NO881190L - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk virksomme 9-(beta-d-deoxyribofuranosyl)-mucleosider. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for behandling av mennesker med sykdommer frembrakt av virus som er kjennetegnet ved RNA-avhengig DNA-polymerase. Av spesiell interesse er fremgangsmåter for behandling av retrovirusinfek-sjoner, spesielt de som er forårsaket av humant immunsviktvirus (HIV) som er årsaken til ervervet immunsviktsyndrom

(AIDS).

Pasienter med.ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) ble først observert i 1981. Mens tilfeller først ble isolert og syntes å være begrenset til den mannlige homoseksuelle popu-lasjon, viste denne observasjon seg hurtig å være feil ettersom AIDS ble funnet å være utbredt i alle populasjonsgrupper.

AIDS-infeksjon er blittkarakterisertsom en epidemi

i noen deler av verden, og det forventes at andre deler av verden snart vil karakterisere infeksjonen som en epidemi.

I U.S. patentskrift nr. 4.520.113, innlevert

23. april 1984, fastslo Gallo et al. at bevismaterialet tyder på at "sykdommen sprer seg ved overføring av et smitte-stoff. De primære mål for hjemsøkelse i menneskekroppen er bestemte underpopulasjoner av T-celler. Den alvorlige immunsvikt hos disse pasientene skriver seg fra en uvanlig lav andel av hjelper-T-celler (T4) i lymfocyttpopulasjonen, noe som reduserer tilgjengeligheten av mange T4-hjelper-funksjoner, hvoriblant er produksjonen av antistoffer ved hjelp av B-celler".

Gallo et al., Science, 220:865-867 (20. mai 1983), foreslo at årsaken til AIDS er et humant T-celle-leukemi-virus (HTLV). Disse virusene er kjennetegnet ved utpreget tropisme for T4-celler, revers transkriptase med høy mole-kylvekt (100 kd), og med preferanse for Mg for optimal enzymaktivitet. Schupbach et al., Science, 224:503-505

(4. mai 1984). Arbeidet til Barre-Sinussi et al., Science, 220:868-871 (20. mai 1983), sluttet seg til Gallo-hypotesen og adskilte seg bare ved at viruset der ble kalt lymfadeno-pati AIDS-assosiert virus (LAV). For tiden refererer de fleste forskere innen området til viruset som humant immunsviktvirus (HIV), og denne betegnelse vil heretter bli brukt.

Det ble praktisk talt øyeblikkelig iverksatt forskning med hensyn på metoder og stoffer for behandling av HIV-infeksjoner, som alltid er dødelige. Det må påpekes at undersøkelsene ble foretatt på flere nivåer. Det første av disse er på "prevensjons"-nivået, dvs. forsøk på å forhindre infeksjon fra å oppstå. Denne fremgangsmåten omfatter modi-fikasjon av adferdsmønsteret og omtales ikke nærmere her. Den andre fremgangsmåten har vært undersøkelser langs linjer for fremkalling av en immunrespons mot viruset ved hjelp av en vaksine. Forskningen har gått sakte fremover på dette område av flere grunner. HIV-infeksjoner oppstår bare hos mennesker og er alltid dødelige. Vaksineforskning omfatter generelt innføring av en svekket eller død stamme av viruset til individet for å fremkalle en immunrespons. Dyremodeller virker ikke, og risikoene som er forbundet med forsøk på mennesker, har vært for store til å ville føre arbeidet på dette området særlig langt.

Så har en tredje fremgangsmåte vært å behandle "oppfølgings"-infeksjoner, slik som Pseudomonas carinii pneumonia (PCP), som utvikler seg etter HIV-ødeleggelser i immunsystemet. Sulfamethoxazol, solgt som "Bactrim", har vært ett effektivt legemiddel. Det er imidlertid svært toksisk, og mange AIDS-pasienter er allergiske overfor det. Disse faktorene resulterer i begrenset nytte av legemidlet. Når sulfamethoxazol ikke kan brukes, anvendes pentamidin-isethionat som er kjent som et anti-protozo-middel. Dette legemidlet har vist seg å være noe mer effektivt når det administreres til AIDS-pasienter i intravenøs eller aerosol-form, men også dette er svært toksisk og har forskjellige kjente og antatte bivirkninger. Langvarig terapi er ikke mulig med noen av disse stoffene.

Den fjerde og siste fremgangsmåte for behandling

av HIV skjer via legemidler som virker inn på virusets evne til å replikere. Dette område har fått mye oppmerksomhet fordi det til sist er den eneste fremgangsmåte som vil øde-legge eller begrense infeksjonen ved dens utspring.

Det legemiddel som for tiden velges på dette området, er azidothymidin, også referert til som AZT. AZT har i svært begrensede forsøk blitt påvist å virke inn på virus-replikasjon, noe som resulterer i en viss remisjon av infeksjonen.

Det har imidlertid vært problemer også med AZT. Det er toksisk og antas å undertrykke benmargfunksjon. Se f.eks. Kolata, Science, 2 2 5:14 6 3 (20. mars 1987). Den kur som anvendes for behandling med AZT, krever svært nøyaktige betingelser som må følges av pasienten for at legemidlet skal være effektivt. På denne bakgrunn, samt toksisiteten til AZT, har forskning ikke stoppet å følge de positive resultater som ble oppnådd med legemidlet.

Det er derfor et formål ved oppfinnelsen å tilveie-bringe en fremgangsmåte for behandling av mennesker som er smittet med viruskarakterisert vedRNA-avhengige polymeraser, spesielt de mennesker som er smittet med humant immunsviktvirus (HIV).

Det er et ytterligere formål ved oppfinnelsen å til-veiebringe et preparat som kan benyttes ved behandling av individer som er smittet med humant immunsviktvirus.

Hvordan disse samt andre formål ved oppfinnelsen oppnås, vil fremgå klarere av beskrivelsen som følger neden-under .

En fremgangsmåte for behandling av mennesker smittet med viruskarakterisert vedRNA-avhengige polymeraser, omfatter å administrere til et smittet individ en effektiv mengde av minst én forbindelse med formelen

hvor X er en azidogruppe, et methoxyradikal eller et fluoratom. B er thymin, uracil, guanin, cytosin, hypoxanthin, eller purin dersom X er et methoxyradikal eller et fluoratom,

og B er et guanin-, purin- eller hypoxanthinradikal dersom X er azido, samt farmasøytisk akseptable salter derav. Det fremstilles også preparater som omfatter minst én forbindelse som beskrevet ovenfor, sammen med vanlige farmasøytiske bærere og fortynningsmidler. Figur 1 viser grafisk patogenisiteten til HIV på MT^-celler. Figur 2 viser - resultater fra in vitro levedyktighets-undersøkelser når 3'-azido-2<1>,3<1->dideoxyguanosin ble tilsatt til HIV-infiserte celler. Figur 3 viser resultatene fra in vitro levedyktig-hetsundersøkelser når 3'-fluor-3'-deoxythymidin ble tilsatt til HIV-infiserte celler. Figur 4 viser resultater fra in vitro levedyktighets-undersøkelser når 3'-fluor-2<1>,3<1->dideoxyguanosin ble tilsatt til HIV-infiserte celler. Figur 5 viser resultater fra in vitro levedyktighets-undersøkelser når 3'-azido-2',3'-dideoxyinosin ble tilsatt til HIV-infiserte celler. De ovenfor beskrevne aktive stoffer vil ses å være 9-(beta-D-deoxyribofuranosyl)nucleosider av thymidin-, uridin-, guanosin-, cytidin- og purinnucleosid- eller -inosinserien. Av spesiell interesse er de bestemte forbindelser 3<1->azido-2',3'-dideoxyguanosin, 3'-azido-2',2'-dideoxy-inosin, 3'-fluor-2',3'-dideoxyguanosin og 3'-fluor-3'-deoxy-thymidin. Den første forbindelse fremstilles i henhold til fremgangsmåten beskrevet i Imazawa et al., J. Org. Chem., 4^:3044-3048 (1978).

Det er overraskende at forbindelsene som anvendes i henhold til oppfinnelsen, er aktive mot HIV ettersom det i Clerco et al., Biochem. Pharm., _2_9 : 1849-1851 (1980) har vært ment at 3<1->azido-2<1>,3'-dideoxyguanosin ikke utviser noen målbar antiviral aktivitet mot vaccinia-virus, herpes simplex-virus 1, eller vesikulært stomatitis-virus.

Fremstillingen av 3<1->azido-2',3<1->dideoxyguanosin finner i prinsippet sted ved transglycosylering av det til svarende 5'-0-acetyl- eller 5<1->O-trimethylsilyl-3'-azido-3'-deoxythymidin med silylert N 2-palmitoylguanin i nærvær av trimethylsily1-trifluormethansulfonat som katalysator.

Den tilsvarende hypoxanthinforbindelse fås på analog måte ved anvendelse av det tilsvarende palmitoyl-hypoxanthin. Alternativt kan disse guanin- og hypoxanthinforbindelser fås ved omsetning av 1-0-methy1-5-0-(4-methylbenzoyl)-3-azido-2,3-dideoxy-D-ribofuranose, erholdt ifølge fremgangsmåten til N.D. Dyatkina og A.V. Azhayev beskrevet i Synthesis, 1984, s. 961, med silylert guanin eller hypoxanthin med hjelp av en katalysator, f.eks. trimethylsilyl-trifluormethansulfonat, ifølge fremgangsmåten til H. Vorbruggen,

K. Krokiewics og B. Benna, beskrevet i Chem. Ber. 114,

s. 1234/1981. De tilsvarende guanin- og hypoxanthinforbindelser med et fluoratom eller en methoxyrest i 3-stillingen i 2-deoxy-ribofuranosy1-strukturen kan fås fra 3'-fluor-3'-deoxy- eller 3<1->0-methy1-3-deoxythymidin ved hjelp av den samme transglycosyleringsreaksjon. 2,3<1->anhydro-1-(2-deoxy-(3-D-xylofuranosyl) -thymin (kort betegnet 0<2>,0<31->cyclothymidin), fremstilt ifølge G. Kowollik, K. Gartner,

P. Langen, Tetrahedron Letters, 1969, s. 3863, tjener derved igjen som utgangsmateriale. Ved omsetning med natrium-methylat fremstilles 3<1->0-methyl-3<1->deoxythymidin.

3'-fluor-3<1->deoxythymidin og dets fremstilling er kjent fra G. Etzold, R. Hintsche, g. Kowollik og P. Langen, Tetrahedron, 21_ (1971), s. 2463-2472 . Fremstillingen oppnås prinsipielt ved omsetning av cyclothymidin i diethylenglycol med kaliumhydrogendifluorid. Reaksjonsproduktene separeres på en kiselgelkolonne med en blanding av CHCl^og methanol. Et andre rensetrinn ble utført ved kromatografi på en "LiChroprep RP-18"-kolonne med en blanding av 50 mM triethyl-ammoniumcarbonat/5% acetonitril.

3'-fluor-3<1->deoxythymidin kan også fremstilles ved

å omsette cyclothymidinet fremstilt ved fremgangsmåten til G. Kowollik, G. Etzold, M. von Janta, Lipinski, K. Gartner, B. Langen i J. Prakt. Chem. (1973), 315, 2. 895, med flussyre

og aluminiumtrifluorid. Alternativt kan cyclothymidinet omsettes med kaliumfluorid i nærvær av kroneetheren 18-krone-6 i dimethylformamid eller dioxan. I tillegg kan hypoxanthinpreparatene fås fra de tilsvarende adeninprepar-ater som delvis er kjent fra litteraturen som er referert ovenfor, ved deaminering med salpetersyre eller nitrosylklorid.

Syntesen av 3.'-f luor-2 ' , 3 '-dideoxyuridin utføres analogt med fremstillingen av 3'-fluor-3<1->deoxythymidin (G. Etzold, R. Hintsche, G. Kowollik og P. Langen, Tetrahedron, 21_ (1971), s. 2463-2472). Således syntetiseres 2 , 3-anhdro-l- (2 1 -deoxy-f3-D-xylof uranosyl) -uracil (kort 2 3' 23' betegnet 0 ,0 -cyclodeoxyuridm) analogt med 0 ,0 -cyclo-ethymidin (G. Kowollik, K. Gartner og P. Lange, Tetrahedron Letters (1969), s. 3863) ved å gå ut fra 2'-deoxyuridin. Cyclodeoxyuridin omsettes så med kaliumhydrogendifluorid i ethylenglycol, hvorved man får 3'-fluor-2<1>,3<1->dideoxyuridin. Denne forbindelsen tjente så som utgangsmateriale for syntesen av 3<1->fluor-2<1>,3<1->dideoxycytidin ved en aminerings-reaksjon ifølge B.F.L. Li, C.B. Reese og P.F. Swann (Biochem. , 2_6 (1987), s. 1986-1993) eller W.L. Sung (J. Org. Chem., 4J7 (1982 ), s. 3623-3628) ved omsetning med difenyl-fosforkloridat eller triisopropylbenzensulfonylklorid eller et annet egnet aktiveringsreagens i nærvær av nitrotriazol, triazol eller en annen passende nucleofil forbindelse, etterfulgt av omsetning med ammoniakk.

Effektiviteten av de aktive forbindelser som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, ble bekreftet i et biolog-isk system hvor HIV isolert fra pasienter med AIDS og ARC, ble dyrket med mottakelige humane T-celler. Den in vitro patogenitet til det således dyrkede HIV ble bestemt ved bruken av MT^-celler, en T^-cellelinje som HIV er cytopatisk for. MT^-cellelinjen er beskrevet i Science, 229, (1985),

s. 563-566. Den cytopatologiske virkning ble derved over-våket ved måling av inkorporeringen at thymidincellene. Dersom de aktive materialer ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt 3'-azido-2',3'-dideoxyguanosin, ble tilsatt til MT^-

cellene inokulert med HIV, så var det mulig, selv med nano-molare konsentrasjoner av de aktive materialer, å beskytte mot de cytopatologiske virkninger tilveiebrakt av viruset.

Toksisitetsbestemmelsen fant også sted i det samme system. I dette tilfelle ble MT^-celler eksponert mot den nucleoside analog som finnes i det farmasøytiske preparat ifølge foreliggende oppfinnelse, som aktive materialer i fravær av HIV, og på nytt ble toksisiteten bestemt på grunnlag av inkorporeringen av thymidin. Fra den således bestemte konsentrasjon for oppnåelse av en antiviral virkning sammen-lignet med mengden av aktivt materiale som er nødvendig for en toksisk virkning, ble det bestemt en in vitro terapeutisk indeks.

For den mest foretrukne forbindelse, 3'-azido-2<1>,3<1->dideoxyguanosin, var denne terapeutiske indeks i tilfellet med den anvendte humane cellelinje, lik med eller større enn 10 3 , for 3'-fluor-3'-deoxythymidin større enn 10 3, for 3'-fluor-2',3'-dideoxyguanosin omtrent 400. Forsøkene ble utført på en slik måte at prøvene av supernatanten fra cellelinjen som produserer viruset, ble overført i trinnvis fortynning til mikrotiterplater som inneholdt MT^-cellelinjen. Samtidig ble radioaktivt merket thymidin tilsatt til mikrotiterplatene, og inkorporeringen av dette stoff, som forløper parallelt med cellenes livsaktivitet, ble målt. Under innflytelsen av toksiske konsentrasjoner av det aktive materiale ifølge foreliggende oppfinnelse, eller cytopatiske mengder av virusholdig væske, avtok inkorporeringen av radioaktivt merket thymidin tilsvarende.

I fig. 1 er innvirkningen av forskjellige fortynn-inger på den HIV-virusholdige supernatant fra den virus-produserende cellelinje (avvikende viruskonsentrasjon) på thymidininkorporeringen i MT^-celler, illustrert grafisk. Inkorporeringskurven viser at opptil en fortynning på 1:30 fører patogeniteten av HIV-virus til et svært lavt thymidin-opptak, øker tilsvarende og når den høyeste verdi ved en fortynning av den virusholdige supernatant på 1:10.000. Figur 1 viser således i tilfellet med en fortynning av den dyrkede supernatant på 1:40, at en nesten maksimal patogenitet av HIV på MT^-cellene fortsatt er til stede. Undersøkelsene av effektiviteten av de aktive materialer i de farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse fant sted i tilfellet med denne virusfortynning ved at en forblandet oppløsning av virusfortynning og av det aktive materiale som skulle undersøkes, ble tilsatt til cellelinje-prøven og thymidininkorporeringen på nytt bestemt.

Resultatene av disse forsøkene med den foretrukne forbindelse 3<1->azido-2<1>,3<1->dideoxyguanosin er vist i fig. 2. Fig. 2 viser grafisk forholdet mellom mengden av aktivt materiale tilsatt i ug/ml og graden av thymidininkorporering i cpm (tellinger pr. minutt). Kurven merket med -HIV, ble oppnådd i fravær av virus, og +HIV-kurven i nærvær av virus. Den viser at en konsentrasjon på 0,3 pg/ml av aktivt materiale beskytter cellene med halv maksimal virkning mot den patogene virkning av en 1:40 fortynning av den opprinnelige HIV-væske. Fig. 3 viser forbindelsen mellom mengden av 3'-fluor-3<1->deoxythymidin tilsatt i ug/ml og thymidininkorporeringen i cpm (tellinger pr. minutt) analogt med det som er forklart for fig. 2. Den viser at den aktive forbindelse ved en konsentrasjon på mindre enn 0,002 ug/ml beskytter cellene allerede med halv maksimal virkning mot den patogene effekt av en 1:40 fortynning av den opprinnelige HIV-væske.

Analogt med dette viser fig. 4 den in vitro anti-virale aktivitet av 3<1->fluor-2<1>,3<1->dideoxyguanosin. Rea-liseringen og fortolkningen ble gjort i henhold til for-klaringen for fig. 2. Dette aktive materiale ved en konsentrasjon på mindre enn 1,5 ug/ml beskytter cellene allerede med halv maksimal virkning mot den patogene effekt av 1:40-fortynningen av den opprinnelige HIV-væske.

I fig. 5 er det presentert forsøk hvor 3'-azido-2',3'-dideoxyinosin var det administrerte legemiddel. Toksisitet av inosinforbindelsen var høyere, men igjen økte graden av thymidininkorporering i den HIV-infiserte cellelinje og nådde nesten opp til inkorporeringen i ikke-infiserte T^-cellelinjer.

Forsøk II

I det følgende forsøk ble undertrykkelsen av HIV-produksjon i lymfocytter fra perifert blod stimulert med fytohemagglutinin (PHA), undersøkt.

Prøver av lymfocytter fra perifert blod ble stimulert med PHA, og dette ble etterfulgt av tilsetning av HIV-virus direkte til dyrkningskolbene hvor cellene ble dyrket. I

de prøvene hvor legemiddel ble tilsatt, skjedde dette umiddelbart etter innføringen av viruset i dyrkningskolben.

Mengden av HIV som er til stede etter administrering av legemidlet, ble bestemt ved hjelp av radioimmunologisk prøve med hensyn på den bestanddel av HIV som er kjent som "p24". Den radioimmunologiske prøve som ble brukt, har en sensitivitet på 20-0,625 ug/ml testet.

Det var vesentlig under utførelsen av denne testen

å bestemme også levedyktigheten til PBLS. Dette ble gjort via inkorporering av radioaktivt thymidin, slik som angitt i eksempel I ovenfor.

Forskjellige konsentrasjoner av et legemiddel ble brukt: for azidothymidin (AZT) var disse 1, 0,1 og 0,01 uM, mens dosene av 3<1->azido-2<1>,3'-dideoxyguanosin (ADG) var 3, 0,3, 0,003 og 0,0003 ug. Positive kontroller ("+") fikk HIV, men ikke noe legemiddel, mens negative kontroller ("-") fikk legemiddel, men ikke noe virus. Prøver ble utført ved 4, 7, 11 og 14 dagers dyrkning. På hvert punkt ble dyrk-ningsmediet erstattet med friskt medium.

Disse resultatene er gjengitt i tabell 1:

Det er interessant å legge merke til at ADG ved en konsentrasjon på 3 ug, var litt mere effektiv enn AZT. Både AZT og ADG begynte å tape virkningsfullhet ved de laveste konsentrasjonene omtrent på samme tid. Legemidlene utviser ikke toksisitet mot PBL heller, ettersom "tellingene" som man fikk fra thymidin, indikerer at cellelevedyktigheten for-ble god.

Tabell 2 viser disse data uttrykt som en RIA justert for 10 celler/ml.

Disse resultatene viser at ADG er effektiv i doser

på fra 0,3 til 3 pg/ml. Man ville forvente lignende resultater for 3<1->azido-2',3'-dideoxyinosin.

Eksempel III

Forsøket beskrevet i eksempel II, ble gjentatt for 31 - fluor-21,31-dideoxyguanosin. 31 - fluor-2',31-dideoxy-guanosin ble syntetisert analogt med syntesen av 3'-azido-2<1>,3<1->dideoxyguanosin (Imazawa og Eckstein, J. Org. Chem. 4_3:3044) (1978) ved transglycosidering av 3 1 -fluor-3 1 -deoxy-thymidin (syntetisert ifølge G. Etzold et al., Tetrahedron, 2_7:2463) (1971) med palmitoylguanin i acetonitril under til-bakeløpskoking i 60 minutter med bis(trimethylsilyl)-acet-amid og trimethylsilyl-trifluormethansulfonat. Kromatografi på kiselgel ga et produkt som på TLC (CHCl3/MeOH, 9:1) har en litt større R (0,43) enn thymin (0,38). Det ble omsatt ved 50 C over natten i MeOH mettet med NH^. Etter inndamping til tørrhet ble resten oppløst i E^O/MeOH og kromato-grafert på en "LiChroprep RP-18"-kolonne med 50 mM triethyl-ammoniumbicarbonat (pH 7,5) inneholdende 6% acetonitril.

Etter inndamping av de produktholdige fraksjoner og ny inndamping med MeOH ble det oppnådd en krystallinsk rest av 9-(3-f luor-2 , 3-dideoxy-f3-D-ribofuranosyl) -guanin;

smp. >230°, -""H-NMR (DMSO) , 8 , 6,15 ppm (dd, 1H, J0 „ „

53 Hz, H=3'), 4,14 (dm, 1H, J. „ _,_ = 32 Hz, H-4').

4 , ri , j r

HPLC på ODS-"Hypersil" med en lineær gradient av 100 mM tri-ethylammoniumbicarbonat (pH 7,5) og acetonitril (0-15% i løpet av 15 minutter), retensjonstider: 8,8 minutter for 3-anomeren, 6,8 minutter for a-anomeren. Utbytte omtrent 15%.

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde det aktive materiale i fri form eller i form av fysiologisk akseptable salter, nemlig i form av

en forbindelse eller en blanding av forbindelser av den ovenfor angitte generelle formel. I tillegg kan det farma-søytiske preparat inneholde farmasøytiske additiver og fortynningsmidler som er vanlige for den påtenkte administrasjons-f orm.

Administrering kan skje oralt, parenteralt, intra-thekalt, eller intravenøst, ved oral administrering er foretrukket. Foretrukne doseringer ligger i området fra ca. 1 til ca. 20 g pr. dag pr. 70 kg kroppsvekt ved administrering til et menneske. Optimal dosering og administrasjonsmåte vil variere fra individ til individ.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av tera peutisk virksomme forbindelser med den generelle formel

   hvor X er en azidogruppe eller et fluoratom, og B er hypoxanthin dersom X er azido, og B er guanin dersom X er F, samt farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at a) det tilsvarende 5'-0-acetyl- eller 5 <1-> O-trimethylsilyl-3 <1-> X-3 <1-> deoxythymidin transglycosileres med silylert N-<p> al mito <y> l-h y <p> oxanthm eller -guanin i nærvær av trimethylsilyl-trifluormethansulfonat som katalysator, eller b) l-O-methyl-5-0-(4-methylbenzoyl)-3-X-2,3-dideoxy-D-ribofuranose omsettes med silylert hypoxanthin eller guanin i nærvær av en slik katalysator som trimethylsilyl-trifluormethansulfonat, eller c) dersom B er hypoxanthin, deamineres den tilsvarende adeninforbindelse med salpetersyre eller nitrosylklorid.