PT88915B - Processo para a preparacao de uma proteina recombinante rica em histidina do plasmodium falciparum - Google Patents

Processo para a preparacao de uma proteina recombinante rica em histidina do plasmodium falciparum Download PDF

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Description

MEMÓRIA DESCRITIVA
Devido à crescente resistência tanto do parasita da malária Plasmodium falciparum (P. falciparum) aos qui mioterapêuticos e prifiláticos tradicionais ou recentemente desenvolvidos como do seu agente de contágio (certos tipos de mosquitos) aos insecticidas, a malária tem sido o principal problema de saúde em países em vias de desenvolvimento. 0 desenvolvimento de proteínas recombinantes ou de peptidos sintê ticos para aplicaÇao na profilaxia por vacinas ê por isso de grande significado. Um passo importante para o desenvolvimento de uma vacina moderna ê a identificação de antigenes prote ctores. Como protectores entendem-se em geral os antigenes que? em testes in vivo com modelos animais como por exemplo em macacos Saimiri ou Aotus? apresentam um efeito protector contra infecçoes de P. falcipardm introduzidas por via intra-
tecçao insuficientes em seres humanos» mas varias proteínas de P. falciparum isoladas revelaram um efeito protector total ou parcial em modelos animais. Isto ê válido tanto para bandas de proteina» de 75 kD e 100 kD purificadas por eleetroforese de gel como para fracções de proteina de pesos moleculares 200 kD, l40 kD e 4l kD purificadas por eleetroforese de gel.
Uma vez que parece nao ser possível preparar antigenes em quantidades suficientes para uma vacina a partir de culturas de parasitas, resta a hipótese de uma preparaçao por via da engenharia genética de tais antigenes. Alêm disso, o processo de preparaçao por engenharia genetica permite excluir a inassimibilidade do material da vacina» causada pela contaminação com células hospedeiras (componentes eritrocitários).
De entre as proteínas atê agora produzidas por engenharia genética as que mostraram provocar um efeito prote
A ** ctor parcial em experiencias de imunizaÇao com macacos saimiri ou Aotus, foram uma proteina de expressão recombinante da região 5’ repeat da chamada merozoitaproteína 155 kD e um oligopêptido sintético da prê-merozoitoproteína superficial 200 kD, bem como uma combinação de oligopêptidos sintéticos de proteínas de P. falciparum de peso molecular 200 kD, 55 kD e 35 kD.
objectivo da presente invenção ê assim o de encontrar outros antigenes de P. falciparum preparáveis por engenharia genética com um bom efeito protector, uma vez que para uma imunizaÇao suficiente ê provavelmente necessária uma mistura de vários antigenes de P. falciparum apropriados.
Na tentativa de clonar o antigene protector 4l kD acima referido, por meio de um anti-soro monoespecífico contra esta banda de proteína 4l kD, isolou-se um clono 4l-3 a partir de um banco de expressão de cDNA, cuja sequência se indica na Tab. 1. Surpreendentemente, esta sequência codifica Par« ^uuna protelna rica em histidina-alanina de 21 kD, compa- 8 rável à proteína PfMRPIII ou SHARP descrita para outras estir pes de-plasmÚdio (H.D. Stahl et al· (1985)» Nucl. Acids Res· 13, 7837-7846} T.E. Wel-lems e R. J. Howard (1986), Proc. Natl, Acad. Sei. U. S.A. 83, 6065-6069). Uma vez que nao foi possível exprimir suficientemente a inserção do clono 4l—3, utilizou-se a sua sequencia para a selecção (Screening”) de um
ÍW outro banco de genes de cDNA. Obteve—se assim, por hibridaçao cruzada, um clono >gt 10-41-3, cuja inserção se conseguiu exprimir.
A sequência de DNA deste clono, a seguir descrita (Tab. 2) possui uma ordem de leitura aberta que termina
AZ ÍW com o codão de fim TAA na posição 568. Uma larga repeat—re— gion (nucleótido 1 a 5^°) codifica quase exclusivamente para os grupos histidina, alanina e asparagina. A unidade básica dos repeats, da origem a repetições tripeptídicas Ala-His-His e Ala-Ala-Asp.
A última unidade de repetição possui uma ligeira variabilidade: para além dos tripêptidos Ala-Ala-Asp en contram-se três unidades tripeptídicas Ala-Ala—Tyr, duas Ala-Ser-Asp, duas Ala-Thr-Asp e uma Val-Ala-Asp. A última destas unidades ê um dipêptido ao qual falta o grupo ácido asparagínico.
Pelo contrário, as repetições tripeptídicas Ala-His-His mantêm-se invariáveis. A variabilidade neste caso ê apenas no número e na ordem destes tripêptidos. Estes encon tram-se entre os tripêptidos Ala-Ala-Asp já ocorrentes como monómeros, na forma de monómeros (10), dímeros (12) e trímeros (2).
A sequência aqui apresentada ê muito semelhan te à do antigene PfHRPII rico em histidina (T.E. Welleras e R.
J. Howard, vide acima). A comparaÇao das sequências de nuclêó tidos mostra um grau de homologia de 90% (Tab. 3)· Ambas as sequências têm 80 nucleêtidos idênticos a partir do mesmo exAZ A* tremo 3’ » mas diferenciam-se na região de repetição devido a
delecçoes e trocas de bases·
Ambos os antigenes têm uma grande percentagem dos aminoácidos histidina» alanina e ácido asparagínico e pos suem as repetições tripeptidicas Ala-His-His e Ala-Asp-Asp.
As diferenças entre as duas sequências consistem principalmen te na ordem e no número de unidades de repetição. Assim, na sequência de aminoácidos derivada do clono /gt 10-41-3 predomina a repetição nonapeptidica Ala-His-His-Ala—His-His-Ala-Ala-Asp sobre a repetição hexapeptídica Ala-His-His-Ala-Ala-Asp» no antigene PfHRPII, pelo contrário, a componente Hexa— peptídica ê maior. Em geral, na sequência aqui descrita, os multímeros da unidade tripeptídica Ala-His-His sao mais frequentes em relaçao aos monómeros correspondentes mais frequen tes no PfHRPII.
Apesar disso, a inserção do clono Agt 10-41-3 parece codificar para um antigene HRPII, que ê heterogéneo em várias estirpes de P. falciparum. Isto resulta, entre outros, de uma análise Western Blot com anti-soros, dirigidos contra uma proteína de fusão que ê codificada pelo vector pEx. 316-41-3. Estes soros reconhecem várias bandas de proteína^ en tre 70 kD e 5θ RU com intensidade decrescente, o que se pode explicar por exemplo por degradaÇao proteolítica de um antige ne 7θ kD· θ peso molecular do HRPII situa-se entre 70 kD e 75 kD, dependendo da estirpe de P. falciparum.Ao mesmo tempo rea ge uma banda de proteína de 37 kD, que se trata provavelmente do antigene HRPIII homélogo. Um padrao Western Blot semelhante foi encontrado por Rock et al. (Rock et al. (19&7) Para sitology, 95» 209-227) com anti-soros contra o antigene HRPII. A sequência de nucleótidos do clono Agt 10-41-3» acima descrita» exprimiu-se como proteína de fusão em E. coli.
Numa experiência de vacinaÇao com o produto de expressão purificado conseguiu-se proteger macacos Aotus
A/ contra uma infecção por P. falciparum.
- 4 t »
X
A invenção refere—se sucessivamente a’· a) um processo para a preparaçao por engenharia genética do antigene HRPII (estirpe SGE2)} b) o gene para tal necessário, incluindo os seus produtos de transcriçaoj c) estruturas de DNA e vectores que contêm este gene total ou parcialmente» d) cêlulas procarióticas ou eucarióticas transformadas com esse DNA e o polipéptido exprimido a partir dessas células» e) sequências de aminoácidos deste antigene HRPII» oligopêptidos e anticorpos com elas obtidos e sua utilizaÇao para o isolamento de polipêptidos, bem como a utilizaÇao do HRPII para a imu nizaÇao e para o diagnóstico da malária» f) vacinas contra a malária, que contenham o HRPII ou partes imunogêgicas dele, isoladamente ou em combinação.
Nos exemplos seguintes e nas reivindicações
A* da patente apresentam-se outras formas de concretização da in vençao.
Exemplo 1
Selecçao (Screening) de um banco de expressão de DNA com um soro 4,1 kD monoespecífico.
At
Seleccionou—se um banco de expressão de cDNA da estirpe SGE2 de P. falciparum (A. Cheung et al· (1985),
The EMBO Journal 4, 1007-1012) com um anti—soro policlonal contra uma banda de proteina 4l kD purificada por electrofore se de gel (L.H. Perrin et al. (19&5)» J· Clin. Invest. 75? 1718-1721), de acordo com o método de A. Cheung et al. (vide acima). Dai resultaram 3 clonos 4l-l, 4l-2 e 4l-3» dos quais se caracterizou posteriormente o clono 4l—3·
Exemplo 2i
Sequenciaçao da inserção do clono 4l-3 «w
A sequenciaçao do DNA efectuou-se de acordo
- 5 com o método de Maxam e Gilbert (A. Maxam e W. Gilbert (1980), Meth. Enzymol· 65» 499)· A sequência de DNA e a sequência de aminoácidos dela derivada encontram-se representadas na Tab. L
Exemplo 3
Isolamento e sequenciaÇao do clono Àgt 10-41-3
Uma vez que a inserção do clono 4l-3 teve ape nas uma expressão fraca como proteína de fusão de MS2-polimerase, apesar do posicionamento no vector pEx 31a ( K. Strebel et al. (1985)5 J· Virology 57» 983-991) na ordem de leitura correcta (verificado por sequenciaÇao)» sob controle do promo tor PL termoindutível» pesquizaram—se outros clonos com a inserção de DNA do clono 41-3 num banco de cDNA de Agt Ιθ» de modo a obter a sua expressão. 0 banco de Agt 10 preparou—se a partir do mRNA da estirpe SGE2 de P. falciparum de acordo com o método de T. V. Huynth, R.A.Young e R.W. Davies (em DNA cio ning, Vol. I (1985)» a practical approach, editado por D.M. Glover» 49-78)» utilizando um lincante de 23bp (pares de bases) cindivel com os enzimas de restrição Pst I, Not I e EcoRI» Do Screening” deste banco de cDNA com a inserção de DNA do clono 41-3 resultou o clono }gtlO-4l-3. A inserção deste cio- ** no sequenciou-se de acordo com o método da reacçao de quebra da cadeia didesoxi» segundo F. Sanger et al. (Proc. Natl. Acad Sei. USA 74j 5463—5467 (1977))· A sequência de nucleôtidos bem como a sequência de aminoácidos derivada deste clono encontram -se representadas na Tabela 2.
Exemplo 4
Expressão da inserção do clono XgtlO-4l-3 no vector pEX31
Isolou-se o fragmento de inserção do clono gtlO-4l—3» compreendendo cerca de 600 bp» por meio de electroforese de gel, ligou-se com o vector pEX3lb desfosforilado e digerido com o enzima de restrição PstI (T. Maniatis et ai.
- 6 (1982) Molecular Cloning, a laboratory manual) e exprimiu-se de acordo com o método de H. Kupper et al. (em Y. Ikeda e T. Beppu (ed.), Procceding of the Fourth International Symposium of Genetics of Industrial Mikroorganisms (1982), Kyoto Kodansha Ltd., Tokyo), como descrito em detalhe no exemplo 5· 0 plasmideo pEX31h-4l-3 daí resultante exprimiu o fragmento de DNA como proteína de fusão M.S-2 em elevado rendimento. Existe uma discrepância entre o peso molecular de 49kD calculado por meio de geles SDS e o peso molecular de 33 kD previsto com ba se no comprimento da sequência codificante. Provavelmente este efeito ê provocado por um comportamento de ligaçao ao SDS inabitúal devido à sequência rica em histidina-alanina·
Exemplo 5
Purificação do produto de expressão
Agitou-se vigorosamente uma cultura da bactéria 0600, contendo o plasmideo pCI 857 (F. Remant et al., (1983), Gene 22, 103—113)» transformado com o plasmideo pEX 31b-4l-3» em 1 1 de meio LB com 5θ p.g/mi de ampicilina e 25^ig de canamicina, a 28° C durante 20 horas.
Após adiçao de 4 1 de meio LB aquecido a 42°C, agitou-se novamente durante 4 horas a 42°C. Removeram-se as bactérias por centrifugação, ressuspenderam-se em 200 ml de uma solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato (PBS) e abriram-se mecanicamente. Separaram-se as proteinas solúveis
Al por meio de centrifugação e ressuspenderam-se os sedimentos, que continham o produto de expressão, apôs duas lavagens com PBS, em ureia 1 M. Separaram-se as proteínas solubilizadas por
A| centrifugação e suspenderam-se de novo os sedimentos em ureia
IW Al
2M. Repetiram-se estas operaçoes com concentrações crescentes ai de ureia· A uma concentração 7 M de ureia conseguiu-se a solu
A# Al Al bilizaçao da proteína de fusão, mantendo—se em solução apos dialise contra ureia 2 M« precipitando as impurezas da E.coli.
Exemplo 6
Identificação da proteína de P. falciparum correspondente
Imunizaram-se coelhos de acordo com o esquema seguinte! Ia dia! 1 mg do produto de expressão purificado em adjuvante de Freund completo, por via subcutânea}
2a—5a, 15a-19a, 29e-33s dias! 0,1 mg de cada vez do produto de expressão purificado, por via intravenosa}
40fl dia! colheita de sangue.
Os ratos (Balb c), pré-imunizados com a proteína de fusão, receberam no Ia dia 0,03 mg do produto de expressão purificado em adjuvante de Freund completo, por via subcutânea, no 15a dia 0,1 mg em adjuvante de Freund incomple to, por via subcutânea, no 29a dia 0,1 mg por via subcutânea e sangraram-se ao 36a dia· Para a obtenção de esquizontes culti vou-se P. falciparum em eritrócitos humanos (W. Trager e J.B. Jensen (1976), Science 193» 673-675) θ sincronizou-se por meio de tratamento com sorbitol (C. Lambros e J. P. Vanderger (1979)
J. Parasitol. 65, 418-420). Obteve-se um enriquecimento dos esquizontes a cerca de 90% por flotaçao em Geiafundina (Braun Melsungen)(de acordo com G. Pasvol et al. (1978), Ann. Trop. ned. Parasitol. 72, 87-88). Centrifugaram-se os esquizontes, iavaram-se» dissolveram-se numa amostra de tampao SDS, aquece ram-se durante 5 minutos a 100°C, submeteram-se a ultra-sonse congelaram-se em tomas aliquotas.
Separaram-se aliquotas da solução do esquizon te por meio da técnica SDS—PAGE e transferiram—se para nitro— celulose. Saturou-se a membrana com 5% de leite magro em ρδ em PBS e incubou-se com uma diluição apropriada dos anti-soros a testar e depois com outros anticorpos biotinizados específicos da espécie. Localizaram-se os anticorpos ligados por meio de avidina/biotina-peroxidase e diaminobenzidina/H 0 .
Δ u
k.
Teste de protecção em modelo animaU Imunização de Aotus azara e boliviensis (Cariotipo VI)
Efectuou-se esta experiência para testar aefi cácia da sequência parcial HRPII (HRPII-P) em relaçao à indu— çao de imunidade protector em macacos susceptiveis a ?* falciparum.
1· Ordenamento das experiências:
Escolheram-se à sorte 9 macacos saudáveis Aotus da espécie acima mencionada (1000-1500 g de peso corporal» ma chos e fêmeas da criaçao da Behringwerke AG) e distribuiram-se por 3 grupos de 3 animais cada·
Todos os três animais do grupo A se imunizaram por via sub-cutanea» com intervalos de 3 semanas com 3X 100 jig de cada vez do produto de expressão pÈX3l6-4l-3 (dissolvido em PBS). Como adjuvante utilizou-se uma mistura a 10% de 50% de Al(OH)^ + 45% de lecitina + 5% de saponina com o an tigene. Os 3 animais do grupo B imunizaram-se segundo o mesmo esquema com uma proteina de fusão M52 ”31-1 longer repeat delete obtida analogamente (31-1 lrd), que contêm uma sequência parcial N-terminal da proteína 200 kD precursora de um an tigene merozoito-superficial (US-A 879>O?6).
animais do grupo de controlo de infecçao re ceberam igualmente de acordo com o esquema anterior» cada um deles» uma injecçao de PBS + adjuvante sem componente antigénico.
- 9 Tabela 1
30 50 CCGTTTTTGCTTCCGTACTTTTGTTAGATAACAATAACTCCGAATTTAACAATAACTTGT
ValPheAlaSerVaILeuLeuLeuAspAsnAsnAsnSerGluPheAsnAsnAsnLeuP
90 110
TTAGCAAAAATGCAAAAGGACTTAATTCAAATAAGAGATTATTACACGAAAGTCAAGCAC heSerLysAsnAlaLysGlyLeuAsnSerAsnLysArgLeuLeuHisGluSerGlnAlaH
130 150 170
ATGCAGGTGATGCCCATCATGCACATCATGTAGCTGATGCTCATCATGCTCACCATGCAG i εAlaGIyAspAlaHi sHi sAlaHi sHi sValAlaAspAlaHi sHi sAlaHi sHi sAla A
190 210 23O
CTAATGCTCACCATGCAGCTAATGCTCACCATGCAGCTAATGCTCATCATGCAGCTAATG 1a AsnAlaHisHi sAlaAlaAsnAlaHisHi sAlaAlaAsnAlaHi sHi sAlaÁlaAsnA
25O 270 290
CTCACCATGCAGCTAAT6CTCATCATGCAGCTAATGCTCGCCATGCA6CTAATGCTCACC laHi sHi sAlaAlaAsnAlaHi sHi sAlaAlaAsnAlaArgHi sAlaAlaAsnAlaHi sH
310 330 350
ATGCAGCTAATGCTCACCATGCAGCTGATGCTAATCACG6ATTTCATTTTAACCTTCAC6 i sAla AlaAsnAlaHi sHi sAlaAlaAspAlaAsnHi sGlyPheHi sPheAsnLeuHi sA
370 390 410
ATAACAATTCCCATACTTTACATCATGCAAAAGCTAATGCTTGTTTTGATGATTCTCACC spAsnAsnSerHisThrLeuHisHisAlaLysAIaAsnAlaCysPheAspAspSerHisH
430 450 470
ATGACGATTCCCACCATGATGGAGCACACCACGACGATGCCCACCATGATGGAGCACACC i sA spAspSerHi sHi sAspGlyAlaHi sHi sAspAspAlaHi sHi sAspGIyAlaHi sH
490
ACGACGATGCCCACCAT 1sAspAspAlaHi sHi s
Tabela 2
30 50
CATGTAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCA HlsVa1AlaAspAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaAspAlaHi sHi sAlaHi sHi sAla
90 110
GCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCTATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCGAT Ala AspAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaTyrAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaAsp
I30 ISO 170
GCCCATCATGCTCATCATGCTCACCATGCAGCCGATGCCCATCACGCTCATCATGCAGCC
190 210 23O
GATGCCCATCATGCTCACCATGCAGCTGATGCTCATCACGCTCATCATGCAGCC6AT6CC AspAlaHisHisAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaHisHisAlaAlaAspAla
25O 270 29O
CATCATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCATGCATCCGATGCTCATCAT Hi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaAspAlaHi sHi sAlaHisHi sAlaS erAspAlaHi sHi s
310 330 350
GCAGCTGATGCTCACCATGCAGCCTATGCCCATCATGCTCATCATGCTCATCATGCATCC AlaAlaA spAlaHi sHi sAlaAlaTyrAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaHi sHisAlaSer
370 390 4l0
GATGCTCATCATGCAGCTGATGCTCACCATGCAGCTTATGCCCATCACGCTCATCAT6CA
43O 45O 470
GCTGATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCATGCAACCGATGCTCATCAC AlaAspAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaHisHisAlaThrAspAIaHisHis
490 510 53O
GCTCACCATGCAGCCGATGCTCACCATGCAACCGATGCTCACCATGCAGCCGCACACCAC
550 570
GAAGCCGCCACACATT6CCTACGCCATTAAATTTATTTAATAA GluAlaAlaThrHisCysLeuArgHi sEnd
Tabela 3 • · · · ·
CATGTAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGC 50 ilil H 1II ii 11II11111! H ί I IIHHil lllli |l| )l 11
354 CATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCATGCAGCTGATGCTCATCACGC 403 • · · · ·
TCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCTATGCCCATC 100 llllllllllllilllllilllllillOlllllilllllllllllilll
404 TCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCTATGCCCATC 453 • · · · ·
101 ATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCTCACCATGCA 150 llllllllllilli Π I ll 11 Hl II I| I I IIIlUUlíHII 454 ATGCTCATCATGCATCCGATGCTCATCATGCAGCTGATGCTCACCATGCA 5O3 • « · · *
151 GCCGATGCCCATCACGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATC.........A 191
II 111 III 1111II111 U i Η I ί 111 lllli |IH i
504 GCTTATGCCCATCACGCTCATCATGCAGCTGATGCTCATCATGCAGCTGA 553 • · · · ♦
192 TGCTCACCATGCAGCTGATGCTCATCACGCTCATCATGCAGCCGATGCCC 241
111II111II1111 Η III l í 1111111 (11 u u li 11II lllli I 554 TGCTCACCATGCAGCTTATGCCCATCACGCTCATCATGCA6CTGAT6CTC 603 • · · · ·
242 ATO ........ATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCAT 282 ||i Illllll íilíil 111(11 í lllli 11111IIII
604 ATCATGCAGCC6ATGCTCACCATGCAACCGATGCTCATCACGCTCACCAT 653 • · · · *
283 GCATCCGATGCTCATCATGCAGCTGATGCTCACCATGCAGCCTATGCCCA 332
III IHIIIIIII llllll 1 IHlllll IHlllll! IIII II
654 GCAGCCGATGCTCACCATGCAACCGATGCTCATCATGCAGCCGATGCTCA 703 • · · * ·
333 TCATGCTCATCATGCTCATCATGCATCCGATGCTCATCATGCAGCTGATG 382 | lí ί I lllllliillll II HUI III III ||l l||ll IIH
704 CCATGCAGCCGATGCTCATCATGCAACCGATGCTCATCATGCAGCCGATG 753 383 CTCACCATGÔAGCTTATGCfcCATC. .ACGCTCÀTCATGCAGCi' 423 , IIIIIIHIII I ΙΙΙΙΊΙΙΙ I lllli l|ll IIH
754 CTCACCATGCAACCGATGCTCATCATGCAGCCGÁTGCTCACCATGCAGCC 803 • · · · ·
424 GATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCATGCAACCGATGC 473 humi mm um 1 um iiimiuiii iiiiih
804 GATGCTCACCATGCAACCGATTCTCATCACGCTCACCATGCAGCCGATGC 853 ··· 9 ·
474 TCATCA--·· .CGCTCACCATGCAGCCGATGCT- ···'··........C 502 llllll l|| ΠΙΗΙΙΙΙ I llllll I
854 TCATCATGCAGCCGCACACCATGCAACTGATGCTCACCATGCAGCCGCAC 903 503 ACCATGCAACCGATGCTCACCATGCAGCCGCACACCACGAAGCCGCCACA 552
111 Illllll III Illlllll|llllllllllllllllllllllllllll
904 ACCATGCAACCGATGCTCACCATGCAGCCGCACACCACGAAGCCGCCACA 953 • · · · e
553 CATTGCCTACGCCATTAAATTTATTTAATAA 5θ3
1111111111II1111111II1111 Η IIII
954 CATTGCCTAC6CCATTAAATTTATTTAATAA 984
Tabela 4
Grupo
Nfimero de macacos
Aotus ug de antigene 3ximuni za Ç a o de dose total
Adjuvantes
Infecçao a debelar 55T. por I.de imunização
A HRPII-P 3
300
B 31-1 Ird 3
Α1(0Η)ο — .LI -,-........... 3 mo di f i3°° cado
C Controle 3 de infecçao r
X 10 eritrócitos parasitados de P. falciparum
Estirpe Paio Alto de macacos dadores apôs remoção do baço
De modo a garantir, tanto quanto possível, nos animais uma infecçao experimental por P.falciparum do mesmo grau, retirou-se o baço a todos os macacos seis dias apôs a fil tima imunização (elevada susceptibilidade). Um animal do grupo de controlo morreu antes da infecçao de malaria na sequencia da ablaçao do pâncreas.
Ao 5θ° dia apôs a primeira vacinaçao infecta6 ram-se todos os macacos Aotus com 5x10 eritrócitos parasitados, por via intravenosa· Escolheu-se a estirpe P. falciparum-Palo Alto, que se administrou directamente aos animais a testar, após adaptaçao in vitro a eritrócitos de Aotus de um animal dador ao qual se retirou o baço (16% de parasitemia). Esta estirpe distingue-se por uma elevada infecciosidade em comparaçao com outras subespécies de P. falciparum. È ainda interes sante referir que esta estirpe ê heterôloga em relaçao à estir pe SGE-2 (Genebra) utilizada para o isolamento de antigenes (proveniência, serotipo, tipo de enzima). No decorrer da expe-
Çao) testaram-se os parâmetros fisiológicos» parasitológicos, seroiógicos e clínico—químicos.
2. Resultados. Durante toda a fase de imunizaÇao nao se verificaram quaisquer alterações patológicas de todos os parâmetros fisiológicos (estado clinico, temperatura, peso), e clínico-químicos (eritrócitos, hematócrito, depressão sanguínea, enzimas do soro GPT e GOT) testados. Os testes de segurança farmacológica adicionais (toxicidade subcutânea aguda no rato, assimilibilidade local em macacos, de acordo com as regras da farmacopeia europeia) acusaram para as preparações de vacina utilizadas uma segurança satisfatória e uma boa assimilibili— dade.
2. 1. Parasitetnia. 0 parâmetro principal para a medição do valor de uma protecção induzida ê a identificação microscópica de eritrócitos parasitados no sangue periférico do animal em estudo.
Logo após ο 72-ΙΟΩ dia puderam identificar-se eritrócitos parasitados isolados (menos que 1 por mil) em es— fregaços sanguíneos corados de animais nao imunizados e de ani mais vacinados com o antigene 31-1 Ird. Os animais imunizados com o antigene HRPIl-P apresentavam uma maior ocorrência de parasitas do 102 ao 15a dia (Fig. 2).
Pela medida do grau de parasitemia (e também em comparaçao com dados conhecidos da literatura) todos os ma cacos, imunizados com HRPII-P, se encontravam protegidos (inexistência de imunidade estéril). A parasitemia de ocorrência retardada foi no máximo de 1-2% em dois animais, desaparecendo espontaneamente após 5 dias, enquanto que o macaco n- 1211 até uma ligeira ocorrência de parasitemia de um por mil ao 1GS dia, se manteve parasitologicamente negativo durante o tempo total de observação (vide Fig. 2).
Pelo contrário, os animais imunizados com o po lipêptido 31-1 ird (Fig. l) nao se encontravam protegidos. En quanto que um animal pode controlar por si práprio uma parasi temia máxima de I0%? o macaco nS 2317 teve de ser sujeito a uma quimioterapia oral com ^Mefloquin (Hoffmann La Roche) de rw m modo a evitar uma evolução mortal da infecçao. A estirpe a de x R belar ”Palo Alto” mostrou-se resistente a Cloroquina em tes— tes de infecçao precedentes.
Os macacos nao imunizados (Fig. 3) apresentaram parasitemias máximas de 3 e 8% que? comparadas com a para sitemia rapidamente decrescente dos animais imunizados com HRPII—P, sá se conseguiram controlar sem terapia num espaço de 15 dias.
Nas figuras 1 a 3 encontra-se representada co mo ordenada a quantidade relativa de eritrácitos precipitados (= % de parasitemia). A abcissa representa a escala de tempo (= dia apás a infecçao).
2.2 Serologia. Determinaram-se os anticorpos contra os antige nes de imunização por meio do método ELISA. Cobriram-se placas de poliestireno de 96 orifícios com as proteínas de fusão 31—1 Ird e HRPII-P e incubaram-se com os soros dos macacos imunizados (diluidos 1:100)? apás lavagem para remoção dos reagentes nao ligados? identificaram-se anticorpos específicos anti-IgG humano de coelho marcados com peroxidase.
A resposta imunolágica especifica à malária controlou—se também por meio de imunofiuorescência^indirecta e confirmou-se. Incubaram-se eritrácitos humanos infectados com P. falciparum e fixados com acetona? com diluições em série dos soros a testar? revelando-se a ligaÇao de anticorpos específicos com anti-Ig humano de coelho marcado com FITC.
Todos os animais imunizados revelaram uma seroconversao por ligaçao de anticorpos humorais específicos? que se comprovou por meio de ambos os métodos serolágicos.
Apenas os anticorpos dirigidos contra o antigene HRPII apreAí Aí sentaram uma correlação com a protecção, enquanto o polipêpti do 3I-I ird se revelou apenas um forte agente imunogênico sem efeito protector indutivo. Os resultados dos testes parasitológicos e serológicos apresentam-se na Tabela 5·
Tabela 5
Resultados parasitológicos e serológicos em macacos Aotus, imunizados com polipêptidos HRPII-P recombinantes e com antigenes 3i-l ird de P. falciparum
Macaco ΝΩ Antigene Parasitemia máxima % de eri— dias após trócitos a infec— Serologia após Aí infecção ELISA 31-1 Ird
I F T ELISA 37 kD
infectadas Aí Çao
1211 1 % 10 1:80 0,6 n. d.
1466 HRPII-P 1?5 24 l:40 0,5 n. d.
1463 2 21 1:40 0,6 n. d.
2317 17 21 1:10 n. r. 0,6
178 176“’ 31-1 Ird 10 21 1:80 n. r. 0,8
2 17 1:320 n. r. 0,7
1468 Controle 4 17 negat. 0,03 0,02
1464 de Aí infecção 8 21 negat. 0,03 0,03
««)
Morto ao 172 dia após infecção (peritonite) '^Um animal morreu antes da infecção em consequência da
Aí ablaÇao do baço
n.d.: nao realizado (por n.r. na Tabela)
Legenda
Tab. li Sequência de DNA e sequência de aminoácidos derivada do ciono 41-3 da estirpe SGE2 de P. falciparum.
Tab» 2: Sequência parcial de DNA e sequência de aminoácidos derivada» da inserção de DNA de J^gt 10-41-3»
Tab» 3: Comparaçao da sequencia de nucleátidos do antigene HRPXX da estirpe SGE2 de P. falciparum (acima) com o antigene HRPII de P. falciparum do ciono 7G8 XMTM 22 (abaixo).
Fig. 1 a 3« Evolução da parasitemia em macacos Aotus» imunizados com as proteínas recombinantes 31-1 Ird (l) ou HRPII-P (2)} (3): controles
Na ordenada representa-se a quantidade de eritrôcitos infectados (%).

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - ia Processo para a preparaçao do antigene HRPII do Plasmodium falciparum SGE2» caracterizado por se efectuar **» a expressão da sequencia da Tabela 2
    Tabela 2
    ΙΟ 30 50
    CATGTAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCA HisVaIAlaAspAlaHisHisAlaHiaHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaHisHisAla
    70 90 110 GCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCTATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCGAT AlaAspAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaTyrAlaHisHi sAlaHi sHi sAlaAlaAsp
    130 I50 170
    GCCCATCATGCTCATCATGCTCACCATGCAGCCGATGCCCATCACGCTCATCATGCAGCC AlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaAspAlaHi sHi sAmaHisHisAlaAla
    190 210 23O
    GATGCCCATCATGCTCACCATGCAGCTGATGCTCATCACGCTCATCATGCAGCCGATGCC AspAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaAspAlaHi sHi sAlaHi sHi sAlaAlaAspAla
    250 270 290 CATCATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCATGCATCCGATGCTCATCAT Hi sHi s AlaHi sHi s Ala Ala Asp AlaHi sHi s AlaHi sHi s AlaS erAspAlaHi sHi s
    3IO 330 350
    GCAGCTGATGCTCACCATGCAGCCTATGCCCATCATGCTCATCAT6CTCATCATGCATCC AlaAlaAspAlaHisHisAlaAlaTyrAlaHisHisAlaHisHisAlaHisHisAlaAer
    370
    390
    410
    GATGCTCATCATGCAGCTGATGCTCACCATGCAGCTTATGCCCATCACGCTCATCATGCA
    430 450 470
    GCTGATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCÁTGCAACCGATGCTCATCAC AlaAspAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaHisHisAlaThrAspAlaHisHis
    490 510 530
    GCTCACCATGCAGCCGATGCTCACCATGCAACCGATGCTCACCATGCAGCCGCACACCAC AlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaThrAspAlaHisHisAlaAlaAlaHisHis
    550 570
    GAAGCCGCCACACATTGCCTACGCCATTAAATTTATTTAATAA GluAlaAiaThrHi sCysLeuArgHi sEnd em sistemas de expressão adequados como o cloro ^gtlO—4l—3 no vector pEX 31.
    o a
    Processo para a preparaçao de anticorpos poli clonais ou monoclonais contra o antigene HRPII, quando prepaAt rado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por seefe ctuar a expressão da sequência da Tabela 2 em sistemas de exAt At pressão adequados e se utilizar o produto dessa expressão ou partes imunológicas dele para a imunização.
    - 3a Processo para a preparaçao de um agente para a imunoprofilaxia, caracterizado por se utilizarem os anticorpos preparados de acordo com a reivindicação 2.
    - 4a Processo para a preparaçao de uma vacina, caracterizado por se utilizarem o antigene HRPII de P. falcipaAt rum, quando preparado de acordo com a reivindicação 1, ou par tes imunológicas deste.
    Processo para a preparaçao de um meio de diagnóstico, caracterizado por se utilizarem a sequência de nu— cleótidos da Tabela 2, ou a sequência a ela complementar, ou
    At antigenes, quando preparados de acordo com a reivindicação 1, ou anticorpos, quando preparados de acordo com a reivindicação 2.
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