PT87004B

PT87004B - Processo de preparacao de composicoes para o tratamento de infeccoes virais e de compostos 3'-azido-2',3'-didesoxi-inosina e 3'-fluoro-2',3'-didesoxiguanosina

Info

Publication number: PT87004B
Application number: PT87004A
Authority: PT
Inventors: Fritz Eckstein; Gerhard Hunsmann; Heinz Hartmann
Original assignee: Max Planck Gesellschaft; Deutsches Primatenzentrum Gmbh
Priority date: 1987-03-18
Filing date: 1988-03-17
Publication date: 1992-06-30
Also published as: DK147088D0; DK147088A; PT87004A; NZ223865A; AU609099B2; AU1308188A; EP0286825A2; NO881190L; EP0286825A3; HU211508A9; NO881190D0

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento refere-se a um método para tratar humanos com doenças provocadas por vírus que são caracterizados por ADN polimerase dependente de ARN. De interesse especial são os métodos para tratar infecções por retrovirus, especialmejn te as causadas por virus da Imunodeficiencia Humana (HIV) que e a causa do Síndroma da Imuno-Deficiencia Adquirida (SIDA).

Antecedentes e Arte Anterior

Em 1981 observaram-se pela primeira vez pacientes que exibiam síndroma da imuno-deficiencia adquirida (SIDA). Embora ao principio as ocorrências fossem isoladas e parecessem confinar-se a população masculina homossexual, verificou-se rapidamente que esta observação estava errada, uma vez que a SIDA se espalhou por todos os grupos da população.

A infecção na SIDA tem sido caracterizada como epideA mica em algumas partes do mundo e preve-se que outras partes do mundo irão em breve caracterizar a infecção como tal.

Na Patente dos E.U. N2 4 520 113 depositada em 23 de

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Abril de 19Θ4, Gallo et al. afirmam que a evidencia sugere que a doença se propaga pela transmissão de um agente infe£ cioso. Os alvos primários do síndroma, no corpo humano, são subpopulaçães especificas de células T. A grave imuno defici

A * encia destes pacientes resulta de uma presença de células T helper (T4) inusualmente baixa, nas suas populaçães de lin focitos, reduzindo-se assim a disponibilidade de muitas funçães helper das T4, entre as quais esta a produção de anticorpos por células B.

Gallo, et al., Science 220:865-867 (20 de Maio de 1983) propuseram que o agente causador de SIDA e um virus de leucemia de células T humanas (HTLV). Estes virus são caracteri, zados por tropismo pronunciado pelas células T4, transcripta se inversa com peso molecular elevado (100 Kd) e com preferern

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-3cia por Mg para actividade enzimatica óptima. Schíípbach, et al., Science 224;503-505 (4 de Maio de 1984). 0 trabalho de Barre-Sinussi, et al., Science 220:868-871 (20 de Maio de 1983), concorda com a hipótese de Gallo, e difere apenas por eles designarem o virus por virus da linfoadenopatia associa, da a SIDA (LAV). Correntemente, muitos cientistas deste campo referem-se ao virus como o virus da imuno-deficiencia humana (HIV) e este termo será usado de aqui em diante.

Quase imediatamente iniciaram-se as investigações de métodos e materiais adequados para o tratamento de infecções por HIV que são sempre fatais. Deve salientar-se que as inves. tigações prosseguiram a vários níveis. 0 primeiro destes é o nível da prevenção”, i.e. tentativas para impedir que ocor ra a infecção. Esta abordagem envolve a modificação de padrões de comportamento e não e aqui discutida. A segunda abordagem tem consistido nas investigações em torno de linhas de desen volvimento de uma resposta imunitária ao vírus, por meio de uma vacina. Nesta área a pesquisa tem sido lenta por várias razões. As infecções por HIV apenas ocorrem em humanos e são sempre fatais. A pesquisa de vacinas envolve geralmente a introdução de uma estirpe, do virus, atenuada ou morta, no sujeito, de modo a desenvolver uma resposta imunitária. Os modelos em animais não resultam e os riscos envolvidos nas

Λ A experiencias em humanos tem sido demasiado grandes para se avançar muito no trabralho neste campo.

Ainda uma terceira abordagem tem consistido em tratar as infecções ”em cadeia”, tal como pneumonia por Pseudomonas carinii (PCP), que se desenvolvem após o HIV devastar o sistema imunitário. 0 sulfametoxazolo , vendido sob □ nome ”Bactrim”, tem sido uma droga eficaz. No entanto e extremamente

X A toxica e muitos pacientes com SIDA tem-lhe alergia. Estes

A factores tem como resultado uma utilidade limitada para a droga. Quandq/^se pode usar sulfametoxazolo usa-se isotionato de pentamidina, conhecido como anti-protozoário. Esta dro.

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ga tem mostrado ser um pouco mais eficaz quando administrada aos pacientes com SIDA na forma intravenosa ou de aerossol, mas também ela é extremamente tóxica e tem vários efeitos se cundários, conhecidos e suspeitados. Não e possível terapia a longo prazo com qualquer destas substancias.

A quarta e última abordagem ao tratamento de HIV e por intermédio de drogas que interferem com a capacidade do vírus se replicar. Esta área tem recebido muita atenção, porque basicamente, e a unica abordagem que destrói ou limita a infecção na sua fonte.

A droga de eleição, corrente, nesta área é a zido-tinú dina, também designada por AZT. Em ensaios rigorosamente limitados, a AZT mostrou interferir com a replicação virai, o que tem como resultado alguma remissão da infecção.

No entanto, também tem havido problemas com a AZT. É tóxica e suspeita-se que suprime a função da medula óssea. Ver, p.e. Kolata, Science 225:1463 (20 de Março de 1987). 0 regime que é usado para o tratamento com AZT requer condições muito rigorosas que devem ser seguidas pelo paciente para a droga ser eficaz. Perante isto, assim como da toxicidade da AZT, a investigação não parou a seguir aos resultados positi vos obtidos com a droga.

É assim um objectivo deste invento proporcionar um método de tratamento de humanos infectados com vírus caracteri. zados por polimerases dependentes de ARN, especialmente de humanos infectados com virus da imuno-deficiencia humana (HIV).

É ainda objectivo do invento proporcionar uma composição útil no tratamento de indivíduos infectados com vírus da imuno-deficiencia humana.

Como estes e outros objectivas do invento são alcançados sera explicado pela descrição que se segue.

Sumario do Invento

Método para tratar humanos infectados por vírus caraç

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-5terizados por polimerases dependentes de ARN, compreendendo administrar a um indivíduo infectado uma quantidade eficaz de pelo menos um composto de formula hoch₂ na qual X e um grupo azido, um radical metoxi ou um átomo de flúor. B é timina, uracilo, guanina, citosina, hipoxantina ou purina se X e um radical metoxi ou um atomo de fluor e B e um radical guanina, purina ou hipoxantina se X á azido; assim como de seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Preparam-se também composições que compreendem pelo menos um composto, descrito como acima, com veículos e diluentes farmaceuticos convencionais.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 apresenta graficamente a patogenecidade de HIV em células MT..

Figura 2 apresenta resultados de estudos de viabilidade in vitro quando se adicionou 3’-azido-2’,3’-didesoxiguano sina a células infectadas com HIV.

Figura 3 apresenta resultados de estudos de viabilidade in vitro quando se adicionou 3’-fluoro-3’-desoxitimidina a células infectadas com HIV.

Figura 4 apresenta resultados de estudos de viabilidade in vitro quando se adicionou 3’-fluoro-2’,3’-didesoxiguanosina a células infectadas com HIV.

Figura 5 apresenta resultados de estudos de viabilidade in vitro quando se adicionou 3'-azido-2’,3’-didesoxi-inosina a células infectadas com HIV.

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Descrição Detalhada das Concretizações Preferidas

Ver-se-a que os materiais activos descritos acima são

9-(beta-D-desoxi-ribofuranosil)nucleósidos das séries de timidina, uridina guanosina, citidina, purinucleosido ou de ino sina. Tem interesse especial os compostos específicos 3’-azido-2’,3’-didesoxiguanosina, 3’-azido-2’,2’-didesoxi-inosina, 3‘-fluoro-2’,3’-didesoxiguanosina e 3’-fluoro-3’-desoxitimidina. 0 primeiro composto é preparado de acordo com o processo descrito em Imazawa, et. al., J. Org. Chem. 43;3044-3048 (1978), cujo conteúdo é aqui incorporado como referencia.

É surpreendente que os compostos usados de acordo com o invento sejam activos, contra HIV porque de Clerco, et. al., Biochem. Pharm. 29: 1849-1851 (1980), sabe-se que a 3’-azido-23’-didesoxiguanosina não mostra actividade antiviral mensurável contra vírus vaccinia, vírus 1 do herpes simplex □u contra vírus da estomatite vesicular.

A preparação de 3’-azido-2’,3’-didesoxiguanosina ocorre, em princípio, por transglicosilação da correspondente 5’-0-acetíL- ou 5’-0-trimetilsilil-3’-azido-3’-desoxitimidina com N - palmitoilguanina sililada na presença de trifluorometanossulfonato de trimetilsililo como catalisador.

correspondente composto de hipoxantina e obtido de modo análogo por utilização da correspondente palmitoil-hipo. xantina. Alternativamente estes compostos de guanina e hipoxantina podem ser obtidos pela reacção de l-0-metil-5-D-(4-metilbenzoíl)-3-azido-2,3-didesoxi-D-ribofuranose, obtida de acordo com o procedimento de N.D. Dyatkina e A.V. Azhayev descrito em Synthesis, 1984, pag. 961 com guanina ou hipoxan. tina sililada com o auxílio de um catalisador, por exemplo trifluorometanossulfonato de trimetilsililo, de acordo com o procedimento de H. Vorbruggen, K. Krokiewics e B. Benna, des. crito em Chem. Ber. 114, p. 1234/1981. Os correspondentes com postos de guanina e hipoxantina com um átomo de flúor ou um resíduo metoxi na posição 3 da estrutura 2-desoxi-ribofura67 473

nosil podem ser obtidos a partir de 3’-fluoro-3’-desoxi- ou 3’-0-metil-3-desoxitimidina por intermédio da mesma reacção de transglicosilação. A 2,3’-anidro-l-(2-desoxi-/3-D-xilofura

3 * nosil)timina (abreviadamente designada por 0,0 - ciclotimidina) preparada de acordo com G. Kowollik, K. Gârtner, P. Langen, Tetrahedron Letters. 1969, p. 3863 serve de novo como material de partida. Por reacção com metilato de sodio prepara-se a 3’-0-metil-3’-desoxitimidina,

A 3’-fluoro -3’-desoxitimidina e sua preparação são conhecidas de G. Etzold,, R. Hintsche, G. Kowollik e P. Langen, Tetrahedron 27 (1971) pag. 2463-2472. A preparação é conseguida, em princípio, pela reacção de ciclotimidina em di, etilenoglicol com hidrogeniodifluoreto de potássio. Os produ_ tos da reacção são separados numa coluna de silicogel com uma mistura de CHCl^ e metanol. Efectuou-se um segundo passo de purificação por cromatografia numa coluna LiChroprep RP-18 com uma mistura de carbonato de trietilamónio 50 mM 5% de acetonitrilo.

Também se pode preparar 3’-fluoro-3’-desoxitimidina por reacção de ciclotimidina, preparada pelo método de G. Kowollik, G, Etzold, M. von Janta, Lipinski, K. Gârtner, B. Langen em J. Prakt. Chem (1973) 315, p. 895, com ácido fluorídrico e trifluoreto de alumínio. Alternativamente, a ciclotimidina pode ser feita reagir com fluoreto de potássio na presença de éter coroa 18-coroa-6 em dimetilformamida ou dioxano. Adi_ cionalmente, as composições de hipoxantina podem ser obtidas a partir das correspondentes composições de adenina, que são em parte conhecidas da literatura citada acima, por desamina. ção com ácido nítrico ou cloreto de nitrosilo.

A síntese de 3’-fluoro-2’3’-didesóxi-uridina é efectua da em analogia com a preparação de 3 ’-fluoro-3 ’-desoxitimidi. na (G. Etzold, R. Hintsche, G. Kowollik e P. Langen, Tetrahedron 27 (1971) pp. 2463-2472). Assim o 2,3-anidro-l-(2’-dje soxi-A- D-xilofuranosil)uracilo (abreviadamente designado por

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A eficácia dos compostos activos usados de acordo com

Λ o presente invento foi determinada num sistema biologico no qual HIV isolado de pacientes com SIDA e ARC foi cultivado o com células T humanas sensíveis. A patogenicidade in vitro do HIV assim cultivado foi determinada com a utilização de células MT^, uma linha de células para a qual □ HIV e citopático. A linha de células MT^ e descrita em Science, 229 (1985) pag. 563-566. 0 efeito citopatológico foi assim mo nitorizado por medição da incorporação de timidina nas células. Se se adicionavam às células MT. inoculadas com HIV os materiais activos de acordo com o presente invento, especial, mente a 3’-azido-2’,3’-didesoxiguanosina, era então possível mesmo com concentrações nanomolares dos materiais activos, •Z proteger contra os efeitos citopatologicos provocados pelo z

virus.

A determinação da toxicidade foi também realizada no mes. mo sistema. Neste caso as células, MT^ foram expostas ao analogo nucleosido contido na composição farmacêutica de acordo

Λ com o presente invento, como material activo, na ausência de

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-9HIV e a toxicidade foi determinada de novo, pela incorporação de timidina. A partir da concentração necessária para se conseguir um efeito antiviral, assim determinada, em comparação com a quantidade de material activo necessário para um efeito tóxico, determinou-se um indice terapêutico in vitro.

Para o composto que se prefere, 3*-azido-2’,3’-didesoX Λ xiguanosina, este indice terapêutico, no caso da linha celu- lar humana usada, foi igual ou superior a 10 , para a 3’-fluo ro-3’-desoxitimidina foi superior a 10 e para a 3’-fluoro-2 ,3 -didesoxiguanosina de aproximadamente 400. As experien. cias foram realizadas de forma a que amostras do sobrenadante da linha celular produtora do virus foram, diluídas suces sivamente, em placas de microtitulação que continham a linha de células MT^. No mesmo momento adicionou-se às placas de microtitulação timidina marcada radioactivamente e mediu-se

A a incorporação desta substancia, que se desenrola em paralelo Γ Λ com a actividade das células vivas. Sob a influencia de concentrações tóxicas do material activo de acordo com o presejn te invento ou de quantidades citopaticas de liquido contendo o vírus, a incorporação de timidina marcada radioactivamente

A diminui em correspondência.

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Na Figura 1 esta ilustrada graficamente a influencia das diferentes diluições do sobrenadante contendo o virus HIV da linha celular produtora do virus (concentrações de vírus diferentes) na incorporação da timidina nas células MT^. A curva de incorporação mostra que ate uma diluição de 1:30 a patogenicidade dos virus HIV conduz a um aumento da incorpora, ção de timidina muito baixo e que alcança o valor maior a uma diluição do sobrenadante contendo o virus de 1:10000.

Assim, a Figura 1 mostra que no caso de uma diluição do sobrenadante da cultura de 1:40, esta ainda presente nas células MT^, uma patogenicidade do HIV quase maxima. As investigações sobre a eficácia dos materiais activos em relação as A composições farmacêuticas de acordo com o presente invento

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decorreu no caso desta diluição de vírus, sendo adicionada uma solução da diluição de virus e do material activo a ser investigado, pré-misturada à amostra da linha celular e a incorporação de timidina de novo determinada.

Os resultados destas experiencias com o composto preferido, 3’-azido-2',3’-didesoxiguanosina, são apresentadas na Figura 2 dos desenhos anexos. A Figura 2 apresenta graficamente a relação entre a quantidade de material activo adicio ' nada, em ^g/ml, e a taxa de incorporação de timidina em cpm (contagens por minuto). A curva indicada por-HIV foi obtida na ausência de virus e a curva +HIV na presença de virus. Ela mostra que uma concentração de 0,3 yng/ml de material activo protege as células com metade da acção maxima contra □ efeito patogénico de uma diluição de 1:40 do liquido mãe de HIV.

A Figura 3 mostra a relação entre a quantidade de 3’-fluoro-3’-desoxitimidina adicionada em yng/ml, e a incorpora, ção de timidina em cpm (contagens por minuto) em analogia com o explicado relativamente a Figura 2. Ela mostra que^uma concentração inferior a 0,002 ^ug/rnl, o composto activo ja protege as células com metade da acção maxima contra o efeito patogenico de uma diluição de 1:40 do liquido mãe de HIV.

Analogamente, a Figura 4 mostra a actividade antiviral in vitro da 3’-fluoro-2’,3’-didesoxiguanosina. A realização e interpretação foram feitas de acordo com a explicação para a Figura 2. Este material activo a uma concentração inferior a 1,5 ^tg/ml ja protege as células com metade da acção maxima, contra o efeito patogénico da diluição de 1:40 do liquido mãe de HIV.

Na Figura 5, apresentam-se experiencias nas quais a drci ga administrada foi a 3’-azido-2’,3’-didesoxi-inosina. A toxicidade do composto de inosina foi superior, mas de novo a taxa de incorporação de timidina aumentou na linha celular infectada com HIV e tornou-se quase igual a das linhas de células não infectadas.

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-11Experiéncia II

Na experiencia que se segue estudou-se a supressão da produção de HIV em linfócitos do sangue periférido estimulados com fito-hemaglutimina (PHA).

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Estimulam-se amostras de linfocitos de sangue periferiz co com PHA, e a seguir adicionou-se virus HIV, directamente aos frascos de cultura nos quais as células foram cultivadas. Nas amostras em que se adicionou a droga isto foi feito imediatamente a seguir à introdução do virus no frasco de cultura.

A quantidade de HIV presente a seguir à administração da droga foi determinada por radio-imunoensaio relativo ao componente de HIV conhecido por ”p24”. 0 radio-imunoensaio usado tem uma sensibilidade de 20-0,625 ^ig/ml testados.

Foi essencial no desenvolvimento deste teste determinar também a viabilidade da ALSP. Isto foi efectuado por incorporação de timidina radioactiva, como foi estabelecido, no Exemplo I, supra.

Usaram-se concentraçães diferentes de cada droga: para azo-timidina (AZT), estas foram de 1, 0,1 e 0,01 enquanto que para 3’-azido-2’,3’-didesoxiguanosina (ADG) as doses foram de 3, 0,3, 0,003 e 0,0003 ^ig. Os controlos positivos (”+’’) receberam HIV, mas não receberam droga, enquanto que □s controlos negativos receberam droga mas não receberam virus. Os ensaios foram realizados no 42, 7^S, 112 e 142 dias de cultura. Em cada ponto, o meio de cultura foi substi z

tuido por meio fresco.

Estes resultados estão estabelecidos no Quadro 1:

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473

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-is- sc .É interessante notar que a ADG, a uma concentração de foi ligeiramente mais eficaz que a AZT. Tanto a AZT como a ADG começaram a perder eficacia as suas concentraçSes mais baixas mais ou menos ao mesmo tempo. As drogas não apresentam toxicidade contra o LSP, visto que as contagens” resultantes da timidina indicam que a viabilidade das células per manece boa.

Quadro 2 apresenta estes valores em termos de um RIA ajustado para 10 celulas/ml.

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473

Estes resultados mostram que a ADG e eficaz em doses de 0,3 a 3 ^vg/ml. Esperam-se resultados semelhantes para 3’-azido-2’,3’-didesoxi-inosina.

Exemplo III

A

Repetiu-se uma experiencia como a descrita no Exemplo II para 3’-fluoro-2’,3’-didesoxiguanosina. A 3’-fluoro-2’,3’-didesoxiguanosina foi sintetizada em analogia com a síntese de 3’-azido-2*,3’-didesoxiguanosina (Imazawa e Eckstein, J. Org. Chem. 43:3044) (1970) por transglicosidação de 3‘-fluoro -3’-desoxitimidina (sintetizada de acordo com G. Etzold et al., tetrahedron 27:2463) (1971) com palmitoilguanina em acetonitrilo sob refluxo durante 60 minutos com bis(trimetilsilil)acetamida e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo. A cromatografia em Kieselgel produz um produto que em TLC (CHCl^/ /MeOH, 9:1) tem um R^. (0,43) ligeiramente maior do que o da timina (0,38). Durante a noite faz-se reagir a 50^sC em MeOH

Z > Z saturado com NH^. Depois da evaporação ate a secura, o residuo e dissolvido em H₂0/Me0H e cromatografado numa coluna

Z

LiChroprep RP-ΙΘ com bicarbonato de trietilamonio 50 mM (pH 7,5) contendo 6% de acetonitrilo. Apos evaporação das fracçdes contendo o produto e re-evaporação com MeOH obtem-se um resíduo cristalino de 9-(3-fluoro-2,3-didesaxi-^-D-ribofurano sil)guaninaj p.f. 2302, ^H-RMN (DMSO),J, 6,15 ppm (dd, 1H, J_ _u _= 53 Hz, H=3’), 4,14 (dm, 1H, J. _u 32 Hz, H-4').

HPLC em ODS-Hypersil com um gradiente linear de bicarbonato de trietilamonio 100 mM (pH 7,5) e acetonitrilo (0-15% em 15 minutos), tempos, de retenção : 8,8 min para o anomero^ , 6,8 minutos para o anomero ol. Rendimento Aprox. 15%.

A

As composiçdes farmacêuticas de acordo com o presente invento podem conter o material activo em forma livre ou na z forma de sais fisiologicamente aceitáveis, nomeadamente na z forma de um composto ou de uma mistura de compostos da formula geral apresentada anteriormente. Em adição a composição farmacêutica pode conter aditivos e diluentes farmacêuticos

473 usuais para a forma de administração pretendida.

z

A administração pode ser oral, parenterica, intratecal ou intravenosa, sendo a administração oral a preferida. As dosagens preferidas variam entre cerca de 1 e cerca de 20 g por dia por 70 Kilogramas de peso corporal quando administra, das a um sujeito humano. A dosagem e modo de administração óptimos variarão de sujeito para sujeito.

Embora se tenham descrito, o que no presente se consideram, as concretizaçães preferidas deste invento, e óbvio para o especialista na matéria que lhes podem ser feitas várias alteraçSes e modificaçães sem afastamento do invento e se pretende portanto que inclua todas essas alteraçSes e modificaçães que caiam no espirito e âmbito real do invento.

Claims

1 - Processo de preparação de uma composição para o tratamento de uma infecção virai em que se verifica ADN polimerase dependente de ARN, caracterizado por se associar uma quanti dade antiuiral eficaz de um composto de fórmula onde X é um grupo azido, um radical metoxi au um átomo de flúor e B é um radical timina, uracilo, guanina, citosina, purina ou hipoxantina se X for metoxi ou flúor, e B é um radical guanina, purina ou hipoxantina se X for um grupo azido; ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável com um veículo farmaceuticameri te aceitável.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizja do por X ser um átomo de flúor ou um radical metoxi e B ser ti. mina, uracilo, guanina, citosina, purina ou hipoxantina.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser 3’-azido-2',3’-di-desoxiguano sina.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser 3'-fluoro-3'-desoxitimidina.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser 3’-fluoro-2’,3’-di-descxiguanosina,

6 - Processo de acordo com a reivindicação l_r caracterizado por o referido composto ser 3’-azido-2’,3'-di-desoxi-inosina.

67 473

7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser incorporado na composição numa quantidade de cerca de 1 a cerca de 20 g por dosagem diária.

8 - Processo de preparação de 3'-azido-2’,3'-di-desoxi-inosina, caracterizado por compreender:

a) a transglicosilação da correspondente 5’-C-acetil- cu 5 '-O-trimetilsilil-3’-azido-3’-desoxitimidina com N^-palmitoíl. -hipoxantina sililada na presença de trifluorometancssulfonato de trimetilsililo comc catalisador ou

b) a reacção de l-0-metil-5-0-(4-metilbenzoíl)-3-azico-2,3-di-desoxi-D-ribofuranose ccrr. hipoxantina sililada na presença de um catalisador como o trifluorometanossulfcnato de tri metilsililo ou

c) a desaminação da correspondente composição .adenina com ácido nítrico cu com cloreto de nitrosilo.

9 - Processo de preparação de 3'-fluorc-2',3'-di-cesoxiguanosina, caracterizado por compreender:

a) a transglicosilação do correspondente 5'-0-acetil- ou 5'-O-trimetilsilil-3'-fluoro-3'-desoxitimidina com N -palnd toílguanina sililada na presença de trifluorometanossulfonato de trimetilsililo como catalisador ou

b) a reacção de l-0-metil-5-0-(4-metilbenzoíl)-3-fluoro -2,3-di-desoxi-D-ribofuranose com guanina sililada na presença de um catalisador como o trifluorometanossulfonato de trimetil sililo..