PT86286B

PT86286B - Processo de preparacao de conjugados de proteinas

Info

Publication number: PT86286B
Application number: PT86286A
Authority: PT
Inventors: Cynthia S Brown; Coleman R Hamel; Robert D Lemmon; Patrick H Mcverry
Original assignee: Connaught Lab
Priority date: 1986-12-03
Filing date: 1987-12-03
Publication date: 1990-11-07
Also published as: NO875038D0; JPS63215638A; IE873268L; IL84677A0; EP0270295A2; AU8204887A; FI875309A; FI875309A0; DK633087D0; DK633087A; PT86286A; NO875038L; ZA879023B; EP0270295A3

Description

MEMORIA DESCRITIVA presente invento refere-se ao processo de preparação de novas vacinas compreendendo conjugados de proteínas virais fracamente imunogénicas e proteínas altamente imunogénicas.

As vacinas de vírus completos, quando administradas ao ο,τ ganismo, induzem uma resposta imunológica pela formação de anti corpos de antigénio virai. No caso do vírus da gripe, sabe-se serem os antigénios de superfície, nomeadamente a hemaglutinina (HA) e a neuraminida (NA), os principais antigénios indutores de anticorpos.

A tendência actual em relação às vacinas afasta-se das vacinas de vírus inteiros na direcção de materiais mais purificados. Isolaram-se os antigénios de superfície da gripe que têm sido utilizados em vacinas. Porém, estas vacinas de prote_í na purificada são apenas fracamente imunogénicas e são incapazes de induzir uma resposta imunológica suficientemente grande para serem eficazes em muitos tipos de indivíduos.

Deste modo, pelo presente invento obtém-se um novo conjuga do no qual um antigénio de proteína virai fracamente imunogénica está ligado covalentemente a uma proteína fortemente imunogénica. Ligando covalentemente o antigénio de proteína virai à pro teína fortemente imunogénica, pode induzir-se, num vertebrado ao qual se administra o conjugado, uma resposta imunológica significativamente maior, do que a que se obteria normalmente com o antigénio fracamente imunogénico.

presente invento tem particular aplicação na glicoproteína hemaglutinina, de várias estirpes do vírus da gripe, incluindo a gripe do tipo A e do tipo B, mas é também aplicável à potenciação de outros antigénios de proteína virai, incluindo a glicoproteína g da raiva, glicoproteínas do vírus da polio e glicoproteínas de rotavírus.

Adicionalmente a estes antigénios de proteína isolados de fontes naturais, incluem-se também no âmbito do presente invento os peptídeos, preparados por engenharia genética e prepa-

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-3rados sinteticamente, correspondentes aos antigénios de proteína virai.

Na preparação dos conjugados remove-se primeiro o trfmero de hemaglutinina do vírus completo por qualquer método conveniente, por exemplo por clivagem convencional de bromeleína. Separam-se deste modo as partes hidrofílicas da hemaglutinina, da parte hidrofóbica que permanece com o núcleo virai.

A imunogenicidade da subunidade HA é consideravelmente me nor do que a do vírus completo. De acordo com o presente inveji to, a imunogenicidade é significativamente aumentada ligando co valentemente o trímero HA a uma proteína altamente imunogénica.

A proteína altamente imunogénica é uma proteína capaz de induzir uma resposta imunológica mediada por um anticorpo humoral e/ou por uma célula. Conduzindo a proteína HA purificada ao centro de resposta, a proteína altamente imunogénica potência a resposta imunológica da subunidade de proteína HA normalmente fracamente imunogénica. Dbserva-se um aumento da prolife ração de células T específicas, bem como da resposta humoral es_ pecífica.

A proteína altamente imunogénica pode ser uma proteína bacteriana, tal como um exotoxóide bacteriano, preferivelmente o toxóide diftérico ou o toxóide tetânico. Outras substâncias proteicas que podem ser usadas incluem moléculas de anticorpos, proteínas fimbriais e proteínas da membrana exterior de bactérias .

Já foi sugerida a ligação covalente de moléculas para vários propósitos. As Patentes dos E.U.A. n^s. 4 496 538 e 4 619 828 de Gordon descrevem a ligação covalente do polissacárido capsular do Haemophilus influenzae b ao toxóide diftérico ou tetânico para induzir respostas dependentes de células T ao polissacárido. Cryz et al observaram uma resposta similar com uma vacina de conjugado de polissacárido da Pseudomonas aeruginosa com toxóide tetânico, tal como se descreve em The Journal of Infectious Diseases, l/ol. 154, nS. 4, Outubro de 1986, págs. 682-688.

Na Patente dos E.U.A. n^. 4 565 696 de Heath et al, a

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-4resposta imunológica de um imunogénio de peptídeo ou proteína é potenciada pela ligação covalente a superfícies de vesícula, acima de uma proporção mínima de proteína para lípido. No pedido de patente internacional publicado W0 83/02069, publicado em 23 de Ounho de 1983, aparece uma descrição semelhante.

Lee et al, em Molecular Immunology”, l/ol. 17, págs. 749-756 (1980) descrevem a ligação covalente da subunidade beta da gonadotropina coriónica humana (hCG) ao toxóide tetânico e a uti lização do conjugado para obter níveis significativos de anticorpos para os peptídeos hCG.

Petrov et al em Reports of the Academy of Sciences of the USSR, 1984, Vol. 277 n9. 3, págs. 752-755 referem-se a uma resposta imunológica aumentada de ambas as subunidades HA e NA do vírus da gripe, por ligação covalente.

Tanto quanto é do conhecimento dos requerentes não existe porém na técnica anterior qualquer sugestão para a preparação de um conjugado adequado para utilização como vacina, que compreenda um antigénio de proteína virai normalmente fracamente imunogénico ligado de modo covalente a uma proteína fortemente imunogénica, para se obter uma maior imunogenicidade ao antigénio de proteína virai. Além disso, não existe na técnica anterior qualquer indicação que prediga razoavelmente que a maior imunogenicidade resulta da conjugação do antigénio de proteína virai com a proteína fortemente imunogénica.

Na preparação do conjugado de acordo com a invenção é necessário ligar as duas moléculas de proteína por uma ligação co valente. Pode utilizar-se qualquer procedimento de conjugação adequado. Preferivelmente, a química da conjugação deverá ser tal que minimize a formação de produtos secundários indesejados, tais como homoconjugados ou polímeros, maximizando simulta neamente o rendimento no conjugado funcionalmente activo.

Preferem-se os ligantes cruzados heterobifuncionais do tipo éster maleimida-N-hidroxissuccinimida uma vez que estes fa vorecem a química desejada. Pela reacção sequencial do éster de N-hidroxissuccinimida com grupos amino numa proteína, segui-

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-5da da reacção do componente maleimida com grupos sulfidrilo livres introduzidos ou presentes na outra proteína, obtêm-se conjugados isentos de produtos poliméricos que resultam da utilizei ção de ligantes cruzados homobifuncionais, tais como □ glutaral_ deído. Prefere-se introduzir o grupo sulfidrilo na proteína fracamente imunogénica e fazer reagir o éster maleimida-N-hidro xissuccinimida com a proteína transportadora fortemente imunogé. nica.

As reacções envolvidas são representadas como se segue:

Proteína (i)-NH

Proteína (i)-NH-C-R-N

Proteína (Π) grupo R no éster maleimida-N-hidroxissuccinimida pode ser qualquer resíduo ácido conveniente, e pode incluir um grupo fenileno facultativamente substituído, um grupo cicloalquileno ou um grupo alquileno contendo de 1 a 12 átomos de carbono, pre ferivelmente de 5 a 12 átomos de carbono. Exemplos de tais ésteres bifuncionais incluem o éster maleimidocaproico-N-hidroxis succinimida (MCS), o éster maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimi da (MBS), o éster maleimidobenzoilsulfossuccinimida (sulfo-MBS), o ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometil) (SMCC) ,o butirato de succinimidil-4-(p-maleimidofenil)

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-6(SMPP), o ciclo-hexano-l-carboxilato de sulfossuccinimidilo-4-(N-maleimidometil) (sulfo-SMCC) e o butirato de sulfossuccinimidil-4-(p-maleimidofenil) (sulfo-SMPP).

Em vez do reagente éster maleimido-N-hidroxissuccinimida podem utilizar-se os ésteres de p-nitrofenilo ou os ésteres do sal de sódio do ácido l-hidroxi-2-nitrobenzenossulfónico corres pondentes, com a fórmula

Após reacção com um grupo amino da proteína, ocorre a reacção seguinte

Proteína (I)

II

R - C - NH - Proteína (i)

As proteínas que são conjugadas para formar os conjugados de acordo com o presente invento apenas raramente contém grupos tiol livres (sulfidrilo). Se estão presentes estes grupos tio, não é necessária a tiolação. Usualmente, porém, é necessário introduzir um grupo tiol usando um agente de tiolação. Pode usar-se qualquer reagente de tiolação conveniente incluindo o

3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) e o 4-mer67 029

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captobutirimidato de metilo, na presença de 4,4'-ditiopiridina, de anidrido S-acetilmercaptossuccínico (SAMSA) ou de, preferência, S-acetiltio-acetato de N-succinimidilo (SATA).

Quando se utiliza este último reagente, o SATA reage com grupos amino da proteína para formar derivados acetiltio, que, após tratamento com hidroxilamina, libertam grupos sulfidrilo livres. As equações seguintes ilustram a modificação de proteí.

nas usando SATA tratamento subsequente com hidroxilamina:

+

NH₂ - Proteína (II)

II

CH₃-C-S-CH

HN-Proteína (II) + NH₂0H

HS-CH₂-C-NH-Proteí na (II) + CH₃C0NH0H

Prefere-se o SATA em detrimento de outros agentes de tiolação potenciais, tais como o SPDP e o SAMSA, uma vez que não é necessária a adição e a escrupulosa remoção subsequente de um excesso de outro tiol antes da conjugação estar completa, em contraste com o que acontece com o SPDP, e em virtude de apenas se poder formar um tipo de derivado, em contraste com o SAMSA, que pode reagir com qualquer dos seus carbonilos do anidrido p.a ra produzir produtos misturados.

número de grupos tiol introduzidos no antigénio de proteína virai formando ligações covalentes, pode variar grandemeri te, de cerca de 3,5 a cerca de 11 per molécula de antigénio de proteína virai. 0 número de grupos tiol reactivos que se formam na proteína imunogénica pode também variar grandemente, de cerca de 5 a cerca de 15,0 por molécula de proteína altamente

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-8imunogénica. 0 número de terceiros grupos reactivos utilizados em qualquer caso particular depende de um certo número de facto, res, incluindo o peso molecular, a conformação e a composição em aminoácidos das proteínas envolvidas na reacção.

presente invento é adicionalmente ilustrado pelos Exejn pios seguintes:

Exemplo 1

Este Exemplo ilustra a preparação de uma vacina conjugada contra a gripe a partir do vírus tipo A da gripe.

Fez-se reagir toxóide diftérico purificado (d) com ester de maleimido-ácido capróico-N-hidroxissuccinimida (MCS) numa proporção molar de 1:1, a uma temperatura de 20 a 259C com agitação. Adicionou-se o MCS ao DT em quatro porções iguais por um período de 60 minutos e continuou-se a reacção, após a adição final, durante mais 15 minutos. Fez-se então passar a mistura reaccional através de uma coluna de cromatografia cheia com Bio-Gel P-6 DG para remover o excesso de MCS não reagido. A coluna foi previamente equilibrada com uma solução tampão de ci trato de sódio 0,1 M, 0,5/o de EDTA, a pH 6,0, e foi eluída com a solução tampão.

Tiolou-se a hemaglutinina (HA) purificada proveniente de um vírus do tipo A (Chile) da gripe, a qual tinha sido solubili zada por clivagem, com bromeleína, do vírus completo inactivado com formalina, por reacção com ácido N-succinimidil-S-acetiltio acético (SATA) numa proporção molar de 1:1, a uma temperatura de 20 a 252C com agitação. Adicionou-se o SATA de uma vez à HA e realizou-se a reacção durante 20 minutos. Fez-se então passar a mistura reaccional através de uma coluna de cromatografia cheia com Bio-Gel P-6 DG para remover o excesso de SATA não rea gido. A coluna foi previamente equilibrada com uma solução tam pão de fosfato de sódio 0,1 M, cloreto de sódio 0,1 Μ, 0,05>ΰ de azida de sódio, a pH 7,5 e eluída com essa solução tampão.

Desacilou-se o produto HA-AT eluído da coluna de cromatografia, por reacção com hidroxilamina e removeu-se o excesso de hidroxilamina não reagida numa coluna de cromatografia cheia com

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-9Bio-Gel P-6 DG, que tinha sido previamente equilibrada com uma solução tampão de citrato de sódio 0,1 M, 0,5^ de EDTA, a pH 6,0. A coluna foi eluída com a mesma solução tampão.

Fez-se então reagir o produto D-MCS com d produto desacilado HA-AT, obtido como anteriormente se descreveu, numa propoj? ção molar de 1:1, a uma temperatura de 20 a 252C, com agitação por um período de 18 a 24 horas. Terminou-se a reacção por adi. ção de uma quantidade em excesso de cisteína.HCl seguindo-se mais duas horas de reacção com agitação a uma temperatura de 20 a 252C.

Purificou-se a mistura reaccional por aplicação a uma coluna de cromatografia cheia com Sepharose CL-6B que tinha sido previamente equilibrada com uma solução salina tamponada com fosfato 0,06 M, a pH 7,2 e com 1:10 000 de timerosal. 0 produto foi filtrado e concentrado.

Diluiu-se o concentrado com quantidades adicionais de tampão timerosal para aumentar a força da vacina, filtrou-se e armazenou-se a uma temperatura de 2 a 83C pronta para ser utiliza, da. A concentração de proteína na vacina de conjugado HA-D resultante era de cerca de 50^n,g/ml e o teor em HA era de cerca de 30^g de HA/ml.

Exemplo 2

Este Exemplo ilustra a preparação de uma vacina conjugada, contra a gripe, a partir do vírus do tipo B da gripe.

Repetiu-se o procedimento do Exemplo 1, substituindo a he maglutinina do tipo A pela hemaglutinina de um vírus do tipo B (URSS) da gripe. 0 conjugado HA-D resultante, quando formulado até à força iónica da vacina, tinha um teor em proteína de cerca de 50y,,,g/ml e uma concentração de HA de cerca de 30^g de HA/ml.

Exemplo 3

Este Exemplo ilustra a eficácia da vacina HA-D, preparada pelo procedimento do Exemplo 1, testada por dois ensaios sorolé gicos, a inibição da hemaglutinina (HAl) e o imuno-ensaio de

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-10absorção ligado a uma enzima (ELISA).

A resposta protectora da vacinação contra a gripe associam-se dois parâmetros da HAI: 1) a obtenção de um título por HAI pós-vacinação 40 e 2) a obtenção de um título por HAI de pós-vacinação 4 vezes o título de pró-vacinação. Por ambos estes parâmetros os receptores de vacina de conjugado HA-D tiveram melhores respostas do que os receptores da vacina de sub

unidade ou do que o grupo de controlo que não estava Na Tabela I seguinte resumem-se os resultados	vacinado. obtidos:
	Tabela I
Valores de HAI		HA-D	Subunidade	Controlo
		n=25	n=25	n=25
pré 10 em %		64	60	80
pré ^-40 em %		0	4	4
pós 1 40* em %		68	36	8
pôs 2 40* em %		80	44	8
pós 1 4X pré em	/^a	72	52	0
pós 2 > 4X pré em	Cf p	72	52	0
pré < 10 com pós 1	. OU
2 4X pré em fo		75	73	0

= diferença estatisticamente significativa p 0,05

Observa-se a persistência de níveis protectores na medida de anticorpos por HAI, seis meses após a vacinação, numa perceri tagem maior de receptores de vacina de conjugado HA-D do que a que se observa no grupo receptor da subunidade, tal como se pode observar na Tabela II seguinte:

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-11Tabela II

Valores de HAI	HA-D n=25	Subunidade n=25	Controlo n=25
pós 1 ou 2 40 e pós 6 40 em %	95	70	0
pós 1 ou 2 4X pré e pós 6 4X pré em %	89	86	0
pré < 10, 40 pós 1 ou 2 e pôs 6 40 em	92	73	0
pré C 10, 4X pré pós 1 ou 2 e pós 6 4X pré em %	93	86	0

Pelo ensaio ELISA usando hemaglutinina apresentada na fo_r ma de extracto detergente (cindida) ou na forma de HA purificada ligada a uma fase sólida, obtiveram-se os resultados seguintes, Estes resultados sugerem uma maior resposta ao HA cognato (A/Chile) em qualquer das apresentaçães, pelos receptores de v cina de cognato de HA-D, do que a resposta dos receptores de v cina cindida. Estes dados mostram também uma maior reactividade dos receptores de vacina conjugada em relação ao reconhecimento do HA de outra estirpe H1N1 (A/Brasil). Na Tabela III s_e guinte apresentam-se os resultados:

Tabela III la la

	RESPOSTA	MÚLTIPLA A	PRIMEIRA	DOSE
GRUPO DE	A/Chile	A/Chile	A/Brasil	A/Fil	A/Fil	B/URSS
VACINA	cindida	HA	HA	cindida	HA	HA
HA-D	2,8	5,5	6,1	1,4	2,0	1,3
CINDIDA	2,6	1,6	2,1	1,1	1,2	0,8

Exemplo 4

Este Exemplo ilustra a eficácia da vacina de HA-D, preparada de acordo com o procedimento do Exemplo 1, por medição da

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-12resposta mediada por células, sendo os resultados expressos como índices de estimulação.

Na Tabela IV seguinte apresentam-se os índices de estimulação absolutos de cada grupo de uacina, seis meses após a vaci nação.

Tabela IV índices de estimulação no ensaio clinico com ha(a/chile)-d

VACINA	N° de ordem do índice pós 1	de Estimulação pós 2	S.I. pós 6
HA-D	10/10	12/12	média: 7,8
HA-D	5/10	1/12
HA-D	2/10	2/12
HA-D	1/10	4/12
HA-D	4/10	3/12
Subunidade	6/10	5/12	média: 5,0
Subunidade	7/10	5/12
Subunidade	9/10	2/12
Subunidade	4/10	10/12
Subunidade	8/10	11/12
Subunidade	4/10	11/12
Subunidade	2/10	7/12
Controlo	6/10	10/12
Controlo	9/10	8/12
Controlo	7/10	6/12
Controlo	6/10	7/12
Controlo	3/10	9/12

Sistema de ordenamento onde 1/10 ou 1/12 é a mais alta ou a melhor resposta em cada grupo e onde 10/10 ou 12/12 e a mais baixa ou a pior resposta em cada grupo índice de Estimulação cpm H-dTR incorporado na presença de antigénio cpm ^H-dTR incorporado na ausência de antigénio

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-130s dados depois de seis meses, anteriormente apresentados, sugerem a persistência de imunidade mediada por células a um ní vel superior no grupo de sujeitos que receberam a vacina de ccri jugado HA-D, em relação ao grupo que recebeu a vacina de subuni dade.

Exemplo 5

Este Exemple ilustra a eficácia da vacina preparada de acordo com o procedimento do Exemplo 2.

Na Tabela V seguinte apresentam-se valores do índice de estimulação absoluta (S.I.) para sujeitos individuais e índices de estimulação médios para dois grupos de vacina.

Tabela V

ÍNDICES DE ESTIMULAÇÃO DO ENSAIO CLINICO COM HA(B/URSS)-D ANTIGÉNIO

VACINA	HA	CINDIDA	Soma de HA e de
pés 1	pós 2	pós 1	pós 2	pós 1	pós
HA-D	4,5	5,4	2,5	2,6	3,5	4,0
HA-D	6,7	8,6	1,6	4,3	4,2	6,5
HA-D	3,7	3,5	5,2	1,6	4,5	2,6
HA-D	10,7	1,5	4,9	1,2	7,8	1,4
HA-D	6,0	9,1	1,5	2,2	3,8	5,7
HA-D	13,5	4,3	1,5	1,5	7,5	2,9
cindida	1,7	9,7	3,3	3,3	2,5	6,5
cindida	2,6	2,3	0,9	2,6	1,7	2,4
cindida	2,6	4,4	3,2	1,2	2,9	2,8
cindida	1,8	3,1	2,0	1,3	1,8	2,2
cindida	2,0	2,8	1,4	1,0	1,7	1,9
cindida	1,9	2,4	1,8	2,3	1,8	2,3
nenhuma	1,3	4,9	0,8	1,6	1,0	3,2
nenhuma	1,2	2,7	0,7	1,1	0,9	1,9
nenhuma	1,0	1,5	0,7	0,8	0,8	1,2
nenhuma	0,9	1,0	1,6	0,6	1,2	0,8
nenhuma	1,3	4,3	0,9	1,5	1,1	2,9
nenhuma	1,0	nd	0,6	nd	0,8	nd
nd: não	disponível

CINDIDA (continua)

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Tabela V (continuação)

-14SI médio

HA-D	7,5	5,4	2,9	2,2	5,3	3,8
cindida	2,1	4,1	2,1	2,0	2,1	3,0
nenhuma	1,1	2,9	0,9	1,1	1,0	2,0

Os resultados sugerem valores de SI muito mais elevados para o grupo receptor do conjugado HA-D do que para o grupo re ceptor da vacina cindida. Observa-se esta tendência para ambas as datas pós 1 e pós 2 e para ambas as apresentações de antigénio HA purificado e HA cindido.

Exemplo 6

Este Exemplo ilustra também a eficácia da vacina preparada de acordo com o procedimento do Exemplo 2.

Geraram-se valores de resposta serológica para a vacina de conjugado do Exemplo 2 e para uma vacina de uma subunidade convencional da gripe, medidos como a média geométrica dos títu los por inibição de hemaglutinação. Na Tabela VI seguinte repro duzem-se os resultados obtidos:

Tabela VI

Vacina

Conjugado pré-vacinação mês após a vacinação meses após a vacinação

39,2

287,6

176,8

Subunidade

29,6

225,2

140,0

Como pode observar-se na Tabela VI, a vacina preparada de acordo com a invenção induz uma resposta imunológica maior do que a vacina de subunidade.

Como sumário desta descrição pode dizer-se que o presente invento se refere ao processo de preparação de um novo conjugado compreendendo a ligação covalente de um antigénio de proteína v_i ral fracamente imunogénico com uma proteína fortemente imunogé67 029

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nica, para produzir uma maior resposta imunológica ao antigénio normalmente fracamente imunogénico. São possíveis modificações dentro do espírito do presente invento.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparação de um conjugado compreendendo um antigénio de proteína virai, normalmente fracamente imunogénico, e uma proteína fortemente imunogénica, caracterizado por se ligarem covalentemente as ditas proteínas por um radical ligado a uma das proteínas por um grupo amida e à outra proteína por um grupo tioéter resultando o dito grupo tioéter da reacção entre grupos sulfidrilo, introduzidos no dito antigénio de proteína virai fracamente imunogénico, e grupos tiol reactivos no radical ligado através dos ditos grupos amida resultantes da reacção com grupos amino localizados na dita proteína fortemente imunogénica.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por se introduzirem cerca de 3,5 a cerca de 11 grupos sulfidrilo por molécula de antigénio de proteína virai e cerca de 5 a cerca de 15 grupos tiol reactivos por molécula de proteína fortemente imunogénica.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza. do por o dito radical ter a estrutura:

na qual R é um grupo fenileno, um grupo cicloalquileno, ou um grupo alquileno, opcionalmente substituídos, contendo de 1 a 12 átomos de carbono.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza, do por R ser um grupo alquileno contendo de 5 a 12 átomos de carbono.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o dito antigénio de proteína virai ser seleccionado do

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-17grupo consistindo na glicoproteína hemaglutinina de vírus de influenza, glicoproteína g do virus da raiva, de glicoproteínas de vírus de polio e de glicoproteínas de rotavirus.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza^ do por o dito antigénio de proteína virai ser a glicoproteína hemaglutinina do vírus da influenza.
7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1,

5 e 6, caracterizado por a dita proteína fortemente imunogénica ser obtida a partir de um organismo bacteriano.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza do por a dita proteína fortemente imunogénica ser o toxóide diftérico ou o toxóide tetânico.