CS262673B2

CS262673B2 - Způsob výroby nových derivátů avermectinu

Info

Publication number: CS262673B2
Application number: CS865646A
Authority: CS
Inventors: Stephen Paul Gibson; Kelvin Scott Dr Holdom; Alexander Crossan Dr Goudie; John Desmond Prof Buolock
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1985-07-27
Filing date: 1986-07-25
Publication date: 1989-03-14
Also published as: CS564686A2

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových derivátů avermectinu a milbemycinu, zvláště těch, které mají nový substituent v poloze 25. Jde o antiparazitární prostředky, vhodné pro lidské i veterinární použití.

Avermectiny jsou skupinou antiparazitárních látek s širokým spektrem účinku, které jsou označovány také jako sloučeniny C—-076. Tyto látky je možno získat pěstováním mikroorganismu Streptomyces avermitllis, kmenů ATCC 31267, 31271 nebo 31272 za aerobních podmínek ve vodném živném prostředí s obsahem anorganických solí a využitelných zdrojů uhlíku a dusíku.

Sloučeniny typu milbemycinů jsou strukturně příbuzná makrolidová antibiotika, která nemají zbytek cukru v poloze 13. Tento typ sloučenin je rovněž možno získat fermentací, například způsobem, popsaným ve zveřejněné Evropské patentové přihlášce č. 0170006.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že v případě, že se k fermentačnímu prostředí organismů, produkujících avermectin přidají určité karboxylové kyseliny nebo deriváty těchto karboxylových kyselin, je možno získat nové sloučeniny, které jsou avermectinovým sloučeninám příbuzné, avšak jsou substituovány v poloze 25 jiným než přírodním substituentem, kterým je v této poloze obvykle isopropyl nebo sek.butyl. Nové sloučeniny jsou vysoce účinné antiparasitální látky, které je zvláště vhodně možno použít jako* anthelmintika, látky, hubící ektoparasity, různé druhy hmyzu a jako látky proti roztočům.

K přípravě dalších derivátů těchto sloučenin je možno užít běžných chemických reakcí. Podle vynálezu je tedy možno- získat sloučeninu obecného vzorce I

kde přerušovaná čára v poloze 22 až 23 znamená případnou dvojnou vazbu a buď

R¹ znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu a dvojná vazba je nepřítomna nebo

R¹ není přítomná a je přítomná dvojná vazba,

R² znamená α-rozvětvený alkylový, alkenylový, alkinylový, alkoxyalkylový nebo alkylthioalkylový zbytek vždy o 3 až 8 atomech uhlíku, cykloalkylalkylový zbytek o 5 až 8 atomech uhlíku, v němž alkylovým zbytkem je α-rozvětvený alkylový zbytek o 2 až 5 atomech uhlíku, cykloalkylový zbytek o> 3 až 8 atomech uhlíku, nebo cykloalkenylový zbytek o 5 až 8 atomech uhlíku, vždy popřípadě substituovaný methylenovým zbytkem nebo jedním nebo větším počtem alkylových zbytků o 1 až 4 atomech uhlíku, nebo atom halogenu, nebo thienyl,

R³ znamená atom vodíku nebo methylový zbytek,

R⁴ znamená 4‘-(«-L-oleandrosylj-a-L-oleandrosyloxyskupinu vzorce:

/ ^CH3°

za předpokladu, že v případě, že R² znamená alkylový zbytek, má tento zbytek odlišný význam od isopropylové nebo sek.butylové skupiny tak, že se pěstuje kmen organismu Streptomyces avermitilis, NCIB 12121 za přítomnosti karboxylové kyseliny obecného vzorce II

R²COOH (II) kde

R^z má svrchu uvedený význam, nebo za přítomnosti soli, esteru nebo amidu této kyseliny nebo oxidativního prekursoru těchto látek obecných vzorců

R²CH(NH2)CO2H,

R²CH₂NH_a

R²(CH2)_nCO2H,

R²CH2OH nebo

R²CHO, v nichž R² má svrchu uvedený význam a n znamená celé číslo 2, 4 nebo 6 a následnou izolací sloučeniny obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu a dvojná vazba není přítomna nebo dvojná vazba je přítomná, R¹ není přítomno a v případě potřeby se sloučenina, v níž se vyskytuje dvojná vazba a R¹ chybí, redukuje za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, v němž R¹ znamená atom vodíku a dvojná vazba schází.

Ve svrchu uvedené definici mohou mít alkylové skupiny o 3 nebo více atomech uhlíku přímý nebo' rozvětvený řetězec. Atomem halogenu může být atom fluoru, chloru, bromu nebo jódu. Zbytky «-rozvětvené jsou vázány tak, že atom uhlíku, vázaný v poloze 25 je sekundární uhlíkový atom, vázaný na dva další uhlíkové atomy. V případě, že R² znamená alkylový zbytek o 5 nebo více atomech uhlíku, může být zbytek alkylového řetězce přímý nebo ještě dále rozvětvený.

Výhodnými sloučeninami obecného vzorce I jsou ty látky, v nichž R⁴ znamená 4‘-(a-L-oleandrosyl j -a-L-oleandrosyloxyskupinu.

Dalšími výhodnými sloučeninami jsou ty látky obecného vzorce I, v němž R² znamená cykloalkylový nebo cykloalkenylový zbytek o 5 až 6 atomech uhlíku, popřípadě substituovaný jedním nebo větším počtem alkylových zbytků o 1 až 4 atomech uhlíku, zvláště výhodným substituentem je v tomto případě cyklopentylový zbytek. V další skupině výhodných látek znamená R² cyklobutylový zbytek. V další skupině výhodných sloučenin znamená R² alkylthioalkylovou skupinu o 3 až 8 atomech uhlíku, zejména 1-methylthioethylovou skupinu nebo thienyl.

Při provádění způsobu podle vynálezu je možno získat sloučeninu obecného vzorce I, tak, že se podrobí fermentaci organismu, produkující avermectin, například mikroorganismus Streptomyces avermitilis kmene ATCC 31 267, 21 271 nebo 31 272 za přítomnosti příslušné karboxylové kyseliny obecného vzorce R²COOH, kde R² má svrchu uvedený význam nebo za přítomnosti její soli, esteru, amidu nebo oxidativního prekursoru těchto látek. Kyselina se přidá do fermentačního prostředí buď najednou při naočkování, nebo v různých intervalech v průběhu fermentace. Produkci sloučenin obecného vzorce I je možno sledovat odebíráním vzorků fermentačního prostředí, jejich extrakcí organickým rozpouštědlem s následnou chromatografií, například při použití vysokotlaké kapalinové chromatografie. Ve fermentaci se pokračuje až do dosažení maximálního výtěžku sloučenin obecného vzorce T, obvykle 4 až 6 dnů.

Výhodné množství při každém přidání karboxvlové kyseliny nebo jeiího derivátu se oohvbuie v rozmezí 0,05 až 1,0 g na litr. Nejlepších výtěžků sloučenin obecného vzorce I je možno dosáhnout postupným přidáváním kyseliny k fermentačnímu prostředí, naoříklad každodenním přidáváním kyseliny nebo jejího derivátu v průběhu několika dnů. Kyselina se s výhodou přidává ve formě soli, naoříklad sodné nebo amonné soli, je však možno ji přidávat také ve formě esteru, například methvlesteru nebo ethylesteru nebo ve formě amidu. Alternativními substráty, kterých je možno užít v průběhu fermentace jsou deriváty, které jsou oxidativními pre262673 kursory karboxylových kyselin, může tedy například jít o aminokyselinu obecného vzorce

R²CH(NH2)COOH glyoxylové kyseliny vzorce

R²COCOOH methylaminové deriváty vzorce R²CH2NHz substituované nižším alkankyseliny obecného vzorce

R²[CH2)_nCOOH kde n znamená celé číslo 2, 4 nebo 6, methanolové deriváty obecného vzorce R²CH2OH nebo aldehydy obecného vzorce R²CHO, ve všech těchto vzorcích má R² svrchu uvedený význam. Prostředím, které se užije pro fermentači může být běžné komplexní prostředí, které obsahuje využitelné zdroje uhlíku, dusíku a zdroje stopových prvků. Bylo však zjištěno, že v případě, že se užije mikroorganismu Streptomyces avermitilis kmen ATCC 31 271, který poskytuje zlepšené výtěžky sloučenin obecného vzorce I, je výhodnější použít semidefinovaného prostředí, což má tu výhodu, že surové extrakty obsahují podstatně menší množství nežádoucích vedlejších materiálů, což velmi zjednodušuje následnou izolaci a čištění získaných výsledných produktů. Svrchu uvedený kmen byl uložen ve veřejné sbírce National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) 19. července 1985 pod číslem NCIB 12 121.

Fermentace se provádí několik dnů při teplotě s výhodou v rozmezí 24 až 33 °C, načež se fermentační prostředí odstředí nebo zfiltruje a myceliální koláč se extrahuje acetonem nebo methanolem. Takto získaný extrakt se koncentruje a výsledný produkt se z něj extrahuje do s vodou nemísitelného organického rozpouštědla, například methylenchloridu, ethylacetátu, chloroformu, butanolu nebo methylisobutylketonu. Takto získaný extrakt se zahustí a surový produkt s obsahem sloučenin obecného vzorce I se dále podle potřeby čistí chromatografií, například preparativní chromatografií při použití reverzní fáze nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií.

Výsledný produkt se obvykle získá jako' směs sloučenin, v nichž R⁴ znamená 4‘-(«-L-oleandr osyl) -a-L-oleandrosyloxyskupinu,

R¹ znamená hydroxyskupinu a dvojná vazba není přítomná nebo R¹ není přítomno a dvojná vazba je přítomná, R³ znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu, podíly jednotlivých typů těchto sloučenin se mohou měnit v závislosti na použité karboxylové kyselině a také v závislosti na použitých reakčních podmínkách.

Bylo prokázáno, že k fermentačnímu prostředí je možno přidat širokou škálu karboxylových skupin, definovaných obecným vzorcem R²COOH za vzniku avermectinu s novým substituentem v poloze 25. Příkladem kyselin, které je k tomuto účelu možno užít, mohou být následující sloučeniny:

kyselina 2-methylvalerová kyselina 2-methyl-4-pentenová kyselina 2-methylthioppoplonová kyselina 2-cyklopropylpropionová kyselina cyklobutankarboxylová kyselina cyklopentankarboxylová kyselina cyklohexankarboxylová kyselina cykloheptankarboxylová kyselina 1-methylcyklopropantoarboxylová kyselina 3-cyklohexan-l-karboxylová a kyselina thiofen-3-karboxylová.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se fermentace provádí za přítomnosti sodné soli kyseliny cyklopentankarboxylové, čímž se získá převážně sloučenina obecného vzorce I, v němž R⁽ znamená hydroxylovou skupinu, dvojná vazba není přítomna, R² znamená cyklopentylový zbytek, R³ znamená methyl a R⁴ znamená 4''-(a-L-oleandrosyl)-a:-4-oleandrosylskupina.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se fermentace provádí za přítomnosti sodné soli kyseliny thiofen-3-karboxylové, čímž se získá převážně jako výsledný produkt sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomná, R² znamená 3-thienylový zbytek, R³ znamená methylový zbytek a R⁴ znamená 4‘-(«-L-oleandrosylj-α-4-oleandrosyloxyskupinu.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se fermentace provádí za přítomnosti sodné soli kyseliny 2-methylthiopropionové, čímž se jako výsledný produkt získá převážně sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomná, R² znamená 1-methylthioethylovou skupinu, R³ znamená methylovou skupinu a R⁴ znamená 4‘- (a-L· oleandrosyl) -α-4-oleandr osyloxyskupinu.

Sloučeniny obecného vzorce I, které obsahují dvojnou vazbu a neobsahují skupinu R¹, je možno získat také z odpovídajících sloučenin obecného vzorce I, v němž R¹znamená hydroxylovou skupinu a dvojná vazba není přítomna, a to dehydratací. Reakci je možno provádět tak, že se nejprve selektivně zavede ochranná skupina na hydroxylové skupiny v polohách 5 a 4“, například za vzniku terc.butyldimethylsilyloxyacetylového derivátu, po této reakci se provádí reakce se substituovaným thiokarbonylhalogenidem, například (4-methylfenoxyjthiokarbonylchloridem s následným zahří262673 váním ve vysokovroucím rozpouštědle, například trichlorbenzenu k uskutečnění dehydratace. Nakonec se výsledný produkt zbaví ochranných skupin, čímž se získá požadovaná nenasycená sloučenina. Tyto stupně spolu s příslušnými reakčními činidly a reakčními podmínkami jsou popsány v US patentovém spisu č. 4 328 335.

Sloučeniny obecného vzorce I v němž R³znamená atom vodíku, je možno získat z odpovídajících sloučenin, v nichž R³ znamená ethylový zbytek demethylací. Tuto reakci je možno provést tak, že se působí na 5-methoxysloučeninu nebo na vhodným způsobem chráněný derivát této sloučeniny octanem rtuťnatým s následnou hydrolýzou takto získaného 3-acetoxyenoletheru zředěnou kyselinou za vzniku požadované 5-ketosloučeniny.

Tato látka se pak redukuje například působením borohydridu sodného, čímž se získá požadovaný 5-hydroxyderivát. Příslušné reakční podmínky a reakční činidla pro tyto reakční stupně byly podrobně popsány v US patentovém spisu č. 4 423 209.

Sloučeniny obecného vzorce I, v němž R¹znamená atom vodíku a dvojná vazba není přítomná, je možno získat z odpovídajících sloučenin, v nichž dvojná vazba je přítomná, a v nichž se nenachází substituent R¹ selektivní katalytickou hydrogenací za přítomnosti příslušného katalyzátoru. Reakci je například možno provádět působením tris-(trifenylfosfinj rhodium (lj chloridu, jak bylo popsáno ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 0001689.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu, jsou vysoce účinnými antiparazitálními látkami, které je možno zvláště dobře použít jako anthelmintika, látky k hubení ektoparazitů, hmyzu a roztočů.

Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu jsou účinné proti řadě onemocnění, způsobených endoparazity včetně helminthiasy, která je nejčastěji způsobována skupinou parazitických červů, popisovaných jako nematoda, tato sekupina parazitů způsobuje velké hospodářské ztráty u vepřů, ovcí, koní a skotu i u malých domácích zvířat a u drůbeže.

Tyto látky jsou rovněž účinné proti jiným nematodům, kteří způsobují onemocnění u zvířat, jako například Dirofilaria u psů, tímto způsobem je možno hubit i další různé parazity, kteří mohou napadat člověka, včetně gastrointestinálních parazitů, jako· jsou Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius a dalších parazitů, které je možno nacházet v krvi a ostatních tkáních nebo orgánech, včetně mimostřevních stádií Strongyloides a Trichinella.

Uvedené látky jsou rovněž cenné při léčbě infekcí, způsobených ektoparazity, například z rodu Arthropoda u zvířat i u ptáků, například parazity typu Acarina, Siphonaptera, dále může jít o vši, mouchy a různé druhy bodavého hmyzu i migrující larvy dvoukřídlých, které napadají skot a koně.

Uvedené sloučeniny mají také insekticidní účinek proti domácím škůdcům, jako jsou například šváb, mol,, moucha domácí a Anthrenus scrophulariae a také proti hmyzu, kteřý škodí ve skladovaném obilí, a který poškozuje i další zamědělské produkty, jako jsou například různé druhy Tetramychidae a různé druhy Hemiptera, jakož i proti migrujícím druhům Orthoptera.

Sloučeniny obecného vzorce I je možno podávat ve formě prostředků, upravených s ohledem na specifické použití a také s ohledem na typ škůdce, proti kterému má prostředků být použito. Při použití jako anthelminticum je možno sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu podávat peropalný prostředek, nebo je také možno tyté kapsle, bolus, tableta nebo s výhodou karálně, vhodnou formou je v tomto případě látky podávat injekčně nebo ve formě implantátu.

Tyto prostředky je možno připravit obvyklým způsobem v souladu s běžnou veterinární praxí. Kapsli, bolus nebo tabletu je možno připravit tak, že se účinná složka smísí s jemně práškovaným ředidlem nebo nosičem, který popřípadě obsahuje ještě činidlo, napomáhající rozpadu této lékové formy a/nebo pojivo, například škrob, laktózu, mastek, stearan hořečnatý apod.

Kapalnou formu je možno připravit například dispergováním účinné složky ve vodném roztoku spolu s dispergačním činidlem nebo smáčedlem a podobně, injekční prostředky je možno připravit například ve formě sterilních roztoků, které mohou obsahovat také další látky, například dostatečné množství soli nebo glukózy k tomu, aby roztok byl isotonický s krví. Tyto prostředky se budou měnit s ohledem na množství účinné složky, s ohledem na druh hostitele, na závažnosti a na typu infekce i na hmotnosti hostitele. Při perorálním podání se obvykle dávka pohybuje v rozmezí 0,001 až 10 mg/kg hmotnosti zvířete pro jednotlivou dávku nebo rozděleně po dobu 1 až 5 dní. Tato léčba obvykle postačí, mohou se však vyskytnout případy, kdy je zapotřebí užít nižších nebo vyšších dávek, a které rovněž spadají do oboru vynálezu.

Dalším možným způsobem podání sloučenin, vyrobených způsobem podle vynálezu, je jejich společné podání s krmivém. K tomuto účelu je možno připravit koncentrované krmivo nebo přísadu do krmivá, určenou k smísení s běžným krmivém těsně před jeho použitím.

Při použití k insektlcidním účelům a k boji proti škůdcům na zemědělských produktech je možno účinné látky užít ve formě spreje, poprašků, emulze a podobně v souladu s běžnou zemědělskou praxí.

Vynález bude dále osvětlen následujícími příklady, z nichž příklady 1 až 19 popisují výrobu účinných látek obecného vzorce I,

282673 příklad 20 popisuje výrobu kapalného prostředku s obsahem účinné látky a příklady 21 a 22 dokládají antiparazitární a insekticidní účinnost těchto sloučenin.

Příklad 1

25-cyklopentylavermectln A2

Suspenze kultury S. avermitilis NCIB 12 121 ze šikmého agaru se naočkuje do 600 ml prostředí, které obsahuje 12,0 g laktosy, 8,0 gramu lihovarských výpalků, a 3,0 g extraktu z kvasnic v baňce o objemu 3 litry, kultura se pak inkubuje při teplotě 28 °C celkem 3 dny. Takto získaný očkovací materiál se užije k naočkování 16 1 prostředí, které obsahuje 640 g rozpustného škrobu, 32 g síranu amonného, 16 g hydrogenfosforečnanu draselného, 16 g chloridu sodného, 16 g síranu hořečnatého . 7 IT2O, 32 g uhličitanu vápenatého, 6,4 g rozpustného extraktu z kvasnic, 0,016 g síranu železnatého . 7 H2O, 0,016 g síranu zinečnatého . 7 H2O a 0,016 g chloridu manganatého . 4 H2O ve fermentoru o objemu 20 litrů.

Fermentační prostředí se po naočkování inkubuje při teplotě 28 °C za stálého míchání při 250 výkyvech za minutu a při provzdušňování 15 litrů vzduchu za minutu. Po 24 hodinách a pak znovu po 48 a 72 hodinách inkubace se přidá vždy 1,6 g kyseliny cyklopentankarbóxylové ve formě její sodné soli a inkubace trvá celkem 120 htodin. Po této době se myselium oddělí filtrací a extrahuje se třikrát 7 litry směsi acetonu a 1M kyseliny chlorovodíkové v objemovém poměru 100 : 1. Získaný extrakt se zahustí za sníženého tlaku na objem přibližně 2 litry a pak se extrahuje dvakrát 5 litry methylenchloridu. Takto získaný methylenchloriďový extrakt se odpaří do sucha, čímž se získá jako surový produkt olejovltá kapalina, která se rozpustí v diethyletheru a roztok se pak nanese na vrchol sloupce s obsahem 1 kg silikagelu. Sloupec se vymývá diethyletherem, přičemž se odebírají frakce o objemu 100 ml. Frakce 20 až 40 se slijí a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá částečně čištěný materiál. Tento produkt se rozpustí ve směsi methanolu a vody v objemovém poměru 1:4a roztok se pak chromatografuje na sloupci o rozměrech 50 milimetrů X 50 cm s náplní C18 Micro-Bondapak v přístroji pro vysokotlakou kapalinovou chromatografií (Waters Prep 500) při použití téhož rozpouštědla a při rychlosti průtoku 100 ml za minutu. Frakce 35 až 50, které obsahují požadovaný produkt, se slijí a znovu se chromatografují na sloupci o rozměrech 21 mm X 25 cm s náplní C18 Zorbax ODS (Dupont), sloupec se vymývá směsí methanolu a vody v poměru 4 : 1 při rychlosti průtoku 9 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomna, R² znamená cyklopentyl, R³ znamená methyl a R⁴ znamená 4‘- (α-L-oleandrosyl j-a-I-oleandrosyloxyskupinu ve formě bílého prášku s teplotou tání 150,5 až 151 °C. Struktury výsledného produktu bylo možno potvrdit hmotovou spektrometrií a C13-nukleární magnetickou resonancí, byly získány následující výsledky:

Hmotová spektrografie (bombardování rychlými atomy) byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 707OE) při použití matrice a triethylenglykolu s pevným chloridem sodným (M2Na)⁺, m/e je 939 (teoretická hodnota 939).

Hmotová spektrografie (náraz elektronů) byla prováděna rovněž na hmotovém spektrometru svrchu uvedeného' typu. Hodnoty m/e pro hlavní fragmenty byly tyto: 335, 317, 275, 257, 251, 233, 205, 181, 179, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Při 13C-nukleární magnetické rezonanci bylo užito spektrometru (Brucker Model WM—-250) při koncentraci vzorku 20 mg/ /ml v deuterochloroformu. Chemické posuny v ppm vzhledem k tetramethylsilanu byly tyto: 14,1, 15,3, 17,8, 18,5, 19,9, 20,3, 24,6, 25,9, 26,2, 29,3, 34,4, (2C), 34,7, 36,7, 37,8,

39,8, 40,5, 41,0, 41,3, 45,8, 56,4, 56,6, 57,8,

67,4, 67,6, 68,0, 68,3, 68,7, 69,9, 70,5, 76,0,

77,6 (2C), 78,3, 79,5, 80,7 (2C), 81,8, 94,9,

98,7, 99,8, 117,7, 118,5, 119,8, 125,0, 135,8, 136,3, 137,8, 140,1 a 173,8.

Příklad 2

Suspenze kultury S. avermitilis ATCC 31 271 ze šikmého agaru se užije k naočkování 50 ml živného prostředí, které obsahuje 1,0 g laktózy, 0,75 g lihovarských výpalků a 0,25 g extraktu z kvasnic v baňce o objemu 350 ml, naočkované živné prostředí se inkubuje 3 dny při teplotě 28 °C. 4 ml takto získaného očkovacího materiálu se užijí k naočkování vždy jedné baňky z 50 baněk s obsahem 50 ml živného prostředí, které obsahuje 2,0 g kukuřičného škrobu, 0,35 gramu sójové mouky a 0,25 g extraktu z kvasnic v 350 ml prostředí, baňky se inkubují při teplotě 28 °C.

Po 24 hodinách se do každé baňky přidá 5 mg sodné soli kyseliny cyklopentankarboxylové a fermentace se provádí za týchž podmínek ještě 5 dnů. Po této době se obsah všech baněk slije a mycelium se oddělí odstředěním. Pak se mycelium extrahuje směsí acetonu a IN kyseliny chlorovodíkové v poměru 100 : 1 a acetonový extrakt se odpaří do sucha. Extrakt se analyzuje vysokotlakou kapalinovou chromatografií, čímž je možno prokázat, že takto získaný výsledný produkt je totožný s výsledným produktem, získaným způsobem podle příkladu 1.

282673

Příklad 3

Očkovací materiál byl připraven způsobem, popsaným v příkladu 1 a byl užit k naočkování 50 ml téhož prostředí jako v příkladu 1 v baňkách o objemu 350 ml.

Živné prostředí se po naočkování inkubuje 24 hodin, pak se přidá 5 mg kyseliny 2-aminocyklopentyloctové (cyklopentylglycinu) a ve fermentaci se pokračuje ještě dalších 5 dní. Pak se výsledný produkt oddělí extrakcí mycelia acetonem a methylenchloridem. Získaný extrakt se analyzuje vysokotlakou kapalinovou chromatografií, čímž je možno prokázat, že takto získaný výsledný produkt je totožný s výsledným produktem, který byl získán způsobem podle příkladu

1.

Příklad 4

Fermentace byla prováděna způsobem podle příkladu 3 s tím rozdílem, že jako- substrát byl užit cyklopentalmethanol.. Tímto způsobem bylo možno dosáhnout obdobného výsledku jako v příkladu 3.

Příklad 5

Fermentace byla prováděna obdobným způsobem jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že jako substrát byl užit methylester kyseliny cyklopentankarboxylové v methanolovém roztoku. Tímto způsobem bylo možno dosáhnout obdobného výsledku jako v příkladu 3.

Příklad 6

Fermentace byla prováděna obdobným způsobem jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že jako substrát byla užita kyselina cykl-opentankarboxylová v methanolovém roztoku. Tímto způsobem bylo- možno dosáhnout obdobného výsledku jako v příkladu 3. Příklad 7

25- (3-thienyl javermectin

Suspenzen kultury S. avermitilis NCIB 12 121 se užije k naočkování 600 ml živného prostředí s obsahem 12,0 g laktosy, 8,0 gramů lihovarských výpalků a 3,0 g extraktu z kvasnic v baňce o objemu 3 1, naočkované prostředí se inkubuje 3 dny při teplotě 28 °C. Takto získaný materiál se pak užije k naočkování 16 1 živného prostředí, obsahujícího 640 g rozpustného škrobu, 32 g síranu amonného, 16 g hydrogenfosforečnanu draselného, 16 g chloridu sodného, 16 g síranu hořečnatého . 7 H2O, 32 g uhličitanu vápenatého, 6,4 g rozpustného extraktu z kvasnic, 0,016 g síranu železnatého . 7 H2O, 0,-016 g síranu zinečnatého. 7 H2O, a 0,016 gramu chloridu manganatého . 4 H2O ve fermentoru o objemu 20 1.

Fermentační prostředí se po naočkování inkubuje při teplotě 28 °C za míchání 250 otáčkami za minutu a za provzdušňo-vání 15 litry vzduchu za minutu. Po 24 hodinách a znovu po 48 a 72 hodinách se přidá vždy 1,6 gramu kyseliny thiofen-3-karboxylové, fermentace trvá celkem 120 hodin. Po- této době se mycelium -oddělí filtrací a extrahuje se 3X71 směsi acetonu a IN kyseliny chlorovodíkové v poměru 100 : 1. Získaný extrakt se odpaří za sníženého tlaku na množství přibližně 2 litry a pak se extrahuje 2X51 methylenchloridu. Methylenchloridový extrakt se odpaří do sucha, čímž se získá v olejovité formě surový produkt, který se rozpustí v diethyletheru a r-oztok se nanese na vrchol sloupce s obsahem 1 kg silikagelu. Sloupec se vymývá směsí diethyletheru a -odebírají se trakce o -objemu 100 ml. Frakce 32 až 45 se slijí a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá částečně čištěný materiál. Tento produkt se rozpustí ve směsi methanolu a vody a poměru 3:1a pak se chromatografuje na sloupci o rozměrech 50 mm X 50 centimetrů s náplní C18 Micro-Bondapack v zařízení pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii (Waters Prep 500) při použití téhož rozpouštědla při rychlosti průtoku 100 mililitrů za minutu. Frakce 27 až 36, které obsahují požadovaný výsledný produkt se slijí a znovu se chromatografují na sloupci o rozměrech 21 mm X 25 cm s náplní C18 Zorbax ODS (Dupontj, sloupec se vymývá směsí methanolu a vody v poměru 3 : 1 při rychlosti průtoku 9 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí a rozpouštědlo- se odpaří, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomna, R² znamená 3-thienyl, R³ znamená methyl a R⁴ znamená 4‘-(«-L-oleandrosyl) -α-L-oleandrosylskupinu ve formě bílého prášku o teplotě tání 167 °C. Struktura výsledného produktu byla potvrzena hmotovou spektrometrií následujícím způsobem:

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla prováděna na hmotovém spektrometru (VG Model 707OE) při použití trlethylenglykolu a pevného chloridu sodného (M + Na)·¹', m/e je 953 (teoretická hodnota 953 j.

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla prováděna na hmotovém spektrometru (VG Model 707OF). Hodnoty m/e pro- hlavní fragmenty jsou 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127, 113, 95 a 87.

Příklad 8

Suspenze vegetativních buněk S. ave-rmitilis NCIB 12 121, která byla uchovávána při teplotě —60 ^QC v 2 ml 10% glycerolu ve vodě byla užita k naočkování 50 ml živného- prostředí s obsahem 1,-0 g laktosy, 0,75 gramu lihovarských výpalků a 0,25 g extraktu z kvasnic v kónické b-aňce s obsahem

300 ml, fermentační prostředí bylo po naočkování inkubováno zatřepání 24 hodin při teplotě 28 °G. Takto získaný materiál byl užit k naočkování 600 ml živného prostředí v baňce o objemu 3 1, materiál byl opět inkubován za protřepávání 24 hodin při teplotě 28 “G. Produkt této fermentace byl užit k naočkování 10 1 svrchu uvedeného prostředí ve fermentoru o obsahu 16 1, tentokrát byla inkubace prováděna 24 hodin při teplotě 23 C za míchání rychlostí 350 otáček za minutu a za provzdušňování 10 1 vzduchu za minutu. 600 ml takto získaného materiálu bylo užito k naočkování 16 1 živného prostředí s obsahem 640 g částečně hydrolyzovaného škrobu, 32 g síranu amonného, 16 g hydrogenfosforečnanu draselného, 16 g chloridu sodného, 16 g síranu horečnatého . . 7 HzO, 32 g uhličitanu vápenatého, 6,4 g rozpustného extraktu z kvasnic, 0,016 g síranu železnatého . 7 HzO, 0,016 g síranu zinečnatého . 7 I-I2O a 0,016 g chloridu manganatébo . 4 H/) ve fermentoru o objemu 20 1. Fermentační prostředí bylo po naočkování inkubováno při teplotě 28 °C za míchání rychlostí 350 otáček za minutu a za provzdušňování 15 1 vzduchu za minutu.

Po 24 hodinách a pak znovu po 48 a 72 hodinách bylo přidáno vždy 1,6 g sodné soli kyseliny cyklobutankarboxylové a fermentace byla prováděna celkem 120 hodin. Po této době bylo mycelium odděleno filtrací a extrahováno 3X71 acetonu. Extrakt byl odpařen za sníženého tlaku na objem přibližně 2 1 a pak byl extrahován 2X51 methylenchloridu. Methylenchloridový extrakt byl odpařen do sucha, čímž byl získán surový produkt jako olejovitá kapalina. Tato kapalina byla rozpuštěna ve 150 ml isooktanu a roztok byl extrahován směsí 95 ml methanolu a 5 ml vody. Odpařením methanolového extraktu byl získán částečně čištěný materiál, který byl rozdělen na své jednotlivé složky vysokotlakovou kapalinovou chromatografii tak, že odparek byl rozpuštěn v malém množství methanolu a roztok byl chromatografován na sloupci o rozměrech 50 mm X 50 cm s náplní C18 Micro-Boudapack v zařízení pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii (Watcrs Prep 500) při použití směsi methanolu a vody v poměru 4 : 1 při rychlosti průtoku 100 ml za minutu. Frakce 1 až 4 byly slity a užity v příkladu 9, frakce 5 až 9 byly slity a užity v příkladu 10, frakce 10 až 19 byly slity a užity v příkladu 11 a frakce 20 až 35 byly slity a užity v příkladu 12.

Příklad 9

25-cyklobutylavermectin B2 (R⁴-= OH, R³ — H)

Slité frakce 1 až 4 z příkladu 8 se odpaří do sucha a odparek se znovu chromatografuje na sloupci o rozměrech 21 X 25 cm s náplní C18 Zorbax ODS (Dupont), sloupec se vymývá směsí methanolu a vody v poměru 3 : 1 při rychlosti průtoku 9 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí, rozpouštědlo se odpaří a produkt se podrobí konečnému čištění na sloupci o rozměrech 10,5 mm X 25 centimetrů s náplníí Silica Spherisorb 5 micron (HPLC Technology), sloupec se vymývá směsí methylenchloridu a methanolu v poměru 98 : 2 při rychlosti průtoku 4 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomná, R² znamená cyklobutyl, R³ znamená atom vodíku a R⁴ znamená 4‘-(a-L-oleandrosyl)-α-L-oleandrosyloxyskupinu ve formě bílého prášku o teplotě tání 110 až 112 °C. Struktura výsledného' produktu byla potvrzena hmotovou spektrometrií následujícím způsobem:

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla prováděna na hmotovém spektrometru (WG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného. (M + Na)+, m/e je 911 (teoretická hodnota je 911).

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla prováděna rovněž na hmotovém spektrometru (WG Model 7070F). Hodnoty m/e pro hlavní fragmenty jsou: 321, 303, 261, 257, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 10

25-cyklobutylavermectin A2 (R¹ = OH, R³ = CH3)

Slité frakce 5 až 9 z příkladu 8 se odpaří do sucha a odparek se znovu chromatografuje na sloupci o rozměrech 21 mm X 25 centimetrů s náplní C18 Zorbax ODS (Dupont), sloupec se vymývá směsí methanolu a vody v poměru 77 : 23 při rychlosti průtoku 9 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí a odpaří, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomna, R²znamená cyklobutyl, R³ znamená methyl a R¹ znamená 4 - (α-L-oleandrosyl) -L-oleandrosyloxyskupinu ve formě bílého prášku, o teplotě tání 135 až 140 °C.

Struktura výsledného produktu byla potvrzena hmotovou spektrometrií následujícím způsobem:

Hmotová spektrometrie byla prováděna na hmotovém spektrometru (VG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného. (M + Na)⁴, m/e je 925 (teoretická hodnota je 925).

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla prováděna na hmotovém spektrometru (VG Model 7070F). Hodnoty m/e pro· hlavní fragmenty jsou: 596, 454, 321, 303, 275, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 11

25-cyklobutylavermectin Bl (22.23-dvojná vazba, R³ = H)

Slité frakce 10 až 19 z příkladu 8 se odpaří do sucha a odparek se rozpustí v methanolu a pak se chromatografuje na sloupci o rozměrech 21 mm X 25 cm s náplní C18 Zorbax ODS (Dupont), sloupec se vymývá směsí methanolu a vody v poměru 4 : 1 při rychlosti průtoku 9 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá výsledný produkt, který se znovu chromatografuje na sloupci o rozměrech 21 milimetrů X 25 cm s náplní Silica Zorbas SIL (Dupont), sloupec se vymývá směsí dichlormethanu a methanolu v poměru 98,5 : : 1,5 při rychlosti průtoku 9 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ je nepřítomno, dvojná vazba je přítomná, R² znamená cyklobutyl, R³ znamená atom vodíku a R⁴ znamená 4'-(a-L-oleamdrosyl)-L-oleandrosytoxyskupinu ve formě bílého prášku o teplotě tání 135 až 138 °C. Struktura výsledného produktu byla potvrzena hmotovou spektrometrií následujícím způsobem:

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla prováděna na hmotovém spektru (VG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného. (M+Na)⁺, m/e je 893 (teoretická hodnota (893).

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla prováděna při použití hmotového spektrometru (VG Model 7070F). Hodnoty m/e pro hlavní fragmenty jsou: 303, 261, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 12

25-cyklobutylavermectiin Al (22,23-dvojná vazba, R³ = methyl)

Slité frakce 20 až 35 z příkladu 8 se odpaří do sucha a odparek se chromatografuje na sloupci o rozměrech 21 mm X 25 cm s náplní C18 Zorbax ODS (Dupont] při rychlosti průtoku 9 ml za minutu.

Příslušné frakce se slijí, rozpouštědlo se odpaří a produkt se znovu chromatografuje na sloupci o rozměrech 10,5 mm X 25 cm s náplní Silica Spherisorb 5 micron (HPLC Technology), sloupec se vymývá směsí dichlormethanu a methanolu v poměru 98,5 :

: 1,5 při rychlosti průtoku 4 ml za minutu. Příslušné frakce se slijí a odpaří, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ není přítomno, je přítomna dvojná vazba, R² znamená cyklobutyl, R³ znamená methyl a R⁴ znamená 4‘-(a-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxyskupinu ve formě bílého prášku o teplotě tání 120 až 124 °C. Struktura výsledného produktu byla potvrzena hmotovou spektrometrií následujícím způsobem:

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného. (M + Na)⁺, m/e je 907 (teoretická hodnota 907).

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 7070F). Hodnoty m/e pro hlavní fragmenty jsou: 578, 303, 275, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 13

25-(cyklohex-3-enyl)avermectin A2

Postupuje se při použití živného prostředí a podmínek z příkladu 1 s tím rozdílem, že jako substrát se užije sodná sůl kyseliny 3-cyklohexanové, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomná, R² znamená cyklohex-3-enyl, R³ je methylový zbytek a R⁴ znamená 4‘-(a-L-oleandrosylj-a-L-oleandrosyloxyskupmu ve formě bílého prášku o teplotě tání 131 až 135 °C.

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného. (M -í- Na)+, m/e je 951 (teoretická hodnota 951).

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 7070F). Hodnoty m/e pro hlavní fragmenty jsou: 624, 482, 349, 331, 275, 263, 245, 235, 217, 205, 193, 179, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 14

2.j-cyklohexylavermectin A2

Byl opakován způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že jako substrát byla užita sodná sůl kyseliny cyklohexankarboxylové, čímž byla získána sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, R² znamená cyklohexyl, R³ znamená methyl a R⁴· znamená 4‘-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxyskupinu ve formě bílého prášku o teplotě tání 112 až 117 ⁰C.

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného. (M + Na) ⁺ , m/e je 953 (teoretická hodnota je 953).

2B2S73

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 7070F). Hodnoty m/e pro hlavní fragmenty jsou: 624, 482, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 15

25- (1-methylthioethyl) avermectin A2

Opakuje se způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se jako substrát užije sodná sůl kyseliny 2-methylthiopropionové, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu, R² znamená 1-methylthioethylovou skupinu, R³ znamená methyl a R⁴ znamená 4‘-(w-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxyskupinu ve formě bílého prášku o teplotě tání 134 až 138 °C.

Struktura výsledného produktu byla potvrzena hmotovou spektrometrií takto:

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla provedena na hmotovém spektrometru (VG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného. (Μ -I- Na)⁺, m/e je 945 (teoretická hodnota 945).

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla provedena hmotovým spektrometrem (VG Model 7070F). Hodnoty m/e pro hlavní fragmenty jsou: 341, 323, 275, 263, 257, 239, 211, 187, 179, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 16

25- (2-methylcyklopropyl)avermectin A2

Opakuje se způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se jako substrát užije sodná sůl kyseliny 2-methylcyklopropankarboxylové, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxylovou skupinu, R² znamená 2-methylcyklopropyl, R³ znamená methyl a R⁴ znamená 4‘-(w-L-oleandrosyl)-L-oleandrosyloxyskupinu ve formě bílého prášku o teplotě tání 147 až 150 °C.

Struktura výsledného· produktu byla potvrzena hmotovou spektrometrií takto:

Hmotová spektrometrie (bombardování rychlými atomy) byla provedena na hmotovém spektrometru ( VG Model 7070E) při použití triethylenglykolu a pevného chloridu sodného·, (M + Na)⁺, m/e je 925 (teoretická hodnota 925).

Hmotová spektrometrie (náraz elektronů) byla provedena hmotovým spektrometrem (VG Model 7070F). Hodnota m/e pro hlavní fragmeny je: 596, 454, 303, 275, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 a 87.

Příklad 17

Byl opakován způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se jako substrát užije některá z následujících karboxylových kyselin místo kyseliny cyklopentankarboxylové, čímž se získá příslušný 25-substituovaný avermectin obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxylovou skupinu, dvojná vazba není přítomna, nebo je přítomna a není přítomen substituent R¹, R³ znamená atom vodíku nebo hydroxylovou skupinu, a R⁴ znamená 4‘-(«-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxyskupinu:

kyselina 2-methylvalerová kyselina 2,3-dimethylmáselná kyselina 2-methylhexanová kyselina 2-methyl-4-pentenová kyselina 2-methylpentanová kyselina 2-cyklopropylpropionová kyselina cykloheptankarboxylová kyselina 4,4-difluorcykloliexankarboxylová kyselina 4-methylencyklohexankarboxylová kyselina 3-metbylcyklohexankarboxylová kyselina cyklopentan-l-karboxylová kyselina l-cyklohexankarboxylová kyselinatetrahydropyran-4-karboxylová kyselina thiofen-2-karboxylová kyselina 3-a-furankarboxylová a kyselina 2-chlorthiofen-4-karboxylová.

Příklad 18

25-cyklobutyl-22,23-dihydroavermectin Bl

Produkt z příkladu 11 se hydrogenuje v benzenu za přítomnosti tris(trifenylfosfin)rhodium (I) chloridu způsobem, popsaným v evropském patentovém spisu č. 0001689, čímž se získá odpovídající sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená atom vodíku a dvojná vazba není přítomna.

Příklad 19

13-deoxy-25-cyklopentylavermectin

A2-aglykon

Na produkt z příkladu 1 se působí zředěnou kyselinou sírovou při teplotě místnosti a výsledný aglykon se izoluje a uvede se do reakce s terc.butyldlmethylsilylchloridem v dimethylformamidu, čímž se získá derivát 23-O-terc.butyldimethylsilylaglykonu.

Ten se rozpustí v methylenchloridu s obsahem 4-dimethylaminopyridinu a diisopropylethylaminu, směs se zchladí v ledu a pak se po kapkách přidá 4-nitrobenzensulfonylchlorid, čímž se získá 13-chlor-13-deoxy-derivát. Tento produkt se pak podrobí dehalogenaci reakcí s hydridem tributylcínu a pak se výsledný produkt zbaví v methanolu s obsahem stop kyseliny p-toluensulfonové ochranných skupin způsobem, popsaným v Evropském patentovém spisu č. 0002615, čímž se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ a R⁴ znamenají atomy vodíku, R³znamená hydroxyskupinu, dvojná vazba není přítomna a R² znamená cyklopentyl.

2B2B73

Příklad 20

Kapalný prostředek

Produkt z kteréhokoliv z předchozích příkladů se rozpustí v polyethylenglykolu se střední molekulovou hmotností 300 na roztok s -obsahem 400 /xg/ml. Roztoku je m-ožno užít například k omývání předmětů nebo- k moření.

Příklad 21

Anthelmintická účinnost

Tato účinnost byla vyhodnocena proti Caenorhabditis elegans in vitro způsobem, popsaným v publikaci K. G. Simpkin a G. L. Coles v Parasitology, 1979, 79, 19. Při použití produktu z příkladů 1, 7 a 9 až 16 bylo možno zahubit 100 % červů při použití koncentrace 0,1 ^g/ml.

Příklad 22

Insektlciviní účinnost

Účinnost proti dospělým jedincům mouchy domácí Musea domestica byla prokázána při standardním pokusu, v němž mouchy jsou anestetizo-vány oxidem uhličitým a na hrudní část samic se uloží 0,1 μΐ acetonového- roztoku zkoumané látky. Pr-odukty z příkladů 1, 7 a 9 až 16 způsobily uhynutí 100 proč. much v dávce 0,01 ,ttg/moucha.

Claims

PŘEDMĚT

Způsob výroby nových derivátů avermectinu obecného vzorce I přerušovaná čára v p-ol-oze 22 až 23 znamená případnou dv-ojnou vazbu a buď

R¹ znamená atom vodíku nebo hydroxyskuplnu a dvojná vazba je nepřítomna, nebo

R¹ není přítomná a je přítomná dvojná vazba,

R² znamená α-rozvětvený alkylový, alkenylo-vý, alklnylový, alkoxyalkyl-ový nebo alkylthi-oalkylový zbytek vždy o 3 až 8 atomech uhlíku, cykloalkylalkylo-vý zbytek o 5 až 8 atomech uhlíku, v němž alkylovým zbytkem je α-rozvětvený alkylový zbytek o 2 až 5 atomech uhlíku, cykloalkylový zbytek o 3 až 8 atomech uhlíku, nebo cykloalkenylový zbytek o 5 až 8 atomech uhlíku, vždy popřípadě substituovaný methylenovým zbytkem nebo jedním nebo větším počtem alkylových zbytků o 1 až 4 atomech uhlíku, nebo atomu halogenu, nebo thienyl,

R³ znamená atom vodíku nebo methylový zbytek,

R⁴ znamená 4‘-(a-L-oleandrosyl)-a-L--oleandrosyloxyskupinu vzorce

VYNÁLEZU za předpokladu, že v případě, že R² znamená alkylový zbytek, má tento zbytek odlišný význam cd is-cpropylové nebo sek.butylové skupiny, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen organismu Streptomyces avermitilis, NCIB 12 121 za přítomnosti karboxyl-ové kyseliny obecnéh-o vzorce II

R²COOH (II) kde

R² má svrchu uvedený význam, nebo za přítomnosti soli, esteru nebo amidu této kyseliny nebo oxidativního prekursoru těchto látek obecných vzorců

R²CH(NH2)CO2H,

R²COCO2H,

R^zCH2NH2,

R²(CH2)_nCO2H,

R²CH2OH nebo

R²CHO, v nichž R² má svrchu uvedený význam a n znamená celé číslo 2, 4 nebo 6 a následnou izolací sloučeniny obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxyskupinu a dvojná vazba není přítomna nebo- dvojná vazba je přítomná, R⁴ není přítomno a v případě potřeby se
2B2673 sloučenina, v níž se vyskytuje dvojná vazba a R¹ chybí, redukuje za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, v němž R¹ znamená atom vodíku a dvojná vazba schází.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se kyselina přidá ve formě soli.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k živnému prostředí přidá kyselina obecného vzorce II, v němž R² znamená cykloalkyl nebo cykloalkenyl o 5 nebo 6 atomech uhlíku, popřípadě substituovaný jedním nebo větším počtem alkylových zbytků o 1 až 4 atomech uhlíku.
4. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se k živnému prostředí přidá kyse22 lina obecného vzorce II, v němž R² znamená cyklopentyl.
5. Způsoib podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k živnému prostředí přidá kyselina obecného vzorce II, v němž R² znamená cyklobutyl.
6. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k živnému prostředí přidá kyselina obecného vzorce II, v němž R² znamená 3-thienyl.
7. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k živnému prostředí přidá kyselina obecného vzorce II, v němž R² znamená 1-methylthioethyl.