PT85053B - Processo para a preparacao de peptideos com influencia na duiresee na excrecao urinaria de sodio bem como de composicoes farmaceuticas contendo estes peptideos - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de novos peptídeos da fórmula I

(I) na qual

R representa um radical da fórmula II (II) **

R representa hidrogénio ou um radical da fórmula

R w £· NH · f )•amino

R significa um grupo amino, guanidino, alquil~(C^«C ou dialquil-ÍC^-C^)-amino;

m significa um número inteiro de 1 a 6;

, 4 5

A representa um radical da formula «NH-CR R-CO-;

R significa hidrogénio, alcanoílo-(C-C. ), aroílo«(C «C ) lo 7 11 eventualmente substituído na fracção aromática por um ou por dois substituintes escolhidos de entre o grupo alquilo· -.(C^-C^), alcoxi-(C^wC^), alquiltio-(C^-C^), halogénio, car bamoílo, alcoxi-(C^~C^)-carbamoílo e/ou sulfamoílo ou mono· •substituído por metilenodioxi, ou significa cicloalquil_(c -c -c₃í, sendo nos radicais em que R é diferente de hidrogénio um grupo ·0Η · eventualmente substituído por -0- ou por -S~;

£ n é 0 ou 1|

5

R e R são iguais ou diferentes e significam hidrogénio, al· quilo«(C^-Cg) ou aralcanoílo»(C^-C^^)J

L representa um resíduo de um ácido /•aminado lipófilo neutro de preferencia Pro, D-Pro ou um radical da fórmula ·ΝΗ·ΟΗ· (R⁶)-CO-|

R^ significa alquilo-( C^-Cg) eventualmente mono**substituído por hidroxilo, alcoxi-(C^-Cg), alcoxi-(C^-Cg)-carbonilo_# carbamoílo ou por R-NH, em que R tem o significado anterior mente definido com a condição de que não pode ser hidrogéni ou significa aralquilo-ÍC^-C^^), que pode ser eventualmente mono-substituído na parte aromática por alcoxi~(C^-Cg), ou significa 3-indolilmetilo;

N representa o resíduo dum ácido ,χ-aminado neutro, de prefe· rância Pro, D-Pro ou um radical da fórmula ~NH-CH(R )-CO-j

R⁷ significa alquilo-(), que pode ser eventualmente substituído por hidroxilo, alcoxi«-(C^-Cg), alcoxi~( C^-Cg) carbo·· nilo,carbamoflo ou por R-NH, em que R tem o sigftifiçado anteriormente definido com a condição de que não pode ser hidrogénio, ou significa aralquilo-ÍC^-C^^), que pode ser eventualmente mono-substituído na parte aromática por alcoxi-(C^-Cg), ou significa 3-indolilmetilo?

B² (iii) na qual R em tem os significados anteriormente definidos;

R^C representa um radical da fórmula

R⁸

-nr⁹-ch(r⁸)-(co) -r¹,

P representa uma cadeia lateral lipófila, a qual tem de pre7 ferSncia o significado de R em que radicais CH, CH^ ou CH^ existentes em posição^ em relação à -NH- podem ser eventu·· alemnte mono-hidroxilados, e

R⁹

R⁸ significa hidrogénio?

ou e R⁹ em conjunto significam “ZCH₂_/^ou é 0 ou 1?

R^,no e

no caso de ser p =0, representa hidrogénio, hidroxilo alcoxi-(C_ -Cz-)}

J- o 10 10 11 caso de ser p = 1, representa OR ou NR R ; e _ago iguais ou diferentes e significam alquilo«·(C_ C,

11 ^{x c} ou aralquilo-(C -C )? ou NR R representa pirrolidino, f Jm JL piperidinio ou morfolinoj ou ou

. p á s l_f

R β rI significam em conjunto uma ligação e os restantes radicais tem os significados anteriormente definidos, bem como os respectivos sais fisiológicamente aceitáveis₀

SSo considerados especialmente os sais formados com ácidos inorgânicos ou orgânicos, por exemplo HC1, HBr, HgSO^, H^PO^, ácido m^lico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido tartárico ou ácido acético. Os centros quirais dos novos peptídeos podem, em cada caso, apresentar-se na configuração R, S ou R,S.

Os grupos alquilo podem ser de cadeia linear ou ramificada. Do mesmo modo, também os radicais derivados de alquilo, por exemplo alcóxi, alquiltio, alquilamino, dial·· quilamino, alcanoílo e aralquilo, podem possuir cadeias lineares ou ramificadas.

Sob a designação de cicloalquilo compreendem-se também radicais alquilo substituídos, como por exemplo

4-metil~ciclo-hexilo ou 2,3-dimetil-ciclopentilo*

Um grupo arilo-( Cg-C^) é por exemplo fe« nilo, naftilo, bifenilo ou fluorenilo; considera-se preferido o grupo fenilo. A mesma observação é válida para os grupos derivados dos mencionados, como por exemplo ariloxi, aroílo, araiquilo e aralquiloxi. Consideram-se como grupos alquilo preferidos benzilo e fenetilo. Halogénio significa fldor, cloro, bromo ou iodo, de preferencia cloro ou bromo.

. · -nN

Conslderam-se preferidos os radicais R , n p

L, N, B e R derivados de ácidos aminados de ocorrência natural (ver por exemplo Schroder, Lubke, The Peptides, Volume I, New York, 1965, págs. 137-270), os respectivos antípodas e os respectivos metabolitos simples!

Consideram-se preferidos os compostos da fórmula I nos quais

L representa um resíduo de isoleúcina, valina, treonina, serina, O-alqull-(C^-C^)-treonina, O-alquil-ÍC^^-C^J-serina, leucina, prolina ou o óster de \M-alquilo-(C^-C^) ou o óster de t-butilo de ácido glutâmico ou de ácido aspártico;

N representa um resíduo de valina, isoleúcina, leucina, fenila lanina, triptofano, tirosina eventualmente O-alquilada-(C^-0^), glutamina, asparagina, glutamato de yí»alquilo-(C^«C^) ou aspartato deÇ»-alquilo-(c^-Cg) ou 6-acil-lisina, e

B significa Arg, D-Arg, Lys ou D-Lys,

Os novos peptídeos podem ser lineares ou cíclicos, sendo neste caso o anel fechado por uma ligação peptídica = ligação peptídica).

processo da presente invenção para preL paração dos compostos da fórmula I caracteriza-se por se promover o acoplamento de um fragmento com um grupo carboxílico terminal ou de um derivado reactivo deste com um fragmento com um grupo amina livre, eventualmente por se eliminar um grupo protector ou grupos protectores temporariamente utilizado ou utilizados para protecção de outros grupos funcionais e por se transformar eventualmente o composto resultante num seu sal fisiológicamente aceitável·

Os fragmentos de um composto da fórmula T com um grupo carboxílico terminal apresentam uma das formulas IVa a IVf seguintes:

R-OH	(IVa)
R-A-OH	(JVb)
N R-OH	(iVc)
N R -L-OH	(iVd)
RN-L-N-OH	(iVe)
rn-l-n-b-oh	(IVf )

Os fragmentos de um composto da fórmula

I com um grupo amina terminal apresentam uma das fórmulas Va a Vf seguintes

Z^J^-R³

-a-nh~ch-co-l-n-b2-rc	(Va)
H2N-CH-C0-L-N-B2-RC	(Vb)
h-l-n-b2-r6	(Vc)
h-n~b2~r6	(Vd)
h-b2-rc	(Ve)
H-Rc	(Vf)

processo da presente invenção para a preparação dos compostos da fórmula I utiliza métodos de síntese da química dos peptídeos, como por exemplo os descritos pormenorizadamente em Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Volume 15 (Stuttgart, Thieme, 1974). De preferência os peptídeos são preparados passo a passo com inicio no ácido aminado C-terminal ou então por acoplamento de fragmentos de acordo com o esquema 2 + 3 ou 3 + 2. Se se utiliza a variante processual de acoplamento de fragmentos deve ter-se o cuidado de utilizar métodos de acoplamento que provoquem o mínimo de raoemização· Nos exemplos apresentados em seguida utiliza-se para o acoplamento de fragmentos principalmente o método de DCC/HOGbt, o qual, de acordo com a experência actual permite a síntese de peptídeos com a mínima racemização. Outros métodoíi adequados são o método do éster activo com N-hidroxi-succinimida como componente de éster, o acoplamento por meio de ani«» drido propanofosfórico e o método de anidrido misto com clore* to de pivaloílo.

A preparação de peptídeos cíclicos da for mula I pode por exemplo ser efectuada por um método análogo ao descrito em EP-A2-135 722.

Os compostos preparados de acordo com o pro* cesso da presente invenção influenciam de modo duradouro a diu rese e a excreção urinária de sódio e de potássio, como demons tram os resultados seguintes de ensaios in vivo.

A. Actividade diurética e de excreção de sódio e de potássio dos peptídeos preparados de acordo com o processo da presen·

te invenção de acordo com o protocolo de ensaio 1 (dosei
mg/kg rato, período de colheita;	90 min.)·
	Urina	Na+	K+
	(ml.	Çnmol.'	Ç^rniol
	kg”1)	kg-1)	kg-1)
Comparação	1,267	65,2	29,5
H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH Fenoxiacetil-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-	2,49	249,1	25,9
—Xle—OH	0,66	117,?	31,7
H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol	1,56	155,4	59,4
H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Leu-ol	1,55	180,8	64,2
H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Val-NH»	1,95	184,7	89,2
H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-isobutilamidal,43	131,6	51,3
H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH^	1,97	225,0	33,0
Ή-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Xle-NH^	1,34	159,8	35,4
Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol (1 ^ig/kg)	0,79	118,4	27,8
Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH^	1,51	263,2	63,3
H-Arg-Pro-Val-Lys-Val-OH	0,91	155,7	28,2
H-Arg-Ile-Ssr(tBu)-Arg-Ile-OH	1,19	74,5	28,4
Η-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH	0,95	87,0	44,3
H-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH	2,03	149,8	50,1
H-Arg~*-Ile-Phe-Arg-Ile -OH	2,00	211,0	68,3
H-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH	0,67	112,0	57,5
Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH	1,64	208,6	37,1
Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OHe	1,16	152,5	46,2
ciclo»(Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile)	1,58	196,2	57,7
i-Arg-Val-Tyr(tBu)-Arg-Prο-OtBu	0,28	59,2	21,9

Protocolo de ensaio li Os ratos foram narcotizados com 0,1 ml/ /100 g de peso corporal de tiobutabarbital sódico a 10$ i»po, Receberam 60 min antes da administração da substância em ensaie uma infusão de NaCl que continuou a ser dada durante o ensaio (2,5 ml de uma solução a 0,9$ de NaCl. h .0,1 kg” de peso corporal). A substância em ensaio foi aplicada sob a forma de uma suspensão i.v. de 0,5 ml/100 g de peso corporal de uma so· lução a 0,9$·

B» Actividade diurética e de excreção de sódio e de potãssio dos peptídeos preparados de acordo com o processo da presen· te invenção de acordo com o protocolo de ensaio 2 (dosei 1 mg/kg rato, período de colheita: 120 min).

	Urina (ml. kg-1)	Na+ Çumol· kg1)	K+
Comparação	0,520	31,5	25,8
Z-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OBzl	0,52	66,9	36,2
Z-D-Arg-Ile-^eu-Arg-Ile-OBzl	o,59	86,3	38,1
Z-Arg-Ile-D-Leu~Arg-D-Val~OBz1	0,48	79,0	43,8
Z-Arg-Ile-Leu-Arg-D-Val-OBz1	0,43	88,6	36,7
H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH	1,13	115,9	49,7
H-Arg-Ile-Glu( OtBu^Arg-Ile-NH^	1,04	95,6	67,3
^-Amino-hexanoil-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH 2	0,82	54,9	38,0
Z-Arg-Ile«Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH2	0,47	91,5	36,1
Z-D-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OBz1	0,29	48,4	30,1
Z-D-Arg-Ile-D-Leu~Arg-Ile-OBz1	0,19	37,3	20,4
Z-Arg-D-Val-^eu-Arg-D-Val-OBzl	0,27	55,1	38,3
H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-OH	0,25	30,2	23,7
H~Lys-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH^	0,08	10,6	22,1
H-Arg-D-Val-^eu-Arg-Ile-OH	0,57	83,77	34,9
H-D-Arg-D-Alo-Ile-D-Leu-Arg-He-OH	0,87	95,1	35,5
H-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OH	0,78	93,7	40,8
H-D~Arg-Ile-Leu-D-Arg«-Ile-OH	0,28	61,4	33,9
H-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH	0,22	55,3	33,6
B-Arg*Ile-Leu—Arg-D-Va1—OH	0,56	68,8	38,9

«· 8 —

I

0,69

0,31

0,44

0,63

0,66 _Π ciclo-(Gly-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile) (com 0,5 mg/kg) H-Àrg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-0H Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OèBu H-Arg-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH^

Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu 0,65 H-Arg-Pro-Cys(S tBu)-Arg-Phe-OtBu II H-Ly s -Phe-Leu-Ly s-Phe-OH II H-Ly s-Phe-Leu-Ly s-Phe-NH^ ciclo-(D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile) (com 1 yUg/kg)

0,32

0,52

0,25

1,05

65,5	26,6
68,4	32,8
88,9	37,8
136,8	31,5
148,7	37,1
143,0	16,5
87,5	XI $ X
80,2	31,0
36,8	16,7
128,2	36,6

Protocolo de ensaio 2i Os ratos foram narcotizados com

0,1 ml/ /100 g de peso corporal de tiobutabarbital sádico a 10% i.p₀₀ Receberam 60 min antes da administração da substância uma infuI *f ·» são de NaCl (2,5 ml de uma solução a 0,85% de NaCl.h .0,1 kg de peso corporal). Após a administração da substância reduziu«s a velocidade de infusão durante uma hora a metade (1,25 ml.h ₀ ♦0,1 kg ). Em seguida e ate terminar o ensaio reduziu-se novamente a velocidade de infusão a metade (0,625 ml.h · A substância em ensaio foi aplicada sob a forma duma i.v. de 0,1 ml/100 g de peso corporal numa solução a

NaCl.

0,1 kg¹), suspensão 0,85% de

A partir dos resultados verifica-se que os pep |[tídeos preparados de acordo com o processo da presente invenção possuem uma actividade tanto diurética como de promoção de excreção de sódio. Em muitos exemplos encontra-se no entanto apenas um aumento da excreção de sédio que muitas vezes ocorre mes mo numa situação de antidiurese· Uma vez que a excreção de potássio em muitos casos não ultrapassa a dos ensaios de comparação, é possível preparar a partir das substâncias desta família medicamentos que provocam a excreção de sédio com manutenção do nível de potássio (por exemplo H-Arg-^ro-Val-Lys-Val-OH), antidiuréticos com actividade de aumento da excreção de sódio (por I exemplo Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol) ou diuréticos com acti9 -

vidade de aumento da excreção de sódio (por exemplo H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH ou ciclo-(D-Arg-Ile-D-leu-Arg-Ile)o Mas também se encontram entre estas substâncias antidiuréticas com actividade de redução da excreção de sódio (por exemplo II-Arg-Pro-Lys(StBu)-Arg-Phe-OtBu ou H-Lys-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH )₀

A presente invenção refere-se, por conseguinte₉ também a um processo de preparação de medicamentos constituídos por composiçSes farmacêuticas com actividade reguladora sobre a diurese, a excreção utinária de sódio e a excreção urinaria de potássio, que podem ser utilizados em situações de alteração do equiííbrio hídrico ou electrolítico, contendo os peptídeos da fórmula I caracterizado por se incorporarem estes peptídeos em conjunto com uma substância veicular e eventualmente de outros excipientes e adjuvantes numa forma de apresentação apropriadao

Os peptídeos dotados de actividade de aumento da escreção utinária de sÓdio e de actividade diurética podem •er utilizados em medicamentos em situaçSes de hipertonia e de carência de água· Os compostos dotados de actividade específica de aumento da excreção urinária de sódio deverão ser usados em pacientes hipertónicos idosos nos quais se pretenda reduzir uma perda de água. Os peptídeos dotados de actividade antiduretica são utilizáveis em situaçêes de poliuria ou de diabetes insipidus ·

Os peptídeos podem ser incorporados em preparações galénicas parentais (i.v., s.c. ou i.m.) isolados ou em combinação num meio fisiológicamente aceitável. Em regra, a dose a utilizar está compreendida entre 1yUg/kg a 5 mg/kg.

Para aplicação parental incorporam-se os compostos activos ou os respectivos sais fisiológicamente aceitáveis em soluçóes, suspensóes ou emulsães, caso se pretenda em conjunto com as substâncias habitualmente utilizadas para estas finalidades, como solventes, emulsionantes e outros adjuvante··

- 10 Como solventes para os novos compostos activos e para os respectivos sais fisiológicamente aceitáveis podem mencionar-se, por exemplo: água, soro fisiológico ou álcoois, como por exemplo etanol, propanodiol ou glicerina, e ainda soluções de açucares como sejam soluções de glucose ou de manitol, ou ainda uma mistura dos diferentes solventes mencionados.

Igualmente e possível administrar os composton activos por meio de implantações, por exemplo sob a forma de polilactídeos, poliglicolídeos, copolímeros de ácido láctico e de ácido glicólico ou de ácido poli-3-hidroxibutírico ou, por exeuplo, em preparações de aplicação intranasal. Para aplica* ções intranasais devem decuplicar-se as dose em virtude da má absorção. A adição de agentes quelantes, como por exemplo EDTAj pode ter uma acção vantajosa sobre a absorção. Para alem disso os peptídeos podem ser administrados sob a forma dos respectivos sais ou complexos metálicos fisiológicamente aceitáveis o

Exemplo 1

H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH

a) Z-Arg(Z₂)-Ile-OBzl

Adiciona-se a 0°C 1,3 ml de N~etilmorfolina e 2,2 g de DCC a uma solução de 5»76 g de Z-Arg(z₂)-OH_? 3»93 g de tosilato de H-Ile~OBzl e de 1,35 g de HOBt em 5θ ml d® dimetilformamida· Agita-se durante lhaOCelhâ temperatura ambiente, Deixa-se em repouso durante a noite Λ temperatura ambiente. Separa-se por filtração o precipitado formado, o qual se despreza. Concentra-se o filtrado à secura sob vácuo e partilha-se o resíduo entre acetato de etilo e água. Lava-se a fase orgânica sucessivamente com solu-

Tritura-se o resíduo com éter, filtra—se e eeca-se.

Rendimento: 7»^5 g, P.F. 142-144°C, /*οζ_7·θ = -5»5 (C = 1, em ácido acético a 90$).

Adiciona-se catalisador de Pd/carvão a uma suspensão de 7,3 g de Z-Arg-(z₂)-Ile-OBzl em 220 ml de ácido acético a e faz-se borbulhar hidrogénio através da solução > Apés terminada a reacção retira-se o catalisador por filtração e concentra-se o filtrado á secura. Tritura-se o resíduo com éter e filtra-se

Rendimento: 3,86 g, P.F. 197-2OO°C, 7^= +19,9° (C = 1, ácido acético a 9θ$)·

c) Acetato de H-Asp(OtBu)-Arg~Tle-0H duo em 7θ ml de ácido acético catalítica de modo análogo ao

Adiciona-se 1,35 g de HOBt e 4,2 g de Z-Asp(OtBu)-ONSu a uma suspensão de 3,45 g de acetato de H-Arg-Ile -OH em 50 ml de dimetilformamida um dia â temperatura ambiente e ra· Partilha-se o resíduo entre saturação de NaHCO^ e 100 ml de i rente (5 andares). Reunem-se as : -Arg-Tle-OH puro, concentram-se i a !

descrito no Exemplo lb«

O² - *0>8°

t. Deixa-se em agitação durante em seguida concentra-se á secu» 100 ml de solução aquosa de mei; acetato de etilo em contra-cor· fracçSes que contem Z-Asp(OtBu) á secura e dissolve-se o resí·» 90%. Submete-se a hidrogenação /W

Rendimento: 2,22 g, amorfo, / (C - 1, em ácido acético a 90$).

d) Z-Tle-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH

Adicionam-se a temperatura ambiente 2,22 g de HOBt e 6,6 g de Z-Ile-ONSu a uma suspensão de 8,55 g de acetato de H-Asp(OtBu)—Arg-Ile-OH em 80 ml de dimetilformamidao Agi· ta-se durante 5 horas â temperatura ambiente e concentra-se à secura sob vácuo. Partilha-se o resíduo entre solução aquosa de meia saturação de NaHCO^ e acetato de te (5 andares). Reunem-se as fracçães que -Arg-Ile-OH puro, concentram-se â secura etilo em contra-corren contêm Z-Ile-Asp(OtBt) e tritura-se o resíduo com éter.

Rendimento: 10,7 g, P.F. 177-179 % Z*V^<2 = -30,2° (C = 1, em ácido acético a 90$)·

e) Acetato de H-Ile-Asp(0tBu)-Arg-Tle-0H

Submetem-se a hidrogenação catalítica 10,7 g de Z-Ilè-Asp-(OtBu)-Arg«.Tle-OH de modo análogo ao descrito nc exemplo lb em 150 ml de ácido acético a 9θ$.

Rendimento: 10,4 g, P.T. 1O7-117°C, /77!²= «3,5° (C = 1, em ácido acético a 90$).

f) Z-Arg(z„)-Ile-Asp(0tBu)-Agg-Ile-0H

Adicionam-se 13,6 g de Z-Ar g(-Z ₂ )-OTcp a uma solução de 11,4 g de acetato de H-Ile-Arg(OtBu)-Arg-Ile-OH e 2,45 g do HOBt em 180 ml de dimetilformamida. ^eixa-se reagir durante 24 horas a temperatura ambiente e em seguida concentra-se â secura. Tritura-se o resíduo com acetato de etilo, separa-se por filtração e seca-se. tância com solução aquosa saturada tração, lava-se com água e seca-se fim seguida tritura-se a subs de NaHCO^, separa-se por fil sobre P_r.O .

5

Rendimento: 5,75 g, P.F. 184-186°C, = -22,5° (C = 1, em ácido acético a 90$)·

g) Diacetato de H-Arg-Tle-Àsp(0tBu)-Arg-Ile-0H

Submetem-se a hidrogenação catalítica 6,3^ g de Z-Arg4z₂)-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH de modo análogo ao descrito no exemplo lb em 120 ml de ácido acético a 9θ$·

Rendimento: 5,66 g

Para purificação partilha-se a substancia obtida entre 100 ml de n-butanol e 100 ml de ácido acético a 10$ em contra-corrente (7 andares).

Rendimento: 4,45 g, amorfo, ~ ⁼ -¹·» ^em agua).

a 25O ml de

Adicionam-se com agitação tetra-hidrofurano arrefecido a -5°C

11,4 g de LiÀlHj . Á esta suspensão ad icionam-se com agitação no decurso de 45 minutos 28,86 g (0,22 moj) de L-isoleucina. Em seguida aqeuec-se durante sob refluxo. Arrefece-se então a 0°C, adicionam-se 250 ml de éter dietílico e adicionam-se devagar gota a gota 5θ ml de ágm continuando a agitar. Separa-se o precipitado por filtração e trata-se o resíduo duas vezes a quente com 150 ml de metanol de cada vez, filtrando-se a quente. Concentraijwse â secura os filtrados reunidos. Retoma-se o resíduo em 100 ml de etanol abso luto e trata-se com 200 ml òe éter. Deixa-seem repouso durante a noite a 4°C, elimina-se o precipitado por filtração e concentra-se o filtrado â secura. Dissolve-se o óleo resultante em 150 ml de metanol. Adicionam-se 36 g (0,22 mol) de HOObt e 200 ml de Óter dietílico ã solução obtida e deixa-se cristalizar o sal a 4°C. Separa-se o precipitado cristalino e lavawse com áter.

Rendimentos 44 g, P.F. 178-179°C, = +8,8° (C s 1, em metanol)·

b) Z-Arg-(z₂)-Leu-ol

Adicionam-se a 0°C 6,6 g de DCC a uma solução de 17,3 g de Z-Arg(z)-0H e 8,4 g de H-Ile-ol. Agita-se durante duas horas a 0°C e deixa-se repousar umas dez horas à temperatura ambiente. Separa-se o precipitado por filtração e despreza-se. Concentra-se o filtrado â secura e tritura-se o resíduo com solução aquosa saturada de NaHCO^, filtra-se, lava, -se bem com água e seca-se* Para purificação deixa-se em agitação â temperatura ambiente com metanol, arrefece-se, filtra

-se e seca-se.

Rendimentoí 17»4 g, P.F. 180-182 0, Z^k^j) ⁼ —4,2 (C = 1, em dimetilformamida)·

c) Di-tosilato de H-Arg-Leu-óT'

Adiciona-se catalisador de Pd/carvão a uma suspensão de 13,5 g Z-Àrg(Z_Q)-Leu-ol em 35θ ml de metanol e faz-se borbulhar hidrogénio através da suspensão mantendo o pH constante a 4,5 por adição de acido (Autotitrator). Durante a hidrogenação da substância. Apos terminar a reacção p-toliienossulfonico 1 M verifica-se a dissolução (quando a do p-toluenossulfénico já não é consumida) separa-se o catali sador por filtração e concentra-se à secura. Trata-se o resíduo por agitação em água. Separam-se os insolúveis por filtração e desprezam-se. Concentra-se o filtrado à secura e tritura·» -se o resíduo com éter. Separa-se o precipitado por filtração e seca-se» . /·ζΓ-/22 „o ,

Rendimento: 9,95 g, substancia amorfa, = +1,8 (C = 1, em metanol).

d) Tosilato de Z-Asp(OtBu)-Arg-Leu-ol

Ãdicionam-se 1,99 ml de N-etilmorfolina ^e 5,θ5 g de Z~Asp4otBu)«ON8u a uma solução de 8,6 g de di-tosiJ lato de H-Arg-Leu-ol em 100 ml de dimetilf ormatnida. Deixa-se en repouso durante a noite à temperatura ambiente. Concentra-se a solução ã secura sob vácuo e dissolve-se o resíduo em n-pentanol. Lava-se a solução duas vezes com água, concentra-se à secura a fase orgânica e tritura-se com o resíduo com éter. Separa-se o precipitado por filtração.

2^o

Rendimento: 9,θ5 g, substância amorfa, zvr =-26,2 (C = 1, em metanol).

e) Di-tosilato de H-Asp(OtBu)-Arg-Leu-ol

Submetem-se a hidrogénaçao catalítica

7,5 g de tosilato de Z-Asp(OtBu)-Arg-Leu-ol de modo análogo ao descrito no exemplo 2c em solução em 15θ ml de metanol. Rendimento: 7,47 g, substância amorfa, Z®L/_D =-7Λ (C = 1, em metanol).

f) Di-tosilato de Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-^eu-ol

Adicionam-se a O°C 440 mg de DCC a uma solução de 843 mg Z-Arg-Ile-OH, 1,58 g de di~tosilato de H-^isp(OtBu)-Arg-Leu-ol e 326 mg de HOObt em 20 ml de dimetilformamida· Agita-se durante 1 hora a 0°C e 2 horas à temperatura ambiente. Deixa-se em repouso a 4°C durante a noite e filtra-se o precipitado no dia seguinte. Despreza-se o precepitado e concentra-se o filtrado a secura sob vácuo. Partillia-se o resíduo entre 80 ml de ácido acético e 80 ml de água em contra-corrente (5 andares). Reunem-se as fracções contendo o composto em epígrafe, o qual é por fim isolado por liofilizaçao.

2· o

Rendimento! 1,89 g, substância amorfa, zvr ~ **2915 I (C = 1, em metanol).

g) Dissolve-se o di-tosilato de H~Arg-Ile-Asp(0tl3u)-Arg-Leu-ol em 30 ml de ácido acético a 90% e submete-se a hidrogenação catalítica de modo análogo ao descrito no exemplo 1b. Para transformação no acetato trata-se o resíduo em solução aquosa com uma resina permutadora de iões fracamente básica (na forma de acetato) com agitação. Separa-se a resina permutadora por filtração e liofjliza—se o filtrado.

**22 o

Rendimento! 1,04 g, zw - -34,7 (C - 1, ^em agua)o

Exemplo 3!

H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol °s compostos seguintes foram preparados de modo análogo ao descrito nc exemplo 2.

a) H-Ile-ol . HOObt

P.F. 178-179°C, Z~<^_7p² = 8,8° (C = 1, em metanol), b ) 4-Arg-( Zg) «-Ile-ol P.F. 180-182°C, Z^.7S² = -4,2° (C = 1, em dimetilformamida)0

c) Di-tosilato de H-Arg-Ile-ol _w £ Ο θ

Substância amorfa, zvr - +7)9 (0 = 1, em metanol).

d) Tosilato de Z-Asp(OtBu)—Arg-Ile-ol

Substância amorfa, 2^7^ = -22,2° (C = 1, em metanol).

^e) Di-tosilato de H-Asp(OtBu)-Ãrg-Ile-ol _r rj rx 0

Substância amorfa, Γ*_7Γ = -4,2 (C = 1, em metanol)₀

f) Di-tosilato de Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol **j ”^2 o

Substância amorfa, 2”?L7q = -26,1 (C = 1, em metanol)»

g) Tri-acetato de H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol

Substância amorfa, Γ<£7*³ = -31,7° (0 = 1, em água).

Exemplo 4:

H-Arg-Ile-Asp^tE^-Arg-isobutilamida

Os compostos seguintes foram preparados de modo análogo ao descrito no exemplo 2.

a) Z-Arg-Çz^j-isobutilamida

p.f. i48-i49°c, 2Έ7ρ² = +7,7° (0 =1, em dimetilformamida).

b) Di-tosilato de H-Arg-isobutileimida o

Substância amorfa, / - +13»3 (θ ⁼ 1» ^em metanol)o

c) Tosilato de Z-Asp(OtBu)-Arg-isobutiIamida

Substância amorfa, 2*çL7p^ = -21,0 (0 = 1, em metanol).

d) Di-tosilato de H-Asp(OtBu)-Arg-isobutilamida

Substância amorfa, 2~*7²² = -1,6° (C = 1, em metanol).

e) Di-tosilato de Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-isobutilamida

Substância amorfa, ZVd° = -22,9° (C = 1, em metanol).

f) Tri-acetato de H-Arg-Ile»»Asp(OtBu)-Arg-isobutilaraida

3 o

Substância amorfa, = -28,5 (0 = 1, em agua).

Exemplo 5

H~Arg-Ile-A3p(OtBtt)-Arg~Ile-NH„

Os compostos seguintes foram preparados de modo análogo ao descrito no exemplo 2.

a) Z-Arg(Z₂)-Ile-NH„

P.F. 178-188°C, Z^² = +3,5° (C = 1, em dimetilformamida)

b) Di-tosilato de H-Arg-Ile-NH

l.r.,..,-— £ · *y2 2 O

Substância amorfa, = +9,8 (C = 1, em metanol) ₀

c) Tosilato de Z-Asp(OtBu)-Arg~Ile-NH._?

Substância amorfa, ZÍ7d = -18,0° (C =1, em metanol)»

d) Di-tosilato de H-Asp(OtBu)-Arg-Ile-MH_?

Substância amorfa, L^7-q~ “3»3° (C “ 1» ^em metanol)»

e) Di-tosilato de Z-Arg-Ile—.lsp( OtBu)-Arg-lle-NH^ o

Substância amorfa, ZU7^ = 26,0 (C = 1, em metanol)»

f) Tri-acetato deH-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Zle-NH„

Substância amorfa, “34,3° (^G = água).

Exemplo 6

H-Arg-Ile~Asp(OtBu)-Arg-Va1-NH„

As substâncias seguintes foram prepara das de modò análogo ao descrito no exemplo 2.

a) Z-Asg(Z„)-Val-NH^

P.F. 174-178°C, ZÕL7d² = +4,6° (0 = 1, era dimetilf ormamida) <>

b) Di-tosilato de H-Arg-Va1·~ΝΗ„

Substância amorfa, = +11,8 (c = 1, em metanol) ₀

c) Tosilato de Z-Asp(OtEu)-Arg-Va1-NIb

Substância amorfa, - -16,5 (0 = 1, eni metanol)»

d) Di-tosilato de HAsp(OtBu)wArg-ValwNH_? o

Substância amorfa, ZsPd = 2,7 (C ss 1, em metanol)»

e) Di-tosilato de Z-Arg-Zle-Asp(OtBu)-Arg-Val-NH_?

Substância amorfa, = -24,3° (C = 1, em metanol)_e

f) Tri-acetato de H-Arg-Zle-Asp(OtBu)-Arg~Val-NH„

Substância amorfa, /*^7^ = -36,2° ( C =1, em água)»

Exemplo 7:

H-Arg-Zle-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH„

As substâncias seguintes foram preparadas de modo análogo ao descrito no exemplo 2.

a) Z-Arg^Z^)-Trp-NIib

P.F. 172-174°C, - -1,4° (C — 1, em dimetilformamida)»

b) Di-tosilato de H-Arg-Trp-NH^

Substância amorfa, Z47n^Z = +13,5° (C = 1, em metanol)o

c) Di-tosilato de Z-Asp(0tBu)-Arg-Trp-NH₂

Substância amorfa, Z<^7^ ⁼ -18,2° (C - 1, em metanol)»

d) Di-tosilato de H-Asp(OtBu)-Arg-Trp~NH_n / | II _U1 . II I ' ' ‘ pZ

Substância amorfa, = ••25,0^o (C - 1, em metanol)₀

f)Tri-acetato de li-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH^ *3 o

Substancia amorfa, = -31,9 (C = 1, em água).

Exemplo 8

H-Arg-Pro-Val-Lys-Vai-OH

a) H»Lys(Boc)~Va1-otBu . HC1

Adicionam-se a 0°C com agitação 1,3 ml de N-etilmorfolina e 2,2 g de DCC a uma solução de 4,5 g de Z-Lys» (Boc)-OH, 2,1 g de H-Val-OtEu.HCl e 1,35 g de HCBt em 20 ml de dimetilformida. Deixa-se em agitação durante uma hora a 0°C e em seguida durante a noite á temperatura ambiente. Separa-se o precipitado por filtração e despreza-se. Concentra-se o filtrado sola vácuo. Partilhasse Lava-se a fase orgânica solução aquosa saturada e concentra-se â secura o resíduo entre acetato de etilo e água o suces ivamente com tampão de NaHCO^ e água, seca-se d e KHS 0 )^ /K^S 0 , sobre Na_oS0^

Purificação: cromatografia em gel de sílica com CH Cl_Q/acetsna/ /éter de petróleo nas proporçSes 9 : 0,5 : 2.

Rendimento: 3,7 g duma substância oleosa.

A substância anterior foi submetida a hidro· gen-.<'. Tc catalítica (Pd/BaSO.) em metanol a pH 4,5 (Autotitrator' *+ adição de HC1 metanólico 1 N). Após terminada a hidrogenação, eliminou-se o catalisador por filtração e concentrou-se o filtrado à secura. Partilhou-se o resíduo entre n-pentanol e solução aquosa^de NaCl em contra-corrente (5 andares). Concentrou» • -se a l^s fracção de pentanol e triturou-se o resíduo com éter.

- 2C -

Rendimento: 1,25 g, P.F. 141-143°0, ZÍ7|¹⁼ -1,7° (C = 1, em metanol)·

b) Z-Pro-Val-OtBu

Adicionam-se a 0°C 1,3 ml de N-etilmorf oli·· na e 2,2 g de DCC a uma solução de 2,49 g de Z-Pro-OH, 2_S1 g de H-Val-OtBu.HCl e 1,35 g de HOBt em 20 ml de dimetilformamidao Segue-se em seguida um procedimento análogo ao do exemplo 8a₀ Tritura-se o resíduo com éter de petróleo, filtra-se e seca-sel

Rendimento: 2,83 g, P,F. 110-112 °0, ZVp¹ - -66,6° (C = 1, em metanol).

c) Z-Pro-Val-OH

Dissolvem-se 2,63 g de Z-Pro-Va1-OtBu em 20 ml de ácido trifluoroacético a 90 %. Deíxa-se em repouso durante uma hora â temperatura ambiente e concentra-se ã secura» Tritura-se o resíduo com água. »epara-se o precipitado por filtração e seca-se sobre P^O^. Para maior purificação submete -ss a cormatografia em gel de sílica com CH^Cl^/CH^OH/eter de petróleo/ácido acético/água nas proporções 18:1:2:0,1:0,1o

Rendimento: 1,2 g, P.F. 131-133°C, - -56,9° (C = 1, em metanol).

d) Z-Pro-Val-Lys(Boc)-Valt»QtBu

Adicionam-se a 0°C 0,j8 ml de N-etilmorfolina e 0,66 g de DCC a uma solução de 1,05 g de Z-Pro-Val-OH,

1,3 g de H-Lys(Boc)-Val-OtBu.HCl e 0,5 g de HOObt em 5 ®1 de dimetilformamida. Agita-se durante uma hora a 0°C e deixa-se em repouso durante a noite â temperatura ambiente. Segue-se em seguida o procedimento descrito no exemplo 8a. Tritura-se o resíduo com éter, aepara-se o precipitado por filtração e seca-se*

Rendimento: 1,45 g, P.F. 139-141°C, /K/ (C = 1, em metanol).

Submetem-se a hidrogenação catalítica 1,32 g de Z-Pro-Val”Lys(Boc)Val-OtBu de modo análogo ao descrito no exemplo 8a.

Rendimento: lg, P.F. 15O-157°C, = -52,2°, (C = 1, em metanol).

f) Z-Arg-(z_g)-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-OtBu

Adicionam-se a 0°C 0,18 ml de N-etilmo.rfo<lina e 0,31 g de DCC a uma solução de 0,89 g de H-Pro-Val (Boc) ·> -Val-OtBu.HCl, 0,81 g de Z-Arg(Z_o)-0H e 0,23 g de HOObt em 10 nil de dimetilformamida e segue-se o procedimento no exemplo 8a o Cristaliza-se o resíduo por trituração com éter.

Rendimento: 1,02 g, P.F. 86-92°C, Z'^D³ (C = 1, em metanol).

56,3°

g) PI -acetato de H-Arg-Pro-Val-Lys-Val-OH

Suspende-se 0,9 g de Z-Àrg(Z_g)-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-OtBu em ácido acético a 90% e submete-se a hidrogenação catalítica de modo análogo ao descrito no exemplo lb. 0 resíduo insolúvel em éter (0,55 g ) e dissolvido em 5 ml de ácido trifluoroacético a 90 %· T)_e;i_xa__{se em} repouso durante uma hora à temperatura ambiente e concentra-se à secura. Retoma-se o resíduo com água e trata-se com resina permutadora de ióes fracamente básica (em fornia de acetato) com agitação. Separa-se a resina promutadora por filtração e liofiliza-se o filtrado.

Purificação: cromatografia em gel de dextrano reticulcido.

— 22 —

Exemplo 9

H-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH

a) Z-D-Arg-Ile-OBzl

Adicionam-se a O°C 6,6 g de DCC a uma solução de 9,25 g de Z-D-Arg-OH, 11,8 g c?e tosilato de H—Ile-OBzl e 4,05 g de HOBt em 150 ml de dimetilformamida. Agita-se duran te uma hora a 0°C e deixa-se em repouso durante a noite à temperatura ambiente, ção e despreza-se.

Separa-se o precipitado

Concentra-se o filtrado formado por filtrasecura partilha

-se o resíduo entre acetato de etilo e solução aquosa saturada de NaHCO^. Lava-se a fase orgânica com âgua, seca-se sobre Na 80. e concentra-se à secura. Tritura-se o resíduo com éter 4 · * * Separa-se por decantação e tritura-se cem éter de petróleOo Separa-se o precipitado por filtração e seca-se.

Rendimento! 19,5 g?

2,7° (C = em metanol)0

b) Z-D-Arg-Ile-OH

Trata-se

-OBzl numa uma solução de de Dioxano, 30 ml g de Z-D-Arg-Ile de água e 12 ml de metanol so durante mistura de 70 ml com 41,8 ml de NaOH 1 N aquoso e deixa-se em repoua noite â temperatura ambiente. No dia seguinte neu com cerca de 3,3 ml de HC1 4 N. Filtra-se a solução traliza-se turva através de um filtro clarificador e conc:.ntra-se o filtrado à secura. Partilha-se o resíduo entre 120 ml de n-penta nol e 120 ml de água. Jxtrai-se ainda a fase aquosa 4 vezes com n-pentanol. Reunem-se as fase de n-pentanol e concentram-se â secura. Tritura-se o resíduo com acetato de etilo e sefiltração· para-se o precipitado por

Rendimento! 8,4 g; / À./j) ⁼ +12,3 a 90$).

(C = 1, em ácido acético

c) Fino c-Le ij-OObt

Adicionam-se 2,06 g de DCC a uma solução de 3,53 g de Fmoc-L_eu-0H e 1,63 g de HOObt em 40 ral de CII_QCl₀o Agita-se uma hora a 0°C e deixa-se em repouso durante a noite ã temperatura ambiente, repara-se por filtração o precipitado formado e despreza-se. Concentra-se o filtrado e tritura-se o resíduo por duas vezes com éter de petróleo, secando-se em seguida sob alto vácuo.

Rendimento: 5,2 g de uma substância amorfa.

d) Fmoc-Leu-Arg-OH

Adicionam-se à temperatura ambiente 5 g de Fmoc -Leu-OObt a uma mistura de 1,74 g de arginina, 1,63 g de HOObt ® 1,79 g d® perclorato de piridínio em 5° ml de dimetilformamida· Agita-se durante 3 horas â temperatura ambiente e deixa-se em repouso durante 1 secura a solução ta-se o pH a 7 com duo por filtração, temperatura ambiente. Concentra-se e trata-se o resíduo com águao Ajusaquosa de NaHCO^. Separa-se o resícom água e seca-se.

P.T. 145-155°C (com decomposição), a noite límpida solução lava-se

Rendimento: 4,7 St ^M -18,5° (C = 1, em metahol).

e) Γηιοο-Ρ6η-ΑΓ&~Τ1θ-0Βζ1 a 0°C 880 mg de DCC a uma solução 1,57 S d® tosilato de H-Ile-OBzl dimetilformamida· Agita-se duranAdicionam-se de 2,04 g de Fmoc-Leu-Arg-OH, e 0,65 g de HOObt em 20 ml de te uma hora a 0°C e deixa-se em repouso durante a noite â tempe ratura ambiente. Separa-se por filtração o precipitado formado e despreza-se. Concentra-se â secura o filtrado e partilha-se o resíduo entre acetato de etilo e solução aquosa saturada de NaHCO^. Lava-se a fase orgânica ainda duas vezes com solução a· quosa saturada de NaHCO^ e 3 vezes com água, seca-se sobre NagSO^ e concentra-se ã secura. Tritura-se o resíduo com éter e separa-se por filtração.

- 24 Rendimento: 2,59 g, ⁼ “36,4 (C = 1, em metanol) .

f) Di-acetato de Z-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OBzl

Adicionam-se 3,25 ml de dimetilformamida a uma solução de 2,18 g de Fmoc-Leu-Arg-Ile-OBzl em 15 ml de dimetilformamida. Deixa-se em agitação durante 15 minutos ã. temperatura ambiente e concentra-se à secura· Dissolve-se o resíduo em 125 ml de n-pentanol e lava-se com uma solução aquosa de concentração média de NaHCO^· Concentra-se a fase de n-pentanol àl secura e tritura-se com éter e filtra-se.

Rendimento: 1,4 g de H-Leu-Arg-Ile-OBzl.

Adicionam-se a 0°C 220 mg de DCC a uma soluçãc de 421,5mg de Z-D-Arg-Ile-OH, 490,6 mg de H-Leu-Arg~Ile-OBzl,

179,5 mg de perclorato de piridínio e 163 mg de HOObt em 10 ml de dimetiformamida. Agita-se durante uma hora a 0°C e deixa-se em repouso durante a noite á temperatura ambiente. Separa-se por filtração o precipitado formado e despreza-se. Concentra-se o filtrado â secura e dissolve-se o resíduo em 50 ml de n-pentanol. Lava-se a solução 2 vezes com 50 ml cada lavagem de solução aquosa de concentração média de NaHCO^ e concentra-se â secura. Tritura-se o resíduo com ácido acético e separa-se por filtração.

Rendimento: 865 mg.

Para purificação partilha-se a substância enti 45 ml de ácido acético aquoso a 10$ e 45 ml de acetato de etilo em contra-corrente. Concentram-se δ secura as fase aquosas j. a 4, tritura-se o resíduo com éter e separa-se por filtração.

_23

Rendimento: 620 mg, substância amorfa, ⁼ “31,3 (C = 1, em metanol).

g) Di-acetato de H-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH

Submetam-se a hidrogenação catalítica 510 mg

de Z-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-Obzl de modo análogo ao descrito no exemplo Ib em 15 ml de ácido acético a 9θ%·

Rendimento: 445 mg» 237o¹ “ -66,2° (C= 1, em água).

Exemplo 10:

H-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OH

a) Fmoc-Leu-D-Arg-OH

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9d.

P.F. 145-155°C (com decomposição), _ ^1,1° (C = 1, em metanol).

b) Fmoc-Leu-D-Arg~Ile-OBzl

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9®· /^7^ - 9»θ° (θ= 1, em metanol).

c) Di-acetato de Z-Arg-Tle-Leu-D-Arg-Ile-OBz1

A substância & preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9f.

Substância amorfa, ₌ _i_8>3° (_{c = lf em ffle}tanol).

d) Di~acetato de H-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OH

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9g·

Substância amorfa, /«*7^ = -14,0 (c= 1, em água).

Exemplo 11:

H-Arg-Ile-Leu-Arg-D-Val-OH

a) Fmoc-Leu-Arg-D-Val-OBzl

A substância á preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9®·

Substância amorfa, = -18,3° (C = 1, em metanol).

b) Di-acetato de Z-Arg-Ile-Leu-Arg-D-Val-OBzl

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9f*.

Λ Λ

Substância amorfa, íST = -24,2 (C = 1, em metanol). D

c) Di-acetato H-Arg-Ile-Leu-Arg-D-Val-OH

A substância e preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9g· o

Substância amorfa, /ç(7^ = -37,1 (C = 1, em água).

Exemplo 12:

H-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val~OH

a) Fmoc-D-Leu-Arg-OH

A substância á preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9d.

Ρ F. 14O-15O°C (com decomposição), /á7^³ = +30,8° (C = 1, em metanol).

b) Fmoc-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl

A substância á preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9®·

- 27 Substância amorfa

c) Di-acetatode Z-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9f.

•*23 o

Substância amorfa, = +5,2 (C s= 1, em metanol) ₀

d) Di-acetato de H-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OH

A substância á preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9g.

Substância amorfa. = +10,6 (C = 1, em água).

Exemplo 13:

H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH

a) Fmoc-D-Leu-Arg-Ile-OBzl

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9e·

Substância amorfa, /tf= -5,7 (C = 1, ^em metanol).

b) Di-acetato de Z-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Tle-OBzl

A substância ó preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9f·

Substância amorfa, -~-^z ,4° (c = 1, em metanol).

c) Di-acetato de H-D-Arg-Ile~D-Leu-Arg-Ile-OH

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9g.

Substância amorfa, = -20,3° (C = 1, em água).

Exemplo 14:

Di-acetato, de H-D-Arg-D-alo-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH

Na purificação de H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH por cromatografia em coluna, isolou -se uma fracção que se verificou por análise de ácidos aminados ser H-D-Arg-D-alo-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH.

Substância amorfa, análise de ácidos aminados: D-alo-lle (0,</, Ile (1,06), Leu (1,03), Arg (1,87).

Exemplo 15 *

H-D-Arg~Ile-Leu-D~Arg~Ile-OH

a) Di-acetato de Z-D-Arg-Tle~Leu-D-Arg-Ile-OBzl

A substância á preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9f·

Substância amorfa, 7^ = -6,9° (C = 1, em metanol)

b) Di-acetato de H—D-Arg-Ile-Leu-D—Arg—Ile-OH

A substância á preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9g»

Substância amorfa, />7^ = -3θ,5 (θ ⁼ 1, ^em água)»

Exemplo 16:

H-Arg-D-Val-Leu-Arg-Ile-OH

a) Z-Arg-D-Val-OBzl

A substância á preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9a»

Suabstância amorfa, /»7^ - +6,2° (C - 1, em metanol).

b) Z-Arg-D-Val-OH

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9b. 2^/jj = -6,1 (C = 1, em ácido acético a 90 $).

c) Di-acetato de Z-Arg~D-Val-Leu-Hrg~Ile-OBzl

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9f.

_illi go θ

Substância amorfa, /ô?7p = -3θ,7 (C = 1, em metanol).

d) Di-acetato de H-Arg-D-Val-Leu~Arg-Tle-OH

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 9g.

Substância amorfa, /^7^ = -15,1° (C = 1, em água).

Exemplo 17?

M-Arg-Ile~Trp-Arg-Tle-OH

a) Z-Arg-Ile-Ofí

A substância é preparada de modo análogo ao descrito nos exemplos 9a e 9h· /37*² = -5,9° (0 a 1, em metanol).

b) Z-Arg(Z?) - II e-OMe

A substância é preparada, de modo análogo ao descrito no exemplo la. P.F. 129-13θ°θ·

c) Di-tosilato de H-Arg-Ile-OMe

A substância é preparada por hidrogenação catalítica a partir de Z-Arg(Z₂)-Ile-0Me de modo análogo ao des- 30 -

crito no exemplo 2c.

*•22 o

Substância amorfa, = +8,4 (C = 1, em metanol).

d) Tosilato de Z-Trp-Arg-Ile-OMe

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 2d.

Substância amorfa, /S7 = -20,6 (C = 1, em metanol).

D

e) Di-tosilato de H-Trp-Arg-Ile-OMe

A substância é preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 2e.

Substância amorfa, gr - ^-,5 (C = 1, ^em metanol).

D

f) Di-tosilato de Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OMe

A substância e preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 2f.

Substância amorfa, /47^² = -27,5° (C = 1 em metanol).

g) Tosilato de Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH

Adiciona-se com agitação a pH 13,5 gota a gota NaOH aquoso a uma solução de 2,7 g de Z-Arg-Tle-Trp-Arg-Tle-OMe em 30 ml de dioxano, 10 ml de água e 4 ml de metanol. Utilizaram-se no total 5,2 ml de NaOH 1 N. Ajusta-se o pH da solução ao valor 7,8 com 0,82 ml de solução aquosa de ácido p-toluenos sulfónico e concentra-se à secura sob vácuo. Dissolve-se o resíduo em n-butanol e extrai-se 3 vezes com água. As fases aquo sas reunidas são extraídas uma vez com n-butanol. As fases de n-butanol reunidas são concentradas à secura. 0 resíduo é dissolvido em etanol e deitado gota a gota sobre uma mistura de acetato de etilo e éter.

Rendimento: 1,59 g, /Ã7^² = -25,2° (C = 1, em metanol).

h) Di-tosilato de H-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH composto foi preparado por hidrogenação catalítica a partir de tosil_ato de Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH de modo análogo ao descrito no exemplo 2c.

•*22 o

Substância amorfa, = -10,5° (C = 1, em metanol).

Os seguintes peptídeos foram também preparados em condições iguais às usadas no exemplo 17:

Di-tosilato

Tosilato de

Di-tosilato

Di-tositalo

Tosilato de

Di-tosilato

Di-tosilato

Tosilato de

Di-tosilato

Di-tosilato

Tosilato de

Di-tosilato de Z-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OMe Z-Arg-Ile-Le u-Arg-Ile-OH de H-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH de Z-Arg-He-Phe-Arg-Ile-OMe Z-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH de H-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH de Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Ile-OMe Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH de H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH de Z-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OMe Z-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH de

H-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH

Os resultados das análises de ácidos aminados estão em todos os casos em concordância com os valores esperados

Exemplo 18:

ciclo-(Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile)

Adicionam-se à temperatura ambiente 78 mg de Boc-Gly-OTcp, 3 mg HOBt e 0,026 ml de N-etilmorfolina a uma solução de 210 mg de di-tosilato de H-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH era 3 ml de dimetilformamida. Agita-se durante algumas horas à ten peratura ambiente e deixa-se em repouso durante a noite à tempe

ratura ambiente e deixa-se em repouso durante a

tempere tura ambiente. Concentra-se à secura sob vácuo e partilha-se c resíduo entre agua e acetato de etilo, adicionando-se então pequena quantidade de etanol, Extrai-se a fase orgânica mais ume vez com água. Extraiem-se as fases aquosas reunidas com acetato de etilo. Conàentram-se â secura as fases aquosas reunidas. Dissolve-se o resíduo (tosilato de Boc-Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH) em 2 ml de ácido trifluoroacético. Após 45 minutos à temperatura ambiente concentra-se à secura e destila-se 2 vezes após se ter adicionado éter. Resultam 200 mg duma resina (trifluoroacetato de tosilato de H-Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH), a qual é dissolvida em 200 ml de dimetilformamida. Adiciona-se então 0,1 ml duma solução a 5θ% de anidrido de ácido etilmetilfosfínico em CHgCl^ e com agitação adiciona-se lentamente ainda uma solução de 0,16 ml de N-etilmorfolina em 5 ml de dimetilformamida. Agita-se durante 2,5 horas à temperatura ambiente, adiciona-se uma pequena quantidade de água e concentra-se à secura sob vácuo. Dissolve-se o resíduo numa pequena quantidade de isopropanol e deita-se gota a gota com agitação sobre éter.

Rendimento: 60 mg. 0 espectro de massa de FAB apresenta a massa m olar esperada de 743·

Exemplo 19:

ciclo-(Gly-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile) composto é preparado a partir de di-tosilato de H-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH de modo análogo ao descrito no exemplo 18. 0 espectro de massa de FAB apresenta a massa molar esperada de 7θ8.

Exemplo 20:

H-Arg-Leu-Gly-Arg-Leu-OH

a) Z-Tyr(tBu) -Arg-Pro-OtBu

Prepara-se di-tosilato de Η-Arg-Pro-OtBu de modo análogo ao descrito nos exemplos 20a e 2c.

Adicionam-se a 0°C 0,66 ml de N-etilmorfolina e 1^2 g de DCC a uma solução de 3,4 g de di-tosilato de H-Arg-Pro-OtBu, 1,9 g de Z-Tyr(tBu)-OH e 0,69 g de HOBt em 15 ml de dimetilformamida. Deixa-se em agitação durante uma hora a 0°C e deixa-se em seguida durante a noite à temperatura ambien te. Separa-se por filtração o precipitado formado e despreza-se. Concentra-se o filtrado à secura e partilha-se o resíduo entre acetato de etilo e solução aquosa saturada de NaHCO^. Lava-se ainda uma vez a fase orgânica com solução aquosa saturada de NaHCO^ e uma vez com água, aeca-se sobre NaSO^ e concentra-se à secura. Tritura-se o resíduo com éter de petróleo e separa-se por filtração.

Rendimento: 3,35 g, P.F. 115-125°C (com decomposição), £7²⁴ = -35, o⁸ (C = 1, em metanol).

b) Di-tosilato de H-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu

A substância foi preparada de modo análogo ao descrito no exemplo 2c.

a) H-Arg-Leu-OtBu.2HC1

Adiciona-se à temperatura ambiente 3,9 ml de N-etilmorfolina e 22,7 g de Z-Arg(Z₂)-0Tcp a uma solução de 6,7 g de H-Leu-OtBu.HCl e 4,05 g de HOBt era 50 ml de dimetilformamida. Após duas horas de tempo de reacção, trata-se a mistura reaccional com 300 ml de água gelada. òepara-se o precipitado por filtração, tritura-se com solução aquosa satura da de NaHCO^, água e seca-se separa-se de novo por filtração, lava-se com

Rendimento: 27,4 g de Z-Árg(z^)-Leu-OtBu. A substância obtida acima Ó submetida a hidrogenação catalítica de modo análogo ao descrito no exemplo 8a.

Rendimento: 11,6 g, = -4,0° (C = 1, em metanol).

Adicionam-se a 0°C 0,52 ml de N-etilmorfolina e 880 mg de DCC a uma solução de 3,27 g de Z-Arg(Zg)-Leu-Gln-0H, 1,66 g de H-Arg-Leu-OtBu.2 HC1, 652 mg HOObt em 5° ml de dimetilformamida. Agita-se durante uma hora a 0°C e durante outra hora â temperatura ambiente e deixa-se em repouso à temperatura ambiente durante a noite. Separa-se o precipitado por filtração. Precipita-se o peptídeo no filtrado com solução aquosa de NaHCO^ de meia saturação. Separa-se por filtraç o precipitado (Z-Arg(Z₂)-Leu-Gln-Arg-Leu-0tBu), lava-se com água e seca-se. A substância obtida acima é submetida a hidro genação catalítica em ácido acético a 90% de modo análogo ao descrito no exemplo lb.

Rendimento: 3,7 g de tri-acetato de H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-OtBu

Dissolvem-se 3θθ mg de tri-acetato de H-Arg-Dw. -Gln-Arg-Leu-OtBu em 3 ml de ácido trifluoroacético a 9θ%· Deixa-se em repouso à secura sob vácuo, com uma resina permutadora de iões fracamente básica forma de acetato) com ca de 4. Separa-se a filiza-se o filtrado.

temperatura ambiente e concentra-se à Dissolve-se o resíduo em água e trata-se (sob a agitação até que se atinja um pH de cerresina permutadora por filtração e lioRendimento: 2$8,8 mg,

Exemplo 21:

H-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-OH

P.F, 105-110°C (com decomposição), metanol).

c) Z-Arg(Z^)-Vai-OtBu

em

Adicionam-se a 0°C 1,3 ml de N-etilmorfolina e 2,2 g de DCC a uma solução de 5,77 S de Z-Arg(Z,,)-OH, 2,1 g de H-Val-OtBu.HCl e 1,63 g de HOObt em 20 ml de dimetilformamida. Segue-se então o procedimento descrito no exemplo la. Rendimento: 4,55 , P.F. 1O3-1O5°C, /^7²^ = +9,2° (C = 1, em

D metanol).

d) Z-Arg(Z₂)-Val0H

Dissolvem-se 4,5 g de Z-Arg(Zg)-Val-OtBu em cerca de 45 ml de ácido trifluoroacético a 90$. Deixa-se em repouso durante uma hora à temperatura ambiente e concentra-se à secura. Tritura-se o resíduo com éter e separa-se por filtração .

Rendimento: 3,58 g, P.F. 142-144°C /Ã7²² = +1,1° (C = 1, em metanol)·

e) Z-Arg(Z^)-Val-Tyr(tBu)-Arg-Pro-0tBu

Adicionam-se a 0°C 0,4 ml de N-etilmorfolina e 0,68 g de DCC a uma solução de 2,8 g de di-*osilato de H-Tyr (tBu)-Arg-Pro-OtBu, 2,1 g de Z-Arg(Z₂)-Val-OH e 0,5 g de HOObt em 10 ml de dimetilformamida. Agita-se durante uma hora a 0°C e deixa-se em repouso durante a noite à temperatura amiriente. Separa-se o procedimento por filtração e despreza-se. Concentra-se o filtrado à secura sob vácuo. Partilha-se o resí duo entre acetato de etilo e água. Precipita-se então uma substancia que ó separada por filtração. Esta substância é turada de NaHCO^ e após cada lavagem.

triturada duas vezes com solução aquosa sa uma vez com água e separada por filtração

Recristaliza-se a substância a partir de acetato de etilo.

Rendimento: 2,6 g, P.F. 141-147°C, /6(7²³ = -41,8° (c - 1, em D metanol).

f) Tri-acetato de H-Arg-Val-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu

Submetem-se a hidrogenação catalítica 2,4 g de Z-Arg(Z₂)-Val-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu de modo análogo ao descrito no exemplo 1b.

Rendimento após purificação em gel de dextranoí 1.172 g, = -39,2° (C = 1, em água).

g) Di-acetato de H-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro~0H

Dissolvem-se 67O mg de tri-acetato de H-Arg-Val-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu numa mistura de 10 ml de ácido trifluoracético a 90$ e 1 ml de etilmercaptano. Deixa-se em repouso durante uma hora à temperatura ambiente e concentra-se à secura sob vácuo. Partilha-se o resíduo entre água e óter t-butil-metílico. Trata-se a fase aquosa com uma resina permutadora de iSes fracamente básica (sob forma de acetato) com agitação, até se atingir um pH de 3,5 a 4,0. Separa-se a resina permutadora por filtração e liofiliza-se o filtrado.

Rendimnnto após purificação em gel de dextrano: 31θ mg. A análise de ácidos aminados deu os valores calculados.

Exemplo 22

Di-tosilato de H-Lys-Ile-Asp(0tBu)-Arg-Ile-NH₂

a) Z-Lys(z)-Ile-0Me

Dissolvem-se 29,8 g de Z-Lys(z)-OH.DCHA e 9,08 g de H-Ile-OMe.HC1 em DMF e depois de 15 min separa-se por filtração o precipitado de DCHA.HC1. Trata-se o filtrado com

10,1 g de HOBt e a 0°C com 10,8 g de DCC. Deixa-se reagir durante uma hora a 0?C e mais outra hora à temperatura ambiente e em seguida elimina-se o solvente. Retoma-se o resíduo em ácido acético, separa-se a ureia por filtração e lava-se o filtrado sucessivamente com solução aquosa de NaHCO^ e com solução aquosa de Na Cl. Após secagem sobre MgSO^ concentra-se a fase orgânica à secura e recristaliza-se o resíduo a partir de acetato de etilo/hexano.

Rendimento: 25,1 g, P.F. 1O3-1O5°C, = H3,8° (C = 1, MeOH).

b) Z-Lys(Z)-Ile-OMe

Dissolvem-se 23,3 g de Z-Lys(Z)-Ile-OMe em I5O ml de metanol e trata-se com agitação com 5θ ml de NaOH aquoso 2 N. Após completada a reacção elimina-se o solvente, dissolve-se o resíduo em água e extrai-se com acetato de etilo Acidifica-se a fase aquosa com arrefecimento até um pH de 2 a 3 e extrai-se com acetato de etilo, Lava-se a fase orgânica com água, seca-se sobre MgSO^ e recristaliza-se a partir de acetato de etilo/éter diisopropílico o resíduo obtido após eliminação do solvente.

Rendimento: 17,5 g, P.F. 110-112°C (decomposição), /57^θ « = *2,4° (C = 1, DMF).

c) Z-Lys(Z)-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH_g

A preparação segue um procedimento análogo ao descrito no exemplo 2f a partir dos compostos dos exemplos 22b e 5d. Obtém-se uma substância amorfa com o espectro de massa de FAB correcto (967, M+H) .

d) Di-tosilato de H-Lys-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH^

A preparação segue um procedimento análogo ao descrito no exemplo 2c a partir do composto do exemplo 22c. Obtém-se uma substância amorfa com o espectro de massa de FaB correcto (699, M+H).

^7²⁰ = -23,4° (C = 1, MeOH).

Exemplo 23¾

A preparação segue um procedimento análogo ao descrito no exemplo 22.

a) Z-^-amino-hexanoíl-Ile-OMe

Xarope oleoso, /c(7^0 = -6,9° (C = 1, MeOH).

b) Z-f-amino-hexanoíl-Ile-OH

P.F. 73-75°C (decomposição), A7|° - +5,1° (C = 1, DMF) .

c) Z-£-amino-hexanpíl-Ile -Aso-(OtBu)-Arg-Ile-NH^ I

Substância amorfa com o espectro de massa de FAB coreecto (819, M+H).

d) Di-tosilato de H-£-amino-hexanoíl-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH,,

Substância amorfa com o espectro de massa de FAB correcto (684, M+H) /ί(7ρθ = -20,6° (C = 1, MeOH).

Exemplo 24:

Acetato de di-tosilato de H-Arg-Ile-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH^

A preparação segue um procedimento análogo ao descrito no exemplo 2.

a) Tosilato de Z-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH^

Preparado de modo análogo ao descrito no exemplo 2d. Substância amorfa com o espectro de NMR correcto.

b) Di-tosilato de H-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH^

A preparação é realizada por hidrogenação cata_

lítica de modo análogo ao descrito no exemplo 2c. A substância amorfa deste modo obtida foi transformada imediatamente.

c) Acetato de tosilato de Z-Árg-Ile-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH^

A preparação segue um procedimento análogo ao descrito no exemplo 2f a partir do composto do exemplo 24b e de Z-Arg-Ile-OH. A purificação final é efectuada por meio de cromatografia em coluna de gel de sílica com CHgClg/MeOH/HgO/ /AcOH (20 : 7 : 2 : 2).

Substância amorfa com o espectro de massa de FAB correcto (876, M+H) 2&7p° = -23,9° (C = 1, MeOH).

d) Acetato de di-tosilato de H-Arg-Ile-Glu(OtBu)-Arg-Zle-NH^

A preparação é realizada por hidrogenação catalítica de modo análogo ao descrito no exemplo 2c.

Substância amorfa com o espectro de massa de FAB correcto (741, M+H) Z£7p° « -15,3^o (C = 1,05; MeOH).

Exemplo 25?

H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu

a) Tosilato de Z-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu

Adicionam-se a 0°C com agitação 3,3 g de DCC a uma solução de 4,43 g de Z-Ser(tBu)-OH (15 mmol), 10,03 g de di-tosilato de H-Àrg-Pro-OtBu e 2,02 g de HOBt em 40 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo la.

Rendimento: 9,8 g, amorfo, /77_p = -49,5 (C = 1, ^em metanol).

b) Di-tosilato de H-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu

Submetem-se a hidrogenação catalítica 9,2 g • tosilato de Z-Ser(tBu)-Arg-Pro-CtEu de modo análogo ao descrito . no exemplo 2c.

c) Di-acetato de Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu

Adicionam-se a 0°C com agitação 2,2 g de DCC a uma suspensão de 4,21 g de Z-Arg-Ile-OH (10 mmol), 8,15 g de di-tosilato de H-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu e 1,63 g de HOObt em 50 ml de dimetilformamida. Deixa-se em agitação durante 1 hora a 0°C e 2horas à temperatura ambiente, deixa-se em repouso durante a noite e separa-se no dia seguinte por filtração o precipitado formado. Concentra-se o filtrado à secura e partilha-se o resíduo entre n-pentanol e solução de

NaHCO^ de concentração média. Concentra-se à secura a fase de pentanol e tritura-se o resíduo com acetato de etilo.

Rendimento: 11 g.

A substância acima obtida é dissolvida em ácido acético aquoso e submetido a cromatografia numa resina permutadora de iães fracamente básica na forma de acetato. 0 eluído contendo o peptídeo e reunido e liofilizado.

Rendimento: 8,75 g

Submetem-se 500 mg da substância acima obtida a cromatografia em gel de sílica para purificação. Elui-se com uma mistura de 1560 ml de n-butanol, 181 ml de ácido acéti co e 55θ ml de água o

Rendimento: 251 mg, /7.7^ = -68,1 (C = 1, em água).

d) Tri-acetato de H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu

Dissolvem-se 4,4 g de di-acetato de Z-Arg-Ile -Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu (antes da purificação) em cerca de 60 ml de ácido acético a 90% e submete-se a hidrogenação catalítica de modo análogo ao descrito no exemplo lb.

Rendimento: 4,25 g·

- 41 Submete-se a crnmatografia em gel de sílica 1 g da substância acima obtida. Elui-se com uma mistura de 4.50 ml de diclorometano, 200 ml de metanol, 150 ml de metilgli· col, 100 ml de água e 5g de acetato de amónio, cujo pH foi ajustado a 6 com ácido acético glaciãl.

**22 o

Rendimento: 560 mg, amorfo, £7; = -53,6 (C = 1, em água).

Exemplo 26:

Η-Arg-Trp-As p(0tB u)-A rg-Phe-NH^

a) Z-Arg(z^,)-Phe-NH^-diciclo-hexilureia

Adicionam-se a 0°C com agitação 3,3 g de DCC a uma solução de 8,65 g (15 mmol) de Z-Arg-(Z₂)-OH, 3,θ1 g de H-Phe-NHg.HCl, 2,45 g de HOObt e 1,95 ml de N-etilmorfolina em 30 ml de dimetilformamida. Deixa-se em agitação durante 1 hoo _s ra a 0 C e em seguida deixa-se em repouso a temperatura embiente. No dia seguinte provoca-se a preeipitação. Trata-se a mis tura reaccional com solução de NaHCO de concentração média, separa-se por filtração e lava-se com solução de KHSO^ ^e agua.

Rendimento: 13,9 g (a substância contém ainda diciclo-hexilureia em quantidade aproximadamente equimolar), /~7p = -2,3° (C = 1, em ácido acético a 80 $) .

b) H-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH .2 HCIO^

Suspendem-se 13,5 g de Z-Arg(-Zg)-Phe-NH^.diciclo-hexilureia em 200 ml de dimetilacetamida e submete-se a mistura a hidrogenação catalítica de modo análogo ao descrito no exemplo 2c. Neste caso usa-se HCIO^ 1 N para manter o pH. Trata-se o resíduo com água com agitação. Separam-se os insolúveis por filtração e liofiliza-se o filtrado. Resulta um óleo que se tritura 2 vezes com éter dietílico e 2 vezes com acetato de etilo, decantando-se depois cada operação. Seca-se o resíduo sob alto vácuo.

Rendimentos 9,5 g sob a forma dum óleo.

Adicionam-se a 0°C com agitação 4 g de DCC a uma solução de 9,5 g do óleo acima obtido, 5,9 g de Z-Asp(OtBu' -OH, 2,48 g de HOBt e 2,37 ml de N-etilmorfolina em 50 ml de dimetilformamida. Segue-se então um procedimento análogo ao descrito no exemplo la. Tritura-se o resíduo com éter dietílico e separa-se por filtração.

Rendimento; 9,θθ g

Submetem-se a hidrogenção catalítica'8,7 g de substância acima obtida /Z-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NHg.HC10^_7 de modo análogo ao descrito no exemplo 2c. Neste caso usa-se HCIO^ 1 N para manter o pH.

o

Rendimentos 7,θ g, amorfo, = -4,0 (C = 1, em metanol).

c) Z-Trp~Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH^.HCIO^

Adicionam-se a 0°C e com agitação 2,2 g de DCC a uma solução de 3,4 g (10 mmol) de Z-Trp-OH, 6,92 g de H-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂.2 HCIO^, 1,35 g de HOBt e 1,3 ml de N-etilmorfolina em 40 ml de dimetilformamida. Segue-se então um procedimento análogo ao descrito no exemplo la. Rendimentos 7,3 g, amorfo, = -17,5° (C = 1, em metanol).

d) H-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂.2 HCIO^

Submetem-se a hidrogenação catalítica 7 g de Z-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH₂ de modo análogo ao descrito no exemplo 2c. Mantém-se o pH com HCIO^ IN.

o

Rendimentos 6,2 g, amorfo, /J7_p = -12,6 (C = 1, em metanol).

⁶) Z-Arg(Zp)-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH^.HCIO^

Adicionam-se a 0°C e com agitação 220 mg de DCC a uma solução de 577 mg (1 mmol) de Z-Arg(Z₂)-0H, 679 mg de

H-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH^·2 HCIO^, I63 mg de HOObt e 0,13 ml de N-etilmorfolina em 10 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo 25c. Neste caso a maior parte da substância precipita a partir da fase de n-pentanol.

o

Rendimento: 1,16 g, = -15,2 (c = 1, em ácido acético aquoso a 80 $).

f) Tri-acetato de H-Arg-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH„

Submete-se a hidrogenação catalítica 3 g de Z·· -Arg(Z₂)-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH^.HCIO^ de modo análogo ao de;^ crito no exemplo lb.

Rendimento: 2,33 g·

Purificam-se 960 mg da substância acima obtida por cromatografia de modo análogo ao descrito no exemplo 25 d.

·“ 22 o

Rendimento: 540 mg, = -14,2 (C = 1, em água).

Exemplo 27?

H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OH

a) Fmoc-Lys(Z)-Phe-OtBu

Adicionam-se com agitação a 0°C 2,2 g de DCC a uma solução de 5>O2 g (10 mmol) de Fmoc-Lys(Z)-OH, 2,6 g de H-Phe-OtBu.HCl, 1,35 g de HOBt e 1,3 ml de N-etilmorfolina em 50 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo la.

*•22

Rendimento: 6,2 g, w

QO $).

b) Fmoc-Lys(z)-Phe-OH

6,7° (C = 1, em ácido acético a

Dissolvem-se 2,95 g de Fmoc-Lys-(z)-Phe-OtBu em 30 ml de unia solução aquosa de ácido trifluoroacético a 90 ¢. Deixa-se uma hora em repouso à temperatura ambiente e concentra-se à secura sob vácuo. Tritura-se o resíduo com étev dietílico e separa-se por filtração.

Rendimento: 2,32 g, /ό<7^θ = -2,3° (C = 1, ^ein metanol).

c) Fmoc-Lys(Z)-Phe-Lys(Z)-Phe-Otbu

Adicionam-se 4,7 ml de dietilamina a uma solução de 3,17 g de Fmoc-Lys(z)-Phe-OtBu em 20 ml de dimetilformamida. Deixa-se em repouso durante 10 minutos à temperatura ambiente e concentra-se à secura sob alto vácuo. Dissolve-se o resíduo em diclorometano, separa-se dos insolúveis por filtração e purifica-se por cromatografia em gel de sílica. Em primeiro lugar elui-se com diclorometano (arrastamento das impurezas lipófilas). Em seguida elui-se a substância com uma mistura de diclorometano/metanol na proporção 95 : 5·

Rendimento: 2,3 g.

o

Adicionam-se a 0 C 99θ mg de DCC a uma solução de 2,3 g de H-Lys(Z)-Phe-OtBu acima obtido, 1,58 g (4,5 mmol) de Fmoc-Leu-OH e 607 mg de HOBt em 20 ml de dimetilformamida. Segue-se num procedimento análogo ao exemplo la.

Rendimento: 2,7 g

Adicionam-se 3,42 ml de dimetilamina a uma solução de 2,7 g de Fmoc-Leu-Lys(z)-Phe-OtBu acima obtido em 2C ml de dimetilforrnamida e segue-se um procedimento análogo ao anterior.

Rendimento: 1,95 g

Adicionam-se a 0°C e com agitação 720 mg de DCC a uma solução de 1,95 g de H-Leu-Lys(z)-Phe-0tBu acima obti do, 2,2 g de Fmoc-Lys(z)-Phe~OH e 533 mg de HOObt em 20 ml de dimetilformamida.

para-se o precipitado por filtração à secura. Tritura-se o resíduo com e separa-se por filtração.

e concentra-se o filtrado solução saturada de NaHCO

Rendimento: 3,14 g, P.F. 178-182°C, /à(7p² = -20,8° (C = 1, em ácido acético a 90 %).

d) Tri-acetato de H-Lys-pHe-Leu-Lys-Phe-OtBu

Submeta-se a hidrogenação catalítica 1 g de

Fmoc-Lys(z)-Phe-OtBu de modo análogo ao descrito no exemplo lb

Rendimento: 750 mg.

A substância acima obtida é purificada por cromatografia de modo análogo ao descrito no exemplo 25d.

o

Rendimento: 45θ mg, ⁼ -25,5 (C = 1, em agua).

e) Di-acetato de H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OH

Dissolvem-se 2,1 g de Fmoc-Lys(z)-Phe-Leu-Lys(z)-Phe-OtBu em 21 ml de ácido trifluoroacético aquoso a 90 $. Deixa-se em repouso 1 hora à temperatura ambiente e concentra-se à secura sob vácuo. Tritura-se o resíduo com éter dietílico e separar-se por filtração.

Rendimento: 1,99 g.

Submete-se a hidrogenação catalítica 1 g de Fmoc-Lys(z)-Phe-Leu-Lys(z)-Phe-OH acima obtido de modo análogo ao descrito no exemplo lb.

Rendimento: 630 mg.

Para purificação submete-se a cromatografia 63θ mg da substância acima obtida de modo análogo ao descrito no exemplo 25 d.

- 46 Rendimento:

45θ mg,

Exemplo 28:

Tri-acetato de H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-NH

Adicionam-se a 0°C e com agitação 182 mg de DCC a uma solução de 97θ mg (θ,θ3 mmol) de Fmoc-Lys(Z)-Phe-Leu-Lys(z)-Phe-OH (ver exemplo 27θ) e 126 mg de HOBt.NH^ em 10 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo 27c (parte inferior).

Rendimento: 950 mg.

SubmeteB-se a hidrogenação catalítica os 95θ mg de Fmoc-Lys(z)-Phe-Leu-Lys(z)-Phe-NHg acima obtidos de modo análogo ao descrito no exemplo lb.

Rendimento: 635 mg.

Purificam-se por cromatografia os 635 mg de tri-acetato de H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-NH_O acima obtidos de modo análogo ao descrito no exemplo 25d.

_w p o _n

Rendimento: 298 mg, = -21,4° (C = 1, em água).

Exemplo 29 i

H-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OH

a) Fmoc-Val-Arg-OH

Adicionam-se à temperatura ambiente e com agitação 14,55 g de Fmoc-Val-OObt a uma suspensão de 5,23 g (30 mmol) de arginina, 4,89 g de HOObt e 5,4 g de perclorato de piridínio. Deixa-se em agitação até se obter solução completa e deixa-se em repouso durante a noite. Concentra-se a solução à secura e trata-se o resíduo com água. Ajusta-se a pH 7 com solução de NaHC0_. Separa-se por filtração o precipitado for* 3 mado e lava-se com água.

Rendimentos 4-70 mg, /Ã7^ = -16,6° (C = 1

b) Fmoc-Val-Arg-Ile-OBzl

Adicionam-se a 0°C e com agitação 660 mg de DCC a uma solução de 1,49 g (3 mmol) de Fmoc-Val-Arg-OH, 1,18 g de tosilato de H-Ile-0bzl e 489 mg de HOObt em 15 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo 2b.

Rendimento: 2,2 g, /5(7^ = -30,0° (C = 1, em metanol).

c) Fmoc-Arg-Ile-OtBu

Adicionam-se a 0°C e com agitação 2,2 g de DCC a uma solução de 2,23 g de H-Ile-OtBu.HCl, 4g (10 mmol) de Fmoc-Arg-OH e 1,35 g de HOBt em 80 ml de dimetilformamida«

Rendimento: 5,65, = -13,8° (C = 1, em metanol).

d) Fmoc-Arg-Ile-OH

Dissolvem-se 15,8 g de Fmoc-Arg-Ile-OtBu em 15O ml de ácido trifluoroacético aquoso a 90%, Deixa-se em repouso durante 1 hora à temperatura ambiente e concentra-se à secura. Tritura-se o resíduo duas vezes com éter dietílico, separando-se o éter por decantação apés cada operação. Trata-se o resíduo com água e ajusta-se o pH com solução saturada dt

NaHCO^.

Separa-se o resíduo por filtração e seca-se.

Rendimento: 9,8 g, £7^ = -5,3° (C = 1, em metanol).

e) H-Val-Arg-Ile-OBzl

Adicionam-se 31,5 ml de dietilamina a uma solução de 21 g (3O mmol) de Fmoc-Val-Arg-Ile-OBzl em 200 ml de dimetilformamida. Deixa-se em repouso durante 10 minutos à temperatura ambiente e concentra-se à secura sob vácuo. Tritura-se o resíduo com éter e separa-se por filtração.

ο

Adicionam-se a 0 C e com agitação 3,3 g d® OCO a uma solução de 7,4 g (15 mmol) de Fmoc-Arg-Ile-OH, 7,15 g de H-Val-Arg-Ile-OBzl e 2,4^1 g de HOObt em 150 ml de dimetilforina·· mida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo 2. Tritura-se o resíduo seco com acetato de etilo, separa-se por filtração e seca-se.

Rendimento: 14,1 g, &7f = -33,5° (C = 1, em metanol).

g) Tri-acetato de H-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OBzl·

Adicionam-se 3,15 ml de dimetilamina a uma solução de 2,9 g (3 mmol) de Fmoc-Arg-Ile-Val-Ile-OBzl em 20 ml de dimetilformamida e deixa-se em repouso durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida concentra-se à secura s®b vácuo e tritura-se o resíduo com éter dietilíco.

Rendimento: 2,7 g

Purificam-se 800 mg da substância acima obtidíi por cromatografia, de modo análogo ao descrito no exemplo 25do

2^4· o

Rendimento: 725 mg, /47 = -27,7 (C = 1, em ácido acético

D a 90$).

h) Di-acetato de H-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OH

Submetem-se a hidrogenação catalítica 1,5 g de A-Arg-Ile-Val-Arg~Ile-OBzl (antes da purificação) de modo análogo ao descrito no exemplo lb.

Rendimento: 1,3 g·

Purificam-se 700 mg da substância acima por cromatografia, de modo análogo ao descrito no exemplo 25d.

Rendimento: 405 mg, /Á7^~ = -47,1° (c = 1, em água).

Exemplo 30:

Di-acetato de ciclo-(P-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile)

Submetem-se a cromatografia através de tuna resina perrautadora de iões fracamente básica a forma de perclorato 1,4 g de di-acetato de II-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile (ver exemplo 12 c). Liofiliza-se o eluído.

Rendimento: 1,343 g de di-perclorato de H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH.

Adiciona-se lentamente gota a gota à temperatura ambiente e com agitação uma solução de 67O mg (1 mniol) do di-perclorato de H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-IlerOH, acima obtido 27O mg de HOBt e 0,13 ml de N-etilmorfolina em 100 ml de dimetilformamida a uma solução de 440 mg de DCC em 50 ml de dimetih formamida. Deixa-se em repouso durante a noite à temperatura ambiente.

No dia seguinte adicionam-se mais

300

e deixa-se durante 2 dias em repouso à temperatura ambiente. Em seguida concentra-se à secura sob vácuo. Partilha-se o residuo entre acetato de etilo e ácido acético aquoso diluído. Liofil:.

za-se a fase aquosa.

Rendimento: 665 mg.

Purifica-se a substância acima obtida por cromatografia através de resina permatadora de iães fracamente básica sob a forma de acetato. Como eluente usa-se àgua. Reunem-se as fracçães do eluído contendo o peptídeo e liofiliza-se.

Rendimento! 5^8 mg, £7

Exemplo 31:

H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu

a) Fmoc-Arg-Pro-OtBu.HClO^

Juntam-se a 0°C e com agitação 3,3 g de DCC a uma solução de 5,95 g (15 mmol) de Fmoc-Arg-OH, 2,57 g de H-Pro-OtBu, 2,02 g de HOBt e 2,7 g de perclorato de piridínio em 30 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo la. Tritura-se o resíduo com éter dietílico e separa-se por filtração.

Rendimento: 9,4 g.

Para caracterização dissolvem-se em ácido acético aquoso a 40 $ 750 mg da substância acima obtida e purificam-se por cromatografia através de uma resina permutadora de iães fracamente básica sob a forma de acetato. Concentra-se o eluído e liofiliza-se.

Rendimento: 69O mg de (P.M. 609,7), = acetato de Fmoc-Arg-Pro-OtBu,

-44,2° (C = 1, em metanol),

substância de acordo com análise de ácidos aminados: 93

b) Fmoc-Arg-Pro-OH

Dissolvem-se 8,5 g de Fmoc-Arg-Pro-OtBu.HCIO^ em 85 ml de ácido trifluoroacético aquoso a 90 $. Deixa-se em repouso durante 1 hora à temperatura ambiente e concentra-se à secura sob vácuo. Tritura-se o resíduo com éter dietílico e separa-se por filtração.

Rendiemnto: 7,9 g.

Suspendem-se 7,16 g da substância acima obtida em 100 ml de água. Ajusta-se o pH a NaHCO^. Deixa-se em repouso durante precipitado por filtração e seca-se com solução saturada dias a 4°C, separa-se de o sobre P„0

5 em vácuo.

Q /» Λ

Rendimento: 6,15 g, 47Γ = -32,2 (C =1, aquoso a 60 $).

em ácido acético

c) Z-Arg()-Phe-OtBu

Adicionam-se a 0°C e com agitação 6,6 g de DCG a uma solução de 17,3 g (30 mmol) de Z-Arg(Z^)-OH, 7,73 g de H-Phe-OtBu.HCl, 4,9 g de HOObt e 3,9 ml de N-etilmorfolina em 70 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo la. Tritura-se o resíduo cora éter dietílico, separa-se por filtração e seca-se sob vácuo.

Rendimento: 19 g, /17^ = -0,5° (C = 1, em ácido acético aquoso a 80 $).

d) H-Arg-Phe-0tBu.HC10^

Dissolvem-se 18,6 g de Z-Arg(Zg)-Phe-OtBu em 200 ml de dimetilacetamida e submetem-se a hidrogenação catalítica na presença de Pd/C. Durante a hidrogenação mantém-se o pH constante no valor 5 por adição de HCIO^ 1 N por meio de um Autotritator. Após terminada a hidrogenação separa-se o catalisador por filtração e concentra-se o filtrado à secura. Dissolve-se o resíduc err áfia, ciar J f 5 ca -se por filtração e liofiliza-se.

Rendimento: 21,1 g de um óleo.

Tritura-se o óleo duas vezes com éter dietílico, separa-se o éter por decantação e seca-se o resíduo oleoso sob vácuo.

Rendimento: 18,5 g (133 %, contém ainda algum solvente).

e) Acetato de Fmoc-Cys(SBu)-Arg-Phe-OtBu

Adicionam-se a 0°C e com agitação 2,2 g de DGC a uma solução de 4,31 g (10 mmol) de Fmoc-Cys(SBu)-OH, 7,47 g de H-Arg-Phe-0tBu.2 HCIO^ (substância oleosa acima obtida), 1,35 g d® HOBt e 1,3 ml de N-etilmorfolina em 40 ml de dimetilformamida. Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo la. Tritura-se o resíduo com éter dietílico e seca-se.

Rendimento: 8 g.

Dissolve-se 1,3 g da substância acima obtida em 30 ml de ácido acético a 55 % e submete-se a cromatografia através duma resina permutadora de iões fracamente básica sob forma de acetato. Elui-se com ácido acético a 55 %· Concentra-se o eluído à secura, retoma-se em água e liofiliza-se.

Rendimento: 1,05 g, /tf7^ = -45,5° (C = 1, em metanol), conteúdo na base peptídica por análise de ácidos aminados: 79 f ) H-Cys-(StBu)-Arg-Phe-OtBu.HCIO^

Adicionam-se à temperatura ambiente 21 ml (200 mmol) de dietilamina a uma solução de 17,84 g (20 mmol) de Fmoc-Cys(StBu)-Arg-Phe-0tBu.HC10^ (substância do exemplo 31e antes da purificação) em 100 ml de dimetilformamida. Agita-se durante 10 minutos à temperatura ambiente e concentra-se à secura sob vácuo.

Tritura-se o resíduo duas vezes com éter dietílico e decanta-se. Seca-se o resíduo oleoso sob alto vácuo.

Rendimento: 14,6 g.

g) Di-acetato de Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-Ãrg-Phe-OtBu

— Adicionam-se a 0°C 2,2 g de DCC a uma solução de 4,94 g (10 mmol) de Fmoc-Arg-Pro-OH, 5,7 g (10 mmol) de H-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu.HCIO^, 163 mg de HOObt e 1, 8 g de perclorato de piridínio em 100 ml de dimetilformamida_o Segue-se um procedimento análogo ao descrito no exemplo la. Tritura-se o resíduo com éter dietílico.

Rendimento: 8,7 g·

Purifica-se 5θθ mg da substância acima obtida por cromatografia de modo análogo ao descrito no exemplo 25d.

o

Rendimento: 3^1 mg, = -60,8 (c = 1, água), conteúdo em | base peptídica por análise de ácidos aminadis: 77

h) Tri-acetato de H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu

Adicionam-se 3,3² ml de dietilamina a uma solução de 3,3 g de Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu (substância antes da purificação) em 20 ml de dimetiléformamida<> Apés 10 minutos à temperatura ambiente, concentra-se à secura sob vácuo. Tritura-se o resíduo com éter e separa-se por filtração.

Rendimento: 2,7 g.

Purifica-se a substância de modo análogo ao descrito no exemplo 25d.

** 22 o z

Rendimento: 1,23 g, /&7_ρ = -42,4 (C = 1, água), contendo em base peptídica por análise de ácidos aminados: 72 %»

Exemplo 32:

Ciclo-(P-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val)

a) Fmoc-P-Leu-Arg-OH

Adicionam-se à temperatura, ambiente e com • agitação 9,97 g de Fmoc-P-Leu-OObt a uma suspensão de 3,^θ g

- 54 3.

se noit (20 mmol) de arginina, 3,26 g de HOObt e 3,6 g de perclorato de piridínio em 100 ml de dimetilformamida. Agita-se ate obter dissolução completa e deixa-se em repouso durante a Em seguida concentra-se à secura e trata-se o resíduo com água

Ajusta-se a pH 7 por adição de solução de NaHCO^. Separa-se o precipitado por filtração e concentra-se à secura.

,--,20 o /

Rendimento: 10,2 g, ./ff/p = +29»2 (C =1, em metanol).

b) Fmoc-D-Leu-Arg-D-Val OBzl

Adicionam-se a 0°C e com agitação 3,3 g de DCC a uma solução de 7,64 g (15 mmol) de Fmoc-D-Leu-Arg-OH, 5,7 g de tosilato de H-D-Val-OBzl e 2,45 g de HOObt em 75 ml de dimetilformamida. Procede-se como habitualmente e partilha-se o resíduo entre acetato de etilo e solução saturada de

NaHCO^. Extrai-se ainda a água, seca-se sobre Na^SO^ solução em acetato de etilo e concentra-se à secura.

com

Rendimento: 8,2 g, /ί(7ρθ = +11,2° (c = 1, em metanol)₀

c) H-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl

Adicionam-se 12,05 ml de dietilamina a uma solução de 8,04 g (11,5 mmol) de Fmoc-D-Leu-Àrg-D-Val-OBzl em 60 ml de dimetilformamida. Deixa-se em repouso durante 15 minutos à temperatura ambiente e concentra-se à secura. Partilha-se o resíduo entre n-pentanol e solução de NaHCO^o Concentra-se a fase de pentanol à secura e tritura-se o resíduo com eter dietílico.

“ 20 o

Rendimento: 3,8 g, w = -3,0° (C = 1, em metanol).

d) Di-acetato de Z-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl

Adiciona-se a 0°C e com agitação 1,65 g de DCC a uma solução de 3,16 g de Z-D-Arg-Ile-OH (ver exemplo 9b) 3,57 g de H-D-Leu-Arg-B-Val-OBzl, 1,23 g de HOObt e 1,35 g de perclorato de piridínio em 75 ml de dimetilformamida. Trata-se como habitualmente e partilh.a-se o resíduo entre n-pentanol e solução de NaHCO^ de meia saturação. Concentra-se à secura a fase de n-pentanol, tritura-se o resíduo com acetato de etilo e separa-se por filtração. Partilha-se a substância obtida entre acetato de etilo e ácido acético aquoso a 10 % em 5 andares de extracção em contra-corrente. 0 composto fica na fase do ácido acético. Purifica-se e concentra-se à secura. Tritura-se o resíduo com éter dietílico.

o

Rendimento: 4,55 g, = +11,4 (c ss 1, em metanol).

e) Di-acetato de H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OH

Submetem-se a hidrogenação catalítica 4,4 g de Z-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D~Val-OBzl de modo análogo ao descrito no exemplo lb.

Rendimento: 3,7 g·

Purificam-se por cromatografia 7θθ mg do composto obtido acima de modo análogo ao descrito no exemplo 25d.

2.2 o

Rendimento: 35θ mg, /4(7^ = -10,6 (C = 1, em água).

f) Di-acetato de ciclo-(D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val)

Transformam-se 2 g do di-acetato de H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val (substância antes da purificação) no respectivo di-perclorato de modo análogo ao descrito no exemplo 3θ·

Rendimento: 1,7θ g.

Ciclizam-se 656 mg (1 mmol) da substância acima obtida de modo análogo ao descrito no exemplo 3θ·

Rendimento: 683 mg.

Purifica-se a substância acima obtida por cromatografia de modo análogo ao descrito no exemplo 25d.

- 56 4

A* abreviatura* utilizada* para repreaei tar o* acido* aminados corresponde» ao código d« trS* letra* habitualment* usado em química d* peptídeoe, tal como descrito, por exemplo, em fiurop. J. Bloohe·. 138« 9(1984)· ^presentam-*e e· seguida algumas outra* abreviatura* utilizadas:

Boc t-butiloxicarbonilo

Bsl benzilo

Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

Me metllo

Ac aoetilo

DCC diciolo-hexiloarbodiimlda

FAB boafoardeamento por átomo* rápido* (Fast Atom

Bombardment)

HOBt 1-hidroxlbenzotriazol

M pico molecular

Z benziloxicarbonilo

MSu eueelnlmido

Top 2,4,5-triclorofenilo

HOObt 3-hidroxi-4-oxo-3,4-di-hidro-benz o/37-1«2,3-triazina

DCHA dioiolo-hexllamina

Claims (1)

1. R E I V I N D I C A ç Õ E a

   - 1· Processo para a preparação de um composto da fórmula I

   R representa hidrogénio ou um radical da fórmula

   R - /“â 7 -NH-; z- _/ n ⁷

   R³ significa um grupo amino, guanidino, alquil-(C -C )-amino **· J ou dialquil-(C^-C^)-amino;

   significa um número inteiro de 1 a 6;

   , 4 5 representa um radical da formula -NII-CR R -C0-;

   significa hidrogénio, alcanoílo-(C^-Cg), aroílo-( eventualmente substituído na fracção aromática por um ou por dois substituíntes escolhidos de entre o grupo alquilo -(C^-C^), alcoxi-(C^-C^), alquiltio-(C^-C^), halogénio, carbamoílo, alcoxi-(C^-C^)-carVamoílo e/ou sulfamoílo ou mono-substituído por metilenodioxi, ou significa cicloalquil~(C^-C?)-alcanoílo-(C^-C^) ou aril-(C^-C^^)-alcanoílo-(q-c/, sendo nos radicais em que R ó diferente de hidrogénio num grupo -CH^- eventualmente substituído por -0- ou por -S-j é 0 ou 1;

   4 5 f

   R e R são iguais ou diferentes e significam hidrogénio, alquilo-( C^-C^) ou aralcanoílo-(C^-C^);

   representa Pro, D-Pro ou um radical da fórmula significa alquilo-(C-^-Cg) eventualmente mono-substituído por hidroxilo, alcoxi-(C^-C^), alcoxi-(C^-C^)-carbonilo, carbamoílo ou por R-NH, em que R tem o significado anterioi mente definido com a condição de que não pode ser hidrogénio, ou significa aralquilo-(, que pode ser eventualmente ..uo-.ub.tltuíd» ». parie aiomátlca por alooxi-^-Cg), ou significa 3-indolilmetilo;

   N representa Pro, D-Pro ou um radical da fórmula -NH-CH(R⁷)-C0-;

   R' significa alquilo-ÍC^-Cg), que pode ser eventualmente substituído por hidroxilo, alcoxi-ÍC^-Cg), alcóxi-(C^-CgJ-.carbonilo, carbamoílo ou por R-NH, em que R tem o significado anteriormente definido com a condição de que não pode ser hidrogénio, ou significa aralquilo-ÍC^-C^^), que pode ser eventualraente aono-substituído na parte aromática por alcoxi-(C^-C^), ou significa 3-indolilmetilo|

   B² representa um radical da fórmula III

   R·³

   I (™)

   - NH-CH - CO .

   na qual R e m tem os significados anteriormente definidos;

   c

   R representa um radical da fórmula

   -NH⁹-CH(R⁸)-(CO)p-R¹;

   tem o significado de R em que radicais CH, CH^ ou CH^ existentes em posição β em relação a -NH- podem ser even tualmente monohidroxilados, e significa hidrogénio; ou

   R⁹ em conjunto significam ou -Z^H₂__7^;

   é 0 ou 1;

   no caso de ser p = O, representa hidrogénio, hidroxilo ou alcoxi-(C^-Cg);

   no caso de ser p = 1, representa OK ou NR R , e e R¹¹ são iguais ou diferentes e significam alquilo-(C--0,)

   10 11 θ ou aralquilo-( C^-C^); ou NR R representa pirrolidina, piperidino ou morfolino; ou p é = 1,

   R e R significam em conjunto uma ligação e os restantes radicais têm os significados anteriormente definidos.

   bem como dos respectivos sais fisiológicamente aceitáveis, caracterizado por se promover o acoplamento de um fragmento com um grupo carboxílico terminal ou de um derivado reactivo deste com um fragmento com um grupo amina livre, eventualmen te por se eliminar um grupo protector ou grupos protectores temporariamente utilizados ou utilizados para protecção de outros grupos funcionais e por se transformar eventualmente o composto resultante num seu sal fisiológicamente aceitável.

   - 2i Processo de acordo com a reivindicação

   1, caracterizado por se obter um composto da fórmula I na qual

   L representa um resíduo de isoleucina, valina, treonina, serina, 0-alquil-(C^-Cp)-treonina, 0-alquil-(C^-Cp)-serina, leucina, prolina ou o éster de í|A“^alQ^uil~( C^-Cp) ou o ésteres t-butilo de ácido glutâmico ou de ácido aspártico;

   N representa um resíduo de valina, isoleucina, leucina, feni' lalanina, triptofano, tirosina eventualffiente O-alquilada-(Cj-C^), glutamina, asparagina, glutamato de j^-alquilo-(Cj-C^) ou aspartato de A-alquil-(C^-C^) ou f*-acil-lisina, e

   6o B significa Arg, D-Arg, Lys ou D-Lys_} bem como os respectivos sais fisiológicamente aceitáveis.

   _ o a _ n * Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por se obter um composto da fórmula I na qual! p é igual a 1 e R e R significam em conjunto uma ligação, bem como os respectivos sais fisiologicamente aceitáveis.

   - 4« Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por se obter um composto no qual R e R não representam em conjunto uma ligação, bem como os respectivos sais fisiológicamente aceitáveis.

   Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um composto da fórmula I quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em conjunto com uma substância veicular e eventualmente outros excipientes e adjuvantes numa forma de apresentação apropriada.

   a requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã, em 11 de Junho de 1986, sob ο η⁹. P 36 19 633.9·