JPH03160368A - 成人型ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、戒人型Ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法、
特に合成ペプチドを用いた成人型Ｔ細胞性白血病関連抗
体の測定方法に関する。

〔従来の技術〕

成人型Ｔ細胞性白血病ウィルス■型（ＨＴＬＶ一１）は
成人型Ｔ細胞性白血病、すなわちＴ細胞の悪性化による
疾病と密接に関連したレトロウィルスであり、このウィ
ルスは母親から乳児に、夫から妻に、また輸血によって
感染することが知られている。そして、輸血による感染
を防止するために、供血者の抗ＨＴＬＶ−１抗体スクリ
ーニングを行なってＨＴＬＶ−１キャリアー患者の確認
作業が実施されている。従来、ＨＴＬＶ−１に対する抗
体スクリーニングは、粒子免疫測定法（ＰＡ法）、酵素
免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）あるいは間接免疫蛍光測定
法（ＩＦ法）で行われていた。

また、近年、抗ＨＴＬＶ−１抗体と反応するＨＴＬｖ−
１のｇａｇ（コア）蛋白質の特定の領域に相応するペプ
チドを合威し、この合成ペブチドを用いたＨＴＬＶ−１
に対する抗体スクリーニングが報告されている（Ｔｈｅ
　Ｊｏｕｒｎ！ｌ　ＯＦＩｍｍｕｎｏＬｏｌＹ，Ｍｏ１
、Ｈ６．Ｎｏ，　　７，Ａｐｔｉ１　　１．Ｉ９１１６
ＰＰ．２３９３〜２３９７　Ｔ［ＩＯＭＡＳ　Ｊ．　Ｐ
ＡＬＫＥＲ　ｅｔｔ１、　）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、従来行われていたＰＡ法、ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ法においては、細胞膜面の蛋白質がウィルス粒子と絡
み合っているため抗原陽性率の変動が避けられず、しば
しば偽陽性になるという問題があり、またＩＦ法におい
ては、ウィルスを産生ずる細胞系を維持することが難し
いという問題があった。

また、上述のパーカーらの合戒ペプチドを用いたＨＴＬ
Ｖ−１に対する抗体スクリーニングでは、ＩＦ法により
陰性と判定された血清を１００％陰性と判定するために
は、２種類の合成ペプチド、すなわちｇａｇ蛋白質のＣ
末端から１０２番目乃至１１５番目までのアミノ酸配列
に相当する合成ペプチドと、ｇａｇ蛋白質のＣ末端から
１２０番目乃至１３０番目までのアミノ酸配列に相当す
る合成ペプチドとについて、それぞれ別個にＨＴＬＶ−
１に対する抗体スクリーニングを行なう必要があり、操
作が繁雑であるという問題があった。

本発明は、このような事情に鑑み創案されたものであり
、面倒な細胞培養を必要とせず、抗ＨＴＬＶ−１抗体の
検出精度が高くｔかつ操作が簡便な成人型Ｔ細胞性白血
病関連抗体の測定方法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、成人型Ｔ細胞性白血病ウィルスの構成蛋白質
の成分ペプチドを合成し、該合成ペプチドの少なくとも
１種を不溶性担体に固定化した不溶化抗原を用いるよう
に構威した。

本発明で用いる合成ペブチドは、成人型Ｔ細胞性白血病
ウィルスの構成蛋白質の成分ペブチドであり、成人型Ｔ
細胞性白血病ウィルス■型（ＨＴＬＶ−１）のｇａｇ　
（コア）蛋白質のＣ末端から１００番目乃至１３０番目
までのアミノ酸配列に相当する合成ペプチド、ｇａｇ蛋
白質のＣ末端から１００番目乃至１１９番目までのアミ
ノ酸配列に相当する合成ペプチドおよびＨＴＬＶ−１の
ｅｎｖ　（エンベロープ）蛋白質のＣ末端から１７５番
目乃至１９９番目までのアミノ酸配列に相当する合成ペ
プチドである。

このような合成ペブチドは、ＨＴＬＶ−１のｇａｇ遺伝
子およびｅｎｖ遺伝子の核酸配列を基に予測したアミノ
酸配列に従って合成される。ペプチド合成は、公知の固
相法、縮合法、この画法を組み合わせた方法、液相法等
により行うことができ、例えば段階的固相法（　Ｍｃｒ
ｒｉｆｔｅｌｔ　Ｒ．　Ｂ（　１９６３）　Ｊ．ＡｌＩ
Ｉ，　Ｃｈｅｗ．Ｓａｃ．　８５．　２１４９　〜２１
５４）により、固相としてｔ−ブトキシカルボニルアミ
ノアシル−４−（オキシメチル）一パム樹脂を用いて行
ってもよい。この場合、合成ペプチドの前記樹脂からの
解離は、例えばフッ化水素水を用いて凍結乾燥操作によ
って行うことができる。このようにして得られた合成ペ
プチドは、低分子量の副生成物を取り除いて精製した後
、高速液体クロマトグラフィーにより純度検定が行われ
、単一ピークが認められた合成ペプチドが本発明に用い
られる。

合戊ペプチドを固定化するための不溶性担体としては、
物理的吸着法または化学的結合法、もしくは両法同時に
用いられるボリスチレン、ボリカーボネート、ガラス、
ボリプロビレン等の多孔性担体、あるいは赤血球、ラテ
ックス、ゼラチン、寒天等の微細粒子等を用いることが
できる。そして、不溶性担体への合威ペプチドの固定化
、すなわち不溶化抗原の調製は、物理的吸着法において
は接触、化学的結合法では架橋剤を用いて結合すること
により行うことができる。合戒ペプチドの固定化後、不
溶性担体の残存する吸着部位はヤギ血清等によってブロ
ッキングされる。

本発明は、上述の不溶化抗原と成人型Ｔ細胞性白血病関
連抗体との抗原抗体反応により生成された抗原一抗体反
応物を公知の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）あるいは
間接免疫蛍光測定法（ＩＦ法）により標識化し、この標
識活性を測定することによって実施される。また、凝集
反応像、沈降線、濁度等を観察することによっても実施
される。

本発明で対象とする成人型Ｔ細胞性白血病関連抗体は、
ＨＴＬＶ−１に対する抗体である。また、測定試料血清
は、被検者から常法に従って採血した血液から分離され
た血清、あるいは、この血清をリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ
　Ｓ）等の緩衝溶液で希釈したものを用いることができ
る。測定試料血清は、またトウイーン系界面活性剤、動
物血清、動物蛋白質、ゼラチン、デキストラン等が添加
されていてもよい。

不溶化抗原と抗ＨＴＬＶ−１抗体との抗原抗体反応は、
通常４〜４０℃で５分〜４８時間の条件で行われる。

生成された抗原一抗体反応物の標識化は、抗ｆ｛　Ｔ　
Ｌ　Ｖ　−　１抗体と特異的に結合しうる物質と酵素標
識物質または蛍光標識物質とが結合した結合体を抗原一
抗体反応物と混合して反応させることにより行われる。

抗ＨＴＬＶ−１抗体と特異的に結合しうる物質としては
、抗ヒト免疫グロブリンＧ（抗ヒトＩｇＧ）ヤギ抗体、
抗ヒトＩｇＧウサギ抗体、抗ヒトＩｇＧヒツジ抗体、抗
ヒトＩｇＧマウス抗体、抗ヒトＩｇＧウマ抗体、抗ヒト
ＩｇＧモルモット抗体、抗ヒトＩｇＧブタ抗体等の抗ヒ
トＩｇＧ抗体、あるいは上記各動物の抗ヒト免疫グロブ
リンＭ（抗ヒトＩｇＭ）抗体等を用いることができる。

酵素標識物質としては、ベルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、キモトリプシノ
ーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラ
ーゼ、テキサスレッド等を用いることができる。また、
蛍光標識物質としては、フルオレセイン・イソチオシア
ネート、テトラメチルローダミン・イソチオシアネート
、置換ローダミン・イソチオシアネート、ローダミンＢ
・イソチオシアネート、ジクロロトリアジンフルオレセ
イン等を用いることができる。

抗ＨＴＬＶ−４抗体と特異的に結合しうる上記の物質と
上記の酵素標識物質または蛍光標識物質との結合体は、
公知の方法によって作成することができ、また市販のこ
のような各種結合体を用いてもよい。

このような結合体と抗原一抗体反応物との反応は、通常
４〜４０℃で５分〜４８時間の条件で行われる。この反
応終了後は充分に洗浄することが好ましい。また、上述
した凝集反応像、沈降線、濁度等を観察する場合は、反
応終了後すみやかに観察することが好ましい。そして、
標識化された抗原一抗体反応物の標識活性（酵素活性ま
たは蛍光活性）の測定等は公知の方法に従って行うこと
ができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を示して本発明を更に詳細に説明
する。

実施例１（ペプチド合成） ＨＴＬＶ−１のｇａｇ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の核酸
配列を基に想定した２７種類（ｇａｇ蛋白質２３種類、
ｅｎｖ蛋白質４種類）のアミノ酸配列（第１表参照）の
ペプチドを合威した。

第　　１　　表 ペプチドの合成は、上述したＭｅ口ｉ１ｉｅｌｄの段階
的固相法に従って、固相としてｔ−プトキシカルボニル
アミノアシル−４−（オキシメチル）一パム樹脂を用い
て行った。原料アミノ酸にはアミノ酸保護剤（蛋白工学
研究所製）を添加した。この結果、αアミノ基は固相中
のｔ−ブトキシカルボニル基によって保護され、側鎖は
各アミノ酸において下記の保護基によって保護された。

（アミノ酸）　　　　　　（保護基） リシン（ＬＹＳ） システイン（Ｃ▼＄） 二Ｎ−２−クロロベンゾ オキシカルボニル基 ：Ｓ−４−メチル ベンジル基 ・トリプトファン（Ｔａｐ）　　　　：　Ｎ−ホルミル
基固相としてのｔ−ブトキシカルボニルアミノアシル−
４−（オキシメチル）一パム樹脂からの合成ペブチドの
解離は、液体フッ化水素を用いて凍結乾燥操作によって
行った。このようにして得られた合成ペプチドを５％酢
酸水溶液の溶解し、ファルマシア社製Ｓｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ−２５等のゲルロ過カラムを用いて低分子量の副生
成物を取り除いて精製した。その後、逆相カラム（オク
タデシルシランＣ１８）を用いた高速液体クロマトグラ
フイーにより純度検定を行って、単一ピークが認められ
た合成ペプチドを本発明に用いる合成ペプチドとした。

実施例２（ＥＬＩＳＡ法） 実施例ｌにおいて合成した２７種類の合成ペプチド５０
０ｎｇを各々０．　　１ｍｌの０．０１Ｍ炭酸水素ナト
リウム緩衝液（　ｐＨ９．　５５）に溶解したものを、
不溶性担体である９６穴ＥＩＡプレート（Ｎｕｎｃ社製
）に塗布し、４℃で一晩放置して固定化し不溶化抗原と
した。この不溶化抗原の不溶性担体の残存する吸着部位
は２０％ヤギ血清によつてブロッキング処理した。

一方、被検者から常法に従って採血した血液から分離さ
れた血清をリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で８倍希釈し
て測定試料血清とした。この測定試料血清は、トゥイー
ン２０界面活性剤を０．０５▼ｔ％、ヤギ血清を１０１
１％それぞれ含有する。なお、採血した血液から分離さ
れた血清は、ＰＡ法（富士レビオ製セロディアＡＬＴＡ
を使用）およびＩＦ法（ＭＴ−１細胞をアセトンで固定
したスライドを使用）により検査し、測定値の評価は日
本赤十字の標準判定法に従って行った。

つぎに、前記不溶化抗原と前記測定試料血清とを３７℃
で１時間反応させた後、酵素標識物質としてベルオキシ
ダーゼで標識化した抗ヒトＩｇＧヤギ抗体を添加して３
７℃で０．５時間反応させた。そして、トゥイーン２０
界面活性剤を０．０５ｖ＋％含有したリン酸緩衝溶液を
用いて洗浄を６回行った後、過酸化水素を０．１ｖｔ％
、Ｏ−フェニレンジアミンを０．０４ｖ＋％含有した０
．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐｌｌ５．５）を１
５０μｌ添加して３７℃で０．５時間反応させ、更に２
．５Ｍ過酸化水素を５０μｌ添加して３７℃で５分反応
させた後、反応を停止した。

ツキに、Ｏ−フエニレンジアミンを基質として４９２ｎ
ｍの吸光度を測定することによって、標識化された抗原
一抗体反応物の標識活性（ベルオキシダーゼ活性）を算
出した。４　９　２　ａｍでの吸光度測定はプレートリ
ーダー（　ＳＬＴ−Ｌｘｂｉｎｓｊｒｕｍｅロ【Ｓ（オ
ーストリア）製）を用い、陽性血清を判定するためのカ
ットオフ値は統計処理を施して算出した。すなわち、上
記ＰＡ法およびＩＦ法においてともに陰性と判定された
血清３１例の平均吸光度値に標準偏差を加えたものと、
ＰＡ法およびＩＦ法でともに陽性と判定された血清３１
例の平均吸光度値の１０％とを加算した値をカットオフ
値とした。また、確認試験として、合成ペプチド抗原に
よる抗体吸収前処理血清を用いる競合反応を利用したＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ法を行った。すなわち、測定試料血清と、
合威ペプチドまたは溶媒のみを反応させて上述のＥＬ　
Ｉ　ＳＡ法を行い、合成ベブチドを用いた場合の吸光度
が溶媒を用いた場合の吸光度に対して３０％以上減少し
た場合に陽性とした。

上述の測定結果を第２表に示した。

第２表には、ＰＡ法およびＩＦ法でともに陽性と判定さ
れた３１例の血清中の抗体と反応性を示した合威ペプチ
ド８種類が示されている。第２表から明らかなように、
ＰＡ法およびＩＦ法でともに陽性と判定された３１例の
血清中の抗体と全て反応したのはｇａｇ蛋白質のＣ末端
から１００番目乃至１３０番目までのアミノ酸配列に相
当する合威ペブチドＰ１９−ｔｏｏ　ｎであった。また
、ｇａｇ蛋白質のＣ末端から１００番目乃至１１９番目
までのアミノ酸配列に相当する合成ペプチドであってＰ
ｌ９−１０Ｏ　ｎよりアミノ酸数の少ない合成ペプチド
Ｐ１９−１［１０　Ｉでも３１例中２２例に反応性（７
１％）が認められた。さらに、ｅｎｖ蛋白質のＣ末端か
ら１７５番目乃至１９９番目までのアミノ酸配列に相当
する合成ペブチドでは３１例中２６例に反応性（８４％
）が認められた。

他方、合成ペプチドＰｌ９−ＩＨ　ＩＩとのみ反応した
９例は、合戒ペプチドＰｌ９−１００　ＩＩを用いた確
認試験で吸光度の減少が認められたが、合成ペプチドＰ
Ｉ９−１００　Ｉを用いた確認試験では吸光度の減少が
認められなかった。これに対して、合成ペプチドＰ１９
−１００　Ｉと合成ペプチド［９−１０ｆｌ　ＩＩの双
方と反応した２１例は、合成ペプチドＰｌ９−１００　
Ｉおよび合成ペプチドＰｌ９−１０［１　ｎのいずれを
用いた確認試験でも吸光度の減少が認められた。このこ
とより、合成ペプチドＰｌ９−１００　ＩＩには２つ以
上の強い抗原決定基領域が存在すると考えられる。

実施例３（合成ペプチドＰ１９−１００　Ｉｔを用いた
スクリーニング） 合成ペプチドＰ１９−１００　Ｉを輸血者のＨＴＬＶ−
■抗体検出用抗原として使用し得ることを確認するため
に、合成ペプチドＰｌ９−１００　ｎのみを用いて不溶
化抗原を作成したこと、および測定試料血清の範囲を拡
大して下記の４種の供血者からの血清を用いた他は実施
例２と同様にしてＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を実施した。

・ＰＡ陰性、ＩＦ陰性の供血者　（対照血清）・ＰＡ陽
性、ＩＦ陰性の供血者　（中位血清）・ＰＡ陰性、ＩＦ
陽性の供血者　（　ｐｒｏｓ＋＋ｎｅ血清）この血清は
ＩＩＴＬＶ−１抗体過剰のため凝集阻害を示している。

・ＰＡ陽性、ＩＦ陽性の供血者　（陽性血清）陽性血清
を判定するカットオフ値を０．５２２とした場合の４９
２ｎｍでの吸光度測定の結果を図に示した。図から明ら
かなように、陽性血清は９４例中９４（１００％）　、
ｐｔｏ！ｏａｅ血清は９例中９（１００％）において抗
ＨＴＬＶ−Ｉ抗体が検出され、かつ、その陽性例（１０
３例）中約８０％がＥＬＩＳＡ値２以上を示している。

これに対して、中位血清は９６例全てにおいてカットオ
フ値１１．５２２を下回るＥＬ　Ｉ　ＳＡ値が検出され
た。また対照血清は９６例中１例を除いてカットオフ値
０．５２２を下回るＥＬ　Ｉ　ＳＡ値が検出され、合威
ペプチドＰ１９−１００　ｎとの反応が認められた１例
についても、上述の競合反応を利用したＥＬＩＳＡ法に
よる測定の結果は陰性と判定された。

すなわち、合成ペブチドＰｌ９−ＩＮ　ｍを用いた本発
明によるＥＬ　Ｉ　ＳＡ法測定結果は、従来から抗ＨＴ
ＬＶ−　Ｉ抗体の信頼できる検出法とされているＩＦ法
による結果と完全に一致しており、従来のＰＡ法に比べ
て精度が高い。また、本発明によるＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の
測定操作は、従来のＰＡ法と同様に簡便なものであり、
ＩＦ法に比べて操作が大幅に簡便なものとなっている。

〔作用〕

ＨＴＬＶ−Ｉのｇａｇ蛋白質のＣ末端から１００番目乃
至１３０番目までのアミノ酸配列に相当する合成ペプチ
ドＰＩ９−ｆＯＧ　ｎ，　ｇ　ａ　ｇ蛋白質のＣ末端か
ら１００番目乃至１１９番目までのアミノ酸配列に相当
する合成ペプチドであってＰ．ｌ９−ＩＱＯ　ｎよりア
ミノ酸数の少ない合成ペプチドＰ１９−１００　Ｉおよ
びｅｎｖ蛋白質の１７５番目乃至１９９番目までのアミ
ノ酸配列に相当する合成ペプチドは、抗ＨＴＬＶ−１抗
体と高い反応性を示す。特に、合成ペプチド［’ｌ９−
１００　ｎには２つ以上の強い抗原決定基領域が存在す
ると考えられる。

そして、上記の合成ペプチドを固定化抗原として健全者
であるＨＴＬＶ−　Ｉキャリャーの血清中抗体の検出に
用いると、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体を効率よく検出し得る。

〔発明の効果〕

上記のように構成した本発明によれば、ＩＦ法における
ウィルスを産生ずる細胞系の維持といった繁雑な操作を
行うことなく、従来のＰＡ法、ＥＬＩＳＡ法と同様の簡
便な測定操作によって、高精度な抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体の
検出が可能であり、かつ用いる合成ペプチドの種類また
は組み合わせを選定することによって、一回の操作で抗
ＨＴＬＶ−Ｉ抗体スクリーニングを行うことができる。

【図面の簡単な説明】

図は、合成ベブチドＩ’ｌ９−ＩＮ　ｎを用いたＥＬＩ
ＳＡ法の吸光度測定結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成人型Ｔ細胞性白血病ウィルスの構成蛋白質の成分
   ペプチドを合成し、該合成ペプチドの少なくとも１種を
   不溶性担体に固定化した不溶化抗原を用いることを特徴
   とする成人型Ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法。 ２、前記合成ペプチドが、成人型Ｔ細胞性白血病ウィル
   スＩ型（ＨＴＬＶ−１）のｇａｇ（コア）蛋白質のＣ末
   端から１００番目乃至１３０番目までのアミノ酸配列に
   相当する合成ペプチド、該ｇａｇ蛋白質のｃ末端から１
   ００番目乃至１１９番目までのアミノ酸配列に相当する
   合成ペプチドおよび成人型Ｔ細胞性白血病ウィルスＩ型
   （ＨＴＬＶ−１）のｅｎｖ（エンベロープ）蛋白質のＣ
   末端から１７５番目乃至１９９番目までのアミノ酸配列
   に相当する合成ペプチドであることを特徴とする請求項
   １記載の成人型Ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法。 ３、前記合成ペプチドが、２つ以上の強い抗原決定基領
   域を有することを特徴とする請求項２記載の成人型Ｔ細
   胞性白血病関連抗体の測定方法。