PT88493B

PT88493B - Processo para a preparacao de derivados de milbemicinas uteis como agentes antiparasiticos

Info

Publication number: PT88493B
Application number: PT88493A
Authority: PT
Inventors: David Austen Perry; Christopher James Dutton
Original assignee: Pfizer Ltd
Priority date: 1987-09-15
Filing date: 1988-09-13
Publication date: 1992-11-30
Also published as: EP0308145A3; DK510588A; US5026643A; US4929638A; GB8721647D0; EP0308145A2; PT88493A; JPH01110685A; US4927847A; FI884227A; FI884227A0; DK510588D0

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE DERIVADOS DE MILBEMICINAS DTEIS COMO AGENTES ANTIPARASITICOS

'1 em que R ê hidrogénio e R ê hidroxi, ou R e R são tomados em conjunto e são oxo; R ê um grupo C₃-C_g-alquilo, alquenilo ou alquinilo, de cadeia linear ou ramificada, que pode, facultativamente, conter um átomo de oxigénio ou de enxofre, como parte da cadeia, ou um grupo C₃-Cg-cicloalquilo ou ci cloalquenilo ou um anel heterocíclico, contendo oxigénio ou enxofre, de 3 a 6 membros, que pode ser saturado ou total ou parcialmente insaturado, e que pode, facultativamente, ser substituido por um, ou mais, grupos C.-C.-alquilo, ou por áto ^{1 4} 4 ^— mos de halogénio; R ê metilo ou etilo; R ê hidrpgênio ou me

6 tilo; R é hidrogénio ou hidroxi, e R é metilo ou hidroxime5 6 tilo, ou os dois grupos R e R são tomados em conjunto e são fi

-O-CH₉-; R ê hidrogénio, metilo ou etilo; e R ê hidrogénio ^c 2 ou halogénio; com a ressalva de que, quando R ê alquilo de cadeia ramificada, não ê isopropilo. Estes compostos são ageii tes antiparasiticos, tendo utilidade como antelmínticos, ecto parasiticidas, insecticidas e acaricidas.

processo de preparação consiste em se efectuar a fermentação de uma estirpe de organismos produtores de milbemicina, Streptomyces cyaneogriseus subsp.

noncyanogenus NRRL 15773 ou Streptomyces thermoarchaensis

NCIB 12015, na presença de um ácido carboxílico de fórmula 2

R C0₂H, ou de um seu derivado funcional, se isolar o composto de fórmula (I) e, facultativamente se halogenar o produto obtido.

Este invento diz respeito a agentes antiparasíticos e, em particular, a compostos relacionados com as milbemicinas, mas que têm um substituinte novo na posição 25, e a um processo para a sua preparação.

As milbemicinas são um grupo de agentes antiparasíticos de espectro largo, relacionados com as avermeetinas, mas diferindo delas pela falta de resíduos de açúcar, na posição 13. Este invento diz respeito, especifi camente, ao subgrupo de milbemicinas, que são caracterizadas pelas insaturação existente no substituinte da posição 25, produzida pelas estirpes de fermentação dos microorganismos Straptomyces cyaneogriseus ssp noncyanogenus NRRL 15773 ou Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015. As propriedades mor fológicas e culturais das estirpes NRRL 15773 e NCIB 12015 estão descritas, em pormenor, no Pedido de Patente Europeia N⁹ 0170006 e no Pedido de Patente do Reino Unido N⁹ 6B 2 166 436A, respectivamente. 0 primeiro destes Pedidos de Patente descreve o isolamento e a caracterização de treze milbe micinas individuais designados por LL-F28249ex- y e a segundo descreve um complexo de seis componentes designados por S541 Factores A-F.

De acordo com a Memória Descritiva do nosso Pedido de Patente Europeia N⁹ 0214731, nós descrevemos um processo para a preparação de avermectinas novas, que têm um grupo modificado na posição 25, adicionando-se um ácido carboxílico, ou um seu derivado, a uma fermentação de um organismo produtor de avermectinas.

Descobrimos, agora, que, adicionan do-se determinados ácidos carboxílicos especificados, ou os seus derivados, a uma fermentação dos organismos produtores de milbemicinas citados, ê possível obterem-se compostos novos, relaccionados com os complexos LL-F28249 e S541, mas ten do um grupo de substituintes não naturais, na posição 25.

De surpresa, contudo, ê que o grupo não estâ directamente ligado â posição 25, como nas aver mectinas, mas está ligado por meio de um grupo de 2-propeni lo.

Os compostos novos são agentes antiparasítieos altamente activos, com uma utilidade específica como antelmínticos, ectoparasiticidas, insecticidas e acaric/ das.

As reacções de transformação quími_ ca convencionais podem ser empregadas, para se prepararem outros derivados, a partir destes compostos. E, assim, de acordo eom o invento, proporcionam-se compostos, que têm a fórmula (I):

1 em que R é hidrogénio e R ê hidroxi, ou em que R e R são considerados em conjunto e são oxo;

?

R ê um grupo de alquilo, de alque nilo ou de alquinilo, de cadeia linear ou de cadeia ramificada, de 3 a 8 átomos de carbono, que pode, facultativamente, conter um átomo de oxigénio ou de enxofre, como parte da ca -5-

deia, ou um grupo de cicloalquilo ou de ciedoalquenilo de 3 a 8 átomos de carbono, ou um anel heterocíc1ico contendo oxigénio ou enxofre de 3 a 6 elementos, que pode ser saturado, ou totalmente ou parcialmente não saturado e que pode ser, facul_ tativamente substituido por um ou mais grupos de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono ou por átomos de halogénio;

R ê metilo ou etilo;

é hidrogénio ou metilo;

6

R é hidrogénio ou hidroxi e R ê metilo ou hidroximetilo, 5 6 ou os dois grupos R e R são considerados em conjunto e são -0-CH₂-;

R? ê hidrogénio, metilo ou etilo; e

O

R é hidrogénio ou halogénio;

?

com a ressalva de que, quando R ê um alquilo de cadeia ramificada, ele não ê isopropilo.

Nas definições precedentes, halo génio designa fluor, cloro, bromo ou iodo.

Uma classe preferida de compostos tem a fórmula (II):

CH

ÇH

OR

CH (II)

CH

4 em que R e R são o que ficou estabelecido no precedente.

Particularmente preferidos são os 2 compostos da fórmula (II), em que R ê (1-metiltio)etilo, 2-pent-4-enilo ou 2-butilo.

De acordo com o invento, os com O postos da fórmula (I), em que R ê hidrogénio, são preparados pela fermentação de uma estirpe do organismo produtor de milbemicina Streptomyces cyaneogriseus subsp. moncyanogenus NRRL

15773 ou Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, na presen2 2 ça do ácido carboxílico adequado da fórmula R CO2H, em que R ê 0 que ficou estabelecido no precedente, ou um seu sal, ou um seu éster ou uma sua amida, ou um precursor oxidante para esse fim.

ácido ê adicionado à fermentação quer no momento da inoculação, quer nos intervalos durante a fermentação. A produção dos compostos da fórmula (I) pode ser controlada pela remoção dos protótipos da fermentação, pela extração com um solvente orgânico e seguindo-se 0 aspecto do composto da fórmula (I) pela cromatografia, por exemplo em pregando-se a cromatografia líquida de pressão elevada. Continua-se a incubação, até que a produção do compostos da fórmula (I) se tenha tornada máxima, de um modo geral durante um período de 4 a 6 dias.

Uma quantidade preferida de cada adição do áciod carboxílico, ou do seu derivado, estã compreen^ dida entre 0,05 e 10 gramas por litro. As melhores produções dos compostos da fórmula (I) são obtidos adicionando-se gradualmente, 0 ácido â fermentação, por exemplo por adições diâ_ rias do ácido, ou do seu derivado, durante um período superior a diversos dias. 0 ácido ê adicionado, de preferência, como um sal, tal como 0 sal de sódio ou de amónio, mas pode ser adicionado como um éster, tal como 0 éster de metilo ou de etilo. Substratos alternativos, que podem ser empregados na fermentação, são os derivados que são precursores oxidantes para os ácidos carboxílicos; deste modo, por exemplo, os sub£ tratos adequados poderiam ser os aminoácidos da fórmula R²CH(NH2)C02H, os ácidos glioxílicos da fórmula R²C0C02H, os derivados da metilamina da fórmula R²CH2NH2, os ácidos alcanóicos inferiores substituídos da fórmula R²(CH2)_nC0₂H em que n ê 2, 4 ou 6, os derivados de metanol da fórmula R²CH₉OH, ou

2 ^cos aldeídos da fórmula R CHO, em que R ê o que ficou estabelecido no precedente. Os meios, empregados para a fermentação podem ser um meio complexo convencional, contendo fontes assi^ miláveis de carbono, de azoto e outros elementos vestigiais.

Após a fermentação, durante um período de diversos dias, a uma temperatura, de preferência, da ordem de 24 a 33⁹C, o caldo da fermentação é centrifugado ou filtrado, e o bolo micelial ê extraído com acetona ou com metanol. 0 extraeto do solvente ê concentrado, e o produto desejado ê, em seguida, extraído num solvente orgânico, miscivel em água, tal como o cloreto de metileno, o acetato de etilo, o clorofórmio, o butanol ou a cetona de isobutilo de metilo. 0 extraeto do solvente ê concentrado e o produto bru to, contendo os compostos da fórmula (I), ê, sem seguida, p£ rificado, conforme for necessário, pela cromatografia, por exemplo empregando-se a fase inversa preparatória, a cromato grafia líquida de elevada pressão.

produto ê, de um modo geral, obtido como uma mistura dos compostos da fórmula (I), em que R, R¹, r3, R⁴, r⁵, r6 e R⁷ são o que ficou estabelecido no

O precedente e R é H; contudo, as proporções dos diversos componentes podem variar, dependendo do organismo específico empregado, do ácido carboxílico empregado e das condições estabelecidas .

Temos verificado que uma vasta gama de ácidos carboxílicos, tais como os estabelecidos pela

- -. fórmula R CC^H, pode ser adicionado â fermentação, para proporcionar os derivados de milbemicina, que têm um substituinte novo na posição 25. Exemplos dos ácidos específicos, que podem ser empregados, incluem os seguintes:

ácido 2-metilpent-4-enóico, ácido 2-metilbutírico, ácido 2-metiltiopropiónico.

Com um objectivo específico e preferido do invento, a fermentação ê levada a efeito na presença do sal de sódio do ácido 2-metiltiopropiónieo, para pro porcionar, predominantemente, os compostos da fórmula (II), em que R ê (1-metiltio)etilo e R ê H.

Com um outro objectivo preferido do invento, a fermentação ê levada a efeito na presença do sal de sódio do ácido 2-metilbutírico, para proporcionar, o predominantemente, o composto da fórmula (II), em que R ê

2-butilo e ê H ou metilo.

Com um ainda outro objetivo prefe rido do invento, a fermentação ê levada a efeito na presença do sal de sódio do ácido 2-metilpent-4-enóico, para dar origem, predominantemente, ao composto da fórmula (II), em que R^ é 2-pent-4-enilo e R^ê H.

Os compostos da fórmula (I), em

O que R é H, podem ser transformados nos compostos corresponO dentes em que R ê um halogénio, empregando-se os processos publicados. A reacção ê levada a efeito protegendo-se, pri meiramente, os grupos de hidroxilo, existentes nas posições 5, 6, 8a e 23, por exemplo como o derivado de t-butildime tilssi1iloxiacetilo, seguida pela halogenação na posição 13, empregando-se, por exemplo, a N-bromosuccinimida, na presen9-

ça de luz seguida pela desprotecção. Alternativamente, o processo é levado a efeito pela epoxidação da ligação dupla 14, 15, empregando-se um perácido, por exemplo o ácido m-cloroperbenzóico. Os grupos de hidroxilo, existentes nas posições 5,

6, 8a e 23, são protegidos, por exemplo como o derivado de t-butildimetilsililo, e o composto ê tratado com um complexo prê-formado do ácido hidrazóico (HNg) e o trietilaluminio, num solvente inerte, para dar origem ao derivado de 15-hidroΔ13 14 ’ -milbemicina. Este composto é, em seguida, transformado na 13-halogeno-milbemicina, por tratamento com um reagente de halogenação adequado, por exemplo o tribrometo de fósforo, para dar origem ao derivado de 13-bromo. Estas fases, em conjunto com os reagentes adequados e as condições da reacção, encontram-se descritas no Pedido da Patente Europeia NS. 0184989.

Os halo-compostos, por serem, também, agentes activos antiparasíticos, podem servir como intermediários, para a preparação dos derivados correspondentes da avermectina. Deste modo, o halo-derivado protegido ê transformado no derivado de 13-acetoxi, por tratamento com uma mistura de acetato de sódio em ácido acético. A reacção subsequente, com o hidroxido de sódio, dá origem à milbemicina de 13-hidroxi, à qual o grupo de L-oleandrosil-ol-L-oleandrosiloxi pode ser ligado, por reacção com um derivado de acetohalo do dissacárido. 0 produto ê, em seguida, finalmente desprotegido, dando origem â avermectina. Estas fases, em conjunto com os reagentes adequados e as condições da reacção, encontram-se descritas na Patente N-. 4093629 dos Estados Unidos da America e na Patente Inglesa N⁹ 15791 18. Determinados produtos da avermectina, produzidos por este processo, são compostos novos, e não são adquiríveis do antecedente.

Os compostos da fórmula (I), em que R e R são considerados em conjunto e são oxo, podem ser isolados da mistura dos produtos obtidos na fermentação do organismo Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, ou de um seu mutante, como se encontra descrito no Pedido de Patente

Inglesa N^s. GB 2176182A, ou-podem ser obtidos pela oxidação dos compostos correspondentes da fórmula (I), em que R ê H e

R é OH. Os reagentes adequados e os process.os para se levar a efeito a oxidação encontram-se descritos na Patente Inglesa 2176182A.

Os compostos da fórmula (I), em que R^ é H, podem, também, ser preparados a partir dos compostos correspondentes em que R⁴ ê CH₃, por desmetilação. Esta reacção ê realizada tratando-se o composto de 5-metoxi, ou um seu derivado adequadamente protegido, com o acetato mercúrio, e hidrolisado o éter de 3-acetoxienol resultante com ácido diluído, para se obter o composto de 5-ceto. Este ê, em seguida, reduzido, empregando-se, por exemplo, o borohidreto de sódio, para se obter o derivado de 5-hidroxi. Os reagentes adequados e as condições da reacção, para estas fases, encontram-se descritos na Patente N⁵ 4423209, dos Estados Unidos da América.

Os compostos do invento são agentes antiparasíticos activos em grau elevado, tendo uma utilidade específica, como antelmínticos, extoparasiticidas, insecticidas e acaricidas.

Deste modo, os compostos são eficazes no tratamento de uma devirsidade de doenças, causadas pelo endoparasitas, incluindo, em particular, a helmintíase, que é originada, mais frequentemente, por um grupo de vermes parasíticos, descritos como nemátodes e que podem dar origem a perdas económicas graves em porcos, carneiros, cavalos e gado vacum, bem como ter influência sobre os animais domésticos e as aves domésticas. Os compostos são, também, eficazes contra outros nemátodes, que têm influência sobre diversas espécies de animais, incluindo, por exemplo, Dirofilaria em cães, e diversos parasitas, que podem infectar os seres humanos, incluindo os parasitas gastro-intestinais, tais como Ancylostoma,

Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinellã,^: Capiliaria, Trichuris, Enterobius e parasitas que se encontram no sangue e em outros tecidos e orgãos, tais como os vermes filariais e as fases extra intestinais de Strongyloides e Trichinella.

Os compostos são, também, de valor, no tratamento de infecções de ectoparasitas, incluindo, em particular, eetoparasitas de artrópodos de animais e de aves, tais como os carrapatos, os ácaros, os piolhos, as pulgas, as moscas, as moscas varejeiras, os insectos que mordem e as larvas de dípteros de migração, que podem ter influência nó gado vacum e nos cavalos.

Os compostos, são, também, insecticidas activos contra pragas domésticas, tais como as baratas, as traças do vestuário, o escaravelho dos tapetes e a mosca doméstica, bem como são proveitosas contra as pragas de insectos dos cereais armazenadas e das plantas agrícolas, tais como os ácaros das aranhas, os pulgões, as lagartas, as formigas do lume, as formigas brancas e contra os ortópteros migratórios, tais como gafanhotos.

Os compostos da fórmula (I) são administrados como uma composição adequada ao emprego específico planeado e à espécie particular do animal hospedeiro a ser tratado e ao parasita, ou insecto, envolvido. Para emprego como um antelmíntico, os compostos podem ser administrados pela via oral, na modalidade de uma cápsula, de uma pílula, de um comprimido, ou, de preferência, como uma poção líquida, ou alternativamente, eles podem ser administrados por injecção ou como um implante. Tais composições são preparadas pela maneira convencional, de acordo com a prática veterinária normalizada. Deste modo, as cápsulas, as pílulas ou os comprimidos podem ser preparados misturando-se o ingrediente activo com um diluente, ou com um veículo, finamente dividido e adequado, contendo, adicionalmente, um agente de desintegração e/ou um agente de ligação, tal como o amido, a lactose, o tal-12-

X .

co, o estearato de magnésio, etc. Uma composição de poção pode ser preparada dispersando o ingrediente activo numa solução aquosa, em conjunto com agentes de dispersão ou de humedecimento, etc. e as composições injectáveis podem ser preparadas na modalidade de uma solução injectável, que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais suficientes ou glucose, para tornar a solução isotónica com o sangue. Estas composições variam de acordo com o peso do composto activo, dependendo da espécie do animal hospedeiro a ser tratado, da gravidade e do tipo da infecção, e do peso do corpo do hospedeiro. De um modo geral, para a administração por via oral, uma dose de cerca de 0,001 a 10 mg, por kg do peso do corpo do animal, dada como uma dose única, ou em doses divididas, durante um período de 1 a 5 dias, será satisfatória, mas, como é evidente, haverá circunstâncias em que graus de dosagem mais elevados ou mais reduzidos, serão os mais indicados, e esses mesmos estão compreendidos no âmbito deste invento.

Como uma alternativa, os compostos podem ser administrados com as substâncias alimentares do animal, e, com esta finalidade, um aditivo, ou um prê-mistura, pode ser preparada, para se misturar com a ração normal do animal.

Para emprego como um insecticida e para o tratamento de pragas agrícolas, os compostos são aplicados como pulverizadores, como poeiras, como emulsões, ou co mo outros idênticos, de acordo com a prática agrícola norma lizada.

Para o emprego humano, os compostos são administrados como uma composição farmacêutieamente aceitável, de acordo com a prática médica normalizada.

Este invento ê tornado claro nos Exemplos, que se seguem, nos quais os Exemplos 1 a 5 são

Exemplos da preparação de compostos da fórmula (I) e os Exemplos 6 e 7 tornam clara a actividade antiparasítica e insecti_ cida dos compostos. As designações milbemicina Ag e de fórmula (II), mas com falta do grupo hidroxilo na posição 23 e com metilo na posição 25, em que R^ ê hidrogénio ou metilo, res pectivamente.

EXEMPLO 1

23-Hidroxi-25-desmeti1-25-(1-meti1-3-metiltio-but-1-eni1) m i 1 bemicina Ag (fórmula II; R ê H, R ê CHgCH(SCHg)-).

Uma composição mieelial gelada de 5. cyaneogriseus subsp. noncyanogenus NRRL 15773 foi inoculada em 50 mis de um meio contendo a glucose (1 g), destiladores solúveis (0,75 g) e extracto de levedura de cerveja (0,25 g), e foi incubada a 28⁹C, durante 2 dias, com agita ção. Esta cultura foi empregada para se inocular um balão de três litros, contendo 600 ml do mesmo meio com que foi incubado como no precedente, durante mais dois dias. Esta cultura (100 ml) foi empregada para se inocular 2,5 litros do meio da composição, que se segue, contida num fermentador de 5 litros:

Glucose (68,5 g), farinha de Trusoy (31,25 g), melaço de cana (3,75 g), hidrogenofosfato dipotássico (0,375 g), carbonato de cálcio (3,125 g), e ácido N-morfolinopropano-sulfúrico (25 g). A fermentação foi incubada a 28⁹C, com agitação a 1.200 rotações por minuto, e gaseificação de 2,5 litros por minuto.

ácido 2-metiltiopropiónico (1 g) foi adicionado, depois de 24 horas de incubação, e a fermentação continuou durante mais 120 horas. 0 micélio foi removido por filtração, e foi extraído com acetona (1,5 litros), segu£ do pelo cloreto de metileno (1,5 litros).

Os extractos de cloreto de metileno, de seis fermentações, como foi descrito no precedente, foram reunidos e concentrados atê a secagem, dando origem ao produto bruto, como uma goma escura. Esta substância foi dis^ solvida numa mistura de cloreto de metileno e hexano (na proporção de 1 para 4) e foi adicionada a uma coluna de alumina básica (160 g). A coluna foi eluída com 400 ml de solvente da mesma composição. A coluna foi, em seguida, eluída com meta nol, recolhendo-se parcelas de 100 ml. As parcelas 1 a 4 fo ram reunidas e foram concentradas, dando origem a uma substâr^ cia purificada parcialmente (15,8 g), como um óleo amarelo. Este óleo foi partilhado entre isooctano (100 ml) e metanol (50 ml). 0 extrato de metanol foi separado, e adicionou-se água (100 ml). Esta mistura foi extraída com o cloreto de metileno (2 x 50 ml), e a camada inferior foi seca com o sulfato de sódio anidro, e foi evaporada dando origem a um produto purificado parcialmente, como um óleo (10 g). Esta substância foi dissolvida numa mistura de cloreto de metileno e acetato de etilo (na proporção de 3 para 1), e foi adicionada a uma coluna de sílica (250 g). A coluna foi eluída com um solvente da mesma composição, e parcelas de 50 ml foram recolhidas. As parcelas, contendo o produto desejado, foram identificadas pela Cromatografia Líquida de Elevada Pressão analítica, foram reunidas e foram concentradas, dando origem ao derivado de milbemicina semipurifiçado. Um protótipo desta substância (150 mg) foi posteriormente purificado pela cromatografia sobre uma coluna (21 mm χ 25 cm) de C18 Zorbax ODS (Marca de Fábrica, Dupont), eluindo-se com uma mistura de metanol e água (78:22), com um caudal de 9 ml, por minuto. As parcelas, recolhidas durante cerca de 70 minutos, foram reunidas e o solvente foi evaporado, dando origem ao composto de fórmula

-152 4 (II), em que R ê (1-metiItio)etilo e R é H, como um pó braii co, com o ponto de fusão de 120 a 122^SC. A estrutura do pro duto foi confirmada pela espectrometria de massa e pela espe£ troseopia de ressonância magnética nuclear C13, como se segue:

A espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido foi levada a efeito num espectrómetro de massa 7070E do modelo VG, empregando-se uma matriz de protótipo de glicerol, trioglicerol, água e cloreto de só dio. (M + Na⁺) observado a m/e 667 (teórico 667).

A espectrometria de massa de impacto electrónico foi levada a efeito empregando-se um espe£ trómetro de massa 7070F de modelo VG. Os valores de m/e, para os fragmentos principais, foram 644 (M⁺), 626, 608, 579, 561, 498, 480, 450, 354, 315, 185, 151.

Os dados espectrais da ressonância magnética nuclear C13 foram obtidos num espectrómetro de Nicolet QE 300, com uma concentração de protótipo de 20 mg/ml em deuteroclorofôrmio. Os desvios químicos, em partes por milhão, relativos ao tetrametilssilano, foram em partes por milhão, relativos ao tetrametilssilano, foram 11,6, 14,0 (dois sinais não resolvidos), 15,6, 19,9, 20,8, 22,3, 34,8,

35,9, 36,0, 36,2, 38,4, 40,8, 41,2, 45,8, 48,5, 67,7 (dois sinais não resolvidos), 68,5, 68,7, 69,1, 76,6, 79,3, 80,3,

99,8, 118,0, 120,2, 120,4, 123,4, 132,6, 134,1, 137,4, 138,0, 139,5, 142,8, 173,4.

i

¢£=3==³

EXEMPLO 2

22-Hidroxi-25-desmeti1-25-(1, 3-dimetilpent-1-éni1)miIbemicina a₃___ (fórmula (II), R⁴ é H, R²ê CH₂CH₂CH(CH₃)-).

As condições do Exemplo 1 foram seguidas, excepto que o ácido 2-metilbutírico foi empregado como substrato. 0 extracto de cloreto de metileno, obtido de doze fermentações de 2,5 litros, foi evaporado, dando origem a um Óleo castanho (27,2 g), que foi purificado parcialmente, dissolvendo-se numa mistura de diclorometano e acetato de etilo (na proporção de 4 para 1) e adicionando-se a uma coluna de sílica (250 g). A coluna foi eluída com um solvente da mesma composição, e foram recolhidas parcelas de 50 ml. As parcelas 4 e 5 reunidas foram empregadas no Exemplo 3, e as parcelas 7 a 11, contendo o composto em epígrafe (identificado pela cromatografia da camada fina), foram reunidas e foram evaporadas, dando origem ao derivado de milbemicina semipurifiçado (2,73 gramas). Esta substância foi a seguir purificada pela cromatografia sobre uma coluna (41 x 250 mm) de Dynamax 60-A C-18 (Marca de Fábrica, Rainin), eluindo-se com uma mistura de água e metanol (na proporção de 1 para 4). Uma purificação final foi realizada pela cromatografia sobre uma coluna (21 mm x 25 cm) de G18 Zorbax ODS (Marca de Fábrica), eluindo-se com uma mistura de água e metanol (na proporção de 1 para 4), com um caudal de 9 ml, por minuto. As parcelas recolhidas a cerca de 90 minutos foram reunidas e o solvente foi evaporado, dando origem ao composto em epígrafe de fórmula (II), em que 2 4

R ê 2-butilo e R ê H, como um pó branco, com um ponto de fusão de 125 a 128^SC. A estrutura do produto foi confirmada pela espeetrometria de massa e por C13 e espectrometria de ressonância magnética nuclear de protões, como se segue:

A espectrometrLa de massa de bombardeamento atómico rápido foi levada a efeito num espêctrome tro de massa 7070E de modelo VG, empregando-se uma matriz de protótipo de glicerol, tioglicerol, âgua e cloreto de sódio. (N+Na⁺) observado a m/e 649 (teórico 649).

A espectrometria de massa de impac to electrônico foi levada a efeito empregando-se um espectrómetro de massa 7070F de modelo VG. Os valores de massa especí fica, para os fragmentos principais foram 626 (M⁺), 608, 590, 480, 462, 425, 354, 314, 248, 151.

Os dados espectrais da ressonância magnética nuclear C13 foram obtidos num espectrómetro de Nicolet QE 300, com uma concentração de protótipo de 20 mg/ml, em deuteroclorofórmio. Os desvios químicos, em partes por milhão, relativosao tetrametilssilano, foram 11,5, 12,1, 14,1,

15.7, 20,1, 20,4, 22,4, 30,2, 33,2, 33,8, 34,9, 36,1, 36,2, 36,3, 40,9, 41,3, 45,8, 48,6, 67,8, 67,9, 68,6, 68,6, 69,5,

76.8, 79,4, 80,3, 99,9, 118,2, 120,4, 123,5, 131,6, 136,2, 137,5, 138,0, 139,5, 142,9, 173,5.

Os dados espectrais da ressonância magnética de protões foram obtidos num espectrómetro de Nicolet QE 300, com um protótipo de uma solução de deuteroclorofórmio. Os desvios químicos dos sinais característicos, em partes por milhão, relativos ao tetrametilssilano foram 5,85-5,7 (m, 2H), 5,45 (bs, 1H), 5,45-5,25 (m, 2H), 5,20 (d, 1H), 4,98 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,32 (t, 1H), 3,99 (d, 1H), 3,90 (s, 1H), 3,80 (d, 1H), 3,61 (d, 1H), 3,30 (m, 1H), 1,90 (bs,

3H), 1,64 (s, 3H), 1,56 (s, 3H), 1,03 (d, 3H), 0,84 (d, 3H).

-18EXEMPLO 3

23-Hidroxi-25-desmeti1-25-(1,3-dimetilpent-1-eni1)mi1bemicina (fórmula II, R⁴ ê CHg, R² ê CH₃CH₂CH(CH₃)-)

As parcelas reunidas 4 e 5 do Exemplo 2 foram evaporadas até a secura, dando origem a 2,25 gramas de resíduo, que foi a seguir purificado em duas parcelas ) iguais, pela cromatografia, numa coluna (41 x 250 mm) de Dynamax 60-A C-18 (Marca de Fábrica, Rainin), eluindo-se com uma mistura de metanol e água (na proporção de 85 para 15), com um caudal de 45 ml, por minuto. As parcelas, eluindo-se a cerca de 70 minutos e contendo o composto em epígrafe, foram reunidas e o solvente foi evaporado, dando origem à milbemicina semipurifiçada. Esta substância foi, em seguida, purificada pela cromatografia de coluna, sobre gel de sílica, eluindo-se com uma mistura de diclorometano e acetato de etilo (na proporção de 4 para 1), e foi, finalmente, purificada pela cromatografia líquida de pressão elevada, empregando-se uma coluna (10 x 250 mm) de Ultrasphere-ODS (Marca de Fábrica), . eluindo-se com uma mistura de metanol e água (na proporção de para 28), com um caudal de 4 ml, por minuto. As parcelas, eluindo-se a cerca de 70 minutos, continham o composto em epígrafe puro, e foram evaporados até a secura. A estrutura do produto foi confirmada pela espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido, levada a efeito num espêctrometro de ’ massa 7070E de modelo VG, empregando-se uma matriz de protótipo de trigol, tetragol, água e cloreto de sódio. (M+Na⁺) observado a m/e 663 (teórico 663).

EXEMPLO 4

23-Hidroxi-25-desmeti1-25-(1,3-dimeti1-hexa-1,5-dieni1 )mi Ibemicina A^___ (fórmula II, R⁴ é H, R² ê CH₂=CHCH₂CH(CH₃)-). .

As condições do Exemplo 1 foram seguidas, excepto que o ãcido 2-metilpent-4-enóico foi empregado como substrato. 0 extracto bruto, derivado de doze fermentações de 2,5 litros (30 g), foi purificado, parcialmente, pela cromatografia de coluna, empregando-se a alumina (activa neutral, Brockman grau 1, BDH Chemicals Ltd., 500 g), eluindo-se, inicialmente, com hexano e, em seguida, com uma mistura de diclorometano e metanol (na proporção de 1 para 1), recolhendo-se parcelas de 200 a 250 ml. As parcelas foram analisadas pela cromatografia de camada fina, e as que continham o produto desejado foram reunidas e foram evaporadas sob vácuo. Uma parte desta substância (10 g) foi, em seguida, purificada, pela cromatografia de coluna, empregando-se gel de sílica (Kieselgel 60, mesh de 230 a 400, MercK, 500 g), eluindo-se com uma mistura de diclorometano e acetato de etilo (na proporção de 4 para 1). As parcelas, que continham o produto desejado, foram reunidas e foram evaporadas sob vácuo. Esta sub£ tância foi, em seguida, purificada em lotes, pela Cromatografia Líquida de Pressão Elevada, empregando-se uma coluna (41 x 250 mm) de Dynamax 60-A C-18 (Marca de Fábrica, Rainin), eluindo-se com uma mistura de metanol e água (na porção de 4 para 1), com um caudal de 52 ml mor minuto. As parcelas foram analisadas pela Cromatografia Líquida de Elevada Pressão, empregando-se uma coluna ( 10 x 250 mm) de Ultrassphers-ODS (5 jjm) (Marca de Fábrica - Beckman), eluindo-se com um gradiente de metanol-água, e aquelas parcelas, que continham o produto em epígrafe, foram reunidas e foram evaporadas sob vácuo. Uma purificação final foi realizada pela cromatografia, empregando-20-se uma coluna (10 x 250 mm) de Ultrasphere-ODS (5 um) (Marca de Fábrica - Becman), eluindo-se com uma mistura de água e metanol (na proporção de 18 para 82), com um caudal de 3 ml por minuto. As parcelas, que continhamo composto em epígrafe puro, foram reunidas e foram evaporadas atê a secura, no vácuo. A estrutura do produto foi confirmada pela espectrometria de massa e pela espectrometria de ressonância magnética nuclear de protões, como se segue:

A espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido foi levada a efeito num espectrómero de massa 7070E modelo VG, empregando-se uma matriz de protótipo de glicerol, tioglicerol, âgua e cloreto de sódio. (M+Na⁺) observado a m/e 661 (teórico 661).

A espectrometria de massa de impacto electrónico foi levada a efeito empregando-se um espe£ trómetro de massa 7070E de modelo VG. Os valores da massa e_s pecífica, para os fragmentos principais eram 5,95-5,70 (3H,m) 5,45 (sl, 1H), 5,4-5,27 (m, 2H), 5,23 (d, 1Η), 5,10 (d, 1H), 5,05 (sl, 1H), 4,98 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,31 (t, 1H), 4,00 (d, 1H), 3,9-3,8 (m, 2H), 3,8 (d, 1H), 3,7-3,6 (m, 1H), 3,60 (d, 1H), 3,3 (m, 1H), 1,90 (sl, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), (t, 1H), 1,03 (d, 3H), 0,98 (d, 3H), 0,83 (d, 3H).

EXEMPLO 5

23-Hidroxi-25-desmeti1-25-(1,3-dimetil-hexa-1,5-dienil)milbemicina Ag (fórmula II, R⁴ é H, R² é CH₂=CHCH_?CH(CH_?]-b

-21Um inóculo de Streptomyces thermoarchaensís NCIB 12015 foi preparado, lavando-se com ãgua es terilizada uma cultura em declive, que foi mantida num meio preparado a partir de extracto de levedura de cerveja (0,5 g) extracto de malte (30 g), peptona (5 g) e agar (20 g) em água de torneira (1 litro), ajustada a pH 5,4. Este inôculo foi transferido para um balão de Erlenmeyer, contendo 50 ml de um meio contendo glucose (0,8 g), glicerol (0,8 g), peptona (0,8 grama, NaCl (0,06 g), CaCOg (0,02 g) em água de tor neira, ajustada a PH 7. 0 balão foi incubado a 28⁹C, num vi brador rotativo, operando-se a 170 rotações por minuto, du rante 48 horas. A produção végetativa resultante foi transferida para um recipiente de 3 litros, agitado mecanicamente, contendo glucose (5 g), dextrina (50 g), farinha de Trusoy (25 g), melaço de cana (3 g), K₂HP0₄ (0,25 g), CaCOg (2,5 g) e ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico (42,0 g), em água de torneira (2 litros), ajustada a pH 6,5, por adição de uma solução de NaOH a 1N. 0 recipiente foi incubado, a 28^SC com uma velocidade de agitação de 1.000 rotações por minuto e um fluxo de ar de 2 litros por minuto.

Depois de 72 horas, adicionou-se o ácido 2-metilpent-4-enóico (0,8 ml), e a fermentação se manteve, durante outras 72 horas. 0 micélio foi recuperado por filtração e foi suspenso, em acetona (500 ml), durante 1 hora, antes de ter sido filtrado. 0 sólido foi suspenso, novamente, em acetona (500 ml), durante 0,5 hora, e foi filtrado. Os filtrados reunidos foram evaporados atê à secura, sob o vácuo, dando origem a um óleo de cor escura (8,1 gra mas). Esta substância foi parcialmente purificada pela croma^ tografia de coluna, sobre o gel de sílica (Kieselgel 60, malha 230 a 400, Merck - marca de fábrica, 240 g), eluindo-se com uma mistura de diclorometano e acetato de etilo (na proporção de 4 para 1), recolhendo-se parcelas de 50 ml. Estas foram analisadas pela cromatografia de camada fina, e as par celas, que continham o composto em epígrafe, foram reunidas e foram evaporadas, sob o vácuo. Elas foram, em seguida, pui ’ »

rificadas pela cromatografia de coluna, sobre o gel de sílica (130 g), eluindo-se com misturas de diclorometano e éter de dietilo, inicialmente na proporção de 4 para 1, em seguida de 2 para 1, e finalmente só com o éter de dietilo. As parcelas, ricas no produto desejado, foram reunidas, foram evaporadas até à secura sob o vácuo, e foram dissolvidas em metanol (3 ml). Esta solução foi purificada pela Cromatografia Líquida de Pressão Elevada, empregando-se uma coluna (41 χ 250 mm) de Dynamax 60-A C-18 (Marca de Fábrica, Rainin) eluindo-se com uma mistura de metanol e água (na proporção de 4 para 1), com um caudal de 52 ml por minuto. As parcelas foram recolhidas a intervalos de 3 a 5 minutos, e foram anali sadas pela Cromatografia Líquida de Pressão Elevada. As que continham o produto desejado foram reunidas e foram evapora das sob o vácuo. A purificação final foi realizada pela Croma tografia Líquida de Pressão Elevada, empregando-se uma coluna (10 χ 250 mm) de Ultraesfera-ODS (5 um) (Marca de Fábrica Beckman), eluindo-se com uma mistura de água e metanol (na proporção de 18 para 82), com um caudal de 3 ml por minuto.

As parcelas adequadas foram reunidas e foram evaporadas sob o vácuo, dando origem a um pó branco, idêntico, em todos os aspectos, ao produto do Exemplo 4.

EXEMPLO 6

Actividade Antelmíntica

A actividade antelmíntica foi avaliada contra Caenorhabditis elegans, empregando-se o teste de rastreio in vitro, descrito por K. G. Simpkin e G. L. Coles, in Parasitology, 1979, 79, 19. 0 produto dos Exemplos 1 e 2

matou 100% dos vermes, a uma concentração boa de 0,01 partes por milhão.

EXEMPLO 7

Actividade Insecticida

A actividade contra a fase larval da mosca varejeira Lucilia cuprina (estirpe Q) é demosntrada empregando-se um procedimento padrão, em que as larvas de primeiro estádio são mantidas em contacto com o papel de filtro, tratado com o composto em experiência. 0 composto em experiência ê primeiramente aplicado ao papel, como uma sol£ ção de acetona. Os papeis de filtro tratados são, em segui da, colocados em tubos, contendo 1 ml de soro de vitelas recém-nascidas, e adicionam-se os primeiros estádios. 0 produto dos Exemplos 1 e 2 matou 100% das larvas, quando aplicado ao papel de filtro, num grau de 10 miligramas por metro quadrado.

Claims

1-. - Processo, para a preparação de um composto, que tem a fórmula

OR em que R é hidrogénio e R^é hidroxi, ou R e R^ são tomados em conjunto e são oxo:

R ê um grupo alquilo, alquenilo ou alquinilo, de cadeia linear ou ramificada, de 3 a 8 átomos de carbono, que pode, facultativamente conter um átomo de oxigénio ou de enxofre, como parte da cadeia, ou um grupo cicloalquilo ou cicloalquenilo de 3 a 8 átomos de carbono, ou um anel heterocíclico, contendo oxigénio ou enxofre, de 3 a 6 membros, que pode ser saturado ou total ou parcialmente insaturados, e que pode, facultativamente, ser substituído por um, ou mais, grupos alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, ou por átomos de halogênio;

R ê metilo ou etilo;

R⁴ ê hidrogénio ou metilo;

5 6

R ê hidrogénio oujiidroxi, e R ê metilo ou hidroximetilo, ou os dois grupos R$ θ r6 são tomados em conjunto e são

-0-CH₂-;

/ ê hidrogénio, metilo ou etilo; e fi

R é hidrogénio ou halogénio;

com a ressalva de que, quando R ê um alquilo de cadeia ramificada, não ê isopropilo;

caracterizado põr compreender a fermentação de uma estirpe de organismos produtores de milbemicina, Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus NRRL 15773 ou Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, na presença de um ácido carboxilico da 2 2 fórmula R CO^H, em que R ê o que ficou estabelecido no precedente, ou de um seu sal, éster ou amida, ou de um precusor oxidativo para esse fim, e o isolamento do composto da fórmufi la (I) , em que R é hidrogénio, e, facultativamente, a conO versão no composto em que R ê halogénio, por processos convencionais.

2^â. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto, que tem a fórmula

26«1)1 t

2 4 em que R e R são o que ficou estabelecido na reivindicação 1.

3^â. - Processo, de acordo com a reivindicação 2, para a preparação de um composto da fórmula II, de acordo com a reivindicação 2, em que R é (l-metiltio)etilo, 2-pent-4-enilo ou 2-butilo, caracterizado por compreender a fermentação de uma estirpe de organismos produtores de milbemicina, Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus NRRL 15773 ou Streptomyces thermoarchaeusis NCIB 12015, na presença de um sal de sódio do ácido 2-metiltiopropiónico, de um sal de sódio do ácido 2-metilbutírico ou de um sal de sódio do ácido

2-metilpent-4-enóico, respectivamente, e o isolamento do composto de fórmula (II).

4^â. - Processo, para a preparação de uma composição para o tratamento, ou prevenção, de infecções parasíticas, em seres humanos e nos animais, incluindo composições ectoparasiticidas, insecticidas, acaricidas e antelmínticas, caracterizado por compreender a mistura de um composto da fórmula (I) ou (II), como ficou estabelecido na reivindicação 1 ou na reivindicação 2, com um diluente ou veículo, inertes.