PT89262B

PT89262B - Processo para a preparacao de peptideos ciclicos

Info

Publication number: PT89262B
Application number: PT89262A
Authority: PT
Inventors: Gordon Wootton; Eric Alfred Watts
Original assignee: Beecham Group Plc
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1993-12-31
Also published as: PT89262A; DK709388D0; EP0325044A2; DK709388A; JPH01211599A; ZA889479B; KR890009974A; GB8729802D0; EP0325044A3; AU2707188A

Description

Este invento diz respeito a novos peptideos cíclicos com actividade farmacológica, a um processo para a sua preparação e aplicação como substâncias de utilidade farmacêutica.

A EP-A-225020 (Beecham Group p.l.c.) descreve um grupo de peptideos compreendendo, em sequência, unidades seleccionadas de resíduos amino ácido de 17 a 24 de PVI (peptideo com vasoactividade intestinal) e consistindo, pelo menos, num resíduo de amino-ácidos 18 a 23, ou num análogo seu em que um ou mais dos resíduos de amino-ácidos é substituído por um outro amino-áido equivalente.

Descobriu-se agora num grupo de novos peptideos cíclicos baseado nos resíduos de amino-ácidos 18-23 de PVI; estes peptideos ciclicos com actividade farmacológica na redução da degradação duodenal induzida por ácido/pepsina, são, assim, de pontencial aplicação no tratamento de desarranjos gastro intestinais como a úlcera péptica.

Desta forma, o presente invento disponibiliza um peptideo cíclico de fórmula (I) farmacológicamente aceitável:

em que ^R1 ^{e R}2 são independentemente ^^CH2^n^NH2 ou (I)

I

ou (CH_O) NH-C=NH.NH em que n é 3-6;

n 2 ^H

R^ θ ^C2^H2^R7 ^em q^{ue R}7 θ fenilo substituído com um ou dois substituintes seleccionados de halogénio, hidroxi, alquilo C^_₄ e alcoxi , ou R_? é alquilo

C

1-6 ' ^R4, ^R5 e Rg são alquilos C^_2 do mesmo ou de grupos diferentes; quatro dos a são elos de amida ou elos em que a ligação amida é substituída para uma ligação estabilizada por enzimas; desde que, quando R^ for fenilo, pelo menos um dos três átomos de carbono representados na fórmula (I) ligados a R^, Rg e Rg esteja na configuração L.

Exemplos adequados de R^, Rg, Rg e R? quando é alquilo incluem metilo, etilo, ri e iso-propilo, n-, iso-, sec-, e ter-butilo.

Exempios adequados de substituintes para

R-? quando este for fenilo incluem, hidroxi, cloro, bromo, fluoro, metilo, etilo, metoxi e etoxi.

Exemplos adequados para substituições em a Χθ, de elo de amida para uma enzima estabilizada incluem -CONCH₃-, -CSNH-, -CH₂NH-, -CH=CH-(cis e trans) e -CH₂S-. A ligação de amida também pode ser estabilizada por substituição de metilo no átomo de carbono adjacente, onde for apropriado .

No que se refere à estabilização da enzima dos elos de amida referir-se-à,aqui, a seguinte literatura :

1. A. Spatola em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins¹; B. Weinstein (Ed), Mareei Dekker (New York) 1983, Vol 7 pp 267-358.

2. J. Samanen in ’J. Biochemical Polypeptides ¹ ; L.G. Gebelein

and L.E. Carraher

Jur. (Eds), Plenum (New York) 1985 pp 279-

-382 .

3. D. Tourwé in	'Janssen Chim. Acta'; F. Meskens (Ed. ) 1985,
3. (1) , 3-15 (C.A.	1985, 103, 105267).
4. J.S. Morley in	'Trends in Pharmaceutical Sciences' 1980,

p463 (publ. Elsevier).

5. V.J. Hruby in

'Life Sciences' 1982, 31, pp 189-199. Num aspecto suplementar o presente in-

vento fornece um peptideo cíclico de fórmula (IA) ou um seu sal farmacêuticamente aceitável:

Lys-/

Vai \

Ala ---Lys \

Tyr /

Leu (IA) em que os resíduos de amino-ácidos estão definidos a seguir e em que um ou mais dos resíduos amino ácido podem ser substituídos por um outro amino ácido equivalente.

Os componentes do amino ácido podem estar na forma D- cu L-.

Quando um ou mais dos resíduos de amino-ácidos foram substituídos por um outro amino ácido equivalente, estes amino-ácidos equivalentes podem ser de ocorrência natural ou não-natural, na forma L- ou na D- ou DL-, sujeitos

às limitações da fórmula (I). Os Lis-Lis-Tir (ou R^ , R₂ , R^ átomos de carbono), estão, preferêncialmente na configuração-L. Os Leu, Ala e Vai (ou R^ , R^ , Rg átomos de carbono) estão, preferêncialmente, na configuração-D.

As abreviaturas utilizadas para os amino-ácidos são as seguintes:

Amino-ácido

Abreviatura

Alanina

Ala

Leucina

Leu

Lisina

Lis

Norleucina

Nle

Fenilalanina

Fen

Tirosina

Tir

Valina

Vai

Os amino-ácidos podem considerar-se como mmbros de diferentes classes; tais conhecidos .

agrupamentos são bem

A substituição de um amino ácido de um peptideo ácido equivalente pode ser feita por um amino ácido da mesma classe, e onde um por outro amino amino-ácido se poder incluir em duas ou mais classes, tir de uma ou a substituição pode mais dessas classes.

ser feita a parAssim, por exemplo:

-alanina pode ser substituída por outro amino-ácido hidrofónorvalina

-valina pode ser substituída por outro amino-ácido hidrofóbico, p.ex. , leucina ou isoleucina

-tirosina pode ser substituída por outro amino-ácido hidrofóbico, especialmente leucina ou outro amino-ácido aromático p.ex., fenilalanina (quando um de Vai, Ala, ou Leu estiver na forma L-);

-leucina pode ser substituída por outro amino-ácido hidrofóbico , p.ex., valina ou isoleucina.

Sais de adição de ácidos podem ser, por exemplo, sais com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromidrico, ácido vatofosfórico ou ácido sulfúrico, ou ácidos orgânicos como, por exemplo, tanossulfónico , toluenossulfónico, ácido acético, ácido meácido trif luoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido salicilico, ou acetilsalicilico.

Os eompostos de fórmula (I) estão preferêncialmente na forma farmacêuticamente aceitável. Por forma farmacêuticamente aceítavel significa-se, inter alia, de um nivel de pureza farmacêuticamente aceitável excluindo aditivos farmacêuticos habituais, como diluentes e transportadores e sem incluir substâncias consideradas tóxicas a níveis normais de dosagem. Um nível de pureza farmacêuticamente aceitável será pelo menos 50% excluindo aditivos farmacêuticos habituais , de preferência 75% e com mais preferência 90% e ainda com maior preferência 95%.

O invento também fornece um processo para a preparação de um peptideo ciclico de fórmula (I) ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável, processo esse que abrange a ciclização de um peptideo linear de fórmula (II);

em que y é uma sequência amino-ácido facultativamente protegi-8-

da, correspondendo aos amino-ácidos no peptideo cíclico desejado de fórmula (I); e Q é um grupo destacável; e a partir daí, removendo, onde necessário, quaisquer grupos protectores da cadeia lateral de amino ácido e, facultativamente, formando um sal seu farmacêuticamente aceitável.

Q pode ser OH, sendo neste caso, a ciclização levada a cabo por processos de condensação convencionais, por exemplo, utilizando um agente desidratante a pH neutro, num solvente aprótico inerte, como a dimetilformamida (DMF) ou dimetilacetamida, à temperatura de -40°C a 50°C de preferência, próximo da temperatura ambiente.

Os exemplos de agentes desidratantes incluem carbodiimidas , como a diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) e diisopropilcarbodi-imida (DIC). Agentes alternativos para a promoção da condensação incluem agentes activantes‘do ácido carboxílico como a difenilfosfonil azida (DPPA).

pH pode ser ajustado utilizando um ácido ou uma base fraca apropriados como NAHCO^, ácido hidroclórico diluído, diisopropiletilamina (DIPEA) ou trietilamina.

O composto de fórmula (II) pode estar na forma de um sal, tais como aqueles com ácidos orgânicos (p.ex., o sal trifluoroacetato) ou o sal Bu^N .

Outro significado adequado para Q é , que é habitualmente obtido a partir do correspondente composto de fórmula (II) em que Q é substituído por NHNH₂ i.e. a hidrazida de fórmula (III)

H₂NNHCO (III)

composto de fórmula (III) é convertido na azida de fórmula (II), correspondente por reacção com ácido nitroso, in situ, seguida para neutralização com uma base inorgânica, como o hidrogenocarbonato de sódio ou com uma base orgânica como a trietilamina ou diisopropiletilamina.

Os reagentes que produzem ácido incluem nitritos de alquilo como o nitritode trito de isoamilo ou um sal nitrito de metal t-butilo alcalino nitroso ou nicomo o nitrito de sódio ou /

na presença de um ácido forte como o ou necessário o ácido o nitrito de potássio, o sulfúrico ou, se desejado Quando se utiliza um nitriclorídrico fosfórico.

to de alquilo a reacção é levada sos ou numa mistura de solventes a cabo em solventes não aquoaquosos/não aquosos quando se utiliza um sal, nitrito de metal alcalino. Os solventes não aquosos, incluem dioxano, clorofórmio, acetato de etilo ou diclorometano. As misturas adequadas de solventes aquosos/não aquosos incluem água com dimetilformamida (DMF), tetra-hidrofurano ou dioxano.

A azida de fórmula (II) torna-se cíclica, originando o composto de fórmula (I), desejado, sob as seguintes condições.

A selecção dos grupos protectores da factores, como as conos componentes de amino ácido e a escolha da resina funcioutilizados incluem fins, por exemplo, benz iloxicarboxilo

Em regra aqueles que substituintes uretano protectores como o (carbobenzoxi), (CBZ=Z), nilo (Boc) e 9-Fluorosenilmetiloxicarbonilo (Fmoc).

os grupos amino protectores são bem conhecidos para estes t-butiloxicarboPrefere-se utilizar o grupo Fmoc para proteger o grupo -amino nos amino-ácidos sujeitos à reacção no fim carboxilico do re-10-

ferido amino-ácido. O fim carboxilico é activado pela formação de um anidreto, (a partir do equivalente 2 mole do aminoácido protegido e DCC ou DIC num solvente como THF ou , ou pela formação de um éster activado como um fenil éster substituido, p.ex., orto- ou para-nitrofenilo ou penta-fluorofenilo. O éster activado pode ser formado in situ por quantidades equimolares de DCC ou DIC e o álcool apropriado.

A cadeia lateral de amino grupo da Lisina pode ser protegida pelo grupo Boc ou CBZ ou 2,6-Cl-CBZ. O OH da tirosina pode ser protegido por um grupo t-butilo (Bu) ou um grupo 2,6-clorobenzilo. A escolha dos grupos protectores defenderá do processo final de desprotecção, por exemplo os grupos Boc e Bu podem ser retirados pelo ácido trifluoroacético. Contudo, pode ser preferível assegurar que não há-perda de grupos protectores da cadeia lateral durante a síntese do peptideo linear e escolheu os grupos CBZ e 2,6-Cl-Bz mais estáveis em ácidos que possam ser removidos por processos hidrogenoliticos.

A desprotecção processa-se convencionalmente. Por exemplo, um tratamento prolongado com ácidos fortes como o ácido trifluoroacético (TFA), o ácido trifluorometano-sulfónico (TFMSA) ou o HF gerarão os sais correspondentes do peptideo cíclico desejado. Em alternativa pode conseguir-se uma desprotecção mais suave por métodos hidrogenoliticos onde a escolha do sal final pode ser uma função do solvente usado, p.ex., 5% Pd sobre C em etanol; água: ácido acético 8:2:1 darão o sal acetato do produto final.

A purificação do produto pode fazer-se por métodos convencionais como se descreve nos exemplos adiante apresentados.

O peptideo linear intermédio de fórmula (II) é preparado de acordo com métodos genericamente descritos em PE-A-225020, assunto que aqui está incorporado por referência .

Em regra não é critica a questão da selecção do amino-ácido para o terminal C desde que a sequência de amino-ácidos seja a sequência desejada para o peptideo ciclicizado requerido.

A selecção do primeiro amino-ácido para iniciar a cadeia não é critica, uma vez que o peptideo linear será tornado ciclico, mas podem existir outros factores que tornem preferível um amino-ácido inicial, relativamente aoutro. Por exemplo a escolha do grupo protector da cadeia lateral pode influênciar a escolha do amino-ácido N terminal, a capacidade para, selectivamente, retirar o N terminal, e a sequência pretendida de amino-ácidos no peptideo ciclico. Outros factores incluem a susceptibilidade dos amino-ácidos à racemisação (i.e. prefere-se que o primeiro amino-ácido não seja susceptível), e considerações esténicas que podem afectar a ciclização do composto de fórmula (III).

A sintese do peptideo linear, sólida, é nalisada.

forma que por fase levada a cabo por passos sobre uma resina funcioA natureza da funcionalização é escolhida de tal o peptideo linear possa ser removido de tal forma que os grupos protectores da cadeia lateral permaneçam intactos e o peptideo linear apenas tenha exposto a metade amino de terminal N e a metade ácido carboxílico terminal C.

Considera-se, geralmente, ser de boa prática, embora não seja absolutamente necessário, incorporar um amino-ácido referência entre a funcionalização para que a sintese possa ser controlada a qualquer momento por análise de amino-acido. Um grupo espaçador adequado pode ser incorporado para facilitar a ligação sintética do amino-ácido referência com a metade ligadora que linear de um modo.

ligadora. È a integridade guimica desta permite ao utilizador construir o peptideo sequêncial com um amino-ácido derivatizado adequado que permite (i) ligação do primeiro amino-ácido ao ligante (habitualmente com um elo éster) (ii) retirada selectiva da protecção do terminal N do primeiro amino-ácido para permitir a cons

trução sequencial do peptideo linear (iii) separação do peptideo linear para dar o peptideo linear, como o amino terminal N-ácido carboxílico terminal C, com a protecção da cadeia lateral intacta.

A escolha eventual de resina pode ser influenciada pela escolha do grupo funcionalizador, do comprimento do peptideo linear, se a síntese é levada a cabo de um modo manual, automático ou semi-automático. A própria resina pode estar apoiada ou existir na forma de leito livre e pode estar dispersa num solvente predeterminado.

A resina pré-peptídeo pode, assim, tomar a forma que se ilustra a seguir:

Ligador...Amino-ácido referência..Espaçador..Resina

Combinações possíveis

CH₃O

B

C

hoch₂

C-NHCH2Poliestireno

Si(CH3)3

A separação de A, B ou C dá-se com ácidos médios, por exemplo, ácido trifluoroacético 1-5% em diclorometano, ou de D com Bu₄N⁺F~ para dar o peptideo linear de fórmula (II) como o sal TFA ou o sal Bu^N⁺ respectivamente .

Os ligadores atrás referidos são conhecidos, por exemplo, os ligadores A, B e C são descritos por R.C. Sheppard e B.J. Williams em Int. J. Peptide Res. 20, 1982, 451-454.

Contudo, em larga escala, prefere-se que o peptideo linear intermédio de fórmula (II), seja preparado por métodos de solução clássica. Quando se requerem intermédios abrangendo ligações amida, estabilizada por enzima, faz-se aqui referência às referências apropriadas 1-5 que anteriormente se listaram.

O presente invento fornece, ainda, em peptideo cíclico do presente invento, num método de tratamento do corpo humano ou animal.

Onde o peptideo ciclico estiver na forma de sal seu, deve, evidentemente, ser entendido que este é um sal fisiológicamente tolerável, que é farmacêuticamente aceitável .

O peptideo ciclico do invento pode ser administrado per se ou, de preferência, como uma composição farmacêutica incluindo também um suporte farmacêuticamente aceitável.

Deste modo, o presente invento fornece, uma composição farmacêutica, que compreende um peptideo ciclico do presente invento, em mistura ou conjunção com um suporte farmacêuticamente aceitável.

A preparação pode, se desejado, estar na forma de uma embalagem acompanhada por instruções de aplicação esentas ou impressas .

De acordo com a prática farmacêutica convencional o suporte consiste num diluente, agente de enchimento, desintegrante, agente molhante, lubrificante, corante, cromatizante ou usa aditivos convencionais.

Uma ccRposição farmacêutica do invento encontra-se, de preferência, sob a forma de dose unitária.

A gama de dosagem adequada para compostos do invento pode variar de composto para composto e pode depender da condição de ser tratada. Também defenderá, inter alia, de relação potência/absorbabilidade e da forma de administração escolhida.

As composições são preparadas por mistura e são convenientemente adaptadas à administração oral ou parentérica e como tal podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, preparações liquidas para administração oral, pós, grânulos, pastilhas, pós reconstitúiveis, soluções ou suspensões injectáveis ou para infusão ou supositórios. As composições administráveis oralmente são preferidas por serem mais adequadas para utilização geral.

Os comprimidos e as cápsulas para administração oral são, habitualmente, apresentados em dose unitária e contêm excipientes convencionais como, ligantes , agentes de enchimento, diluentes, agentes para a formação de comprimidos, librificantes, desintegrantes, corantes, aromatizantes e agentes molhantes. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na arte, por exemplo com um revestimento entérico.

Agentes de enchimento adequados incluem

celulose, manitol, lactose e outros agentes similares. Desintegrantes adequados incluem amido, polivinilpolipirrolidona e derivados de amido como o glicolato de amido de sóio. Lubrificantes adequados incluem, por exemplo, o estearato de magnésio.

Agentes molhantes adequados, farmacêuticamente aceitáveis, incluem laurilossulfato de sódio. Preparações liquidas para administração oral podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções,emulsões , xaropes, ou elixires, ou podem ser apresentados como produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado, antes da utilização. Tais preparações liquidas podem conter aditivos convencionais como agentes promotores de suspensão, por exemplo sorbitol, xarope, metil-celulose, gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, gel de estearato de alumínio ou gorduras comestíveis hidrogenadas, agentes emulsificantes , por exemplo, lecitina, monooleato de sorbitano, ou acácia; veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), por exemplo, óleo de amêndoas, óleo de coco fraccionado, ésteres oleosos como os ésteres de glicerina, propilenoglicol, ou álcool etílico; conservantes, por exemplo, p-hidrobenzoato de metilo ou propilo ou ácido sórbico, e, se desejado, agentes aromatizantes ou corantes convencionais .

As preparações liquidas para administração oral estão habitualmente na forma de suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes, ou elixires ou são apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Tais preparações liquidas podem conter aditivos convencionais como agentes promotores de suspensão, agentes emulsificantes, veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestiveis), conservantes, e agentes aromatizantes ou corantes.

As composições para administração oral

-16podem ser preparadas por métodos convencionais de mistura, enchimento ou compressão. Operações de mistura repetidas podem ser utilizadas para distribuir o agente activo ao longo daquelas composições empregando grandes quantidades de enchedores. Tais operações são, evidentemente, convencionais na arte .

Para administração parentérica, preparam-se formas de dose unitária fluida contendo um composto do presente invento e um veículo estéril. 0 composto pode ser suspenso ou dissolvido, conforme o tipo de veículo e a concentração. As soluções parentéricas preparam-se normalmente por dissolução do composto no veiculo e esterilizando um frasco ou ampola adequados e de selar.

Adjuvantes como um anestésico local, conservantes e agentes tampão também são, com vantagem, dissolvidos no veiculo. Para aumentar a estabilidade, a composição pode ser congelada após o enchimento do frasco e a água retirada sob vácuo.

As preparações parentéricas são preparadas de uma forma substâncialmente igual com excepção do facto do composto ser suspenso no veiculo em vez de ser dissolvido e esterilizado por exposição de óxido de etileno antes de ser suspenso no veículo estéril. á incluído' com vantagem, na composição um surfactante ou agente molhante para facilitar a distribuição uniforme do composto do invento.

presente invento também disponibiliza um método de tratamento de mamíferos, incluindo o homem, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade efectiva, não tóxica, de um peptideo ciclico do presente invento; e um peptideo ou análogo do presente invento para aplicação farmacêutica, particularmente para utilização no tratamento da úlcera peptica.

ingrediente activo pode ser administrado, convenientemente, como uma composição farmacêutica anteriormente definida, e isto constitui um aspecto particular do presente invento.

,01 a

0,01 , por

Uma dose adequada está,

100 com mais a 2,5 mg/kg. exemplo , 1,0 por exemplo, no frequência 0,01 a 10, preUma dose diária possível a 50 mg por infusão intravea 500 mg por adminisintervalo de 0 ferêncialmente para o homem é nosa, 1,0 a 250 mg por aerosol ou 1,0 tração oral, incluindo a forma de cápsula revestida entérica.

Não são indicados efeitos toxicológicos adversos para as doses anteriormente mencionadas.

Os exemplos seguintes ilustram o invento; as descrições seguintes ilustram a preparação das resinas funcionalizadas.

Cada exemplo de peptideo cíclico foi caracterizado por clivagem acidolitica de 24 h e análise de amino-ácidos derivatizados com FITC (fenilisotiocianato) (Waters Picotag System) e espectrometria de massa por bombardeamento atómico rápido (BAR) (Jeol D χ 303).

Na parte que se segue os vários grupos protectores, reagentes e solventes são referidos por abreviaturas, por conveniência.

Abreviaturas	Grupo/reagente etc.
Boc	t-butiloxicarbonilo
Bu	t-butilo
CBZ ou Z	Benziloxicarbonilo
Fmoc	9-Fluorenilmetiloxicarbonilo
HOBT	Hidroxibenzotriazole
OPFP	Éster pentafluorofenilo
ONP	Éster para-nitrofenilo
DCC	Diciclo-hexilcarbodi-imida
DIC	Di-isopropilcarbodi-imida
DPPA	Difenilfosfonil-azida
TFA	Acido trifluoroacético
DMAP	Dimetilaminopiridina
DIPEA	Diisopropiletilamina
TFMSA	Ácido trifluorometanossulfónico
DCU	Diciclo-hexilurea
DMF	Dimetilformaniida
THF	Tetra-hidrofurano
DMA	Dimetilacetamida
DMSO	Dimetilsulfóxido

-19Preparação da Resina Funcionalizada A

ΝΉςΟΗ2Polietireno

Fmoc-Nle-OPFP v

Fmoc-Nle-NHCH2Polietireno

20% Piperidina/DMF

V

H-Nle-NHCH2Polietireno

CH₃O

O

H ch₂c-opfp

CH3O

HOCH₂ —ό Λ—OCH₂C-Nle-NHCH₂ Polietireno

Espandiu-se aminoetilpoliestireno (Bachem UK (td) (lg, 0,5 meguiv/g) por agitação sob o efeito de um jacto contínuo de bolhas de azoto em DMF/CE^Ci^ (20 ml) durante 2x15 minutos. Adicionaram-se à resina drenada Fmoc-Nle-OPFP (649 mg, 2,5 eguivs) e HOBT (169 mg) em DMF/Cf^C^ a 10% (10-15 ml) e o conjunto foi agitado durante 1 hora. A reacção foi controlada até-ao final pelo teste de ninidrina (Kaiser, E. et al. Anal. Biochem (1970) 34, 595). A resina

-20foi drenada e lavada repetidamente sob agitação similar, com

DMF (10x15 mlxl min). Foi adicionada piperidina 20% em DMF (15 ml) à resina drenada e a mistura agitada como se referiu atrás durante 3 minutos e então de novo durante 7 minutos com uma lavagem intermédia com DMF (2x15 mlxl min). A resina foi

então sujeita a uma lavagem suplementar com agitação com DMF (10x15 mlxl min). Adicionaram-se à resina drenada

4-hidroximetil-3-metoxifenoxi-acetato de (567 mg, 3 equiv (202 mg, 3 equivs) em DMF (10-15 ml) e agitou-se como anteriormente, durante 1 hora. Uma lavagem (10x15 mlxl min) deu a resina expandida, pronta çao imediata na preparação dos ácidos terminal-C linear a protecção da cadeia lateral intacta.

e HOBT conjunto,

Esta resina funcionalizada pode, em alternativa, ser lavada sucessivamente com CH₂C1₂ (10xl5mlxl min) e Et₂O anidro (10x15 mlxl min), drenada, seca em vácuo e armazenada para utilização mais tarde.

-21Preparação da Resina Funcionalisada B il

CF^OC-Poliamida (Pepsina)

Etileno diamida

O ll

Poliamida

Fmoc-Nle-OPFP

O il

Fmoc - N1 e - NH ^x^NHC-Po 1 i ami d a

20% Piperidina/DMF

NHC-Poliamida

H-Nle-NH

CH₃O

HOCH₂

NHC- Poliamida

-OPFP

Espandiu-se pepsina seca (Cambridge Research Biochemicals Ltd) (1,0 g, 0,3 mequiv.) por agitação durante a noite sob um jacto contínuo de bolhas de azoto em etilenodiamida (35-40 ml). A resina foi drenada e repetidamente lavada sob agitação semelhante com DMF (10x20 mlxl min.), DIPEA 10% em DMF (2x20 mlxl min.) e DMF (5x20 mlx 1 min.). Foram adicionados à resina drenada Fmoc-Nle-OPFP (935 mg, 6 equivs) e HOBT (243 mg) em DMF (15-20 ml) e o todo agitado durante 1 hora. A reacção foi controlada até final pelo teste Kaiser-ninidrino. A resina foi drenada e lavada repetidamente sob agitação similar com DMF (10x20 mlxl min.). Foi adicionada piperidina 10% em DMF (20 ml) à resina drenada e procedeu-se a uma agitação como anteriormente durante 3 minutos, e, então novamente, durante 7 minutos com uma lavagem intermédia (2x200 mlxl min.) com DMF. A resina foi entãosujeita a uma lavagem suplementar, com agitação, com DMF (10x20 mlxl min . ) .

Foi adicionado acetato de pentafluorofenil 4-hidroximetil-3-metoxifenoxi (681 mg, 6 equivs) e HOBT (243 mg) em DMF (20 ml) à resina drenada e o conjunto foi agitado como anteriormente durante 1 hora. A reacção foi controlada como anteriormente com o teste Kaiser.

Uma lavagem com DMF (10x20 mlxl min) deu a resina expandida adequada à preparação imediata do ácido terminal-C do peptideo, com a protecção da cadeia lateral intacta.

Esta resina funcionalisada pode, em alternativa ser, ser sucessivamente lavada com (10x20mlxl min), Et2O anidro (10x20 mlxl min) drenada, seca em vácuo e armazenada para ulterior utilização.

/~ Esta preparação difere da sugerida por Cambridge Research Biochemicals no facto de utilizar HOBT para aumentar a velocidade de acilação pelos ésteres de penta-

-23fluorofenilo7.

Exemplo 1

Ciclo-/ D-alcanil-L-Valil-L-Lisil-L-Lisil-L-Tirosil-L-Leucina7

HOCH₂

CH

ll

OCH₂C-Nle-NH

H

NHC-Poliamida

Repetido uma vez

1) (Fmoc-Leu)₂0, DMAP

2) DMF

Fmoc-Leu-OCH₂

CH

II

NHC-Poliamida

Procedimento repetido para cada Amino ácido

1) Piperidina 20%/CMF

2) Lavagem com DMF

3) Fmoc-Amino Acido-OPFP

HOBT

1) Piperidina 20% ) Lavagem com DMF

3) Lavagem com CH^Cl^

4) 1% TFA/CH₂C1₂

Boc Boc Bu i i i

H-D-Ala-Val-Lis-Li s-Ti r-Leu-OH

1) DPPA, DMF, ΝβΗΟΟβ,

N2 0° - 3 dias a tempo ambiente

2) Resina de permuta iónica em leito misto

Boc Boc Bu

D-Ala-Val-Lis-Lis-Trr-Leu

1) TFA 100¾

2) HPLC

(EI)

A resina funcionalisada Β (1 g, 0,5 meq/ /g) foi preparada como se delineou acima ou expandida do estado seco em DMF (2x200 mlxl5 min.).

Dissolveu-se Fmoc-Leu-OH (530 mg, 5 equiv) em CF^C^ (4 ml) com DMF (0,5 ml), arrefeceu-se até θ C e tratou-se com DIC (96 mg, 0,12 ml). Deixou-se que a mistura agitada atingisse a temperatura ambiente durante 20-25 min. e evaporou-se em vácuo. O resíduo foi dissovido em DMF (5-10 ml) e adicionado à resina, seguido de DMAP (9 mg). A resina foi agitada sob um jacto contínuo de azoto durante 1 h, drenada, lavada com DMF (5x20 mlx 1 min). Esta adição do primeiro amino ácido foi repetida e a resina drenada e lavada com DMF (10 x 20 ml x 1 min).

Foi adicionada à resina drenada piperidina 20% em DMF e a mistura agitada como anteriormente duran-25-

te 3 minutos e depois novamente durante 7 minutos com uma lavagem intermédia com DMF (2x15 mlxl min.). A resina foi então sujeita a um ciclo de lavagem suplementar com DMF (10x15 mlxl min) para dar a resina com o primeiro aminoacido de terminal-N desprotegido (Leu) ligado.

Os amino ácidos a seguir listados foram então adicionados à resina por passos com desprotecção por piperidina, como se descreveu atrás, após cada ligação.

Em cada caso foi adicionado HOBT (122 mg) e cada ligação deixada durante 60 minutos. O fim da reacção foi controlado pelo teste Kaiser-ninidrino.

Bu
1 Fmoc-Tir-OPFP	563	mg
Boc 1 Fmoc-Lis-OPFP
571	mg
Boc I
1 Fmoc-Lis-OPFP	571	mg
Fmoc-Val-OPFP	455	mg
Fmoc-D-Ala-OPFP	430	mg

Quando o último amino-ácido foi adicionado o terminal-N foi desprotegido como anteriormente, drenado, lavado com DMF (10x15 mlxl min.), (10x15 mlxl min.) e

Et₂O (10x15 mlxl min.) e seco em vácuo durante 2 horas.

A resina tornou a ser expandida em CH₂C1₂ (2x15 mlxl min.) drenada e tratada com TFA 1% em CH₂C1₂(10x20 mlx5 mins.). As soluções resultantes deste tratamento foram evaporadas no vácuo e o resíduo tratado com éter para dar o ácido amino-peptideo de cadeia lateral protegida, impu-26-

ro, (153 mg) FABM+1=977 utilizado sem purificação suplementar.

Esta substância (153 mg) foi dissolvida em DMF desgaseifiçado (200 ml) e arrefecido a 0°C. A solução foi tratada com DPPA (42 ul) e NaHCO^ sólido (59 mg) e deixada com agitação sob azoto durante 3 dias, atingindo a temperatura ambiente nas primeiras'6 horas. Foram adicionadas à mistura e agitadas durante 3 horas, água (5 ml) e resina de permuta iónica em leito misto Bio-Rad AG 501-X8 (3 g). A mistura foi filtrada e as substâncias insolúveis lavais com DMF (10-20 ml). O filtrado foi evaporado em vácuo e o resíduo tratado com éter para produzir o peptideo ciclico de cadeia lateral protegida, impuro, (54 mg) FABM+Na⁺=982.

Deixou-se, com agitação durante 4 horas, sob azoto, uma solução desta substância (54 mg) em TFA (10 ml) a 0°C atingindo a temperatura ambiente durante 1/2 hora. A solução foi evaporada num vácuo, tornada azeotrópica com tolueno (ca. 10 ml), depois éter (2x20 ml) para produzir um sólido gomoso. Este sólido foi dissolvido em água e liofilisado, transformando-se num sólido bronco (52 mg). Espectrometria de massa FAB revelou a presença de peptideo ciclico requerido, M+l=703 e de peptideo não ciclisado M+l=721.

Esta mistura foi sujeita a repetidas HPLC sobre coluna de fase reversa uBondapak C18 utilizando 20% MeOH: 80% contendo 0,1% TFA como eluente para produzir o composto em titulo (10 mg) sob a forma de sal trifluoroacetato. FAB M+l=703.

Exemplo 2

Ciclo-/ D-Alanil-D-Valil-L-Lisil-L-Lisi1-L-Tiros il-D-Leucina7

Repetido uma vez

O il

OCH2C-Nle-NHCH2-Poliestireno

1) (Fmoc-Leu)₂0, DMAP

2) DMF

CH,0 \

Fmoc-Leu-OCH2-^^-OCH₂CNle-NHCH2 Poliestireno

Procedimento repetido para cada Amino ácido

1)	Piperidina	20%/CMF
2)	Lavagem com	DMF
3)	Lavagem com	DMF
4)	Fmoc-Amino	Ácido-OPFP

Z Z Cl_?Bz _Ί . I I I.

Fmoc-D-Ala-D-Val-Lrs-Lvs-T-ir-D

eNH-

1)	Piperidina 20%
2)	Lavagem com DMF
3)	Lavagem com C^Cl
4)	1-5% TFA/CH₂C1₂

λ/

Ζ Ζ Cl₂Bz

I ι I H-D-Ala-D-Val-L is-L is-Tir-D-Leu-OH

1) DPPA, DMF, NaHCO₃ ⁿ2 0^o -5» 3 dias a tempo ambiente

2) Resina de permuta iónica em leito misto

1) 10% Pd/C

EtOH: HOAc: H₂O (7:2:1)

ZJ

D-Ala-D-Val-L is-L is-T ir-D-Leu (E2)

V

A resina funcioanlisada A (1 g, 0,5 meq/g) foi preparada como se delineou anteriormente ou expandida do estado seco em DMF (2x20 mlx!5 min.).

Como se delineou anteriormente, foram adicionados à resina, iqpetindo o ciclo de ligação e desprotecção, os seguintes amino-ácidos.

(Fmoc-D-Leu)₂O (como	Fmoc-Leu	_OH	(882	mg; 5 equiv)
DIC	(0,2 ml) :	DMAP	(15	mg)
Fmoc-Tir (Cl₂Bz)-OPFP	(909	mg ;	2,5	equiv)
Fmoc-Lis-(CBZ)-OPFP	(835	mg;	2,5	equiv)
Fmoc-Lis-(CBZ)-OPFP	(835	mg ;	2,5	equiv)
Fmoc-D-Val-OPFP	(632	mg ;	2,5	equiv)
Fmoc-D-Ala-OPFP	(597	mg ;	2,5	equiv)

Após a última desprotecção a matriz resina-peptideo foi seca durante, pelo menos, 2 horas, então expandida em CH₂C1₂ e tratada com TFA l%-5% como se expôs no Exemplo 1, para produzir o hexapeptideo linear com a cadeia lateral protegida (523 mg; 92%) FAB M+l=1147 Análise de amino-ácido encontrou Ala=l,0; Val=0,9; Lis=l,9; Tir=l,l; Leu=l,0.

O hexapeptideo cíclico de cadeia lateral protegida (160 mg, 0,14 mmole) foi dissolvido em DMF anidro (30 ml) e hidrogenado sobre Pd/C 10% (160 mg) durante 3 horas à temperatura ambiente. O catalisador foi removido por filtração através de terra de diatomáceas e filtrado evaporado in vacuo. O resíduo foi retirado para uma solução aquosa de ácido acético (200 ml) 5%, filtrado e liofilizado para produzir o composto em título (114 mg; 98%) FAB M+l=703, sob a forma de sal acetato.

Foi conseguida uma purificação adicional por cromatografia de permuta iónica sobre CM TriSacryl* seguida por ensaio HPLC (uBondapak via 30% MeOH: 50 mM NH^OAC aq:

-300,05% HOAc).

*

-Marca registada

Os exemplos seguintes foram preparados de uma forma similar.

Exemplo 3

Acetato de Ciclo-/ D-Alanil-L-Valil-L-Lisil-L-Lisil-L-Fenil àlanil-L-Leucina7

FAB M+l=687.

Exemplo 4

Acetato de Ciclo-/ D-Alanil-D-Valil-L-Lisil-L-Lisil-L-Leucil

-D-Leucina7

FAB M+l=653.

Dados Farmacológicos

Método para o problema duodenal induzido por Acido/pepsina

Preparação

Ratazanas macho Wistar, com 180 a 300 g de peso do corpo, foram anestesiados com uretano (1,75 g/kg i.m.). A traqueia é canulada para assegurar uma fácil passagem de ar e a veia jugular é canulada. É levada a cabo uma laporotomia e é inserido um fistular de titânio (3 cmx0,5 cm d.i.) na parte dianteira não-glandular do estômago. Este chega ao exterior através de um golpe feito no corpo. A cânula de perfusão duodenal é construída a partir de um tubo de doseamento oral 8 fg. Esta cânula tem dois orifícios situados a 1 cm de distância em lados opostos da cânula aproximadamente a 5 cm da extremidade próxima da cânula. O lúmer é fechado entre os dois orifícios e os colares de localização posicionados próximos do orifício superior e afastados do orifício interno.

Esta cânula é passada pela abertura gástrica através do piloro para o interior da fonte mais próxima do duodeno e deixa o duodeno por uma pequena incisão exactamente junto à Papilla de Vater. A cânulo é colocada de modo que o orifício mais próximo esteja dirigido para a maior curvatura do duodeno e mantida no lugar em volta dos colares de colocação de forma que produza uma câmara duodenal próãma, excluindo as secreções gástricas, biliares e pancreáticas.

Procedimento Experimental

Após a da câmara duodenal NaCl 0,9% 0,5 h, sendo, a partir desta são mortos, e examinados mM com o o meio para a aspersão

HC1 e mesmo os duodenos

250 meg/ml de pepdébito durante removidos, aberpara detectar danos, com um

0,9% de baixo poder, por um observador desconhecendo doseamento e utilizando um sistema de registo de

È utilizado um grupo de dimensão 6 e a

U' preparação é aspergido através a pH 6,5 a 0,1 ml/min durante altura, mudado para NaCl 0,9% contendo sina (Bovina), que é aspergida 4,5 h. Os animais tos em NaCl microscópio o regime de a 10, subjectivo.

significância é determinada, com aplicação do teste Mann-Whitney. Os compostos são administrados lina estéril de pH 6,5 sob a forma de infusão da veia numa solução sai.v. através jugular a um débito de 1,2 ml/h ao longo da experiência, desde o inicio da aspersão duodenal com pH 6,5.

Composto EI com uma de 51% nos estragos de 50 mmol/kg/h deu (p < 0,01 > 0,001)

Com a utilização deste protocolo o dosagem de 450 mmol/kg/h deu uma redução duodenais e o Composto E2 com uma dosagem uma redução de 45% nos estragos duodenais

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de um peptideo cíclico farmacológicamente activo de fórmula (I) ou um seu sal farmacêuticamente aceitável:

em que R, e R_o são independentemente (CH„) NH„ ou (C^H2) n^NH~C=NH. NH2 em que n é 3-6; R^ é Cf^R-? em que é fenilo facultativamente substituido por um ou dois substituintes seleccionados de entre halogénèo, hidroxi, alquilo ^e alcoxi C_x_₄, ou R? é alquilo ; R^, R^ e R^ são os mesmos ou diferentes grupos alquilo ; quatro dos X¹ a X⁶ são ligações amida e os outros dois são ligações amida ou ligações em que a ligação amida é substituída por uma ligação estabilizada por enzimas; desde que, quando fôr fenilo, pelo menos um dos três átomos de carbono representados na fórmula (I) ligados aR^,R^eRg, esteja na configuração L; caracterizado por compreencfer a ciclização de um peptideo linear de fórmula (II)

NH2

QCO (II) em que Y é uma sequência de amino-ácidos facultativamente protegida correspondente aos amino-ácidos no peptideo ciclico desejado de fórmula (I); e Q é um grupo separável; e, em seguida, quando for necessário, a remoção de quaisquer grupos protectores das cadeias laterais dos amino-ácidos e a formação, facultativamente de um seu sal farmacêuticamente aceitável .
2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar um peptideo ciclico de acordo com a reivindicação 1 de fórmula (IA) ou um seu sal farmacêuticamente aceitável;

LysLys /\

VaiTyr \/

Ala -----Leu(IA) em que um ou mais dos amino-ácidos pode ser substituído por outro amino-ácido equivalente.
3â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um peptideo ciclico de fórmula (IA) em que Tyr é substituído por outro amino ácido hidrofóbico, como a leucina ou a fenilalanina (quando um dos Vai, Ala, ou Leu estiver na forma L).
4â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por se preparar um peptideo cíclico em que Lys-Lys-Tyr (ou os átomos de carbono de R^ , R₂ , Rg estão na configuração L e os Leu-Ala-Val (ou

-35os átomos de carbono de R^ , R^ , R^) estão na configuração D.
5â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar ciclo-/~D-Alanil-L-Valil-L-Lisil-L-Lisil-L-Tirosil-L-Leucina7, ciclo-/~D-Alanil-D-Valil-L-Lisil-L-Lisil-Tirosil-D-Leucina7, ciclo-/ D-Alanil-L-Valil-L-Lisil-L-Lisil-L-Fenilalanil-L-Leucina7;

ciclo-/ D-Alanil-D-Valil-L-Lisil-L-Lisil-L-Leucil-D-Leucina7, ou um sal farmacêuticamente aceitável de qualquer dos precedentes .
6â. - Processo para a preparação de um medicamento para uso no tratamento de úlceras pépticas, caracterizado por se incluir, no referido medicamento um peptideo ciclico obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7â. - Método para o tratamento de úlceras pépticas caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz anti-úlcera de um peptideo ciclico

-36obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, sendo a gama de dosagem de composto activo de 0,01 a 100 mg, de preferência de 0,01 a 10 mg por kg de peso corporal por dia.