PT91201B

PT91201B - Novos metodos para produzir anticorpos monoclonais aperfeicoados reactivos com a caquectina

Info

Publication number: PT91201B
Application number: PT91201A
Authority: PT
Inventors: George Kuo
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1988-07-18
Filing date: 1989-07-18
Publication date: 1996-12-31
Also published as: FI101937B; DE68928857T2; JPH03501330A; FI101937B1; JP2638652B2; DK69890D0; EP0351789B1; EP0351789A2; DE68928857D1; ES2124209T3; NO901247L; DK69890A; ATE173766T1; NZ229922A; FI901344A0; AU626572B2; NO901247D0; IL90990A; NO179615C; AU3970389A

Description

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TITULAR: CHIRON CORPORATION

EPÍGRAFE: NOVOS MÉTODOS PARA PRODUZIR ANTICORPOS MONOCLO-NAIS APERFEIÇOADOS REACTIVOS COM Λ CAQUECTINA

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo da Invenção O presente estudo refere-se à aplicação de téc nicas imunológicas para a produção de novos materiais Citeis no diagnóstico e tratamento, inter alia, de infec-ções bacterianas e mais particularmente para a produção e aplicação de anticorpos monoclonais aperfeiçoados,capazes de reagir especificamente com a caquectina humana.

Antecedentes da Invenção A introdução de estímulos invasivos tais como infecções parasíticas, bacterianas ou virais, ou células neoplãsicas, induz alterações metabólicas significativas no hospedeiro susceptível. Se são graves, as alterações podem eventualmente destruir os mecanismos homeostáticos normais, quer localmente, quer sistemicamente, conduzindo à deplecção das energias do hospedeiro, progredindo para o declínio (caquexia), destruição tecidular, deficiências 1 múltiplas nos sistemas orgânicos, choque e morte.

Até hã pouco tempo, os clínicos supunham que os padrões sistemáticos deviam-se primeiramente â acção dos prõprios agentes invasivos. Contudo, sabe-se hoje que os estímulos invasivos provocam no hospedeiro a produção de várias citoquinas, cujas acções combinadas causam a maioria das respostas biológicas indesejáveis. Estes mediadores inflamatórios derivados do hospedeiro oferecem novas oportunidades para desenvolver regimes de tratamento contra uma larga variedade de estados inflamatórios das doenças.

Uma das mais potentes citoquinas é a caquecti-na que é libertada principalmente por macrófagos, após esti^ mulação apropriada. A caquectina que é também conhecida por Factor de Necrose Tumoral (TNF), é uma proteína contendo 157 aminoácidos, normalmente encontrada _in_ vivo como um dímero ou outro multímero. 0 peso molecular calcula_ do do monomero humano do TNF é cerca de 17.000 daltons. A caquectina actua na supressão da bioslntese de várias proteínas adipócito-específicas, tal como a li-pase 1ipoproteica. Também actua na indução da bioslntese f ou libertação de numerosas outras proteínas, incluindo o antigénio da Classe I do sistema Major de Histocompatibilidade factor estimulante das colónias granulocitos-macrofagos e interleucina 1. (Ver, em gera 1 Bentlex e Cerami, New Eng. J♦ of Med., 316:379-385 (1987), aqui incorporado para referência . ) O reconhecimento da larga influência da caquec 2

tina nos vários estados das doenças levou à tentativa de controlo da sua acção. Por exemplo, experiências mostraram que os anticorpos especificamente reactivos com caquec tina podem ser terapeuticamente úteis no controlo das res postas imuno-modulatórias que se sabe hoje estarem associadas com a caquectina (ver U.S. Patent NQs. 4.603.106 e 4.684.623, ambas aqui incorporadas para referência). Em particular, os anticorpos neutralizantes capazes de ligação de alta afinidade a vários epítopos, na caquectina humana, têm um potencial significativo como mediadores dos e feitos tóxicos dos níveis excessivos da caquectina.

Assim, há a necessidade de anticorpos aperfeiçoados capazes de neutralizar o efeito tóxico da caquecti^ na in vivo. Á presente invenção preenche estes requisitos.

Sumário da Invenção

Obtiveram-se novas linhas celulares que produzem anticorpos monoclonais capazes de se ligarem aos epítopos da caquectina humana,com capacidade neutra 1izante aumentada i_n vivo. Adicionalmente, obtiveram-se métodos pa ra tratamento de seres humanos susceptíveis à bacteremia ou sepsia,ou já infectados com bactéria possuindo endoto xina,pela administração de uma dose profiláctica ou terapêutica de uma composição compreendendo, pelo menos, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, capaz de reagir com a caquectina humana e exibindo actividade neutralizante nos ensaios citolíticos das células L929 a 3

menos de cerca de 400 ng, tipicamente entre cerca de 50 a 200 ng ou mais. Esta composição deverá preferencialmente incluir ainda um veículo fisiologicamente aceitável. A composição pode também conter qualquer um ou mais dos seguintes: anticorpos monoclonais adicionais capa zes de reagir com endotoxinas ou exotoxinas bacterianas? anticorpos monoclonais capazes de reagir com determinantes serotipos em estirpes bacterianas particulares, possuindo endotoxinas; uma fracção gama globulina, do plasma sanguíneo humano; uma fracção gama globulina do plasma sanguíneo huma no onde o plasma pode ser obtido a partir de um indivíduo humano exibindo elevados níveis de imunoglobulinas reacti-vas com endotoxinas bacterianas; e um ou mais agentes anti microbianos. Além disso, conseguem-se utilizações clínicas dos anticorpos monoclonais, incluindo a produção de "kits" de diagnóstico.

Descrição das Modalidades Específicas

De acordo com a presente invenção, são obtidas novas células capazes de produzir anticorpos monoclonais neutra 1izantes de afinidades e composições que compreendem tais anticorpos, desejáveis, composições essas que são capja zes de reconhecimento selectivo dos epítopos presentes na caquectina humana. As células em estudo possuem cromossomas identificáveis nos quais a linha do DNA briginário das pró prias ou de uma célula percurssora) se rearranjou de modo a codificar um anticorpo contendo um sítio de ligação para um 4 epítopo desejado na caquectina humana. Estes anticorpos mo noclonais podem ser usados numa grande variedade de formas, incluindo diagnóstico e terapia.

Os anticorpos monoclonais assim obtidos são par ticularmente úteis, quando comparados com os anticorpos das práticas anteriores, no tratamento ou profilaxia de doenças graves, tal como bacteremia, sépsia, caquexia, ou outros e£ tados de doenças associadas a elevados níveis de caquectina. Assim, os anticorpos terão tipicamente actividade neutrali-zante a menos de 400 ng, preferencialmente menos de cerca de 300 ng, mais preferencialmente cerca de 50 a 200 ng nos ensaios citolíticos das células L929. Este nível superior da actividade permite a utilização de níveis de dosagem significativamente mais baixos nos tratamentos. A preparação de anticorpos monoclonais pode ser realizada pela imorta1ização de uma linha celular com capacidade de expressão de sequências de ácidos nucleicos, que codificam os anticorpos específicos para um epítopo apropri ado na caquectina humana. A linha celular imortalizada pode ser uma linha celular de mamíferos que foi transformada através de onco-génese por transfecção, mutação ou semelhantes. Estas células incluem linhas de mielomas, linhas de linfomas ou outras linhas celulares capazes de apoiar a expressão e secreção da imunoglobulina ou seu fragmento de ligação iri vi-tro. A imunoglobulina ou fragmento pode ser uma imunoglobulina que ocorre naturalmente num mamífero à excepção das fontes usuais de humanos ou ratos, produzida por transfor- 5 mação de um linfõcito, particularmente um esplenocito, por meio de um virus ou por fusão do linfOcito com uma célula neoplásica, e. g., um mieloma, para produção de uma linha celular híbrida. Tipicamente o esplenocito será obtido a partir de um animal imunizado contra antigénios relacionados com a caquectina ou seus fragmentos contendo um sítio epitópico. Os protocolos de imunização são bem conhecidos e podem variar consideravelmente continuando no entanto efi cazes.(ver, Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2â. Ed., Academic Press, N.Y. (1986), aqui incorpo rado para referência).

As linhas celulares híbridas podem ser clonadas e filtradas de acordo com técnicas convencionais, e podem ser detectados, no sobrenadante celular, os anticorpos que são capazes da ligação aos determinantes desejáveis da caquectina humana com afinidades apropriadas. As linhas celu lares híbridas apropriadas podem então crescer em culturas de larga escala ou serem injectadas na cavidade peritonial de um hospedeiro apropriado para a produção de anticorpos aos fluidos ascíticos.

Porque possuem os anticorpos da presente invenção, que se sabe serem específicos para a'proteína da caquectina humana, nalguns casos,os sobrenadantes das experiências subsequentes podem ser filtrados num ensaio de com petição com os anticorpos monoclonais em estudo, como um meio de identificar amostras adicionais dos anticorpos mono clonais anti-caquectina humana desejáveis (assim chamados "anticorpos bloqueadores"). Deste modo as linhas celulares 6

Τ' híbridas podem ser rapidamente produzidas a partir de uma variedade de fontes baseadas na disponibilidade dos presen tes anticorpos específicos para os determinantes caquéti-cos particulares a níveis de afinidade apropriados.

Alternativamente, quando existem linhas célula res híbridas, que produzem anticorpos específicos para os sítios epitõpicos em estudo, estas linhas celulares l\í bridas podem fundir-se com outras células B-neoplásicas, quando as tais outras células B puderem servir como rece£ tores para o código genómico do DNA para os anticorpos. Estes anticorpos podem ser funcionais à superfície da célula e não, por exemplo, como receptores. Enquanto que as células B-neoplásicas dos roedores, mais particularmente dos murídeos, são as mais vulgarmente utilizadas, outras espécies de mamíferos podem ser empregadas, tal como as es pécies lagomorfa, bovina, ovina, equina, porcina, aves ou semelhantes.

Os anticorpos monoclonais podem ser de qualquer uma das classes ou subclasses das imunoglobulinas,tais como IgM, IgD, IgA, IgE ou subclasses conhecidas da IgG para cada espécie de animal. Geralmente, os anticorpos monoclonais podem ser usados intactos, ou como fragmentos de liga ção, tais como Fv, Fab, F(ab')2, mas usualmente intactos.

As linhas celulares da presente invenção podem ter outro uso para além da produção directa dos anticorpos monoclonais. As linhas celulares podem sofrer fusão com outras células (tal como mieloma humano adequadamente marcado com fármacos, mielomas de ratos ou células linfoblas- 7

toides humanas) para produção de hibridomas ou triomas e assim garantir a transferência de genes que codificam os anticorpos monoclonais. Alternativamente, as linhas celulares podem ser usadas como fonte de cromossomas que codi_ ficam as imunoglobulinas, que podem ser isoladas e transferidas para as células através de outras técnicas que não a fusão. Em adição, os genes que codificam os anticorpos monoclonais podem ser isolados e utilizados em conformida de com as técnicas de recombinação do DNA para a produção de imunoglobulinas específicas numa variedade de hospedei^ ros. Particularmente, por preparação do património de cDNA a partir do RNA mensageiro, um clone de cDNA simples, que codifica a imunoglobulina e que é livre de introns, pode ser isolado e colocado em vectores de expressão euca riõtica ou procariótica adequados e^subsequentemente, transformados num hospedeiro para posterior produção em massa. (Ver, Generalidades, U. S. NQs. 4.172.124 ? 4.350.683; 4.363.799; 4.381.292; e 4.423.147. Ver também, Kennett et al., Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980) e referências aí citadas, todas aqui incorporadas para re ferência) .

Mais especificamente, de acordo com a tecnologia de hibridação do DNA, as imunoglobulinas ou fragmentos da presente invenção podem ser produzidos em bactérias ou leveduras. (Ver, Boss, et al., Nucl. Acid. Res., 12: 3791 e Wood, et al., Nature 314:446 , ambos aqui incorporei dos para referência). Por exemplo, o RNA mensageiro trans crito a partir dos genes que codificam as cadeias leve, e 8 pesada,dos anticorpos monoclonais produzidos por uma linha celular da presente invenção pode ser isolada por hibrida-ção diferencial do cDNA,empregando cDNA dos linfócitos BALB/c exceptuando o do clone em estudo. 0 mRNA que não hi brida será rico para o cõdigo da mensagem para as desejáveis cadeias das imunoglobulinas. Se necessário, este processo pode ser repetido para aumentar futuramente os níveis de mRNA desejáveis. A composição subtraída do mRNA pode de pois ser transmitida reversamente para providenciar uma mistura de cDNA enriquecido para as sequências desejáveis. 0 RNA pode ser hidrolizado com uma RNAse apropriada e o ssDNA tornado cadeia dupla com DNA polimerase I e iniciado res casuais, e.g. fragmentos casuais de DNA do timo do v^i telo. 0 dsDNA resultante pode ser clonado por inserção num vector apropriado, e.g., vectores virais, tais como os vec tores lambda, os vectores plasmídeos (tal como pBR322, pACYC184, etc). Por aperfeiçoamento de sondas baseadas nas sequências conhecidas para as regiões constantes das cadeias,leve e pesada, estes clones de cDNA contendo os genes que codificam as cadeias,leve e pesada,desejáveis podem ser identificados por hibridação. Seguidamente os ge nes podem ser extraídos dos plasmídeos, manipulados para remoção do DNA supérfluo a montante do codão de iniciação ou região constante do DNA e depois introduzido num vector apropriado para a transformação num hospedeiro e posterior expressão do gene.

Convenientemente, mamíferos hospedeiros (e.g., células de ratoá podem ser empregadas para preparar a ca- 9

deia (e.g., juntar as cadeias leve e pesada) para a produ ção de uma imunoglobulina intacta e, além disso, segregar a imunoglobulina livre da sequência guia, se desejável. Alternativamente, pode-se usar microrganismos unicelulares para produzir as duas cadeias, quando for necessário mani_ pulações futuras para remover as sequências de DNA que co dificam o guia secretor e sinais de processamento, fornecendo simultaneamente um codão de iniciação no terminus 5' da sequência que codifica a cadeia pesada. Deste modo, as imunoglobulinas podem ser preparadas e processadas de modo a serem reunidas e glicoziladas noutras células que não de mamíferos. Se desejável, cada uma das cadeias pode ser truncada de modo a reter pelo menos a região variável.

Tais regiões podem então ser manipuladas para fornecer as outras imunoglobulinas ou fragmentos específicos para os epítopos da caquectina (ver, e.g., NQs de publicação de pedido de patente Europeia NQ 0239400 e 0125023, as quais são aqui incorporadas para referência).

Os anticorpos monoclonais da presente invenção são particularmente úteis devido à sua grande afinidade com os epítopos de caquectina humana. Também, alguns dos anticorpos monoclonais são protectores ijn vivo, permitindo a sua incorporação em produtos farmacêuticos, tais como combinações de anticorpos para infecções bacterianas.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem também servir para uma grande variedade de utilizações in vitro. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser utilizados para purificar caquectina humana na- 10

tiva ou recombinante, para remover selectivamente a ca-quectina humana numa mistura heterogénea de proteínas, ou semelhantes.

Para fins de diagnóstico, os anticorpos mono-clonais podem ser ou não marcados- Tipicamente os ensaios de diagnóstico têm como consequência detectar a formação de um complexo através da ligação do anticorpo monoclonal â proteína. Quando não marcados, os anticorpos servem para os ensaios de aglutinação. Em adição, anticorpos não marcados podem ser usados em combinações com outros anticorpos marcados (segundos anticorpos) que são reactivos com o anticorpo monoclonal, tais como anticorpos específi. cos para as imunoglobulinas. Alternativamente, os anticoj: pos monoclonais podem ser marcados directamente. Uma larga variedade de marcadores pode ser utilizada, tal como radionuclidos, agentes fluorescentes, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimãticos, inibidores enzimáti-cos, ligandos (particularmente haptenos), etc. Existem nu merosos tipos de imunoensaios e, por exemplo, alguns incluem os descritos nas Patentes Norte Americanas N° 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074 e 4.098.876, todas aqui incorporadas para referência .

Vulgarmente, os anticorpos monoclonais da presente invenção são utilizados em imunoensaios de enzimas, nos quais os anticorpos em estudo, ou segundos anticorpos de diferentes espécies, são conjugados a um enzima. Quando uma amostra contendo caquectina humana, tal como san- 11

gue humano ou seu lisado, é combinado com o anticorpo em estudo, ocorre ligação entre anticorpos e aquelas moléculas que exibem os epítopos desejáveis. Tais complexos podem ser depois separados dos reagentes não ligados,e adicionado um segundo anticorpo (marcado com um enzima) . Seguidamente, é determinada a presença do conjugado anticorpo-enzima ligado específicamente às células. Podem ser também utilizadas outras técnicas convencionais bem conhecidas para os especialistas neste campo.

Podem também ser fornecidos "kits" para serem utilizados com os anticorpos em estudo na detecção da ca-quectina humana em solução ou da presença de epítopos da caquectina humana em fracções de recombinantes. Assim a composição do dito anticorpo monoclonal da presente inven ção pode ser obtido, usualmente numa forma liofilizada, quer simples ou em conjunção com anticorpos específicos para endotoxinas, exotoxinas ou bactérias gram-negativas. Os anticorpos, que podem ser ou não conjugados a um marca dor, são incluídos nos "kits" com tampões, tal como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, e.g., albumina sérica bovina, ou semelhan tes. Geralmente, estes materiais estarão presentes em menos de cerca de 5 p% baseado na quantidade do anticorpo activo e, usualmente,presente na quantidade total de pelo menos cerca de 0,001 p% baseado novamente na concentração do anticorpo. Frequentemente, será desejável incluir um amplificador inerte ou excipiente para diluir os ingredien tes activos, em que o excipiente pode estar presente a par 12 tir de cerca de 1 para 99 p% da composição total. Quando se utiliza um segundo anticorpo capaz de ligação ao anticorpo monoclonal, este deverá estar presente num frasco separado. 0 segundo anticorpo é tipicamente conjugado a um marcador e formulado de modo análogo às formulações do anticorpo acima descritas.

Os anticorpos monoclonais desta invenção podem ser incorporados como componentes de composição farmacêutica contendo uma dose terapêutica ou profiláctica de pelo menos um, mas vulgarmente uma mistura compreenden do dois ou mais, dos anticorpos monoclonais da presente invenção com um veículo farmaceuticamente eficaz. Um veículo farmacêutico deverá ser qualquer substância não tóxi^ ca compatível, adequada para fornecer os anticorpos monoclonais ao paciente. Agua esterilizada, álcool, gorduras, ceras e sõlidos inertes podem ser usados como veículos. Adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis {agentes-tampão, agentes dispersantes) podem ser também incorporados na composição farmacêutica. Estas composições podem conter anticorpos monoclonais específicos apenas para a caquecti^ na humana. Alternativamente, uma composição farmacêutica pode conter anticorpos monoclonais reactivos directamente com bactérias e podem ser usados para formar um "cocktail". Por exemplo, um cocktail contendo anticorpos monoclonais contra epítopos de caquectina humana e contra grupos de várias estirpes bacterianas (e.g., serotipos diferentes) causadores de sépsia seria um produto universal com acti-vidade contra a grande maioria dos isolados clínicos 13

responsáveis pela doença. A razão molar dos vários componentes do anticorpo monoclonal geralmente não diferirá em mais de um factor de 10, mais geralmente em não mais de um factor de 5 e, geralmente será numa razão molar de cerca de 1: 1-2 de cada um dos outros componentes do anticorpo. Quando usado em combinação, os anticorpos monoclonais da presente invenção serão geralmente usados em razões molares iguais.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem também ser usados em combinação com os produtos e-xistentes no plasma sanguíneo, tal como a gama globulina comercialmente disponível e produtos imunoglobulínicos usados nos tratamentos profilácticos ou terapêuticos da sépsia bacteriana em seres humanos. Preferencialmente, pa ra as globulinas imunes o plasma deverá ser obtido a partir de dadores hurnanos exibindo elevados níveis de imuno-globulinas reactivas com bactérias possuindo endotoxinas. (ver, generalidade, o compêndio "Intravenous Immune Glo-bulin and the Compromised Host," Amer. J. Med. 76 (3a), Março 30. 1984, pp.1-231, aqui incorporados para referên cia) .

Os anticorpos monoclonais podem também ser usa dos como composições administradas separadamente,dadas em conjunto com antibióticos ou agentes antimicrobianos. Tipicamente, os agentes antimicrobianos podem incluir uma penicilina em conjunção com um aminoglicosídeo (e.g., gen tamicina, tobramicina, etc.), mas podem também ser usados 14 numerosos agentes adicionais (e.g., cefalosporina) bem co nhecidos para os especialistas neste campo.

Os anticorpos monoclonais e as composições far macêuticas da presente invenção são particularmente úteis na administração oral ou parentérica. Preferencialmente, as composições farmacêuticas podem ser administradas pa-rentericamente, i.e., subcutaneamente, intramuscularmente, intra-arterialmente, ou intravenosamente. Assim, esta inven ção fornece composições para administração parentérica que compreendem uma solução do anticorpo monoclonal ou um seu cocktail dissolvido num veículo aceitável, preferencialmente um veículo aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser utilizada, e.g., água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de partículas de matéria. Estas composições podem ser esterilizadas por téc nicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceu-ticamente aceitáveis como as que permitem aproximar as con dições fisiológicas tais como agentes ajustadores e tampo nantes do pH, agentes ajustadores da toxicidade e semelhan tes, por exemplo acetato de sódio, cloreto de sódio, clore to de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração do anticorpo nestas formulações pode variar largamente, i.e., de menos de cerca de 0,5%, usualmente a ou pelo menos a cerca de 1% para o máximo de 15 a 20% de pesq e será seleccionado principalmente com base nos volumes de fluidos, viscosidade, etc, preferencialmente para 15 o modo particular de administração seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica típica para injecção intramuscular pode ser constituído de modo a con ter 1 ml de água tamponada esterilizada e 500 mg do anticorpo monoclonal. Uma composição típica para infusão intravenosa será constituída de modo a conter 250 ml da solução de Ringer esterilizada e 150 mg do anticorpo monoclonal. Métodos actuais para preparar as composições adm_i nistráveis parentericamente serão conhecidas ou evidentes para os especialistas neste campo e são descritas com mais detalhe em, por exemplo, Regminton1s Pharmaceutical Science, 15 Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsyl-vania (1980), aqui incorporada para referência.

Os anticorpos monoclonais desta invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos antes da sua utilização num veículo adequado. Esta técnica mostrou ser eficaz com as globulinas imunes convencionais, e as técnicas de liofilização e reconstituição bem conhecidas podem ser empregues. Os especialistas neste campo poderão apreciar que a liofilização e reconstituição pode levar à perda em vários graus da actividade do anticorpo (e.g. com globulinas imunes convencionais, anticorpos IgM tendem a ter uma maior perda da actividade do que os anticorpos IgG) e que os níveis usados podem ser ajustados para compensação.

As composições contendo os presentes anticorpos monoclonais ou seu cocktail podem ser administrados para o tratamento profiláctico e/ou terapêutico de qualquer de 16

uma variedade de infecções bacterianas. Na aplicação tera pêutica, as composições são administradas a um paciente já infectado com uma ou mais estirpes bacterianas numa quantidade suficiente para curar ou,pelo menos,parar parcialmente a infecção e suas complicações. A quantidade a-dequada para atingir este fim é definida como a "dose te-rapeuticamente eficaz". Doses eficazes para este fim dependerão sobretudo da gravidade da infecção e do estado geral do próprio sistema imune do paciente, mas geralmente variam de cerca de 1 para cerca de 200 mg dos anticorpos, por Kg do peso do corpo,sendo as dosagens de cerca de 5 a 25 mg por Kg mais vulgarmente usadas. Deverá ser tomado em conta que os materiais desta invenção podem ser geralmente utilizados em estados graves de doenças, isto é, situação de perigo de vida ou potencial perigo de vida, especialmente bacteremia e endotoxemia.

Nas aplicações profilácticas, composições contendo o presente anticorpo ou um seu cocktail são administra dos a um paciente ainda não infectado para aumentar a resistência do paciente a potenciais infecções. Tal dose é definida como sendo uma "dose profilacticamente eficaz". Nesta utilização, a quantidade precisa depende novamente do estado de saúde e nível geral da imunidade do doente, mas geralmente varia de 0,1 a 25 mg por Kg, especialmente 0,5 a 2,5 mg por Kg.

Administrações simples ou múltiplas das composições podem ser levadas a cabo com níveis e padrões de dosagem seleccionados pelo médico assistente. Em qualquer 17

caso, as formulações farmacêuticas devem fornecer uma quantidade de anticorpo(s) desta invenção suficiente para permitir o tratamento eficaz ou profiláctico do doente.

PARTE EXPERIMENTAL

Produção e Purificação da Caguectina

Caquectina humana recombinante (Pennica, et al, Nature, 312:724-729 (1984) e Shirai, et al, Nature, 313: 803-806 (1985), ambos aqui incorporados para referência) foi expressa como uma proteína intracelular em leveduras, a partir de um gene sintético que codifica uma meteonina de iniciação e a sequência da caquectina madura, com os codões escolhidos para reflectir os dos genes altamente expressos da levedura, de acordo com técnicas padrão. As sequências sintéticas foram colocadas a jusante de um pro motor álcool dehidrogenase/gliceralceído-3-fosfato dehi-drogenase (ADH2/GAPDH) híbrido. A síntese da caquectina foi induzida em culturas transformadas de Saccharomyces cerevisiae por privação de glucose. Cerca de 5-10% da pro teína total da levedura era caquectina. A caquectina foi purificada a partir de extractos impuros, não tratados, de levedura por (a) P raccionação sul^ fato amónia, (b) Cromatografia de Coluna de Fluxo Rápido de Q-sefarose, (c) Cromatograf ia de Coluna de Fluxo rápi_ do de S-sefarose e (d) Cromatografia de Coluna Sefarcril S-200 (HR). 18

Este procedimento recupera cerca de 80% da ac-tividade da caquectina como foi testada com células L929 tratadas com actinomicina D (Ruff and Gifford, (1981) Tumor Necrosis Factor, Lymphokines, 2^: 235-272). A activida-de específica da caquectina purificada foi de 2-4 x 10 unidades/mg e a pureza foi considerada superior a 98% pela electroforese em gel de poliacrilamida SDS.

Produção de Anticorpos Monoclonais para Caquectina

Ratos BALB/c foram imunizados intraperitonial-mente com 5 a 25 pg de adjuvante completo Freund1s e foi--lhes dado duas vezes um reforço da mesma dose de adjuvante incompleto Freund's com intervalos de três semanas. Foi dado um reforço intraperitonial final da mesma dose em so lução aquosa e a fusão realizou-se 3 a 4 dias mais tarde.

O Células do baço (cerca de 10 células) de ratos imunizados foram fundidas com cerca de 2 x 107 células de mieloma (P3-X63-Ag8.653) (Kearney et al . , J. Immunol. (1979) 123:1548-1550) usando glicol polietileno de acordo com Kohler e Milstein (Nature 256:495 (1979)). Estas células foram plaqueadas em placas de microtitulação, e os hí bridos foram seleccionados pelo meio timidina aminopteri-na hipoxantina (HAT).

Foram efectuadas cinco fusões com células do baço a partir de cinco ratos imunizados com caquectina. Utilizando ensaios de imunoabsorção de ligação a enzima em fase sólida, obtiveram-se 60 clones positivos que 19 4 produzem anticorpos monoclonais para a caquectina.

Os híbridos, a partir dos poços positivos, foram clona-dos três vezes através de diluições limite para garantir que cada um deles era um verdadeiro clone. Foram clonados e caracterizados catorze hibridomas positivos para a caquectina .

Caquectina/Bioensaio TNF: Citotoxicidade das Células L-929

Mediu-se a actividade TNF usando um ensaio ci-tolítico com células tratadas com actinomicina D como foi descrito por Ruff e Gifford em Lymphokines 2:225, (1981) aqui incorporado para referência.

As células L929 (CCL1, American Type Culture Collection, Rockville, MD) foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com Hepes lOmM e 10% de soro fetal bovino, 7 (ou DME + 10% FBS). Culturas complementares (3-4x10 célu- 3 las/frasco 75 cm ) foram libertadas por breve tratamento de tripsina (lavagem com 0,05% de tripsina) numa solução salina fisiológica contendo EDTA 5 mM e Hepes 10 mM, pH 7,4 e resuspendidas em meio novo contendo actinomicina D (1 pg/ml). As células foram depois plaqueadas em placas 4 de microtitulaçáo com 96 poços (5-7x10 células/poço).

Após duas horas de cultura, amostras diluídas em série foram adicionadas aos poços, (menos de 10-20% de soro) e as placas foram incubadas durante a noite (5% CC>2 r 37°C) . As amostras foram tratadas em quadriplicado.

No dia seguinte, após observação microscópica, o meio foi 20 decantado e os poços cheios com uma solução de violeta cristal a 0,2%, formalina a 10% e fosfato 0,01 pH 7-7,5 durante 5 minutos, lavados cuidadosamente com água e secos. O grau de lise foi quantificado espectrofotometrica-mente (550-570 nM) num leitor de placas de microtitulação. Os resultados testes são expressos como U/ml, sendo a un_i dade (U) definida como a quantidade de caquectina resultante da lise de 50% das células.

Teste de Neutralização In Vitro

Mistura-se caquectina humana recombinante (20 ng/ml em Tris NC1 0,02 M, pH 8,0, 0,15 M NaCl, lmg/ml BSA) com volumes iguais de anticorpo diluído e incubam-se a 37°C durante 60 minutos. A mistura é diluída 1:10, com meio novo contendo actinomicina D (pg/ml); e adiciona-se em quadriplicado 0,1 ml amostras (duplas) diluídas em série, aos poços das placas de microtitulação. A actividade citolítica residual é determinada usando um ensaio de cito-xicidade das células L929.

Caracterização dos Anticorpos Monoclonais

Foram identificados e subclonados catorze hi-bridomas positivos para a caquectina. Os anticorpos produ zidos por estes hibridomas foram caracterizados pela sua capacidade para competir com anticorpo monoclonal 18-1-1. (Tracey, et al., Nature 330:662-664 (1987) aqui incorpo- 21

rado para referência) para a ligação à caquectina num ELISA. Como foi mostrado na Tabela 1, os anticorpos mono-clonais dividem-se em três classes; os que não competem com os 18-1-1, os que o fazem, e os que mostram competição intermédia. Realizou-se um teste de captura de caquectina, para verificar que esses anticorpos que não competem com o 18-1-1 são especí ficos para a caquectina. Os anticorpos monoclonais para capturar a caquectina foram ligados numa fase sólida,e o anticorpo monoclonal 18-1-1 foi usado como o anticorpo mar cado. Neste teste todos os anticorpos monoclonais eram es peclficos para a caquectina.

Foram também realizadas experiências com meio condicionadcy a partir das células dos hibridomas, para determinar até que ponto o Mabs neutraliza a actividade de£» truidora celular da caquectina. Todos os 14 anticorpos monoclonais foram produzidos nos fluidos ascíticos de ratos para posterior caracterização. Foi determinada a eficácia dos anticorpos monoclonais purificados na protecção das células L929 contra a destruição pela caquectina. A actividade neutralizadora do MAb 1-2-4B1 foi confirmada com o material purificado. Incubações de MAb 2-2-3E3 (50 ng/ml) com igual volume de caquectina humana recombinante (20 ng/ /ml) a 37°C durante 60 minutos, mostraram que 50% da acti^ vidade citolítica da caquectina foi neutralizada, como determinada pelo ensaio de destruição das células L929. Como foi mostrado na Tabela 1, o MAb 2-2-3E3, que reconhece o mesmo epítopo que MAb 18-1-1, é necessário em 1/8 da quantidade do 18-1-1 para a protecção celular. 22

A Tabela 1 mostra também que a maioria dos anticorpos com a mesma especificidade do 18-1-1 neutralizava a caquecti-na (a 100%), nos ensaios de destruição das células L929. Outros anticorpos, tais como 1-2-4B1, que têm especificidades epitópicas diferentes daquelas do 18-1-1, também possuem actividade neutralizante significativa. TABELA 1

Perfil dos Anticorpos Monoclonais Reactivos com Caquectina Humana

Hibridoma MAb, tipo Ensaio de Competição Ensaio de Neutralização com 18-1-lk Meio Ig Purificado

ÍE 18-1-1 IgG + + 400 1-2-4D4 XgG + + 1-2-4B2 IgM - - l-2-4BlC IgG - + 400 1-1-1F3 IgG - + 2-2-2FS IgG + + >800 1-1-4C8 IgG - + 2-2-3E3C IgG + + 50 1-2-2F8 IgG + + 1-1-2E3 IgG + + 200 1-2-2A1 IgG + + 2-3-1A8 IgG + + 1-2-4C6 IgG + - 23

a) Determinado por SDS-PAGE de MAb purificado parcialmente a partir de fluidos ascíticos por precipitação com sulfato de amónia. b) Determinado num ELISA de Competição de Fase Sólida como a seguir se refere: foram adicionados, a cada poço, meio condicionado de culturas de hibridomas de 24 hr (50 ^il),e 18-1-1 marcado-HRP (25 μΐ, 0,2 pg/ml em PBS + 10% de soro de cabra). c) As linhas celulares 1-2-4B1 e 2-2-3E3 foram depositadas com A.T.C.C. e designadas pelos Números de Acesso HB9737 e HB9736, respectivamente.

Eficácia do pós-tratamento com fragmento de Anticorpo monoclonal anti-TNF na prevenção dos efeitos nocivos da sépsia no babuíno

Aos babuínos admistrou-se intravenosamente uma infusão LD^qo de Escherichia col i (E_. coli) de duas horas. Os animais foram monitorizados durante 10 horas e observa dos até à morte, ou durante um máximo de 7 dias. A seguir â infusão de duas horas de E. coli, administrou-se a intervalos designados o antibiótico aminoglicosídeo, genta-micina. Um bolus intravenoso do fragmento 2-2-3E3 F(ab')2 do anticorpo monoclonal anti-TNF (10 mg/kg) foi administrado a quatro babuínos a T+30 minutos (um quarto da via através da infusão bacteriana i.e., "post-treatment"). A um babuíno adicional administrou-se a mesma dose de E. co- 24

li mais gentamicina e tratou-se com um controlo isotípico de um fragmento F{ab')2 irrelevante. (1) Dados de sobrevivência DATA EXPERIÊNCIA Φ BABUÍNO PESO BABUlNO DOSE E.COLI TEMPO DE SOBI (KG + SEXO) (#ORG/KG) VIVÊNCIA 2/25/88 + Anticorpo 1 6,8 M 3,7 x 1010 17 horas 3/01/88 + Anticorpo 2 14,3 M 4,6 X 1010 24 horas 3/17/88 + Anticorpo 3 7,3 M 6,2 X 1010 + de 7 dias 4/05/88 + Anticorpo 4 6,6 F 4,4 x 1010 + de 7 dias 4/06/88 + Controlo 5 6,4 F 6,5 x 1010 21 horas (Suporte) (2) Observações Post-Mortem 0 sumário das examinações post-mortem feitas nos babuínos # 1.2,5, (post-mortems não incluídos nos babuínos sobreviventes 3,4, porque trabalhos anteriores com animais sobreviventes não mostraram efeitos histológicos adversos). A maioria dos dados post-mortem nos animais 7^1,2,5 eram muito similares entre si e são os seguintes: + f

Pulmões: Hemorragias (3 )

Rins: Congestionados, necrosados (3+++)

Supra -renais: Hemorragias, necrosadas (4 + + ) Fígado: Congestionado (2+)

Baço: Ingurgitado e congestionado

Intestinos: Aparência normal mas foram observadas intussuscepções no intestino delgado nos animais

Hf i,2. 25

Coração, pâncreas, estomâgo, colon; Aparência normal. (3) Parâmetros Fisiológicos e outros monitorizados duran-te 10 horas (a) Os parâmetros associados com benefícios so breviventes nos babuínos φ 3,4 e diferentes dos babuínos não sobreviventes (#1,2,5) eram: pressão arterial mé dia sistémica (MSAP) , f pH, ^ lactato, J, BUN, J, crea-tinina, J, SGPT, J, cortisol, f glucose, J, FDP e fi-brinogénio. (b) Os parâmetros que não diferem entre babuínos sobreviventes (.#3,4) e não sobreviventes (#1,2,5) e ram: Taxas cardíaca e respiratória, WBS, plaquetas, pC02, p02, CPK, hematocrito, concentrações sanguíneas de colónias (E_;_ coli) , temperatura corporal. Não se notaram diferenças significativas, quan do os estudos foram repetidos com o anticorpo total. Assim, quer os fragmentos de ligação, quer os anticorpos in tactos podem ser utilizados de acordo com a presente invenção . A partir do que foi referido anteriormente, po derá ser apreciado que as linhas celulares da presente in venção fornecem meios para a produção de anticorpos mono-clonais e seus fragmentos reactivos com a caquectina huma na, em doses neutra 1izantes baixas. Isto permite que as composições profilácticas e terapêuticas sejam desenvolvi_ das mais economicamente e administradas com segurança, sen 26

Claims

Campo da Invenção O presente estudo refere-se â aplicação de téc nicas imunolõgicas para a produção de novos materiais Citeis no diagnóstico e tratamento, inter alia, de infecções bacterianas e mais particularmente para a produção e aplicação de anticorpos monoclonais aperfeiçoados,capazes de reagir especificamente com a caquectina humana. Antecedentes da Invenção A introdução de estímulos invasivos tais como infecções parasíticas, bacterianas ou virais, ou células neoplásicas, induz alterações metabólicas significativas no hospedeiro susceptível. Se são graves, as alterações podem eventualmente destruir os mecanismos homeostáticos normais, quer localmente, quer sistemicamente, conduzindo à deplecção das energias do hospedeiro, progredindo para o declínio (caquexia), destruição tecidular, deficiências múltiplas nos sistemas orgânicos, choque e morte. Até hã pouco tempo, os clínicos supunham que os padrões sistemáticos deviam-se primeiramente â acção dos próprios agentes invasivos. Contudo, sabe-se hoje que os estímulos invasivos provocam no hospedeiro a produção de várias citoquinas, cujas acções combinadas causam a maioria das respostas biológicas indesejáveis. Estes mediadores inflamatórios derivados do hospedeiro oferecem novas oportunidades para desenvolver regimes de tratamento contra uma larga variedade de estados inflamatórios das doenças . Uma das mais potentes citoquinas é a caquectina que é libertada principalmente por macrófagos, após esti mulação apropriada. A caquectina que é também conhecida por Factor de Necrose Tumoral (TNF), é uma proteína contendo 157 aminoácidos, normalmente encontrada in vivo como um dímero ou outro multímero. 0 peso molecular calcula. do do monomero humano do TNF é cerca de 17.000 daltons. A caquectina actua na supressão da biosíntese de várias proteínas adipócito-específicas, tal como a lipase 1ipoproteica. Também actua na indução da biosíntese I ou libertação de numerosas outras proteínas, incluindo o antigénio da Classe I do sistema Major de Histocompatibilidade factor estimulante das colónias granulocitos-macrofagos e interleucina 1. (Ver, em gera 1 Bentlex e Cerami, New Eng. J. of Med., 316:379-385 (1987), aqui incorporado para referência . ) O reconhecimento da larga influência da caquec tina nos vários estados das doenças levou â tentativa de controlo da sua acção. Por exemplo, experiências mostraram que os anticorpos especificamente reactivos com caquec tina podem ser terapeuticamente úteis no controlo das res postas imuno-modulatórias que se sabe hoje estarem associadas com a caquectina (ver U.S. Patent NQs. 4.603.106 e 4.684.623, ambas aqui incorporadas para referência). Em particular, os anticorpos neutra 1izantes capazes de ligação de alta afinidade a vários epítopos, na caquectina humana, têm um potencial significativo como mediadores dos e feitos tóxicos dos níveis excessivos da caquectina. Assim, há a necessidade de anticorpos aperfeiçoados capazes de neutralizar o efeito tóxico da caquecti_ na in vivo. Á presente invenção preenche estes requisitos. Sumário da Invenção Obtiveram-se novas linhas celulares que produzem anticorpos monoclonais capazes de se ligarem aos epítopos da caquectina humana,com capacidade neutra 1izante aumentada in vivo. Adicionalmente,obtiveram-se métodos pa ra tratamento de seres humanos susceptíveis à bacteremia ou sepsia,ou já infectados com bactéria possuindo endoto xina,pela administração de uma dose profiláctica ou terapêutica de uma composição compreendendo, pelo menos, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo,capaz de reagir com a caquectina humana e exibindo actividade neutralizante nos ensaios citolíticos das células L929 a menos de cerca de 400 ng, tipicamente entre cerca de 50 a 200 ng ou mais. Esta composição deverá preferencialmente incluir ainda um veículo fisiologicamente aceitável. A composição pode também conter qualquer um ou mais dos seguintes: anticorpos monoclonais adicionais capa zes de reagir com endotoxinas ou exotoxinas bacterianas; anticorpos monoclonais capazes de reagir com determinantes serotipos em estirpes bacterianas particulares, possuindo endotoxinas; uma fracção gama globulina, do plasma sanguíneo humano; uma fracção gama globulina do plasma sanguíneo huma no onde o plasma pode ser obtido a partir de um indivíduo humano exibindo elevados níveis de imunoglobulinas reactivas com endotoxinas bacterianas; e um ou mais agentes anti. microbianos. Além disso, conseguem-se utilizações clínicas dos anticorpos monoclonais, incluindo a produção de kits de diagnóstico. Descrição das Modalidades Específicas De acordo com a presente invenção, são obtidas novas células capazes de produzir anticorpos monoclonais neutra 1izantes de afinidades e composições que compreendem tais anticorpos, desejáveis, composições essas que são capa, zes de reconhecimento selectivo dos epítopos presentes na caquectina humana. As células em estudo possuem cromossomas identificáveis nos quais a linha do DNA (originário das pró prias ou de uma célula percurssora) se rearranjou de modo a codificar um anticorpo contendo um sítio de ligação para um epítopo desejado na caquectina humana. Estes anticorpos mo noclonais podem ser usados numa grande variedade de formas, incluindo diagnóstico e terapia. Os anticorpos monoclonais assim obtidos são par ticularmente úteis, quando comparados com os anticorpos das práticas anteriores, no tratamento ou profilaxia de doenças graves, tal como bacteremia, sépsia, caquexia, ou outros es tados de doenças associadas a elevados níveis de caquectina Assim, os anticorpos terão tipicamente actividade neutralizante a menos de 400 ng, preferencialmente menos de cerca de 300 ng, mais preferencialmente cerca de 50 a 200 ng nos ensaios citolíticos das células L929. Este nível superior da actividade permite a utilização de níveis de dosagem significativamente mais baixos nos tratamentos. A preparação de anticorpos monoclonais pode ser realizada pela imorta1ização de uma linha celular com capacidade de expressão de sequências de ácidos nucleicos, que codificam os anticorpos específicos para um epítopo apropri ado na caquectina humana. A linha celular imortalizada pode ser uma linha celular de mamíferos que foi transformada através de oncogénese por transfecção, mutação ou semelhantes. Estas células incluem linhas de mielomas, linhas de lmfomas ou outras linhas celulares capazes de apoiar a expressão e secreção da imunoglobulina ou seu fragmento de ligação in vitro. A imunoglobulina ou fragmento pode ser uma imunoglobulina que ocorre naturalmente num mamífero à excepção das fontes usuais de humanos ou ratos, produzida por transfor5 mação de um linfõcito, particularmente um esplenocito, por meio de um virus ou por fusão do linfõcito com uma célula neoplásica, e. g., um mieloma, para produção de uma linha celular híbrida. Tipicamente o esplenocito será obtido a partir de um animal imunizado contra antigénios relacionados com a caquectina ou seus fragmentos contendo um sítio epitópico. Os protocolos de imunização são bem conhecidos e podem variar consideravelmente continuando no entanto efi. cazes. (ver, Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2S. Ed., Academic Press, N.Y. (1986), aqui incorpo rado para referência). As linhas celulares híbridas podem ser clonadas e filtradas de acordo com técnicas convencionais, e podem ser detectados, no sobrenadante celular, os anticorpos que são capazes da ligação aos determinantes desejáveis da caquectina humana com afinidades apropriadas. As linhas celu lares híbridas apropriadas podem então crescer em culturas de larga escala ou serem injectadas na cavidade peritonial de um hospedeiro apropriado para a produção de anticorpos aos fluidos ascíticos. Porque possuem os anticorpos da presente invenção, que se sabe serem específicos para a'proteína da caquectina humana, nalguns casos,os sobrenadantes das experiências subsequentes podem ser filtrados num ensaio de com petição com os anticorpos monoclonais em estudo, como um meio de identificar amostras adicionais dos anticorpos mono clonais anti-caquectina humana desejáveis (assim chamados anticorpos bloqueadores). Deste modo as linhas celulares I híbridas podem ser rapidamente produzidas a partir de uma variedade de fontes baseadas na disponibilidade dos presen tes anticorpos específicos para os determinantes caquéticos particulares a níveis de afinidade apropriados. Alternativamente, quando existem linhas célula res híbridas, que produzem anticorpos específicos para os sítios epitõpicos em estudo, estas linhas celulares h_í bridas podem fundir-se com outras células B-neoplásicas, quando as tais outras células B puderem servir como recep tores para o código genómico do DNA para os anticorpos. Estes anticorpos podem ser funcionais à superfície da célula e não, por exemplo, como receptores. Enquanto que as células B-neoplásicas dos roedores, mais particularmente dos murídeos, são as mais vulgarmente utilizadas, outras espécies de mamíferos podem ser empregadas, tal como as es pécies lagomorfa, bovina, ovina, equina, porcina, aves ou semelhantes. Os anticorpos monoclonais podem ser de qualquer uma das classes ou subclasses das imunoglobulinas,tais como IgM, IgD, IgA, IgE ou subclasses conhecidas da IgG para cada espécie de animal. Geralmente, os anticorpos monoclonais podem ser usados intactos, ou como fragmentos de liga ção, tais como Fv, Fab, F(ab')2, mas usualmente intactos. As linhas celulares da presente invenção podem ter outro uso para além da produção directa dos anticorpos monoclonais. As linhas celulares podem sofrer fusão com outras células (tal como mieloma humano adequadamente marcado com fãrmacos, mielomas de ratos ou células linfoblas7 toides humanas) para produção de hibridomas ou triomas e assim garantir a transferência de genes que codificam os anticorpos monoclonais. Alternativamente, as linhas celulares podem ser usadas como fonte de cromossomas que codi. ficam as imunoglobulinas, que podem ser isoladas e transferidas para as células através de outras técnicas que não a fusão. Em adição, os genes que codificam os anticorpos monoclonais podem ser isolados e utilizados em conformida de com as técnicas de recombinação do DNA para a produção de imunoglobulinas específicas numa variedade de hospedei^ ros. Particularmente, por preparação do património de cDNA a partir do RNA mensageiro, um clone de cDNA simples, que codifica a imunoglobulina e que é livre de introns, pode ser isolado e colocado em vectores de expressão euca riõtica ou procariõtica adequados ejsubsequentemente, transformados num hospedeiro para posterior produção em massa. (Ver, Generalidades, U. S. NQs. 4.172 . 124 ; 4.350.683;

1- Método para produzir anticorpos monoclonais aperfeiçoados reactivos com a caquectina, caracterizado pelo facto de uma linha celular que produz um anticorpo monoclonal ser capaz de reagir especificamente com a caquectina humana, em que menos do que 200 ng de anticorpo monoclonal ir neutralizar 20 ng da caquectina humana num ensaio citolítico de células L929.

(1) Dados de sobrevivência

DATA EXPERIÊNCIA BABUÍNO PESO BABUÍNO DOSE E.COLI TEMPO DE SOBF (KG + SEXO) (#ORG/KG) VIVÊNCIA 2/25/88 + Anticorpo 1 6,8 M 3,7 x io¹⁰ 17 horas 3/01/88 + Anticorpo 2 14,3 M 4,6 X ío¹⁰ 24 horas 3/17/88 + Anticorpo 3 7,3 M 6,2 x 10¹¹⁵ + de 7 dias 4/05/88 + Anticorpo 4 6,6 F 4,4 x ίο¹⁰ + de 7 dias 4/06/88 + Controlo (Suporte) 5 6,4 F 6,5 x 10¹^ 21 horas

1-2 de cada um dos outros componentes do anticorpo. Quando usado em combinação, os anticorpos monoclonais da presente invenção serão geralmente usados em razões molares iguais.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem também ser usados em combinação com os produtos existentes no plasma sanguíneo, tal como a gama globulina comercialmente disponível e produtos imunoglobulínicos usados nos tratamentos profilácticos ou terapêuticos da sépsia bacteriana em seres humanos. Preferencialmente, pa ra as globulinas imunes o plasma deverá ser obtido a partir de dadores humanos exibindo elevados níveis de imunoglobulinas reactivas com bactérias possuindo endotoxinas. (ver, generalidade, o compêndio Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host, Amer. J. Med. 76 (3a), Março 30. 1984, PP·1-231, aqui incorporados para referên cia) .

Os anticorpos monoclonais podem também ser usa dos como composições administradas separadamente,dadas em conjunto com antibióticos ou agentes antimicrobianos. Tipicamente, os agentes antimicrobianos podem incluir uma penicilina em conjunção com um aminog1icosídeo (e.g., gen tamicina, tobramicina, etc.), mas podem também ser usados numerosos agentes adicionais (e.g., cefalosporina) bem co nhecidos para os especialistas neste campo.

Os anticorpos monoclonais e as composições far macêuticas da presente invenção são particularmente úteis na administração oral ou parentérica. Preferencialmente, as composições farmacêuticas podem ser administradas parentericamente, i.e., subcutaneamente, intramuscularmente, intra-arterialmente, ou íntravenosamente. Assim, esta inven ção fornece composições para administração parentérica que compreendem uma solução do anticorpo monoclonal ou um seu cocktail dissolvido num veículo aceitável, preferencialmente um veículo aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser utilizada, e.g., água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de partículas de matéria. Estas composições podem ser esterilizadas por téc nicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como as que permitem aproximar as con dições fisiológicas tais como agentes ajustadores e tampo nantes do pH, agentes ajustadores da toxicidade e semelhan tes, por exemplo acetato de sódio, cloreto de sódio, clore to de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc.

A concentração do anticorpo nestas formulações pode variar largamente, i.e., de menos de cerca de 0,5%, usualmente a ou pelo menos a cerca de 1% para o máximo de 15 a 20% de pesq e será seleccionado principalmente com base nos volumes de fluidos, viscosidade, etc, preferencia 1 mente para o modo particular de administração seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica típica para injecção intramuscular pode ser constituído de modo a con ter 1 ml de água tamponada esterilizada e 500 mg do anticorpo monoclonal. Uma composição típica para infusão intravenosa será constituída de modo a conter 250 ml da solução de Ringer esterilizada e 150 mg do anticorpo monoclonal. Métodos actuais para preparar as composições admi. nistráveis parentericamente serão conhecidas ou evidentes para os especialistas neste campo e são descritas com mais detalhe em, por exemplo, Regminton's Pharmaceutica1 Science, 15 Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), aqui incorporada para referência.

As composições contendo os presentes anticorpos monoclonais ou seu cocktail podem ser administrados para o tratamento profiláctico e/ou terapêutico de qualquer de uma variedade de infecções bacterianas. Na aplicação tera pêutica, as composições são administradas a um paciente já infectado com uma ou mais estirpes bacterianas numa quantidade suficiente para curar ou,pelo menos,parar parcialmente a infecção e suas complicações. A quantidade adequada para atingir este fim é definida como a dose terapeuticamente eficaz. Doses eficazes para este fim dependerão sobretudo da gravidade da infecção e do estado geral do próprio sistema imune do paciente, mas geralmente variam de cerca de 1 para cerca de 200 mg dos anticorpos, por Kg do peso do corpo,sendo as dosagens de cerca de 5 a 25 mg por Kg mais vulgarmente usadas. Deverá ser tomado em conta que os materiais desta invenção podem ser geralmente utilizados em estados graves de doenças, isto é, situação de perigo de vida ou potencial perigo de vida especialmente bacteremia e endotoxemia.

Nas aplicações profilácticas, composições contendo o presente anticorpo ou um seu cocktail são administra dos a um paciente ainda não infectado para aumentar a resistência do paciente a potenciais infecções. Tal dose é definida como sendo uma dose profilacticamente eficaz. Nesta utilização, a quantidade precisa depende novamente do estado de saúde e nível geral da imunidade do doente, mas geralmente varia de 0,1 a 25 mg por Kg, especialmente 0,5 a 2,5 mg por Kg.

Administrações simples ou múltiplas das composições podem ser levadas a cabo com níveis e padrões de dosagem seleccionados pelo médico assistente. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas devem fornecer uma quantidade de anticorpo(s) desta invenção suficiente para permitir o tratamento eficaz ou profiláctico do doente.

PARTE EXPERIMENTAL

Produção e Purificação da Caquectina

Caquectina humana recombinante (Pennica, et al,

Nature, 312:724-729 (1984) e Shirai, et al, Nature, 313:

803-806 (1985), ambos aqui incorporados para referência) foi expressa como uma proteína intracelular em leveduras, a partir de um gene sintético que codifica uma meteonina de iniciação e a sequência da caquectina madura, com os codões escolhidos para reflectir os dos genes altamente expressos da levedura, de acordo com técnicas padrão. As sequências sintéticas foram colocadas a jusante de um pro motor álcool dehidrogenase/gliceralceído-3-fosfato dehidrogenase (ADH2/GAPDH) híbrido. A síntese da caquectina foi induzida em culturas transformadas de Saccharomyces cerevisiae por privação de glucose. Cerca de 5-10% da pro teína total da levedura era caquectina.

A caquectina foi purificada a partir de extractos impuros, não tratados, de levedura por (a) Eraccionação sul_ fato amónia, (b) Cromatografia de Coluna de Fluxo Rápido de Q-sefarose, (c) Cromatograf ia de Coluna de Fluxo rápj. do de S-sefarose e (d) Cromatografia de Coluna Sefarcril

S-200 (HR).

I

Este procedimento recupera cerca de 80% da actividade da caquectina como foi testada com células L929 tratadas com actinomicina D (Ruff and Gifford, (1981) Tumor Necrosis Factor, Lymphokines , 2-.225-212} . A actividag de específica da caquectina purificada foi de 2-4 x 10 unidades/mg e a pureza foi considerada superior a 98% pela electrof orese em gel de poliacrilamida SDS.

Produção de Anticorpos Monoclonais para Caquectina

Ratos BALB/c foram imunizados intraperitonialmente com 5 a 25 pg de adjuvante completo Freund¹s e foi-lhes dado duas vezes um reforço da mesma dose de adjuvante incompleto Freund's com intervalos de três semanas. Foi dado um reforço intraperitonial final da mesma dose em so lução aquosa e a fusão realizou-se 3 a 4 dias mais tarde.

O

Células do baço (cerca de 10 células) de ratos imunizados foram fundidas com cerca de 2 χ 10⁷ células de mieloma (P3-X63-Ag8.653) (Kearney et al., J. Immunol.

(1979) 123:1548-1550) usando glicol polietileno de acordo com Kohler e Milstein (Mature 256:495 (1979)). Estas células foram plaqueadas em placas de microtitulação, e os hí. bridos foram seleccionados pelo meio timidina aminopterina hipoxantina (HAT).

Foram efectuadas cinco fusões com células do baço a partir de cinco ratos imunizados com caquectina. Utilizando ensaios de imunoabsorção de ligação a enzima em fase sólida, obtiveram-se 60 clones positivos que produzem anticorpos monoclonais para a caquectina.

Os híbridos, a partir dos poços positivos, foram clonados três vezes através de diluições limite para garantir que cada um deles era um verdadeiro clone. Foram clonados e caracterizados catorze hibridomas positivos para a caquectina .

Caguectina/BioensaioTNF: Citotoxicidade das Células L-929

Mediu-se a actividade TNF usando um ensaio citolítico com células tratadas com actinomicina D como foi descrito por Ruff e Gifford em Lymphok ines .2:235 , (1981) aqui incorporado para referência.

As células L929 (CCL1, American Type Culture

Collection, Rockville, MD) foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com Hepes lOmM e 10% de soro fetal bovino, (ou DME + 10% FBS). Culturas complementares (3-4x10 célu3 las/frasco 75 cm ) foram libertadas por breve tratamento de tripsina (lavagem com 0,05% de tripsina) numa solução salina fisiológica contendo EDTA 5 mM e Hepes 10 mM, pH

2- Uma linha celular, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do anticorpo monoclonal ser protector in vivo contra as bactérias possuindo endotoxinas.

(2) Observações Post-Mortem

O sumário das examinações post-mortem feitas nos babuínos :#· 1,2,5, (post-mortems não incluídos nos babuínos sobreviventes 3,4, porque trabalhos anteriores com animais sobreviventes não mostraram efeitos histológicos adversos). A maioria dos dados post-mortem nos animais ^1,2,5 eram muito similares entre si e são os seguintes:

Pulmões: Hemorragias (3⁺⁺)

Rins: Congestionados, necrosados (3⁺⁺⁺)

Supra-renais: Hemorragias, necrosadas (4⁺⁺)

Fígado: Congestionado (2⁺)

Baço: Ingurgitado e congestionado

Intestinos: Aparência normal mas foram observadas intussuscepções no intestino delgado nos animais <= 1,2.

Coração, pâncreas, estomâgo, colon: Aparência normal.

3- Uma linha celular, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de possuir o Número de Acesso ATCC, HB9736 ou HB9737.

(3) Parâmetros Fisiológicos e outros monitorizados durante 10 horas (a) Os parâmetros associados com benefícios so breviventes nos babuínos 3,4 e diferentes dos babuínos não sobreviventes (^1,2,5) eram: 4* pressão arterial média sistémica (MSAP) , f pH, £ lactato, £ BLJN, £ creatinina, J, SGPT, j cortisol, f glucose, £ FDP e ψ fibrinogénio.

(b) Os parâmetros que não diferem entre babuínos sobreviventes (.#3,4) e não sobreviventes (#tl,2,5) £ ram: Taxas cardíaca e respiratória, WBS, plaquetas, pCO^, pO^, CPK, hematocrito, concentrações sanguíneas de colónias (E. coli), temperatura corporal.

Não se notaram diferenças significativas, quan do os estudos foram repetidos com o anticorpo total. Assim, quer os fragmentos de ligação, quer os anticorpos in tactos podem ser utilizados de acordo com a presente invenção .

A partir do que foi referido anteriormente, po derã ser apreciado que as linhas celulares da presente in venção fornecem meios para a produção de anticorpos monoclonais e seus fragmentos reactivos com a caquectina huma na, em doses neutra 1izantes baixas. Isto permite que as composições profilácticas e terapêuticas sejam desenvolvi das mais economicamente e administradas com segurança, sen do eficazes contra as infecçoes devidas à maioria das estirpes bacterianas possuindo endotoxinas. Em adição, os anticorpos terão utilização em várias práticas de diagnóstico e terapêuticas.

Apesar da presente invenção ter sido descrita com algum detalhe de modo a ilustrar e exemplificar, com objectivos de clareza de compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser realizadas no âmbito das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345;

4- Um método de produção de anticorpos monoclonais capazes de tratar ou evitar as infecçoes bacterianas possuindo endotoxinas, caracterizado pelo facto de compreender o cultivo de uma linha celular, conforme reivindicada nas reivindicações 1 a 3, e a recuperação dos anticorpos monoclonais produzidos pela linha celular.

4.034.074 e 4.098.876, todas aqui incorporadas para referência .

Vulgarmente, os anticorpos monoclonais da presente invenção são utilizados em imunoensaios de enzimas, nos quais os anticorpos em estudo, ou segundos anticorpos de diferentes espécies, são conjugados a um enzima. Quando uma amostra contendo caquectina humana, tal como san11 gue humano ou seu lisado, é combinado com o anticorpo em estudo, ocorre ligação entre anticorpos e aquelas moléculas que exibem os epítopos desejáveis. Tais complexos podem ser depois separados dos reagentes não ligados,e adicionado um segundo anticorpo (marcado com um enzima). Seguidamente, é determinada a presença do conjugado anticorpo-enzima ligado específicamente âs células. Podem ser também utilizadas outras técnicas convencionais bem conhecidas para os especialistas neste campo.

Podem também ser fornecidos kits para serem utilizados com os anticorpos em estudo na detecção da caquectina humana em solução ou da presença de epítopos da caquectina humana em fracções de recombinantes. Assim a composição do dito anticorpo monocional da presente inven ção pode ser obtido, usualmente numa forma liofilizada, quer simples ou em conjunção com anticorpos específicos para endotoxinas, exotoxinas ou bactérias gram-negativas. Os anticorpos, que podem ser ou não conjugados a um marca dor, são incluídos nos kits com tampões, tal como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, e.g., albumina sérica bovina, ou semelhan tes. Geralmente, estes materiais estarão presentes em menos de cerca de 5 p% baseado na quantidade do anticorpo activo e, usualmente,presente na quantidade total de pelo menos cerca de 0,001 p% baseado novamente na concentração do anticorpo. Frequentemente, será desejável incluir um amplificador inerte ou excipiente para diluir os ingredien tes activos, em que o excipiente pode estar presente a par tir de cerca de 1 para 99 p% da composição total. Quando se utiliza um segundo anticorpo capaz de ligação ao anticorpo monoclonal, este deverá estar presente num frasco separado. 0 segundo anticorpo é tipicamente conjugado a um marcador e formulado de modo análogo às formulações do anticorpo acima descritas.

Os anticorpos monoclonais desta invenção podem ser incorporados como componentes de composição farmacêutica contendo uma dose terapêutica ou profiláctica de pelo menos um, mas vulgarmente uma mistura compreenden do dois ou mais, dos anticorpos monoclonais da presente invenção com um veículo farmaceuticamente eficaz. Um veículo farmacêutico deverá ser qualquer substância não tóxi. ca compatível, adequada para fornecer os anticorpos monoclonais ao paciente. Agua esterilizada, álcool, gorduras, ceras e sólidos inertes podem ser usados como veículos. Adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis (agentes-tampão, agentes dispersantes) podem ser também incorporados na composição farmacêutica. Estas composições podem conter anticorpos monoclonais específicos apenas para a caquecti. na humana. Alternativamente, uma composição farmacêutica pode conter anticorpos monoclonais reactivos directamente com bactérias e podem ser usados para formar um cocktail. Por exemplo, um cocktail contendo anticorpos monoclonais contra epítopos de caquectina humana e contra grupos de várias estirpes bacterianas (e.g., serotipos diferentes) causadores de sépsia seria um produto universal com actividade contra a grande maioria dos isolados clínicos responsáveis pela doença.

A razão molar dos vários componentes do anticorpo monoclonal geralmente não diferirá em mais de um factor de 10, mais geralmente em não mais de um factor de 5 e, geralmente será numa razão molar de cerca de 1:

4.363.799; 4.381.292; e 4.423.147. Ver também, Kennett et al., Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980) e referências aí citadas, todas aqui incorporadas para re ferência).

Mais especificamente, de acordo com a tecnologia de hibridação do DNA, as imunoglobulinas ou fragmentos da presente invenção podem ser produzidos em bactérias ou leveduras. (Ver, Boss, et al., Nucl Acid. Res., 12:

3791 e Wood, et al., Nature 314:446 , ambos aqui incorporei dos para referência). Por exemplo, o RNA mensageiro trans crito a partir dos genes que codificam as cadeias leve, e pesada,dos anticorpos monoclonais produzidos por uma linha celular da presente invenção pode ser isolada por hibridação diferencial do cDNA,empregando cDNA dos linfócitos BALB/c exceptuando o do clone em estudo. 0 mRNA que não hi brida será rico para o código da mensagem para as desejáveis cadeias das imunoglobulinas. Se necessário, este processo pode ser repetido para aumentar futuramente os níveis de mRNA desejáveis. A composição subtraída do mRNA pode de pois ser transmitida reversamente para providenciar uma mistura de cDNA enriquecido para as sequências desejáveis.

0 RNA pode ser hidrolizado com uma RNAse apropriada e o ssDNA tornado cadeia dupla com DNA polimerase I e iniciado res casuais, e.g. fragmentos casuais de DNA do timo do vi. telo. O dsDNA resultante pode ser clonado por inserção num vector apropriado, e.g., vectores virais, tais como os vec tores lambda, os vectores plasmídeos (tal como pBR322, pACYC184, etc). Por aperfeiçoamento de sondas baseadas nas sequências conhecidas para as regiões constantes das cadeias,leve e pesada, estes clones de cDNA contendo os genes que codificam as cadeias,leve e pesada,desejáveis podem ser identificados por hibridação. Seguidamente os ge nes podem ser extraídos dos plasmídeos, manipulados para remoção do DNA supérfluo a montante do codão de iniciação ou região constante do DNA e depois introduzido num vector apropriado para a transformação num hospedeiro e posterior expressão do gene.

Convenientemente, mamíferos hospedeiros (e.g., células de ratoá podem ser empregadas para preparar a ca9 deia (e.g., juntar as cadeias leve e pesada) para a produ ção de uma imunoglobulina intacta e, além disso, segregar a imunoglobulina livre da sequência guia, se desejável. Alternativamente, pode-se usar microrganismos unicelulares para produzir as duas cadeias, quando for necessário mani. pulações futuras para remover as sequências de DNA que co dificam o guia secretor e sinais de processamento, fornecendo simultaneamente um codão de iniciação no terminus 5' da sequência que codifica a cadeia pesada. Deste modo, as imunoglobulinas podem ser preparadas e processadas de modo a serem reunidas e glicoziladas noutras células que não de mamíferos. Se desejável, cada uma das cadeias pode ser truncada de modo a reter pelo menos a região variável.

Tais regiões podem então ser manipuladas para fornecer as outras imunoglobulinas ou fragmentos específicos para os epítopos da caquectina (ver, e.g., NQs de publicação pedido de patente Europeia NQ 0239400 e 0125023, quais são aqui incorporadas para referência).

Os anticorpos monoclonais da presente invenção são particularmente úteis devido â sua grande afinidade com os epítopos de caquectina humana. Também, alguns dos anticorpos monoclonais são protectores in vivo, permitindo a sua incorporação em produtos farmacêuticos, tais como combinações de anticorpos para infecções bacterianas.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem também servir para uma grande variedade de utilizações in vitro. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser utilizados para purificar caquectina humana nade as tiva ou recombinante, para remover selectivamente a caquectina humana numa mistura heterogénea de proteínas, ou semelhantes.

Para fins de diagnóstico, os anticorpos monoclonais podem ser ou não marcados. Tipicamente os ensaios de diagnóstico têm como consequência detectar a formação de um complexo através da ligação do anticorpo monoclonal â proteína. Quando não marcados, os anticorpos servem para os ensaios de aglutinação. Em adição, anticorpos não marcados podem ser usados em combinações com outros anticorpos marcados (segundos anticorpos) que são reactivos com o anticorpo monoclonal, tais como anticorpos específi. cos para as imunoglobulinas. Alternativamente, os antico£ pos monoclonais podem ser marcados directamente. Uma larga variedade de marcadores pode ser utilizada, tal como radionuc1 idos, agentes fluorescentes, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inibidores enzimáticos, ligandos (particularmente haptenos), etc. Existem nu merosos tipos de imunoensaios e, por exemplo, alguns incluem os descritos nas Patentes Norte Americanas NQ 3.817.827;

5- Um método de produção de anticorpos monoclonais para tratamento de bacteremias e/ou septicémias, caracterizado pelo facto de compreender o cultivo de uma linha celular, conforme reivindicado nas reivindicações 1 a 3, e a recuperação dos anticorpos monoclonais produzidos pela linha celular.

6- Um método de produção de uma composição capaz de tratar ou evitar as infecções bacterianas possuindo endotoxinas, caracterizado pelo facto de compreender o cultivo de qualquer uma das linhas celulares das reivindicações 1 a 3, e a recuperação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares.

7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de compreender ainda o passo de adição de um veículo farmaceuticamente aceitável.

7,4 e resuspendidas em meio novo contendo actinomicina D (1 pg/ml). As células foram depois plaqueadas em placas 4 de microtitulaçao com 96 poços (5-7x10 células/poço) .

Após duas horas de cultura, amostras diluídas em série foram adicionadas aos poços, (menos de 10-20% de soro) e as placas foram incubadas durante a noite (5% CC^r 37°C). As amostras foram tratadas em quadriplicado. No dia seguinte, após observação microscópica, o meio foi decantado e os poços cheios com uma solução de violeta cristal a 0,2%, formalina a 10% e fosfato 0,01 pH 7-7,5 durante 5 minutos, lavados cuidadosamente com água e secos. 0 grau de lise foi quantificado espectrofotometricamente (550-570 nM) num leitor de placas de microtitulação. Os resultados testes são expressos como U/ml, sendo a uni dade (U) definida como a quantidade de caquectina resultante da lise de 50% das células.

Teste de Neutralização In Vitro

Mistura-se caquectina humana recombinante (20 ng/ml em Tris NC1 0,02 M, pH 8,0, 0,15 M NaCl, lmg/ml BSA) com volumes iguais de anticorpo diluído e incubam-se a 37°C durante 60 minutos. A mistura é diluída 1:10, com meio novo contendo actinomicina D (pg/ml); e adiciona-se em quadriplicado 0,1 ml amostras (duplas) diluídas em série, aos poços das placas de microtitulação. A actividade citolitica residual é determinada usando um ensaio de citoxicidade das células L929 .

Caracterização dos Anticorpos Monoclonais

Foram identificados e subclonados catorze hibridomas positivos para a caquectina. Os anticorpos produ zidos por estes hibridomas foram caracterizados pela sua capacidade para competir com anticorpo monoclonal 18-1-1. (Tracey, et al., Nature 330:662-664 (1987) aqui incorpo21 num rado para referência) para a ligação à caquectina ELISA. Como foi mostrado na Tabela 1, os anticorpos monoclonais dividem-se em três classes; os que não competem com os 18-1-1, os que o fazem, e os que mostram competição intermédia. Realizou-se um teste de captura de caquectina, para verificar que esses anticorpos que não competem com o 18-1-1 são especl ficos para a caquectina. Os anticorpos monoclonais para capturar a caquectina foram ligados numa fase sólida,e o anticorpo monoclonal 18-1-1 foi usado como o anticorpo mar cado. Neste teste todos os anticorpos monoclonais eram es peclficos para a caquectina.

Foram também realizadas experiências com meio condicionado^ a partir das células dos hibridomas,para determinar até que ponto o Mabs neutraliza a actividade de£5 truidora celular da caquectina. Todos os 14 anticorpos monoclonais foram produzidos nos fluidos ascíticos de ratos para posterior caracterização. Foi determinada a eficácia dos anticorpos monoclonais purificados na protecção das células L929 contra a destruição pela caquectina. A actividade neutra 1izadora do MAb 1-2-4B1 foi confirmada com o material purificado. Incubações de MAb 2-2-3E3 (50 ng/ml) com igual volume de caquectina humana recombinante (20 ng/ /ml) a 37°C durante 60 minutos, mostraram que 50% da acti. vidade citolítica da caquectina foi neutralizada, como determinada pelo ensaio de destruição das células L929. Como foi mostrado na Tabela 1, o MAb 2-2-3E3, que reconhece o mesmo epítopo que MAb 18-1-1, é necessário em 1/8 da quantidade do 18-1-1 para a protecção celular.

A Tabela 1 mostra também que a maioria dos anticorpos com a mesma especificidade do 18-1-1 neutralizava a caquectina (a 100%), nos ensaios de destruição das células L929 . Outros anticorpos, tais como 1-2-4B1, que têm especificidades epitópicas diferentes daquelas do 18-1-1, também possuem actividade neutralizante significativa.

TABELA 1

Perfildos Anticorpos Monoclonais Reactivos com Caquectina Humana

Hibridoma MAb, tipo Ensaio de Competição ^a com 18-1-lk

Ensaio de Neutralização

Meio Ig Purificado ng.

8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de compreender ainda a adição de um segundo anticorpo monocional capaz de se ligar à caquectina humana e de reconhecer um epitopo distinto do epitopo reconhecido pelos anticorpos produzidos pelos Número de Acesso ATCC, HB9736 ou HB9737.

9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de compreender o passo de adição de um agente antibiótico ou uma fracção gama globulina do plasma sanguíneo humano.

10- Método de utilização de uma composição incluindo anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares das reivindicações 1-3, um veículo farmaceuticamente aceitável e uma fracção gama globulina proveniente do plasma sanguíneo humano, caracterizado pelo facto de a fracção gama globulina proveniente do plasma sanguíneo humano ser obtida a partir de seres humanos exibindo elevados níveis de imunoglobulinas reactivas com as bactérias de endotoxinas para o tratamento de infecções bacterianas possuindo endotoxinas.

10% de soro de cabra).

c) As linhas celulares 1-2-4B1 e 2-2-3E3 foram depositadas com A.T.C.C. e designadas pelos Números de Acesso HB9737 e HB9736, respectivamente.

Aos babuínos admistrou-se intravenosamente uma infusão LD₁₀₀ de Escherichia coli (E_. coli) de duas horas. Os animais foram monitorizados durante 10 horas e observa dos até â morte, ou durante um máximo de 7 dias. A seguir â infusão de duas horas de E. coli, administrou-se a intervalos designados o antibiótico aminoglicosídeo, gentamicina. Um bolus intravenoso do fragmento 2-2-3E3 F(ab')₂do anticorpo monoclonal anti-TNF (10 mg/kg) foi administrado a quatro babuínos a T+30 minutos (um quarto da via através da infusão bacteriana i.e., post-treatment). A um babuíno adicional administrou-se a mesma dose de E. co24 li mais gentamicina e tratou-se com um controlo isotípico de um fragmento F(ab’) irrelevante.

11- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto dos anticorpos monoclonais serem ainda tratados para produzir fragmentos dos anticorpos monoclonais e recuperando-se os fragmentos dos anticorpos monoclonais capazes de ligação à caquectina.

12- Um método para a produção de uma composição para o tratamento de um indivíduo sensível a bacteremia e/ou septicemia, caracterizado pelo facto de compreender o cultivo de qualquer uma das linhas celulares, conforme reivindicado nas reivindicações 1 a 3, e a recuperação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares.

13- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de compreender ainda o passo de adição de um veículo farmaceuticamente aceitável.

14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender ainda a adição de um segundo anticorpo monoclonal capaz de ligação à caquectina humana e de reconhecer um epítopo distinto do epítopo reconhecido pelos anticorpos produzidos pelos Números de Acesso ATCC, HB9736 ou HB9737.

15- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender ainda a fase de adição de um agente antibiótico ou de uma fracção gama globulina do plasma sanguíneo humano.

16- Um método de utilização de uma composição constituída pelos anticorpos monoclonais recuperados das linhas celulares das reivindicações 1-3, um veículo farmaceuticamente aceitável e uma fracção gama globulina proveniente do plasma sanguíneo humano, caracterizado pelo facto de a fracção gama globulina proveniente do plasma sanguíneo humano ser obtida a partir de seres humanos exibindo níveis elevados de imunoglobulinas reactivas com bactérias possuindo endotoxinas, para o tratamento de bactérias e/ou septicémias.

17- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto de os anticorpos monoclonais serem ainda tratados para produzir fragmentos dos anticorpos monoclonais e recuperando-se os fragmentos dos anticorpos monoclonais capazes de se ligar à caquectina.

18- Anticorpos monoclonais, caracaterizados pelo facto de serem produzidos pelas linhas celulares das reivindicações 1 a 3.

18-1-1 IgG + 4* 400 1-2-4D4 IgG 4* 4 1-2-4B2 IgM - - l-2-4Bl^C IgG - 4- 400 1-1-1F3 IgG - 4- 2-2-2FS IgG 4- 4- >800 1-1-4C8 IgG - + 2-2-3E3^C IgG + 4- 50 1-2-2F8 IgG + 4- 1-1-2E3 IgG + 4- 200 1-2-2A1 IgG + 4- 2-3-1A8 IgG + 4- 1-2-4C6 IgG 4- —

a) Determinado por SDS-PAGE de MAb purificado parcialmente a partir de fluidos ascíticos por precipitação com sulfato de amónia.

b) Determinado num ELISA de Competição de Fase Sólida como a seguir se refere: foram adicionados, a cada poço, meio condicionado de culturas de hibridomas de 24 hr (50 ^ul),e 18-1-1 marcado-HRP (25 μ 1, 0,2 pg/ml em PBS +

19- Anticorpos monoclonais, caracterizados pelo facto de serem produzidos pelas linhas celulares da reivindicação 3.

20- Um conjunto de materiais para a detecção da caquectina humana, caracterizado pelo facto de compreender anticorpos monoclonais produzidos por qualquer uma das linhas celulares da reivindicação 3 e marcadores fornecendo um sinal detectável, covalentemente ligados ao referido anticorpo ou ligados a segundos anticorpos reactivos com cada um dos referidos anticorpos monoclonais.