PT91088B - Processo de preparacao de composicoes a base de alfa-,beta- ou gama- -cilcodextrinas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 91 088

REQUERENTE: THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA, norte-americana (Estado de Pennsylvania), com sede em 133 South 36th Street, Philadelphia, PA 19104, Estados Unidos da América.

EPIGRAFE: ·’ PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES A

BASE DE ALFA-,BETA-OU GAMA-CICLODEXTRI NAS ”

INVENTORES: Steven A.Roth, Paul B. Weisz, George Farn bach, David B.Weiner, Mark I. Greene e William V. Williams.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.® da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América em 07 de Julho de 1988, em 28 de Junho de 1989, sob os n⁹s.07/216 176 e 07/373.005, respectivamente.

1NP1 MOO 113 RF 18732

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Ref: 6749-009-118 .

PATENTE NS. 91 088 2'

Processo de preparação de composições à base de alfa-, beta- ou gama-ciclodextrinas para que

THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PEN NSYLVANIA, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se a um processo de preparação de composições à base de ciclodextrinas o qual compreende a mistura de (l) um derivado de oligossacárido cíclico com (2) um ageri te anti-viral, sendo o derivado caracterizado por possuir uma solubilidade a 0°C, em água destilada, de pelo menos cerca de 20 g/ /100 ml de água.

As composições preparadas pelo presente invento são úteis na inibição de infecção de células por vírus, na inibição da trans. missão, célula a célula, de um vírus e na inibição da formação de sincícios entre células infectadas por um vírus.

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-2MEMORIA descritiva

- CAMPO DO INVENTO presente invento refere-se ao campo dos.tratamentos para infecções por vírus. Mais particularmente, este invento refere-se ao campo dos agentes activos biologicamente que interferem com, ou inibem, as interacções vírus-célula hospedeira por ligação com o(s) locais receptor(es) nas células hospedeiras^ou nos vírus, ou em ambos.

- ANTECEDENTES DO INVENTO 2.1 - HIV 'ΤΟ .Síndroma da Imuno Deficiência Adquirida (SIDA) é uma das doenças mais temidas no mundo de hoje. A infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV-l), considerada como a causa da SIDA é quase sempre fatal. Os sintomas da doença podem levar anos a desenvolver-se, facilitando como tal a disseminação desta doença fatal por pessoas que desconhecem que têm o vírus. Os tratamentos para a SIDA são limitados e não têm tido sucesso no controlo da doença.

z

E geralmente aceite que uma glicoproteína de envólucro de HIV-1 joga um papel chave no processo de infecção das células de tecido humano pelo vírus. A glicoproteína de envólucro consiste em duas porções principais de glicoproteina-gp 120 e gp 41. Crê-se que a gp 120 é a parte mais exterior do complexo composto por estas duas glicoproteinas. Crê-se que a ligação da partícula de HIV-1 às células humanas, um acontecimento chave na infecção das células com o vírus, requer a ligação entre a gp 120 e um complexo proteica receptor conhecido como CD4 em certas células humanas.

A expressão de CD4 nas células humanas revelou aumentar a susceptibilidade da ligação, a penetração e infecção por HIV-1. Pensa-se que a CD4, uma glicoproteína da superfície celular com 55 000 dalton, representa um receptor de superfície celular ao qual a glicoproteína de envólucro do HIV-1 (gp 120) se liga. Esta interacção facilita provavelmente os acontecimentos necessários

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-3à fusão virai com a membrana de plasma e a subsequente entrada na célula.

Crê-se que há pelo menos três locais de ligação separados na molécula de gp 120 que se combinam para formar um local de ligação de alta afinidade pelo receptor CD4. Esta afinidade pelo receptor CD4 é extremamente forte e esta afinidade de ligação pode deslocar ou impedir a ligação de anticorpos produzidos pelo hospedeiro na sua defesa imunolégica Standard. Por exemplo, a maior parte dos doentes com SIDA e com ARC (complexo relacionado com a SIDA) têm níveis elevados de anticorpos para gp 120, contudo a interacção gp 120-CD4 pode deslocar o anticorpo ligado de mo do que se pode esperar que as vacinas dirigidas contra a gp 120 sejam ineficazes, uma vez que os anticorpos que induzem no hospedeiro serão relativamente ineficazes. Um composto, comercialmente disponível, que é útil como agente anti-infeccioso é uma forma de CD4. Crê-se que o composto resulta porque se liga à gp 120 tão fortemente como a CD4 natural. Deste modo, se administrada em concentrações suficientemente altas, a CD4 livre (administrada) ligar-se-á a toda a gp 120 virai e evitará a sua ligação ao CD4 das células hospedeiras.

vírus HIV—1 revelou infectar preferencialmente as células que expressam a glicoprotelna de superfície CD4. Crê-se que este tropismo resulta de interacçães entre a gp 120 de envólucro do vírus e uma glicoprotelna de local de ligação de grande afinidade CD4 que permite a absorção virai. Seguidamente à ligação inicial do vírus à molécula de CD4 de superfície da célula, crê-se que são importantes outras regiães do envólucro do virus na fusão inicial entre as membranas virais e celulares. Pensa-se que esta interacção precede a entrada , descapsulagem e replicação virais.

Embora exista muita evidência a suportar a sequência de acontecimentos anteriormente exposta, vários estudos têm demonstrado que a CD4 pode ser necessária, mas não suficiente, para mediar a entrada de HIU-1 nas células. Estas experiências têm usado células primárias expressando a CD4 e linhas de células humanas transfectadas com CD4; estas células ligam e internalizam o

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-4- ¹ / virus KIU-1. Adicionalmente, os monocitos e algumas linhas de células B raras que são infectáveis por HIU-1 expressam mRNA codificando potencialmente proteínas CD4. Finalmente, os anticorpos para epitopos específicos CD4 inibem a ligação virai e formação de sincícios bem como a infecção virai.

A maior parte das células murinas que expressam a glicoproteina humana CD4 ligam-se ao HIU-1 mas não formam facilmente sincícios e não são facilmente infectadas. Adicionalmente foi revelado que os anticorpos que quebram as interacções vírus-CD4 não bloqueiam a infecção virai de certas linhas de células neurónicas humanas. Estas últimas observações sugerem que outros factores e/ou outras moléculas presentes nas células humanas para lá da CD4 podem ser operantes na penetração do HIV—1.

Sabe-se que os receptores de superfície da célula ocorrem em muitos tipos de células. Crê-se que estes receptores são importantes numa larga variedade de funções celulares tais como os processos de reconhecimento célula-célula, regulação do crescimen to, regulação hormonal e metabólica e agregação estrutural das c_é lulas. Alguns destes receptores de superfície de célula, como por exemplo o receptor CD4, são considerados glicoproteinas. As glicoproteínas são moléculas compreendendo uma região proteica l_i gada a uma região polissacarídica. A região proteica constitui tipicamente a maior parte da molécula. Os ligandos de alguns receptores, tais como a gp 120, a glicoproteína de envólucro do HIV-1 que se liga ao receptor CD4, são também glicoproteínas. Crê -se que a porção polissacarídica da molécula de glicoproteína joga um papel na interacção entre o receptor e o seu ligando e é im portante para conferir especificidade à ligação receptor-ligando pelo menos nalguns casos.

2.2 - POLISSACARIDOS COMO AGENTES TERAPÊUTICOS

Os polissacáridos são polímeros biologicamente importantes compostos por moléculas de açúcares simples ligadas. Estas substâncias estão sempre presentes em organismos biológicos. 0 amj. do é um polissacárido usualmente conhecido tal como o são muitas composições de ocorrência natural. Sabe-se que pequenos segmen69 589

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-5tos de cadeias de polissacáridos são importantes nas propriedades físicas e químicas de muitas proteínas - particularmente em organismos eucariotas. Sabe-se que vários polissacáridos e seus der_i vados são importantes nos fenómenos de superfície em sistemas bio lógicos. A heparina, por exemplo, é uma mistura de polissacáridos polissulfatados com pesos moleculares variando entre cerca de 5 000 e 40 000; é preparada comercialmente a partir de material biológico tal como tecido do pulmão. As substâncias contidas na heparina são surfactantes biológicos importantes e também previnem a formação de coágulos no sangue. Sabe-se que a heparina e as substâncias semelhantes à heparina previnem a adesão de bactérias potencialmente infecciosas a superfícies na bexiga urinária, uretra e uretéres.

Embora a heparina tenha sido durante muito tempo usada em medicina para tratar coágulos sanguíneos, a heparina tem, recente mente, suscitado a atenção de investigadores para outros usos. Science Focus, Netu York Academy of Sciences, 2(3): 1, 1988 revela que a heparina pode inibir o HIV, o agente virai que causa a SIDA, em células seleccionadas, num estádio do ciclo, reprodutivo do vírus. Contudo, a heparina é um anticoagulante forte, muito conhecido e o seu uso continuado em mamíferos pode levar a desordens hemorrágicas. Mais ainda, a heparina comercial é uma mistura heterogénea de substâncias derivadas de fontes naturais.

Mitsuya et al. , Science, 240: 646-649 (1988) demonstraram que o uso de polidextranos lineares poli-sulfatados de alto peso molecular (P.M de aproximadamente 8 000) podem inibir a infecção por HIV-1 de certos glóbulos brancos. Baba et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 6132-6136 demonstrou que o sulfato de dextrana (P.M. 5 000) e a heparina podem inibir a infecção por HIV-1 de certos glóbulos brancos. A Patente americana N9. 4 733 446, 1988 revela o uso de carragenanos ou mistura de carregenanos no tratamento da SIDA ou outras infecçães por retrovírus. Os carragenanos estarão na gama de P.M. de 5 000 - 500 000 variando a maioria entre P.M. 100 000 e 500 000. Contudo não está claro se este fenómeno é um efeito específico ou não específico deste composto, uma vez que as substâncias de alto peso molecular deste tipo po69 589

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-6dem ter efeitos de membrana não específicos nas propriedades lipi. dicas da superfície da célula e da superfície do envelope virai.

Hais ainda, tal como a heparina, o composto de alto peso molecular é fortemente anticoagulante.

tratamento de indivíduos infectados com HIV-1 tem sido complicado pela capacidade de ligação do vírus às células de mami feros e a extrema toxicidade de infecção com o vírus. Há um potencial para infectar inadvertidamente indivíduos saudáveis com apenas HIV-1 completo parcialmente inactivado ou componentes do vírus, como parte de uma vacina. Os esforços para controlar o v_í rus através de drogas não tiveram sucesso até à data. São necessários meios alternativos de tratamento de indivíduos infectados com HIV-1, bem como métodos alternativos de prevenção ou inibição de infecção de células com HIV-1 que não sejam tóxicos para o indivíduo infectado com HIV-1 e que sejam seguros para os indivíduos não infectados com o vírus.

- SUMARIO DD INVENTO presente invento proporciona métodos novos para inibir a infecção de células por um vírus usando um carbo-hidrato como agente de bloqueio. 0 invento é também dirigido a métodos para a inibição da transmissão célula a célula do vírus usando um carbo-hidrato comoagente de bloqueio. 0 agente de bloqueio carbo-hidrato é capaz de interagir com as células do hospedeiro e interfe re com a ligação do vírus às células. De preferência o agente de bloqueio carbo-hidrato é um derivado de um oligossacárido cíclico muito solúvel em água contendo até cerca de doze monómeros de aç_ú car. 0 derivado de oligossacárido cíclico pode conter substituin tes iónicos e/ou não iónicos. Tal como é usado no presente pedido o termo muito solúvel em água pretende englobar uma solubil_i dade medida a 0°C, de pelo menos cerca de 15 g/lOO ml em água des. tilada, preferencialmente de pelo menos cerca de 20 g/lOO ml, mais preferencialmente maior que 30 g/lOO ml. De preferência, o oligossacárido cíclico tem cerca de seis a oito monómeros de açúcar.

Este invento também fornece um método de inibição da for69 5Θ9

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-7mação de sincícios entre células, compreendendo proporcionar um agente bloqueador carbo-hidrato que seja capaz de interagir com as referidas células ou vírus, compreendendo o referido agente bloqueador carbo-hidrato um derivado de oligossacárido cíclico contendo até cerca doze açúcares, em que o dito derivado é caracterizado por uma solubilidade de pelo menos 20 g/100 ml. 0 agente é administrado às referidas células sob condições seleccionadas para causar a interacção do derivado de oligossacárido cíclico com as referidas células, inibindo assim a formação de sincíci os. Noutra concretização, os derivados de oligossacárido cíclicos do presente invento podem inibir a formação de sincícios por administração do agente de bloqueio carbo-hidrato sob condições em que o vírus é impedido de se ligar à célula.

Este invento fornece ainda uma composição para inibir a infecção por vírus, em mamíferos, incluindo o Homem, compreendendo (1) um derivado, muito solúvel em água, de um oligossacárido cíclico em combinação com (2) pelo menos um agente antiviral, sen do o referido derivado caracterizado por uma solubilidade em água destilada de pelo menos cerca de 20 gramas por 100 mililitros de água a 09C. As composições podem também ser usadas para inibir a transmissão célula a célula do vírus. As composições, noutra con cretização, podem ser usadas para inibir a formação de sincícios em células infectadas.

invento fornece adieionalmente uma composição para inibir a infecção por retrovírus em mamíferos incluindo humanos compreendendo (1) um derivado de um oligossacárido cíclico, muito sei lúvel em água em combinação com (2) pelo menos um composto orgâni co modulador do crescimento celular, esteróide ou não esteróide, em que o composto esteróide é desprovido de actividade glucocort_i cóide e o referido derivado é caracterizado por uma solubilidade em água destilada de pelo menos 20 gramas por 100 mililitros de água a 09C. Numa concretização, estas composições podem ser usadas para tratar o sarcoma de Kaposi, muitas vezes manifestado em pacientes com SIDA. As composições podem também ser usadas para prevenir a transmissão célula a célula do vírus.

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-8Ainda é revelada uma composição para inibir a infecção por retrovírus em mamíferos incluindo o Homem, compreendendo (l) um derivado de um oligossacárido cíclico, muito solúvel em água, em combinação com (2) pelo menos um agente antiviral e (3) pelo menos um composto orgânico modulador do crescimento, esteróide ou não esteróide, em que o composto esteróide é desprovido de actividade glucocorticóide e o referido derivada é caracterizado por uma solubilidade em água destilada de pelo menos 20 gramas por 100 mililitros de água a OSC. Numa concretização, estas composições podem ser usadas para tratar o sarcoma de Kaposi, muitas vezes manifestado em pacientes com SIDA.

- BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra a formação de sinclcios na presença (A) ou ausência (B) de sulfato de ^3 -ciclodextrina 32 0

A figura 2 ilustra os efeitos de ciclodextrina e derivados da ciclodextrina na infecciosidade do HIV, determinados pela actividade da transcriptase inversa. As amostras ensaiadas foram (A) células de controlo não tratadas, (B) anel de /3-ciclodextrina não substituído, (C) anel de ^-ciclodextrina parcialmente sulfatado, (D) anel de β-cicl odex trina profilado, (0) anel de y3-cicl_o dextrina sulfatado e (F) anel de /3-ciclodextrina metilado. 0s números indicam diluições /2 dos compostos teste com 1 = 2,5 mM de concentração do composto.

A figura 3 mostra o efeito do tetradeca-sulfato de beta-ciclodextrina (yá-CD-14S ou yS-CD-TDS) na produção de RNA de HIV. As partículas de vírus foram incubadas com células alvo na presen ça ou ausência de y3-CD-145 1M. 72 horas após infecção, as células foram lavadas e realizaram-se testes de dot blot para detejr minar a presença ou ausência de produção de RNA virai. Em (A), as células alvo foram infectadas na presença de β-ciclodextrina sul fatada (faixa A), na ausência de ciclodextrinas (faixa B), ou na presença de yi-ciclodextrinas não substituídas (faixa C). As diluições ^ί/2 das células processam-se da esquerda para a direita, começando com 10 células/cavidade utilizadas. Em (Β), as células infectadas viralmente (+) ou não infectadas (-) foram testa69 589

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-9das quando à sua capacidade de produzir RNA virai por análise dot blot. CD = células infectadas incubadas com /3-CD-14S 1 mM. As diluições ¹/2 das células dispõem-se de cima para baixo, começando com 10 células/cavidade.

A figura 4 mostra uma micrografia electrónica de partículas de HIU-1 produzida por células H9 infectadas na presença de /3-CD-14S 1 mM. Note-se a morfologia madura das partículas virais produzidas (acima à esquerda) bem como o desenvolvimento do vírus.

A figura 5 mostra a ligação do anticorpo monoclonal na presença de /3-CD-14S 1 ρβ. í\ linha humana de células T CEM foi pre-incubada com /3-CD-14S 1 M, e depois incubada com vários anti. corpos monoclonais como se nota na secção 6.1, infra. Ds histogramas de fluorescência mostram a intensidade relativa de fluores^ cência (abcissa) relativamente ao número de células (ordenada) p_a ra cada monoclonal listado. A ligação do anticorpo primária foi determinada na presença (direita) ou ausência (esquerda) de y3-CD-145.

A Figura 6 compara os efeitos do poli-sulfato de dextrana e das y3-cicl odextrinas substituídas na infecciosidade de HIU. Em (A), o grau de inibição dos sincícios ê mostrado em ordenada para cada composto adicionado. SUL = /3-CD-14S 600 ^iM, AL = /3-CD não substituído 600 ytM, Pro = /3-CD propoxilado 600 y<M, 2MET = y3-CD metoxilado 300 ^tM, DS5 = sulfato de dextrana 5 000 600 yUM, DS500 = = sulfato de dextrana 500 000 600 ycM. Apresentam-se os resultados para cada um dos 3 pontos temporais. Apresentam-se em (B) os resultados semelhantes utilizando os testes com transcriptase inversa. As partículas de vírus infecciosas foram incubadas na pre sença de y3-ciclodextrinas sulfatada (faixa l), sulfato de dextra na 5 000 (faixa 2) ou meios (faixa 3) durante 6 dias, tempo após o qual as células foram ressuspensas em meios frescos e deixadas incubar durante mais 10 dias antes de serem recolhidas. A activi. dade da transcriptase inversa foi determinada como se descreveu na Secção 6.1, infra. As diluições ¹/2 do composto adicionado são apresentadas de baixo (concentração mais alta a 2,5 mM) para cima (concentração mais baixa).

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-105 - DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO presente invento fornece métodos para inibir a infecção de células por um virus que emprega um agente bloqueador carbo-hidrato capaz de interactuar com células de modo a interferir com a ligação do vírus com as células. 0 invento também se refere a métodos para o uso de tais agentes bloqueadores carbo-hidrato para bloquear a transmissão célula a célula do vírus. 0 inveri to proporciona ainda métodos que utilizam esses agentes bloqueada res carbo-hidrato para inibir a formação de sincícios. 0 invento refere-se ainda a uma composição que compreende um agente de bloqueio carbo-hidrato em combinação com pelo menos um agente antiv_i ral. Também é proporcionada uma composição que compreende um ageri te bloqueador carbo-hidrato em combinação com pelo menos um corapos^ to orgânico esteróide ou não esteróide em que o esteróide não cojn tenha actividade glucocorticóide.

5.1 - AGENTES BLOQUEADORES CARBO-HIDRATO: OLIGOSSACÁRIDOS

Os agentes bloqueadores carbo-hidrato adequados para uso de acordo com o método do invento compreendem um ou mais derivados, muito solúveis em água, de oligossacáridos cíclicos possuindo até doze monómeros de açúcar. Os oligossacáridos são geralmeri te definidos como carbo-hidratos contendo dois até cerca de dez açúcares simples ligados uns aos outros. Contudo, para estes efeitos, o termo oligossacárido é usado para significar carbo-hidratos contendo de dois a cerca de doze açúcares simples ligados uns aos outros. Prefere-se o uso de oligossacáridos com menos de cerca de doze monómeros de açúcar. Os oligossacáridos cíclicos mais preferidos compreendem moléculas cíclicas com seis a oito mo némeros de açúcar tais como a alfa-, beta- ou gama-ciclodextrina. As ciclodextrinas (CDs) são oligossacáridos cíclicos não lineares com pelo menos seis unidades de glucopiranose. Embora se conheçam ciclodextrinas com até doze destas unidades, apenas os três primeiros homólogos têm sido estudados extensivamente. As designaçães comuns das ciclofextrinas de baixo peso molecular são alfa-, beta- e gama-ciclodextrinas que correspondem a 6, 7 b 8 unidades de glucopiranose, respectivamente. As ciclodextrinas são

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-11também conhecidas, por vezes, como cicloamiloses. São conhecidos um certo número de derivados de ciclodextrina. Em geral, estas ciclodextrinas modificadas quimicamente são formadas por reacção dos grupos hidroxilo primários ou secundários ligados aos carbonos 2, 3 ou 6 sem perturbar as ligaçóes hemiacetal alfa (l-4). Açúcares, que não a glucose, tais como a arabinose, galactose e outros açúcares com 5 a 6 carbonos e muitas outras formas conheci^ das dos especialistas no ramo como açúcares podem ser úteis.

De acordo com o presente invento são úteis os derivados de oligossacáridos cíclicos de grande solubilidade em água compor tando substituintes não iónicos e/ou iónicos. Os derivados de oligossacárido cíclico, altamente solúveis com água, adequados incluem os derivados alfa, beta e gama CD com substituintes não iónicos incluindo não limitativamente os substituintes alquilo tais como metilo, etilo, etc., bem como aqueles em que um número de grupos hidroxilo são substituídos por outros grupos de modo a aumentar a actividade hidrofílica do CD. Estes grupos podem incluir ésteres, éteres (por ex. alcóxi), tioésteres, tioéteres, ácidos carboxílicos, carbo-hidratos ou outros grupos que transmitam actividade hidrofílica através de constituintes polares ou de ligação de hidrogénio. A substituição pode ocorrer em alguns ou todos os grupos hidroxilo. Numa concretização preferida, os oligossacáridos cíclicos contêm cerca de 10 a cerca de 16 grupos.

Os derivados de oligossacárido cíclico úteis no presente invento são altamente hidrofílicos e como tal muito solúveis em z

água. E provavelmente importante um carácter altamente hidrofíljÍ co para permitir a interacção com as superfícies celulares. A actividade hidrofílica é provavelmente indicada grosseiramente pe. la afinidade pela água, tal como medida pela solubilidade em água. E importante medir a mesma a O^C uma vez que a temperaturas mais altas o derivado mais adequado tem solubilidades tão el_e vadas que é difícil obter medidas com sentido.

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E tido em atenção que os derivados de oligossacárido cíclicos, muito solúveis em água, comportando substituintes iónicos e/ou não iónicos podem, em alguns casos, ter propriedades uantaj_o

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-12sas e que estas estão dentro do âmbito deste invento. Embora os derivados altamente solúveis em água sejam em geral considerados úteis, preferem-se os derivados salinos. 0 termo muito solúvel tal como usado aqui refere-se a uma solubilidade de pelo menos 20 g/lOO ml medida a 0°C, preferencialmente a mais de 50 g/lOO ml.

A frase derivado salino tal como usada aqui significa um composto iónico derivado de um oligossacárido cíclico por reac ção com um reagente adequado. Os derivados salinos preferidos são proporcionados por um oligossacárido cíclico com substituintes seleccionados de entre o grupo consistindo em sulfato, fosfato, carboxilato e misturas destes, associado a um catião não tóx_i co, fisiologicamente aceitável. Muitos dos referidos derivados preferidos são compostos conhecidos (Croft e Bartech, 1985, Tetrahedron 59:1417-1474). Mas muitas formas potencialmente úteis podem ser variantes, estruturais ou químicas de compostos conhec_i dos. Algumas das formas salinas preferidas dos derivados são as formas de sódio e potássio, uma vez que estas tendem a conferir uma solubilidade em água aumentada a aniães orgânicos. Qs deriv£ dos salinos úteis exibirão condutividade electrolítica e propriedades osmóticas caracteristicas de electrólitos e poli-electrólitos quando em solução aquosa. Um derivado salino particularmente preferido seria um derivado beta-ciclodextrina contendo cerca de 12-16 grupos sulfato. Podem ser usados vários graus de sulfatação por unidade de glucose, tal como uma média de um grupo sulfato por duas unidades de glucose ou de dois grupos sulfato por uni dade de glucose. Preferem-se ciclodextrinas com cerca de dois grupos de sulfato por unidade de glucose.

que se expôs atrás teve o objectivo de proporcionar uma compreensão geral dos oligossacáridos que são provavelmente úteis na prática do presente invento. Deve compreender-se, contudo, que tais oligossacáridos são melhor descritos por aquilo que fazem do que por aquilo que são. Os oligossacáridos que são úteis aqui são os oligossacáridos que são capazes de interactuar com cê_ lulas hospedeiras potenciais de tal forma que interferem com a l_i gação dos vírus às células hospedeiras. Os especialistas no ramo

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-13saberão que □ modo de interferência com a ligação de um vírus a uma célula hospedeira variará de acordo com a ligação particular vírus-célula hospedeira que estiver em causa. Supãe-se que estão envolvidas na ligação a células hospedeiras potenciais diferentes porçSes dos oligossacáridos, de acordo com os requisitos específicos de uma interacção particular vírus-célula hospedeira.

5.2 - AGENTES ANTIVIRAIS

De acordo com uma concretização do invento, utiliza-se um derivado de oligossacárido cíclico, muito solúvel em água, em com binação com pelo menos um agente antiviral para interferir com a interacção do vírus com uma célula. Um agente antiviral é qualquer composto orgânico ou inorgânico que inibe qualquer estádio do ciclo da replicação virai incluindo, não limitativamente, a ligação do vírus à célula, entrada do vírus na célula, o des-revestimento do vírus, a inibição da replicação do ácido nucleico v_i ral, a inibição da síntese de proteína virai e a maturação da par tícula de vírus.

Um exemplo de um agente antiviral é um derivado de nucle_ó sido. Os derivados de nucleósido são formas modificadas dos nucleósidos purina (adenosina e guanosina) e pirimidina (timidina, uridina e citidina) que são os blocos de construção de RNA e DNA. Os derivados de nucleósidos que podem ser usados no invento aqui reivindicado incluem não limitativamente: AZT (3'-azido-2',3 -dideoxitimidina, azidotimidina, zidovudina);

2',3' didesoxinuclósidos incluindo 2',3' didesoxiadenosina, 2',3' didesoxiguanosina, 2’ ,3’ didesoxicitidina, 2',3' dides_o xitimidina, e 2',3' didesoxi-inosina;

3'-desoxitimidina-aleno (3'-desoxi-2' ,3'-didesidrotimidina; e

D4T (2',3'-didesidro-2',3'-didesoxitimidina).

Outros exemplos de derivados de nucleósidos incluem não limitativamente um péptido CD4 ou seus análogos derivados e hiperici na.

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-145.3 - COMPOSTOS ORGÂNICOS ESTERÓIDES E NÃO ESTEROIDSIS presente invento proporciona qualquer composição que compreenda um derivado de oligossacárido cíclico isolado ou em combinação com compostos orgânicos esteróides ou não esteróides que sejam moduladores do crescimento celular, i.e. um composto que seja capaz de alterar ou modificar o comportamento do crescimento, incluindo tanto a promoção como a inibição.

Sao preferidos entre os compostos esteróides moduladores do crescimento os esteróides inibidores do crescimento latente que não tenham actividade glucocorticóide e mineralo-corticóide, uma vez que tal actividade é um efeito secundário indesejável e limita o tamanho da dose e a extensão do uso do esteróide para os fins do presente invento. Entre estes os esteróides preferidos estão 11 alfa, 17,21-tri-hidroxipregna-4-eno-3,20-diona (ll-desoxicortisol ou cortexolona), 17-alfa,21-di-hidroxipregna-4,9-(11)-dieno-3,20-diona e tetra-hidrocortisol.

Os compostos orgânicos não esteróides podem incluir, não limitativamente compostos que podem ter natureza de péptidos, carbo-hidratos ou lípidos. Exemplos de tais compostos podem incluir não limitativamente interleucina-1, interleucina-2 e alfa, beta e gama interferões.

5.4 - APLICAÇÕES E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO presente invento fornece novos métodos de inibição da infecção de células por um vírus. Fornece-se um agente carbo-hidrato bloqueador capaz de interactuar com as células hospedeiras de modo a interferir com a ligação do vírus às células. 0 agente bloqueador carbo-hidrato compreende um ou mais oligossacáridos, com até cerca de doze monómeros de açúcar. As células hospedeiras são contactadas com o agente bloqueador carbo-hidrato numa quantidade, durante um tempo e sob condiçSes seleccionadas para efectuar a interacção do agente, bloqueador carbo-hidrato com as células do que resulta uma interferência com a ligação do vírus às células.

□ agente bloqueador carbo-hidrato é administrado às célu69 539

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-15las numa concentração eficaz para interferir com a ligação do vírus às células. A concentração de qualquer agente oligossacári. do particular administrado às células dependerá de parâmetros como a sua solubilidade no meio que rodeia as células, a sua capac_i dade para interferir com a ligação de um vírus às células hospedeiras potenciais e os seus efeitos nos outros sistemas biológicos da célula. Espera-se que as concentraçães variando entre aproximadamente 0,15 e 2 milimolar resultarão em interferência com a ligação do vírus ãs células. Os agentes bloqueadores carbo -hidrato são administrados às células durante um tempo suficiente para permitir e manter a interferência da ligação do vírus às células. Os especialistas no ramo saberão que o intervalo de tempo que um agente bloqueador carbo-hidrato particular será administra do está dependente de factores como a concentração de agente bloqueador carbo-hidrato administrado, o tipo de interacção vírus-cé lula hospedeira e a capacidade do agente bloqueador carbo-hidrato interferir com a ligação do vírus às células.

As condiçães sob as quais um agente bloqueador carbo-hidrato particular realizará a interferência com ligação do vírus às células hospedeiras potenciais podem ser determinadas com ensaios adequados tais como ensaios de inibição de sincícios descr_i to na secção 6.11, infra. Tais ensaios ajudarão a determinar as concentraçães do agente bloqueador carbo-hidrato que são mais eficazes na inibição da infecção de células com o vírus.

Os especialistas no ramo saberão que as concentraçães dos agentes bloqueadores carbo-hidrato podem ser apresentadas às cél_u las no corpo de um mamífero, incluindo humanos, através de qualquer de várias vias de administração usando dosagens que forneçam pelo menos as concentraçães acima mencionadas no meio extracelular do corpo nas superfícies das células. Estas vias de administração incluem, entre outras as vias oral, intravenosa e transdé_r mica.

Os métodos do invento são adequados para utilização no tratamento de infecçães por vírus. Eles podem ser usados com retrovírus, incluindo não limitativamente o vírus-1 da imunodefici69 589

Ref: 6749-009-118

-16ência humana (HIV-l), o vírus-2 da imunodeficiência humana (HIU-2), o vírus-I linfotrópico das células T humanas (HTLV-l), o v.í rus-II linfotrópico das células T humanas (HTLV-II), o vírus da leucose das aves, o vírus do sarcoma de Rous, o vírus da eritroblas, tose das aves, o vírus da mieloblatose das aves, o vírus da leuce mia felina e o virus da leucemia bovina. Eles podem também ser usados com paramixovírus (por exemplo o vírus do sarampo e o vírus respiratório sincicial) e o vírus do herpes (por ex. o vírus de Epstein Barr). Tais compostas podem agir de modo a interferir com a ligação do virus com as células. Tais células podem incluir não limitativamente as células 1infoblastóides (células T e células B) e monócitos.

A inibição da ligação de um virus a uma célula hospedeira potencial é considerada importante na prevenção da infecção da c_é lula com o vírus. No caso de um retrovírus tal como o HIV-1 ou HIV-2, a ligação e entrada numa célula hospedeira são partes importantes do ciclo de vida do vírus. Se o retrovírus for impedido de entrar na célula, a célula não ficará infectada com o vírus. Uma das consequências da infecção com um vírus tal como um retrovírus e mais particularmente o HIV-1, é o facto de as células começarem a fundir-se em conjunto para formar sincícios. A formação de sincícios á letal para as células afectadas.

Crê-se ainda que alguns receptores de superfície da célula são também enzimas que reconhecem certas substâncias extracelu lares possuindo resíduos de polissacáridos curtos. Crê-se que a_l guns destes receptores de superfície de células são glicosiltrans ferases que reconhecem resíduos de polissacáridos curtos presentes em glicoproteínas e outras moléculas biológicas. Crê-se que as glicoproteínas encontradas nas superfícies virais e através das quais o vírus manifesta específico de tipo de célula ou tropismos específicos da espécie, também usam tais receptores de superfície de célula/enzimas para se ligarem às células hospedeiras antes da infecção das células.

A prevenção de interacção entre o vírus e a célula hospedeira potencial é importante para minimizar a patofisiologia da

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-17doença em que a formação de sincícios é uma parte importante da acção do vírus ou agente virai no processo da doença.

invento também fornece métodos para inibição da transmissão célula a célula de um vírus. E fornecido um agente bloqueador carbo-hidrato capaz de interactuar com células hospedeiras para interferir com a transmissão do vírus de uma célula para outra célula, Exemplos não limitativos de tais células incluem as células T; células B e monócitos. As células hospedeiras são postas em contacto com o agente bloqueador carbo-hidrato numa quantidade durante um tempo e sob condiçães seleccionadas para se efectuar a interacção do agente bloqueador carbo-hidrato com as células de modo a resultar na interferência com a transmissão do vírus célula para célula. 0 agente bloqueador carbo-hidrato é um derivado de oligossacárido cíclico, muito solúvel em água. Estes métodos são adequados para uso com retrovírus incluindo, não limi. tativamente, o virus-1 da imunodeficiência humana (HIV-l), o vírus-2 da imunodeficiência humana (HIV-2), o vlrus-I linfotréfico da célula-T humana (HTVL-l), o vírus-II linfotréfico da célula-T humana HTVL-II, o vírus da leucose das aves, o vírus do sarcoma de Rous, o vírus da mieloblatose das aves, o vírus da leucemia fe lina e o vírus da leucemia bovina. Estes métodos podem também ser usados com paramixovírus (por ex. vírus do sarampo e vírus respiratório sincicial) e virus do herpes (por ex. o vírus de Eps tein Barr).

invento também proporciona métodos de inibição da formação de sincícios entre as células, Prcporciona-se um agente bloqueador carbo-hidrato que evita a interacção do vírus com a célula. Exemplos não limitativos de tais células incluem as células T, células 8 e monócitos. 0 agente bloqueador carbo-hidrato é administrado às células sob condiçães seleccionadas para per mitir ao agente interactuar com as células, inibindo assim a formação de sincícios. 0 agente bloqueador carbo-hidrato no presente invento.é um derivado de oligossacárido cíclico, muito solúvel em água. Est_es métodos são adequados para uso com retrovírus, incluindo não limitativamente o vírus-1 da imunodeficiência humana (HIV-l), o vírus-2 da imunodeficiência humana (HIV-2), o vírus

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-18-I linfotrófico das células T humanas (HTl/L-l), o vírus-II linfotrófico das células-T humanas, o vírus de leucose das aves, o vírus do sarcoma de Rous, o vírus da mieloblastose das aves, o vírus da leucemia bovina e o vírus da leucemia felina. Estes métodos podem também ser usados com paramixovírus (por ex. vírus de sarampo e o vírus respiratório sincicial) e o vírus do herpes (por ex. vírus de Epstein Barr).

A eficácia dos agentes bloqueadores carbo-hidrato na infecção pelo vírus, transmissão célula a célula do vírus e formação de sinclcios pode ser determinada utilizando procedimentos conhecidos no ramo. Uma descrição desses procedimentos é dada na Secção 6.1, infra.

invento fornece ainda composições de derivados de oligossacáridos cíclicos, muito solúveis em água, descritas na Secção 5.1, supra em combinação com agentes antivirais descritos na Secção 5.2, supra. Tais composições podem ser usadas para inibir a ligação de um vírus a uma célula. Noutra concretização, as comp_o sições podem ser usadas para inibir a transmissão célula a célula do vírus. Numa outra concretização, tais composições podem ser usadas para inibir a formação de sincícios. Estas composições p_o dem ser usadas com retrovírus, tais como o vlrus-l da imunodefic_i ência humana, o vírus-2 da imunodeficiência humana, o virus-I liri fotrófico das células-T humanas (HTLV-l), o vírus-II linfotrófico das células-T humanas (HTLU-Il), o vírus da leucose das aves, o vírus do Sarcoma de Rous, o vírus da mieloblastose das aves, o v_í rus da leucemia felina e o vírus da leucemia bovina. Adicionalmente estas composições podem ser usadas com paramixovírus (por ex. vírus do sarampo ou vírus respiratório sincicial) ou vírus do herpes (por ex. vírus de Epstein Barr). A eficácia das composições do presente invento na infecção com o vírus ou na formação de sincícios, pode ser determinada usando os procedimentos conhecidos no ramo. Uma descrição de tais procedimentos é dada na Sejç ção 6.1, infra.

invento fornece ainda composições de derivados de oligossacáridos cíclicos, muita solúveis em água, descritos na Secção 5.1, supra. Tais composições podem ser usadas para inibir a

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-19ligação de um vírus a uma célula em combinação com compostos orqâ nicos, esteróides ou não esteróides, que contenham uma actividade moduladora de crescimento descrita na Secção 5,3, supra. Estas composições podem ser usadas com retrovírus, tais como o vírus-1 da imunodeficiência humana, o vírus-2 da imunodeficiência humana, o vírus-I linfotrófico das cêlulas-T humanas (HTLV-I), o vírus-II linfotrófico das células-T humanas (HTVL-Il), vírus da leucose das aves, o vírus do sarcoma de Rous, o vírus da mieloblastose das aves, o vírus da leucemia felina e o vírus da leucemia bovina. Adicionalmente, estas composições podem ser usadas para tratar o Sarcoma de Kaposi, o qual se manifesta frequentemente nos pacientes com SIDA. A eficácia das composições do presente invento na infecção com vírus ou na formação de sincícios, pode ser determinada usando procedimentos conhecidos no ramo. Uma descrição de tais procedimentos é dada na Secção 6.1, infra.

invento fornece ainda composições de derivados de oligossacáridos cíclicos, muito solúveis em água, descritas na Secção 5.1, supra. Tais composições podem ser usadas para inibir a liga ção de um vírus a uma célula em combinação com compostos orgânicos, esteróides ou não esteróides, que contenham actividade moduladora do crescimento celular descritas na Secção 5.3 e agentes antivirais descritos na Secção 5.2, supra. Estas composições podem ser usadas com retrovírus, tais como o vírus-1 da imunodefic_i ência humana, o vírus-2 da imunodeficiência humana, o vírus-I li_n fotrôfico das células-T humanas (HTLV-l), o vírus-II linfotrófico das células-T humanas, o vírus de leucose das aves, o vírus do Sarcoma de Rous, o vírus da mieloblastose das aves, o vírus da leucemia bovina, e o vírus da leucemia felina. Adicionalmente, estas composições podem ser usadas para tratar o sarcoma de Kaposi que se manifesta frequentemente nos pacientes com SIDA. A ef_i cácia das composições do presente invento na infecção com vírus ou na formação de sincícios, pode ser determinada usando os proce dimentos conhecidos no ramo. Uma descrição de tais procedimentos é dada na Secção 6.1, infra.

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-206 - EXEMPLO: CICLODEXTRINAS SINTÉTICAS INIBEM ή INFECÇÃO POR

HIV IN VITRO

Os exemplos seguintes são apresentados como ilustrações e não como limitaçães. 0 invento foi aqui descrito com referência a certas concretizações preferidas e exemplos. Contudo variações óbvias serão evidentes para os especialistas na matéria. 0 inve_n to não deve ser considerado limitado as concretizações particular; mente exemplificadas.

6.1 - MATERIAIS E MÉTODOS ensaio de inibição da fusão (sincicios) foi levado a ca bo de acordo com procedimentos publicados (Dalgleish et al., Nature 512:765, (1984) e Sodroski et al., Nature 522:470, (1986)).

As células Sup-Tl são células alvo preferidas pelo seu alto grau de fusão celular quando co-cultivadas com linhas de células prodtj toras de HIU-1. A cultura celular é levada a cabo de acordo com o método de Dalgleish et al. (Nature 512:765, (1984)). As células Sup-Tl foram cultivadas em placas de 96 orifícios (10^ células/orifício em RPMI 1640 + 10% de FCS) e incubadas com ou sem d_i luições de tetradecassulfato de beta-ciclodextrina (3-CD-TDS ou P-CD-14S) a 5790. Adicionaram-se então células H9 infectadas com HTLV-IIIB (HIB-l) ou WMJ, 5 χ 10⁴/orificio, e o número de células gigantes mononucleadas por campo de 16 X foi contado com um micros cópio Zeiss de contraste de fase e campo invertido após 18 horas. 0s sincicios são facilmente identificados e a sua inibição de si_n cicios por diferentes diluições de /3-CD-TDS pode ser comparada com preparações sem y3-CD-TDS. Será evidente para os especialistas no ramo, que a formação de sincicios entre células susceptiueis de infecção por HIU-1 e células expressando glicoproteínas de envelope de HIU-1 representa os mesmos fenómenos moleculares envolvidos na infecção por HIU-1, mas é muito menos perigosa e p_o de ser empregue no estudo dos mecanismos de infecção e dos efeitos dos factores moduladores nos mecanismos de infecção intracel_u lares do HIU-1 sem receio de exposição ao próprio vírus.

Para se testarem diferentes diluições, prepararam-se dilui, ções de 10 vezes de uma solução 150 micromolar de /3-CD-TDS e ad_i

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-21cionaram-se directamente aos ensaios de síncícios descritos acima .

*

6.1.1 - ENSAIOS COM SINCÍCIOS

Para o ensaio de fusão de HIV-1, usaram-se células Supt Tl como células alvo. Elas fundem rapidamente quando co-cultivadas com linhas celulares produtoras de HIV-1 (H9/lIIb). Para o ensaio da fusão de célula mediada por HIV-2, usaram-se células H9 como células alvo. Elas fundem rapidamente quando co-cultivadas com linhas celulares produtoras de HIV-2 (CEMROD-2). As células infectadas com HIV foram cultivadas em placas com 96 orifícios (10⁴ células/orifleio em RPMI 1640 + 10% de FCS) e incubadas com ou sem diluição dos compostos durante 30 minutos a 37SC. As células alvo foram então adicionadas a 5 x 10^/orifício e o número de sincícios foi qualitativamente determinado apôs os períodos de incubação descritos no texto.

6.1.2

ENSAIO DA TRANSCRIPTASE INVERSA

As células infectadas foram transformadas em pelotas por centrifugação e recolheram-se 50 yj. de sobrenadantes de cultura em cada orifício para ensaio. 0 sobrenadante da cultura (25 /CL) foi cultivado em placas de fundo recondo de 96 orifícios e adicio naram-se 50 do cocktail de transcriptase a cada orifício. 0 cocktail é composto por Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, DTT 20 mM,

MnCl^ 0,6'mM, NaCl 60 mM, 0,05% de NP-40, 5 y*g/ml de dt ácido ol_i godesoxitimidílico, 10^ug/ml de poli A (ácido poli-riboadenílico) dTTP 10 de 1 Ci/mm dTTP ^^P. As placas foram então incubadas durante 60 minutos a 379C. Apôs incubação as amostras foram colo cadas em papel Whatman DEAE-81, lavadas e analisadas por contagem ou auto-radiografia directa.

6.1.3 - ANALISE D0 RNA VIRAL

Fizeram-se crescer células tratadas com vírus em cultura de tecidos e recolheram-se para ensaio 72 h após infecção. As concentrações celulares foram então ajustadas a 1 x 10^ células/ / ml com solução salina tamponada com fosfato e espalhado (spot69 589

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-22ted) directamente num screen para gene, previamente molhado, uti. lizando um equipamento de dot blot. 0 filtro foi depois dixado com NaCl a 3%, NaH^PO^ 10 mM, (pH 7,2) contendo 1% de gluteraldeí. do a 4?C durante 1 h. A mancha fixada foi então lavada três vezes com tampão proteolítico (EDTA 50 mM, Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0), yx^/ml de proteinase K) durante 30 minutos a 37SC. 0 filtro foi seco ao ar atê ser sondado. Uma sonda de Sall-xhol derivada do plasmideo plllenvl (uma oferta generosa do Dr. 0. Sodrofsky) e que codifica a região de envólucro do vírus HIV-1, HXB2, foi marcada pelo método aleatório usando tecnologia Standard e hidridado ao filtro como se descreveu anteriormente (Weiner et al., 1986, Cell Immunol. 100:197).

6.1.4 - ESTUDOS ESTRUTURAIS

As células infectadas com o vírus foram lavadas e ressuspensas em meios frescos na presença ou ausência de compostos teste. Após um período de cultura de 48 horas, as culturas foram transformadas em pelotas e fixadas em 1% de glutaraldeído, Cacodylato-HCl 0,1 M, pH 7,3 seguido por 0s0^, e embebido em resina spur para exame dessas secções por microscopia electrónica.

6.1.5 - CITOFLUOROMETRIA

Centrifugaram-se linhas de células T humanas e lavaram-se 2 X em tampão FACS (l% de albumina de soro bovino em solução sal_i na tamponada com fosfato com 0,1% de NaN,). As células foram res. suspensas a 10 /ml e pré-incubadas com ou sem y3-CD-TDS como ind_i cado. Adicionou-se então anticorpo primário durante 30 minutos adicionais e as amostras foram preparadas como se descreveu anteriormente (Williams et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 35:6433) .

6.2 - RESULTADOS

6.2.1 - INIBIÇÃO DA I MFECCI 05 IDApE DO HIV POR /3-CI CL QDEXTR I NA 5

SU35TITUIDA5

Uma faceta importante dos lentivírus humanos é a sua capa cidade de se fundirem com células alvo. Quando analisada in vitro

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-23er, linhas de células aluo humanas, a infecção mediada por HIV resulta na formação de células gigantes multinucleadas ou sincícios. Observou-se que tais sincicios contribuem para a patologia da pe_r da de imunidade das células caracteristica da infecção observada em pacientes com 5IDA. Este processo de fusão difere do mecanismo de entrada na célula de muitos outros retrovírus no facto da fusão não requerer o pH ácido das vesículas endocitóticas. Pens_a -se que a fusão da célula mediada por HIV in vitro ocorre por uma via análoga à da entrada do vírus in vivo.

Numa série de experiências preliminares, foi levada a cabo um ensaio de sincícios induzido por fusão de células Sup-Tl por HIV—1 como se descreveu na secção 6.1.1, supra. Os resultados foram ilustrados na Tabela 1.

Como se mostra na Tabela 1, observou-se inibição de sinc_í cios, numa gama de concentrações de β -CD-TDS entre 1,5 micromolar e 1500 micromolar. Pelo contrário, não se observou inibição da formação de sincícios a concentrações de 0,15 micromolar.

TABELA 1

Actividade de inibição de sinsicios; qau de formação de sincícios

Concentração de /3-CD-TDS (micromolar)

Estirpe virai	1500	150	15,0 1,50	0,15
HTLV III-B (HIV-1 IIIB)	0	2M	AL AL	AL
HTLV III WM0	0	0	1Ξ 3H	AL
a Grau de formação A=Total 0= Nula	de sincícios		Tamanhos dos sincícios S=Pequeno f':=Médio L=Grande	formados

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-24Numa série de experiências adicionais, a análise dos sincicios induzidos por HIV-1 foi levada a cabo por co-cultura de c_é lulas H9 infectadas com o isolado III —b com células Supt-1 náo i_n fectadas (linha de células CD4 + T humanas) como alvos. Para o ensaio de HIU-2, 78 células HUT infectadas, com isolado ROD-2 foram co-cultivadas com células alvo H9 (uma linha de células CD4 +

T humanas). A β-ciclodextrina sem substituintes (/3-CD) , com 4 grupos sulfato (^-CD-4S) e com 4 grupos propoxi (/$-CD-4Pr) foram tão ineficazes como os meios isoladamente, na inibição da formação de sinclcios por HIV-1. Pelo contrário, a /3-cicl odex trina com 14 grupos sulfato por molécula ( β-CD-TDS) mediou grandemente a actividade anti-sincícios como se mostra na Tabela 2 e Figura 1.

Tabela 2

Capacidade das ciclodextrinas para bloquear a entrada da HIV-1

Solubil_i Concentração (mM) de β -ciclodextrinas dade 0 9 C e/ioo

Compostos	ml 0	2,5	1,3	0,65	0,52	0,16	0,00	0,04	0,02	0,0
Controlo		4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L
Beta-CD	0,7	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L
Beta-CD-Pr	20	1 m	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L
Be ta-CD-4-7S	15	5m	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L
Beta-CD-14S	42	0	0	0	0	ls	2 m	5L	4L	4L
Beta-CD-M	52	0	0	0	0	0	0	5m	4L	4L

a Os resultados foram expressos como o número de sinclcios fornia dos: os sinclcios foram cotados numericamente de 0 a 4, sendo correspondente a sinclcios múltiplos largamente distribuídos e indicando 0 a ausência de sinclcios. 0 tamanho dos sinclcios é registado como sinclcios s=pequenos, m=médios e L=grandes.

b Beta-CD é um anel de ciclodextrina não substituído, Beta-CD-Pr e a estrutura de anel básica substituída com grupos propoxi 8_e ta-CD-145 é a estrutura anel básica completamente substituída com sulfatos, Beta-CD-M é a estrutura básica anelar completa69 589

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-25mente substituída com grupos metoxi

A β-ciclodextrina com 14 grupos metoxi (/3-CD-14Me) exibiu um maior grau de inibição de sincícios que a que foi observada com B-CD-TDS. A inibição da formação de sincícios foi observada em doses abaixo de 80

Resultados similares de indução de sincícios mediada pelo isolado ROD-2 de HIV-2 doram obtidos como se mostra na Tabela

5.

TABELA 3 g

Capacidade das ciclodextrinas para bloquear a entrada de HIV-2

Solubili. Concentração (mM) de /3-ciclodextrina dade 05 g/100

Compostos	ml H2 0	2,	5 1,3	0,63	0,32	0,16	0,08	0,04	0,02	0,01
Controlo		4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L
Beta-CD	0,7	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L	4L
Beta-CD-14S	42	0	0	0	ls	2 m	3L	4L	4L	4L
Beta-CD-M	32	0	0	0	0	0	0	3m	4L	4L
a Os resultados	foram expressos como o	número de	sincícios	for-
mados:	os sincícios	foram	cotados numericamente de	0 a 4	, s e_n

do 4 correspondente a sincícios múltiplos largamente distribuí, dos e indicando 0 a ausência de sincícios. 0 tamanho dos sincícios é registado como sincícios s = pequenos, m=médios e L = gra£t des.

b Beta-00 é anel de ciclodextrina não substituído, 8eta-CD-14S é a estrutura de anel básica completamente substituída com sulfa tos, Beta-CD-M ê a estrutura anelar básica completamente substi. tuída com grupos metoxi.

Tanto o p-CD poli-sulfatado como a β-ciclodextrina poli-metoxilada inibiram a formação de sincícios mediada por ROD-2. Contudo, o grau de inibição foi substancialmente maior com /3-CD-14Me.

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-26A capacidade das ciclodextrinas para inibir a infecção por HIV foi determinada in vitro utilizando ensaios de transcriptase inversa descritos na Secção 6.1.2, supra. Os stocks de vírus isentos de células HTVL-IIIb foram inoculados em células al. vo na presença ou ausência dos compostos sintéticos. Após um período de incubação de 10 dias, os orifícios foram recolhidos e a actividade da transcriptase inversa determinada (Figura l). A -cicladextrina em si mesma (faixa B) não exibiu inibição da infe.ç ciosidade viram uma vez que a actividade de transcriptase inversa se mostrou semelhante ao controlo de infecciosidade positivo (fai. xa A). A y3-ciclodextrina parcialmente sulfatada (caixa C) e pro poxilada (faixa D) foi essencialmente ineficaz, com uma inibição mínima da actividade transcriptase inversa. Pelo contrário, a /3-CD-14S altamente sulfatada foi extremamente eficaz na inibição da infecciosidade in vitro (faixa E). Embora alguma actividade fosse aparente a concentrações tão altas como 320 yxM (diluição 4), a actividade de transcriptase inversa foi dramaticamente inibida a concentrações tão baixas como 80 ytM (diluição 6). A y3-CD-14Me (faixa F) foi pelo menos tão eficaz, sem actividade da transcriptase inversa aparente em culturas de células em contacto com o vírus na presença de doses tão baixas como 80 a 40 jaS (diluição 7). Embora estes resultados sejam idênticos aos dos ensaios de sincícios eles sugerem que a infecciosidade virai na presença de baixas quantidades de algumas ciclodextrinas substituídas é marcadamente diminuída mesmo a concentrações que não inibem tota.1 mente a formação de sincícios.

6.2.2 - LOCAIS DE ACÇÃO DAS CICLODEXTRINAS

De modo a determinar os locais específicos de patogenese virai interrompidos pelos compostos de ciclodextrina, determinou-se a capacidade de tratamento com ciclodextrinas para afectar os níveis de transcriptase inversa das células já infectadas com HIV—1. Contrariamente aos resultados observados quando o vírus foi adicionado a células não infectadas (ver acima, Secção 6.2.l) não se observou inibição significativa da transcriptase inversa. Isto sugere que as ciclodextrinas devem exercer os seus efeitos

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-27nos primeiros estágios do ciclo de vida do vírus.

Para determinar se as ciclodextrinas interferem com os passas relevantes para a replicação virai, determinou-se a capac_i dade destes compostos para inibir a síntese do ácido nucleico virai. As partículas de vírus foram incubadas com células alvo na presença ou ausência de y3-CD-14S 1 mM. Após 72 horas de infecção, as células foram lavadas e realizaram-se ensaios dot blot para determinar a presença ou ausência de produção de RNA virai. Não se detectou ou detectou-se muito pouco RNA especifico do HIV-1 nas células alvo infectadas na presença y3-ciclodextrina sulfa tada (Figura 5A , faixa A). Nas faixas do anel não substituído e na do controlo positivo, detectou-se uma quantidade substancial de RNA virai nesta mesma altura. Contudo, a inibição da replicação do ácido nucleico virai não teve um efeito directo na máquina replicadora do vírus. As células infectadas incubadas com ^3-ciclodextrina sulfatada não foram inibidas na sua capacidade de pro duzir RNA virai (Figura 5B). Estes resultados complementam os e_n saios sincíciais e da transcriptase inversa sugerindo que os efei. tos antivirais mediados por estes compostos operam cedo no ataque virai à célula.

Embora as ^-ciclodextrinas substituídas não inibam a actividade do HNA virai ou da transcriptase inversa nas células infectadas, é possível que estes compostos interfiram com a maturação virai. Para salientar este ponto, analisámos a produção de partículas de vírus na presença de ciclodextrinas especificamente substituídas por exame de microscópico e electrónico. As células infectadas por vírus foram lavadas e ressuspensas em meios frescos na presença ou ausência dos compostos de teste. Apôs um período de cultura de 48 horas, as culturas foram transformadas em pelotas e fixadas em glutaraldeído 1%, Cacodilato-HCl 0,1 Μ, pH 7,5 seguido por OsO^ e embebidas em resina spur para exame das secções finas.

As preparações de vírus tratadas na presença de ciclodextrinas sulfatadas 500 M demonstraram regiões de grande densidade de membranas correspondentes ao desenvolvimento e separação do vi. rus. A morfologia do HIU observada neste vírus de separação

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-28(shed) era típica da família lentivirus (Figura 4). 0 exame mor fológico detalhado das partículas virais produzidas na presença de ciclodextrinas substituídas exibiram um fenotipo normal maturo de HIV. Adicionalmente, não se observou desvio significativo na razão de vírus maduro presente após o tratamento com ciclodextrina ou no número total de partículas de vírus produzidas na presen ça destes compostos. Em conjunto, estes resultados sugerem que as β-ciclodextrinas substituídas não exercem efeitos directos na produção ou maturação do vírus HIV. Elas exercem os seus efe_i tos, aparentemente, na membrana celular durante as fases iniciais do ataque à célula.

6.2.5 - INFLUENCIA DAS CICLODEXTRINAS NAS INTERAÇÕES COM CD4

As células infectadas com ambos o HIV-1 e HIV-2 expressam o antigénio de superfície CD4 das células humanas T. 0 tropismo estrito observado é uma manifestação de locais de ligação de alta afinidade revelados na glicoproteína de invólucro do retrovírus que medeiam a ligação com as células portadoras de CD4. A capac_i dade de algumas moléculas de ciclodextrina completamente substituídas de interferirem especificamente com a formação de sincícios, actividade de transcriptase inversa e a transferência do RNA virai infeccioso é idêntica aos efeitos dos anticorpos dirigidos â molécula de CD4. Um subconjunto de anticorpos anti-CD4 destrói especificamente a capacidade dos invólucros virais de interactuarem com este receptor específico. Um modo possível de acção destes compostos é a interacção com estes locais específicos no CD4. Como tal determinou-se a capacidade de y3-ciclodextrina substitu_í da 1 mM para interferir com a ligação de anticorpos monoclonais dirigidos a diferentes epitopos da glicoproteína CD4. Utilizou-se citometria de fluxo nesta investigação.

anticorpo monoclonal Leu5a liga-se à primeir/região delimitada pela cisteína da glicoproteína CD4 e demonstrou-se que interfere directamente com a ligação com HIV-1, HIV-2 bem como com SIV. 0 anticorpo monoclonal MT1151 tem sido mapeado até à segunda região delimitada pela cisteína de CD4 e está implicado em restriçães estruturais secundárias necessárias para interacções

L/._ JruGÍNAL í

599

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-29gpl2D-CD4. 0 anticorpo monoclonal 0Kt4 liga-se a uma região distai destes primeiros dois anticorpos monoclonais e está mapeada numa região que não é necessária para a reacção de ligação entre o vírus HIV e a célula CD4 positiva.

Uma comparação dos padrões de reactividade destes anticor. pos em células tratadas e de controlo demonstrou que dentro dos limites desta análise, nenhum dos epitopos reconhecidos por estes anticorpos monoclonais diminuiu a sua capacidade de interactuar com CD4 (Figura 5). Estes resultados sugerem que as interacções proteicas importantes para ligação com o CD4, de forma análoga à ligação do vírus não são alteradas pelo tratamento com ciclodextrina. Mais ainda, os resultados também sugerem que estes compos. tos não interferem com a expressão do CD4 nas células alvo. Embq ra estes resultados não excluam um efeito nas interacções gpl20-CD4, eles indicam que as ciclodextrinas não têm efeito directo nas interacções específicas proteína-proteína no local CD4.

z

6.2.4 - COMPARAÇÃO DAS CICLODEXTRINAS SUBSTITUÍDAS COM POLI-SULFAT05 DE DEXTRANO

Estudos recentes demonstraram a capacidade dos sulfatos de dextrano poli-aniónicos inibirem a infecção por HIU-1 in vitro (Mitsuya et al., 1988, Science 240:646-649 e Baba et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:6132-6136). A inibição da actividade do vírus observada com y3-ciclodextrinas substituídas pare ce semelhante à que se observou para os sulfatos de dextrano. D_e terminámos e comparámos os efeitos destes compostos e das /3-cicl.o dextrinas substituídas na formação de sincícios induzida por HIU (Figura 6A).

Após 24 horas, as β -ciclodextrinas totalmente sulfatadas e ^-ciclodextrinas totalmente metiladas exibiram uma capacidade semelhante para bloquear a infecção por HIU-1 à do sulfata de dex. trano 5 000. Todos estes compostos foram mais eficazes que o sul fato de dextrano 500 000 maior, no bloqueio da formação de sincícios. Contudo, houve uma grande diferença no tamanho do efeito anti-viral evidenciado pelas duas classes de açúcares complexos (Figura 6A e B). Após 48 horas, a actividade do sulfato de dex69 589

Ref:· 6749-009-118

-30trano 5 000 descresceu de quase 90%. Nas culturas tratadas com as ciclodextrinas metiladas ou sulfatadas, a actividade anti-sincicial permaneceu imutável durante o período de cultura. ^ste resultado tornou-se mais pronunciado após 144 horas em cultura após o que não há ou há muito pouco efeito anti-viral do sulfato de dextrano 5 000 mesmo quando presente numa gama de várias cente nas de micromolar. Contrariamente, as /6 -ciclodextrinas substituídas perderam apenas 50% da sua potência depois de 6 dias em cultura contínua.

Estes resultados foram confirmados utilizando ensaios de transcriptase inversa como indicador específico de entrada e infecciosidade virais (Figura 68). A partículas de vírus infeccio_ sas foram incubadas na presença de β-ciclodextri na sulfatada (faixa l). Sulfato de dextrano (faixa 2) ou meios (faixa 3) durante 6 dias após o que as células foram ressuspensas em meios frescos e deixadas a incubar durante mais 10 dias antes de serem recolhidas e a actividade da transcriptase inversa foi ensaiada.

A jS -ciclodextrina sulfatada mediou uma actividade anti-viral significativa mesmo após períodos prolongados de cultura de tecidos. Este resultado pode ser relacionado ccm diferenças de susceptibilj. dade entre o sulfato de dextrano e a β>-ciclodextrina sintética à degradação enzimática durante a cultura de tecidos.

6.3 - DISCUSSÃO

Demonstrámos os efeitos anti-virais dramáticos dos agentes de bloqueio virai carbo-hidrato, partícularmente as /3-ciclodextrinas sulfatadas ou metiladas completamente substituídas. Es. tes efeitos anti-virais estão intimamente associados com as cadei^ as laterais apresentadas pelo anel de ciclodextrina e não são uma função do próprio anel. Mais ainda, examinámos o efeito de várias moléculas diferentemente substituídas e concluímos que apenas um subgrupo específico de cadeias laterais são capazes de mediar efeitos significativos anti-HIV. Estes compostos parecem interfe rir com um passo inicial associado à patogénese do HIV. Há várias evidências para estas ccnclusães. As -ciclodextrinas totalmente sulfatadas não exibem efeitos detectáveis em células que já tenham

589

Ref:- 6749-009-118

-31sido infectados com HIU-1. Não se observaram efeitos na activida. de da transcriptase inversa, produção de partículas virais, ou morfologia das partículas de vírus nas linhas celulares infectadas incubadas com concentrações de ciclodextrinas que se mostraram ser protectoras em ensaios de sincícios, por ex. antes da infecção virai das células. Em contraste, a ciclodextrina, em concentrações equivalentes, bloqueia a infecção por HIU de células não infectadas como se demonstrou por ensaios de transcriptase i_n versa e a presença de RNA virai, em conjunto com a formação de si_n cicios. Conjuntamente, estes dados suportam um modelo de interfe rência na função virai nos primeiros passos do encontro entre o vírus e a célula.

Testámos a capacidade destes compostos de inibir especifi camente a ligação de anticorpos monoclonais ao receptor conhecido do HIU. Os resultados demonstram que não houve inibição significativa de anticorpos que se ligam especificamente a regiões de CD4 necessárias à função virai. Esta observação é importante uma vez que sublinha o facto do tratamento das células humanas com es tes compostos provavelmente não afectar a função deste receptor imunológico importante.

Uários estudos indicavam uma grande afinidade para absorção (adesão) às superfícies das células por glicosaminoglicanos e sacárídos sulfatados altamente hidrofílicos, incluindo poli-sul fatos de ciclodextrina (Folkman et al., 1989, Science 243:1490-1493 e Folkman e Weisz, 1989, Amer. Chem. Soc. Symp. Ser. 392: 19-32) numa variedade de circunstâncias (Folkman et al., 1989, Science 243: 1490-1493; Folkman e Weisz, 1989, Amer. Chem. Soc. Symp. Ser. 392: 19-32; Mitsuya et al., 1988, Science 240: 646-649; Ito et ai., 1987, Antiviral Ras. 7: 361-367; Declerq,

1986, 0. Med. Chem. 29: 1561-1569; Cole et al., 1986, Nature 323: :723; Hook et al., 1984, flnn. Rev. Biochem. 53:847-869 e Desomer et al., 1968, 0. Uirol 2:386-893). Com isto em vista, os nossos resultados sugerem que uma forte ligação dos agentes à membrana celular e/ou ao invólucro virai resulta em velocidades de difusão reduzidas dos receptores, influenciando como tal criticamente as cinéticas das interacções intermoleculares entre o ligando esper

Urw.!. i.CtlNÂL

5Θ9

Ref:. 6749-009-118

-32cífico virai e as moléculas celulares receptoras, através dos princípios físico-químicos clássicos (Lauffenburger e DeLisi,

1983, Internat. Rev. Cytol. 84:268-302).

Comparámos moléculas de poli-sulfatos de dextrano e de β -ciclodextrina substituídos em ensaios de sincícios de HIV-1 e transcriptase inversa. Observámos efeitos semelhantes em ambas as classes de compostos, mas encontrámos uma diferença especial na longevidade dos efeitos anti-virais mediados pelas ciclodextrinas em oposição aos sulfatos de dextrano. Os resultados ind_i cam que o composto ciclizado substituído pode ser mais estável ao contacto prolongado com células e sugerem um potencial para estes compostos serem eficazes com uma frequência de administração menor sem diminuir os desejados efeitos anti-virais. Finalmente, a observação de que esta classe de composto interfere com os estágios iniciais de patogênese dos lentivírus sugere que estes compostos sejam úteis no tratamento de outros patogénios humanos e animais com mecanismos semelhantes de entrada.

Claims (95)

1. reivindicaçUes

   1 - Processo de preparação de uma composição para inibição de infecção indesejável de células por um vírus, em mamíferos, incluindo seres humanos, caracterizado por compreender a mistura de (l) um derivado de oligossacárido cíclico com (2) um agente anti-viral, sendo o derivado caracterizado por possuir uma solubilidade a 02C, em água destilada, de pelo menos cerca de 20 g/lOO ml de água.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter cerca de seis a cerca de doze monómeros de açúcar.
3. 3 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter cer ca de seis a oito monómeros de açúcar.
4. 4 - Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido oligossacárido cíclico ser alfa-, beta- ou g_a ma-ciclodextrina.
5. 5 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado de sal aniónico da referida ciclodextrina tendo substituintes seleccionados do grupo consistindo em sulfato, fosfato, carboxilato, nitrato e suas misturas e ser associado a um catião fisiologicamente aceitável.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um sulfa to de ciclodextrina.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracteriza do por o referido sulfato de oligossacárido cíclico conter cerca de 10-16 grupos sulfato.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do por 0 referido sulfato de oligossacárido cíclico ser tetradeca. -sulfato de beta-ciclodextrina.

   69 599

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   -349 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza. do por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado não iónico do referido oligossacárido tendo substituintes se leccionados do grupo consistindo em porções alquilo, éster, éter, tio-éster, tio-éter, ácido carboxílico e carbo-hidrato.
9. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um oli. gossacárido cíclico substituído com alcoxilo.
10. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri zado por o referido oligossacárido cíclico substituído com alcox_i lo conter cerca de 10-16 grupos metoxilo.
11. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterí. zado por o referido oligossacárido cíclico substituído por alcox_i lo ser o tetradeca-metoxi-betaciclodextrina.
12. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter substituintes iónicos e não iónicos.
13. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido agente anti-viral ser um derivado de nucleósj. do.
14. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido agente anti-viral ser um péptido CD4 ou um seu análogo.
15. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido agente anti-viral ser a hipericina.
16. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido vírus ser um retrovírus.
17. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiência hu mana-1.

    1 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterí zado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiência hu mana-2.

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    -3520 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido vírus ser um paramixovírus.
18. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido vírus ser um virus herpes.
19. 22 - Processo de preparação de uma composição para inibição de infecção indesejável de células por um vírus, em mamíferos, incluindo seres humanos, caracterizado por compreender a mistura de (l) um derivado de oligossacárido cíclico com (2) um agente anti-viral, sendo derivado caracterizado por possuir uma solubil_i dade a DSC, em água destilada, de pelo menos 20 g/lOO ml de água.
20. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri. zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter cer ca de seis a cerca de doze monómeros de açúcar.
21. 24 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter cerca de seis a cerca de oito monómeros de açúcar.
22. 25 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o referido oligossacárido cíclico ser alfa-, beta- ou gama-ciclodextrina.
23. 26 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado de sal aniónico do referido oligossacárido tendo substituintes se leccionados do grupo consistindo em sulfato, fosfato, carboxilato, e suas misturas associadas com um catião fisiologicamente aceitável.
24. 27 - Processa de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser o sulfato de oligossacárido cíclico.
25. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracteri. zado por o referido sulfato de oligossacárido cíclico conter cerca de 10-16 grupos sulfato.
26. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri zado por o referido sulfato de oligossacárido cíclico ser o tetra deca-sulfato de beta-ciclodextrina.

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    -36- ‘ ..
27. 30 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado não iónico do referido oligossacárido tendo substituintes seleccionados do grupo consistindo em porçoes alquilo, éster, éter, tio-éster, tio-éter, ácido carboxílico, carbo-hidrato, halogeneto e halogeneto de alquilo.
28. 31 - Processa de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um ol_i gossacárido cíclico substituído com alcoxilo.
29. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteri. zado por o referido oligossacárido cíclico substituído com alcoxi lo conter cerca de 10-16 grupos metoxilo.
30. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteri zado por o referido oligossacárido ciclico substituído por alcoxi lo ser o tetradeca-metoxi-beta-ciclodextrina.
31. 34 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterj. zado por o referido oligossacárido ciclico substituído por alcoxi lo conter cerca de 10-16 grupos propoxi.
32. 35 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracteri zado por o referido oligossacárido ciclico substituído por alcoxi lo ser a tetradecapropoxi-ciclodextrina.
33. 36 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter substituintes iónicos e não iónicos.
34. 37 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado por o referido vírus ser um retrovírus.
35. 38 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteri zado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiência hu ma na-1.
36. 39 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteri zado por o referido retrovirus ser o vírus de imunodeficiência hu mana-2.
37. 40 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado por o referido virus ser um paramixovírus.

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    41 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri. zado por o referido vírus ser um vírus herpes. 42 - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracteri. zado por o referido agente anti-viral ser um derivado de nucleósi. do. 43 - Processo de acordo com a reivindicação 39, carac teri. zado por o referido agente anti-viral ser um péptido CD4 ou um seu análogo • 44 - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracteri. zado por o referido agente anti-viral ser a hipericina.
38. 45 - Processo de preparação de uma composição para inibição da formação de sincícios entre células infectadas por um virus, em mamíferos, incluindo seres humanos, caracterizado por compreeri der a mistura de (l) um derivado de uma ciclodextrina de oligossa^ cárido cíclico com (2) um agente anti-viral, sendo derivado carac terizado por possuir uma solubilidade a OSC, em água destilada, de pelo menos 20 g/lOO ml de água.
39. 46 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracteri zado por o referido derivado oligossacárido cíclico conter cerca de seis a cerca de doze monómeros de açúcar.
40. 47 - Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por o referido derivado oligossacárido cíclico conter cerca de seis a cerca de oito monómeros de açúcar.
41. 48 - Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o referido derivado de alfa-, beta- ou gama-ciclodextrina ser um sulfato de ciclodextrina.
42. 49 - Processo, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por o derivado do referido oligossacárido ser um derivado de sal aniónico da referida ciclodextrina tendo substituintes seleccionados do grupo consistindo em sulfato, fosfato, carboxilato, nitrato e suas misturas associadas com um catião fisiologicamenta aceitável.
43. 50 - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracteri zado por o referido sulfato de ciclodextrina conter cerca de 10-16

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    -38grupos sulfato.
44. 51 - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido sulfato de ciclodextrina ser o tetradeca-sulfato de beta-ciclodextrina.
45. 52 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterí. zado por o referido derivado de alfa-, beta- ou gama-ciclodextrina ser uma alcoxiciclodextrina.
46. 53 - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracteri. zado por a referida ciclodextrina de alcoxilo conter cerca de 10-16 grupos metoxilo.
47. 54 - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracteri. zado por a referida ciclodextrina de alcoxilo ser a tetradeca-metoxi-beta-ciclodextrina.
48. 55 - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracteri zado por a referida ciclodextrina de alcoxilo conter cerca de 10-16 grupos propoxi.
49. 56 - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracteri. zado por a referida ciclodextrina de alcoxilo ser a tetradecaprop.0 xi-ciclodextrina.
50. 57 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracter_i zado por o referido agente anti-viral ser um derivado de nucleósi do.

    5Θ - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracteri zado por o referido agente anti-viral ser um péptido CD4 ou um seu análogo.
51. 59 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracteri zado por o referido agente anti-viral ser a hipericina.
52. 60 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracteri zado por o referido vírus ser um retrovírus.
53. 61 - Processo de acordo com a reivindicação 60, caracteri zado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiência hu ma na-1.
54. 62 - Processo de acordo com a reivindicação 60, caracteri

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    Ref:. 6749-009-118

    -39zado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiência hu mana-2.
55. 63 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracter_i zado por o referido vírus ser um paramixovírus.
56. 64 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterí. zado por o referido vírus ser um vírus herpes.
57. 65 - Processo de preparação de uma composição para inibição de infecção indesejável de células por um vírus, em mamíferos incluindo seres humanos, caracterizado por compreender a mistura de (1) um derivado de oligossacárido cíclico com (2) um composto orgânico esteróide ou não esteróide modulador do crescimento celu lar latente, não possuindo o referido esteróide actividade glucocorticoide, sendo o derivado de oligossacárido cíclico caracterizado por possuir uma solubilidade a 02C, em água destilada, de p_e lo menos 20 g/lOO ml de água.
58. 66 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterí zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter ce_r ca de seis a cerca de doze monómeros de açúcar.
59. 67 - Processo, de acordo com a reivindicação 65, caracterj. zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter cer ca de seis a cerca de oito monómeros de açúcar.
60. 68 - Processo, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado por o referido oligossacárido cíclico ser alfa-, beta- ou gama-ciclodextrina.
61. 69 - Processo, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado por o derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado de sal aniónico do referido oligossacárido tendo substituintes s_e leccionados do grupo consistindo em sulfato, fosfato, carboxilato e suas misturas associadas com um catião fisiologicamente aceitável .
62. 70 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracter_i zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser sulfato de oligossacárido cíclico.

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    Ref: 6749-009-118

    -4071 - Processa de acordo com a reivindicação 70, caracteri. zado por o referido sulfato de oligossacárido cíclico conter cerca de 10-16 grupos sulfato.
63. 72 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteri. zado por o referido sulfato de oligossacárido cíclico ser o tetra deca-sulfato de beta-ciclodextrina.
64. 73 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracteri zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado não iónico do referido oligossacárido tendo substituintes seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, éster, éter, tio-éster, tio-éter, ácido carboxílico e carbo-hidrato.
65. 74 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracteri. zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um οΐχ gossacárido cíclico substituída com alcoxilo.
66. 75 - Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterj. zado por o referido oligossacárido cíclico substituído com alcox_i lo conter cerca de 10-16 grupos metoxilo.
67. 76 - Processo de acordo com a reivindicação 74, caracteri zado por o referido oligossacárido cíclico substituído por alcox_i lo ser o tetradeca-metoxi-beta-ciclodextrina.
68. 77 - Processo de acordo com a reivindicação 74, caracteri zado por o referido oligossacárido cíclico substituído por alooxi. lo conter cerca de 1C-16 grupos propoxi.
69. 78 - Processo de acordo com a reivindicação 74, caracteri. zado por o referido oligossacárido cíclico substituído por alcox_i lo ser a tetradecapropoxi-ciclodextrina.
70. 79 - Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterj. zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter subs. tituintes iónicos e não iónicos.
71. 80 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterj. zado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiência hu ma na-1.
72. 81 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracteri

    69 589

    Ref; 6749-009-118

    -41zado por o referido retrovírus ser o vírus da imunodeficiência hu ma na-2.
73. 82 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterj. zado por o esteróide ser cortisona, hidrocortisona, cortexolona ou tetra-hidrocorticol.
74. 83 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterj. zado por o composto não esteróide ser interferão-alfa, interferã_o -beta ou interferão-interferão.
75. 84 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterj. zado por o composto não esteróide ser interleuquina-1 ou interleu quina-2.
76. 85 - Processo de preparação de uma composição para inibição de infecção indesejável de células por um retrovírus, em mam_í feros, incluindo seres humanos, caracterizado por compreender a mistura de (l) um derivado de oligossacárido cíclico com (2) um composto orgânico esteróide ou não esteróide modulador do crescimento celular latente, e (3) um agente anti-viral, no qual o refe rido esteróide não possui actividade glucocorticoide e sendo derj. vado de oligossacárido cíclico caracterizado por possuir uma soIlj bilidade a 09C, em água destilada, de pelo menos 20 g/lOO ml de água.
77. 86 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterj. zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter cer ca de seis a cerca de doze monómeros de açúcar.
78. 87 - Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ccnter cerca de seis a cerca de cito monómeros de açúcar.

    83 - Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o referido oligossacárido cíclico ser alfa-, beta- cu gama-ciclodextrina.
79. 89 - Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado de sal aniónico do referido oligossacárido tendo substituintes se leccionados do grupo consistindo em sulfato, fosfato, carboxilato,

    69 589

    Ref: 6749-009-118

    -42e suas misturas associadas com um catião fisiologicamente aceitável.
80. 90 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterí zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser o sulfato de oligossacárido cíclico.
81. 91 - Processo de acordo com a reivindicação 90, caracterí zado por o referido sulfato de oligossacárido cíclico conter cerca de 10-16 grupos sulfato.
82. 92 - Processo de acordo com a reivindicação 90, caracterí zado por o referido sulfato de oligossacárido cíclico ser o tetra deca-sulfato de beta-ciclodextrina.
83. 93 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterí. zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico ser um derivado não iónico do referido oligossacárido tendo substituintes seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, éster, éter, tio-éster, tio-éter, ácido carboxílica e carbo-hidrato.
84. 94 - Processo de acordo com a reivindicação 88, caracterí zado por o referido derivado de oligossacárido cíclica ser um ol_i gossacárido cíclico substituído com alcoxilo.
85. 95 - Processo de acordo com a reivindicação 94, caracterí. zado por o referido oligossacárido cíclico substituído com alcoxi. lo conter cerca de 10-16 grupos metoxilo.
86. 96 - Processo de acordo com a reivindicação 94, caracterizado por o referido oligossacárido cíclico substituído por alco xilo ser a tetradeca-metoxi-beta-ciclodextrina.
87. 97 - Processo de acordo com a reivindicação 94, caracterí. zado por o referido oligossacárido cíclico substituído por alcoxj. lo conter cerca de 10-16 grupos propoxi.
88. 98 - Processo de acordo com a reivindicação 94, caracterí zado por o referido oligossacárido cíclico substituído por alcoxj. lo ser a tetradecapropoxi-ciclodextrina.
89. 99 - Processo de acordo com a reivindicação 94, caracterj. zado por o referido derivado de oligossacárido cíclico conter substituintes iónicos e não iónicos.

    Ref: 6749-009-118

    -45100 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterj zado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiSncia hjj mana-1.
90. 101 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o referido retrovírus ser o vírus de imunodeficiSncia humana-2.
91. 102 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o esteróide ser cortisona, hidrocortisona, cortexolona ou tetra-hidrocorticol.

    105 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterí zado por o composto não esteróide ser interferão-alfa, interferão. -beta ou interferão-interferão.
92. 104 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o composto não esteróide ser interleuquina-1 ou inter1euquina-2.
93. 105 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o referido agente anti-viral ser um derivado de nucleú sido.
94. 106 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o referido agente anti-viral ser um péptido CD4 ou um seu análogo.
95. 107 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o referido agente anti-viral ser a hipericina.

    Lisboa, vjL