PT86651B

PT86651B - Processo de preparacao de derivados da purinona

Info

Publication number: PT86651B
Application number: PT86651A
Authority: PT
Inventors: William John Coates
Original assignee: Smith Kline French Lab
Priority date: 1987-02-02
Filing date: 1988-01-28
Publication date: 1992-02-28
Also published as: GR3003956T3; EP0293063B1; DE3869205D1; AU1095688A; ES2033423T3; IE880213L; CA1303037C; AU599452B2; EP0293063A1; PT86651A; DK40788A; US4885301A; DK40788D0

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

C presente invento refere-se ao processo de preparação de derivados da purinona, em particular, de compostos com um grupo fenilo substituído na posição 2 do anel da purinona. C presente invento refere-se também ao processo de preparação de compostos intermediários e de composições farmacêuticas contendo estes compostos. Cs com postos cia invenção são inibidores de uma fosfodiesterase cíclica GMP, insensível à calmodulina, e são úteis no co são bron _ma e bronquite. Adicionalmente, os compostos do presente in vento exibem activiíade anti-alérgica, e deste modo, são úteis no combate a doenças alérgicas, tais como asma alérgi ca, rinite alérgica, urticária e síndroma do intestino inivitável. Além disso, os compostos da invenção são vasodilatadores, e deste modo, são úteis no combate à angina de to, hipertensão e falência cardíaca congestiva.

Deste modo, a presente invento refere-se ao processo de preparação de compostos com a fórmula (1):

(1) e dos seus sais farmacêuticamente aceitáveis, onde

R^ é alquilo C, _c ou alcenilo C .., e

1-6z-o

2z

R é hidrogénio ou hidróxido.

Adequadamente, R¹ é alquile _{r t} por exemplo etilo,

170

Ref: CT/ds/11934/35

-4n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo ou pentilo.

Adequadamente, R' é alcenilo C_ _c por exemplo alilo, butenilo ou pentenilo.

Preferivelmente, é n-propilo.

Adequadamente, ?. é hidrogénio. Adequa iamente, R é hidróxilo.

Compostos particulares do presente invento são:

- (2 -or opóx i£s ni 1) -6 -pur inona,

2-(2-etóxi£enil)-6-purinona,

2—(2-butóxifenil)-6-purincna,

2-(2-is obutóxifen il)-6-pur inona,

2-(2-propóxifenil)purina-6,δ-diona,

2-(2-metóxifenil)purina-6,8-diona,

2-(2-etóxifenil)purina-6,3-diona,

2-(2-butcx i£e ni1)purina-6,S-d i ona ,

2-(2-isobutóxifenil)purina-6,3-diona, e

2-(2-alilóxifenil)purina-6,8-diona, e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis.

presente invento abrange o processo de preparação de todas as formas tautoméricas dos compostos com a formula (1). Por exemplo, o composto com a fórmula (1) onde é hidróxilo, pode existir numa forma ceto tautomérica:

CE

170

Ref: CT/ds/11934/35

Os compostos com a fórmula (1) onde R⁴ é hidrogénio, podem formar sais farmacêuticamente aceitáveis com ácidos, taj,s como os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico,/acético, cítrico, maleico, láctico, ascomco, fu márico, oxálico, metanossulfónico e etanossulfónico.

Os compostos com a fórmula (1) podem formar sais

farmacêuticamente	aceitáveis com iões	me tá 1 ic os,	tais como
metais alcalinos,	oor exemplo sódio e	potássio,	ou com um
ião amónio.
De modo a	usar um composto com	a fórmula	(1), ou

um seu sal farmacêuticamente aceitável, para o tratamento de humanos e de outros mamíferos, este é normalmente formu lado, de acordo com a prática farmacéuticamente convencio nal, como uma composição farmacêutica.

Os compostos com a fórmula (1), e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis, podem ser administrados, de um modo convencional, para o tratamento das doenças indicadas, por exemplo, oralmente, parenteraImente, transdermicamente, rectalmente, por inalação ou por administração bucal.

Os compostos com a fórmula (1) e os seus sais farma cêuticamente aceitáveis, que são activos quando administra dos oralmente ou por administração bucal, podem ser formulados como líquidos, xaropes, comprimidos, cápsulas e trociscos. Uma formulação líquida para administração oral con sistirá geraImante de uma suspensão ou solução do composto, ou de um seu sal, num transportador líquido, por^- exemplo, etanol glicerina ou água, com um agente aromatizante ou co rante. Quando a composição está na forma de um comprimido, pode usar-se qualquer transportador farmacêutico normaImen te usado na preparação de formulações sólidas. Zxeraplos de tais transportadores incluem estearato de magnésio, amido , celuloses, lactose e sacarose, Quando a composição está na forma de uma cápsula é adequada qualquer encapsulaçãc habitual, por exemplo, a utilização dos transportadores ante riormente referidos num involcuro de cápsula de gelatina dura. Quando a composição está na forma de uma cápsula de

170

Ref: CT/ds/11934/35

-6gelatina mole pode considerar-se qualquer transportador farmacêutico normalmente usado na preparação de dispersões ou suspensões, por exemplo, gomas aquosas, celuloses, sili catos ou óleos que são incorporados num invólucro de cápsu la de gelatina mole.

As composições parenterais típicas consistem numa solução ou suspensão do composto, ou de um seu sal, num transportador aquoso ou não aquoso estéril, contendo facui tativamente um óleo parenteraImente aceitável, por exemplo, polietileno-glicol, polivinilpirrolidona, lecitina, óleo de amendoim ou óleo de sésamo.

Uma formulação de supositório típica compreende, um composto com a fórmula (1), ou um seu sal farmacêuticamente aceitável, que é activo quando administrado desta forma, com um agente aglomerante e/ou lubrificante, por exemplo, glicóis poliméricos, gelatinas, manteiga de cacau ou outras ceras ou gorduras vegetais de baixo ponto de fusão.

As formulações transdérmicas típicas compreendem um veículo, aquoso ou não aquoso, convencional, por exemplo, um creme, pomada, loção ou pasta, ou estão na forma de um penso medicado, emplastro ou membrana.

As composições típicas para inalação estão na forma de uma solução, suspensão ou emulsão, que pode ser adminis trada, na forma de um aerossol, usando um propulsor conven cional, tal como triclorodifluorometano, ou estão na forma de um pó para insuflação.

Preferivelmente, a composição está na forma de uma unidade de dosagem, por exemplo, um comprimido, cápsula ou dose regulada de aerossol, por forma a que o paciente possa administrar, a ele próprio, uma dose única.

Cada unidade de dosagem para administração oral con tém, adequadamente, de 0,0Cl mg/Kg a 3 mg/Kg, e, preferivelmente, de 0,005 mg/Kg a 1,5 mg/Kg, e cada unidade de do sagem para administração parenteral contém, adequadamente de C,GC1 mg/Kg a 1 mg/Kg, de um composto com a fórmula (1), ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável, calculada co

170

Ref: CT/ds/11934/35 ' ί* * base livre.

regime de dosagens diárias para administração oral é, adequadamente_r de cerca de 0,001 mg/Kg a 12 mg/Kg, de um composto com a fórmula (1), ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável, calculada como base livre. 0 regi, me de dosagens diárias para administração parenteral é, adequadamente, de cerca de 0,001 mg/Kg a 4 mg/Kg, por exem pio, de cerca de 0,005 mg/Kg a 1 mg/Kg, de um composto com a fórmula (1), ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável, calculada como base livre. C ingrediente activo pode ser administrado como necessário, por exemplo, de 1 a 8 vezes ao dia ou por infusão. As composições da invenção são broncodilatadoras e são úteis no tratamento de doenças crónicas reversíveis de obstrução dos pulmões, por exemplo, as. ma e bronquite. As composições do presente invento têm acti vidade vasodilatadora e são úteis no tratamento da angina de peito, da hipertensão e da falência cardíaca congestiva. Estas situações podem ser tratadas por administração oral, local, rectal, parenteral ou por inalação. Para administração por inalação as dosagens são controladas por uma válvula e são administradas na quantidade necessária que, por exemplo para um adulto, está convenientemente compreendida na gama de 0,1-5,0 mg de um composto com a fórmula (1) ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável.

Os compostos do presente invento podem ser co-administrados com outros compostos farmacêuticamente activos, por exemplo em combinação, concorrentemente ou sequencialmente. Convenientemente, os compostos do presente invento e o outro composto activo, ou compostos, são formulados numa composição farmacêutica. Exemplos de compostos que podem ser incluídos em composições farmacêuticas com os compostos da fórmula (1), são os broncodilatadores, tais como as aminas simpatomiméticas, por exemplo, isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina e efedrina ou derivados de xantina, por exemplo, teofilina e aminofilina, os agentes anti-alárgicos, por exemplo, cromoglicato de dissódio, antagonistas

170

Ref: CT/ds/11934/35

de histamina, os vasodilatadores, por exemplo a Iiidrala zina, inibidores da enzima de conversão da angiotensina, por exemplo, captopril, os agentes anti-angina, por exemplo nitrato de iso-sorbeto, trinitrato de glicerilo e tetra-nitrato de pentaeritritol, os agentes anti-anítmicos , por exemplo quinidina, procaínamida e linhocaína, os antagonistas de cálcio, por exemplo verapamil e nifedipina, os cliuré ticos tais como tiazidas e compostos relacionados, por exem pio bendrofIuazida, clorotiazida, clorotalidona, hidrocloro tiazida e outros diuréticos, por exemplo frusemida e triantereno e cs sedativos, por exemplo, nitrazepam, flurazepam e diazepam.

hum seu outro aspecto, c presente invento refere-se a um processo para a preparação de um composto com a fórmula (1), ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, processo este que compreende:

a) para compostos onde R é hidrogénio, a reacção de um composto com a fórmula (2):

onde r! é definido como anteriormente, cova um agente de for mi laça o;

b) para compostos onde R é hidróxilo, a reacção de um composto com a fórmula (2), definida como anteriormen te, com um agente de carbonilação;

r

c) para compostos onde R e hidrogénio, a reacção de um composto com a fórmula (3):

(3)

170

Ref: CT/ds/11934/35

onde R¹ é definido como anteriormente, com 4-amino-5-imida zolecarboxamida;

d) para compostos onde R é hidrogénio, a ciclização de um composto com a fórmula (4):

H-NCO

(4) onde é definido como anteriormente;

e depois, a formação facultativa de um sal farmacêuticamen te aceitável.

A reacção entre um composto com a fórmula (2) e um agente de formilação, o convenientemente realizada na ausência de um solvente, ou na presença de um solvente adequado, tal como um álcool C^_^, piridina ou N-metilpirroli dona, à temperatura ambiente ou a uma temperatura elevada, por exemplo, de 5O-25O°C, preferivelmente, de 100-2CC°C, Exemplos de agentes de formilação incluem ácido fórmico, formato de alquilo formamida, alquil(C^^) formamida, formamidina, alquil (C^^) formamidina ou ortoformato de tri-(alquilo (C^ ^)). Faz-se reagir adequadamente um composto com a fórmula (2) com acetato de formamidina, na pre sença de acetato de sódio. Preferivelmente, usa-se o compos to com a fórmula (2) na forma de um sal de adição de ácido, por exemplo sulfato, e faz-se reagir com um excesso de um agente de formilação, por exemplo, formamida.

A reacção entre um composto com a fórmula (2) e um agente de carbonilação é convenientemente realizada, na ausência de um solvente ou na presença de um solvente adequado, tal como um hidrocarboneto halogenado, piridina ou tolueno, à temperatura ambiente ou a uma temperatura elevada,

170

Ref: CT/ds/11934/35 por exemplo de 5O-25O°C. Os agentes de carbonilaçao adequa dos incluem, ureia, carbonato de di-(alquilo (C^__₄)), cloro formato de alquilo fosgénio, cloroformato de triclorometilo ou carbonildiimidazole.

Adequadamente, faz-se reagir um composto com a fórmula (3) com um sal de adição de ácido 4-amino-5-imidazole carboxamida, por exemplo com o hidrocloreto, na ausência de um ^Cl-4' vada, ou num solvente adequado tal como um alcóol ele solvente piridina ou I’-metilpirrolidona a por exemplo de 50-250°C.

uma temperatura a fórmula (4) é uma temperatura

A ciclização da um composto com quadamente realizada por aquecimento a vada, por exemplo de 50-150 C, na presença de um ácido de uma base , num solvente adequado, tal como álcoois C aquosos, água, tolueno, um hidrocarboneto acetonitrilo.

ade ele ou

1-4 halogenado ou

Pode preparar-se um composto com a reacção da 4-amino-5—imidazolecarboxamida com a fórmula (5):

fórmula (4) por com um composto

(5) / / 1 onde L é halogéneo e R 4 definido como anteriormente.

Adequadamente ΐΛ é cloro ou bromo. Adequadamente, faz-se reagir um composto com a fórmula (5) com 4-amino-5-imidazolecarboxamida, à temperatura ambiente ou a uma temperatura elevada, p.e. 5O-1CO°C, num solvente adequado, tal como tolueno, acetonitrilo ou um hidrocarboneto halogenado, p.e., clorofórmio ou diclorometano, facultativamen te na presença de uma base tal como piridina ou trietilami na, para formar um composto com a fórmula (4), que pode ser ciclizado in situ para formar um composto com a fórmula (1) onde R á hidrogénio, ou pode ser isolado e depois

170

Ref: CT/ds/11934/35

-11ciclizado tal como aqui anteriormento se descreveu.

Gs compostos com as fórmulas (2) e (3) são conheci dos ou podem preparar-se, de uma forma convencional, de acordo com a Patente da G.B. ns. 1338235.

Podem preparar-se os sais de adição de ácido farma. cêuticamente aceitáveis dos compostos com a fórmula (1), onde R. é hidrogénio, pelo processo convencional a partir da base correspondente dos compostos com a fórmula (.1) . Por exemplo, pode fazer-se reagir a base com um ácido num alcanol C- ., ou pode usar-se uma resina de permuta ióni1*“^ ) ca. Gs sais dos compostos com a fórmula (1) podem ser interconvertidos usando resinas de permuta iónica. Podem usar-se pois sais não farmacêuticamente aceitáveis, uma vez que estes podem ser convertidos em sais farmacêuticamente aceitáveis.

Os sais de adição de base farmacêuticamente aceitá veis dos compostos com a fórmula (1) podem ser preparados por processos convencionais, por exemplo, fazendo reagir uma solução do composto com a fórmula (1) com uma solução da base.

Gs métodos para ensaie biológico, dados experimentais e exemplos seguintes servem para ilustrar o presente | invento.

Broncodilatação - In vivo

Anestesiaram-se cobaias macho da estirpe Dunkin Eartley (5CG-6CC g) com Gagatal (pentobarbital de sódio) (60 mg/Kg). Mediu-se a resistência à passagem cio ar usando uma modificação da técnica clássica de Konzett-Rossler (Versuchsanordnung zu Untersuchungen an der Bronchialmuskulatur. líaunyn-Sdhntí.edebergs Arch. Exp. Pa th. Fharmak., vol 195: pp 71-74, (194C). Administrou-se U46619 (9,11-metanoepóxi-PGE^) por infusão intra-venosa a uma velocidade de 2,5 nmole/mn, o que produziu um estado estacionário da broncoconstrição (um aumento de aproximadamente 12G% a par

17C

Ref: CT/ds/11934/35

-12·’

C, {

tir da resistência à passagem do ar, basal. Administrou-se o composto a testar por injecção de bolus i.v», e registou -se o pico subsequente de inibição da broncoconstrição.

A dose de composto necessária para reduzir a broncoconstrição, induzida pelo U466I9, em 50% é dada pelo va lor de PD-,. Estes resultados demonstrara a actividade de anti-broncoconstrição in vivo.

COMPOSTO DO EXEMPLO	«D ₅ θ (yrfnol/Kg)
1	3,6
2	6,5
3	3,8
4	5,3
5	1,0
7	3,6
8	1,5
9	4,5

Vasodilataçao - In vivo

Anestesiaram-se i,p.‘ratazanas Wistar macho (300 g) com uma mistura de 5-etil-5-(1-metilpropil)-2-tio-barbiturato de sódio/pentobarbitona de sódio (62,5 e 22,5 mg/I'g respectivamente). Introduziu-se uma cânula na traqueia e as ratazanas respiraram espontaneamente ar enriquecido com C₂ (5 ml/mn). Registou-se a pressão sanguínea de uma artéria carótida e introduziu-se uma cânula na veia jugular pa ra a administração dos compostos. Manteve-se a temperatura do animal a 37°C usando um cobertor eléctrico. Separou-se a aorta abdominal da veia cava inferior na parte distai das artérias renais e depois introduziu-se nela, centralmente, uma cânula para fornecer a bomba cie perfusão com sangue e, distalmente, para a perfusão dos quartos traseiros, a pressão constante. Inoculou-se o circuito de perfusão com albu67 170

Ref: CT/ds/11934/35

mina de soro bovino a 5% dissolvida sm solução d© cloreto de sódio a 0,9%, e com o pH ajustado a 7,4. 0 caudal da bomba foi inicialmente regulado a um valor entre 10 e 15 ml/mn, por forma a ajustar a pressão de perfusão do quarto traseiro à da circulação sistémica. Uma vez ajustada não mais se alterou a pressão durante o resto da experiên cia. Para estabelecer as modificações na resistência vascular dos quartos traseiros, alterou-se a velocidade da bomba (equivalente à corrente sanguínea nos quartos traseiros ) ·

Administraram-se todos os compostos na forma de bo lus i.v., a partir das curvas de resposta á dose determinou-se, em moles/Kg, a dose necessária para produzir um aumento de 50% na corrente sanguínea dos quartos traseiros (EDHQ_3C). Cbtiveram-se os resultados seguintes:

COMPOSTO DO EXEMPLO	ED	^HQ50
1		10,8
5		3,7

Actividade anti-alérgica - In vitro

Sensibilizaram-se activamente, cobaias macho, da estirpe Hartley (pesando de 250-300 g), à ovalbumina (CA) por um método de Herxheimer modificado (J. Physiol, 117: 251-253, 1952). Injectaram-se os animais, intramuscularmen te, com 0,7 ml de uma solução de OA a 5% preparada em soro isotónico. Quatro semanas após a sensibilização removeram-se as traqueias e cortaram-se em tiras em espiral. Cortou -se cada traqueia ao meio, colocou-se num banho de tecido de 10 ml arrefecido a água e ligou-se por um agrafo de tecido biológico, através de uma sutura de seda, a um transductor de deslocamento de força para registo da tensão iso métrica. Uma metade da traqueia serviu como controlo para

170

Ref: CT/ds/11934/35

-14o tecido correspondente tratado com droga. As traqueias fo ram banhadas com solução de Krebs-Henseleit modificada com a seguinte composição (mM) : NaCl, 118; I<C1, 4,7; MgSO^, 1,2; CaCl_o, 2,5; IlaHC0_o , 25; ΚΕ_ΩΡ0,, 1,2; e glucose 10. Manteve-se o tampão fisiologico a 37 C e arejou-se continuamente com 95% de C^/5^C/' de CCg · Colocaram-se as preparações de tecido sob uma tensão passiva de 2 g e equilibraram-se durante 60 minutos, período durante o qual se lavaram, de 15 em 15 minutos, com tampão fresco. Cacla tecido foi pré-tratado durante 45 minutos com ácido meclofenâmico ( 1 yHfí) .

Pré-trataram-se os tecidos, com o composto a testar (1CC yxM) ou com veículo (NaCH C,4 mM), durante 30 minutos, antes da adição de OA. Adicionou-se OA (G,I yug/ml) a todos os tecidos e controlou-se a contracção durante 15 minutos.

Experiências anteriores indicaram que ©sta concentração de CA produzia um máximo de contracção induzida por antigénio.

;;a conclusão da experiência, adicionou-se a cada tecido uma concentração maximamente eficaz de carbacol miram-se as respostas induzidas por CA corno percentagem de h| ro| rai ta contracção de referência. Uma vez que os compostos test dos reduziram o tónus bàsal, calculou-se a resposta absoluta (i.e., g de tensão) ao carbacol, como a diferença entre a tensão após a adição dos compostos teste e a tensão máxima desenvolvida na presença do carbacol. Para avaliar os efeitos dos compostos teste, calculou-se o grau de contracção 2 e 12 minutos após a adição de CA. Exprimiu-se a contracção induzida por OA dos tecidos tratados com droga, como percentagem da resposta dos controlos correspondentes tratados com veículo.

Quando administrados antes do desafio com OA, ambos os compostos do Exemplo 1 (100 e do Exemplo 5 (100 jull) reduziram significativamente o tonus basal. 0 composto do Exemplo 1 reduziu o tónus basal em 17 — 3% e o composto do Exemplo 5 em 24^7%, percentagens da resposta máxima ao car-

170

Ref: CT/ds/11934/35 bacol, A administração de OA aos tecidos de controlo tratados com veículo, produziu contracções que atingiram um máximo (de 67-2% da resposta máxima ao carbacol; N=4) nos 3 minutos seguintes e que se mantiveram durante o período de observação de 15 minutos. Dois minutos após a adição de OA, a resposta dos tecidos tratados durante 30 minutos com o composto do Exemplo 1 (1CC juM) foi de 78^12% (K.S., P>0,05; N=4) do controlo e a resposta de contracção dos te eidos tratados com o composto do Exemplo 5 (1CC AJí) foi de 79-3% (P<O,C5; N=4) do controlo. Doze minutos após o desafio com OA, a força de contracção tinha diminuído (P<0,05) em tecidos tratados, quer com o composto do Exemplo 1, quer com o composto do Exemplo 5) para, respectivamente,

-u 446-9% e 60-4% dos valores de controlo.

Cs resultados estão expressos como o valor médio ís.E. de 4 experiências« A significância estatística de di ferenças, entre as médias de controlo e os grupos tratados com droga, foi determinada usando um teste t de Student pa ra o par.

Estes resultados indicam que os compostos dos Exemplos 1 e 5 inibem a contracção, induzida por antigénio, da traqueia isolada da cobaia.

Actividade anti-alérgica - in vivo

Sensibilizaram-se activamente cobaias macho, adultas, albinas, da estirpe Hartley, pesando cerca de 400-600 g, com CA de acordo com o procedimento anteriormente descrito: para medir a mecânica pulmonar, inseriu-se um catéter de polietileno na traqueia dos animais anestesiados (pentobarbital de sódio, 35 mg/Kg, i.p.) e mediu-se o fluxo de ar utilizando um pneumotacógrafo em combinação com um transdutor de pressão diferencial ligado ao pneumotacógrafo. Forneceram-se os sinais, do fluxo de ar e da pres são transpulmonar, a um computador de mecânica pulmonar em linha, gue integrou o sinal do fluxo para obter o volume da

170

Ref: CT/ds/11934/35

respiração. Calcularam-se a resistência pulmonar total (R ) e a concordância dinâmica dos pulmões (C^.„ ) em ponJj l) XIJ tos is ovo lume tricôs, de acordo com o método de Amdur e Meacl (Am. J. Physiol. 192:364-368, 1958).

Dissolveu-se o composto a testar em NaHCO^ 25 mM, com uma gota de polietileno-glicol 400, por forma a ter-se uma concentração de 100 mí'. Com base no peso do animal, re moveu-se a quantidade apropriada de solução e perfez-se o volume a 1 ml com KaHCG^ 25 mi·'. Para administração intraduo denal dos compostos a testar, fez-se no abdómen uma pequena incisão na linha mediana, expôs-se o duodeno, e inseriu-se uma agulha borboleta (butterfly) ligada a uma tubagem de plástico. Ajustaram-se todas as soluções ao mesmo volume (1 ml) e administraram-se através da agulha borboleta, seguindo-se 0,5 ml de água destilada. Removeu-se então a agu lha e coseu-se a incisão abdominal para evitar perdas de calor.

Prepararam-se aerossóis de OA para debitar aproxima damente 0,375 ^,1/respiração. Ajustaram-se a pressão, o caudal e a sensibilidade, a valores tais, que durante a inala ção se atingiu uma pressão plural máxima de 20 cm de água. Uma hora após a administração dos compostos a testar, desa fiaram-se as cobaias com 5 inalações de CA (0,5 mg/ml) atra vés da cânula inserida na traqueia e registaram-se, durante 10 minutos, as modificações nos valores de C„,.„ e R„. Os va lores da linha de base para o C______ e para o RL foram, respe ctivamente, 0,4-0,5 rnl/cm de água e 0,1-0,2 cm de água/ /ml/seg.

A administração de CA às cobaias anestesiadas tratadas com veículo, produziu broncoconstrição que se desenvolveu lentamente por um período de 5 minutos. Cinco minutos após o desafio com OA, o ?.„ tinha aumentado 162-40% e o b

tinna diminuído 51-26% (b=5). Estas modificações de função pulmonar mantiveram-se estáveis durante os 5 minutos restantes do período de observação. A administração intraduodenal de 1C0 ^cmol/Kg do composto do Exemplo 1, (N=4) 60

170

Ref: CT/ds/11934/35

-17minutos antes do desafio com OA, reduziu significativamen te a broncoconstrição induzida por antigénio: 5 minutos aoós o desafio, o valor de não se tinha afastado do valor da linha de base (P<0,01 vs, controlos tratados com veículo) e o aumento do valor de foi limitado a 51-26% (P<G,C5 vs, controlos tratados com veículo).

Cs resultados estão expressos com o valor médio S.E. de 4 experiências. A significância estatística das diferenças entre as médias dos grupos de controlo e dos grupos tratados com droga, foi determinada usando um teste t de Stuâent não emparelhado.

Inibição da fosfodiesterase (PDE)

Recolheram-se no matadouro oito coraçoes/pulrnÕes de porco e mantiveram-se em gelo até se poderem dissecar as artérias pulmonares e as aortas e remover o excesso de gor dura. Dissecaram-se 12G g de tecido. A não ser onde de outro modo, indicado todos os procedimentos se realizaram a 4°C, Após a dissecação, as artérias foram congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenadas a -7G°C até serem necessárias. Mo dia da homogeneização, lavou-se o tecido com azoto líquido e quebrou-se em pequenos bocados batendo com um martelo. Homogeneizou-se o tecido ©m 3IS-TRIS 15 ml·', 1 y^g/ml de leupeptina e de antipaína, 2 y*g/ml de pepstatina A, benzamídina 5 EDTA (ácido etilenodiaminatetraacético) 2 mM, e ditiotreitol 2 mE, pH 6,5. Exactamente antes da homogeneização, adicionou-se fluoreto de fenilmetanossul fonilo até uma concentração final de 50 /tM. Centrifugou-se então o homogeneizado durante 20 minutos a 30 COO g. Filtrou-se o sobrenadante, primeiro através de lã de vidro e depois através de um filtro de C,45 y<m. Aplicou-se então o filtrado resultante a uma coluna DEAS-Sepharose* CL-6B de 60 ml (Dietilaminoetilcelulose com uma dimensão de partículas do leito de 45-165 micrometros) (Pharmacia) préeguilibrada em tampão de homogeneização. Lavou-se a coluna

17G

Ref: CT/ds/11934/3 5 com 15C ml de tampão de homogeneização e eluiram-se as acti vidades de PDS com 150 ml de tampão cie homogeneização contendo acetato de sódio 1CC mH. Recolheram-se seis fracções de 25 ml# e o caudal através da coluna foi de ôO ml/h.

As fracções 2 e 3 reunidas adicionou-se BIS-TRIS, MgCl^ θ CaCl^ até se terem concentrações finais de 50 mM, 7 mM e 5 mM respectivamente# e adicionaram-se também PMSM, leupeptina, antipaína e pepstatina A# nas concentrações anteriormente referidas para estes compostos. Corrigiu-se o pE desta amostra a 6,9.

Aplicou-se a amostra# com um caudal de 3 ml/h a uma montagem de duas colunas em série. A primeira coluna da raon tagem era uma coluna de calmodulina-agarose de 5 ml (Sigma) e a segunda uma coluna de 1,5 ml de azul cie cibacron 3GA-agarose (Sigma). Pré-equ.ilibraram-se ambas as colunas com EIS—TRIS 5C ml', MgCl 5 mM, CaCl„ 5 mM, benzamidina 5 mM, ditiotreitol 2 mM a pH 6#9. Após a aplicação da amostra lavaram-se as colunas com 20 ml de tampão de equilíbrio.

Desligou-se então a coluna de azul de cibacron-agaro se# e lavou-se com os tampões que a seguir se indicam (tampão A = PIS-TRIS 50 mM# benzamidina 5 mM# ditiotreitol 2 ml'# pH 7#0).

ml de Tampão A+NaCl 2M# MgCl^ 5 mM ml de Tampão A+NaCl 2M ml de Tampão A+NaCl 2M# EDTA 10 mM

Eluíu-se a actividade de PDE ligada à coluna# com oito alíquotas de 2#5 ml de Tampão A# contendo NaCl 2 M, EDTA 10 mM e cGMP 10 mM. Recolheram-se as fracções que se verificou conterem PDE e concentraram-se depois# até aproximadamente 1/3 do volume original# por diálise durante 2 horas contra tampão A:glicexol (5O:5C) contendo 2-mercapto etanol 15 mM# e EDTA 2 mM. Após a diálise reduziu-se a con centração do cGMP na fracção por tratamento, usando uma co luna PD-1C (Pharmacia), usando tampão de diálise.

170

Ref: CT/ds/11934/35

-19Armazenou-se a fracção produzida a -2u^OC e para as experiências usou-se, diluída 5C vezes, como fonte de acti vidade de PDZ para testar os compostos.

Propriedades da actividade de PDE

A actividade de PDC, isolada pelo procedimento anteriormente descrito, demonstrou uma considerável selectividade para o cGMP como substrato, mostrando apenas baixas velocidades de hidrólise do cAMP. Não se podia aumentar em incubações a actividade de PD2 desta preparação, pela pre2 + sença de Ca (10 mM) e de calmodulina (25 y^g), e não se au mentou a hidrólise cio cAIlP pela adição de cGKP 10 i*M ès in cubaçÕes. Reunem-se seguidamente as características cineti cas desta enzima.

cGKP =1,3 juM

m /

Razão de hidrólise cGl-íP/cAMP para 1 yuM de substrato = 30.

Teste da Posfodiesterase

Para este teste usou-se o procedimento descrito por Davis & Daly (1979) J. Cyclic hucleotide Res., 5., 65-74, embora com algumas modificações. A mistura reaccional padrão continha, para ura volume final de I0C ui,

t tamponada

ção foi iniciada com enzima e realizada a 37°C durante 5-

170

Ref: CT/ds/11934/35

-20-10 minutos. Terminou-se a reacção, colocando os tubos num banho de água a ferver durante 2 minutos. Adicionaram-se então, a cada tubo de ensaio, 500yJí de tampão de HEPES (ácido N-2-hidrôxietilpiperaz;ina-iT-2-etanossulfónico) 0,1 M a pH 8,5, contendo NaCl 0,1 E, e aplicou-se o conteúdo de cada tubo a um meio de cromatografia de afinidade de borona to Affigel 601 (Bio-Rad) (Volume de leito 1,2 ml) que tinha sido oreviamente equilibrado com 10 ml de tampão H3PES/NaCl.

Removeu-se o H-cGEP não reagido da coluna, por lavagem com 10x1 ml de tampão HEPES/NaCl. Eluíu-se o 5'-AMP marcado para um frasco de cintilação, com 6 ml de ácido acético 0,25 M, e contou-se, num contador de cintilação, usando Instagel de 10 ml (Packard). As recuperações oscilaram entre 50-75%, medidas pela recuperação de C-GEP. Os testes foram realizados em duplicado e os valores foram corrigidos com os brancos de 2%.

Cálculo dos valores de IC_c_ □ 0

Obtiveram-se os valores cie ΙΟ^θ (concentração de ini bidor requerida para se ter uma inibição de 5C% da activida de) por incubação das enzimas com 1 de GMP cíclico e para uma gam.a de concentrações de inibidor.

COMPOSTO DO EXEMPLO	^xC5G 9^
1	0,96
2	4,49
3	5,04
4	1,74
5	1,25
7	5,26
8	6,79
0	.. 3,64

170 .

Ref: CT/ds/11934/3□ ^c; - . '

-21Exemplo 1

2-(2-Propóxifenil)-6-purinona

Aqueceu-se uma mistura agitada de sulfato de 4,5 — -diamino-2-(2-propóxifenil)pirimidina-6-ona (1,5 g) (prepa^ rado pela adição de ácido sulfúrico concentrado a uma solu ção etanólica cia base livre) e de formamida (15 ml), num banho de óleo (temp» 19C°-2OO°C) durante 70 minutos. Depois de arrefecida, filtrou-se a mistura, recolheu-se o sólido, e lavou-se com etanol, obtendo-se um produto bruto (1,1 g) ponto de fusão 254-259°C, que se recristalizou a partir de etanol por forma a obter-se o composto do título, 0,72 g, ponto de fusão 263—265°C.

Exemplo 2

2-(2-Etóxifenil)-6-purinona

De uma forma similar à do Exemplo 1, por reacção do sulfato de 4,5-diamino-2-(2-etóxifenil)-pirimidina-6-ona (1,5 g) com formamida (15 ml), obteve-se o composto do título, 0,36 g, ponto de fusão 276-277 C, (recristalizado a partir de etanol).

I

Exemplo 3

2-(2-Butóxifenil)-6-purinona

De uma forma similar à do Exemplo I, por reacção do sulfato de 4,5-diamino-2-(2-butóxifenil)-pírimidina-6-ona (1,5 g) com formamida (15 ml) obteve-se o composto do títu lo, 0,65 g, ponto de fusão 247-248 C, (recristalizado a partir de etanol)·

Exemplo 4

2-(2-Is obut óx ife n i1)-6-purin ona uma forma similar à do Exemplo 1, por reacção do

170

Ref: CT/ds/11934/35

sulfato de 4,5-diamino-2-(2-isobutóxifenil)pirimidina-6-ona (1,4 g) com formamida (5 ml), obteve-se o composto do título, 0,24 g, ponto de fusão 272-273 C, (recristalizado a partir de etanol).

Exemplo 5

2-(2-Propóxifenil)purina-6,8-diona

Aqueceu-se uma mistura de 4,5-diamino-2-(2—propóxifenil)pirimidina-6-ona (1,3 g), e de ureia (1,5 g) num banho de óleo (temp. 190°C) durante 45 minutos. Digeriu-se o sólido resultante com água quente, filtrou-se a mistura e lavou-se o sólido com água, obtendo-se um produto bruto,

I, 36 g. Por recristalização a partir de dimetilformamida obteve-se o composto do título (1,01 g), ponto de fusão ^35O°C, ô(DKSC-d₆), 1,01 (t, 3H); 1,83 (m, 2H); 4,09 (t, 2H); 7,10, 7,21, 7,52 e 7,76 (multipletos, 4H); ca

II, 07, 11,55 e 11,35 (singletos muito largos, 3H).

Exemplo 6

2-(2-Metóxifenil)purina-6,8-diona

De uma forma similar à do Exemplo 5, por reacção da

4,5-diamino-2-(2-metóxifenil)pirimidina-6-ona (0,93 g) com ureia (1,20 g) obteve-se o composto do título, 0,28 g, ponto de fusão 329-330 C, (recristalizado duas vezes a partir de dimetilformamida),

Exemplo 7

2-(2-Etóxifenil)purina-6,8-diona

Neutralizou-se uma solução de sulfato de 4,5-diamino-2-(2-etóxifenil)pirimidina-6-ona (2,0 g) em água (50 ml), com hidróxido de amónio e extractou-se com clorofórmio. Evaporou-se o extracto orgânico até à secura sob pressão reduzi

170

Ref: CT/ds/11334/35

da e tratou-se a base livre residual com ureia (1,74 g) de uma forma similar à do Exemplo 5, obtendo-se o composto do título, 0,66 g, ponto de fusão 349-351 C, após recristalização com dimetilformamida.

Exemplo 8

2-(2-Butóxifenil)purina-6,8-diona

De uma forma similar à do Exemplo 5, por reacção da

4,5-diamino-2-(2-butóxífenil)pirimidina-6-ona (0,96 g) com ureia (1,05 g) obteve-se o composto do título, 0,26 g, pon to de fusão 324-326°C, (recristalizado a partir de dimetil formamida)·

Exemplo 9

2—(2-lsobutóxifenil)purina-6,8-diona

A uma solução de 4,5-d.iamino-2-(2-isobutóxifenil) pirimidina-6-ona (1,50 g) em tolueno (100 ml) adicionou-se carbonildiimidazole (1,01 g) e aqueceu-se ao refluxo a mis tura resultante durante uma hora, tendo-se obtido um sólido castanho que se recolheu. Lavou-se este sólido com água e recristalizou-se a partir de dimetilformamida obtendo-se o composto do título, 0,22 g, ponto de fusão >360 C.

Exemplo 10

2-(2-Alilóxifenil)purina-6,8-diona

A uma solução agitada de carbonildiimidazole (0,72 g) em piridina anidra (8 ml) sob azoto, adicionou-se sulfato de 4,5-diamino-2-(2-alilóxifeniI)pirimidina-6-ona (0,8 g). Agitou-se a solução resultante durante 3 horas, sob azoto à temperatura ambiente, e reduziu-se depois o vo lume da solução por evaporação sob pressão reduzida. Diluiu -se o xarope residual com acetona aquosa (50%, 20 ml), reco lheu-se o sólido resultante, lavou-se com água e acetona, e

170

Ref: CT/ds/11934/35

-24secou-se por forma a obter-se um produto bruto (0,48 g). Recristalizou-se este material, conjuntamente com outra amostra em bruto (0,1 g preparada de uma forma similar, aqui anteriormente descrita) a partir de ácido acético (ca 25 ml) pela adição de água quente (5 ml) por forma a obter-se, após lavagem com ácido acético, água e etanol, e secagem , o composto do título, 0,4 g, ponto de fusão 34C-345°C, dec», 8(DMSC-dg), 4,68 (m, 2H); 5,2-5,4 (m, 2H); 5,9-6,2 (m, 1Γ); 7,07-7,2, 7,4-7,55, 7,6-7,7 (m's, 4H); 10,9, 11,45 e 12,1 (singletos largos, 3H).

I

Exemplo 11

2-(2-Propóxifenil)-6-purinona

Aqueceu-se uma mistura de 4,5-diamino-2-(2-propóxifenil)pirimidina-6-ona (0,3 g), acetato de formamida (0,18 g) e acetato de sodio (0,1 g), num banho de óleo, a 155 -165°C durante 2·^ horas. A mistura fundiu e depois ressoli dificou. Adicionou-se etanol (1 ml) e recolheu-se o compos to do título por filtração, C,31 g, ponto de fusão 255-258°C.

Exemplo 12

I ....... 1,111.1111..... .

►

2-(g-Propóxiteniljpurina-ó,8-diona

De uma forma similar à do Exemplo 9, por reacção de carbonildiimidazole (4,98 g) com 4,5-diamino-2-(2-propóxifenil)pirimidina-6-ona (7,00 g) em tolueno (350 ml), obteve-se o composto do txtulo, 3,76 g, ponto de fusão J>340 C (recrisbalizado a partir de dimetilformamida).

Exemplo 13

Composições farmacêuticas para administração oral são preparadas por combinação dos ingredientes seguintes:

170

Ref: CT/ds/11934/35

-252-( 2-Propóxifenil)-6-purinona

2% p/p de lecitina de soja em óleo de soja

Gordura vegetal hidrogenada e cera de abelha

	Z J .Λ c ' * €
%	p/p
0,5	3,0	7,14
90,45	θ'”· O Oo _f z	84,41
9,05	Q Q O _t O	8,45

Encheram-se depois cápsulas individuais de gelatina mole com as formulações.

Exemplo 14

Preparou-se uma composição farmacêutica para administração parenteral dissolvendo o composto em título no Exemplo 1 (0,02 g) em polietileno-glicol 300 (25 ml) com aquecimento. Esta solução foi em seguida diluída com água para injecções Ph, Sur. (a 100 ml). A solução foi em segui da esterilizada por filtração através de membrana de filtro de 0,22 micron e selada em recipientes esterilizados.

170

Ref; CT/ds/11934/35

Claims

1 - Processo de preparação de um composto com a fór mula (1) (1) r1 r ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável, onde R é al. quilo C.. _Λ ou alcenilo Ce

2 l—o*“O

R^z é hidrogénio ou hidroxilo, processo este que compreende:

a) para compostos onde P. é hidrogénio, a reacção de um composto com a fórmula (2):

(2) onde é definido como anteriormente, com um agente de for milação?

2 ,

b) para compostos onde R e hidroxilo, a reacção de um composto com a fórmula (2), definida como anteriormente, com um agente de carbonilacão;

c) para compostos onde R é hidrogénio, a reacção de um composto com a fórmula

(3):

67 170

Ref: CT/ds/11934/35 (3) onde é definido como anteriormente, com 4-amino-5-imida zolcarboxamida; ou

2 z

(4) onde R é definido como anteriormente; .

e depois facultativamente a formação de um sal farmacêuticamente aceitável.

í

2 - Processo de acordo cora a reivindicação 1, cara- cterizado por R ser hidrogénio.

3 - Processo de acordo cora a reivindicação 1 cara- cterizado por R ser hidróxilo.

4 - processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por R‘¹' ser alquilo C„ _r.

- Processo de acordo com qualquer das çoes de 1 a 3 caracterizado por ser alcenilo C reivindica3-5*

61 170

Ref: CT/ds/11934/35

-2 8-

6 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o composto preparado ser:

2-(2-propoxifenil)-6-purinona,

2-(2-etoxifenil)-6-purinona,

2-(2-butoxifenil)-6-purinona,

2-(2-isobutoxifenil)-6-purinona,

2-(2-propoxifenil)purina-6,8-diona,

2~(2-metoxifenil)purina-6,8-diona,

2-(2-etoxifenil)purina-6,8-diona,

2-(2-butoxifenil)purina-6,8-diona,

2-(2-isobutoxifenil)purina-6,8-diona, ou

2-(2-aliloxifenil)purina-6,8-diona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

7 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado por o agente de formilação ser escolhido de en tre o ácido fórmico, formato de alquilo formamida, alquil(C^ _A) formamida, formamidina, alquil(C^ ^Jformamidi na ou crtoformato de tri(alquilo ^).

8 — Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente de carbonilação ser escolhido de en tre a ureia, carbonato de di(alquilo(C^_₄)), cloroformato de alquilo C fosfogénio, cloroformato de triclorometilo ou carbonildiimidazole.

9 - Processo de preparação da 2-(2-propoxifenil)-6-purinona, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, que compreende a reacção da 4,5-diamino-2—(2-propoxifenil)-pirimidina-6-ona ou de um seu sal de adição de ácido com formamida ou com acetato de formamidina, e a formação facul tativa de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

10 - Processo de preparação da 2-(2-propóxifenil)purina-6, 8-diona ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável,

67 170

Ref: CT/ds/11934/35 que compreende a reacção da 4,õ-diamino-2-(2-prcpóxifenil)pirimidin —6-ona com ureia ou com carbonildiimidazole, e a formação facultativa de um seu sal farmaceuticamente aceitá vel.

11 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica que compreende a associação de um composto com a fórmula (1), preparado de acordo com a reivindicação 1, ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável, com um transpor tador farmacêuticamente aceitável.