PT92278B

PT92278B - Processo para a preparacao de proteinas de ligacao de factor de crescimento semelhante a insulina

Info

Publication number: PT92278B
Application number: PT92278A
Authority: PT
Inventors: Christopher Binkert; Guenther F Heinrich; Jurg Schwander
Original assignee: Sandoz Sa
Priority date: 1988-11-11
Filing date: 1989-11-10
Publication date: 1995-09-12
Also published as: FI895346A0; PT92278A; HUT53936A; ZA898610B; AU623447B2; GB8826451D0; MY104673A; DK564989D0; IL92257A0; JPH0341096A; AU4453689A; DE68918556D1; EP0369943A1; HU895607D0; EP0369943B1; PL162290B1; ATE112311T1; DK564989A; NZ231333A; HU895836D0

Description

A invenção refere-se ao processo para a preparação por via recombinante proteínas veiculares que ligam factor de cres! cimento semelhante a insulina, também conhecidas como somato! medinas, contendo uma sequência de aminoácidos como a indica_; t íí da nas reivindicações e à sua utilização na preparação de váj rias composições farmacêuticas para aplicações terapêuticas.

A presente invenção refere-se a proteínas veiculares que ligam os factores de crescimento (lGF's) semelhantes à insulina, também conhecidos por somatomedinas, a um processo para a produção das citadas proteínas e à sua utilização em diversas aplicações terapêuticas.

-Os IGF’s são hormonas de polipéptidos de baixo peso molecular 'com homologia estrutural com a proinsulina. Conhecem-se dois diferentes IGFs, nomeadamente o IGF-I e o IGF-II, que são mitogénicos in vitro para uma vasta variedade de células em cul|turas de tecidos. Ambos os IGFs estimulam in vivo o crescimento de diversos tecidos e, em especial, eles promovem a síntese do colageno. 0 IGF-I é intermediário do efeito de promoção do crescimento da hormona do crescimento em condrogénese e formação dos ossos e é, portanto, essencial para o cresI :cimento normal de um indivíduo. Isto é comprovado pelo facto ;; de que os pigmeus e os poodels-anões têm deficiência de IGF-I, [jmas têm um nível normal de crescimento de hormonas no seu sohro. Acredita-se que o IGF-II desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do feto e no crescimento dos nervos.

íj i: Além do seu efeito primário nos tecidos do esqueleto, eles í também assumem as funções de estímulo do crescimento noutros tecidos. Sabd-se que os fibroblastos das feridas produzem IGFs, que são eficazes no estímulo dos fibroblastos para o ;crescimento e a síntese do colageno, uma proteína estrutural ι que é normalmente exigida para a cura das feridas. A vascula' rização do tecido da ferida é também induzida. Além disso, !! constatou-se que os IGFs têm uma actividade semelhante à da ií eritropoetina, pelo facto de que eles induzem a hematopoese.

s ¹ Estudos recentes têm também demonstrado que os IGFs produzijí dos por determinadas câulas de cancro, por exemplo células ! cancerosas do peito e dos rins auto-estimulam a proliferação das células cancerosas e os tecidos vasculares e fibrosos i necessários para sustentarem o crescimento dos tecidos can! cerosos.

Além disto, os dois IGFs mostram um espectro de actividades í metabólicas semelhantes às da insulina, pelo facto de estimuI!

í; larem em especial o transporte e o metabolismo da glucose. Os efeitos biológicos dos IGFs e da insulina são alcançados por intermédio da sua ligação a receptores específicos. Em especial, ambos os IGFs têm a capacidade para se ligarem ao receptor da insulina com uma afinidade que é cem vezes menor, aproximadamente, que a da insulina.

i

Ambos os IGFs têm uma concentração no sangue que é cerca de !100 vezes mais elevada que a da insulina. Devido a que ambos !os IGFs têm uma actividade semelhante à da insulina, isso deveria, portanto, levar a uma lipoglicemia. Isto é impedido por um mecanismo regulador que implica as protéinas veiculares presentes no sangue e capazes de formarem complexos com os IGFs. Assim, os IGFs circulam no sangue sob a forma de um complexo que não tem nenhuma actividade semelhante à da insulina. Através da sua associação com proteínas veiculares (d¹ ora avante referidas como proteínas que ligam os IGFs ou IGF-BPs), fica inibida a ligação aos receptores na superfície das suas células. Também se demonstrou que uma outra função das proteínas que ligam os IGFs é a de aumentarem a breve semi- vida dos IGFs, que estão sujeitos a uma rápida degradação proteolítica quando presentes sob a forma livre no sangue.

De acordo com o texto precedente, os IGFs podem ser Steis in vivo para estimularem: a) o crescimento de animais e seres humanos que possuam deficiência da hormona do crescimento;

b) regeneração dos tecidos, como a eritropoese e a condrogénese; c) a cura de feridas, e d) as funções de diversos orgãos, por exemplo fígado ou rins. Como resultado da sua actividade estimuladora da condrogénese, os IGFs são especial mente apropriados para a formação dos ossos, por exemplo no tratamento da osteoporose. 0 IGFs para aplicação nos tratamentos acima citados são vantajosamente administrados a um indivíduo em associação com pelo menos uma proteína de ligação dos IGFs. A administração desta combinação, mais do que o IGF sozinho, tem efeitos benéficos, incluindo o da preven4

ção da hipoglicemia e possíveis efeitos mitogénicos em locais de injecção e o prolongamento da semi-vida do IGF. Além disso descobriu-se que as proteínas de ligação são também úteis na potencialização do efeito do IGF-I semelhante ao da eritropesetina.

.Quando são administradas sozinhas, isto é, sem qualquer IGF, as proteínas de ligação podem também ser terapeuticamente |úteis para o bloqueio dos efeitos nocivos dos IGFs, tais como ^!aqueles que surgem quando os IGFs são produzidos em excesso, por exemplo os IGFs livres segregados por certas células cancerosas, por exemplosas células cancerosas produtoras de hori monas, tais como as células de cancro no peito ou nos rins. A : terapia da ligação com os IGFs pode também impedir a cegueira j como efeito secundário da retinopatia por proliferação diabética. Na realidade, tem sido demonstrado que os IGFs podem ‘ ser nm dos factores que estimulam a proliferação endotelial e fibroblástica na retinopatia diabética.

Um outro uso terapêutico é o controlo do crescimento excessiI vo nos indivíduos com deficiência da proteína de ligação aos IGFs visto que é muito provável que os elevados níveis de IGFs, combinados com níveis de proteína de ligação anormal! mente baixos sejam os responsáveis por um crescimento excessi ! vo.

í. Nestes últimos anos, pelo menos duas estirpes principais de [! proteínas de ligação aos IGFs, com tamanho diferente, foram !ί detectadas no soro de animais roedores e em serem humanos.

l‘ ji A grande proteína de ligação é a glicoproteína com cerca de 'i , ~ ! 150 kd e composta por varias subunidades. A sua formaçao, em J contraste com a da pequena proteína de ligação, está depen! dente da hormona do crescimento.

I !i

A pequena proteína de ligação tem um peso molecular de cerca de 30 a 40 kd no ser humano e no rato. A pequena proteína de ‘ligação do ser humano tem já sido purificada a partir de diversas fontes, inclusive do líquido amniótico (Povoa, G. et al., Eur. J. Biochem. (1984) 144, 199 (portanto também referida como proteína de ligação do líquido amniótico), da placenta (Koistenen, R. et al, Endocrinology (1986), 118:1375) ie do meio condicionado das células G2 do hepatoma (Powell, D. R. et al., Y. Chromatogr. (1987) 420:163)♦ As proteínas de ;ligação têm sido caracterizadas pelos seus teores de aminoácidos e suas sequências de aminoácido com N-terminais, e tem se verificado que são idênticos ou pelo menos muito semelhantes. A comparação das sequências de aminoácidos da proteína de ligação do IGP isolada das células G2 do hepatoma (lee, Y. !,1. et al, Mol. Endocrinol. (1988) 2 (5): 404) e a proteína jlde ligação ao IGF clonada a partir de um conjunto de cABN na i! placenta (Brinkman A. et al, The EMBO Journal (1988), 7 (8): 2417) revela 99 % de homologia. Além disso, estas duas sequên cias de aminoácidos, com a proteína de ligação codificada por uma sequência de cADN, clonada de um útero humano com um conjunto de cABN, mostraram uma homologia de 94 % (Brewer, Μ. T. jet al, Bioch. Biophys. Res. Com. (1988) 152 (3): 1289).

I l| Além das duas formas principais de proteínas de ligação aos

ÍIGFs existentes na linfa, várias outras proteínas de ligação i

jaos IGFs têm sido identificados em diferentes extractos de itecidos humanos e meios de culturas de células por melo das '1 técnicas de formação de manchas e rotulação, por afinidade, i; com /1 ^? 7 IGF. Os seus pesos moleculares variam no intervaΪ ~ \lo entre 15 e 150 kd e algumas destas proteínas podem ser pro jduzidas por degradação proteolítica das maiores proteínas de 'ligação dos IGFs. Em especial uma proteína de ligação dos

IGFs, com 53 kd, que foi purificada a partir de soro humano, representa uma subunidade da proteína de ligação dos IGFs com 150 kd (Baxter, R.C., Biochem. Biophys. Res. Com. (1986), 139 (3): 1256).

ί**’*

Λ,

- Uma outra forma de proteína de ligação IGF foi também encontrada no meio condicionado retirado de células BRL-3A do rato, ie tem um peso molecular de 33-36 kd, aproximadamente. Uma sequência parcial de proteína amino-terminal da proteína de ligação BRL-3A do rato já foi determinada (Mottola C. et al.,

J. of Biol. Chem. (1986) 261: 11180; lyons, R.M. , Smitt G. L., ÍMol. Cell. Endocrinol. (1986) 45: 263) e está ilustrada na 'figura 1, juntamente com a sequência de aminoácido de N-ter- I .minai da pequena proteína huma de ligação (Povoa G. et al and íLee X. 1. et al.). 0 grau de 33 % de homologia revelado pelas (sequências terminais do rato e do ser humano não é bastante (elevado para permitir que as respectivas proteínas de ligação ísejam consideradas equivalentes.

j A proteína de ligação humana equivalente à das células BR]>3A [do rato foi agora descoberta e a sua sequência de aminoácido completamente estabelecida. A comparação com a sequência de outras pequenas proteínas de ligação humanas indica claramente que esta nova proteína de ligação humana representa uma íforma distinta.

ι jConsequentemente, a presente invenção proporciona uma nova proteína de ligação dos IGFs que compreende a sequência de aminoácido 289 ilustrada na figura 2, que começa com o ácido 'glutãmico na posição 1 (resíduo M-terminal) e termina com glu( tamina na posição 289 (resíduo C-terminal) também chamado '[madura IGF-BP. Provavelmente esta proteína consiste nesta (sequência de aminoácidos289. A proteína pode também incluir (a sequência de aminoácido 327 ou 328, que começa com leucina jna posição - 38 ou com metionina na posição - 39 θ termina (com glutamina na posição 289, sequência essa que corresponde à forma de precursor da proteína madura de aminoácido 289, visto que contém a sequência do sinal juntamente com a sequên[ cia completa da proteína madura. Dentro do âmbito da invenção está também incluída qualquer forma alélica do precursor ou

-Ida proteína madura, cuja sequência de aminoácido parte da ί

ilustrada na figura 2 por anulação, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, na medida em que pelo menos se mantenha uma das propriedades funcionais. Por exemplo, tais variações podem aumentar ou diminuir a afinidade de ligação dos ; IGFs da proteína. As anulações são caracterizadas pela eliminação dos resíduos do aminoácido sem a inserção de um resíduo de substituição. Os mutantes de substituição são aqueles em que um resíduo de aminoácido foi substituído por outro, jí enquanto que os mutantes de inserção são aqueles em que um ou -mais resíduos são colocados dentro ou junto de cada extremiI dade da sequência de aminoácido da proteína original. Tipicai,mente, as fusões são uma espécie de mutante de inserção, no 'j qual a inserção ocorre no resíduo terminal de carboxilo ou de li h amino.

I ~ , iDado que uma comparaçao entre os peptidos pode ser convenien! temente estabelecida com base no grau de homologia das suas sequências de aminoácido, considera-se que o âmbito da inven!ção engloba qualquer proteína que seja substancialmente homó!Ioga, por exemplo que tenha cerca de 85 preferivelmente ;i entre 95 % e 100 % de homologia com o pré-IGF-BP ou o IGF-BP, *|de preferência com o IGF-BP, conforme se mostra na figura 2,

I ou qualquer fragmento da dita proteína que tenha mais de 20 p

ί resíduos.

ί

I:

^: I

I A capacidade de ligação a um factor de crescimento semelhante J à insulina é uma das actividades biológicas das proteínas da invenção. Estas proteínas podem ser convenientemente experijl mentadas num processo de ligação que use o IGF-I (Rinderkne cht, E. and Humbel, R.E., J. Biol. Chem. (1978) 253: 27ó9) e o IGF-II /Rinderknecht, E. and Humbel, R.E., FEBS (1978) 89:

2837, de preferência o IGF-II, numa forma rotulada por exemplo iodada. Um processo desse tipo pode, por exemplo, incluir vantajosamente a realização de uma electroforese com gel (SDS8

ί

-PAGE) das proteínas da invenção, seguindo-se a formação de

-I ou -II, a lavagem da mancha para retirar o IGP-I ou -II livre e a detecção da radioactividade na mancha.

Ainda que os IGF-BPs da invenção signifiquem originalmente

IGF-BPs humanos, os IGF-BPs da invenção, provenientes de fontes como mamíferos, por exemplo, ratos, porcos, cavalos ou Ibois, estão incluídos na definição dos IGF-BPs, na medida em ;que apresentam o necessário grau de homologia.

:í Os IGF-BPs da invenção incluem aqueles purificados a partir ij de um extracto de tecido ou de um meio de cultura condiciona^;do, assim como os obtidos por meios recombinantes.

; i '(

Os derivados dos IGF-BPs estão incluídos no âmbito desta injjvenção. Os derivados incluem as formas glicosiladas, os coníj jugados por agregação com outras moléculas de IGF-BP e os conjugados covalentes com partes químicas não relacionadas.

Os derivados covalentes são preparados por ligação das capaj cidades funcionais a grupos que se encontram na cadeia de ! , , ι aminoácido do IGF-BP ou no resíduo N-terminal ou C-terminal,

I ? por meios já conhecidos na técnica.

•ί A invenção proporciona ainda sequências de ácido nucleíco í recombinantes que codificam os IGF-BPs da invenção, por exemplo a proteína que compreende a sequência de aminoácido 289 jj ilustrada na figura 2, que começa com ácido glutâmico na poji sição 1 e termina com glutamina na posição 289. A sequência de ácido nucleico pode codificar a proteína do precursor ilus j trada na figura 2, que se inicia com leucina na posição - 38 ou com metionina na posição-39 e termina com glutamina na j posição 289. Dentro do âmbito da invenção está também incluí' da qualquer sequência de ácido nucleico que codifique as formas alélicas do precursor ou da proteína madura IGF-BP, coni forme se mostra na figura 2. Pelo termo sequência de ácido

nucleico recombinante entende-se qualquer sequência de ácido ΐnucleico produzida pela junção de pedaços de sequências de ácido nucleico provenientes de diversas fontes. Por ampliação, este termo inclui também uma sequência isolada da sua origem natural. Estas sequências de ácido nucleico recombinantes podem ser mRNA ou rADN, incluindo o cADN e o genómico rADN. De preferência elas são o cADN. Com a máxima preferência, a sequência cADN é a da figura 2, começando na posição 120, 123 ou 237 e terminando na posição 1103.

i pComo guia geral, qualquer sequência de ácido nucleico que se phibridize com a sequência de ADN com o código do pré-IGF-BP íi ou o IGP-BP maduro, da figura 2, sob condição de hibridização jadstringente, por exemplo a 65°C em substância-tampão de ci^!j í trato-aalino 4 x durante um período máximo de 16 horas, é considerada como enquadrada no âmbito da invenção.

A estratégia geral, com a qual se obtiveram as sequência codificadas com o IGE-BP, é a seguinte:

t A conhecida sequência N-terminal da célula BRL-3A do rato com IGF-BP, como se mostra na figura 1, foi usada para 'projectar duas amostras do oligonucleótidos de base 92, chaίmadas BPS1 e BPS2, que estão ilustradas na figura 4. Após a titulação comiádio, estas amostras foram usadas para abrigarem um conjunto de cADN de rato. 34 clonos independentes, hibridizáveis com reticulação, vindos de 10^ clonos foram de! tectados e analisados por meio de enzima de restricção e análise de mancha. Este 34 clonos foram classificados em 12 diρ ferentes grupos de clonos, de acordo com o tamanho do frag1' mento de cADN. Os fragmentos de cADN representativos de cada grupo foram clonados no vector M13mp8 (Vpeira, J. and Messing J. - Gene (1982) 19: 259) θ amplificados em sequência. 0 rei sultado foi que se determinou a completa sequência de nucleótido do IGF-BP da célula BRL-3A do rato, num dos grupos ilus s

-|trados na figura 1. Ela possui uma estrutura de leitura aberta que codifica 299 aminoácidos. Se o terminal NHg da proteína de ligação madura corresponder à sequência determinada por jLyons R. M. e Smitt, G. L., então a proteína de ligação e o ίpéptido de sinal são compostos por 270 e 29 aminoácidos, respectivamente. A proteína não tem nenhumas regiões de JÇ-glicosilação e contém 19 resíduos de cisteína, a maior parte deles reunidos próximo do seu térmico de NI^.

Três conjuntos de cADN humano foram cobertos com a sequência ! de cADN do rato como amostra 1, de um conjunto de fígado adulií to (disponível no comércio em Clontech, com o número de catálogo HL 10013), um conjunto de fígado de um feto (Clontech

HL 1005) e um conjunto de cADN derivado da linha de células j HEPG2 (Clontech HL 1015). Embora os fago-clonos independen' 5 tes 5 x 10 do fígado adulto fossem cobertos, não se poude í _z 5 :detectar nenhum clono hibridizável. De um conjunto 2,5 x 10 c

clonos (conjunto de fígado de feto humano) e 1,5 x 10 clonos (conjunto HEPG2), 14- e 3 clonos hibridizáveis em cruz foram ίrespectivamente isolados e analisados. Constatou-se que os insertos de cADN dos clonos 3 HDPG2 eram idênticos e tinham cerca de 800 bp de comprimento. Esta sequência de nucleótido

I foi também codificada num clono de cADN com 1,4 de extenI^I '^! z ' são, isolado do conjunto de cADN do fígado de um feto, a qual j sequência foi depois determinada, como se mostra na figura 2. í‘ Este cADN tem uma estrutura de leitura aberta codificando jí 289 aminoácidos, que se inicia com o codão translacional ATG.

h A comparação do aminoácido com a proteína de ligação da céíu! í ) la BRL 3A do rato revela uma homologia de 81 %.

; A proteína de ligação humana madura, codificada por esta sequência de ADN é mais comprida em 19 aminoácidos do que a equivalente do rato, se o péptido de sinal for cortado na me_s í| ma posição que na proteína de ligação BRL-3A do rato. Esta ·, proteína de ligação humana e a outra proteína de ligação hu11

imana com 30 kd (Lee, Y. L. et al. , Brinkman, A. et al., e

Brewer Μ. T. et al.) têm cerca de 37 % dos seus aminoácidos em comum. Este grau baixo de homologia revela claramente que elas são proteínas de ligação diferentes. Duas estruturas na sequência são partilhadas com as proteínas de ligação já conhecidas, ou seja, uma região rica em cisteína junto do terminal NH2 da proteína e uma sequência Aig-Gly-Asp nas posições 262-264. Esta última sequência diferencia esta proteína de ligação das outras proteínas humanas de ligação das hormonas, e pode ser importante devido à sua função, ou seja, por ''exemplo, a ligação ao seu receptor específico na superfície (da célula.

1^! ' Um outro aspecto da invenção proporciona sectores de expresí são que compreendem uma sequência de ADN que codifica o IGP:-BP da invenção, a qual é operacionalmente ligada às adequadas sequências de controlo, permitindo a expressão do citado

IGF-BP num hospedeiro apropriado eucariótico ou procariótico. Tais sequências de controlo incluem um promotor de transcriição, um operador opcional para controlar a transcrição, uma ! sequência que codifica os locais de ligação do adequado mRNA ribosomal, e sequênciss que controlam o fim da transcrição e

I translação. Os vectores incluem plasmidas-virus e fragmentos i de ADN integráveis, isto é, fragmentos que são integráveis no j genoma do hospedeiro por recombinação. Para uso na presente íi invenção, escolheu-se vantajosamente as plasmidas. Elas podem ser adequadas para expressãq nu num hospedeiro procariótico, ou num hospedeiro eucariótico, sendo este último 0 preferido.

ji Numa forma de realização preferida da invenção, um fragmento Si de cADN EcoRI-EcoRI, codificando 0 precursor de proteína de ligação, conforme se mostra na figura 2, é clonado na plasmida pXMT previamente digerida por EcoRI. A plasmida pXMT está ; ilustrada na figura 5 e derivou de p91O23 (B), (Wong, G. G.

et al., Science 228: 810) por manipulação-padrão do ADN. 0

pXMT tem a origem pBR322 do gene de réplica e resistência à ampicilina, para propagação nos E. coli e falta-lhe as sequências hacterianas que inibem a réplica do ADN nas células COS do macaco. Ele contém além disso, elementos reguladores eucarióticos oriundos de diversas fontes: (i) uma origem SV4O e um segmento promotor do SV4O, os quais conjuntamente permitem à plasmida replicar num elevado número de cópias nas células COS e transcrever, efectivamente, os genes cADN inseridos; (ii) o promotor tardio principal do adenovirus, acopla do a uma cópia de cADN do líder tripartido do adenovirus;

(iii) um intrão híbrido, constuído por uma região de fenda 5' do primeiro exão do líder tripartido e uma região de fenda 3¹ de um gene de imunoglobulina de um rato; (iv) o sinal prematuro SV4O de poliadenilação; e (v) a região do gene do adenovirus VA I. A plasmida pXMT contém também a sequência codificante da redutase do hidrofolato do rato (DHFR) a jusante da única região de cionação Eco RI, a qual está situada logo a seguir à região de fenda 3'.

De acordo com a presente invenção, obtêm-se também linhas de células que foram transformadas com uma sequência de ADN ou um vector de acordo com a invenção. A escolha de células de hospedeiro adequadas, assim como os processos de transformação e crescimento já são conhecidos na técnica. Ainda que pos sam ser utilizadas linhas de células procarióticas e eucarióticas, preferem-se estas últimas. As células eucarióticas compreendem, por exemplo, as células de fermentação ou as células derivadas de um organismo miúticelular, por exemplo células de mamíferos. Uma linha de células de mamífero especial mente adequada é a linha de células do ovário do criceto chinês (CHO). Uma outra linha de células de mamíferos adequada é a linha de células COS-1 ou CV-1 do macaco.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, obtém-se um processo para a produção do IGE-BP, o qual compreende a

recuperação do citado IGF-BP a partir de uma cultura de uma linha de células transformada com um fragmento de AON ou um vector da invenção.

Breve descrição dos desenhos.

ίΑ Figura 1 é uma comparação da sequência N-terminal da proteí-i na de ligação BRL-3A do rato, conforme determinada! por (a) Lyons, R.M. e Smith, G. 1., Mol. Cell. Endocrinol. (1986) 45: 263; ou (h) Mottola, C. et al, J. of Biol. Chem. (1986) 261: 11180; e a sequência

N-terminal da pequena proteína humana de ligação (c) sempre que está determinado por Lee, Y. L. et al, Mol. Endocrinol. (1988) 2 (5) 404; Brinkman,

A. et al., The EMBO Journal (1988) 7 (8): 2417; ou Povoa, G. et al, Eur. J. Biochem. (1984) 144: 119. Um afastamento é introduzido para maximizar a homologia da sequência entre as duas proteínas.

A Plgura 2 mostra a sequência de um fragmento de cADN EcoRI-EcoRI cionado de um conjunto de cADN de fígado de feto (Clontech, HL 1005) θ a correspondente sequên-i cia de aminoácido da forma do precursor, a qual codifica a forma de precursor da proteína de ligaij ção humana equivalente à das células BRL-3A do rato, que começa na posição - 39 e termina na posiI ção 289. A proteína madura começa na posição 1.

h A sequência do sinal está sublinhada.

I j A Figura 3 mostra a sequência de cADN completa da proteína de ligação das células BRL-3A do rato que codifica a ! forma de precursor da proteína que começa na posiS ção-29 e a forma madura que começa na posição 1.

A sequência do sinal está sublinhada.

A Figura 4 apresenta as sequências do ALN das amostras BPS-1 e BPS-2, concebidas de acordo com a sequência N-terminal da proteína de ligação BRL-3A do rato, conforme é relatado por Mottola et al, e utilizado para cobrir os conjuntos de cADN do rato.

A Figura 5 ilustra a plasmida pXMT e os seus derivados obtidos após a inserção de um fragmento de ADN na única região EcoRI.

A Figura 6 mostra uma análise de mancha obtida da seguinte maneira: 50 ^ul do meio condicionado por células CHO não transferidas (pista 4), pXMT + (pista 1) ou pXMT - (pista 2) foram aplicados na electroforese do gel de poliacrilamida sob condições de não-redução. Na pista 3, aplicaram-se 50 ^ul de soro huma no do cordão umbilical. Após a migração, as proteí nas foram depois transferidas para as membranas de nitrocelulose e expostas a [_ ^J I7-IGP-I.

A Figura 7 mostra uma análise de blocos de Western do meio condicionado pelo pXMT + transferido em células CHO. A ligação de 1 ng IGF-II foi completada com 0 ng (pista A), 5 ng (pista B), 25 ng (pista C) do IGF-II não titulado; 5 ng ou 25 ng (pistas D e E) do IGF-I frio, ou 100 ng (pista F) de insulina não titulada. A mancha foi preparada como na Figura 6.

Exemplo 1

Recuperação de uma proteína de ligação do IGF do rato, codificada no cADN

Duas amostras de oligo-nucleótico de base 92, BPS-1 e BPS-2,

que correspondem à sequência N-terminal da proteína de ligação BRL-3A, determinada por Mottola e outros, foram sintetizadas num sintetizador de oligonucleótidos com biosistema 380 A aplicados. Estas amostra estão ilustradas na Figura 4. Elas foram determinadas por meio da escolha dos codões para os cor respondentes aminoácidos que ocorrem com mais frequência nos ratos. As amostras foram depois tituladas com gama /“32 P7 ATP usando-se a quinase do polinucleótido.

Os 1C'6 fago-clones ^gtll recombinantes, provenientes de uma biblioteca de cADN do fígado de um rato adulto (Skoder Biozentrum) ou de uma biblioteca de cADN do fígado de um adulto (Clontech, RL 1001) foram escolhidos usando-se as duas amostras como se segue:

x 10^ fagos Agtll recombinantes, provenientes de cada biblioteca, foram usados para transferir 4.10 células competentes de E. coli K803 em 2 ml de 10 mM CaC^ . 10 mM MgC^· Após uma incubação de 15 minutos num banho de água a 37°C, adicionaram-se 30 ml de 1 % de agar macio num meio de caldo de Luria (LB), às células, e foram colocadas em placas de Petri de Nunclon com 23 x 23 cm, contendo 400 ml de 1,5 % de agar em meio LB. As placas foram incubadas por 12 horas a 37^QC e depois transferidas a 4²G, pelo menos durante 1 hora.

Um filtro de membrana de nitrocelulose com 21,5 x 22 cm (Schleier and Schnell BA 85) foi colocado sobre os clones de cada placa de Petri e depois transferidos para 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, durante 5 minutos, para desnaturar o ADN nos filtros, e foi lavado por duas vezes numa solução neutraziladora (0,2 M Tris, 2,5 M NaCl, 0,015 M citrato de sódio, 0,015 M de KHgPO^ e 0,001 M de EDTA (Na)₂> pH 7). Finalmente, os filtros foram secos ao ar por 1 hora antes de serem transferidos para um forno a vácuo durante 2 horas, a 80°C.

-ίOs filtros foram depois pré-embebidos a 5O²C, por 6 horas, em x SSC, 1 x Denhardt, 50 mM de Pipes e 0,1 M KPO^ como soluição-tampão, com pH 7. (20 x SSC : 0,15 M NaCl e 0,015 M de citrato de sódio; 20 x Denhardt; 0,4 % de albumina de soro bovino; 0,4 % de ficol e 0,4 % de polivinil-pirrolidona MW 360 ^: kd).

'A hibridização foi efectuada a 5O⁹C, por 36 horas, em 6 x SSC, x Denhardt, lmM Tris-HCl pH 7, 0,2 mM EDTA ph 8; 0,9 M de

KPO^, pH 7, 0,5 % de SDS complementado com 10 mg/ml de ADN i do esperma de salmão desnaturado com 0 calor, empregando-se íí 6 6

I; uma mistura de 10 cpm/ml da amostra BPS-1 e 10 cpm/ml de ;i BPS-2. Finalmente, os filtros foram lavados por 3 vezes, dui· rante 30 minutos em cada vez, com 4 x SSC, 0,5 % de SDS a 50° il C e expostos com uma pelécula X-OMAT XAR da marca Kodak.

ί ! As áreas que correspondem às manchas radioactivas no filme foram identificadas sobre as placas e destacadas. Após uma nova selecção, isolaram-se 34 clones independentes, que se > podem hibridizar em cruzamentos, das bibliotecas do cADN no [ fígado. Estes clones foram analisados por enzimas de restrici ção e mancha de Souttern, e clasificados em 12 grupos. 0 inserto de ADN, representativo de cada grupo, foi clonado para M13 mp 8 (Vieira, J. e Messing, J., Gene (1982), 19: 259) e _; formada uma sequência consoante 0 processo de Sanger. A sei quência de nucleótido com 4 clones, isolados do fígado de um recém-nascido, da sua biblioteca de cADN e também sequenciadc ί era idêntica e correspondia à sequência parcial da proteína ' de ligação BRL-3A do rato. A sequência completa do ADN da Fij^! gura 3 foi determinada pela reunião das sequências de fragmentos de cADN sobrepostos. Estes subfragmentos foram clonaj dos e sequenciados após uma ruptura ocasional do cADN origi! nal por sonicação.

Exemplo 2 iRecuperação da proteína de ligação do IGF, humana, que codifica o cADN fragmento de cADN completo da Figura 3, que codifica a proteína de ligação do rato BRL-3A foi titulada usando-se o processo primário ocasional (Boehringer Kit) e foi usada para seleccionar uma biblioteca de cADN de fígado humano adulto

J(Clontech, Hl 10013), um fígado de um feto humano (Glontech,

I

JHI 1005) e uma célula HEP G2 (Clontech Hl 1015). 0 processo

1' , íde selecção foi idêntico ao ja descrito no Exemplo 1, excepto ; em que a hihridização foi efectuada a 65°C. Embora fossem esj colhidos 5 x 10⁵ clones de’ fagos independentes oriundos de ji uma biblioteca de cADN de fígado adulto, não se poude detecj tar nenhum clone de fago hibridizável em cruz. Entre 2,5x10^

Ι 5 ; (biblioteca de fígado de feto humano) e 1,5 x 10 de clones de fago (HEP G2) foram isolados, respectivamente, 14 e 3 clones hibridizáveis em cruz. 0 comprimento do inserto de todos os clones de cADN específicos de HEP G2 era de cerca de 800 bp. A sequência de nucleótido destes três clones de cADN era idêntica e estava também codificada por um clone de cADN com a extensão de 1,3 kb, isolado da biblioteca de cADN do fígado de um feto. Este fragmento de cADN com 1,3 Kb foi sequenciado í de acordo com o processo de Sanger que emprega os primários ι de oligonucleótido e pode-se ver na Figura 2.

:Exemplo 3

Expressão da proteína humana de ligação do IGF

Um fragmento EcoRI-EcoRI, contendo a sequência de cADN que codifica a proteína de ligação do precursor, conforme se mostra na Figura 2, foi clonado para dentro do pXMT, previamente

I

Após a ligação, uma plasmida recomhinante EcoRI-EcoRI na orientação apropriada foi :digerido com EcoRI.

I [com um fragmento de identificada e ainda digerida com ScPI, para lineanizar o [vector.

yUg da preparação de plasmida assim obtida foi cotransferida com 1^ug de plasmida circular pSV2-neo (Southern, J. P. e jBerg, P. J. Mol. Applied Gen. (1982) 1 : 327) para 10^ células de CHO, previamente desenvolvidas para uma confluência de 70 % no meio alfa⁺ MEM (comercialmente disponível por Gihco, com o número de catálogo 041-02571 M) e complementadas com 10 % de soro de um feto de vitela (PCS). A transfecção foi realizada de acordo com o processo de carregamento de Fechjíheimer, M. e outros, PNAS (1987) 84: 8463. A seguir à trans·· íj fecção, as células foram introduzidas em frascos de cultura com 75 cm , num meio alfa MEM, complementado com 10 % de i FCS.

I i [

Passadas 48 horas, adicionou-se 1 mg / ml da droga G418, ao melo, Passados 18 dias, as colónias de crescimento (resistenj tes à droga) foram transferidas para dentro do meio alfa~MEM [ (Gihco, 041-02561 Η), complementado com 10 % de FCS dializa[’ do.

As colónias resistente à droga, assim como as células CHO não ( transferidas, usadas como controlo, foram depois ensaiadas !: quanto à sua expressão do IGF-BP, como se segue: Obteve-se l[ [[ uma preparação de mRNA e efectuou-se uma análise de manchea; mento de Northern usando-se a sequência de ADN que codifica a [ sequência terminal de NH_?, da proteína de ligação BRL-3A do ι rato, como amostra. Verificou-se uma hihridização. As células de CHO foram transfectadas com pXMT contendo o inserto de cADN na orientação correcta (pXMT+) e as células de embrião de rato com a idade de 20 dias transcreveram- um cADN específico de proteína de ligação, enquanto as células CHO, não transfectadas ou transfectadas com pXMT contendo o inserto de ícADN na orientação errada (pXMT-) não o fizeram.

ι

As partes sobrenadantes da cultura de células CHO (pXMT-) transfectadas e não transfectadas foram ainda concentradas _:20 vezes e depois separadas no SDS-PAGE. Depois realizou-se |uma análise do mancheamento de Western. Este mancheamento foi finalmente hibridizado com ⁷l7lGF-I, conforme se mosítra na Figura 6. Num meio condicionado com células CHO transfectadas com pXMT+ (pista 1) e em soro humano (pista 3), emer jgiu uma fita de MW 36 Kd. Não se detectou nenhum sinal nos imeios condiconados por células CHO não transfectadas (pista jj lj 4) ou por células transfectadas com pXMT- (p^sta 2). Isto com Βprova, adicionalmente, que somente as células CHO transfecta|| das com o cADN na devida orientação exprimiram a proteína de ,! ligação.

I li

Para determinar a capacidade do IBP-2, expressa pelas células CHO, para ligar o IGF-II e as suas relativas afinidades com o IGF-I, IGF-II e a insulina, realizaram-se estudos acerca da ligação competitiva. 50 ^ul de amostras do meio condicionado proveniente das células de CHO transfectadas com pXMT + foram sujeitas ao SDS-PAGE em condições não redutoras e transferidas para a nitrocelulose. 0 filtro foi cortado verticalmente |em tiras e cada tira foi tratada de modo diferente num processo de ligação competitiva (Figura 7). Cada filtro foi hibridizado para 1 ng / ⁵l7lGF-II (10 cpm/5 yUg de proteína). Depois na pista A adicionaram-se ainda nenhum IGF-II não titulado, na pista B 5 ng e na pista C 25 ng de IGF-II não titulado. Quando se usou o IGF-I como competidor, adicionaram-se à solução de hibridização 5 ng (pista D) e 25 ng (pista E). Empregaram-se 100 ng de insulina na experiência de competição F. Os resultados destas experiências de competição estão ilustrados na Figura 7. Eles mostram que o IGF-BP da invenção liga especificamente o IGF-II porque a ligação pode

ser inibida por eomento cinco vezes o excesso de IGF-II não titulado. A ligação também pode ser inibida por excesso de IGF-I não titulado, mas o IGF-I tem uma afinidade menor do que o IGF-II. Com um excesso de 100 vezes da insulina fria não foi detectada nenhuma inibição da ligação do / ^iyiGF-II. Isto comprova que o IGF-BP humano da invenção tem maior afinidade com o IGF-II do que o IGF-I e não se liga à insuli:na. Também a este respeito o IGF-BP da invenção é diferente ido IGF-BP purificado do líquido amniótico humano, que tem uma afinidade maior ou igual com o IGF-I.

í i

J Exemplo 4 pPurificação da proteína humana de ligação do IGF j Método 4A)

Um clone CHO que expressa a proteína de ligação foi introdu6 2 zido numa densidade de células de 2 a 4 x 10 células/75 cnn

I ' da proveta e desenvoidios até 90 % de confluência em meio alfai-!»IEM. As células foram separadas do meio de crescimento por ί filtração e a camada, superior flutuante foi usada para a puí rificação da proteína de ligação do IGB.

li j i i 200 ml da camada superior foram diluídos com um volume igual ; de 50 mM de solução-tampão de fosfato de sódio, com pH de 6,0 je o pH da solução final foi regulado para pH 6,0 com ácido ! fosfórico. A solução foi depois aplicada numa coluna de troca de iões com Q-sefarose FF (Farmácia) (tendo a coluna 10 x i 120 mm), previamente equilibrada com 50 mM de solução-tampão de fosfato de sódio, com pH de 6,0. A coluna foi operada num !índice baixo de 1,3 ml/minuto. A corrente através da coluna í

continha a proteína de ligação do IGF, que foi recolhida. A : detecção da actividade de ligação foi efectuada por manchea21 _;mento de Western, ou seja, as porções foram submetidas à elec jtroforese com SDS-PAGE, transferidas para camadas de nitroce. lulose e a proteína de ligação foi desenvolvida pela sua propriedade de interactuar com o IGF titulado radioactivamente.

I

À corrente na coluna de Q-sefarose contendo a actividade de ligação do IGF, adicionou-se ácido trifluoracético (TFA) para se obter uma concentração final de 0,1 %. Esta solução acidificada foi submetida a uma ulterior purificação por croma1, tografia de fase reversiva numa coluna Vydac C4 (4,6 x 250 ^!mm), equilibrada com 0,1 % de TFA em água. A seguir à aplicaj:ção, as proteínas foram eluídas por uma eluição de gradiente, •com um gradiente de 0,1 $ de TFA em água, para originar 0,1 % ,de TFA em acetonitrilo. Porções contendo a proteína de ligai; ção do IGF foram eluídas em cerca de 30 % do acetonitrilo, i conforme foi detectado por mancheamento de Western.

Η ii Método 4B) |( •Uma camada superior da cultura de células contendo o IGF-BP é diluída na proporção de 1 : 1 com 20 mM de acetado trissó|dico, com pH de 5,5. Após a diluição, o pH da solução é con;· trolado e, se necessário, é regulado para um pH de 5,5 com ácido clorídrico.

i¹ 'Esta solução é aplicada a uma coluna de S-sefarose (Pharmacia) equilibrada com 20 mM de acetato trissódio, com pH de 5,5. A coluna é lavada com 20 mM de acetato trissódico, pH '5,5, até que a adsorvência volte à linha de base. 0 IGF-BP é eluído por adição gradual de cloreto de sódio em 10 mM de inícremento para originar 20 mM de acetato trissódico, pH 5,5.

IGF-BP elui-se entre 0,1 e 0,3 M de cloreto de sódio, conforme foi detectado por mancheamento de Western, das porções

I •eluídas.

As porções com actividade de ligação do IGF are reunidas e concentradas num concentrador Amicon equipado com membranas YM 10. 0 concentrado é submetido a filtração em gel numa coluna de superose 12 (Pharmacia) equilibrada em 20 mM de acetado trissódico, pH de 5,5, com solução-tampão. As porções ' activas são reunidas.

As fracções reunidas que contêm o IGF-BP proveniente da filjtração em gel são submetidas a cromatografia de reversão de ιfase numa coluna Vydac 04, previamente equilibrada com 0,1 % 'j de ácido trifluoracético. 0 composto eluado com superose 12 é aplicado e a coluna é lavada até à linha de base com ácido

I trifluoracético. 0 IGF-BP é a seguir recuperado da coluna por eluição de gradiente com acetonitrilo contendo 0,1 % de ácido trifluoracético.

I !As aplicações terapêuticas das proteínas de ligação da invenIção incluem o seu uso como agente terapêutico único e o seu uso em combinação com um IGF, sendo preferido este último uso i

ιQuando é usado em combinação com um IGF, uma proteína de li!gação da invenção é adequada para uso nas indicações acima referidas, primariamente como agente promotor do crescimento, regenerador dos tecidos e saneador de feridas.

ίConsequentemente, a invenção proporciona:

i) o uso de uma proteína de ligação da invenção juntamente com um IGF, em combinação livre ou fixa, para estimular o crescimento de um indivíduo, a regeneração de um tecido ou orgão ou a cura de ferida, ou ii) um processo para estimular o crescimento de um indivíduo para regenerar um tecido ou orgão ou para curar feridas num indivíduo, o qual compreende a administração de uma

iii) quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação da invenção, juntamente com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um IGF a um paciente necessitado de um tal tratamento; ou uma composição farmacêutica para estimular o crescimento de um indivíduo, para regenerar um tecido ou orgão ou para curar feridas, a qual compreende uma proteína de ligação da invenção, juntamente com um IGF e com um agente veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitável; ou íiv) uma embalagem de conjunto duplo, contendo formas de doI ses unitárias separadas de uma proteína de ligação da í invenção e de um IGF, juntamente com instruções para se [ efectuar a mistura e a concomitante administração.

I

I i

|Em associação com um IGF, uma proteína de ligação da invenção é especialmente interessante para promover a condrogénese ou a hemotopoese. Isto pode ser comprovado com os seguintes en'saios A a C:

A) Um IGF aumenta a formação dos ossos, conforme indicado, por exemplo, por uma crescente incorporação da /3h7 prolina no colágeno e proteínas que não são do colágeno na calvaria fetal do rato. Surpreendentemente, um efeito sinérgico ocorre quando um IGF é usado na presença de uma proteína de ligação da invenção. As culturas de orgão da calvaria do rato são preparadas por dissecação dos ossos frontal e parietal retirados de ratos com 21 dias, fendendo ao longo da sutura sagital e processando de acordo com o processo de Krean e outros (Endocrinology (1985) 116, 296). Uma proteína de ligação do IGF é adicionda em doses entre 10 e 200 ng/ml das culturas. Quando são adicionadas em combinação umas com as outras,

a proporção molar é de 1 : 1. Faz-se a cultura durante 24 a 48 horas. Para quantificar a incorporação da /3h7 prolina na proteína digerível na colagenase e na proteína que não é colágeno, os produtos de osso homogeneizados são digeridos com colagenase hacteriana de acordo com o processo de Diegelman R. e Peterkofsky (Dev. Biol. (1972) 28:443) e modificado por Krean e outros. (Endocrinology (1985) 116:296).

B) Um IGF diminui a resorpção dos ossos conforme é indicado pela diminuição da libertação de /3/7 Ca do osso. Surpre endentemente, um efeito sinérgico ocorre quando um IGF é usado na presença de uma proteína de ligação da invenção. 0 ensaio é efectuado de acordo com os princípios de Raisz (J. Clin. Invest. (1965) 44, 103). Ratos prenhes são injectados s.c. com Ca no 18^e. dia de gestação.

Um IGF, sozinho ou na presença de uma proteína de ligação da invenção, é injectado numa dose de 10 ng a 200 ng por animal. A proteína de ligação é adicionado para que a proporção molar em relação ao IGF seja de 1 : 1. No 19-. dia, os animais são sacrificados, os fetos retirados. Os veios mineralizados dos rádios e dos ulnos são dissecados e colocados numa cultura. A resorpção é quantificada à base da libertação do /3/7 Ca das extracções de osso.

C) Descobriu-se também que as proteínas de ligação do IGF da invenção, assim como outras proteínas potencializam o efeito semelhante ao da eritropoetina do IGF-I. Isto pode ser especialmente demonstrado pelo ensaio de IGF-I, por exemplo 10 ng/ml de IGF-I, sozinho ou em combinação com a proteína de ligação madura da Figura 2, por exemplo uma parte de 50 ^ul de uma camada superior derivada de uma cultura de linha de células CHO que exprime a pro

teína de ligação do IGF madura da Figura 2, numa operação de CFU-E conforme está descrito em Fagg, B. Roitsch e outros, C.A, Cell. Physiol. (1986) 126: 1. Ainda que o resultado obtido com a proteína de ligação do IGF soziί nha não seja significativamente diferentedo do controlo, um efeito sinérgico da combinação é observado quando se ί

¹ compara com o IGF-I sozinho.

i

ÍAlém disso, a actividade nitrogénica de um IGF combinado com uma proteína de ligação da invenção pode ser ensaiada como se segue:

[A incorporação da /3H7 metil-timidina nas células CC139 (célu;las fibroblásticas do pulmão do criceto chinês) na cultura é medida conforme já foi descrito por Plouet e outros, Cell.

Mol. Biol. (1984) .30: 105. Nesta operação, a linha de células CC139 é colocada numa placa em 40 000 células por 0,5 ml de meio de cultura MEM (Gibco) contendo 10 % de soro de feto de vitelo, 0,1 % de penicilina, 0,4 °i° de estreptomicina e 0,5 % de fungizona. Passadas 72 horas de incubação a 37^QC numa atmos jfera carregada com 5 % de as células são lavadas com meio jMEM na ausência de soro de feto de vitela e depois cultivadas neste meio por 20 horas. Nesta fase, a cultura de células é confluente e um IGF e uma proteína de ligação, ou os dois juntos, são inoculados, cada um numa dose de 10 ng até 200 ng do meio de cultura. Quando adicionados juntos, a proporção molar deve ser de 1 : 1. A amostra de ensaio é incubada a 37°0 por 24 horas e depois junta-se-lhe 1 ^u de Cí/3h7 de metiltimidina em 10 yul de PBS. Passadas 4 horas de incubação, a incorporação de metiltimidina é concluída com a lavagem das células com PBS. As células são fixadas com 0,5 ml de ácido tricloroacético (5 %) por 30 minutos, lavadas com água e finalmente lisadas com 0,5 ml de NaOH 0,1 M por 2 horas a 37°C. Transfere-se 0,5 ml do lisado para um frasco de cintilação e mistura-se com 3 ml de líquido de cintilação para se medir a

ibeta-radioactividade. A proteína de ligação potencializa a actividade mitogénica do IGF, embora o nível de radioactividade que é medido quando a proteína de ligação é usada sozinha não seja substancialmente diferente do da amostra do controlo .

Mais especificamente, uma proteína de ligação da invenção, em combinação com um IGF, é útil: a) para o tratamento do hipo|pituitarismo, raquitismo do tipo laron, osteoporose, anemia, em especial complicações subsequente a uma deficiência renal crónica e deficiências de fígado ou de rins, e b) para promover a cura de feridas, tais como úlceras e queimaduras, ou as ique ocorrem em acidentes ou resultam de cirurgias, ί

jpara uso em assoicação com uma proteína de ligação da invenção, o IGF é preferivelmente escolhido entre o IGF-I descrito por Rinderknecht, E. e Humbel, R.E, J. Biol. Chem. (1978) 253: '2769; o IGF-II, como é descrito por Rinderknecht, E. e Humbel, R.E., FEBS (1978) 89: 283; e qualquer derivado ou fragmento dos IGF-I e IGF-II que tenha uma actividade de factor [de crescimento semelhante à da insulina. Com maior preferência, escolhe-se o IGF-II.

i

I Para uso em associação com um IGF, uma proteína de ligaçao ida invenção é preferivelmente uma proteína que seja em 85 a 100 % homóloga com o pré-IGF-BP ou o IGF-BP, ilustrados na Figura 2.

Quando não são associadas aos IGFs, as proteínas de ligação da invenção têm outras aplicações terapêuticas em quaisquer perturbações fisiológicas que resultam de uma produção excessiva de IGFs livres, por exemplo os cancros produtores de IGF tais como os cancros de peito e de rins, a retinopatia proliferativa diabética ou o crescimento anormal de crianças altas com elevado nível de soro do IGF livre.

ÍConsequentemente, a invenção também proporciona:

i) o uso de uma proteína de ligação da invenção para tratar as perturbações fisiológicas que resultem de uma produção excessiva de IGF livre num mamífero, por exemplo no

I corpo humano, por exemplo cancros produtores de IGF, retinopatia diabética ou crescimento anormal de indivíduos altos; ou ii) um processo para tratar as perturbações fisiológicas reII jí sultantes de uma produção excessiva do IGF livre, por ji exemplo cancros produtores de IGF, retinopatia diabéti'[ ca ou crescimento anormal de um indivíduo, o qual compre|! ende a administração de uma quantidade terapeuticamente i eficaz de uma proteína de ligação da invenção a um indij víduo necessitado desse tipo de tratamento; ou

I iii) uma composição farmacêutica para tratar as perturbações fisiológicas resultantes de uma produção excessiva de

I

IGF livre, por exemplo cancros produtores de IGF, retinopatia diabética ou crescimento anormal de um indivíduo ' a qual inclui uma proteína de ligação da invenção em as[i sociação com um agente veicular ou diluente farmaceuticamente aceitáveis, i

Fragmentos ou formas mudadas do pré-IGF-BP ou do IGF-BP, ilustrados na Figura 2, têm valor especial para o tratamento de perturbações fisiológicas resultantes de uma produção excessiva do IGF livre no corpo humano.

'Uma proteína de ligação da invenção, sozinha ou em combinação com um IGF, pode ser administrada por qualquer via convencional adequadas aos péptidos, em especial por via entérica, por exemplo sob a forma de comprimidos ou cápsulas, ou, de preferência por via parentérica, por exemplo de maneira subcutânea

ou intravenosa, sob a forma de injecção ou infusões. Além disso, pode também ser usada topicamente, por exemplo sob a forma de unguentos ou suspensões quando é aplicado, por exemplo como agente na cura de feridas.

Para todas as indicações acima, o doseamento apropriado irá, é claro, variar dependendo, por exemplo da natureza e gravidade da perturbação a ser tratada e da forma de administrajção. Por exemplo, resultados satisfatórios podem ser obtidos no tratamento das osteoporose ou da anemia com doses diárias entre cerca de O,lyUg/kg até 40 yu/kg de peso corpóreo, prefe!rivelmente entre cerca de 0,5 ^ug/kg até cerca de 20 ^ug/kg de peso corporal, de uma proteína de ligação da invenção. Nos mamíferos maiores, por exemplo nos seres humanos, a dose diáiria indicada está compreendida no intervalo entre cerca de 5 i

ί/Ug e cerca de 500 yUg, preferivelmente entre 10 e 100 mg, con! venientemente administrada por via parentérica, por exemplo uma vez ao dia. Para a cura de feridas, uma dose diária entre 0,1 e 10yUg de uma proteína da invenção por cm de ferida é a indicada para os mamíferos maiores, por exemplo os seres humanos. Esta é convenientemente administrada uma vez por dia. Quando é usada em combinação com um IGF, a proporção molar da proteína de ligação para o IGF é, preferivelmente, de 0,1 : 1 a 5 : 1, com maior preferência entre 0,5 : 1 e 2 : 1, com a ί máxima preferência 1:1.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser produzidas de forma convencional.

Claims

5_e_i_Y_i_n_d_i_ç_a_q_o_e_s

1§. - Processo para a preparação de uma proteína de ligação de factor de crescimento semelhante a insulina· (IGF), por métodos recombinantes, caracterizado pelo facto de compreender a realização da cultura de uma linha de células procarióticas ou eucarióticas transformada por um fragmento de ADN recombinante compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85 homóloga com a sequência de aminoácidos (I)

Figure 2 io 20 30 40 SO <0 30 «0 90

CAATTCCGCO CCACCCACGA CGAACAACCO OAGGAGGCCG CTCCCCCTCC CAGGGCCGTG CACCTGCCCO CCCCCCCCCT CCCTCCCTCG

100 110 134 144

CCCCCCGCGC CGCGCTGCCG ACCCCCAGC ATO CTO CCC ACA GTC CGC TGC CCC CCG CTG CCC CTO CCO CCO CCG CCG CTC

MET Lau Pro Arq Vai Gly Cya Pro Al· Lau Pro Lau Pro Pro Pro Pro Lau

ΠΟ 194 209 224 239

1 CTO CCG | Lau Pro CTG CTO CCO CTQ CTG CTO CTG CTA CTG GGC CCG AGT GGC GGC GGC GGC GGG CCG CGC GCG GAG GTG CTG Lau Lau Fro LaU Lau Lau Lau Lau Lau Gly Ala Sar Cly Gly Gly Gly Gly Ala Arg Ala Clu Vai Lau 1 254 269 264 299 314 TTC CGC TGC CCG CCC TGC ACA CCC CAG CGC CTG GCC GCC TGC GCC CCC CCG CCG GTT GCG CCO CCC CCC CCG GTG j Ptia Arq cye Pro Pro cya ThC Pro Glu Arg Lau Ala Ala Cys Cly Pro Pro Pro Vai Ala Pro Pro Ala Ala Vai j 329 344 359 374 3*9 GCC CCA GTG GCC CGA GGC GCC CGC ATG CCA TGC CCG ΟΛΟ CTC CTC CCG GAG CCG GGC TGC GGC TGC TCC TCG GTO Ala Ala V«1 Ala Gly Oly Ala Arq met Pro Cys Ala Olu Lau Vai Arg Glu Fro Gly Cys Gly cy· cy» Sar Vai 404 419 434 449 464 TGC GCC CGG CTG GAG GGC GAG CCO TGC GGC GTC TAC ACC CCO CGC TCC GGC CAG GGG CTG CCC TGC TAT CCC CAC Cya Ala Arg Lau Olu Oly Glu Ala Cya Gly Vai Tyr The Fro Arg cy. Gly Gin Gly Lau Arg cya' Tyr Fro Mia 419 494 509 524 539 CCG GGC TCC GAG CTG CCC CTG CAG CCG CTG GTC ATG GGC GAG GGC ACT TCT GAG AAG CGC CGG CAC GCC CAG TAT’ Fro Gly Sar Clu Lau Fro Lau Gin Ala Lau Vai MET Gly Clu Cly Thr cys Glu Lys Arg Arg Aap Ala Glu Tyr í l 554 569 564 599 614 GGC CCC AGC CCC GAG CAG GTT GCA CAC AAT CGC GAT CAC CAC TCA GAA GGA OGC CTG GTG CAG AAC CAC GTG CAC Gly Al· Sar Fro Clu Gin Vai Ala Aap Asn Gly Aap Aap llla Sar Glu Gly Gly Lau Vai Olu Asn llls Vai Aap ! 1 629 644 659 674 669 I AGC ACC ATG AAC ATG 1TG GGC GGG GCA GGC AGT GCT GGC CGG AAG CCC CTC AAG TCG GCT ATG AAG GAG CTG GCC Sac The ηετ Asn «ET Lau Oly Gly Oly Gly Ser Ala Gly Arg Lys Fro Lau Lys Sar Cly «ET Lys Glu Lau Ala

Figure 2 (continuação)

CTG V*1 TTC Pb· 704 CGG Arq GAG Clu AAG Lys GTC V*1 ACT Thr 719 GAG Clu CAG Gin CAC llls CGG Arg CAG Gin 734 ATG MET GCC Gly AAG Lys CGT Gly GGC Cly 749 ΛΑΟ lys CAT llls CAC llls err Leu GGC Gly 764 CTG GAG Lau Glu GAG Glu 779 794 009 «24 «39 ccc AAG AAG CTG CGA CCA CCC ccr GCC AGG ACT CCC TGC CAA CAG GAA cro GAC CAC GTC CTG GAG CGG ATC TCC Pro Lys Lys Leu Arg Pro Pro Pro Al* Arg Thr Pro cys Gin Gin Glu Leu Asp Gin V*1 Leu Glu Arq 11« Ser 1 i «94 «09 004 99 914 *CC ATG CCC CTT CCG CAT GAG CCG GGC ccr CTG GAG CAC crc TAC TCC CTG CAC ATC CCC AAC TGT GAC AAG CAT Thr MET Arq Leu Pro Asp Glu Arq Gly Pro Leu Glu ilis lau Tyr Ser Leu Ilis 11· Pro Asn cys Asp Lys Ilis 929 944 959 974 9«9 GGC CTG TAC AAC crc ΑΛΛ CAG TGC AAG ATG TCT CTG AAC GGG CAG CGT GGG GAG TGC TGG TGT GTG AAC CCC AAC ί Cly Leu Tyr Asn Leu Lys Gin cy. Lys MET Ser Leu Asn Gly Gin Arg Gly Glu cys Trp cys V«1 Asn Pro Asn 1004 1019 1034 1049 1064 GGG AAG CTG ATC CAG CGA GCC CCC ACC ATC CGG GGG GAC CCC GAG TGT CAT crc TTC TAC ΑΛΤ GAG CAG CAG ι The ! Cly Lys Leu 11· Gin Cly Ala Pro Thr 11« Arg Gly Asp Pro Glu cys Ilis Leu Pho Tyr Asn Glu Gin Gin ! 1079 1094 1116 1126 1126 1146 1 j GAG GCT TGC GGG GTG CAC ACC CAG CGG ATG CAG TAG ACCGCAGCCA CCCGGTGCCT GGCGCCCCTG CCCCCCGCCC CTCTCCAJ Glu Al* cy. Gly V*1 Hi» Thr Gin Arg MET Gin

1166 1176 1166 1196 1206 1216 1226 1236 1246 | ACCGGCAGAA 1 AACGGAGAGT GCTTGGGTGG TGGGTCCTGG AGGATTTTCC AcrrcrGACA CACGTATrTA TATTTGGAAA ÇAGACCAGCA ί 1256 1266 1276 1206 1296 1306 1316 1326 \^1336 | CCGAGCTCGG ! CACCTCCCCG GCCTCTCTCr TCCCAGCTGC ACATGCCACA ccTGCTCcrr. crrociTrcc' CCGGGGGAGG AAGGGGGTTG 1346 1356 1366 1376 1306 1396 • 1406 1416 1426 TGGTCGGGOA GCTGGGCTAC AGGTTTGGGG AGGGGGAAGA ΟΛΛΛΤΤΤΤΓΛ TTrrTGAACc CCTGTGTCCC THTGCATAA GATTAAAGGA

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AGCAAAAGTA Λ comecanço na posição 1 e acabando na posição 289 ou qualquer fragmento com mais de 20 aminoácidos ou começando na posição 39, 38 ou 1 ou terminando na posição 289 θ se recuperar a proteína que liga AGF e a recuperação da proteína que liga o IGF, a partir da referida cultura.

2-. - Processo para a preparação de proteínas de ligação de ! factor de crescimento semelhante a insulina (IGF), caracteri— zado pelo facto de se obter uma proteína com uma sequência de aminoácido que é, pelo menos, 85 % homóloga com sequência de «mi nnár.i rins (I) referida na reivindicação 1, que se inicia na posição 1 e termina na posição 289 ou qualquer seu fragmento com mais de 20 resíduos de aminoácidos.
3&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína de ligação de IGP que com· preende a sequência do aminoácido (I) mencionada na reivindicação 1, que tem início na posição -39, -38 ou 1 e termina na posição 289.
4-ã. - Processo para a preparação de fragmentos de ADN recombinante, caracterizado pelo facto de se obter um fragmento que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de ligação, do IGF de acordo com as reivindicações 2 ou 3.
5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se obter um-fragmento cADN.

óã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se obter um fragmento de cADN que compreende a sequência de ADN (I) referida na reivindicação 1, com início nas posições 120, 123 ou 237 e o fim na posição 1103.
7§. - Processo para a preparação de um fragmento de ADN, caracterizado pelo facto de o referido fragmento de ADN se hibridizar sob condições de hibridização rigorosa com a sequência de ADN codificada com a sequência de aminoácidos (I) indicada na reivindicação 1, com início nas posições -39, -38 ou I e conclusão na posição 289.
8^. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido fragmento se hibridizar sob condições de hibridização rigorosa, com a sequência de cADN (I) ^mencionada na reivindicação 1, que se inicia nas posições 120, '123 ou 237 e termina na posição 1103.
9-. - Processo para a obtenção de um vector que compreende um ii fragmento de ADN de acordo com qualquer das reivindicações 4 ía 8, caracterizado pelo facto de o referido vector ser eficaz

I;

jpara a expressão da proteína que liga IGF, codificada pelo ímencionado fragmento de ADN, num hospedeiro procariótico ou i eucariótico.

ii ¹ í
10^. - Processo para a obtenção de uma linha de células procarióticas ou eucarióticas, caracterizado pelo facto de a referida linha de células ser transformada, ou pelo fragmento de ADN de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 8, ou pe|lo vector de acordo com a reivindicação 9.
11§. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, para estimular o crescimento de um indivíduo, a regeneração de um tecido ou de um orgão ou a cura de um ferimento, caracterizado pelo facto de se misturar uma proteína de ligação de IGF de acordo com as reivindicações 1 a 3 conjuntamenI te com IGF e com uma substância veicular ou um diluente far' i maceuticamente aceitáveis.

i
12^â. - Processo para a preparação de composições farmacêuti33 cas para o tratamento de perturbações fisiológicas resultantes de uma produção excessiva de IGF livre, caracterizado pelo facto de se misturar uma proteína de ligação IGF de acordo com as reivindicações 1 a 3, com um agente veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitáveis.