で存在す
るのが望ましい。本発明で重要な点は、鎖側のスルフヒ
ドリル基はブロックされていることである。これによっ
てジスルフィド結合が阻止され、システィン残塁の酸化
が阻止され、またペプチドの好ましくないロンジ１ゲー
シヨンが阻止される。

本発明のペプチドは式（Ｉ）の配列を含有している。Ｈ
ｒＶ−１Ｒ体に結合するペプチドとしては、Ｘ　はＧが
望ましく、×２は１１Ｌ又はＭが望ましい。）ＩＩＶ−
２抗体に結合するペプチドとしては、×１はＮが望まし
く、×２がＳが望ましい。しかしながら、ペプチドが目
的とするＨＩＶ抗体に結合できるのであれば他のアミノ
酸残括であってもよい。また、更に式（Ｉ）の配列のＮ
−末端及び／又はＣ−末端には、ｌｌ　Ｉ　Ｖ抗体がペ
プチドに結合するようなアミノ酸残基が典型的には存在
するようにする。Ｎ−末端側には１４個まで、例えば８
又は４個までのアミノ酸残基が延長されていてもよい。

Ｃ−末端側には１４個まで、例えば８又は６個までのア
ミノ酸残基が延長されていてもよい。

式（Ｉ）のアミノ酸配列は、ＨＩＶ−１のｏｐ４１糖蛋
白及びＨＩＶ−２のそれに対応する部位上のイムノドミ
ナントエピトープ部分から誘導されたものである。これ
らの部分は、ＨＩＶｌの場合にはアミノＩＩ！５９９−
６０３に相当し、ＨＩＶ−２（７）１合１．：は７ミ／
１Ｉｌｔ５９３−５９７に相当する。ＨＩＶ−１のナン
バリングシステムは、Ｍａｉｎ−１１０ｂｓｏｎ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　　４０．９　（１９８５）の記
載によるものであり、ｌ−１１Ｖ　−２のナンバリング
システムはＧｕｖａｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　　３２６．６６２　（１９８６）の記載によるも
のである。従って、式（Ｉ）のアミノ酸配列のいずれの
末端側あるいはそれぞれの末端側のアミノ酸は、）−１
１Ｖの特異的殊についての配列情報から推定することが
できる。ペプチドは、ｌｌ［Ｖ−１株のアミノ酸残基５
９Ｂ−６０９の配列又はＨＩＶの他のタイプのそれに対
応するアミノ酸配列を含有しているのが好ましい。従っ
て、ＨＩＶ−２については、アミノ酸残基５９２−６０
３のアミノ酸配列をペプチドが含有しているのが好まし
い。これらのアミノ酸配列は、目的とする抗体、例えば
ＨＩＶ−１特異的抗体又はＨＩＶ−２特異的抗体に結合
する能力に影響を与えない限り、１つもしくはそれ以上
のアミノ酸で＠換されていてもよい。

元のアミノ酸配列の物理化学的性質、例えば、荷電密度
、親木性／疎水性、ナイス及びコンフィギユレーション
などを保持し得る適当なアミノ酸を選択して置換するこ
とができる。適当なアミン酸残基の置換としては、Ｔを
Ｓに置換するあるいはその逆、ＤをＥに置換するあるい
はその逆、ＮをＱＧ：ＩＩ換するあるいはその逆などが
挙げられる。

また、ＨｆＶ−１の場合アミノ酸残基５９８あるいはＨ
ＩＶ−２の場合アミノ酸残基５９２はＫであってもよい
。

本発明のペプチドは、典型的には少なくとも６個、例え
ば少なくとも９又は１２個のアミノ酸残基からなる。

本発明のペプチドは、３０１Ｉ以下、例えば２５又は１
５個までのアミノ酸残基を含有する。本発明のペプチド
の全体の配列は、ＨＩＶ−１の場合に−ＧＪ７ミ／酸残
ＪＪ５９９−６０３またＨ　ＩＶ−２の場合にはそれに
相当する配列を含むＨＩＶ株の天然の配列に対応するの
が好ましい。しかしながら、このような天然の配列には
前記したように１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が
置換されていてもよい。本発明のペプチド配列の基礎に
なるＨＩＶ株の例としては以下のような単離株が挙げら
れる。即ち、ＨＩＶ−１（Ｚ−３）　：Ｗｉｌｅｙ　ｅ
ｔａｌ、、ＰＮＡＳ　　ＵＳ＾、　８３．５０３８　　
（１９８６）　　；ＨＩＶ−１（ＬＡＶ　　　　　：Ｈ
ＴＬ、Ｖ−Ｉ［［Ｂ：ＲＵ ＨＴＬＶ−ＩＩ　　　　：ＷＭＪ−１；ＡＲＶ−２）：
ＲＦ Ｍａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、　　　（１
９８５）　　：　Ｒａｔｎｅｒ　　ｅｔａｌ、、　　Ｎ
ａｔｕｒｅ　　３１３．２７７　　（１９８５）；５ｔ
ａｒｃｉｃｈ　ｅｊ　ａｌ、、　　Ｃｅ１ｌ、　　　４
５．６３７（１９８６）　　：　５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅ
ｓｃａｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　
　２２７、　　４８４　　　（１９８５）　　　：　　
ト１［Ｖ−１（ＬＡＶ　　−Ｅ　Ｌ　Ｉ　）及びＨＩＶ
−１（ＬＡＶ−ＭＡＬ）：Ａ１１ｚｏｎ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、、Ｃｅ１ｌ、　　　４６．３６（１９８６）　　；
及びＨＩＶ−２：Ｇｕｙａｄｅｒｅｔａｌ、、　　（１
９８７）などがある。

以下の配列を有するペプチドが好ましい。

ＨＸＶＪ：１１；Ｌ’ＪＧＣ５ＧＫＬＺＣＴＩＸ’ＪＧ
Ｃ５ＧＫＲＸＣＨＩＶ−２：Ｎ５ＷＧＣＡＦＲＱＶＣシ
ステイン残基又はそれぞれのシスティン残塁のスルフヒ
ドリル基はブロックされている。スルフヒドリル基のブ
ロッキング基はアセトアミドメチルでもよく、また有機
水銀、マレイミドもしくはジスルフィドブロッキング試
薬から誘導されるものでもよい。エルマン試薬であるジ
ヂオジピリジルは好適なジスルフィドブロッキング試薬
の１つの例である。ブロッキング基はＮ−エチルマレイ
ミドから誘導される基又はアセトアミドメチルが好まし
く、これらは以下の式で表わされる。

本発明のペプチドは合成ペプチドであり、化学合成によ
って調製することができる。ペプチドの固相合成法又は
溶液合成法を用いることができる。

ペプチドは、以下の工程： （ａ）単一アミノ酸及び／又は２つもしくはそれ以上の
アミノ酸からなるあらかじめ形成されたペプチドを本発
明のペプチドにおけるアミノ酸の順序で縮合して（アミ
ノ酸がシスティンの場合にはそのスルフヒドリル基はフ
リー又はブロックされている）、末端のカルボキシ耕が
フリーもしくはアミド型の式（Ｉ）のペプチドを得：次
いで（ｂ）必要に応じて、得られるペプチドにおけるフ
リーのスルフヒドリル基を有するシスティン残基もしく
はそれらそれぞれのシスティン残基のフリーのスルフヒ
ドリル基をブロックする：ことからなるプロセスにより
構築することができる。

固相合成法では、目的とするペプチドのアミノ醒配列は
不溶性樹脂に結合したＣ−末端アミノ酸から順次組立て
ることができる。目的とするペプチドが合成されると、
それを樹脂から解裂させる。

溶液相合成法を用いる場合にも、Ｃ−末端アミノ酸から
ペプチドを組立てることができる。Ｃ−末端アミノ酸の
カルボキシ基は合成工程においては適当な保護基によっ
てブロックされる。この保護基は合成の最後に除去され
る。

固相又は溶液相合成法のいずれを用いた場合でも、反応
系に添加されるそれぞれのアミノ酸は保護されたα−ア
ミノ基と活性化されたカルボキシ基を有している。アミ
ノ基はフルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍ
ｏｃ）又はｔ−ブトキシカルボニル ができる。カルボキシ基はペンタフルオロフェニル又は
１−オキソ−２−ヒドロキシ−ジヒドロベンゾトリアジ
ンエステルとして活性化することができる。それぞれの
縮合工程はジシクロへキシルカルボジイミド又は１−ヒ
ドロキシベンゾ−　トリアゾールの存在下で実施できる
。

側鎖の官能基、例えばリシンの側鎖アミノ基、スレオニ
ンの側鎖ヒドロキシ基又はシスティンの側鎖スルフヒド
リル基も典型的には保護されている。合成におけるそれ
ぞれの工程の後、α−アミノ保護基が除去される。しか
しながら、側鎖の保１１は必要により保持することもで
きるが、通常は合成の最少に初めて除去される。しかし
ながら、保護されたスルフヒドリル基の場合には、その
保護基がブロック機能を発揮するものとして必要な場合
にはそのまま保持される。他のブロッキング基が望まし
い場合には、その保護基は除去される。

Ｃ−末端にカルボキシ基またはアミド基を有するペプチ
ドがＷ４製される。固相合成法では、カルボキシ基また
はアミド基のいずれを有づるかは、Ｃ−末端のアミノ酸
が樹脂支持体にどのようにして結合しているか及び／又
は最終的なペプチドが樹脂からどのようにして解裂され
るかによって決定される。典型的には、樹脂はスチレン
及び／又はジビニルベンピンボリマーである。Ｃ−末端
アミノ酸はエステル結合を介して樹脂に結合しており、
このエステル結合は）−１［３ｒのトリフルオロ酢酸溶
液又は）−Ｉ　Ｆなどの強酸によって解裂されて、Ｃ−
末端にカルボキシ基を有するペプチドが得られる。アミ
ツリシスの場合にはＣ−末端がアミド型であるペプチド
が得られる。

固相合成法によってペプチドアミドを得る他の方法は、
ペプチドのＣ−末端アミノ酸がペプチドアミノベンズヒ
ドリル結合を介して樹脂に結合するようにアレンジする
方法である。これはジシクロヘキシルカルボジイミドと
カップリングすることによって形成することができ、Ｈ
Ｆにより典型的には冷却下で解裂することができる。

溶液相合成法の場合には、Ｃ−末端がカルボキシ基又は
アミド基のいずれになるかは、Ｃ−末端アミノ酸のカル
ボキシ基がどのようにブロックされておりそして合成の
最後でどのように除去されるかによって決定される。Ｃ
−末端にカルボキシ基を有づるペプチドはＣ−末端にア
ミド基を有するペプチドに変換でき、その逆の変換も可
能である。

本発明のペプチドは組換λＤＮＡ技術によって調製する
こともできる。即ち、先ず、ペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を用意する。次いで、該ＤＮＡ配列を組込んだベ
クターであって適当な宿主中にて当該ペプチドを発現す
ることのできる発現ベクターを構築する。ＤＮＡ配列は
、ベクター中においては翻訳開始シグナルと翻訳間始終
」［シグナルとの間に挿入される。適当な転写コントロ
ールエレメント、特にＤＮＡ配列用のプロモーター及び
転写終止部位も組込まれる。ベクターと親和性を有する
宿主中にてペプチドの発現が起こるようにＤＮＡ配列は
正しいフレーム中に位置するように挿入される。

適当な宿主−ベクター系が用いられる。ベクターはプラ
スミドを用いることができる。この場合にはバクテリア
もしくは酵母宿主が用いられる。

あるいはベクターはウィルスベクターでもよい。

このウィルスベクターを用いて、ペプチドの発現が起こ
るように補乳動物セルラインの細胞をトランスフェクト
する。

ブロックされたスルフヒドリル基をＴｈＴるペプチドは
以ｒの２つの方法のうちの１つの方法によって調製する
ことができる。第１の方法は、前駆体アミノ酸からペプ
チドを組立てる場合に前記１稈（ａ）においてスルフヒ
ドリル基がブロックされたシスデインを用いる方法であ
る。第２の方法は、フリーのスルフヒドリル基を有づる
ペプチドを調製し、次いでブロックする方法である。従
って、スルフヒドリルのブロッキング試薬を、フリーの
システィンあるいは目的とする配列を有するペプチドと
反応させる。

スルフヒドリルのブロッキング試薬は適当ないずれのブ
ロッキング試薬を用いてもよい。例えば、アセトアミド
メタノール、有機水銀、マレイミド、ジスルフィドブロ
ッキング試薬などが挙げられる。

エルマン試薬であるジチオビリジルも適当なジスルフィ
ドブロッキング試薬の１つの例である。しかしながら、
Ｎ−エチルマレイミド又はアゼドアミドメタノールが好
ましい。

フリーのスルフヒドリル縫を有するペプチドが得られ次
いでブロックするのが望ましい場合には、ペプチドを先
ず還元する。ジチオナイト、２−メルカプトエタノール
、ジチオスレイトール又はジチオエリスリトールなどの
強力な還元剤が典型的には用いられる。ジチオスレイト
ールが好ましい。

わずかに過剰の還元剤を用いた場合には、スルフヒドリ
ルのブロッキング試薬を加える前に還元されたペプチド
を分離する必要はない。

典型的な合成法においては、ペプチド（１００−５００
μＭ）のｐＨ７のバッファー溶液を、ジチオスレイトー
ル（例えば２００−１０００μＭ）などの約２倍モル過
剰の還元剤で少な（とも２０分間、典型的には約３０分
間還元する。その後Ｎ−エチルマレイミドなどのブロッ
キング試薬を全スルフヒドリル基の約２倍モル過剰加え
る。次いでブロック反応を少なくとも１時間行なう。次
いで、修正ペプチドを適当なバッファー溶液にゲル濾過
する。あるいは、ゲル濾過を行なう前に、修正ペプチド
を更にＳ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒト０キシス
クシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）又は４−（Ｎ−マレ
イミド−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＳＭＣＣ）などのコンジュゲート試薬と反応させ
てもよい。

本発明のペプチドは、ＨＩＶ、例えばＨＩＶ−１及び／
又はＨＩＶ−２に特異的な抗体のアッセイに用いること
ができる。適当な生理学的液体のテストサンプル、例え
ば尿、プラズマ、血清、血液、精液、涙、唾液、脳を髄
液などをアッセイに用いることができる。このアッセイ
法は、テストサンプルをペプチドと接触させ次いで抗体
がペプチドに結合したかどうかを求めることからなる。

このために、本発明のペプチド、及びテストサンプル中
のＨＩＶに対する抗体がペプチドに結合したかどうかを
求めるための手段を含むテストキットが提供される。

各種のアッセイフォーマットを用いることができる。本
発明のペプチドは、溶液中のＩ］Ｉ　Ｖに対する抗体を
選択に捕捉するために用いることができ、あるいは、既
に捕捉されたそのような抗体をラベル化するために用い
ることができ、あるいはまた捕捉とラベル化の両方を行
なうために用いることもできる。更には、相分離を行な
うことなくペプチドと反応する抗体を溶液中で検出する
各種のホモジニアスアッセイフォーマットに本発明のペ
プチドを用いることができる。またＨＩＶ抗原の検出に
も用いることができる。

ペプチドを用いて溶液中の抗体を捕捉するアッセイ法で
は、ペプチドを固相表面に吸着させる。

この固相表面は何んらかの方法によって洗浄できること
が必要である。用いられる固相表面としては、各種タイ
プのポリマー（マイクロタイタープレート、ビーズ、各
種のデイツプスティック、アスビレーションチップ、電
極、光学デバイスなどに成型されたもの）、粒子（例え
ば、通常０．１−５ミクロンの粒径を有する、ラテック
ス、安定化血液、バクテリア細胞、真菌細胞、スボア、
金もしくは他の金属のゾル、タンパク様コロ、イドなど
）、ｌ（例えば、ニトロセルロース、ペーパーヒルロー
スアセテート、有機もしくは無機材料からなる高多孔性
／高表面積性膜など）等が挙げられる。

固相表面にペプチドを結合させるためには、表面活性剤
、溶媒、塩、カオトロープなどを含む最適組成の溶液を
用いた受動型吸着により行なうことができ、また能動型
化学結合により行なうこともできる。能動型結合は、固
相表面に結合することのできる各種の反応性もしくは活
性化官能基（例えば、縮合剤、活性エステル、ハライド
、無水物ニアミノ、ヒドロキシ又はカルボキシル基：ス
ルフヒドリル基；カルボニル基；ジアゾ基；不飽ｇＪ基
など）を介したものである。あるいは、能動型結合は蛋
白を介したものでもよく（蛋白自体が能動型結合あるい
は受動型結合により固体表面に結合している）、またア
ルブミン、カゼインなどのキャリアー蛋白を介したもの
でもよくこの場合には各種の方法でペプチドをこのキャ
リアー蛋白に化学的に結合させることができ等電点、荷
電、親水性あるいは他の物理化学的特性の点で有利であ
る。あるいは、免疫沈降などの反応の混合物を電気泳動
分離後にペプチドを同相表面（必すしもそうではないが
通常は膜へ）に結合させることもできる。

ペプチドを保持する固相表面とテストサンプルとを接触
せしめ（反応せしめ）、次いで必要に応じて各種の方法
（例えば、洗浄、遠心分離、濾過、磁気作用、毛管作用
など）で過剰のサンプルを除去した後、捕捉した抗体を
検出信号を発する手段によって検出する。このような検
出は、捕捉した抗体と反応する前記した如きラベル化分
子もしくは粒子（例えば、プロティンＡ又はプロティン
Ｃなど；抗スピーシイズ又は抗イムノグロブリンサブタ
イプ；リウマトイド因子：競争的にあるいはブロック法
として用いるペプチドに対する抗体；ペプチドを構成す
るエピトープを含有する分子例えばペプチド自体あるい
は他の蛋白、＋」Ｉ　Ｖから直接的にあるいは間接的に
得られるペプチド等）を用いることによって達成できる
。

検出信号は光学的信号、放射活性信号または物理化学的
信号などであり、これらは、例えば色素、放射ラベル化
剤、電気活性体、磁気共鳴体または起電盤などで上記し
た分子を直接的にラベル化することによって得られ、あ
るいは、上記した分子または粒子を測定可能な変化を与
える酵素で間接的にラベル化することによっても得られ
る。あるいは、検出信号は、固相表面が粒子の場合には
、凝集、回折効果または複屈折効果などによることもで
きる。

既に捕捉された抗体をラベル化するためにペプチドを用
いるアッセイの場合には、検出できるようなペプチドの
ラベル化が必要である。このラベル化は、例えば、放射
活性もしくは磁気共鳴粒子あるいは酵素をペプチドに化
学的に結合しあるいは受動型結合により結合する直接的
方法によることができ、またペプチドに対する抗体など
のペプチドと反応する分子にラベル化剤を結合させる間
接的方法によることができる。この間接的方法の場合に
はペプチドとこのラベル化分子とを反応させる。

ラベル化剤をペプチドに結合するには、アミノ基などの
ペプチド中に存在する部分を介して直接行なうことがで
き、あるいはマレイミドなどの基を導入してこの基を介
して直接行なうことができる。抗体の捕捉は、試薬を用
いて受動型吸着もしくは活性化吸着により前記した固相
表面上で行なうことができ、この場合には特異的抗体も
しくは免疫複合体が結合する結果となる。特に、抗体の
捕捉は、抗スピーシイズまたは抗イムノグロブリンサブ
タイプにより、あるいはりウマトイド因子、プロティン
Ａ、Ｇなどにより、あるいは前記したペプチドを構成す
るエピトープを含有する分子により行なうこともてぎき
る。

ペプチドを用いてケンプル中のト１１Ｖ抗原を測定する
アッセイの場合には、ペプチドを前記したいずれかの方
法でラベル化し、競合結合方法あるいは非競合法に用い
ることができる。競合法の場合には、前記した固相表面
上の特異的分子との結合がサンプル中の抗原によってブ
ロックされる。

非競合法の場合には、サンプル中の抗原が同相表面に特
異的もしくは非特異的に結合し、その時に特異的２価も
しくは多価分子（例えば抗体）に結合し、該分子の残り
の分子価はラベル化ペプチドを捕捉するために用いられ
る。

モホジニアスアッセイでは、ペプチドと抗体とが通常ラ
ベル化される。そしてこの抗体とフリーの溶液中のペプ
チドとが反応する時に、これら２つのラベルが相互作用
し、例えば一方のラベルによって捕捉されたエネルギー
が他のラベルに移動し、この活性化された第２のラベル
またはクウェンチされた第１のラベルを適当な手段（例
えば螢光光度計、磁気共鳴測定あるいは酵素測定により
）により検出する。ケンプル中の抗原あるいは抗体のい
ずれかを添加することによりこの一対のラベルの相互作
用が制限され、その結果中じるシグナルのレベルの相違
をディテクターにより検出する。

ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２抗体を検出するための適当
なアッセイフォーマットとしては直接サンドイッチ酵素
イムノアッセイ（ＥＩＡ）フォーマットがある。ＨＩＶ
−１抗体あるいはＨＩＶ−２抗体のいずれか１つが結合
することのできる本発明のペプチドをマイクロタイター
ウェル上にコートする。テストサンプルと、ＨＩＶ−１
抗体あるいはＨＩＶ−２抗体のいずれか１つが結合し更
に酵素が結合した本発明のペプチド（コンジュゲートペ
プチド）を同時に加える。いずれの特異的抗体もウェル
にコートされたペプチドとフンシュゲートペプチドの両
者に結合する。洗浄後、変色し得る特異的基質を用いて
結合酵素を検出する。

このようなＥＩＡに用いるテストキットは、（１）トｆ
ｌＶ−１抗体あるいはＨＩＶ−２抗体のいずれか１つが
結合し酵素でラベル化された本発明のペプチド： （２）　　該酵素の基質； （３）　　本発明の非ラベル化ペプチドが固定化されＨ
ＩＶ−１抗体あるいはＨＩＶ−２抗体のいずれか１つが
結合する表面を提供する手段；及び（４）　　任意の洗
浄溶液及び／又はパンファーからなる。

本発明のペプチドは、ＨＩＶ−１特異的抗体とＨＩＶ−
２特異的抗体の両者を検出するコンバインドアッセイに
用いることもできる。このようなアッセイは、テストサ
ンプルを、ＨＩＶ−１抗体あるいはＨＩ　Ｖ　−２抗体
のいずれか１つが結合した本発明のペプチドと、ＨＩ　
Ｖ　−１抗体あるいはＨＩＶ−２抗体うらの他の１つが
結合するエピトープを有するポリペプチドとを接触せし
め、次いで本発明の該ペプグード及び／又は該ポリペプ
チドと抗体とが結合したかどうかを測定することからな
る。前記したいずれのアッセイフォーマットも採用でき
る。

ＨＩＶ−１抗体とＨＩＶ−２抗体の両名を検出するコン
バインドアッセイに用いる適当なテストキットは、ＨＩ
Ｖ−１抗体アルイハｌｌ　Ｉ　Ｖ−２抗体のいずれか１
つが結合した本発明のペプチド、ＨＩＶ−１抗体あるい
はＨＩＶ−２抗体の他のいずれか１つが結合するエピト
ープを有するポリペプチド、及びテストサンプル中に存
在するＨ［Ｖ−１またはＨＩＶ−２に対する抗体が本発
明の該ペプチドまたは該ポリペプチドに結合したか否か
を測定するための手段からなる。

上記したＥＩＡフォーマットはコンバインドアッセイに
適している。ＨＩＶ−１抗体あるいは１−！ｆＶ−２抗
体の他のいずれか１つが結合７るエピトープを有するポ
リペプチドはマイクロタイターウェル上に付加的にコー
トされる。酵素でラベル化されたこのようなポリペプチ
ド、例えばコートされたものと同じポリペプチドを、テ
ストサンプルと本発明のコンジュゲートペプチドと一緒
に添加する。コンジュゲートペプチドのラベル酵素とコ
ンジュゲートポリペプチドのラベル酵素とは同じでも異
なっていてもよい。従って、ＥＩＡのようなアッセイに
適したテストキットは、前記した成分（１）−（４）と
ともに、 （５）　　ＨＩＶ−１抗体あるいはＨＩｖ−２抗体の他
のいずれか１つが係合するエピトープを有しＳ素でラベ
ル化されたポリペプチド： （６）　　該酵素がペプチド（１）をラベル化するのに
用いた酵素と相違する場合には、該酵素の基質；及び （７）　　ＨＩＶ−１抗体あるいＬＬＨＩＶ−２抗体の
他のいずれか１つが結合するエピトープを右する非ラベ
ル化ポリペプチドが固定される表面を提供する手段； を更に含む。

本発明の非ラベル化ペプチドと成分（１）の非ラベル化
ペプチドとを同じ表面上に固定化する場合には、（３）
及び（７）の手段は同じである。ＨＩＶ−１抗体あるい
はＨＩＶ−２抗体の他のいずれか１つが結合するポリペ
プチドは、化学的に合成されたポリペプチドでもよい。

このポリペプチドは、本発明によるブロックされたスル
フヒドリル基を有するペプチドでもよく、あるいは絹換
えポリペプチドでもよい。

ＨＩＶ−１は特に２つのタイプの抗体を誘導でる。即ち
、これらはｃｏａｇ蛋白に対Ｊる抗Ｄ２４抗体とｅｎｖ
蛋白に対する抗０ρ４１抗体である。

本発明者は、抗ｐ２４抗体と抗Ｃ１１）４１抗体の両者
が結合する特異的な融合構築体を調製した。従って、こ
の蛋白は、ＨＩＶ−１抗体が結合するエピトープを有す
るポリペプチドとして使用することができる。この蛋白
のアミノ酸配列は以下の通りである。

Ａｉｎ１１ｅＧ１ｎＣ１ｙＧｌｎＭｅｅＶａｌＨ１ｓに
１ｎＡｌａＩｌｅＳａｒＰｒｏＡｒｇＴｈｒＬａｕＡｓ
ｒ＋ＡｌａＴｒｐＶａ１ＬｙｓＶａｌＶａ１ｃ１ｕＧ１
ｕＬｙｓＡ１ａＰｈａＳａｒＰｒｏＧ１ｕＶａＩＩｌａ
ＰｒｏＭｅｅＰｈａｓｅｒＡ１ａＬａｕＳａｒＱ１ｕＱ
１ｅＬａｕＡｇｎＴｈｒＶａｌＧｌｙｃ１ｙＨＬｓ６１
ｎＡｌａ０Ａｌａｒ　ｔｃｌｎｌ（ａ　ｅＩＪｓｓＬｙ
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この蛋白をＤＭ６２６と命名した。その調製法は本発明
者の欧州特許出願Ｎα ８８３０８１７０．５号明細書に記載されている。

この蛋白のアミノ酸配列はＬ正Ｊ゛ることができ、修正
された配列を右する蛋白が抗ｐ２４抗体と抗Ｑｐ４１抗
体との両者に結合することができ目つ修正配列と元の配
列との間に少なくとも７５％の相同性が存在する限りに
おいては、１つもしくはそれ以上のアミノ酸の置換、挿
入及び／又は欠失によりアミノ酸配列を修正してもよく
、また両末端あるいはいずれかの末端を延長さＵること
によって修正してもよい。

この蛋白の未修正のアミノ酸配列は、基本的には、ト１
１Ｖ−１のＣＢＬ−１単離休（ＷＯ８６１０４４２３）
のｏ２４蛋白の１部と０ｐ４１蛋白の１部との融合に基
づいてる。これらの部分は、それぞれアミノ酸残基１２
１−３５６及び５４２−６７４に対応しており、このナ
ンバリングシステムはＨｅｕｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、
　Ｎａｔｕｒｅ、　３１３．４５０−１１５８　（１９
８５）の記載に基づいている。これらの部分のスタート
部位は、それぞれ上記のアミノ酸配列における１７番目
及び２４４４４番目ミノ酸として示されている。上記し
たアミノ酸配列のアミノｗ１５−１６はｐ１８蛋白に由
来するものである。アミノＭｌ−４，２４１−２４３及
び３７７−３７９は、融合蛋白を発現する発現ベクター
及びＤＮＡ操作から得られたものである。

アミノ酸配列は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸の置
換、挿入及び／又は欠失によって修正することができる
。これらは配列のいずれの部位においても起こすことが
できるが、特にｐ２４蛋白及び０１）４１蛋゛白に由来
しない配列部分において起こすのがよい。置換の場合に
は、未修正のアミノ酸配列における１つもしくはそれ以
上のアミン酸を、未修正の配列の物理化学的＋。

荷密度、親木性／疎水性、サイズ、配置などを保持する
ことのできる１つもしくはそれ以上のアミノ酸で置換す
ることができる。例えば、３ｅｒはＴｈｒｔ”ｌｉ換す
ることができこの逆でもよい。

ＧｌｕはＡＳｇ）で置換することができこの逆も可能で
あり、ＧｌｎはＡＳｎで置換することができこの逆ちり
能である。アミノ酸１０のＳｅｒ残基はＡｓｎで置換す
ることができる。

また配列は両末端あるいはいずれかの末端が延長されて
いてもよい。この延長はカルボキシ末端にＣｙＳ残基を
付加する以上のものではない。しかしながら、両末端あ
るいはいずれかの末端が５０個までのアミノ酸残基によ
って延長することができる。従って、４０個、例えば２
０個までのアミノ酸を、未修正配列のアミノ末端及び／
又はカルボキシ末端に付加することができる。しかしな
がら、アミノ末端のアミノ酸は、核酸配列の翻訳開始コ
ドンの点から通常はＭｅｔである。尚、翻訳開始コドン
から蛋白が発現される。これは、蛋白がそのアミン末端
でキャリアー蛋白と融合していない形態で発現された場
合に相当する。融合蛋白の場合には開裂されて本発明の
蛋白を遊離する。

未修正蛋白をコードするＤＮＡ配列中にアミノ酸配列変
化に対応する変化を導入することによっても、アミノ酸
配列を修正することができる。これは、エンドヌクレア
ーゼによる配列の制限、リンカ−の挿入、エキソヌクレ
アーゼ及び／又はポリメラーゼを用いる方法、部位特異
的突然変異などの適当な技術によって達成覆ることがで
きる。

修正ＤＮＡ配列が、抗ｐ２４抗体と抗０ｐ４１抗体との
両者が結合することのできる修正蛋白をコードするか否
かは容易に決定することができる。

即ち、修正ＤＮＡ配列を適当なプラスミドにクローン化
し、このプラスミドで宿主１１ｉｌ胞を形質転換し、発
現される蛋白について、抗Ｄ２４抗体と抗ＱＤ４１抗体
への結合能をデストすればよい。修正蛋白のアミノ酸配
列と未修正蛋白のアミノ酸配列との相同性は、少なくと
も７５％、例えば８５％以上あるいは９０％以上の程度
でなければならない。

本発明のペプチドに特異的な抗体は、該ペプチドを用い
て誘発することができる。抗体はポリクローナル抗体で
もモノクローナル抗体でもよい。

抗体は、ペプチドの品質コントコールバッチテストに用
いることができ、また、組換え蛋白、ペプチド、ウィル
ス溶解物の精製、あるいはエピトープマツピングに用い
ることもできる。また、ラベル化した場合には抗体検出
用の競合型アッセイのコンジュゲートとして用いること
ができ、あるいは抗原検出アッセイに用いることもでき
る。

ポリクローナル抗体は、キャリアーに結合した本発明の
蛋白を、マウス、ラット、ヒツジ、ラビットなどの咄乳
動物もしくは他の動物に注射し、かくして誘発されるペ
プチドに対する抗体を回収することによって得ることが
できる。ペプチド−キャリアーコンジュゲートは、生理
学的に許容し得る希釈剤からなる注射剤の形態で一般的
に投与される。フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ
）、フロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）などの
アジュバントをこの注射剤に含有させてもよい。動物は
適当な期間にわたって免疫される。適当な間隔を置いて
初物から採血し、族ペプチド抗体活性のアッセイを行な
う。活性レベルが適当な値に到達した時に動物から血液
を取る。抗体を抽出し、塩析、固定化合成ペプチドを用
いたアフィニティークロマトグラフィなどによってＭ製
する。

モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、永続
性細胞と、本発明のペプチドに対する抗体を産生ずる細
胞とを融合することによってＩ賀することができる。典
型的には、マウスなどの宿主動物をペプチドで免疫する
。この免疫宿主から牌Ｓ＋胞を採取する。牌ｍ胞を、例
えばマウスのミニローマセルラインなどの永続性セルラ
インと融合する。この方法によって、ペプチドに特異的
なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが得ら
れる。抗体は前記したと同様にして精製することができ
る。

以下に本発明を例により説明する。以下に３つの参考例
を挙げる。

１１０ｕ（ｌｈｔｅｎ、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８２．５１３１−５１
３５　（１９８５）に記載された、ｔ４ｅｒｒｉｒｉｅ
ｌｄ法（Ｎｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　　ＪＡＣ３，８５，
２１４９−２１５４，１９６３）の採用法を用いてペプ
チドを合成した。ｐ−メチルベンズヒドリルアミンジビ
ニルベンゼン樹脂上でペプチドを合成した。

それぞのアミノ酸のα−アミノ保１１基として１−ブト
キシカルボニル（ＢＯＣ）を用いた。それぞれのカップ
リングサイクルは以下の通りであった。

１、ジクロロメタンによる樹脂の洗浄−１０分間： ２．５％ジイソプロピルエチルアミンのジクロロメタン
溶液による洗浄−２分間×３：３、ジクロロメタンによ
る洗浄−１分間×２：４、ジクロロメタン、０．３Ｍシ
イツブａビルカルボジイミド中でのｔ−ブトキシカルボ
ニルアミノ酸のカップリング−６０分間； ５．３と同じ； ６．５０％トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液によ
る脱保護−２０分＠ニ ア、ジクロロメタンによる洗浄−１分間×６；８．２へ
戻る。

カップリングサイクルが完了した時に、アニソールスカ
ベンジャー１０％を含有する水素化フルオライドで１Ｆ
Ｒ間処理して、ｆｊ４脂からペプチドを解裂させた。か
くして、カルボキシ末端にアミド基を有するペプチドを
得た。次いでエーテルで洗浄し、乾燥し、１５％酢酸に
溶解し、次いで凍結乾燥した。

のスルフヒドリル基を以下のようにしてブロックした。

ペプチド（１００−５００μＭ）　の２５ｅＨＩＩ　Ｅ
　Ｐ　Ｅ　Ｓバッフｙ−（ｐＨ７，０）溶液を、２倍モ
ル過剰のジチオスレイトール（２００−１０００μＭ）
と３０分間反応させて還元した。しかしながら、ペプチ
ドＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣの場合には、１
つのシスティン残基しかこのペプチドは有していないた
め１倍モル過剰のジスレイトール（１００−５００μ、
Ｍ　）を用いた。

存在する全てのスルフヒドリル基に対して２侶モル過剰
のＮ−エチルマレイミドを加えた。ブロッキング反応を
１時間行なった。次いで修正ペプチドをバッファー溶液
にゲル濾過した。

参考例１と同様にしてそれぞれのペプチドを調製した。

従って、それぞれのペプチドがそのカルボキシ末端にア
ミド基を有している。

１：スルフヒドリル基のブロッキン 参考例１及び２で合成したそれぞれのベプチドッチＥＩ
Ａ ペプチドをマイクロタイターウェル上に受動的にコート
した。次いで血清サンプルをコンジュゲートペプチドと
ともにウェルに加えた。コンジュゲートペプチドの酵素
はアルカリホスファターゼを用いた。約１時間インキュ
ベージコンした後、ウェルを洗浄し、酵素の基質を加え
た。これはサイクリック増幅系を有するニコチン７ミド
アデニンジヌクレオチドホスフエート（ＮＡＤＰ）を用
いた。テストサンプル中のＫ１−１１Ｖ−２抗体をスタ
ンダードと比較することによって確認した。結果は表１
に示した。

表　　１ アッセイ での＋ｖｅ を検出する酵素イムノアッセイ ペプチドをマイクロタイターウェル上にコートした。次
いで、フンシュゲートペプチドとともに血清サンプルを
ウェルに加えた。このコンジュゲートは、アルカリホス
ファターゼでラベル化された同じ抗原の混合物である。

約１時間インキュベージコンした後、ウェルを洗浄し、
ウェルに酵素の基質を加えた。これは、サイクリック増
幅系を有するニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフ
ォスフェート（ＮＡＤＰ）であり、発色生成物が形成さ
れる。インキュベーション後、酵素反応を止め、分光光
度計で発色を測定した。ウェル中のフンシュゲートの量
、従って発色はサンプル中のＨ［Ｖに対する抗体濃度に
直接関係している。得られる結果は表２．３及び４に示
した。

１と２１１１Ｖ−１とＨｒＶ−２に　する表　　２ 表　　３ ＡＩＤＳ ＾ＲＣ ハイ　ｂ リスク ＡＩＤＳに無 つの他のイムノアッセイにより確認した。

ｂ：ｉｉＦ立されたリスクグループの患者。

ｃ：ＡＩＤｓＩＤ症状を有する患者（例えば永続性の全
身性リンパ節炎疾息）。

ｄ：急性ウィルス疾患、自己免疫疾患及びｎ１ｆＡなと
の患者。

西アフリカのサンプル ３８６個の西アフリカサンプルをテストすることによっ
て、ウエルコザイム（ｗｅｌ！ｃｏｚｙｓ＋ｅ）ＨＩＶ
−１とＨｆＶ−２の反応性を評価した。

ＨＩＶ−１及びト１１Ｖ−２テストにより、全てのサン
プルがＨＩＶ−２抗体イムノアッセイでポジティブと検
出された。

表　　４ ＨＩＶ抗体テストではネガデイプであり、抗ＨＩＶ−２
抗体テストではあいまいであり、ＨＩＶ−１とＨ［Ｖ−
２ウエスタンプロツトでははっきりしなかった。

：全でのサンプルは抗ＨｒＶ−２抗体イムノアッセイで
ポジティブであった。これらのサンプルについてｌ−１
１Ｖ　−２ウエスタンプロツトを実施した所、２６個が
ポジティブであり、３個がはっきりしない結果を与えた
。

３８６　　　　　　２６１ａ２５９ｂ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＩＶタイプに特異的な抗体に結合することので
   きる３０個までのアミノ酸からなるペプチドであつて、
   下記式（１） Ｘ＿１Ｘ＿２ＷＧＣ（１） （式中、Ｘ＿１とＸ＿２はそれぞれアミノ酸残基を示す
   ） で表わされる配列を含有し、その末端のカルボキシ基が
   任意にアミド型であつてよく、そのＣまたはそのそれぞ
   れのＣのスルフヒドリル基がブロックされているペプチ
   ド。
2. （２）末端のカルボキシ基がアミド型である請求項１の
   ペプチド。
3. （３）それぞれのＣのスルフヒドリル基がブロッキング
   試薬を用いてブロックされている請求項１又は２のペプ
   チド。
4. （４）ブロッキング基がアセトアミドメチル又はジチオ
   ピリジル、あるいはエルマン試薬である有機水銀もしく
   はマレイミド化合物から得られるものである請求項３の
   ペプチド。
5. （５）ブロッキング試薬がＮ−エチルマレイミドから得
   られるものである請求項３のペプチド。
6. （６）Ｘ＿１がＧ、Ｘ＿２がＩ、Ｌ又はＭである請求項
   １のペプチド。
7. （７）Ｘ＿１がＮ、Ｘ＿２がＳである請求項１のペプチ
   ド。
8. （８）Ｎ−末端及び／又はＣ−末端でアミノ酸が延長さ
   れている請求項１のペプチド。
9. （９）１−１４個のアミノ酸残基によりＮ−末端が延長
   されている請求項８のペプチド。
10. （１０）１−１４個のアミノ酸残基によりＣ−末端が延
    長されている請求項８のペプチド。
11. （１１）以下のアミノ酸配列： ＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣを有する請
    求項１のペプチド。
12. （１２）以Ｆのアミノ酸配列： ＫＹＬＱＤＱＡＲＬＨＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣ（式中、末
    端のカルボキシ基はアミド型でありそれぞれのＣのスル
    フヒドリル基はブロックされている） を有する請求項１のペプチド。
13. （１３）請求項１−１２のいずれかのペプチドを調製す
    る方法であって、 （ａ）単一アミノ酸及び／又は２つもしくはそれ以上の
    アミノ酸であらかじめ形成されたペプチドを必要な順序
    で縮合し、ここでアミノ酸がシステインの場合にはその
    スルフヒドリル基はフリーまたはブロックされている；
    次いで （ｂ）必要により末端のカルボキシ基をアミド型に変換
    し、そして必要によりシステイン残基あるいはそれぞれ
    のシステイン残基のフリーのスルフヒドリル基をブロッ
    クする； ことを含む上記方法。
14. （１４）請求項１−１２のいずれかのペプチドを調製す
    る方法であって、 （ｉ）請求項１−１２のいずれかのペプチドをコードす
    る遺伝子を有し且つ宿主細胞中にて該ペプチドを発現す
    ることのできるベクターで宿主細胞を形質転換し： （ｉｉ）得られる形質転換宿主細胞を培養してペプチド
    を発現せしめ；次いで （ｉｉｉ）該ペプチドを回収する； ことを含む上記方法。
15. （１５）生体液中のＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２抗
    体の存在を測定する方法であつて、 （ａ）請求項１−１２のいずれかのペプチドが固定化さ
    れた固相とテストサンプルとを接触すること；及び （ｂ）テストサンプルがいずれかの抗体を含んでいるか
    否かを測定するための手段； を含む上記方法。
16. （１６）該手段がラベル化分子もしくは粒子を用いるこ
    とによるものである請求項１５の方法。
17. （１７）ラベル化分子もしくは粒子が、アルカリホスフ
    ァターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、抗スピーシイ
    ズもしくは抗イムノグロプリンサブタイプ、リウマトイ
    ド因子、請求項１−１２のペプチドに対する抗体、ある
    いは該ペプチドを構成するエピトープを含む分子である
    請求項１６の方法。
18. （１８）ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２抗体の存在を
    測定するのに用いるテストキットであつて、（ａ）酵素
    でラベル化された請求項１−１１のいずれかのペプチド
    ； （ｂ）該酵素の基質； （ｃ）請求項１−１２のいずれかのペプチドが固定化さ
    れる表面を提供するための手段；及び、（ｄ）任意の洗
    浄溶液及び／又はバッファー；を含む上記テストキット
    。
19. （１９）ペプチドがＨＩＶ−１ｇａｇ及び／又はｅｎｖ
    配列である請求項１８のテストキット。
20. （２０）ｇａｇ配列はアミノ酸１２１−３５６を含むＨ
    ＩＶ−１配列であり、ｅｎｖ配列はアミノ酸５４２−６
    ７４を含むＨＩＶ−１配列である請求項１９のテストキ
    ット。