JPH03107764A - 成人型ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、成人型Ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法、
特に合成ペプチドを用いた成人型Ｔ細胞性白血病関連抗
体の測定方法に関する。

〔従来の技術〕

成人型Ｔ細胞性白血病ウィルス夏型（ＨＴＬＶ−１）は
成人型Ｔ細胞性白血病、すなわちＴ細胞の悪性化による
疾病と密接に関連したレトロウィルスであり、このウィ
ルスは母親から乳児に、夫から妻に、また輸血によって
感染することが知られている。そして、輸血による感染
を防止するために、供血者の抗ＨＴＬＶ−１抗体スクリ
ーニングを行なってＨＴＬＶ−１キヤリア一患者の確認
作業が実施されている。従来、ＨＴＬ４−１に対する抗
体スクリーニングは、粒子免疫測定法（ＰＡ法）、酵素
免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）あるいは間接免疫蛍光測定
法（ＩＦ法）で行われていた。

また、近年、抗ＨＴＬＶ−１抗体と反応するＦ（ＴＬＶ
−１のｇａｇ（：＋ア）蛋白質の特定の領域に相応する
ペプチドを合成し、この合成ペプチドを用いたＨＴＬＶ
−１に対する抗体スクリーニングが報告されている（　
Ｔｈｅ　ｌｏｕ＋ｎｘｌ　ＯＦ１ｍｍｕｎｏｌｏｇ７．
　Ｖｏｌ、　！３８．　Ｎｏ、７．　Ａｐｒｉ　ｌ　１
．１９８６Ｐｔ’、　２３９３〜２３９７　ＴＨＯＭＡ
！ｉ　Ｊ、　ＰＡＬＫＥＲｃｒ　ａｌ。）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、従来行われていたＰＡ法、ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ法においては、細胞膜面の蛋白質がウィルス粒子と絡
み合っているため抗原陽性率の変動が避けられず、しば
しば偽陽性になるという問題があり、またＩＦ法におい
ては、ウィルスを産生ずる細胞系を維持することが難し
いという問題があった。

また、上述のパーカーらの合成ペプチドを用いたＨＴＬ
ｖ−１に対する抗体スクリーニングでは、ＩＦ法により
陰性と判定された血清を１００％陰性と判定するために
は、２種類の合成ペプチド、すなわちｇａｇ蛋白質のＣ
末端から１０２番目乃至１１５番目までのアミノ酸配列
に相当する合成ペプチドと、ｇａｇ蛋白質のＣ末端から
１２０番目乃至１３０番目までのアミノ酸配列に相当す
る合成ペプチドとについて、それぞれ別個にＨＴＬＶ−
１に対する抗体スクリーニングを行なう必要があり、操
作が繁雑であるという問題があうた。

本発明は、このような事情に鑑み創案されたものであり
、面倒な細胞培養を必要とせず、抗ＨＴＬ’ｉ’−１抗
体の検出精度が高く、かつ操作が簡便な成人型Ｔ細胞性
白血病関連抗体の測定方法を提供することを目的とする
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、成人型Ｔ細胞性白血病ウィルスの構成蛋白質
の成分ペプチドを合成し、該合成ペプチドの少なくとも
１種を不溶性担体に固定化した不溶化抗原を用いるよう
に構成した。

本発明で用いる合成ペプチドは、成人型Ｔ細胞性白血病
ウィルスの構成蛋白質の成分ペプチドであり、成人型Ｔ
細胞性白血病ウィルスｌ型（ｉ（Ｔ　Ｌ　Ｖ　−１）の
ｇａｇ（：Ｉア）蛋白質のＣ末端から１００番目乃至１
３０番目までのアミノ酸配列に相当する合成ペプチド、
ｇａｇ蛋白質のＣ末端から１００番目乃至１１９番目ま
でのアミノ酸配列に相当する合成ペプチドおよびＨＴＬ
Ｖ−１のｅｎｖ（エンベロープ）蛋白質のＣ末端から１
７５番目乃至１９９番目までのアミノ酸配列に相当する
合成ペプチドである。

このような合成ペプチドは、ＨＴＬＶ−１のｇａｇ遺伝
子およびｅｎｖ遺伝子の核酸配列を基に予測したアミノ
酸配列に従って合成される。ペプチド合成は、公知の固
相法、縮合法、この画法を組み合わせた方法、液相法等
により行うことができ、例えば段階的固相法（Ｍｅｒ＋
１ｌｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ（１９６３）　１．　Ａｍ、　
Ｃｈｅ＠、　Ｓｏｃ、　８５．２１４９〜２１５４）に
より、固相としてｔ−ブトキシカルボニルアミノアシル
−４−（オキシメチル）−バム樹脂を用いて行ってもよ
い。この場合、合成ペプチドの前記樹脂からの解離は、
例えばフッ化水素水を用いて凍結乾燥操作によって行う
ことができる。このようにして得られた合成ペプチドは
、低分子量の副生成物を取り除いて精製した後、高速液
体クロマトグラフィーにより純度検定が行われ、単一ピ
ークが認められた合成ペプチドが本発明に用いられる。

合成ペプチドを固定化するための不溶性担体としては、
物理的吸着法または化学的結合法、もしくは画法同時に
用いられるポリスチレン、ポリカーボネート、ガラス、
ポリプロピレン等の多孔性担体、あるいは赤血球、ラテ
ックス、ゼラチン、寒天等の微細粒子等を用いることが
できる。そして、不溶性担体への合成ペプチドの固定化
、すなわち不溶化抗原の調製は、物理的吸着法において
は接触、化学的結合法では架橋剤を用いて結合すること
により行うことができる。合成ペプチドの固定化後、不
溶性担体の残存する吸着部位はヤギ血清等によってブロ
ッキングされる。

本発明は、上述の不溶化抗原と成人型Ｔ細胞性白血病関
連抗体との抗原抗体反応により生成された抗原−抗体反
応物を公知の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）あるいは
間接免疫蛍光測定法（ＩＦ法）により標識化し、この標
識活性を測定することによって実施される。また、凝集
反応像、沈降線、濁度等を観察することによっても実施
される。

本発明で対象とする成人型Ｔ細胞性白血病関連抗体は、
ＨＴＬＶ−１に対する抗体である。また、測定試料血清
は、被検者から常法に従って採血した血液から分離され
た血清、あるいは、この血清をリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ
　Ｓ）等の緩衝溶液で希釈したものを用いることができ
る。測定試料血清は、またトウイーン系界面活性剤、動
物血清、動物蛋白質、ゼラチン、デキストラン等が添加
されていてもよい。

不溶化抗原と抗ＨＴＬＶ−１抗体との抗原抗体反応は、
通常４〜４０℃で５分〜４８時間の条件で行われる。

生成された抗原−抗体反応物の標識化は、抗ＨＴＬＶ−
１抗体と特異的に結合しうる物質と酵素標識物質または
蛍光標識物質とが結合した結合体を抗原、−抗体反応物
と混合して反応させることにより行われる。

抗ＨＴＬＶ−１抗体と特異的に結合しつる物質としては
、抗ヒト免疫グロブリンＧ（抗ヒトＩｇＧ）ヤギ抗体、
抗ヒトＩｇＧウマ抗体、抗ヒトＩｇＧヒツジ抗体、抗ヒ
トＩｇＧマウス抗体、抗ヒトＩｇＧウマ抗体、抗ヒトＩ
ｇＧモルモット抗体、抗ヒトＩｇＧブタ抗体等の抗ヒ）
ＩｇＧ抗体、あるいは上記各動物の抗ヒト免疫グロブリ
ンＭ（抗ヒトＩｇＭ）抗体等を用いることができる。

酵素標識物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、キモトリプシノ
ーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラ
ーゼ、テキサスレッド等を用いることができる。また、
蛍光標識物質としては、フルオレセイン番イソチオシア
ネート、テトラメチルローダミン−イソチオシアネート
、置換ローダミン・イソチオシアネート、ローダミンＢ
・イソチオシアネート、ジクロロトリアジンフルオレセ
イン等を用いることができる。

抗ＨＴＬＶ−１抗体と特異的に結合しうる上記の物質ど
上記の酵素標識物質または蛍光標識物質との結合体は、
公知の方法によって作成することができ、また市販のこ
のような各種結合体を用いてもよい。

このような結合体と抗原−抗体反応物との反応は、通常
４〜４０℃で５分〜４８時間の条件で行われる。この反
応終了後は充分に洗浄することが好ましい。また、上述
した凝集反応像、沈降線、濁度等を観察する場合は、反
応終了後すみやかに観察することが好ましい。そして、
標識化された抗原−抗体反応物の標識活性（酵素活性ま
たは蛍光活性）の測定等は公知の方法に従って行うこと
ができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を示して本発明を更に詳細に説明
する。

実施例１（ペプチド合成） ＨＴＬＶ−１のｇａｇ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の核酸
配列を基に想定した２７種類（ｇａｇ蛋白質２３種類、
ｅｎｖ蛋白質４種類）のアミノ酸配列（第１表参照）の
ペプチドを合成した。

第　　１　　表 ペプチドの合成は、上述したＭｅｒｒＮｉｅｌｄの段階
的固相法に従って、固相としてｔ−ブトキシカルボニル
アミノアシル−４−（オキシメチル）−パム樹脂を用い
て行った。原料アミノ酸にはアミノ酸保護剤（蛋白工学
研究新製）を添加した。この結果、αアミノ基は固相中
のｔ−ブトキシカルボニル基によって保護され、側鎖は
各アミノ酸において下記の保護基によって保護された。

（アミノ酸）　　　　　　（保護基） リ シン（ＬＹＳ） システィン（Ｃｙｓ） ；Ｎ−２−クロロベンゾ オキシカルボニル基 ：５−４−メチル ベンジル基 ・トリプトファン（Ｔｒｐ）　　　　：Ｎ−ホルミル基
固相としてのｔ−ブトキシカルボニルアミノアシル−４
−（オキシメチル）−パム樹脂からの合成ペプチドの解
離は、液体フッ化水素を用いて凍結乾燥操作によって行
った。このようにして得られた合成ペプチドを５％酢酸
水溶液の溶解し、ファルマシア社製Ｓｅｐｈｇｄｅｘ　
Ｇ−２５等のゲル口過カラムを用いて低分子量の副生成
物を取り除いて精製した。その後、逆相カラム（オクタ
デシルシランＣｌ８）を用いた高速液体クロマトグラフ
ィーにより純度検定を行って、単一ピークが認められた
合成ペプチドを本発明に用いる合成ペプチドとした。

実施例２（ＥＬＩＳＡ法） 実施例１において合成した２７種類の合成ペプチド５０
０ｍｇを各々０．　１ｍｌの０．０１Ｍ炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液（ｐ［Ｉ９．５５）に溶解したものを、不溶
性担体である９６穴ＥＩＡプレート（Ｍａｎｅ社製）に
塗布し、４℃で一晩放置して固定化し不溶化抗原とした
。この不溶化抗原の不溶性担体の残存する吸着部位は２
０％ヤギ血清によってブロッキング処理した。

一方、被検者から常法に従って採血した血液から分離さ
れた血清をリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で８倍希釈し
て測定試料血清とした。この測定試料血清は、トウビー
ン２０界面活性剤を０．０５ｖｔ％、ヤギ血清を１０ｖ
ｔ％それぞれ含有する。なお、採血した血液から分離さ
れた血清は、ＰＡ法（富士レビオ製セロディアＡＬＴＡ
を使用）およびＩＦ法（ＭＴ−１細胞をアセトンで固定
したスライドを使用）により検査し、測定値の評価は日
本光十字の標準判定法に従って行ワた。

つぎに、前記不溶化抗原と前記測定試料血清とを３７℃
で１時間反応させた後、酵素標識物質としてペルオキシ
ダーゼで標識化した抗ヒトＩｇＧヤギ抗体を添加して３
７℃で０．５時間反応させた。そして、トウビーン２０
界面活性剤を０．０５ｖｔ％含有したリン酸緩衝溶液を
用いて洗浄を６回行った後、過酸化水素を０．１ｖ１％
、０−フェニレンジアミンを０．０４ｖｔ％含有した０
、１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉｓ。５）を１
５０μ！添加して３７℃で０．５時間反応させ、更に２
．５Ｍ過酸化水素を５０μ！添加して３７℃で５分反応
させた後、反応を停止した。

つぎに、０−フェニレンジアミンを基質として４９２　
ａｍの吸光度を測定することによって、標識化された抗
原−抗体反応物の標識活性（ペルオキシダーゼ活性）を
算出した。４９２　ａｍでの吸光度測定はプレートリー
ダー（５ＬＴ−Ｌ＊ｂｉｎｓｔｒｏＩＩＩ＠ｎｔｓ（オ
ーストリア）製）を用い、陽性血清を判定するためのカ
ットオフ値は統計処理を施して算出した。すなわち、上
記ＰＡ法およびＩＦ法においてともに陰性と判定された
血清３１例の平均吸光度値に標準偏差を加えたものと、
ＰＡ法およびＩＦ法でともに陽性と判定された血清３１
例の平均吸光度値の１０％とを加算した値をカットオフ
値とした。また、確認試験として、合成ペプチド抗原に
よる抗体吸収前処理血清を用いる競合反応を利用したＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ法を行った。すなわち、測定試料血清と、
合成ペプチドまたは溶媒、のみを反応させて上述のＥＬ
　ｔ　ＳＡ法を行い、合成ペプチドを用いた場合の吸光
度が溶媒を用いた場合の吸光度に対して３０％以上減少
した場合に陽性とした。

上述の測定結果を策２表に示した。

第２表には、ＰＡ法およびＩＦ法でともに陽性と判定さ
れた３１例の血清中の抗体と反応性を示した合成ペプチ
ド８種類が示されている。第２表から明らかなように、
ＰＡ法およびＩＦ法でともに陽性と判定された３１例の
血清中の抗体と全て反応したのはｇａｇ蛋白質のＣ末端
から１００番目乃至１３０番目までのアミノ酸配列に相
当する合成ペプチドＰ１９−１０［Ｉ　ＩＩであった。

また、ｇａｇ蛋白質のＣ末端から１００番目乃至１１９
番目までのアミノ酸配列に相当する合成ペプチドであっ
てＰｌ、、９−ＩＱＯｎよりアミノ酸数の少ない合成ペ
プチドＰ１．９−ＩＧｆｌ　Ｉでも３１例中２２例に反
応性（７１％）が認められた。さらに、ｅｎｖ蛋白質の
Ｃ末端から１７５番目乃至１９９番目までのアミノ酸配
列に相当する合成ペプチドでは３１例中２６例に反応性
（８４％）が認められた。

他方、合成ペプチドＰ１９−１００　ｎとのみ反応した
９例は、合成ペプチドｆ’１９−１（ＩＱ　ＩＩを用い
た確認試験で吸光度の減少が認められたが、合成ペプチ
ドＰＩ９−１００　Ｉを用いた確認試験では吸光度の減
少が認められなかった。これに対して、合成ペプチドＰ
１９−１００　Ｉと合成ペプチドＰ１９−１００　ＩＩ
の双方と反応した２１例は、合成ペプチドＰＩ９−１０
０　Ｉおよび合成ペプチドＰＩ９−１．００　Ｉｆのい
ずれを用いた確認試験でも吸光度の減少が認められた。

このことより、合成ペプチドＰ１．９−１００　ｎには
２つ以上の強い抗原決定基領域が存在すると考えられる
。

実施例３（合成ペプチドＰ１９−１００　ｎを用いたス
クリーニング） 合成ペプチドＰＩ９−１００　Ｉを輸血者のＨＴＬＶ−
１抗体検出用抗原として使用し得ることを確認するため
に、合成ペプチドＰ１９−１．Ｈｎのみを用いて不溶化
抗原を作成したこと、および測定試料血清の範囲を拡大
して下記の４種の供血者からの血清を用いた他は実施例
２と同様にしてＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を実施した。

・ＰＡ陰性、ＩＦ陰性の供血者　（対照血清）・ＰＡ陽
性、ＩＦ陰性の供血者　（中位血清）−ＰＡ陰性、ＩＦ
陽性の供血者　（ｐ＋ｏｓｏｎｅ血清）この血清はＨＴ
ＬＶ−１抗体過剰のため凝集阻害を示している。

・ＰＡ陽性、ＩＦ陽性の供血者　（陽性血清）陽性血清
を判定するカットオフ値を０．５２２とした場合の４９
２＋＋ｍでの吸光度測定の結果を図に示した。図から明
らかなように、陽性血清は９４例中９４（１００％）　
、ｐｒｏ！ｏｎｓ血清は９例中９（１００％）において
抗ＨＴＬＶ−１抗体が検出され、かつ、その陽性例（１
０３例）巾約８０％がＥＬＩＳＡ値２以上を示している
。

これに対して、中位血清は９６例全てにおいてカットオ
フ値０．５２２を下回るＥＬ、ＩＳＡ値が検出された。

また対照血清は９６６例中１を除いてカットオフ値０．
５２２を下回るＥＬ　Ｉ　ＳＡ値が検出され、合成ペプ
チドＩ’１９−１θＯＩＩとの反応が認められた１例に
ついても、上述の競合反応を利用したＥＬＩＳＡ法によ
る測定の結果は陰性と判定された。

すなわち、合成ペプチドＰ１．９−１００　ｎを用いた
本発明によるＥＬ　Ｅ　ＳＡ法測定結果は、従来から抗
ＨＴＬＶ−１抗体の信頼できる検出法とされているＩＦ
法による結果と完全に一致しており、従来のＰＡ法に比
べて精度が高い。また、本発明によるＥＬＩＳＡ法の測
定操作は、従来のＰＡ法と同様に簡便なものであり、Ｉ
Ｆ法に比べて操作が大幅に簡便なものとなっている。

〔作用〕 ＨＴＬＶ−１のｇａｇ蛋白質のＣ末端から１００番目乃
至１３０番目までのアミノ酸配列に相当する合成ペプチ
ドＰ１９−１０Ｏｎ、ｇ　ａ　ｇ蛋白質のＣ末端から１
００番目乃至１１９番目までのアミノ酸配列に相当する
合成ペプチドであってＰｌ９−１００■よりアミノ酸数
の少ない合成ペプチドＰ１９−１００　Ｉおよびｅｎｖ
蛋白質の１７５番目乃至１９９番目までのアミノ酸配列
に相当する合成ペプチドは、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体と高い
反応性を示す。特に、合成ペプチドＰ１９−１００　Ｉ
Ｉには２つ以上の強い抗原決定基領域が存在すると考え
られる。

そして、上記の合成ペプチドを固定化抗原として健全者
であるＨ、ＴＬＶ−１キヤリヤーの血清中抗体の検出に
用いると、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体を効率よく検出し得る。

〔発明の効果〕

上記のように構成した本発明によれば、ＩＦ法における
ウィルスを産生ずる細胞系の維持といった繁雑な操作を
行うことなく、従来のＰＡ法、ＥＬＩＳＡ法と同様の簡
便な測定操作によって、高精度な抗ＨＴＬＶ−１抗体の
検出が可能であり、かつ用いる合成ペプチドの種類また
は組み合わせを選定することによって、−回の操作で抗
ＨＴＬＶ−Ｉ抗体スクリーニングを行うことができる。

【図面の簡単な説明】

図は、合成ペプチドＰ１９−１００　ＩＩを用いたＥＬ
ＩＳＡ法の吸光度測定結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成人型Ｔ細胞性白血病ウィルスの構成蛋白質の成分
   ペプチドを合成し、該合成ペプチドの少なくとも１種を
   不溶性担体に固定化した不溶化抗原を用いることを特徴
   とする成人型Ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法。 ２、前記合成ペプチドが、成人型Ｔ細胞性白血病ウィル
   スＩ型（ＨＴＬＶ−１）のｇａｇ（コア）蛋白質のＣ末
   端から１００番目乃至１３０番目までのアミノ酸配列に
   相当する合成ペプチド、該ｇａｇ蛋白質のＣ末端から１
   ００番目乃至１１９番目までのアミノ酸配列に相当する
   合成ペプチドおよび成人型Ｔ細胞性白血病ウィルスＩ型
   （ＨＴＬＶ−１）のｅｎｖ（エンベロープ）蛋白質のＣ
   末端から１７５番目乃至１９９番目までのアミノ酸配列
   に相当する合成ペプチドであることを特徴とする請求項
   １記載の成人型Ｔ細胞性白血病関連抗体の測定方法。 ３、前記合成ペプチドが、２つ以上の強い抗原決定基領
   域を有することを特徴とする請求項２記載の成人型Ｔ細
   胞性白血病関連抗体の測定方法。