FI88401C

FI88401C - Foerfarande foer framstaellning av peptider med inverkan pao diures och natriures

Info

Publication number: FI88401C
Application number: FI872576A
Authority: FI
Inventors: Rolf Geiger; Wolfgang Koenig; Gerhard Breipohl; Jochen Knolle; Max Hropot
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-06-11
Filing date: 1987-06-09
Publication date: 1993-05-10
Also published as: AU7408887A; DE3619633A1; DE3783657D1; EP0249169B1; GR3007609T3; FI872576A0; DK296487D0; AU601436B2; FI88401B; DK296487A; ATE84795T1; ZA874163B; US5011825A; PT85053B; IL82813A0; CA1317068C; IL82813A; JPS62292798A; EP0249169A2; PT85053A

Description

1 88401

Menetelmä dlureesiin ja natrlureeslln vaikuttavien peptidien valmistamiseksi ANF-analogipeptidejä sarjasta ANF( 1-33), ANF(2-33), 5 ANF(3-33) ja ANF(8-33) ja menetelmä niiden valmistamiseksi tunnetaan EP-hakemusjulkaisusta 140 731. Välituotteena näiden yhdisteiden synteesissä muodostuu mm. heksapeptidi, Jolla on kaava Boc-Arg-Ile-Asp-Arg-Ile-Gly-OCH3, jonka aminohappojärjestys on muotoa emäksinen - lipofiilinen, neut-10 raali - hapan - emäksinen - lipofiilinen.

Myös suomalaisessa patenttihakemusjulkaisussa 872 959 kuvataan ANF-analogipeptidejä, joilla on kaava Zj-AAe-AAg-AAjQ-AAjj-Ajj-Zj, jossa Z2 on hydrofobinen tähde tai peptidi, jossa on hydrofobinen tähde, AAe - AA12 ovat amino-15 happotähteitä tyyppiä emäksinen, neutraali (AAe) - neutraali (AA9) - hapan (AA10) - emäksinen, neutraali (AAn) -neutraali (AAl2) ja Z2 on amiini tai peptiditähde.

Keksintö koskee menetelmää uusien peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava 20

Rn-L-N-B2-Rc (I) : . jossa R" on ryhmä, jolla on kaava V: 25 R3 [ch2].

R2 - CH - CO - (II) 1 jossa R2 on vety tai ryhmä, jolla on kaava R-[A]n-NH-; R3 on amino, guanidino, C1.3-alkyyliamino tai di-Cl.3-alkyyli-amino; m on kokonaisluku 1 - 6; A merkitsee ryhmää, jolla 2 88401 on kaava -NH-CR4R5-CO-; R on vety tai peptidikemiassa ta vanomainen suojaryhmä, kuten C^g-alkanoyyli, fenyylikarbo-nyyli, naftyylikarbonyyli, fenyyli-Ci.j-alkanoyyli, naftyy-li-Ci.j-alkanoyyli, bifenylyyli-C^-alkanoyyli tai fluore-5 nyyli-Ci.j-alkanoyyli, jolloin kun R ei ole vety, -CH2-ryhmä on mahdollisesti korvattu hapella tai rikillä; n on 0 tai 1; R4 ja R5 ovat samanlaisia tai erilaisia ja merkitsevät vetyä, Cj.j-alkyyliä, fenyyli-C^j-alkanoyyliä tai naftyyli-karbonyyliä; 10 L on isoleusiini-, väliini-, treoniini-, serii- ni-, O-CCj-CgJ-alkyylitreoniini-, 0-((^-0, )-alkyyliserii-ni-, leusiini-, proliini- tai glutamiinihapon tai aspara-giinihapon -(Cj-CgJ-alkyyli-, edullisesti t-butyylieste-ritähde; N on väliini-, isoleusiini-, leusiini-, fenyylia- 15 laniini-, tryptofaani-, mahdollisesti 0-(Cj-C6)-alkyloitu tyrosiini-, glutamiini-, asparagiini-, glutamiinihappo- -(Ci-Cg-alkyyliesteri- tai asparagiinihappo-B-iCj-C^-alkyy-liesteri- tai -asyyli-lysiinitähde; ja B2 on Arg, D-Arg, Lys tai D-Lys; 20 Rc on ryhmä, jolla on kaava -NR9-CH(Re)-(CO)p-R1, jossa R8 on C^-alkyyli, joka on mahdollisesti monosubsti-tuoitu hydroksilla, C^-alkoksilla, C^-alkoksikarbonyy-lillä, karbamoyylillä tai ryhmällä R-NH, jolloin R merkitsee samaa kuin edellä, mutta ei voi olla vety, tai bent- 25 syyli- tai fenetyyliryhmä, jonka aromaattinen osa on mahdollisesti monosubstituoitu Cx.6-alkoksilla, tai indol-3-yylimetyyli, jolloin β-asemassa ryhmään -NH- nähden olevat CH-, CH2- tai CHj-ryhmät ovat mahdollisesti monohydroksy-loituja, ja R9 on vety; tai R8 ja R9 merkitsevät yhdessä ·: 30 ryhmää -[CH2]3- tai -[CH2]4-; p on 0 tai 1; R1 on vety, hyd-roksi tai C^-alkoksi, kun p on 0 tai R1 on OR10 tai 35 3 88401 NR10RU, kun p on 1, ja R10 ja R11 ovat samanlaisia tai erilaisia ja merkitsevät vetyä, Cx.6-alkyyliä, bentsyyliä tai feneyyliä, tai NR^R11 on pyrrolidino, piperidino tai mor-folino; tai p on 1 ja R ja R1 ovat yhdessä sidos ja muut 5 ryhmät merkitsevät samaa kuin edellä, tai niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että pääteasemassa olevan karboksyyliryhmän sisältävä fragmentti tai reaktiivinen johdannainen kytketään vastaavaan fragmenttiin, joka si-10 sältää vapaan aminoryhmän, ja mahdollisesti muiden funktionaalisten ryhmien suojaamiseksi lohkaistaan tilapäisesti liitetty (liitetyt) suojaryhmä(t) ja näin saatu yhdiste muutetaan mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

15 Suoloina tulevat kyseeseen erityisesti epäorgaa nisten tai orgaanisten happojen, kuten esim. HCl:n, HBr:n, H2S04:n, H3P04:n, maleiinihapon, fumaarihapon, sitruunahapon, viinihapon ja etikkahapon kanssa muodostetut suolat. Uusien peptidien kiraalisilla keskuksilla voi kulloinkin 20 olla R-, S- tai R,S-konfiguraatio.

Alkyyli voi olla suoraketjuinen tai haarautunut.

. .·. Vastaava pätee siitä johdettuihin ryhmiin, kuten esim.

;·. alkoksiin, alkyyliaminoon, dialkyyliaminoon ja alkanoyy- : .·. liin.

'] ! 25 Edullisina pidetään sellaisia ryhmiä RN, L, N, B2 ; · ja Rc, jotka on johdettu luonnossa esiintyvistä aminoha- '· " poista (kts. esim. Schröder, Liibke, The Peptides, Volume I, New York, 1955, sivut 137 - 270), niiden antipodeista tai niiden yksinkertaisista metaboliiteista eli aineen-: 30 vaihduntatuotteista.

: : : Keksinnön mukaisesti valmistetut uudet peptidit ovat joko avoinketjuisia tai syklisesti peptidisidoksen (R, Rj = peptidisidos) kautta liittyneitä.

4 88401

Kaavan I mukaisen yhdisteen fragmenteilla, jotka sisältävät pääteasemassa olevan karboksyyliryhmän, on seu-raavat kaavat IVa - ivf: 5 R-OH (IVa) R-A-OH (IVb) R"-OH (IVc) R"-L-OH (IVd) R"-L-OH (IVe) 10 Rn-L-N-B2-0H (IVf)

Kaavan I mukaisen yhdisteen fragmenteilla, jotka sisältävät pääteasemassa olevan aminoryhmän, on seuraavat kaavat Va - Vf: 15 [CH2]m-R3 H-A-NH-CH-CO-L-N-B2-Rc (Va) 20 [CH2]m-R3 H2N-CH-CO-L-N-B2-Rc (Vb) H-L-N-B2-R6 (Vc) : 25 H-N-B2-R6 (Vd) : 30 H-B2-Rc (Ve) H-Rc (Vf) 5 88401

Keksinnön mukainen yhdisteiden synteesi tapahtuu peptidikemian tunnettujen menetelmien mukaisesti, joita on seikkaperäisesti kuvattu esimerkiksi julkaisussa "Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band 15 (Stuttgart, 5 Thieme, 1974)". Peptidejä valmistetaan edullisesti vaiheittain alkaen C-terminaalisesta aminohaposta tai suorittamalla fragmenttikytkentä kaavion 2+3 tai 3+2 mukaisesti. Fragmenttikytkennässä on kiinnitettävä huomiota siihen, että käytetään mahdollisimman "rasemointivapaita" 10 kytkentämenetelmiä. Tässä olevissa esimerkeissä käytettiin fragmenttikytkentään ennen kaikkea DCC/HOObt-menetelmää, joka tähänastisten kokemusten mukaan aikaansai vähäisimmän rasemoitumisen peptidisynteesin aikana. Edelleen tarkoitukseen soveltuvat aktiiviesterimenetelmä, jossa käytetään 15 N-hydroksisukkinimidiä esterikomponenttina, ja propaani- fosfonihappoanhydridin avulla tapahtuva kytkentä sekä seosanhydridimenetelmä, jossa käytetään pivaloyyliklori-dia.

Kaavan I mukaisten syklopeptidien valmistus voi 20 tapahtua esimerkiksi julkaisusta EP-A2-135722 kuvatun menetelmän mukaisesti.

. .·. Kuten seuraavat in vivo -testien tulokset osoit- tavat, keksinnön mukaisesti valmisetut yhdisteet vaikutta-1 vat pysyvästi diureesiin eli virtsan eritykseen, natriu- ; 25 reesiin eli natriumin erittymiseen virtsaan ja kaliuree-siin eli kaliumin erittymiseen virtsaan.

A. Keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien diureettinen eli virtsan eritystä lisäävä vaikutus, nat-riureettinen eli natriumin erittymistä virtsaan lisäävä .'-I 30 vaikutus ja kaliureettinen eli kaliumin erittymistä virt-saan lisäävä vaikutus koejärjestelyn 1. mukaisesti. (Annos . 1 mg/kg rotta, keräyksen kestoaika 90 minuuttia).

6 88401

Virtsa Na* K* (ml · (μπιοί · (pmol · kg'1) kg'1) kg'1) 5 Kontrolli 1,267 65,2 29,5 H-Arg-lle-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH 2,49 249,1 25,9 fenoksiasetyyli-Arg-Ile-Asp(OtBu)- 0,66 117,7 31,7

Arg-Ile-OH

H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol 1,56 155,4 59,4 10 H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Leu-ol 1,55 180,8 64,2 H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Val-NH2 1,95 184,7 89,2 H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-iso- 1,43 131,6 51,3 butyy li amidi H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH2 1,97 225,0 33,0 15 H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2 1,34 159,8 35,4 Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-ol 0,79 118,4 27,8 (1 pg/kg) Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2 1,51 263,2 63,3 H-Arg-Pro-Val-Lys-Val-OH 0,91 155,7 28,2 20 H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH 1,19 74,5 28,4 H-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH 0,95 87,0 44,3 H-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH 2,03 149,8 50,1 H-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH 2,00 211,0 68,3 H-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH 0,67 112,8 57,5 . 25 Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH 1,64 208,6 37,1 Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OMe 1,16 152,5 46,2 syklo-(Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile) 1,58 196,2 57,7 H-Arg-Val-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu 0,28 59,2 21,9 ; 30 Koejärjestely 1:

Rotat nukutettiin annostelemalla intraperitoneaali-sesti 0,1 ml 10-%:ista natriumtiobutabarbitaalia/100 g kehon paino. Ne saivat alkaen 60 min. ennen aineen annostelua NaClta tippainfuusiona, jota jatkettiin kokeen ajan •‘35 (2,5 ml 0,9-%:sta NaCl-liuosta · h'1 · 0,1 kg-1 painokilo).

7 88401

Testiaine annosteltiin suonensisäisenä annoksena 0,5 ml:ssa 0,9-%:ista liuosta/100 g kehon paino.

B. Keksinnön mukaisten peptidien diureettinen, nat-riureettinen ja kaliureettinen vaikutus koejärjestelyn 2. 5 mukaisesti.

(Annos: 1 mg/kg rotta, keräyksen kestoaika 120 min. )

Virtsa Na* K* (ml· (pmol· (pmol· 10 kg'1) kg'1) kg'1)

Kontrolli 0,520 31,5 25,8 Z-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OBzl 0,52 66,9 36,2 Z-D-Arg-lle-Leu-Arg-Ile-OBzl 0,59 86,3 38,1 15 Z-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl 0,48 79,0 43,8 Z-Arg-Ile-Leu-Arg-D-Val-OBzl 0,43 88,6 36,7 H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH 1,13 115,9 49,7 H-Arg-Ile-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH2 1,04 95,6 67,3 c-aminoheksanoyyli-Ile-Asp(OtBu)- 0,82 54,9 38,0 20 Arg-Ile-NH2 Z-Arg-Ile-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH2 0,47 91,5 36,1 Z-D-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OBzl 0,29 48,4 30,1 Z-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OBzl 0,19 37,3 20,4 i . Z-Arg-D-Val-Leu-Arg-D-Val-OBzl 0,27 55,1 38,3 j 25 H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-OH 0,25 30,2 23,7 · H-Lys-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2 0,08 10,6 22,1 H-Arg-D-Val-Leu-Arg-Ile-OH 0,57 83,77 34,9 VV H-D-Arg-D-allo-lle-D-Leu-Arg- 0,87 95,1 35,5

Ile-OH

30 H-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OH 0,78 93,7 40,8 H-D-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-0H 0,28 61,4 33,9 H-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH 0,22 55,3 33,6 ' H-Arg-Ile-Leu-Arg-D-Val-OH 0,56 68,8 38,9 syklo-(Gly-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile) 0,69 65,5 26,6 :'V 35 (0,5 mg/kg) β 88401

Virtsa Na* K" (ml· (pmol· (pmol· kg'1) kg'1) kg'1) 5 H-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OH 0,31 68,4 32,8 Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu 0,44 88,9 37,8 H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu 0,63 136,8 31,5 H-Arg-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH2 0,66 148,7 37,1

Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg- 0,65 143,0 16,5 10 Phe-OtBu H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu 0,32 87,5 11,1 H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OH 0,52 80,2 31,0 H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-NH2 0,25 36,8 16,7 syklo-(D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile) 1,05 128,2 36,6 15 (1 pg/kg)

Koejärjestely 2:

Rotat nukutettiin annostelemalla intraperitoneaali-sesti 0,1 ml 10-%:ista natriumtiobutabarbitaalia/100 g 20 kehon paino. Ne saivat alkaen 60 min ennen aineen annostelua aina aineen annosteluun saakka NaCl:a tippainfuusiona (2,5 ml 0,85-%:ista NaCl-liuosta · h'1 · 0,1 kg'1 painokilo). Aineen annostelun jälkeen tiputusnopeus vähennettiin 1 tunnin ajaksi puoleen (1,25 ml · h'1 · 0,1 kg'1). Tämän i 25 jälkeen tiputusnopeus vähennettiin kokeen päättymiseen saakka vielä kerran puoleen (0,625 ml · h'1 · 0,1 kg'1). Testiaine annosteltiin suonensisäisenä annoksena 0,1 ml:ssa 0,85-%:ista NaCl-liuosta/100 g kehon paino.

Arvoista käy ilmi, että keksinnön mukaisesti val-: 30 mistetut peptidit voivat vaikuttaa sekä diureettisesti eli virtsan eritystä lisäten että myös natriureettisesti eli natriumin eritystä virtsaan lisäten. Monissa esimerkeissä havaitaan kuitenkin ainoastaan natriureesia, johon monasti liittyy jopa antidiureesia. Koska kaliumin eritys ei mo-V 35 nissa tapauksissa kohoa yli kontrollin, voidaan tästä ai- 9 88401 neluokasta kehittää kaliumia elimistössä pidättäviä nat-riureetteja (esim. H-Arg-Pro-Val-Lys-Val-OH), antidiureet-teja, joilla on natriureettinen vaikutus (esim. Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-oli) tai lääkeaineita, joilla on di-5 ureettinen ja natriureettinen vaikutus (esim. H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH tai syklo-(D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile). Mutta myös antidiureetit, joilla on antinatriureettinen vaikutus (esim. H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu) löydettiin tästä aineluokasta (esim. H-Lys-Ile-Asp(OtBu)-Arg-10 Ile-NH2).

Kaavan I mukaisia peptidejä voidaan käyttää lääkeaineina, joilla on säätelevä vaikutus diureesiin, natriu-reesiin tai kaliureeslin ja joita voidaan käyttää neste-ja elektrolyyttitasapainon häiriöissä, näitä peptidejä 15 sisältävissä farmaseuttisissa aineissa, jolloin peptidit saatetaan yhdessä kantaja-aineen ja mahdollisesti muiden lisä- ja apuaineiden kanssa tarkoitukseen soveltuvaan an-nostelumuotoon.

Natriureettisesti ja diureettisesti vaikuttavia 20 peptidejä voidaan käyttää lääkeaineina kohonneessa veren paineessa ja vesipöhössä. Spesifisesti natriureettisesti ; eli natriumin eritystä lisäten vaikuttavia yhdisteitä voi- ;·. daan käyttää iäkkäämmillä hypertoniapotilailla, joiden kohdalla tulee välttää nesteen poistumista elimistöstä.

I 25 Antidiureettisesti vaikuttavat peptidit soveltuvat hyvin käytettäviksi polyuriassa eli normaalia runsaammassa virt-’ san erityksessä tai diabetes insipiduksessa eli vesitys- taudissa.

Peptidejä voidaan annostella yksittäin tai yhdis-30 telmänä parenteraalisesti (ruiskeena laskimoon, ihonalai seen kudokseen ja lihakseen) fysiologisesti hyväksyttävässä väliaineessa. Annosteltava annos on yleensä 1 pg -5 mg/kg.

Parenteraalista annostelua varten aktiiviset yh-• V 35 disteet tai niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat ίο 88401 saatetaan mahdollisesti tarkoitukseen soveltuvien aineiden, kuten liukenemista välittävien aineiden, emulgaatto-rien tai muiden apuaineiden kanssa liuoksiksi, suspensioiksi tai emulsioiksi. Uusissa aktiivisissa yhdisteissä 5 ja vastaavissa fysiologisissa suoloissa käytettävinä liuottimina tulevat kyseeseen esimerkiksi vesi, fysiologiset keittosuolaliuokset tai alkoholit, esim. etanoli, pro-paanidioli tai glyseroli, näiden ohella myös sokeriliuokset, kuten glukoosi- tai mannitoliliuokset, tai myös mai-10 nittujen eri liuottimien seos.

Samoin vaikuttavia aineita voidaan annostella im-plantaatteina, jotka koostuvat esim. polylaktidistä, poly-glykolidista, maito- ja glykolihaposta peräisin olevista kopolymeereista tai poly-3-hydroksivoihaposta, tai nenään 15 annettavina valmisteina. Nenän kautta tapahtuvassa annostelussa annos täytyy kymmenkertaistaa huonomman imeytymisen johdosta. Kelaatin muodostajan, esim. EDTA:n, lisääminen voi vaikuttaa edullisesti imeytymiseen. Edelleen peptidejä voidaan annostella niiden fysiologisesti hyväksyt-20 tävinä suoloina tai metallikomplekseina.

Esimerkki 1

H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-0H

a) Z-Arg(Z2)-Ile-0Bzl

Liuokseen, jossa on 5,76 g Z-Arg(Z2)-OH:ta, 3,93 g . 25 H-Ile-OBzl-tosylaattia ja 1,35 g H0Bt:tä 50 ml:ssa dime-tyyliformamidia lisätään 0 °C:ssa 1,3 ml N-etyylimorfolii-nia ja 2,2 g DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa ja 1 tunti huoneenlämpötilassa. Annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suo-; 30 dos haihdutetaan vakuumissa ja jäännös jaetaan etikkaeste-rin ja veden välillä. Etikkaesterifaasi pestään peräjälkeen kyllästetyllä vesipitoisella NaHC03-liuoksella, KHS04/K2S04-puskurilla ja vedellä. Kuivataan Na2S04:llä ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään eetterin kanssa, imu-35 suodatetaan ja kuivataan.

n 88401

Saanto: 7,45 s, sp. 142 - 144 °C [a]J! - -5,5 " (o - 1, 90-prosenttisessa etikkahapossa).

b) H-Arg-Ile-OH-asetaatti

Suspensioon, jossa on 7,3 g Z-Arg(Z2)-Ile-OBzl:ää 5 220 ml:ssa 90-%:ista etikkahappoa lisätään Pd/hiili-kata- lysaattoria, ja liuoksen läpi johdetaan vetyä. Reaktion päätyttyä katalysaattori imusuodatetaan ja suodos haihdutetaan. Jäännöstä hierretään eetterin kanssa ja imusuoda-tetaan.

10 Saanto: 3,86 g sp. 197 - 200 °C, [a]2D2 = +19,9 ° (c = 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

c) H-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH-asetaatti

Suspensioon, jossa on 3,45 g H-Arg-Ile-OH-asetaat- tia 50 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 1,35 g H0Bt:tä 15 ja 4,2 g Z-Asp(0tBu)-0NSu:ta. Sekoitetaan yhden päivän ajan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan. Jäännös jaetaan 100 ml:n puoliksi kyllästettyä vesipitoista NaHC03-liuosta ja 100 ml:n etikkaesteriä välillä vastavirtaisesti (5 eri vaihetta). Ne fraktiot, jotka sisältävät puhdasta Z-A-20 sp(OtBu)-Arg-lle-OH:ta, haihdutetaan ja liuotetaan 70 ml:aan 90-%:ista etikkahappoa ja hydrataan katalyyttises-. ti, kuten esimerkissä Ib.

Saanto: 2,22 g, amorf., [α]“ = +0,8 ° (c 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

25 d) Z-Ile-Asp (OtBu )-Arg-Ile-0H

Suspensioon, jossa on 8,55 g H-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH-asetaattia 80 ml:ssa dimetyyliformamidia lisätään huo-*-*- neenlämpötliassa 2,22 g H0Bt:tä ja 6,6 g Z-Ile-ONSu:ta.

Sekoitetaan 5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja haihdu-30 tetaan vakuumissa. Jäännös jaetaan puoliksi kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen ja etikkaesterin välillä vastavirtaa käyttäen (5 eri vaihetta). Ne fraktiot, jotka sisältävät puhdasta Z-lle-Asp(OtBu)-Arg-lle-OH:ta, haihdutetaan ja hierretään eetterin kanssa.

’· 35 Saanto: 10,7 g, sp. 177 - 179 °C, [a]” = -30,2 ° (c = 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

12 88401 e) H-Ile-Asp(OtBu)-Arg-lle-OH-asetaatti 10,7 g Z-Ile-Asp(OtBu)-Arg-lle-OH:ta hydrataan katalyyttisestl vastaavasti kuten esimerkissä Ib 150 ml:ssa 90-%:ista etikkahappoa.

5 Saanto: 10,4 g, sp. 107 - 117 °C, [a]22 - -3,5 ° (c - 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

f) z-Arg(Z2)-1le-Asp(OtBu)-Arg-lle-OH

Liuokseen, jossa on 11,4 g H-Ile-Asp(OtBu)-Arg-

Ile-OH-asetaattia ja 2,45 g HOBt:tä 180 ml:ssa dimetyyli-10 formamidia, lisätään 13,6 g Z-Arg( Z2 )-0Tcp: tä. Annetaan reagoida 24 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään etikkaesterln kanssa, imu-suodatetaan ja kuivataan. Lopuksi ainetta hierretään kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen kanssa, imusuoda-15 tetaan, pestään vedellä ja kuivataan P205:llä.

Saanto: 5,75 g, sp. 184 - 186 °C, [a]£2 * -22,5 ° (c = 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

g) H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-OH-diasetaatti 6,34 g Z-Arg( Z2)-Ile-Asp(0tBu)-Arg-Ile-0H:ta hyd- 20 rataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä Ib 120 ml:ssa 90-%:ista etikkahappoa. Saanto: 5,66 g.

Puhdistamista varten aine jaetaan 100 ml:n n-bu-tanolia ja 100 ml:n 10-%:ista etikkahappoa välillä vastavirtaa käyttäen (7 eri vaihetta).

25 Saanto: 4,45 g, amorf., [a]p2 = -32,4 ° (c = 1, vedessä).

Esimerkki 2 H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-oli a) L-isoleusinoli«HOObt (* H-Ile-oli*H00bt) 250 ml:aan -5 °C:seen jäähdytettyä tetrahydrofu-30 raania lisätään sekoittaen 11,4 g LiAlH4:ä. Tähän suspensioon lisätään sekoittaen 45 minuutin sisällä 28,86 g (0,22 moolia) L-isoleusiinia. Lopuksi keitetään 4 tuntia paluujäähdyttäen. Tämän jälkeen jäähdytetään 0 °C:seen, lisätään 250 ml dietyylieetteriä ja tiputetaan hitaasti 35 sekoittaen 50 ml vettä. Sakka imusuodatetaan ja jäännös kiehautetaan kaksi kertaa kulloinkin 150 ml:n metanolia 13 88401 kanssa ja imusuodatetaan kuumana. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan. Jäännös liuotetaan 100 ml:aan abs.etanolia ja lisätään 200 ml eetteriä. Annetaan seistä yön ajan 4 °C:ssa, sakka imusuodatetaan ja suodos haihdutetaan. Tu-5 lokseksi saatava öljy liuotetaan 150 ml:aan metanolia. Tähän lisätään 36 g (0,22 moolia) H00bt:ä ja 200 ml di-etyylieetteriä ja suolan annetaan kiteytyä 4 °C:ssa. Sakka imusuodatetaan ja pestään eetterillä.

Saanto: 44 g sp. 178 - 179 °C, [a]” = +8,8 e (c = 1, meta-10 nolissa).

b) Z-Arg(Z2)-Leu-oli

Liuokseen, jossa on 17,3 g Z-Arg( Z2 )-0H: ta ja 8,4 g H-Ile-oli. H00bt:tä 200 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 6,6 g DCC:tä. Sekoitetaan 2 tuntia 0 15 °C:ssa ja annetaan seistä huoneenlämpötilassa noin 10 tuntia. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan ja jäännöstä hierretään kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen kanssa ja imusuodatetaan, pestään hyvin vedellä ja kuivataan. Puhdistusta varten sekoitetaan 20 huoneenlämpötilassa metanolin kanssa, jäähdytetään, imu- suodatetaan ja kuivataan.

Saanto: 17,4 g, sp. 180 - 182 °C, [a] “ * -4,2 ° (c = 1, dimetyyliformamidissa).

c) H-Arg-Leu-oli-ditosylaatti j 25 Suspensioon, jossa on 13,5 g Z-Arg(Z2)-Leu-olia 350 ml:ssa metanolia, lisätään Pd/hiili-katalysaattoria ja suspension läpi johdetaan vetyä pH 4,5:ssä lisäten 1 M p-tolueenisulfonihappoa (autotitraattori). Hydrauksen aikana aine menee liuokseen. Reaktion päätyttyä (p-tolueeni-. ·: 30 sulfonihappoliuos ei enää liukene) katalysaattori imusuodatetaan ja haihdutetaan. Jäännöstä sekoitetaan veden ____ kanssa. Liukenematon imusuodatetaan ja heitetään pois.

Suodos haihdutetaan ja jäännöstä hierretään eetterin kanssa. Sakka imusuodatetaan ja kuivataan.

. 35 Saanto: 9,95 g, amorfista ainetta, [a]*2 = +1,8 ° (c * 1, metanolissa).

14 88401 d) Z-Asp(OtBu)-Arg-Leu-oli-tosylaatti

Liuokseen, jossa on 8,6 g H-Arg-Leu-oli-ditosy- laattia 100 ml:ssa dimetyyliformamidia lisätään 1,99 ml N-etyylimorfoliinia ja 5,85 g Z-Asp(0tBu)-0NSu:ta. Annetaan 5 seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Liuos haihdutetaan vakuumissa ja jäännös liuotetaan n-pentanoliin. Liuosta ravistellaan kaksi kertaa veden kanssa. Orgaaninen faasi haihdutetaan ja jäännöstä hierretään eetterin kanssa. Sakka imusuodatetaan.

10 Saanto: 9,05 g, amorfista ainetta, [a]p2 * -26,2 ° (c = 1, metanolissa).

e) H-Asp(OtBu)-Arg-Leu-oli-ditosylaatti 7,5 g Z-Asp(OtBu)-Arg-Leu-oli-tosylaattia liuotetaan 150 ml:aan metanolia ja hydrataan katalyyttisesti 15 vastaavasti kuten esimerkissä 2c.

Saanto: 7,47 g, amorfista ainetta, [a]” - -7,4 ° (c = 1, metanolissa).

f) Z-Arg-lle-Asp(OtBu)-Arg-Leu-oli-ditosylaatti

Liuokseen, jossa on 843 mg Z-Arg-Ile-OH:ta, 1,58 g 20 H-Asp(OtBu)-Arg-Leu-oli-ditosylaattia ja 326 mg H00bt:tä 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 440 mg DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunnin ajan 0 °C:ssa Ja 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Yöksi asetetaan 4 °C:seen ja seuraa-vana päivänä sakka imusuodatetaan. Sakka heitetään pois ja 25 suodos haihdutetaan vakuumissa. Jäännös jaetaan 80 ml:n etikkahappoa ja 80 ml:n vettä välillä vastavirtaa käyttäen (5 eri vaihetta). Otsikon yhdistettä sisältävät fraktiot käytetään ja lopuksi kylmäkuivataan.

Saanto: 1,89 g, amorfista ainetta, [a]20 = -29,5 e (c - 1, 30 metanolissa).

g) H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Leu-oli-ditosylaatti liuotetaan 30 ml:aan 90-%:ista etikkahappoa ja hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä Ib. Asetaa-tiksi muuttamista varten jäännöstä sekoitetaan vesipitoi- 35 sessa liuoksessa heikosti emäksisen ioninvaihtajan kanssa is 88401 (asetaattimuodossa). Ioninvaihtaja imusuodatetaan ja suo-dos kylmäkuivataan.

Saanto: 1,04 g, - [α]” = -34,7 ° (c = 1, vedessä). Esimerkki 3 5 H-Arg-Ile-Asp(OtBu]-Arg-Ile-oli

Yhdisteet valmistettiin vastaavasti kuten esimerkissä 2.

a) H-Ile-oli«HOObt

Sp. 178 - 179 °C, [a] o3 = 8,8°(c = 1, metanolissa).

10 b) Z-Arg(Z2)-Ile-oli

Sp. 180 - 182 °C, [a]22 = -4,2 ° (c = 1, dimetyyliformami-dissa).

c) H-Arg-Ile-oli-ditosylaatti Amorfinen aine, [a]^2 = +7,9 ° (c = 1, metanolissa).

15 d) Z-Asp(OtBu)-Arg-Ile-oli-tosylaatti

Amorfinen aine, [a] “ -22,2 ° (c = 1, metanolissa).

e) H-Asp(OtBu)-Arg-Ile-oli-ditosylaatti Amorfinen aine, [α]“ * -4,2 ° (c - 1, metanolissa).

f) Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-oli-ditosylaatti 20 Amorfinen aine, [a]o° * -26,1 ° (c = 1, metanolissa).

g) H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-oli-triasetaatti - ·': Amorfinen aine, [a]” -31,7 ° (c - 1, vedessä).

Esimerkki 4 : .·. H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-isobutyyliamidi . 25 Yhdisteet valmistettiin vastaavasti kuten esi merkissä 2.

a) Z-Arg( Z2)-isobutyyliamidi

Sp. 148 - 149 °C, [a]22 = +7,7 0 (c = 1, dimetyyliformami-dissa).

30 b) H-Arg-isobutyyliamidi-ditosylaatti

Amorfinen aine, [a]22 * +13,3 ° (c = 1, metanolissa).

c) Z-Asp(0tBu)-Arg-isobutyyliamiditosylaatti Amorfinen aine, [a]^3 = -21,0 ° (c = 1, metanolissa).

d) H-Asp(OtBu)-Arg-isobutyyliamidi-ditosylaatti V 35 Amorfinen aine, [a]j;2 = -1,6 ° (c = 1, metanolissa).

16 8 8 401 e) Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-isobutyyliamididitosylaatti

Amorfinen aine, [a]1° = -22,9 ° (c - 1, metanolissa).

f) H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-isobutyyliamiditriase- 5 taatti

Amorfinen aine, [a]£3 = -28,5 ° (c * 1, vedessä).

Esimerkki 5 H-Arg-lle-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2 Yhdisteet valmistettiin vastaavasti kuten esi-10 merkissä 2.

a) Z-Arg(Z2)-lle-NH2

Sp. 178 - 188 °C, [a] o2 = -*-3,5 ° (c = 1, dimetyyliformami-dissa).

b) H-Arg-Ile-NH2-ditosylaatti 15 Amorfinen aine, [a]” = +9,8 ° (c = 1, metanolissa).

c) Z-Asp (OtBu) -Arg-lle-NH2-tosylaatti Amorfinen aine, [α)£3 = -18,0 ° (c = 1, metanolissa).

d) H-Asp (OtBu) - Arg- Ile-NH2-di tosylaatti Amorfinen aine, [α]^2 * -3,3 ° (c 1, metanolissa).

20 e) Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2-ditosylaatti

Amorfinen aine, [a]p° * -26,0 ° (c = 1, metanolissa).

f) H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2-triasetaatti Amorfinen aine, [a]23 = -34,3 ° (c = 1, vedessä).

Esimerkki 6 : 25 H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Val-NH2

Aineet valmistettiin vastaavasti kuten esimerkissä 2.

a) Z-Arg(Z2)-Val-NH2

Sp. 174 - 178 °C, [a]o2 = +4,6 ° (c = 1, dimetyyliformami-: 30 dissa).

b) H-Arg-Val-NH2-ditosylaatti

Amorfinen aine, [a]\2 - +11,8 ° (c « 1, metanolissa).

c) Z-Asp( OtBu] -Arg-Val-NH2-tosylaatti Amorfinen aine, [a]23 -16,5 ° (c * 1, metanolissa).

35 d) H-Asp( OtBu)-Arg-Val-NH2-ditosylaatti

Amorfinen aine, [a]^2 = 2,7 ° (c * 1, metanolissa).

17 8 8 401 e) Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Val-NH2-ditosylaatti Amorfinen aine, [a]20* -24,3 ° (c * 1, metanolissa).

f) H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Val-NH2-triasetaatti Amorfinen aine, [a]” = -36,2 (c * 1, vedessä).

5 Esimerkki 7 H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH2

Aineet valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 2.

a) Z-Arg(Z2)-Tr-NH2 10 Sp. 172 - 174 °C, [a]” = -1,4 ° (c = 1, dimetyyliformami-dissa).

b) H-Arg-Trp-NH2-ditosylaatti

Amorfinen aine, [α]ο2 = +13,5 ° (c = 1, metanolissa).

c) Z - Asp (OtBu )-Arg-Trp-NH2-ditosylaatti 15 Amorfinen aine, [a]“ = -18,2 ° (c = 1, metanolissa).

d) H-Asp (OtBu) -Arg-Trp-NH2-ditosylaatti Amorfinen aine, [a]” = -3,2 ° (c = 1, metanolissa).

e) Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH2-ditosylaatti Amorfinen aine, [a]^0 = -25,0 ° (c - 1, metanolissa).

20 f) H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH2-triasetaatti

Amorfinen aine, [a]j;3 -31,9 ° (c = 1, vedessä).

. Esimerkki 8

H-Arg-Pro-Val-Lys-Val-OH

a) H-Lys(Boc)-Val-OtBu*HCl . 25 Liuokseen, jossa on 4,5 g Z-Lys(Boc)-0H:ta, 2,1 g H-Val-OtBu*HCl:a ja 1,35 g HOBtctä 20 ml:ssa dimetyyli-formamidia lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 1,3 ml N-etyyli-morfoliinia ja 2,2 g DCC:tä. Sekoitetaan tunnin ajan 0 °C:ssa ja lopuksi annetaan seistä yön ajan huoneenlämpöti-: 30 lassa. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan vakuumissa. Jäännös jaetaan etikkaesterin ja veden välillä, etikkaesterifaasi pestään peräjälkeen KHS04/K2S04-puskurilla, kyllästetyllä, vesipitoisella NaHCH3-liuoksella ja vedellä, kuivataan Na2S04:llä ja haih-:·. 35 dutetaan.

.···. Puhdistus: kromatografoidaan silikageelillä CH2Cl2/aseto- is 8 8 401 ni/petrolieetteriseoksessa suhteessa 9:0,5:2.

Saanto: 3,7 g öljyistä jäännöstä.

Edellä oleva aine hydrataan katalyyttisesti (Pd/BaS04) metanolissa pH 4,5:ssä (autotitraattori:1 N me-5 tanolipitoisen HCl:n lisäys). Hydrauksen päätyttyä katalysaattori imusuodatetaan ja suodos haihdutetaan. Jäännös jaetaan n-pentanolin ja vesipitoisen NaCl-liuoksen välillä vastavirtaa käyttäen (5 eri vaihetta). 1. pentanolifrak-tio haihdutetaan ja jäännöstä hierretään eetterin kanssa. 10 Saanto: 1,25 g, sp. 141 - 143 °C, [a]*1 = -1,7 ° (c 1, metanolissa).

b) Z-Pro-Val-OtBu

Liuokseen, jossa on 2,49 g Z-Pro-OH:ta, 2,1 g H-Val-OtBu·HC1:ä ja 1,35 g HOBt:tä 20 ml:ssa dimetyyli-15 formamidia, lisätään 0 °C:ssa 1,3 ml N-etyylimorfoliinia ja 2,2 g DCC:tä. Nyt menetellään kuten esimerkissä 8a. Jäännöstä hierretään petrolieetterin kanssa, imusuodatetaan ja kuivataan.

Saanto: 2,83 g, sp. 110 - 112 °C [a]*1 = -66,6 ° (c = 1, 20 metanolissa).

c) Z-Pro-Val-OH

2,63 g Z-Pro-Val-OtBu:ta liuotetaan 20 ml:aan 90-%:ista trifluorietikkahappoa. Annetaan seistä tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan. Jäännöstä hier-- 25 retään veden kanssa. Sakka imusuodatetaan ja kuivataan P205:llä. Edelleen puhdistamista varten kromatografoidaan silikageelillä CH2Cl2/CH3OH/petrolieetteri/etikkahappo/ve-dessä suhteessa 18:1:2:0,1:0,1.

Saanto: 1,2 g, sp. 131 - 133 °C, [a]*2 = -56,9 ° (c = 1, ’ 30 metanolissa).

d) Z-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-OtBu

Liuokseen, jossa on 1,05 g Z-Pro-Val-OH:ta, 1,3 g H-Lys(Boc)-Val-OtBu‘HCl:ää ja 0,5 g H00bt:tä 5 ml:ssa di- 35 metyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 0,38 ml N-etyylimor foliinia ja 0,66 g DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa ja 19 88401 annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Työskennellään edelleen kuten esimerkissä 8a. Jäännöstä hierretään eetterin kanssa. Sakka imusuodatetaan ja kuivataan. Saanto: 1,45 g, sp. 139 - 141 °C, [a]” = +75,1 ° (c = 1, 5 metanolissa).

e) Η-Pro-Vai-Lys(Boc)-Vai-OtBu·HC1 1,32 g Z-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-OtBu:ta hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä 8a.

Saanto: 1 g, sp. 150 - 157 °C, [a] “ = -52,2 ° (c = 1, meta-10 nolissa).

f) Z-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-OtBu Liuokseen, jossa on 0,89 g H-Pro-Val-Lys(Boc)-

Val-OtBu*HCl:a, 0,81 g Z-Arg(Z2)-0H:ta ja 0,23 g H00bt:tä 10 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 0,18 ml 15 N-etyylimorfoliinia ja 0,31 g DCC:tä ja menetellään kuten esimerkissä 8a. Jäännös kiteytyy hierrettäessä eetterin kanssa.

Saanto: 1,02 g, sp. 86 - 92 °C, [a]33 = -56,3 ° (c = 1, metanolissa).

20 g) H-Arg-Pro-Val-Lys-Val-OH-diasetaatti 0,9 g Z-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-0tBu:ta sus-pendoidaan 90-%:iseen etikkahappoon ja hydrataan katalyyt-tisesti kuten esimerkissä Ib. Eetteriin liukenematon jään-; " nös (0,55 g) liuotetaan 5 ml:aan 90-%:ista trifluorietik- 25 kahappoa. Annetaan seistä 1 tunti huoneenlämpötilassa ja ·. ·; haihdutetaan. Jäännös liuotetaan veteen ja sekoitetaan heikosti emäksisen ioninvaihtajan kanssa (asetaatti-muo-dossa). Ioninvaihtaja imusuodatetaan ja suodos kylmäkuiva-taan.

: 30 Puhdistus: kromatografointi silloitetulla dekstraanigee-. Iillä.

Saanto: 306,3 mg, [a]34 «* +89,5 ° (c = 1, vedessä). Esimerkki 9 H-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH 35 a) Z-D-Arg-Ile-OBzl

Liuokseen, jossa on 9,25 g Z-D-Arg-OH:ta, 11,8 g H-Ile-OBzl-tosylaattia ja 4,05 g H0Bt:tä 150 ml:ssa dime- 20 88 401 tyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 6,6 g DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa ja annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan ja jäännös Jaetaan etikkaesterin ja 5 kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen välillä. Etikka-esterifaasi pestään vedellä, kuivataan Na2S04:llä ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään eetterin kanssa. Dekantoi-daan ja hierretään petrolieetterin kanssa. Sakka imusuodatetaan ja kuivataan.

10 Saanto: 19,5 g, [a] jj5 = -2,7 ° (c = 1, metanolissa).

b) Z-D-Arg-Ile-OH

Liuokseen, jossa on 19 g Z-D-Arg-Ile-OBzl:ää seoksessa, joka koostuu 70 ml:sta dioksaania, 30 ml:sta vettä ja 12 ml:sta metanolia, lisätään 41,8 ml vesipitois-15 ta 1 N NaOH:ta ja annetaan seistä yön ajan huoneenlämpö-tilassa. Seuraavana päivänä neutraloidaan noin 3,3 ml:11a 4 N HCl:ää. Samea liuos imusuodatetaan kirkastavan kerroksen läpi ja suodos haihdutetaan. Jäännös jaetaan 120 ml:n n-pentanolia ja 120 ml:n vettä välillä. Vesipitoista faa-20 siä ravistellaan vielä 4 kertaa n-pentanolin kanssa, n-pentanolifaasit haihdutetaan yhdessä. Jäännöstä hierretään etikkaesterin kanssa ja sakka imusuodatetaan.

Saanto: 8,4 g, [αΐ^2 = +12,3 ° (c = 1, 90 % etikkahapossa).

c) Fmoc-Leu-OObt 25 Liuokseen, jossa on 3,53 g Fmoc-Leu-OH:ta ja 1,63 g H00bt:tä 40 ml:ssa CH2Cl2:ta, lisätään 2,06 g DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa ja annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan ja jäännöstä hierretään kaksi kertaa . 30 petrolieetterin kanssa ja kuivataan korkeavakuumissa. Saanto: 5,2 g amorfista ainetta.

d) Fmoc-Leu-Arg-OH

Seokseen, jossa on 1,75 g arginiinia, 1,63 g H00bt:tä ja 1,79 g pyridiinlperkloraattia 50 ml:ssa di-35 metyyliformamidia, lisätään huoneenlämpötilassa 5 g Fmoc-Leu-OObt :tä. Sekoitetaan 3 tuntia huoneenlämpötilassa ja 2i 88401 annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Kirkas liuos haihdutetaan ja jäännökseen lisätään vettä. Vesipitoisella NaHC03-liuoksella pH saatetaan arvoon 7. Sakka imusuoda-tetaan, pestään vedellä ja kuivataan.

5 Saanto: 4,7 g, sp. 145 - 155 °C (hajoten), [a]*3 -18,5 0 (c * 1, metanolissa).

e) Fmoc-Leu-Arg-Ile-OBzl

Liuokseen, jossa on 2,04 g Fmoc-Leu-Arg-OH:ta, 1,57 g H-Ile-OBzl-tosylaattia ja 0,65 g HOObtttä 20 mlrssa 10 dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 880 mg DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunnin ajan 0 °C:ssa ja annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan ja jäännös jaetaan etikka-esterin ja kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen vä-15 Iillä. Etikkaesterifaasia ravistellaan vielä kaksi kertaa kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen kanssa ja 3 kertaa veden kanssa, kuivataan Na2S04:llä ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään eetterin kanssa ja imusuodatetaan. Saanto: 2,59 g, [a]p4 = -36,4 ° (c = 1, metanolissa).

20 f) Z-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OBzl-diasetaatti

Liuokseen, jossa on 2,18 g Fmoc-Leu-Arg-Ile-0Bzl:ää 15 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 3,25 ml dletyyliamiinia. Sekoitetaan 15 minuuttia huoneenlämpö-tilassa ja haihdutetaan. Jäännös liuotetaan 125 ml:aan n-; 25 pentanolia ja ravistellaan puoliksi konsentroidun, vesipitoisen NaHC03-liuoksen kanssa, n-pentanolifaasi haihdutetaan ja jäännöstä hierretään eetterin kanssa ja imusuo-- datetaan.

Saanto: 1,4 g H-Leu-Arg-Ile-OBzl:ää.

30 Liuokseen, jossa on 421,5 mg Z-D-Arg-Ile-OH:ta, 490,6 mg H-Leu-Arg-Ile-OBzl:ää, 179,5 mg pyridiiniperklo-raattia ja 163 mg H00bt:tä 10 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 220 mg DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa ja annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa.

' 35 Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan ja jäännös liuotetaan 50 ml:aan n-pentanolia. Liuosta 22 88401 ravistellaan 2 kertaa kulloinkin 50 ml:n kanssa puoliksi konsentroitua vesipitoista NaHC03-liuosta ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään etikkahapon kanssa ja imusuodatetaan. Saanto: 865 mg.

5 Puhdistamista varten aine jaetaan vastavirtaa käyt täen 45 ml:n 10-prosenttista vesipitoista etikkahappoa ja 45 ml:n etikkaesteriä välillä. Vesipitoiset faasit 1-4 haihdutetaan ja jäännöstä hierretään eetterin kanssa ja imusuodatetaan.

10 Saanto: 620 mg, amorfista ainetta, [a]|3 = -31,3 ° (c = 1, metanolissa).

g) H-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH-diasetaatti 510 mg Z-D-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OBzl:ää hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä Ib. 15 15 ml:ssa 90-%:ista etikkahappoa.

Saanto: 445 mg [α]ρ* = -66,2 ° (c 1, vedessä).

Esimerkki 10

H-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OH

a) Fmoc-Leu-D-Arg-OH

20 Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9d. Sp. 145 - 155 °C (hajoten), [a]“ = -31,3 0 (c = 1, metanolissa).

b) Fmoc-Leu-D-Arg-Ile-OBzl

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 25 9e. [a] p4 = -9,8 °C (c = 1, metanolissa).

c) Z-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OBzl-diasetaatti Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9f. Amorfinen aine, [a]“ * -18,3 ° (c - 1, metanolissa).

d) H-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OH-diasetaatti . : 30 Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9g. Amorfinen aine, [a]p4 * -14,0 ° (c 1, vedessä). Esimerkki 11 H-Arg-Ile-Leu-Arg-D-Val-OH a) Fmoc-Leu-Arg-D-Val-OBzl 35 Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9e. Amorfinen aine, [a] l* = -18,3 0 (c =* 1, metanolissa).

23 8 8 401 b) Z-Arg-lle-Leu-Arg-D-Val-OBzl-diasetaatti Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9f. Amorfinen aine, [a]“ * -24,2 ° (c = 1, metanolissa).

c) H-Arg-lle-Leu-Arg-D-Val-OH-diasetaatti 5 Ainetta valmistetaan vastaavasti kuin esimerkissä 9g. Amorfinen aine, [a] 20* -37,1 0 (c * 1, metanolissa). Esimerkki 12

H-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OH

a) Fmoc-D-Leu-Arg-OH

10 Ainetta valmistetaan vastaavasti, kuten esimerkissä 9d. Sp. 140 - 150 °C (hajoten), [a]l* = +30,8 ° (c * 1, metanolissa ).

b) Fmoc-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 15 9e. Amorfinen aine, [a] 34 = +11,2 ° (c = 1, metanolissa).

c) Z-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl-diasetaatti Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9f. Amorfinen aine, [a]“ +5,2 ° (c = 1, metanolissa).

d) H-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OH-diasetaatti 20 Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9g. Amorfinen aine, [a]32 +10,6 e (c - 1, vedessä). Esimerkki 13

H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH

a) Fmoc-D-Leu-Arg-Ile-OBzl - 25 Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9e. Amorfinen aine, [a]24 = -5,7 ° (c = 1, metanolissa).

b) Z-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OBzl-diasetaatti : Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9f. Amorfinen aine, [a]p4 » -2,4 ° (c = 1, metanolissa).

- 30 c) H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH-diasetaatti

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9g. Amorfinen aine, [a]p3 = -20,3 ° (c - 1, vedessä). Esimerkki 14 H-D-Arg-D-allo-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH-diasetaatti 35 Puhdistettaessa H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH pyl- väskromatografiaa käyttäen eristettiin fraktio, joka oli 24 88 401 aminohappoanalyysin mukaan H-D-Arg-D-allo-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH. Amorfinen aine, aminohappoanalyysi: D-allo-Ile (0,9), Ile (1,06), Leu (1,03), Arg (1,87).

Esimerkki 15

5 H-D-Arg-ile-Leu-D-Arg-lle-OH

a) Z-D-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OBzl-diasetaatti Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9f. Amorfinen aine, [a]j;4 = -6,9 0 (c = 1, metanolissa).

b) H-D-Arg-Ile-Leu-D-Arg-Ile-OH-diasetaatti 10 Ainetta valmistetaan vastaavasti, kuten esimer kissä 9g. Amorfinen aine, [a] ” = -30,5 ° (c - 1, vedessä). Esimerkki 16

H-Arg-D-Val-Leu-Arg-Ile-OH

a) Z-Arg-D-Val-OBzl 15 Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9a. Amorfinen aine, [a]*5 = +6,2° (c = 1, metanolissa).

b) Z-Arg-D-Val-OH

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9b. [a]p4 = -6,1 ° (c * 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

20 c) Z-Arg-D-Val-Leu-Arg-Ile-OBzl-diasetaatti

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 9f. Amorfinen aine, [a] “ * -30,7 ° (c * 1, metanolissa).

d) H-Arg-D-Val-Leu-Arg-Ile-OH-diasetaatti Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä • 25 9g. Amorfinen aine, [a]J9 = -15,1 ° (c = 1, metanolissa).

Esimerkki 17 H-Arg-Ile-Trp-lle-OH

a) Z-Arg-Ile-OH

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 30 9a ja 9b. [a]\2 * -5,9 ° (c » 1, metanolissa).

b) Z-Arg(Z2)-Ile-0Me

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä la. Sp. 129 - 130 °C.

c) H-Arg-Ile-OMe-ditosylaatti 35 Ainetta valmistetaan hydraamalla katalyyttisesti Z-Arg(Z2)-Ile-OMe vastaavasti kuten esimerkissä 2c.

25 88 401

Amorfinen aine, [a]22 = +8,4 ° (c = 1, metanolissa).

d) Z-Trp-Arg-Ile-OMe-tosylaatti

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 2d. Amorfinen aine, [a]” = -20,6 ° (c * 1, metanolissa).

5 e) H-Trp-Arg-Ile-OMe-ditosylaatti

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 2e. Amorfinen aine, [a]£2 = -4,5 ° (c = 1, metanolissa).

f) Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OMe-ditosylaatti

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 10 2f. Amorfinen aine, [a]” = -27,5 ° (c 1, metanolissa).

g) Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH-tosylaatti

Liuokseen, jossa on 2,7 g Z-Arg-lle-Trp-Arg-Ile-

0Me:a 30 ml:ssa dioksaania, 10 ml:ssa vettä ja 4 ml:ssä metanolia, lisätään sekoittaen pH:sta 13,5 tipoittain ve-15 sipitoista NaOH:ta. Käytettiin yhteensä 5,2 ml 1 N

NaOH:ta. 0,82 ml:lla vesipitoista 1 N p-tolueenisulfoni-happoliuosta saatetaan liuoksen pH arvoon 7,8 ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan n-butanoliin Ja uutetaan 3 kertaa vedellä. Yhdistetyt vesifaasit uutetaan ker-20 ran n-butanolilla. Yhdistetyt n-butanolifaasit haihdutetaan. Jäännös liuotetaan etanoliin ja tiputetaan seokseen, joka koostuu etikkaesteristä ja eetteristä.

Saanto: 1,59 g, [a]j2 * -25,2 ° (c = 1, metanolissa).

h) H-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH-ditosylaatti • 25 Yhdistettä valmistetaan hydraamalla katalyytti- sesti Z-Arg-Ile-Trp-Arg-Ile-OH-tosylaatti vastaavasti kuten esimerkissä 2c. Amorfinen aine, [α]£2 * -10,5 ° (c = 1, metanolissa).

Samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 17 valmis-30 tettiin vielä seuraavia peptidejä: Z-Arg-Ile-Leu-Arg-lle-Ome-ditosylaatti, Z-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH-tosylaatti, H-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH-ditosylaatti Z-Arg-lle-Phe-Arg-Ile-OMe-ditosylaatti 35 Z-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH-tosylaatti H-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH-ditosylaatti 26 8 8 401 Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Ile-OMe-ditosylaatti Z-H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH-tosylaatti H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH-ditosylaatti Z-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OMe-ditosylaatti 5 Z-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH-tosylaatti H-Arg-Ile-D-Ser(tBu)-Arg-Ile-OH-ditosylaatti Aminohappoanalyysi on kulloinkin yhtäpitävä odotettujen arvojen kanssa.

Esimerkki 18 10 Syklo-(Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile)

Liuokseen, jossa on 210 mg H-Arg-Ile-Phe-Arg-Ile-OH-ditosylaattia 3 mlrssa dimetyyliformamidia, lisätään huoneenlämpötilassa 78 mg Boc-Gly-OTcp:tä, 3 mg H0Bt:tä ja 0,026 ml N-etyylimorfoliinia. Sekoitetaan joitakin tunteja 15 huoneenlämpötilassa ja annetaan seistä yön ajan huoneen lämpötilassa. Haihdutetaan vakuumissa ja jäännös jaetaan veden ja etikkaesterin, johon on lisätty vähän etanolia, välillä. Etikkaesterifaasi uutetaan vielä kerran vedellä. Yhdistetyt vesifaasit uutetaan etikkaesterillä. Yhdistetyt 20 vesifaasit haihdutetaan. Jäännös (Boc-Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-

Ile-OH-tosylaatti) liuotetaan 2 ml:aan trifluorietikkahap-poa. Sen jälkeen kun on pidetty 45 min ajan huoneenlämpö-tilassa haihdutetaan ja tislataan edelleen 2 kertaa eetterillä. Jäljelle jää 200 mg hartsia (H-Gly-Arg-Ile-Phe-Arg-25 Ile-OH-tosylaattitrifluoriasetaattia), joka liuotetaan 200 ml:aan dimetyyliformamidia. Siihen lisätään 0,1 ml 50-%:ista etyylimetyylifosfiinihappoanhydridiliuosta CH2Cl2:ssa ja sekoittaen lisätään hitaasti liuos, jossa on 0,16 ml N-etyylimorfoliinia 5 ml:ssa dimetyyliformamidia.

: 30 Sekoitetaan 2,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, lisätään vähän vettä ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan pieneen määrään isopropanolia ja tiputetaan sekoittaen eetteriin.

Saanto: 60 mg FAB-massaspektri osoittaa moolipainoksi odo-35 tetusti 743.

27 88401

Esimerkki 19

Syklo-(Gly-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile)

Vastaavasti kuten esimerkissä 18 valmistetaan H-Arg-Ile-Leu-Arg-Ile-OH-ditosylaatista yhdiste. FAB-mas-5 saspektri osoittaa odotetusti moolipainoksi 708.

Esimerkki 20

H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-OH

a) H-Arg-Leu-OtBu*2HCl

Liuokseen, jossa on 6,7 g H-Leu-OtBu»HClJää ja 10 4,05 g HOBt:tä 50 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään huoneenlämpötilassa 3,9 ml N-etyylimorfoliinia ja 22,7 g Z-Arg( Z2)-0Tcp:tä. 2 tuntia kestäneen reaktion jälkeen seokseen lisätään 300 ml jäävettä. Sakka imusuodatetaan, hierretään kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen kans-15 sa, imusuodatetaan uudelleen ja pestään vedellä ja kuivataan.

Saanto: 27,4 g Z-Arg(Z2)-Leu-0tBu:ta. Edellä saatu aine hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä 8a. Saanto: 11,6 g, [e]” * -4,0 ° (c = 1, metanolissa).

20 b) H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-OH-diasetaatti

Liuokseen, jossa on 3,27 g Z-Arg(Z2)-Leu-Gln-OH:ta 1,66 g H-Arg-Leu-0tBu*2HCl:ää, 652 mg HOObt:tä 50 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 0,52 ml N-etyylimor-foliinia ja 880 mg DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunnin ajan 0 25 °C:ssa ja 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Sakka imusuodatetaan. Suodoksesta seostetaan peptidi puoliksi kyllästetyllä, V vesipitoisella NaHCOj-liuoksella. Sakka (Z-Arg( Z2 )-Leu-Gln-

Arg-Leu-OtBu) imusuodatetaan ja pestään vedellä ja kuiva-30 taan.

Edellä saatu aine hydrataan katalyyttisesti 90-%:isessa etikkahapossa vastaavasti kuten esimerkissä Ib.

Saanto: 3,7 g H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-OtBu-triasetaattia.

‘ " 35 300 mg H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-OtBu-triasetaattia liuotetaan 3 ml:aan 90-%:ista trifluorietikkahappoa. Anne- 28 8 8 401 taan seistä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan veteen ja sekoitetaan heikosti emäksisen ioninvaihtajan kanssa (asetaatti-muodossa), kunnes pH on noin 4. Ioninvaihtaja imusuoda-5 tetaan ja suodos kylmäkuivataan.

Saanto: 258,8 mg, [a]33 = -28,9 ° (c 1, vedessä).

Esimerkki 21

H-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-OH

a) Z-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu 10 H-Arg-Pro-OtBu-ditosylaatti valmistetaan vastaavas ti kuten esimerkissä 20a ja esimerkissä 2c.

Liuokseen, jossa on 3,4 g H-Arg-Pro-OtBu-ditosy-laattia, 1,9 g Z-Tyr(tBu)-0H:ta ja 0,69 g HOBtrtä 15 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 0,66 ml N-15 etyylimorfoliinia ja 1,12 g DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa ja lopuksi asetetaan yön ajaksi huoneenlämpötilaan. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan ja jäännös jaetaan etikkaesterin ja kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen välillä. Etikkaesterifaasia ra-20 vistellaan vielä kerran kyllästetyn, vesipitoisen NaHC03-liuoksen kanssa ja kerran veden kanssa, kuivataan Na2S04:llä ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään petroli-eetterin kanssa ja imusuodatetaan.

Saanto: 3,35 g, sp. 115 - 125 °C (hajoten), [a]„4 -: 25 -35,8 0 (c = 1, metanolissa).

b) H-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu-ditosylaatti

Ainetta valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 2c. Sp. 105 - 110 °C (hajoten), [a]*4 - -20,7 ° (c - 1, metanolissa) .

30 c) Z-Arg( Z2 )-Val-0tBu

Liuokseen, jossa on 5,77 g Z-Arg(Z2)-0H:ta, 2,1 g H-Val-OtBu-HCl:ää ja 1,63 g H00bt:tä 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 1,3 ml N-etyylimorfoliinia ja 2,2 g DCC:tä. Lopuksi menetellään kuten esimerkissä la. . 35 Saanto: 4,55 g, sp. 103 - 105 °C, [a] l* - +9,2 ° (c - 1, metanolissa).

29 88 401

d) Z-Arg(Z2)-Val-OH

4,5 g Z-Arg(Z2)-Val-OtBu:ta liuotetaan noin 45 ml:aan 90-%:ista trifluorietikkahappoa. Annetaan seistä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan. Jäännöstä 5 hierretään eetterin kanssa ja imusuodatetaan.

Saanto: 3,58 g, sp. 142 - 144 °C, [a]“ = + 1,1 ° (c = 1, metanolissa).

e) Z-Arg( Z2)-Val-Tyr( tBu)-Arg-Pro-OtBu

Liuokseen, jossa on 2,8 g H-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu- 10 ditosylaattia, 2,1 g Z-Arg(Z2)-Val-OH:ta ja 0,5 g HOObt:tä 10 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 0,4 ml N-etyylimorfoliinia ja 0,68 g DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunnin ajan 0 °C:ssa ja annetaan seistä yön ajan huoneenlämpötilassa. Sakka imusuodatetaan ja heitetään pois. Suodos 15 haihdutetaan vakuumissa. Jäännös jaetaan etikkaesterin ja veden välillä. Tällöin saostuu aine, joka imusuodatetaan. Tätä ainetta hierretään kaksi kertaa kyllästetyn, vesipitoisen NaHCOj-liuoksen kanssa ja kerran veden kanssa ja imusuodatetaan kulloinkin. Aine kiteytetään uudelleen 20 etikkaesteristä.

Saanto: 2,6 g, sp. 141 - 147 °C, [a]“ = -41,8 ° (c - 1, metanolissa).

f) H-Arg-Val-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu-triasetaatti 2,4 g Z-Arg( Z2)-Val-Tyr( tBu)-Arg-Pro-OtBu: ta hyd- : 25 rataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä Ib.

Saanto dekstraanigeelillä tapahtuneen puhdistuksen jälkeen: 1,172 g, [α]“ * -39,2 ° (c - 1, vedessä).

g) H-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-OH-diasetaatti . . 670 mg H-Arg-Val-Tyr(tBu)-Arg-Pro-OtBu-triasetaat- ; 30 tia liuotetaan seokseen, joka koostuu 10 ml:sta 90-%:ista trifluorietikkahappoa ja 1 ml:sta etyylimerkaptaania. An-·:·*: netaan seistä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja haih dutetaan vakuumissa. Jäännös jaetaan veden ja -butyylime-tyylieetterin välillä. Vesipitoista faasia sekoitetaan ; 35 heikosti emäksisen ioninvaihtajan kanssa (asetaattimuodos-sa), kunnes pH on 3,5 - 4,0. Ioninvaihtaja imusuodatetaan 30 88 401 ja suodos kylmäkuivataan. Saanto dekstraanigeelillä tapahtuneen puhdistuksen jälkeen 310 mg. Aminohappoanalyysi osoitti lasketut arvot.

Esimerkki 22 5 H-Lys-Ile-Asp( OtBu) -Arg-Ile-NH2-ditosylaatti a) Z-Lys(Z)-lle-0Me 29,8 g Z-Lys(Z)-0H»DCHA:ta ja 9,08 g H-lle-OMe· HCl:ää liuotetaan DMF:ään ja 15 min kuluttua imusuodate-taan erilleen saostuneesta DCHA«HC1:stä. Suodokseen lisä-10 tään 10,1 g HOBtrtä ja 0 eC:ssa 10,8 g DCCrtä. Annetaan reagoida 1 tunnin ajan 0 °C:ssa ja edelleen 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten liuotin poistetaan tislaamalla. Jäännös liuotetaan etikkahappoon, suodatetaan erilleen ureasta ja suodosta ravistellaan peräjälkeen vesipi-15 toisen NaHC03- ja NaCl-liuoksen kanssa. Sen jälkeen kun on kuivattu MgS04:llä, haihdutetaan orgaaninen faasi ja jäännös kiteytetään uudelleen etikkaesteri/heksaaniseoksesta. Saanto: 25,1 g, sp. 103 - 105 °C, [a] p° * -13,8 ° (c * 1, MeOH).

20 b) Z-Lys(Z)-Ile-0H

23,3 g Z-Lys(Z)-Ile-0Me:a liuotetaan 150 ml:aan metanolia ja sekoittaen lisätään 50 ml 2 N vesipitoista NaOH:ta. Täydellisen reaktion jälkeen liuotin poistetaan tislaamalla, jäännös liuotetaan veteen ja uutetaan etikka-: 25 esterillä. Vesifaasi saatetaan jäähdyttäen pH-arvoon 2-3 ja uutetaan etikkaesterillä. Orgaaninen faasi pestään vedellä, kuivataan MgS04:llä ja liuottimen poistamisen jälkeen saatu jäännös kiteytetään uudelleen etikkaesteri/di-isopropyylieetteriseoksesta.

30 Saanto: 17,5 g, sp. 110 - 112 °C (hajoten), [a]p° = +2,4 ° (c - 1, DMF).

c) Z-Lys(Z)-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2 Valmistus tapahtuu vastaavasti kuten esimerkissä 2f, esimerkkien 226 ja 5d mukaisista yhdisteistä. Amorfi-35 nen aine, jolla on oikea FAB-massaspektri (967, M + H).

3i 88401 d) H-Lys-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2-ditosylaatti Valmistus tapahtuu vastaavasti kuten esimerkissä 2c esimerkin 22c yhdisteestä. Amorfinen aine, jolla on oikea FAB-massaspektri (699, M + H). [a]„° = -23,4 ° (c = 1, 5 MeOH).

Esimerkki 23 H-> -aminoheksanoyyli-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2-dito-sylaatti

Valmistus tapahtuu vastaavasti, kuten esimerkissä 10 22.

a) Z-ε-aminoheksanoyyli-Ile-OMe öljymäinen siirappi, [a]p° * -6,9 ° (c = 1, MeOH).

b) Z-ε-aminoheksanoyyli-Ile-OH

Sulamispiste 73 - 75 °C, (hajoten), [a]*° - +5,1 ° (c = 1, 15 DMF).

c) Z- ε-aminoheksanoyyli-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2 Amorfinen aine, jolla on oikea FAB-massaspektri (819, M + H).

d) H-t -aminoheksanoyyli-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Ile-NH2- 20 ditosylaatti

Amorfinen aine, jolla on oikea FAB-massaspektri (684, M + :Λ: H) [a] p° * -20,6 ° (c = 1, MeOH).

: ·.. Esimerkki 24 H-Arg-Ile-Glu( OtBu)-Arg-Ile-NH2-ditosylaattiasetaat- : 25 tJ·

Valmistus vastaavasti kuten esimerkissä 2. a) Z-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH2-tosylaattia valmistettiin vastaavasti kuten esimerkissä 2d. Amorfinen aine, jolla on oikea NMR-spektri.

30 b) H-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH2-ditosylaatti

Valmistus tapahtuu hydraamalla katalyyttisesti • ;--f vastaavasti kuten esimerkissä 2c. Näin saadun amorfisen ____ aineen annettiin heti reagoida edelleen.

c) Z-Arg-Ile-Glu(OtBu)-Arg-lle-NH2-tosylaatti-- 35 asetaatti 32 8 8 401

Valmistus tapahtuu vastaavasti kuten esimerkissä 2f esimerkin 24b yhdisteestä ja Z-Arg-Ile-OH:sta. Lopuksi tapahtuva puhdistus suoritetaan pylväskromatografoimalla silikageelillä käyttäen CH2Cl2/Me0H/H20/Ac0H-seosta 5 (20:7:2:2). Amorfinen aine, jolla on oikea FAB-massaspekt- ri (876, M + H) [all0· -23,9 ° (c = 1, MeOH).

d) H-Arg-Ile-Glu(OtBu)-Arg-Ile-NH2-distosylaatti-asetaatti

Valmistus tapahtuu hydraamalla katalyyttisesti vas-10 taavasti kuten esimerkissä 2c. Amorfinen aine, jolla on oikea FAB-massaspektri (741, M + H), [a]p° * -15,3 ° (c = 1,05; MeOH).

Esimerkki 25 H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu 15 a) Z-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu-tosylaatti

Liuokseen, jossa on 4,43 g Z-Ser(tBu)-OH:ta (15 mmol), 10,03 g H-Arg-Pro-OtBu-ditosylaattia ja 2,02 g HOBt:tä 40 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 3,3 g DCC:tä. Seosta käsitellään edelleen vas-20 taavasti kuten esimerkissä la.

Saanto 9,8 g, amorf. [a] = -49,5 ° (c » 1, metanolissa).

b) H-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu-ditosylaatti 9,2 g Z-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu-tosylaattia hydra-taan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä 2c.

; 25 Saanto 8,85 g, amorf. [a] 1° = -40,8 ° (c = 1, vedessä).

c) Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu-diasetaatti

Suspensioon, jossa on 4,21 g Z-Arg-Ile-OH:ta (10 mmol), 8,15 g H-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu-ditosylaattia ja 1,63 g HOObtrtä 50 ml:ssa dimetyyliformamidia lisätään 0 30 °C:ssa sekoittaen 2,2 g DCC:tä. Sekoitetaan 1 tunnin ajan 0 °C:ssa ja 2 tuntia huoneenlämpötilassa, annetaan seistä yön ajan ja seuraavana päivänä sakka imusuodatetaan. Suo-dos haihdutetaan ja jäännös jaetaan n-pentanolin ja puoliksi konsentroidun NaHC03-liuoksen välillä. Pentanolifaasi ; 35 haihdutetaan ja jäännöstä hierretään etikkaesterin kanssa. Saanto 11 g.

33 88 401

Edellä saatu aine liuotetaan vesipitoiseen etik-kahappoon ja kromatografoidaan asetaattimuodossa olevaa, heikosti emäksistä ionlnvaihtajaa käyttäen. Peptidiä sisältävä eluaatti yhdistetään Ja kylmäkuivataan. Saanto 5 8,75 g.

500 mg edellä saatua ainetta kromatografoidaan si-likageelillä puhdistamista varten. Tällöin eluoidaan seoksella, Joka koostuu 1560 ml:sta n-butanolia, 181 ml:sta etikkahappoa ja 550 mlrsta vettä.

10 Saanto 251 mg, [a]“ = -68,1 ° (c = 1, vedessä).

d) H-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu-triasetaatti 4,4 g Z-Arg-Ile-Ser(tBu)-Arg-Pro-OtBu-diasetaattia (raaka-ainetta) liuotetaan noin 60 ml:aan 90-%:ista etikkahappoa ja hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten 15 esimerkissä Ib. Saanto 4,25 g.

1 g edellä saatua ainetta kromatografoidaan sili- kageelillä. Tällöin eluoidaan seoksella, joka koostuu 450 mlrsta metyleenikloridia, 200 ml:sta metanolia, 150 ml:sta metyyliglykolia, 100 mlrsta vettä ja 5 g:sta ammoniumase-20 taattia, jolloin seoksen pH saatetaan jääetikalla arvoon 6.

Saanto 560 mg, amorf. [a]*0 * -53,6 ° (c = 1, vedessä).

Esimerkki 26 H-Arg-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH2 : 25 a) Z-Arg( Z2)-Phe-NH2*disykloheksyyliurea

Liuokseen, jossa on 8,65 g (15 mmol) Z-Arg(Z2)-OH:ta, 3,01 g H-Phe-NH2»HCl:ää, 2,45 g HOObtrtä ja 1,95 ml N-etyylimorfoliinia 30 mlrssa dimetyyliformamidia, lisä-. . tään 0 °C:ssa sekoittaen 3,3 g DCCrtä. Sekoitetaan 1 tunti 30 0 °C:ssa ja sitten annetaan seistä huoneenlämpötilassa.

Seuraavana päivänä seos on jähmettynyt. Seosta sekoitetaan *:·: puoliksi konsentroidun NaHC03-liuoksen kanssa, imusuodate- — taan Ja pestään KHS04-liuoksella ja vedellä.

Saanto 13,9 g (aine sisältää vielä suunnilleen ekvimolaa-35 risissa määrissä disykloheksyyliureaa), [a]1° = -2,3 ° (c * 1, 80-%:isessa etikkahapossa).

34 8 8 4 01 b) H-Asp( OtBu) -Arg-Phe-NH2 · 2HC104 13,5 g Z-Arg( Z2)-Phe-NH2*disykloheksyyliureaa sus-pendoidaan 200 ml:aan dlmetyyliasetamidia ja hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä 2c. Tällöin 5 titrataan 1 N HC104:llä. Jäännös sekoitetaan veteen. Imu-suodatetaan erilleen liukenemattomista aineosista ja suo-dos kylmäkuivataan. Tulokseksi saatavaa öljyä hierretään 2 kertaa dietyylieetterin kanssa ja 2 kertaa etikkaesterin kanssa ja kulloinkin dekantoidaan. Jäännös kuivataan kor-10 keavakuumissa. Saanto 9,5 g öljyä.

Liuokseen, joka koostuu 9,5 g:sta edellä saatua öljyä, 5,9 g:sta Z-Asp(OtBu)-OH:ta, 2,48 g:sta HOBt:tä ja 2,37 ml:sta N-etyylimorfoliinia 50 ml:ssa dimetyyliform-amidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 4 g DCC:tä. Edelleen-15 työskentely tapahtuu vastaavasti kuten esimerkissä la. Jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa ja imusuoda-tetaan. Saanto 9,00 g.

8,7 g edellä saatua ainetta [Z-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH2 ·HC104: ää] hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten 20 esimerkissä 2c. Tällöin titrataan 1 N HC104:llä. Saanto 7,6 g, amorf. [a]o° * -4,0 ° (c = 1, metanolissa).

c) Z-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH2*HC104

Liuokseen, jossa on 3,4 g (10 mmol) Z-Trp-0H:ta, 6,92 g H-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH2·2HC104:ää, 1,35 g HOBt:tä : 25 ja 1,3 ml N-etyylimorfoliinia 40 ml:ssa dimetyyliformami-dia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 2,2 g DCC:tä. Työskennellään edelleen vastaavasti kuten esimerkissä la.

Saanto 7,3 g, amorf. [0]“ * -17,5 0 (c » 1, metanolissa).

d) H-Trp-Asp( OtBu ) -Arg-Phe-NH2 · 2HC104 30 7 g Z-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH2: ta hydrataan kata lyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä 2c. Tällöin titrataan 1 N HC104:llä.

Saanto 6,2 g, amorf. [a]*0 = -12,6 0 (c * 1, metanolista).

e) Z-Arg( Z2)-Trp-Asp (OtBu)-Arg-Phe-NH2*HC104 35 Liuokseen, jossa on 577 mg (1 mmol) Z-Arg(Z2)-0H:ta, 879 mg H-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH2*2HC104:ää, 163 mg 35 8 8 401 HOObt:tä ja 0,13 ml N-etyylimorfoliinia 10 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 220 mg DCC:tä. Työskennellään edelleen vastaavasti kuten esimerkissä 25c. Tällöin aine saostuu suurimmaksi osaksi n-pen-5 tanolifaasista.

Saanto 1,16 g, [a]^0 = -15,2 ° (c - 1, 80-%:isessa vesipitoisessa etikkahapossa).

f ) H-Arg-Trp-Asp( OtBu) -Arg-Phe-NH2-triasetaatti 3 g Z-Arg( Z2) -Trp-Asp( OtBu) -Arg-Phe-NH2 · HC104: ää 10 hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä

Ib. Saanto 2,33 g.

960 mg edellä saatua ainetta puhdistetaan kroma-tografisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

Saanto 540 mg, [a]^2 = -14,2 ° (c = 1, vedessä).

15 Esimerkki 27

H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OH

a) Fmoc-Lys(Z)-Phe-OtBu

Liuokseen, jossa on 5,02 g (10 mmol) Fmoc-Lys(Z)-OH:ta, 2,6 g H-Phe-OtBu*HCl:ää, 1,35 g HOBt:tä ja 1,3 ml 20 N-etyylimorfoliinia 50 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisä tään sekoittaen 0 °C:ssa 2,2 g DCC:tä. Käsitellään edelleen vastaavasti kuten esimerkissä la.

Saanto 6,2 g, [a]l2 = -6,7 ° (c = 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

·.: 25 b) Fmoc-Lys( Z )-Phe-0H

2,95 g Fmoc-Lys(Z)-Phe-OtBu:ta liuotetaan 30 ml:aan 90-%:ista vesipitoista trifluorietikkahappoa. Annetaan seistä huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja haihdutetaan . . vakuumissa. Jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa ' 30 ja imusuodatetaan.

Saanto 2,32 g, [a]jj0 = -2,3 ° (c = 1, metanolissa).

*"·: c) Fmoc-Lys(Z)-Phe-Lys(Z)-Phe-OtBu

Liuokseen, jossa on 3,17 g Fmoc-Lys(Z)-Phe-OtBu:ta 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 4,7 ml dietyyli-35 amiinia. Annetaan seistä 10 min ajan huoneenlämpötilassa 36 88401 ja haihdutetaan korkeavakuumissa. Jäännös liuotetaan mety-leenikloridiin, suodatetaan liukenemattomista aineosista erilleen ja kromatografoidaan silikageelillä. Ensiksi eluoidaan metyleenikloridilla (lipofiilisen epäpuhtauden 5 erottaminen). Sitten aine eluoidaan metyleenikloridi/meta-noli-seokselle suhteessa 95:5. Saanto 2,3 g.

Liuokseen, jossa on 2,3 g edellä saatua H-Lys(Z)-Phe-OtBu:ta, 1,58 g (4,5 mmol) Fmoc-Leu-OH:ta ja 607 mg HOBt:tä 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 10 990 mg DCC:tä. Käsitellään edelleen vastaavasti kuten esi merkissä la. Saanto 2,7 g.

Liuokseen, jossa on 2,7 g edellä saatua Fmoc-Leu-Lys(Z)-Phe-0tBu:ta 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 3,42 ml dietyyliamiinia ja edelleenkäsittely tapahtuu vas-15 taavasti kuten edellä. Saanto 1,95 g.

Liuokseen, jossa on 1,95 g edellä saatua H-Leu-Lys(Z)-Phe-0tBu:ta, 2,2 g Fmoc-Lys(Z)-Phe-OH:ta ja 533 mg H00bt:tä 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa ja sekoittaen 720 mg DCC:tä. Annetaan seistä kuten taval-20 lisesti, sakka imusuodatetaan ja suodos haihdutetaan. Jäännöstä hierretään kyllästetyn NaHC03-liuoksen kanssa ja imusuodatetaan.

Saanto 3,14 g, sp. 178 - 182 °C » -20,8 e (c = 1, 90-%:isessa etikkahapossa).

25 d) H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OtBu-triasetaatti 1 g Fmoc-Lys(Z)-Phe-Leu-Lys(Z)-Phe-OtBu:ta hydra-taan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä Ib. Saanto 750 mg.

Edellä saatu aine pundistetaan kromatografisesti 30 vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

Saanto 450 mg, [α]£3 = -25,5 ° (c = 1, vedessä), e) H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OH-diasetaatti 2,1 g Fmoc-Lys(Z)-Phe-Leu-Lys(Z)-Phe-0tBu:ta liuotetaan 21 ml:aan 90-%:ista vesipitoista trifluorietikka-35 happoa. Annetaan seistä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 37 3 8 401 ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännöstä hierretään dietyyli-eetterin kanssa ja imusuodatetaan. Saanto 1,99 g.

1 g edellä saatua Fmoc-Lys(Z)-Phe-Leu-Lys(Z)-Phe-OH:ta hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimer-5 kissä Ib. Saanto 630 mg.

Puhdistusta varten edellä saatu 630 mg puhdistetaan kromatografisesti vastaavasti, kuten esimerkissä 25d. Saanto 458 ml [α]“ = “9,7 ° (c = 1, vedessä).

Esimerkki 28 10 H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-NH2-triasetaatti

Liuokseen, jossa on 970 mg (0,83 mmol) Fmoc-Lys(Z)-Phe-Leu-Lys(Z)-Phe-0H:ta (katso esimerkki 27e) ja 126 mg H0Bt*NH3:a 10 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 182 mg DCC:tä. Edelleen käsittely tapahtuu vas-15 taavasti kuten esimerkissä 27c. Saanto 950 mg.

950 mg edellä saatua Fmoc-Lys(Z)-Phe-Leu-Lys(Z)-Phe-NH2:ta hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä Ib. Saanto 635 mg.

635 mg edellä saatua H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-NH2-tri-20 asetaattia puhdistetaan kromatografisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

Saanto 298 mg, [a]£3 - -21,4 ° (c = 1, vedessä).

‘ · Esimerkki 29

H-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OH ·.; 25 a) Fmoc-Val-Arg-OH

Suspensioon, jossa on 5,23 g (30 mmol) arginiinia, 4,89 g HOObtitä ja 5,4 g pyridiiniperkloraattia, lisätään huoneenlämpötilassa sekoittaen 14,55 g Fmoc-Val-OObt:tä.

. . Sekoitetaan, kunnes kaikki on liuennut ja annetaan seis- ; ' 30 tä yön ajan. Liuos haihdutetaan ja jäännökseen lisätään vettä. pH saatetaan NaHC03-liuoksella arvoon 7. Muodostuva sakka imusuodatetaan ja pestään vedellä.

Saanto 470 mg, [a]31 = -16,6 ° (c = 1, metanolissa).

b) Fmoc-Val-Arg-Ile-OBzl - - 35 Liuokseen, jossa on 1,49 g (3 mmol) Fmoc-Val-Arg- OH: ta, 1,18 g H-lle-OBzl-tosylaattia ja 489 mg HOObtitä 15 38 8 8 401 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa ja sekoittaen 660 mg DCC:tä. Edelleenkäsittely tapahtuu kuten esimerkissä 2b.

Saanto 2,2 g, [a]“ * -30,0 ° (c = 1, metanolissa).

5 c) Fmoc-Arg-Ile-OtBu

Liuokseen, jossa on 2,23 g H-Ile-OtBu*HCl:ää, 4 g (10 mmol) Fmoc-Arg-OH:ta ja 1,35 g HOBt:tä 80 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 2,2 g DCC:tä. Edelleenkäsittely tapahtuu kuten esimerkissä 2b. 10 Saanto 5,65 g, [a]^ * -13,8 ° (c = 1, metanolissa).

d) Fmoc-Arg-Ile-OH

15,8 g Fmoc-Arg-Ile-OtBu:ta liuotetaan 150 mlraan 90-%:ista vesipitoista trifluorietikkahappoa. Annetaan seistä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan. 15 Jäännös hierretään 2 kertaa dietyylieetterin kanssa, jolloin eetteri dekantoidaan kulloinkin. Jäännökseen lisätään vettä ja pH säädetään kyllästetyllä NaHC03-liuoksel-la. Sakka imusuodatetaan ja kuivataan.

Saanto 9,8 g, [a]*1 = -5,3 ° (c - 1, metanolissa).

20 e) H-Val-Arg-Ile-OBzl

Liuokseen, jossa on 21 g (30 mmol) Fmoc-Val-Arg-lle-OBzl:ää 200 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 31,5 ml dietyyliamiinia. Annetaan seistä 10 min ajan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännöstä hierre-25 tään dietyylieetterin kanssa ja imusuodatetaan.

Saanto 13,85 g, [aljj1 = -27,2 ° (c * 1, metanolissa).

f) Fmoc-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OBzl Liuokseen, jossa on 7,4 g (15 mmol) Fmoc-Arg-lle-0H:ta, 7,15 g H-Val-Arg-Ile-OBzl:ää ja 2,44 g HOObt:tä 150 30 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 3,3 g DCC:tä. Edelleenkäsittely tapahtuu vastaavasti kuten esimerkissä 2b. Kuivattua jäännöstä hierretään etikkaeste-rin kanssa, imusuodatetaan ja kuivataan.

Saanto 14,1 g, [a]^1 = -33,5 ° (c * 1, metanolissa).

35 39 8 8 401 g) H-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OBzl-triasetaatti

Liuokseen, jossa on 2,9 g (3 nunol) Fmoc-Arg-Ile-

Val-Arg-Ile-OBzl:ää 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 3,15 ml dietyyliamiinia ja annetaan seistä 10 min 5 ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen haihdutetaan va-kuumissa ja jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa. Saanto 2,7 g.

800 mg edellä saatua ainetta puhdistetaan kroma-tografisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

10 Saanto 725 mg, [a]” = -27,7 ° (c - 1, 90-%:isessa etikka-hapossa.

h) H-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OH-diasetaatti 1,5 g H-Arg-Ile-Val-Arg-Ile-OBzl:ää (raaka-ainetta) hydrataan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä 15 Ib. Saanto 1,3 g.

700 mg edellä saatua ainetta puhdistetaan kromato-grafisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

Saanto 405 mg, [a]” * -47,1 ° (c = 1, vedessä).

Esimerkki 30 20 Syklo-(D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile)-diasetaatti 1,4 g H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-diasetaattia (kts. esimerkki 13c) kromatografoidaan käyttäen perklo-raattimuodossa olevaa, heikosti emäksistä ioninvaihtajaa. Eluaatti kylmäkuivataan.

25 Saanto 1,343 g H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile-OH-diperkloraat- tia.

Liuokseen, jossa on 440 mg DCC:tä 50 ml:ssa dimetyyliformamidia, tiputetaan hitaasti liuos, jossa on . . 670 mg (1 mmol) edellä saatua H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-Ile- 30 OH-diperkloraattia, 270 mg H0Bt:tä ja 0,13 ml N-etyyli-morfoliinia 100 ml:ssa dimetyyliformamidia, huoneenlämpö-tilassa ja sekoittaen. Annetaan seistä yön ajan huoneen-— lämpötilassa. Seuraavana päivänä lisätään vielä kerran 300 mg DCC:tä ja annetaan seistä 2 päivää huoneenlämpötilassa.

35 Tämän jälkeen haihdutetaan vakuumissa. Jäännös jaetaan 40 B8 401 etikkaesterin ja laimennetun vesipitoisen etikkahapon välillä. Vesipitoinen faasi kylmäkuivataan. Saanto 665 mg.

Edellä saatu aine kromatografoidaan käyttäen ase-taattimuodossa olevaa heikosti emäksistä ioninvaihtajaa.

5 Eluointiaineena toimii vesi. Peptidiä sisältävä eluaatti yhdistetään ja kylmäkuivataan.

Saanto 548 mg, [a]” = -16,7 0 (c = 1, vedessä).

Esimerkki 31 H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu 10 a) Fmoc-Arg-Pro-0tBu*HC104

Liuokseen, jossa on 5,95 g (15 mmol) Fmoc-Arg-0H:ta, 2,57 g H-Pro-OtBu:ta, 2,02 g HOBtttä ja 2,7 g py-ridiiniperkloraattia 30 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 3,3 g DCC:tä. Edelleenkäsittely 15 tapahtuu vastaavasti kuten esimerkissä la. Jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa ja imusuodatetaan. Saanto 9,4 g.

Karakterisointia varten liuotetaan 750 mg edellä saatua ainetta 40-%:iseen vesipitoiseen etikkahappoon ja 20 kromatografoidaan käyttäen asetaattimuodossa olevaa, heikosti emäksistä ioninvaihtajaa. Eluaatti haihdutetaan ja kylmäkuivataan. Saanto 690 mg Fmoc-Arg-Pro-OtBu-asetaat-tia, C32H43N507, (moolipaino 609,7), [a]*° = -44,2 ° (c = 1, metanolissa). Aminohappoanalyysin mukaan sisältää ainetta 25 93 %.

b) Fmoc-Arg-Pro-0H

8,5 g Fmoc-Arg-Pro-0tBu*HC104:ää liuotetaan 85 ml:aan 90-%:ista vesipitoista trifluorietikkahappoa. Annetaan seistä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja haihdu-30 tetaan vakuumissa. Jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa ja imusuodatetaan. Saanto 7,9 g.

7,16 g edellä saatua ainetta suspendoidaan 100 ml:aan vettä. pH saatetaan kyllästetyllä NaHC03-liuoksel-la arvoon 6. Annetaan seistä 2 päivää 4 °C:ssa ja sakka 35 imusuodatetaan ja kuivataan P205:lla vakuumissa.

4i 88 401

Saanto 6,15 g, [α]ρ° * -32,2 ° (c - 1, 80-%:isessa vesipitoisessa etikkahapossa).

c) Z-Arg(Z2)-Phe-OtBu

Liuokseen, jossa on 17,3 g (30 mmol) Z-Arg(Z2)-5 OH:ta, 7,73 g H-Phe-OtBu. HCl:ää, 4,9 g HOObtitä ja 3,9 ml N-etyylimorfoliinia 70 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään sekoittaen 0 °C:ssa 6,6 g DCC:tä. Edelleenkäsittely kuten esimerkissä la. Jäännöstä hierretään dietyylieette-rin kanssa, imusuodatetaan ja kuivataan vakuumissa.

10 Saanto 19 g, [a]^0 * -0,5 ° (c * 1, 80-%:isessa vesipitoisessa etikkahapossa).

d) H-Arg-Phe-OtBu·HC104 18,6 g Z-Arg(Z2)-Phe-OtBu:ta liuotetaan 200 ml:aan dimetyyliasetamidia ja hydrataan katalyyttisesti vedyllä 15 käyttäen Pd/C:tä. Autotitraattorin avulla pH pidetään hyd- rauksen aikana arvossa 5 lisäämällä 1 N HC104:ää. Hydrauk-sen päätyttyä katalysaattori imusuodatetaan ja suodos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan veteen, suodatetaan kirkastavan kerroksen läpi ja kylmäkuivataan. Saanto 21,1 g 20 öljyä.

öljyä hierretään kaksi kertaa dietyylieetterin kanssa, dietyylieetteri dekantoidaan ja öljymäinen jäännös kuivataan vakuumissa. Saanto 18,5 g (135 %, sisältää siis vielä liuotinta).

:.::25 e) Fmoc-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu-asetaatti

Liuokseen, jossa on 4,31 g (10 mmol) Fmoc-Cys-(StBu)-OH:ta, 7,74 g H-Arg-Phe-OtBu*2HC104:ää (edellä saatua öljymäistä ainetta), 1,35 g H0Bt:tä ja 1,3 ml N-etyylimorfoliinia 40 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 : 30 °C:ssa sekoittaen 2,2 g DCC:tä. Seosta käsitellään edelleen vastaavasti kuten esimerkissä la. Jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa ja suodatetaan. Saanto 8 g.

1,3 g edellä saatua ainetta liuotetaan 30 ml:aan 55-%:ista etikkahappoa ja kromatografoidaan käyttäen ase-:-..35 taattimuodossa olevaa, heikosti emäksistä ioninvaihtajaa.

42 8 8 401

Eluoidaan 55-prosenttisella etikkahapolla. Eluaatti haihdutetaan, liuotetaan veteen ja kylmäkuivataan.

Saanto 1,05 g [a]” - -45,5 ° (c = 1, metanolissa), sisältää aminohappoanalyysin mukaan peptidiemästä 79 %.

5 f) H-Cys-(StBu)-Arg-Phe-OtBu·HC104

Liuokseen, jossa on 17,84 g (20 mmol) Fmoc-Cys-(StBu)-Arg-Phe-OtBu«HClO^tää (esimerkin 31e raaka-ainetta) 100 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään huoneenlämpötilassa 21 ml (200 mmol) dietyyliamiinia. Sekoitetaan 10 min 10 ajan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännöstä hierretään kaksi kertaa dietyylieetterin kanssa ja dekantoidaan. öljymäinen jäännös kuivataan korkeavakuu-missa. Saanto 14,6 g.

g) Fmoc-Arg-Pro-Cys (StBu)-Arg-Phe-OtBu-diasetaatti 15 Liuokseen, jossa on 4,94 g (10 mmol) Fmoc-Arg-Pro- 0H:ta, 5,7 g (10 mmol) H-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu«HClO^ää, 163 mg H00bt:tä ja 1,8 g pyridiiniperkloraattia 100 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa 2,2 g DCC:tä. Edel-leenkäsittely tapahtuu vastaavasti kuten esimerkissä la. 20 Jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa. Saanto 8,7 g.

500 mg edellä saatua ainetta puhdistetaan kroma-tografisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

Saanto 341 mg, [a]22 = -60,8 ° (c = 1, vedessä), : 25 sisältää aminohappoanalyysin mukaan peptidiemästä 77 %.

h) H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu-triasetaatti Liuokseen, jossa on 3,3 g Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-

Arg-Phe-OtBu:ta (raaka-ainetta) 20 mltssa dimetyyliforra-amidia, lisätään 3,32 ml dietyyliamiinia. Sen jälkeen kun : 30 on pidetty 10 min ajan huoneenlämpötilassa, haihdutetaan vakuumissa. Jäännöstä hierretään eetterin kanssa ja imu-suodatetaan . Saanto 2,7 g.

Aine puhdistetaan kromatografisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d. Saanto 1,23 g [a]£2 = -42,4 ° (c = 35 1, vedessä), sisältää peptidiemästä aminohappoanalyysin mukaan 72 %.

43 8 8 4 01

Esimerkki 32

Syklo-(D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val)

a) Fmoc-D-Leu-Arg-OH

Suspensioon, jossa on 3,48 g (20 mmol) arginiinia, 5 3,26 g H00bt:tä ja 3,6 g pyridiiniperkloraattia 100 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään huoneenlämpötilassa ja sekoittaen 9,97 g Fmoc-D-Leu-OObt:tä. Sekoitetaan, kunnes kaikki on liuennut ja annetaan seistä yön ajan. Tämän jälkeen haihdutetaan ja jäännökseen lisätään vettä. pH sääde-10 tään arvoon 7 lisäämällä NaHC03-liuosta. Sakka imusuodate-taan ja haihdutetaan.

Saanto 10,2 g, [α]£° = +29,2 ° (c = 1, metanolissa) b) Fmoc-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl

Liuokseen, jossa on 7,64 g (15 mmol) Fmoc-D-Arg-15 OH:ta, 5,7 g H-D-Val-OBzl-tosylaattia ja 2,45 g HOObt:tä 75 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 3,3 g DCC:tä. Menetellään tavanomaisella tavalla ja jäännös jaetaan etikkaesterin ja kyllästetyn NaHC03-liuok-sen välillä. Etikkaesterifaasia ravistellaan vielä kerran 20 veden kanssa, kuivataan Na2S04:llä ja haihdutetaan.

Saanto 8,2 g, [a]1° - +11,2 ° (c = 1, metanolissa).

c) H-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl

Liuokseen, jossa on 8,04 g (11,5 mmol) Fmoc-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl:ää 60 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään : 25 12,05 ml dietyyliamiinia. Annetaan seistä huoneenlämpöti lassa 15 minuutin ajan ja haihdutetaan. Jäännös jaetaan n-pentanolin ja NaHC03-liuoksen välillä. Pentanolifaasi haihdutetaan ja jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa. Saanto 3,8 g [a]jj° * -3,0 e (c * 1, metanolissa) . : 30 d) Z-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl-diasetaatti

Liuokseen, jossa on 3,16 g Z-D-Arg-Ile-OH:ta (kts. esimerkki 9b), 3,57 g H-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl:ää, 1,23 g pyridiiniperkloraattia 75 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 0 °C:ssa sekoittaen 1,65 g DCC:tä. Edelleen-.35 käsittely tapahtuu tavanomaisella tavalla ja jäännös jaetaan n-pentanolin ja puoliksi kyllästetyn NaHC03-liuoksen 44 8 8 4 01 välillä. N-pentanolifaasi haihdutetaan ja jäännöstä hierretään etikkaesterin kanssa Ja imusuodatetaan. Aine jaetaan etikkaesterin ja 10-%:isen vesipitoisen etikkahapon välillä 5 eri vaiheessa vastavirtaa käyttäen. Yhdiste on 5 etikkahappofaaseissa. Se yhdistetään ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään dietyylieetterin kanssa.

Saanto 4,55 g, [a]” = +11,4 0 (c 1, metanolissa).

e) H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-OH-diasetaatti 4,4 g Z-D-Arg-lle-D-Leu-Arg-D-Val-OBzl:ää hydra-10 taan katalyyttisesti vastaavasti kuten esimerkissä Ib. Saanto 3,7 g.

700 mg edellä saatua yhdistettä puhdistetaan kro-matografisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

Saanto 350 mg, [a]” = -10,6 ° (c = 1, vedessä).

15 f) Syklo-(D-Arg-lle-D-Leu-Arg-D-Val)-diasetaatti 2 g H-D-Arg-Ile-D-Leu-Arg-D-Val-diasetaattia (raaka-ainetta) muutetaan vastaavasti kuten esimerkissä 30 vasvaaksi diperkloraatiksi. Saanto 1,78 g.

656 mg (1 mmol) edellä saatua ainetta syklisoidaan 20 vastaavasti kuten esimerkissä 30. Saanto 683 mg.

Edellä saatu aine puhdistetaan kromatografisesti vastaavasti kuten esimerkissä 25d.

Saanto 366 mg, [a] j;1 = +20,5 0 (c - 1, vedessä).

Käytetyt lyhennykset: : 25 Aminohappojen kohdalla käytetyt lyhenteet vastaavat pep-tidikemiassa tavanomaista kolmen kirjaimen koodia, jollaista on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Europ. J: Biochem. 138 (1984) 9. Joitakin muita lyhennyksiä on esitetty seuraavassa: 30 Boc = -butyylioksikarbonyyli

Bzl = bentsyyli

Fmoc = 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli

Me = metyyli

Ac = asetyyli : 35 DCC = disykloheksyylikarbodi-imidi 45 88401 FAB = Fast atom bombardment HOBt = 1-hydroksibentsotriatsoli M = molekyylipiikki Z = bentsyylioksikarbonyyli 5 NSu = sukkinimido

Top = 2,4,5-trikloorifenyyli HOObt = 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentso/d/-l,2,3-triatsiini DCHA = disykloheksyyliamiini 10

Claims

46 88401

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava 5 Rn-L-N-B2-Rc (I) jossa Rn on ryhmä, jolla on kaava 10 R3 [CH2]n R2 - CH - CO - (II) 15 jossa R2 on vety tai ryhmä, jolla on kaava R-[A]n-NH-; R3 on amino, guanidino, Cj.j-alkyyliamino tai di-C^j-alkyyliamino; m on kokonaisluku 1 - 6; A merkitsee ryhmää, jolla on kaava -NH-CR4R5-CO-; R on vety tai peptidikemiassa tavanomainen suojaryhmä, kuten C^-alkanoyyli, fenyylikarbonyyli, 20 naftyylikarbonyyli, fenyyli-Cj.j-alkanoyyli, naftyyli-C^-alkanoyyli, bifenylyyli-C^j-alkanoyyli tai fluorenyyli-Cj.j-alkanoyyli, jolloin kun R ei ole vety, -CH2-ryhmä on mahdollisesti korvattu hapella tai rikillä; n on 0 tai 1; R4 ja R5 ovat samanlaisia tai erilaisia ja merkitsevät ve-25 tyä, C1.6-alkyyliä, fenyyli-C^j-alkanoyyliä tai naftyyli- karbonyyliä; L on isoleusiini-, väliini-, treoniini-, serii-ni-, O-Ci.g-alkyylitreoniini-, O-C^g-alkyyliseriini-, leu-siini- tai proliinitähde tai glutamiinihapon tai aspara-·.: 30 giinihapon ω -C1.6-alkyyli-, edullisesti t-butyyliesteritäh-de; N on väliini-, isoleusiini-, leusiini-, fenyyli-alaniini-, tryptofaani-, mahdollisesti O-C^-alkyloitu ty-rosiini-, glutamiini-, asparagiini-, glutamiinihappo-^ -35 C^-alkyyliesteri- tai asparagiinihappo-B-Cj^-alkyylies- teri- tai ε-asyylilysiinitähde; 47 8 8 401 B2 on Arg, D-Arg, Lys tai D-Lys; Rc on ryhmä, jolla on kaava -NR9-CH(R8)-(CO)p-R1, jossa R8 on Cj.g-alkyyli, joka on mahdollisesti monosubsti-tuoitu hydroksilla, C^-alkoksilla, C^-alkoksikarbonyy-5 Iillä, karbamoyylillä tai ryhmällä R-NH, jolloin R merkitsee samaa kuin edellä, mutta ei voi olla vety, tai bent-syyli- tai fenetyyliryhmä, jonka aromaattinen osa on mahdollisesti monosubstituoitu Cj.g-alkoksilla, tai indol-3-yylimetyyli, jolloin β-asemassa ryhmään -NH- nähden olevat 10 CH-, CH2- tai CH3-ryhmät ovat mahdollisesti monohydroksy-loituja, ja R9 on vety; tai R8 ja R9 merkitsevät yhdessä ryhmää -[CH2]3- tai -[CH2]4-; p on 0 tai 1; R3 on vety, hyd-roksi tai C1.6-alkoksi, kun p on 0, tai R1 on OR10 tai NR10Rn, kun p on 1, ja R10 ja R11 ovat samanlaisia tai eri-15 laisia ja merkitsevät vetyä, C^-alkyyliä, bentsyyliä tai fenetyyliä, tai NR10Rn on pyrrolidino, piperidino tai mor-folino; tai p on 1 ja R ja Rl ovat yhdessä sidos ja muut ryhmät merkitsevät samaa kuin edellä, tai niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, t u n -20 n e t t u siitä, että pääteasemassa olevan karboksyyli-ryhmän sisältävä fragmentti tai reaktiivinen johdannainen kytketään vastaavaan fragmenttiin, joka sisältää vapaan aminoryhmän, ja mahdollisesti muiden funktionaalisten ryhmien suojaamiseksi tilapäisesti liitetty (liitetyt) suoja-.25 ryhmä(t) lohkaistaan ja näin saatu yhdiste muutetaan mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- .·. n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen pep tidi, jossa p on 1 ja R ja R1 ovat yhdessä sidos, tai sen 30 fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa R ja R1 eivät ole yhdessä sidos, tai sen fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja. 48 88 401