HUT55834A - Process for producing peptides binding to antibodies specific for human immune-deficite virus, process for diagnosting this virus and diagnostical kit for them - Google Patents
Process for producing peptides binding to antibodies specific for human immune-deficite virus, process for diagnosting this virus and diagnostical kit for them Download PDFInfo
- Publication number
- HUT55834A HUT55834A HU896324A HU632489A HUT55834A HU T55834 A HUT55834 A HU T55834A HU 896324 A HU896324 A HU 896324A HU 632489 A HU632489 A HU 632489A HU T55834 A HUT55834 A HU T55834A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- peptide
- hiv
- sequence
- amino acid
- peptides
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 173
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 6
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 16
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 57
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 50
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- -1 acetamidomethyl Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 4
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000005414 dithiopyridyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 2
- 229940100892 mercury compound Drugs 0.000 claims description 2
- 150000002731 mercury compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 8
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical group 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 19
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012124 AIDS-related disease Diseases 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LTZUZKNZSJFKDA-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;(4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C.C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 LTZUZKNZSJFKDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004066 1-hydroxyethyl group Chemical group [H]OC([H])([*])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBWDKUBOZHGOU-UHFFFAOYSA-N 2-acetylsulfanylacetic acid Chemical compound CC(=O)SCC(O)=O QSBWDKUBOZHGOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 229930186657 Lat Natural products 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N N-methylacetamide Chemical compound CNC(C)=O OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241001417527 Pempheridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100029807 SUMO-conjugating enzyme UBC9 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 208000010949 lymph node disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002653 sulfanylmethyl group Chemical group [H]SC([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 125000006633 tert-butoxycarbonylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
ELJÁRÁS HUMÁN IMMUNHIÁNY VÍRUSRA SPECIFIKUS ANTITESTEKHEZ KÖTŐDŐ PEPTIDEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA, ELJÁRÁS A FENTI VÍRUS DIAGNOSZTIZÁLÁSÁRA, ÉS AZ ERRE HASZNÁLHATÓ DIAGNOSZTIKAI KÉSZLET
THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED, London, Nagy-Britannia
Feltaláló:
DUNCAN Richard Julián Stuart,
Beckenham, Kent, Nagy-Britannia
Bejelentés napja: 1989. 11. 30.
Elsőbbsége:
1988. 12. 01. /8828097.9/ Nagy-Britannia
68446-881-SI • · ·· ·· ·· • · · · ····« • · · · · · ♦ · · ··· · ·· ·· ·
- 2 A találmány tárgya eljárás olyan peptidek előállítására, amelyek a humán immunhiány vírusra (HIV-ra) specifikus antitestekhez képesek kötődni, eljárás a HÍV diagnosztizálására, és az erre használható diagnosztikai készlet.
A HÍV felfedezése után szükségessé vált e virus jelenlétének kimutatása. Az 1-es tipusu HIV-re specifikus antitestek kimutatására szolgáló első generációs vizsgálatokban inaktivált HIV-l-et használnak. Olyan második generációs vizsgálati módszert fejlesztettünk ki az antitestre, amelyben a víruson azonosított antigén-molekularészletnek megfelelő szintetikus pepti eket használunk. Gnann és munkatársai /Science 237, (1987.
09. ll._)7 ismertettek olyan szintetikus peptides immunológiai vizsgálatokat, amelyekben meg lehet különböztetni az 1-es és
2-es tipusu HÍV (HIV-2) által okozott fertőzéseket.
Sikerült olyan különlegesen specifikus immunológiai vizsgálatot kifejlesztenünk a HÍV antitestekre, szintetikus peptidek alkalmazásával, amelyek szabad merkaptocsoportjai blokkoltak. A peptidek a HIV-1 gp41 glikoproteinjén levő, immunológiai szempontból domináns antigén-molekularész szekvenciáján és a megfelelő HIV-2 szekvencián alapulnak.
Ennek megfelelően a találmány· tárgya eljárás legfeljebb 30 aminosavmaradékból álló, valamely HÍV típusra specifikus antitesthez kötődni képes peptidek előállítására, amelyek egy (I) általános képletü szekvenciát tartalmaznak. A képletben X1 és Xg jelentése azonosan vagy eltérően egy aminosavmaradék; a terminális karboxilcsoport adott esetben amid formában van; és minden C-maradék merkatocsöpört ja blokkolt.
Az aminosavmaradékokat az egybetüs kóddal jelöljük • · · ·
- 3 /Éur. J. Biochem. 138, 9-37 (1184)/. A terminális karboxilcsoport előnyösen amid - azaz -CONHg - formában van, karboxil - azaz -COOH - forma helyett. Az oldalláncban lévő merkaptocsoport(ok) jellemző módon blokkoltak. Ezzel megakadályozható a diszulf id-hid ak kialakulása, megelőzhető a cisztein-maradékok oxidációja, és megakadályozható a peptidek hordozókhoz való nemkívánatos kötődése.
A peptidek (I) általános képletü szekvenciát tartalmaznak. A HIV-1 antitesthez kötődő peptidekben X^ jelentése előnyösen I, L vagy M. A HIV-2 antitesthez kötődő peptidekben X1 jelentése előnyösen N és Xg jelentése S. A többi aminosavmaradékot azonban változtathatjuk, feltéve, hogy a peptid a kivánt módon képes a HÍV antitesthez kötődni. Tehát az (I) általános képletü szekvencia N-terminálisához és/vagy C-terminálisához rendszerint további maradékok is kapcsolhatók, és a peptid igy is kötődik az antitesthez. Az N-terminális vég legfeljebb 14 aminsavmaradékkal, például legfeljebb 8, vagy legfeljebb 4 aminosavmaradékkal meghosszabitható. A C-terminálishoz legfeljebb 14, például legfeljebb 8, vagy 6 aminosavmaradék kapcsolható.
Az (I) általános képletü szekvencia a HIV-1 gp41 glikoproteinjén lévő immunológiailag domináns antigén-molekularész egy részéből, és a HIV-2 megfelelő helyéből származik. Ezek a HIV-1 esetén az 599 - 603· aminősavak, és a HIV-2 esetén az 593 - 597. aminősavak. A HIV-1 számozása Wain-Hobson és munkatársai /Cell 40, 9 (198517 szerint történik, a HIV-2 számozási rendszere Guyader és munkatársai /.Natúré 326, 662 (1986)7 szerinti. Az (I) általános képletü szekvencia egyik vagy mindkét
- 4 oldalán lévő aminosavak a HÍV specifikus törzsei szekvencia-adataiból következik. Előnyösek azok a peptidek, amelyek egy HIV-1 törzs 598 - 609. aminosav-maradékából álló szekvenciát, vagy egy másik HIV-tipusu törzs megfelelő aminosa-maradékainak szekvenciáját tartalmazzák. HIV-2 esetén ezért előnyösek azok a peptidek, amelyek az 592 - 603. aminosavakból álló szekvenciát tartalmazzák. A szekvencia egy vagy több aminosav szubsztitúciójával módosítható, ami nem változtatja meg a peptid kivánt antitesthez - azaz HIV-1-re vagy HIV-2-re specifikus antitesthez - való kötődését .
A megfelelő aminosav-helyettesitéseket úgy választjuk meg, hogy azok: nem változtatják meg az eredeti szekvencia fizikai-kémiai jellegét, például nem változik meg a töltés-sürüség, hidrofil/hidrofób jelleg, méret és konfiguráció. Az S például T-vel helyettesíthető, és fordítva; az E D-vel, és forditva; és a Q N-nel, és forditva. Ezenkívül a HIV-1 peptid estén az 598. aminosavmaradék, vagy a HIV-2 peptid esetén az 592. aminosavmaradék K is lehet.
A peptidek rendszerint legalább 6, például legalább 9, vagy legalább 12 aminosavmaradékot tartalmaznak.
A peptidek nem tartalmaznak 30-nál több aminosavmaradékot, például legfeljebb 25 vagy legfeljebb 15 aminosavmaradékból állnak. A peptid teljes szekvenciája előnyösen egy HIV-törzs természetes szekvenciájának felel meg, a szekvencia tartalmazza a HIV-1 esetén az 599 - 603. aminosavmaradékokat, vagy más HÍV típusok esetén a megfelelő aminosavmaradékokat. A fenti természetes szekvenciában azonban egy.vagy több fent említett szubsztitúció is előfordulhat. A peptidek például az alábbi izolált HÍV • · · · törzsekből származhatnak:
HIV-1 (Z-3): Wiley és munkatársai, PNAS USA, 83, 5038 (1986);
HIV-1 (LAVbru; HTVL-IIIB; HTVL-IIifr; WMJ-1; ARV-2): Wain-Hobson és munkatársai (1985); Ratner és munkatársai, Natúré 313, '277 (1985); Starcieh és munkatársai, Cell, 45, 637 (1986); és
Sanchez-Pescador és munkatársi, Science 277, 484 (1985);
HIV-1 (LAV-ELI) és HIV-1 (LAV-MAL): Alizon és munkatársai, Cell,
46, 36 (1986) ; és
Guyader és munkatársai (1987).
Előnyösek az alábbi szekvenciáju peptidek:
HIV-1: LGLWGCSGKLIC
LGIWGCSGKLIC
LGIWGCSGKHIC
LGMWGCSGKHIC
HIV-2: NSWGCAFRQVC
KYLQDQARLNSWGCAFRQVC
AIEKYLQDQARLNSWGC
KNSWGCAFRQVCHTTVPWVN
RVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVC
A peptidben lévő minden merkaptocsöpört védett. A merkapto-védőcsoport acetamido-metil-csoport lehet, vagy egy szerves higanyvegyületből, maleimidből vagy diszulfid-blokkolószerből származtatható csoport. Diszulfid-blokkolószerre példaként említhetjük az Ellman-reagenst, ditio-piridilt. A védőcsoport előnyösen N-etil-maleimidből származó (a) képletü csoport, vagy (b) képletü acetamido-metil-csoport.
• · · · • · · · 4 • · ·· ····· • · · · ·*··· ·♦· · · a· ·· ·
- 6 A találmány szerinti péptidek szintetikus peptldek.
Ezeket kémiai szintézissel állíthatjuk elő. Szilárd fázisú vagy oldatban végbemenő peptidszintézist alkalmazhatunk. A peptidet igy az alábbi eljárással állíthatjuk elő:.
(a) az egyes aminosavakat és/vagy két vagy több aminosavból álló aminosav-fragmenturnékat a találmány szerinti pepiidnek megfelelő sorrendben kondenzáljuk, mimellett ha az aminosav cisztein, a merkaptocsoport szabad formában van, vagy blokkolt; ily módon egy találmány szerinti peptidet kapunk, amelynek terminális karboxilcsoportja szabad, vagy amid formában van; és (b) kívánt esetben a cisztein-maradék(ok) szabad merkaptocsoportját blokkoljuk.
Szilárd fázisú peptidszintézis esetén a kívánt peptid amincsav-szekvenciáját a C-terminális aminosavtól kezdve építjük fel, amelyet oldhatatlan gyantához kötünk. A kívánt peptid-szekvencia kialakítása után a peptidet a gyantáról lehasitjuk.
Ha a peptid-szintézist oldatban hajtjuk végre, a peptidet ismét a C-terminális aminosavból kiindulva építhetjük fel. A fenti aminosav karboxilcsoportja a szintézis során végig blokkolt megfelelő védőcsoporttal, amelyet a szintézis végén eltávolítunk.
Bármelyik - szilárd fázisú vagy oldat-fázisú - eljárás esetén a reakció-rendszerbe beadagolt összes aminosav rendszerint védett «K-amino-c söpör ttal és aktivált karboxilcsoporttal rendelkezik. Az aminocsoportót fluoren-9-il-metoxi-karbonil-csoporttal (?moc) vagy terc-butoxi-karbonil-csoporttal (Boc) védhetjük. A karboxilcsoportot pentafluor-fenil- vagy l-oxo-2-hidroxi-dihid- 7 ro-benzotriazin-észter formájában aktiválhatjuk. Az egyes kondenzációs lépéseket diciklohexil-karbodiimid vagy 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében hajthatjuk végre.
Az oldalláncokban lévő funkciós csoportokat rendszerint szintén védjük, például a lizin oldalláncban lévő aminocsoportját, vagy a treonin oldalláncban lévő hidroxilc söpört ját, vagy a cisztein cldalláncban lévő merkaptocsoportját.
Az X-amino-védőcsoportot minden egyes szintézis-lépés után eltávolítjuk. Az oldallánc-védőcsoportokát azonban rendszerint csak a szintézis befejezése után távolitjuk el, vagy kívánt esetben nem távolitjuk el azokat. Védett merkaptocsoport esetén viszont kívánt esetben a védőcsoportot nem távolitjuk el, ha azzal blokkolni kívánjuk a merkaptocsopcrtot. Ha más blokkoló csoportot kívánunk bevinni a peptidbe, vagy a peptidet szabad merkaptocsoporto(ka)t tartalmazó formában kívánjuk előállítani, a védőcsoportot eltávolítjuk.
A peptideket tetszés szerint C-terminális karboxilcsporttal vagy amidcsoporttal állíthatjuk elő. Szilárd fázisú peptid-szintézis esetén ez attól függ, hogy a C-terminális aminosav hogyan kötődik a hordozó gyantához és/vagy a kész peptidet hogyan hasítjuk le a gyantáról. A gyanta általában egy sztirol és/vagy divinil-benzol polimer. A C-terminális aminosav a gyantához észter-kötéssel kapcsolódhat, amelyet erős savval, például trifluor-ecetsavban hidrogén-bromiddal, vagy hidrogén-fluoriddal hasíthatunk C-terminális karboxilcsoportot tartalmazó peptiddé. Ammonolizissel megfelelő amidot állitháunk elő szabad karboxilcsoportot tartalamzó peptid helyett.
• ♦ *
- 8 A peptid-amid szilárd fázisú szintézissel való előállításának másik módja az, hogy a peptid C-terminális aminosavját peptid amino-benzhidril-kötéssel kapcsoljuk a gyantához. Ezt úgy alakítjuk ki, hogy diciklohexil-karbodiimiddel végezzük a kapcsolást, és a kötést hidrogén-f luoriddal hasíthatjuk, rendszerint hidegen. Oldat-fázisú szintézis esetén attól függ, hogy C-terminális karbcxil- vagy amid csoportot kapunk, hogy a C-terminális aminosav karboxilesöpörtját hogyan blokkoljuk, és a szintézis befejezése után hogyan távolitjuk el a védőcsoportot.
A C-terminális karboxi le söpör tót tartalmazó pepdidet C-terminális amidcsoportot tartalmazó pepiiddé alakíthatjuk, és f ord i tva.
A peptideket rekerabináns DNS-eljárásokkal is előállíthatjuk. így a peptidet kódoló DNS-szekvenciát állítjuk elő. Készítünk egy expressziós vektort, amely a DNS-szekvenciát magában foglalja, és amely képes megfelelő gazdasejtben a peptid kifejezésére .
A DNS-szekvenoia a vektorban transzlációs start és stop jelek között helyezkedik el. Megfelelő transzkripciós szabályozó elemeket is alkalmazunk, különösen proűotert a DNS-szekvenciára, és egy transzkripciós terminációs helyet.
A DNS-szekvencia a helyes transzkripciós keretben van, igy a peptid kifejeződhet a vektorral összeférhető gazdaszerveze tben.
Bármely megfelelő gazda-vektor rendszert alkalmazhatunk. A vektor például plazmid lehet. Ebben az esetben bakteriális vagy élesztő gazdaszervezetet használhatunk. A vektor virá• « • · ······ • · ·· ·· · · · • · · · ····» ···· · ·· ·* ·
-· 9 lis vektor is leket. Ezt emlős sejtvonal sejtjeinek fertőzésére használhatjuk, a peptid kifejezésére.
A blokkolt merkaptocsöpörtokát tartalmazó peptldeket kétféle módon állíthatjuk elő. Egyik módszer szerint védett merkaptocsoportokát tartalmazó cisztein-molekulákat használhatunk az (a) lépésben, amikor a peptidet az aminosav-prekurzorokból felépítjük. Másik módszer szerint szabad merkaptocsoporto(ka)t tartalmazó találmány szerinti peptidet állítunk elő, amelyeket ezután blokkolunk. A merkaptocsoportot blokkoló szert vagy a szabad ciszteinnel, vagy az (I) általános képletü pepiiddel reagáltatjuk, a módszertől függően.
Bármely megfelelő, merkaptocsoportot blokkoló szert alkalmazhatunk. Példaként az aoetamido-metanolt és a szerves higany, maleimid és diszulfid blokkolószereket említhetjük, Megfelelő diszulfid blokkolószer például az Ellman-reagens és a ditio-piridil. Előnyösen N-etil-maleimidet vagy acetamido-metanéit használunk.
Ha a találmány szerinti peptidet szabad merkaptoCsoporto(ka)t tartalmazó formában kapjuk, amelye(ke)t azután blokkolni kívánunk, a peptidet először redukáljuk. Rendszerint erős redukálószert, igy ditionitot, 2-merkapto-etanolt, ditio-treitolt vagy ditio-erivritolt használunk. Előnyös a ditio-treitol használata. Ha a redukálószert csak kis feleslegben használjuk, a redukált peptidet nem szükséges szeparálni a merkaptocsoportot blokkoló szer hozzáadása előtt.
Rendszerint úgy járunk el, hogy a peptid 100 - 5G0 yumól/1 koncentrációjú oldatát pufferben (pH 7) közelítőleg ···· ·· • · · · ····· ···· · ·* ·· ·
- 10 kétszeres moláris feleslegben lévő redukálószerre1, például ditio-treitollal (azaz 200 - 1000 yumól/1 redukálószerrel) redukáljuk, legalább 20 percen keresztül, rendszerint 30 percen át. Ezután hozzáadjuk a blokkolószert, például IJ-e til-maleimide t, közelítőleg kétszeres moláris feleslegben az összes jelenlévő merkaptocsoportra számolva. A blckkolósz-ert legalább 1 órán keresztül reagáltatjuk. A módosított pepiidet ezután megfelelő pufferoldattal gélszürhetjük. Úgy is eljárhatunk, hogy a módosított peptidet továbbreagál tat juk a kapcsolószerrel, például S-acetil-tioglikolsav N-hidroxi-szukcinimid-észteréve 1 (SATA) vagy 4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-l-karboxiláttal (SI4CC) a gélszürés előtt.
A találmány szerinti peptidet HIV-re, például HIV-1-re és/vagy HIV-2-re specifikus antitestek vizsgálatára alkalmazhatjuk. A vizsgálat bármely megfelelő biológiai folyadékban - például vizeletben, plazmában, vérben, szérumban, ondóban, könnyben, nyálban vagy agy- . -gerincvelő-folyadékban - elvégezhetjük. A vizsgálati eljárás abból áll, hogy a vizsgálandó mintához hozzáadjuk a peptidet, és meghatározzuk, hogy kötödik-e antitest a peptidhez. Erre a célra készíthetünk egy teszt-készletet, amely egy találmány szerinti peptidet és olyar. eszközöket tartalmaz, amelyek alkalmasak annak meghatározására, hogy a mintában esetleg jelenlévő, HIV-re specifikus antitest kötődik-e a peptidhez.
Számos vizsgálati forma alkalmazható. A peptidet használhatjuk a HIV-re szelektív antitest oldatból való megkötésére, a már megkötött antitest jelölésére, vagy mind megkötésre, mind jelölésre. Ezenkívül a peptidet számos homogén vizsgálati ···· ·«·· ·· ·· · • · · · · · • · · ·»··· • · · ····· • ·· ·· *
- 11 formában is alkalmazhatjuk, amikor a pepiiddel reagáló antitestet oldatban detektáljuk, a fázisok szétválasztása nélkül. A peptidet HÍV antigén detektálására is használhatjuk.
Az olyan vizsgálatban, amikor a peptidet az antitestek oldatból való megkötésére használjuk, a peptidet egy szilárd felületen immobilizáljuk. Hz a felület valamilyen módon mosható kell, hogy legyen. Az alkalmazható felületek például különféle tipusu polimerek (mikrotitrátor lemezzé préseltek· gyöngyök; különféle tipusu mérőpálcák; felszívó hegyek; elektródok és optikai eszközök), részecskék (például latex; stabilizált vér-, bakteriális vagy gombasejtek; spórák; arany vagy egyéb fém-szolok; és protein jellegű kolloidok; a részecskék átlagos mérete 0,1 - 5 mikron lehet), membránok (például nitro-cellulóz; papír; cellulóz-acetát; és nagyporczitásu vagy nagyfelületű, szerves vagy szervetlen anyagokból készült membránok) lehetnek.
A peptid felülethez való kötése történhet optimális összetételű oldatból való passzív adszorpcióval (az oldat felületaktív szereket, oldószereket, sókat, szuszpendálószereket tartalmazhat) vagy aktív kémiai kötéssel. Az aktív kötést különféle reakcióképes vagy aktiválható funkciós csoportokon keresztül alakíthatjuk ki, amelyeket a felülethez kapcsolhatunk (ilyenek például a kondenzálószerekj aktív észterek, halogenidek, anhidridek; aminc-, hidroxil- vagy karbcxilcsoportok; merkaptocsoportok;. karbonilcsoportok; d iazocsopcrtck; telítetlen csoportok).
Az aktív kötést proteinen keresztül is kialakíthatjuk (magát a proteint kapcsoljuk a felülethez passzívan vagy aktív kötéssel) vagy hordozó proteinen - például albuminon vagy kaze♦· ·««· ·· ♦· · • · * · · * 4» • · ·9 ···«« • · · · ···«· ♦··· · ·· ·· ·
- 12 inén - keresztül, amelyhez a peptidet különféle eljárásokkal kémiailag köthetjük, és amely előnyöket biztosíthat izoelektromos pontja, töltése, hidrofil jellege vagy egyéb fizikai-kémiai tulajdonságai következtében. A peptidet is köthetjük a felülethez (rendszerint, de nem szükségszerűen membránhoz) a reakcióé légy, például immun-precipitációs elegy elektrofőretikus szétválasztása után.
A peptidet hordozó felülete,t a vizsgálandó mintával val érintkeztetve (reagáltatva), majd a vizsgálandó minta feleslegét valamely arra'alkalmas módszerrel (mosással, centrifugálással, szűréssel, mágnesességgel, kapilláris hatással) eltávolitva a megkötött antitestet valamilyen detektálható jelet szolgáltató módszerrel meghatározzuk. Például egy fent megadott jelzett molekulát vagy részecskét használunk, amely reagál a megkötött antitesttel (például protein Α“ΐ vagy protein G-t vagy hasonló molekulát; anti-speciest vagy anti-immunglobulin altípust; reumatoid faktort; a peptidhez kompé titiv módon vagy irreverzibilisen kötődő antitestet; vagy bármely olyan molekulát, amely a peptidet felépítő részt vagy magát a peptidet tartalmazza; vagy a HIV_ből közvetlen vagy közvetett módon származó más proteineket és peptideket).
A detektálható jel optikai, radioaktív vagy fizikai-kémiai jellegű lehet, amelyet úgy nyerünk, hogy a kívánt molekulát közvetlenül például egy festékkel, radioaktivan, elektroaktivan, mágneses rezonanciásan vagy fluoreszcenciásan; vagy közvetve jelezzük, például úgy, hogy a molekulát vagy részecskét egy enzimmel jelezzük, amely képes valamely mérhető váltó• * · · · ♦ · • · · ···· • · ·· ·
- 13 zást okozni. A detektálható jel például agglutináció, diffrakciós hatás vagy kétszeres fénytörés következménye is lehet, amely, akkor lép fel, ha az emlitett felület részecske formában van.
Az olyan tipusu vizsgálatokban, amikor a peptidet arra használjuk, hogy azzal egy már megkötött antitestet jelezzünk, a peptidet valamilyen módon jelezni kell, amelynek segítségével azután detektálni tudjuk. A jelzés közvetlen lehet, amikor a pepiidhez kémiailag vagy passzívan például rádió-, mágneses rezonancia-, részecske- vagy enzim-jelzőt kötünk; vagy közvetett, amikor egy olyan molekulát jelzünk valamilyen formában, amely maga képes reagálni a peptiddel, ilyen molekula például a peptiddel szembeni antitest, és a jelzett molekula ezt követően a peptiddel reagál.
A jelzésnek a pepiidhez való kötése kémiailag közvetlen lehet olyan csoporton keresztül, amely eredetileg is jelen van a pepiidben, ilyen például egy aminocsoport; vagy egy, a pepiidbe utólagosan bevitt csoporton, például maleimidcsoporton keresztül. Az antitestek megkötése lejátszódhat valamely fent emlitett felületen, bármilyen módon, például passzív vagy aktivált adszorpcióval, amelynek eredményeként specifikus antitest vagy kötött immun-komplexek keletkeznek. Az antitest megkötése közelebbről anti-speciesek vagy anti-immunglobulin-altipusok, reumatoid faktorok, protein A, G és hasonlók által; vagy bármely, a peptid antigén-szakaszát tartalmazó molekula által történhet.
Az olyan tipusu vizsgálatokban, amikor a peptidet a mintában lévő HÍV antitest mérésére használjuk, a peptidet valamely fent ismertetett módon jelezhetjük, és vagy kompetitiv mó·· «·«· *· «· * ·« »·«·«· • · ·· ··· « * • · · · · ·*·· ···· · ·· ·· ·
- 1.4 dón való kötésre használjuk, amikoris a pepiidnek a fent ismertetett felületen lévő specifikus molekulákhoz való kötődését gátolja a mintában lévő antigén; vagy nem-kompetitiv módon való kötésre, amikoris a mintában lévő antigént kötjük specifikusan vagy nem-specifikusan egy fenti felülethez, ami viszont egy specifikus két vagy több vegyértékű molekulához - például antitesthez kötődik, és a molekula fennmaradó vegyértékét használjuk fel a jelzett peptid megkötésére.
Homogén vizsgálati módszer alkalmazása esetén általában a peptidet és az antitestet jelezzük, úgy, hogy amikor az antitest a peptiddel szabad oldatban reagál, a két jelzés kölcsönhatása következtében például az egyik jelzéssel kapcsolódó energia a másik jelzésre nem-sugárzásos módon áttevődik, és a gerjesztett második jel vagy kioltott első jel megfelelően mérhető (például f luorime triásan, mágneses rezonanciásan vagy enzimatikusan). Antigén vagy antitest hozzáadása a mintában a jelzett párok közötti kölcsönhatást gyengíti, igy a detektálás során eltérő nagyságú jelet kapunk.
A HIV-1 vagy HIV-2 detektálására alkalmas módszer a közvetlen szendvics enzim immunvizsgálati módszer (EIA). A mikrotitrátor lemez bemélyedéseit bevonjuk egy találmány szerinti peptiddel, amelyhez a HIV-1 és HIV-2 antitestek egyike kötődik. Ezután egyidejűleg bemérjük a vizsgálandó mintát és egy, a fenti HIV-1 és HIV-2 antitestek egyikéhez kapcsolódni képes találmány szerinti peptidet, amelyet egy enzimhez kapcsoltunk (konjugált peptidet).
A specifikus antitestek mind a mélyedést bevonó peptidhez, mind a konjugált pepiidhez kötődnek. Rendszerint ugyan·*«· • ·
• · ···« ·· «· ·
- 15 azt a találmány szerinti peptidet alkalmazzuk a szendvics mindkét oldalán. Mosás után a megkötött enzimet színváltozást okozó specifikus szubsztráttal detektáljuk. A fenti EIA kivitelezésére alkalmas készlet összetétele az alábbi:
(1) egy enzimmel jelzett, találmány szerinti eljárással előállított vegyület, amelyhez a HIV-1 és HIV-2 antitestek közül az egyik kötődik;
(2) az enzim egy szubsztrátja;
(3) olyan eszköz, amely megfelelő felülettel rendelkezik a találmány szerinti eljárással előállított, jelzetlen peptid immobilizálására, és amelyhez a HIV-1 és HIV-2 antitestek közül az egyik kötődik; és (4) kívánt esetben mosóoldatok és/vagy pufferek.
A találmány szerinti peptideket kombinált vizsgálatban is használhatjuk, a HIV-1-re és HIV-2-re specifikus antitestek együttes kimutatására. Ekkor a vizsgálandó mintát egy, a HIV-1 és HIV-2 antitestek közül az egyiket megkötő; találmány szerinti eljárással előállított pepiiddel, és egy olyan polipeptiddel hozzuk érintkezésbe, amely a HIV-1 éa HIV-2 antitestek közül a másikra specifikus antitestet megkötő antigén-molekularészt tartalmazza, és meghatározzuk, hogy kötődik-e antitest a találmány szerinti . pepiidhez és/vagy a fenti polipeptidhez. Bármely fent említett vizsgálati módszert alkalmazhatjuk erre a célra, megfelelő módosításokkal.
A HIV-1-re és HIV-2-re specifikus antitestek kimutatására alkalmas kombinált vizsgálatra megfelelő készlet tartalmaz egy találmány szerinti eljárással előállított peptidet, amelyhez a HIV-1 és HIV-2 antitestek közül egyik kötődik, egy olyan poli16 ·· ·<·· ·· ·ν « » · · · · · ·· • · ·· ··· · 4 • · · · · ···· ···♦ · ·« ·· · peptidet, amely egy, a HIV-1 és HIV-2 antitestek közül a másikat megkötő antigén-molekularészt tartalmaz, és olyan eszközöket, amelyekkel kimutatható, hogy a vizsgált mintában esetleg jelenlét vő HIV-1 vagy HIV-2 elleni antitestek kötődtek-e a fenti polipeptidhez, vagy a találmány szerinti eljárással előállított peptidhez.
A fent említett EIA módszer alkalmas a kombinált vizsgálatra is. A HÍV—1 és HÍV—2 antitestek közül a másikat megkötő antigén-molekularészt tartalmazó polipeptiddel is bevonjuk a mikrotitrátor lemez bemélyedéseit. A fenti polipeptidet, például egy enzimmel jelzett azonos polipeptidet a vizsgálandó mintával és a találmány szerinti eljárással előállított konjugált pepiiddel együtt hozzáadjuk. A polipeptiden lévő enzim-jelzés azonos vagy különböző lehet, mint a. .találmány szerinti peptiden lévő jelzés. így a fenti (1) - (4) komponenseken kívül az ilyen EIA vizsgálatra alkalmas készletek az alábbi komponenseket tartalmazzák:
(5) egy, a HIV-1 és HIV-2 antitestek közül a másikat megkötő antigén-molekularészt képviselő polipeptidet, amely egy enzimmel van jelezve;
(6) abban az esetben, ha az enzim a találmány .szerinti peptid jelzésére használt enzimtől eltérő, egy szubsztrátot az enzim számára; és (7) a HIV-1 és HIV-2 közül a másikat megkötő antigén-molekularészt képviselő jelzetlen polipeptid immobilizálására alkalmas felületet biztositó eszközöket.
Ha a. találmány szerinti peptidet és a (7) pontban említett, jelzetlen polipeptidet ugyanazon felületen immobilizáljuk, a (3) éa (7) pontban megadott eszközök azonosak.
• · · ·
- 17 A HIV-1 és HIV-2 antitestek közül a másikat megkötő polipeptidet kémiai utón is előállíthatjuk. Ez egy olyan polipeptid is lehet, amelynek egy vagy minden merkaptocsöpört ja blokkolt a találmány szerinti eljárásnak megfelelően. A fenti polipeptid azonban rekombináns polipeptid is lehet.
A HIV-1 különösen kétféle tipusu antitestet provokál.
Ezek a gag protein elleni anti-p24 és az env protein elleni anti-gp4l. Előállítottunk egy olyan speciális fúziós peptidet, amelyhez mind az anti-p24, mind az anti-gp41 kötődik. Ez a protein ezért a HIV-1 antitestet megkötő antigén-molekularészt képviselő polipeptidként használható. A fenti protein szekvenciája az alábbi:
20
MetAsnSerProAspThrGlyHisSerSerGlnValSerGlnAsnTyrProIleValGln pl8> p24>
AsnlleGlnGlyGlnMetValHisGlnAlalleSerProArgThrLeuAsnAlaTrpVal
LysValValGluGluLysAlaPheSerProGluValIleProMetPheSerAlaLeuSer
100
AlaMetGlnMetLeuLysGluThrlleAsnGluGluAlaAlaGluTrpAspArgValHis
110
120
ProValHisAlaGlyProIleAlaProGlyGlnMetArgGluProArgGlySerAspIle
- 18 130· 140
AlaGlyThrThrSerThrLeuGlnGluGlnlleGlyTrpMetThrAsnAsnProProIle
150160
ProValGlyGluIleTyrLysArgTrpIlelleLeuGlyLeuAsnLysIleValArgMet
170180
TyrSerProThrSerlleLeuAspIleArgGlnGlyProLysGluProPheArgAspTyr
190200
ValAspArgPheTyrLysThrLeuArgAlaGluGlnAlaSerGlnGluValLysAsnTrp
210220
MetThrGluThrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspCysLysThrlleLeuLysAla
230240
LeuGlyProAlaAlaThrLeuGluGluMetMetThrAlaCysGlnGlyValGlyGlyPro
250260
AsnSerProArgGlnLeuLeuSerGlylleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAla gp41>
270280
IleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlylleLysGlnLeuGlnAla
290300
ArglleLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCys
310320
SerGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSer
330340
LeuGluGlnlleTrpAsnAsnMetThrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyr
350360
ThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln
370
GluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPheAsnGlyAspPro.
* · · • · · · · · » · * · · · • · · · · · « • · · ♦ · · · • · · · ·
- 19 A fenti proteint DM626 jelzéssel láttuk el. Előállítását 8830170.5 számú európai szabadalmi bejelentésünkben ismertettük. A protein szekvenciája egy vagy több aminosav helyettesítésével, inzerciójával és/vagy deléciójával és/vagy egyik vagy mindkét vég meghosszabitásával módosítható, feltéve, hogy az ilyen módosított szekvenciája protein képes megkötni az anti-p24-et és az anti-gp41-et, és legalább 75 % homológia van a módosított és módosítatlan szekvencia között.
A módosítatlan szekvencia alapvetően a HIV-l-ből izolált CBL-1 p24 és gp41 protein részeinek fuzionálásából származik (WO 86/04423). Ezek a részek a 121 - 356. és 542 - 674. aminosavaknak felelnek meg, Meusing és munkatársai számozási rendszere szerint /_Nature 313, 450 - 458 (1985)/. A fenti részek kezdete a fenti aminosavszekvencia 17. és 244. aminosavjánál van. Az
5-16. aminosavak a pl8 proteinből származnak. Az 1-4·, 241 - 243.és 377 - 379. aminosavak abból az expressziós vektorból származnak, amelyből a fúziós proteint kaptuk, illetve a DNS-manipuláclókból.
A szekvencia egy vagy több aminosav helyettesítésével, inzerciójával és/vagy deléciójával módosítható. Ezek a módosítások a szekvenciában bárhol előfordulhatnak, de különösen a szekvencia azon részeiben, amelyek nem a p24 és gp41 proteinből származnak. Szubsztitúció esetén a módosítatlan szekvencia egy vagy több aminosavját egy vagy több olyan aminosavval helyettesítjük, amelyek megőrzik a szekvencia fizikai-kémiai tulajdonságait, például nem változik a töltés-sürüség, üdrofil/hidrofob jelleg, méret és konfiguráció. így például a Ser-t Thr-cal helyettesíthetjük, és megfordítva; a Glu-at Asp-val, és megfordítva; míg a • · ···· ·· · · * • · · « ·· ·· . · · · ···· • · · · · · •··· · ·· ··
- 20 Gln-t Asn-nal, és megfordítva. A 10. aminosavat képviselő Ser-t Asn-nal helyettesíthetjük.
A szekvenciát egyik vagy mindkét végén meg is nyújthatjuk. Ez adott esetben legfeljebb egy további karboxil-terminális Cys-maradék hozzáadását jelenti. Az aminosav-szekvenciát azonban 50 aminosav-maradék hozzáadásával is meghosszabi thatjuk, egyik vagy mindkét végén. A módosítatlan szekvenciához igy legfeljebb 40 aminosavat, például 20 aminosavat adhatunk az amino-terminális és/vagy karboxil-terminális végen. Az amino-terminális aminosav azonban rendszerint Met, a proteint kifejező nukleinsav-szekvencia transzlációs start-kod ónja következtében.
Ez a helyzet, hacsak a protein nem úgy fejeződik ki, hogy amino-terminálisán egy hordozó-proteinnel van fuzionálva, és a fúziós proteint hasítva kapjuk a találmány szerinti proteint.
A szekvenciát úgy módosíthatjuk, hogy a módosítatlan proteint kódoló DNS-szekvenciában végrehajtjuk a megfelelő változtatásokat. Ezt bármely arra alkalmas módszerrel végrehajthatjuk, például a szekvenciát egy endonukleázzal megrövidítjük, beillesztünk. egy kötő-szekvenciát, exonukleázokat és/vagy polimerázokat és hely-irányitott mutagenezis technikát alkalmazunk. Azt, hogy a módosított DNS-szekvencia olyan módosított proteint kódol-e, amelyhez mind az anti-p24, mind az anti-gp-41 képes kötődni, egyszerűen megállapíthatjuk. A módosított szekvenciát egy megfelelő plazmidba klónozzuk, a nlazmiddal egy gazdasejtet transzformálunk, és a kifejeződött proteint megvizsgáljuk, hogy képes-e kötődni az anti-p24-gyel és az anti-gp41-gyel. Tehát legalább 75 például 85 %, vagy több, vagy 90 % vagy több kell, hogy legyen a homológia mértéke a módosított és módosítatlan proteinek aminősav-szekvenciájában.
A találmány szerinti peptidre specifikus antitestek termelődését egy fenti peptid alkalmazásával válthatjuk ki. Az antitest moncklonális vagy poliklonális lehet. Az antitestet a peptid-sarzsok minőségi kontroli-vizsgálatára; a rekombináns protein, peptid vagy virális lizátum tisztítására; antigén-molekularész ' feltérképezésére ; és ha .jelzett, antitest-detektálási kompetitiv tipusu vizsgálatban konjugátumként; valamint antigén-detektálási vizsgálatokban használhatjuk.
Poliklonális antitest előállítására a hordozóhoz kapcsolt (I) általános képletü peptidet egy emlős vagy egyéb állati szervezetbe injektáljuk, például egérbe, patkányba, birkába vagy nyulba, és a pepiiddel szemben termelődött antitestet kinyerjük. A peptid-hordózó konjugátumot rendszerint injektálható készítmény formájában adagoljuk, amely fiziológiailag elfogadható higitószert is tartalmaz. A készítmény adjuvánst - például Freund-féle adjuvánst (FCA-t) vagy Freund-féle nem teljes adjuvánst (FIA-t) is tartalmazhat. Az állatokat megfelelő időtartamon keresztül immunizáljuk. Az állatoktól megfelelő időközökben vért veszünk a peptid-ellenes aktivitás meghatározására. Ha az aktivitás megfelelő szintet ér el, az állatokat elvéreztetjük. Az antitestet extraháljuk és például sóval kicsapva és affinitási kromatográfiás eljárással tisztítjuk, immobilizált szintetikus peptidet alkalmazva.
A monoklonális antitestet termelő hibridómát úgy állíthatjuk ele, hogy a szaporodást biztosító sejteket a találmányszerinti pepiiddel szembeni antitestet termelő sejtekkel fu
- 22 zionáljuk. Jellegzetes módon egy állati gazdaszervezetet, például egeret immunizálunk a pepiiddel szemben. A lépet eltávolítjuk az immunizált állatból. A lépsejteket egy fenntartó sejtvonallal, például egérből származó myeloma-sejtvonallal fuzionáljuk. Ily módon peptid-specifikus monoklonális antitestet kiválasztó hibridomát kapunk. Az antitestet a fent ismertetett módon tisztíthatjuk..
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni. Három referenciapéldát is ismertetünk.
1, referenciapélda
Karboxil-terminálisán amidcsoportot tartalmazó KYIQDQAKINSWG-CAFRQVC peptid előállítása
A peptidet Merrifield módszerének /Kerrifield, JACS,
85, 214-9 - 2154 (1963)/ Houghten által leirt módosításával szintetizáljuk /Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5131 - 5135 (1985)7.
A peptidet p-metil-benzhidril-amin-divinil-benzol gyantán szintetizáljuk. Az egyes aminősavak «f-amino-csopcrtját terc-butoxi-karbonil-csopcrttal (Boc) védjük. Az egyes kapcsolási lépések az alábbiak:
1. a gyantát diklór-metánnal mossuk - 10 perc
2. mosás 5 % diizopropil-etil-amint tartalmazó diklór-metánnal - perc, háromszor
3. mosás diklór-metánnal - 1 perc, kétszer
4. terc-butoxi-karbonil-aminosav kapcsolása diklór-metánban,
0,3 mól/1 diizopropil-karbodiimid jelenlétében - 60 perc
5. azonos a 3. lépéssel • · • ·
6. védőcsoport eltávolítása 50 % trifluor-ecesavat tartalmazó diklór-metánnal - 20 perc
7. mosás diklór-metánnal - 1 perc, hatszor
8. folytatni a 2. lépéstől.
A kapcsolási ciklusok befejezése után a peptidet a gyantáról lehasitjuk, hidrogén-f luoriddal 1 órán keresztül kezelve, 10 % anizol (scavenger) jelenlétében. A peptidet a fenti módon C-terminálisán amid csoportot tartalmazó formában kapjuk. A terméket ezután éterrel mossuk, szárítjuk, 15 %-os ecetsavban oldjuk és liofilizáljuk.
2.referenciapélda
Karboxil-terminálisán amidésenortót tartalmazó,ΑΙΕΚΪΙQjjQARI;N5WGC_ és_KKSWGCAFEQ7CHTPVPWVN pe ptidek előállitása
A cim szerinui peptideket az 1.referenciapélda szerint állítjuk elő. Ezért mindkét peptid C-terminálisán amidcsoportot tartalmaz.
1. példa
Merkaptocsoportok blokkolása
Az 1. és 2. példa szerint előállított egyes peptidek merkaptocsoportjait az alábbiak szerint blokkoljuk.
A peptid 25 mmól/1 koncentrációjú HEPES pufferrel (pH
7,0) készült mólfeleslegü
100 150 umól/1 koncentrációjú (azaz 200 - 1000 umól/1) oldatát kétszeres ditio-treitollal redukáljuk 30 percen keresztül. Az AIEKYLQDQARLNSWGC peptid esetén azonban csak egyszeres mólfeleslegü (azaz 100 - 500 ^umól/1) ditio-treitolt használunk, mivel a peptid csak egyetlen cisztein-ma• · · • 4 • · radékot tartalmaz.
® Az összes jelenlevő merkaptocsoportra számítva kétszeres moláris feleslegben N-etil-maleimidet adunk az elegybez. A blokkolási reakciót 1 órán keresztül hagyjuk végbemenni. A módosított peptidet ezután pufferoldatba gélszürjük.
2. példa jl2!í!S2]:j_!jl2£!S2PÍ222°P°r^2^a'b tartalmazó ΚΥ^Ι^ΑνΙΙ'Ο'G0AFR^VC_2eptiddel_végzett_kczvetlen_szendvics_SIA A pepiiddel passzívan bevonjuk a mikrotitrátor lemez lyukait. A lyukakba a szérum-mintákkal együtt bemérjük a konjugált peptidet. A peptid-konjugátum enzim-komponense lúgos foszfatáz. A lemezt kb. 1 órán keresztül inkubáljuk, majd a lyukakat kimossuk és bemérjük az enzim szubsztrátját. A szubsztrát ciklusos eró'sitési rendszerrel nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP). Az anti-HIV-2 jelenlétét a mintában hasonló módon kezelt standarddal összehasonlítva mutatjuk ki. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük.
1. táblázat vizsgálatban + vizsgálatban Ismerten HIV-2 Ismerten HIV-1 Ismerten HÍV pozitív minták pozitív minták negatív minták
115 0 0
170 * · ····♦· • · ·· ··· · · « · ·· ··♦·· ···· · ·· ·· ·
3- referenciapélda
Enzim__immunvizsgálat 1-es és 2-es tipusu humán immunhiány virus (HIV-1 és HIV-2) kimutatására, KYLQDQAKINSWGCAER2YG_HIV-2_peptid__és a 17 - 18. oldalakon hivatkozott szekvenciáju HIV-1 fúziós peptid felhasználásával
A peptidekkel bevonjuk a mikrotitrátor lemez lyukait.
A konjugált peptidekkel együtt bemérjük a szérum-mintákat az igy előkészített lyukakba. A konjugátümok ugyanezen antigének elegyei, amelyeket előzőleg lúgos foszfatázzal jeleztünk. A lemezeket kb.
órán keresztül inkubáljuk, majd a lyukakat kimossuk és az enzim szubsztrátját bemérjük. Szubsztrátként ciklusos erősítő rendszerrel nikotinamid-adenin-dinukleotid-f oszfátot (MAI?) használunk, amely színes reakcióterméket eredményez. Az enzimreakciót megfelelő inkubálás után leállítjuk, és a szint spektrofotometriásán meghatározzuk. A konjugátum mennyisége, és ennek következtében a szín a lyukakban egyenesen arányos a HIV-vel szembeni antitest koncentrációjával a mintában. Az eredményeket a 2., 3. és
4. táblázatban ismertetjük.
2. táblázat: HIV-l-re és HIV-2-re specifikus antitest kimutatása szérum-mintákban (A, G, D és E csoport) és plazma-mintában (B csoport) európai véradók esetén ··*· ·· ··· · · • · · · · *· ·
| Csoport | Vizsgált minta száma | Nem reagáló | Kezdetben reagáló | Ismételten reagáló |
| A | 2064 | 2055 | 9 | 3 |
| B | 1842 | 1836 | 6 | 1 |
| C | 1897 | 1893 | 4 | 2 |
| JJ | 1757 | 1756 | 1 | 0 |
| E | 1557 | 1553 | 4 | 1 |
| összesen | 9117 | 9093 | 14 (0,26%) 7 (0,08%) |
3. táblázat: AIDS-es, AIDS-szel kapcsolatos betegségben szenvedő, erősen veszélyezte tett csoportba tartozó és egyéb betegségben szenvedő egyebekből vett szérum reaktivitása, európai klinikai minták esetén
| Klinikai | Minták | HIV-1 és HIV-2 | Ismételten HIV-1 antí· |
| csoport | száma | antitestre pozitív | testre pozitív3- |
| AIDS | 117 | 117 | 117 |
| ARC | 107 | 107 | 107 |
| erősen | 304 | 219 | 219 |
| veszélyez- | |||
| te tett° | |||
| vegyes0 | 15 | 13 | 13 |
| AIDS-sel | 140 | 1 | 1 |
| nem kapcso | - | ||
| latos be te | g- | ||
| ségek | |||
| a: Western | biot | és/vagy legalább két | másik immunológiai vizs- |
gálattal megerősítve ··
b; meghatározott veszélyezte te tt csoportba tartozó betegek c; AIDS-szel kapcsolatos betegségekben szenvedő betegek (például állandósult és általános nyirokcsomómegbetegedés) d: akut virális fertőzésben, autoimmun betegségben és daganatos betegségben szenvedő betegek
4. táblázat: A Wellcozyme HIV-1 és HIV-2 antitest reaktivitását
386 nyugat-afrikai mintában vizsgáltuk. Az összes HIV-l-re és HIV-2-re detektált mintát pozitívnak találtuk HIV-2 antitest immunológiai vizsgálatban. Nyugat-afrikai betegek szérumának reaktivitása
Minták Anti test-pozitív Antitest-pozi tiv száma HIV-l-re és HIV-2-re HIV-2-re végzett vizsgálva immunológiai vizsgálatban
386 261a 259b a; két minta ellentmondó eredményt adott; az egyik anti-HIV-1 és anti-HIV-2 alternatív kimutatására szolgáló vizsgálatokbán negatív volt, csak p24-et lehetett kimutatni HIV-1 Western Biot módszerrel, és nem kaptunk HIV-2 Western Biot eredményeket^ a másik minta anti-HIV vizsgálatban negatív volt, egyértelműen az anti-HIV-2 vizsgálatban, és határozatlan az együttes HIV-1 és HIV-2 Western Biot vizsgálatban b: az összes minta pozitív volt anti-HIV-2 jmmunvizsgálatban; a mintákat HIV-2 Western Biot vizsgálatnak alávetve 26 egyértelműen pozitív volt, mig 3 nem adott határozott eredményt.
Claims (18)
1. Eljárás legfeljebb 30 aminosavmaradékból álló, valamely HÍV típusra specifikus antitesthez kötődni képes peptidek előállítására, amelyek egy (I) általános.képletü szekvenciát tartalmaznak, ahol
X>| és Xg jelentése azonosan vagy eltérően egy aminosavmaradék;
a terminális karboxilcsoport adott esetben amid formában van;
és minden cisztein-maradék merkaptocsoportja blokkolt, azzal jellemezve,; hogy (a) - az egyes aminosavakat és/vagy két vagy több aminosav- ból álló aminosav-fragmentumokat a kívánt sorrendben kondenzáljuk, mimellett ha az aminosav cisztein, annak merkaptocsoport ja szabad vagy blokkolt formában van; és
- kívánt esetben a kapott peptid terminális karboxilcsoportját amidcsoporttá alakítjuk, és kívánt esetben a ciszteinmaradék(ok) szabad merkaptocsoportját blokkoljuk;
vagy (b) - egy gazdasejtet egy olyan vektorral transzformálunk, amely tartalmazza a tárgyi körben meghatározott peptidet kódoló gént, és amely képes a gazdasejtben a peptidet expreszszáln i ;
- a transzformált gazdasejtet tenyésztjük; és
- a kifejeződött peptidet kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, .amelyek terminális kaboxilcsoportja amid formában van, azzal jellemezve, hogy a megfelelő ki• * indulási vegyületeket használjuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, amelyekben minden cisztein-maradék merkaptocsoportja blokkolt, azzal jellemezve, hogy a megfelelő blokkolószereket használjuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, amelyekben a merkaptocsöpörtok acetamido-metil-, ditio-piridil- vagy Ellman-reagensből, szerves higanyvegyületből vagy maleimid-vegyületből származó csoporttal vannak blokkolva, azzal jellem ezve, hogy a megfelelő blokkolószereket használjuk.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, amelyekben a merkaptocsoportok N-etil-maleimidből származó csoporttal vannak blokkolva, azzal jellemezve:, hogy a megfelelő blokkolószert használjuk.
6. Az 1. igénypont szerinti·eljárás olyan peptidek előállítására, amelyekben az (I) általános képletü szekvenciában p jelentése G és jelentése I, L vagy M, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, amelyekben az (I) általános képletü szekvenciában Χή jelentése N és Xg jelentése S, azzal jellemez v e , hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
··· ♦ * • ·*·· ·· ·
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, amelyek N-terminálisukon és/vagy C-terminálisukon aminosav-meghosszabitást tartalmaznak, azzal jellemezve., hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, amelyek N-terminálisukon 1-14 aminosavmaradékkal vannak meghosszabitva, azzal jellemezve,, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás olyan peptidek előállítására, amelyek C-terminálisukon 1-14 aminosavmaradékkal vannak meghosszabitva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás a
KYLQDQARLNSWGCAFRQVC aminosav-szekvenoiáju peptid előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk .
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás a
KYLQDQARLNSWGCAFRQVC a'minosav-szekvenciáju peptid előállítására, amelynek terminális karboxilcsöpört ja amid formában van, és minden C-maradék merkaptocsoportja blokkolt, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
13. Eljárás HIV1-re és/vagy HIV-2-re specifikus antitestek jelenlétének kimutatására testfolyadékokban, azzal jellemezve , hogy (a) a vizsgálati mintát egy szilárd fázison immobilizált, egy, az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított pepiiddel hozzuk érintkezésbe, és (b) megfelelő eszközökkel meghatározzuk, hogy a vizsgálati minta tartalmaz-e egy fenti antitestet.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eszközként jelzett molekulát vagy részecskét használunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy jelzett molekulaként vagy részecskeként lúgos foszfatázt, protein A-t, protein-G-t, anti-speciest, vagy anti-immunglobulin-altipusokat, reumatoid faktort, vagy az
1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított peptidre, vagy a peptid antigén-szakaszát tartalmazó bármely molekulára specifikus antitestet használunk.
16. Teszt-készlet a HIV-1 és/vagy HIV-2 antitestek jelenlétének kimutatására, azzal jellemezve, hogy (a) egy., az 1 -12. igénypontok szerinti eljárások bármelyikével előállított, enzimmel jelzett peptidet, (b) az enzim egy szubsztrátját, (c) az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított peptid immobilizálására alkalmas felületet biztosító tositó eszközöket, és (d) kivánt esetben mosóőldatokat és/vagy puffereket tartalmaz.
17. A 16. igénypont iszerinti teszt-készlet, azzal jellemezve , hogy a peptid egy HIV-1 gag és/vagy env szekvencia.
18. A 17. igénypont szerinti teszt-készlet, azzal jellemezve , hogy a gag. szekvencia a 121 - 356. aminosavakat magában foglaló HIV-1 szekvencia, és az env szekvencia az 542 - 674. aminosavakat magában foglaló HIV-1 szekvencia.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888828097A GB8828097D0 (en) | 1988-12-01 | 1988-12-01 | Peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU896324D0 HU896324D0 (en) | 1990-02-28 |
| HUT55834A true HUT55834A (en) | 1991-06-28 |
Family
ID=10647810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU896324A HUT55834A (en) | 1988-12-01 | 1989-11-30 | Process for producing peptides binding to antibodies specific for human immune-deficite virus, process for diagnosting this virus and diagnostical kit for them |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0371817A3 (hu) |
| JP (1) | JPH02209891A (hu) |
| AU (1) | AU623949B2 (hu) |
| DK (1) | DK604589A (hu) |
| GB (1) | GB8828097D0 (hu) |
| HU (1) | HUT55834A (hu) |
| PT (1) | PT92465B (hu) |
| ZA (1) | ZA899167B (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990015071A1 (en) * | 1989-06-02 | 1990-12-13 | Genetic Systems Corporation | Cysteine thiol-protected peptides for use in immunoassays |
| US5439792A (en) * | 1989-06-02 | 1995-08-08 | Genetic Systems Corporation | Cysteine thiol-protected peptides for use in immunoassays |
| GB9215129D0 (en) * | 1992-07-16 | 1992-08-26 | Medical Res Council | Development relating to human immunodeficiency viruses |
| CA2140663C (en) | 1992-07-20 | 2004-01-27 | Carl T. Wild | Compounds which inhibit hiv replication |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4629783A (en) * | 1985-04-29 | 1986-12-16 | Genetic Systems Corporation | Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease |
| WO1986006414A1 (en) * | 1985-04-29 | 1986-11-06 | Genetic Systems Corporation | Synthetic antigens for the detection of aids-related disease |
| US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
| ATE108457T1 (de) * | 1987-03-25 | 1994-07-15 | Genetic Systems Corp | Synthetische antigene zur bestimmung der aids- bezogenen, von lav-2 verursachten krankheiten. |
| IL88963A (en) * | 1988-01-27 | 1996-05-14 | Iaf Biochem Int | Circular synthetic peptides and their mixtures for the detection of VIH antibodies and for the formation of vaccines |
-
1988
- 1988-12-01 GB GB888828097A patent/GB8828097D0/en active Pending
-
1989
- 1989-11-30 AU AU45767/89A patent/AU623949B2/en not_active Ceased
- 1989-11-30 EP EP19890312513 patent/EP0371817A3/en not_active Withdrawn
- 1989-11-30 DK DK604589A patent/DK604589A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-11-30 JP JP1312254A patent/JPH02209891A/ja active Pending
- 1989-11-30 HU HU896324A patent/HUT55834A/hu unknown
- 1989-11-30 ZA ZA899167A patent/ZA899167B/xx unknown
- 1989-11-30 PT PT92465A patent/PT92465B/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4576789A (en) | 1990-06-07 |
| DK604589D0 (da) | 1989-11-30 |
| EP0371817A3 (en) | 1990-09-19 |
| GB8828097D0 (en) | 1989-01-05 |
| DK604589A (da) | 1990-06-02 |
| PT92465A (pt) | 1990-06-29 |
| PT92465B (pt) | 1995-07-18 |
| AU623949B2 (en) | 1992-05-28 |
| ZA899167B (en) | 1991-07-31 |
| JPH02209891A (ja) | 1990-08-21 |
| HU896324D0 (en) | 1990-02-28 |
| EP0371817A2 (en) | 1990-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4589420B2 (ja) | Ｈｉｖ−１のｏグループ（またはサブグループ）レトロウイルス性抗原のヌクレオチド配列 | |
| KR930000189B1 (ko) | 임파선증과 후천성 면역 결핍증 바이러스의 항원을 제조하는 방법 및 이 항원에 대한 항체의 생산 방법 | |
| JP3271666B2 (ja) | Ｈｔｌｖ―ｉ、ｈｔｌｖ―ｉｉ又は関連レトロウイルスに対する抗体間の識別、新規ペプチド、抗体の検出及び免疫アッセイキット | |
| VanCott et al. | Characterization of a soluble, oligomeric HIV-1 gp160 protein as a potential immunogen | |
| AU621317B2 (en) | Hiv peptides and methods for detection of hiv | |
| EP0284383B1 (en) | Synthetic antigens for the detection of aids-related disease caused by LAV-2 | |
| HUT55834A (en) | Process for producing peptides binding to antibodies specific for human immune-deficite virus, process for diagnosting this virus and diagnostical kit for them | |
| AU753780B2 (en) | Synthetic antigen for the detection of antibodies immunoreactive with HIV virus | |
| AU627738B2 (en) | Htlv-i / hiv-1 fusion proteins | |
| HUT55835A (en) | Process for producing peptides binding to hiv-2 virus-specific antibodies, for diagnosting hiv-2 and in a given case hiv-1, and diagnostical kit for them | |
| JPH04505621A (ja) | Ｔリンパ球向性レトロウイルス単クローン抗体 | |
| JP2002511853A (ja) | Ｈｉｖ抗体の検出方法及びそれに使用する抗原 | |
| EP0293792A2 (en) | Human immunodeficiency virus GAG-encoded proteins | |
| CA2290217C (en) | Peptides for the detection of hiv-1 group o | |
| AU780017B2 (en) | Nucleotide sequences of HIV-1 type (or subtype) O retrovirus antigens | |
| JPH02111790A (ja) | Ｈｉｖ抗体と免疫化学的に反応する合成ペプチド | |
| WO1990000204A1 (en) | Novel protein and coding sequence for detection and differentiation of siv and hiv-2 group of viruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC9 | Refusal of application |